BRPI0717634A2 - Dispositivo para amplificação e detecção de ácidos nucleicos, sistema para amplificação e detecção de ácidos nucléicos, e, método para detectar hibridização em tempo real de ácidos nucleicos para uma sonda de captura - Google Patents
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Description
"DISPOSITIVO PARA AMPLIFICAÇÃO E DETECÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS, SISTEMA PARA AMPLIFICAÇÃO E DETECÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS, E, MÉTODO PARA DETECTAR HIBRIDIZAÇÃO EM TEMPO REAL DE ÁCIDOS NUCLEICOS PARA UMA SONDA DE CAPTURA"
CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção se refere à um dispositivo e um método para amplificar e detectar fragmentos de ácido nucleico, especialmente por hibridização. CONHECIMENTO DA INVENÇÃO
PCR (reação em cadeia de polimerase) é um método para amplificar fragmentos específicos de ácido nucleico. Este é freqüentemente usado em pesquisa e para diagnose de várias doenças, incluindo muitas doenças infecciosas. Detecção de produtos de PCR amplificados podem ser feitos através de hibridização para seqüências de ácido nucleicos complementares imobilizados. Imobilizando as seqüências complementares específicas (assim chamado sondas de captura) em um padrão definido, seqüência de múltiplos nucleotídeos pode ser detectada, de forma simultânea. Tal um arranjo padronizado de sondas de captura é freqüentemente referido como microarranjo. Seqüências de nucleicos hibridizados para o microarranjo podem ser detectadas através de meios ópticos, e. g. através de fluorescência.
WO-A-01/45843 divulga um sistema para efetuar ensaios de hibridização que compreende um cartucho para acomodar um dispositivo de fluir através. O fluxo, através de dispositivo tem um arranjo de passagens de micro-canal. O cartucho pode incluir uma janela de observação. Embora este sistema pode ser funcional em um ambiente de laboratório especializado, isto não preenche a necessidade de um simples dispositivo operado que pode ser operado em um ponto de atendimento.
WO-A-OO/12675 divulga um dispositivo auto-contido que é realizar análises química e biológica, o dispositivo compreende um arranjo de micro-colunas tri-dimensional projetando para longe de uma placa de suporte. Arranjos de múltiplos materiais biológicos diferentes podem ser fixados à superfície de ditas colunas. O dispositivo pode ser usado em combinação com placas de poços de micro-titulação existente.
US 2004/0166508 descreve uma plataforma analítica e um método realizado para a análise de uma variedade de amostras para analitos contidos nele, sendo de relevância biológica como padrões de ligação em reações de ligação específica. Dito método compreende depositar amostras a serem analisadas em áreas de medição discretas em uma plataforma de sensor de campo evanescente como um suporte sólido, colocando um ou mais compostos traço em contato com as amostras, medindo mudanças de sinais opto-eletrônicos, resultando da ligação de compostos traço para analitos contidos nas amostras e determinar a presença de analitos a serem detectados especificamente qualitativamente e/ou quantitativamente da quantidade relativa de mudanças em ditos sinais opto-eletrônicos das áreas de medição correspondentes.
WO-A-00/12675 e US 6.649.378 divulga um dispositivo auto- contido que é descrito para ser facilmente operado e que é desprovido de contaminação. A idéia descrita fornece a rápida e precisa detecção de ácidos nucleicos amplificados usando um dispositivo auto-contido. O dispositivo integra extração de ácido nucleico, amplificação de alvo específico e detecção em um único dispositivo, permitindo rápida e precisa detecção de seqüência de ácido nucleico. O dispositivo auto-contido compreende um primeiro cilindro oco com uma extremidade fechada e uma pluralidade de câmaras nele, um segundo cilindro alongado oco posicionado contiguamente dentro do primeiro cilindro capaz de rotação relativa. Amostra é introduzida no primeiro cilindro para extração. Os ácidos nucleicos extraídos são confinadas a uma fase sólida, e por conseguinte, não separados da fase sólida através da adição de tampão de lavagem. Amplificação e classificação ocorrem no mesmo cilindro. Finalmente, o produto amplificado, classificado é reagido com micro-partículas conjugadas com ligantes específicos de receptor para a detecção da seqüência alvo.
É um objeto da invenção fornecer um sistema alternativo
simples para amplificar e detectar ácidos nucleicos. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção por conseguinte se refere à um dispositivo para amplificação e detecção de ácidos nucleicos, compreendendo um tubo (1), que compreende pelo menos, um compartimento (3) compreendendo composição de reação, e o tubo compreendendo uma tampa (2) onde a tampa compreende um microarranjo de ácidos nucleicos em seu interior.
A invenção ainda se refere à um método para detectar hibridização em tempo real de ácidos nucleicos para uma sonda de captura, que compreende os estágios de:
a) administrar uma amostra compreendendo mistura padrão de PCR, iniciadores de PCR apropriados e DNA gabarito para um compartimento de fundo do dispositivo de acordo com a invenção,
b) administrar tampão de hibridização para o compartimento
(3)
c) fechar o dispositivo com a tampa compreendendo um microarranjo de ácidos nucleicos (sondas de captura) em seu interior
d) realizar uma reação de PCR para amplificação de gabarito
de DNA
e) girar o dispositivo tal que o conteúdo do compartimento (3)
flui para fora do compartimento
f) opcionalmente girar o dispositivo repetidamente para assegurar mistura de seu conteúdo com o conteúdo do dispositivo
g) hibridização do DNA gabarito amplificado com as sondas de captura
h) detectar o DNA gabarito amplificado hibridizado.
Em uma instância adicional a invenção se refere à um sistema para amplificação e detecção de ácidos nucleicos, compreendendo pelo menos, um, preferencialmente uma variedade de dispositivos como descrito acima.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:
Fig. 1 mostra um dispositivo de acordo com a invenção.
Fig. 2 mostra um sistema de acordo com a invenção. Fig. 3 ilustra o método de acordo com a invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Definições
DNA gabarito é DNA que está presente em uma amostra e do qual a presença é para ser eliminado. Mistura padrão de PCR é uma mistura concentrada de
componentes de reação de PCR. Geralmente tal uma mistura compreende uma composição selecionada a partir do grupo compreendendo enzima de polimerase, tampão, nucleotídeos ou uma combinação deles.
Microarranjo é definido como um conjunto de áreas de reação química em miniaturas que é usado para testar fragmentos de nucleotídeos, preferencialmente fragmentos de DNA.
O tubo compreende um compartimento (3) que compreende reagentes que podem ser misturadas com componentes presentes no fundo do compartimento do tubo (1) em um estágio específico na reação, preferencialmente após amplificação de qualquer seqüência alvo presente em uma amostra no fundo do tubo (1).
O pelo menos, um compartimento (3) é preferencialmente preenchido com composição de reação que é mais preferida tampão de hibridização no caso de reações de PCR sendo realizadas. O compartimento (3) preferencialmente compreende uma abertura no lado do topo. Desta maneira, o compartimento pode ser manipulado tal que seu conteúdo é liberado no tubo (1). Tal manipulação pode e. g. ser girando o dispositivo/tubo de 180 graus.
Alternativamente o compartimento (3) é feito de um material
específico que pode ser feito permeável ou pode ser rompido através de um acionador específico. Tal acionador pode ser uma mudança de temperatura, a aplicação de luz de um comprimento de onda específico ou uma reação química que é forçada a acontecer no tubo (1). Maioria do compartimento (3) preferido tem um abertura em seu lado de topo como especificado acima.
O dispositivo de acordo com a invenção é preferencialmente integrada em um sistema compreendendo em elemento de aquecimento (4), um leitor (5) e uma placa de fundo transparente (6).
Tal um sistema para amplificação e detecção de ácidos nucleicos, preferencialmente compreende pelo menos, um, mais preferencialmente uma variedade de dispositivos de acordo com a invenção.
Para realizar uma reação de PCR, o sistema preferencialmente compreende um elemento de aquecimento (4), e um leitor (5).
O sistema preferencialmente ainda compreende um elemento de rotação que serve para girar o dispositivo, ou dispositivos.
Leitores preferidos incluem câmeras de CCD.
Para facilitar a detecção, o sistema mais preferencialmente compreende uma placa de fundo transparente.
Em um outro aspecto a invenção se refere à um método para detectar hibridização em tempo real de ácidos nucleicos para uma sonda de captura, que compreende os estágios de:
a) administrar uma amostra compreendendo mistura padrão de PCR, iniciadores de PCR apropriados e de ácido nucleico gabarito preferencialmente DNA para um fundo do compartimento do dispositivo de acordo com a invenção,
b) administrar tampão de hibridização para o compartimento
(3)
c) fechar o dispositivo com a tampa compreendendo um microarranjo de ácidos nucleicos (sondas de captura) em seu interior
d) realizar uma reação de PCR para amplificação de ácido nucleico gabarito
e) girar o dispositivo tal que o conteúdo do compartimento (3) flui para fora do compartimento
f) opcionalmente girar o dispositivo repetidamente para
assegurar mistura de seu conteúdo com o conteúdo do dispositivo
g) hibridização do ácido nucleico gabarito amplificado com as sondas de captura
h) detectar o ácido nucleico gabarito amplificado hibridizado.
Neste método a detecção é preferencialmente realizada usando
um leitor por varredura, mais preferido uma câmera de CCD.
A invenção é ilustrada através de uma primeira modalidade como descrito abaixo.
Fig. 1 mostra uma figura esquemática de um tubo de reação.
Uma amostra, compreendendo mistura padrão de PCR, iniciadores de PCR apropriados (classificados) e DNA gabarito é administrado para o fundo do tubo (1). Tampão de hibridização é administrado ao compartimento de fluido aberto (3) dentro do tubo (1). O tubo é capeado com uma tampa (2) que compreende um microarranjo de ácidos nucleicos em seu interior.
O tubo (1) é colocado em um dispositivo de leitor integrado
(Fig. 2) que é aqui referido como o sistema (8). Este sistema compreende de um bloco térmico móvel capaz de (rápido) termo-ciclagem (elemento de aquecimento 4), um contato de topo aquecido e uma placa de fundo transparente (6). Abaixo da placa de fundo um leitor óptico confocal (5) é posicionado. O elemento de aquecimento pode ser usado para regulação de temperatura in termo-ciclagem, amplificação isotérmica ou para aquecimento da amostra durante hibridização.
Quando a amostra está para ser analisada, esta é administrada ao tubo como descrito acima e então colocada no bloco térmico (4) (Fig. 3.1). Esta figura mostra um exemplo de um bloco térmico capaz de manter múltiplos tubos. Um dispositivo para um único tubo é também factível. O bloco de aquecimento (4) com os tubos é movido para cima para assegurar que as tampas dos tubos sejam comprimidas à tampa aquecida (3.2). Esta tampa é mantida em uma temperatura constante levemente acima de IOO0C para prevenir evaporação da amostra durante termo-ciclagem da PCR. Após a termo-ciclagem estar completa, o bloco térmico é movido para baixo e girado de 180° (3.3). Isto força o fluido para fluir para o topo dos tubos e o tampão de hibridização para fluir para fora de seu compartimento (3). Opcionalmente, o bloco pode ser girado repetitivamente para assegurar mistura apropriada do fluido de PCR e do tampão de hibridização. Opcionalmente, o bloco pode ser movido para cima na posição vertical de novo para um estágio de desnaturação de 95°C. Quando os tubos estão de cabeça para baixo, os produtos de PCR amplificado são permitidos hibridizar as sondas de captura no microarranjo. O bloco é movido para baixo para uma placa transparente. Abaixo desta placa está um leitor confocal capaz de detectar fluorescência. Porque o leitor é confocal, o volume de medidas (detecção e excitação) é reduzido substancialmente para tipicamente uns poucos micrometros distante da superfície do microarranjo, e assim sendo o leitor tem especificidade de superfície aprimorada. Como um resultado da especificidade de superfície aprimorada, hibridização pode ser medida em tempo real já que nenhuma lavagem ou remoção de fluidos é necessário. Isto é ilustrado na Fig. 3.4. O leitor pode ser um leitor por varredura.
Como um método alternativo para melhorar a especificidade de superfície, alguém pode usar métodos de excitação evanescente, onde uma onda evanescente é excitada na superfície do substrato e excita fluoróforos vinculados à superfície. Neste contexto a superfície da tampa, posicionado no lado interno da tampa, é o substrato.
Como um primeiro método alguém pode usar reflexão interna
total (TIR) na interface de substrato/fluido, que resulta em volumes de medida (excitação) dentro de 100-500 nm da superfície do arranjo. Contudo, TIR prefere o uso de um prisma de vidro conectado ao substrato ou o uso de um substrato com uma forma em cunha para permitir o acoplamento de luz de excitação com ângulos acima do ângulo crítico da interface entre substrato e fluido no substrato.
Como um segundo método preferido alguém pode cobrir o substrato com uma estrutura não transparente tal como um metal e gabarito, o substrato com [um arranjo de] aberturas com pelo menos, uma dimensão no plano paralelo da interface entre substrato abaixo do limite de difração de luz no fluido. Como um exemplo, alguém pode modelar o substrato com grades de fio que tem uma plano no plano acima e a outra dimensão abaixo do limite de difração da luz no fluido. Isto resulta em volume de excitação dentro de 50 nm (tipicamente 20-30 nm) da superfície do arranjo. A vantagem deste método sobre o primeiro método [para excitação evanescente] é que isto é mais simples- não há necessidade para um prisma ou uma superfície em forma de cunha e que não há requisitos especiais para o ângulo de incidência e forma do ponto de excitação e alguém pode usar uma simples câmera de CCD para formar imagens de fluorescência- e permite volumes substancialmente menores de excitação.
Na modalidade onde o substrato é modelado com uma grade de fio, o arranjo de nucleotídeos pode idealmente ser posicionado nas aberturas da grade de fio.
Referência de técnicas de detecção adicionais é por exemplo feita para a aplicação internacional IB2005/053168 que é incorporada para referência.
Claims (16)
1. Dispositivo para amplificação e detecção de ácidos nucleicos, caracterizado pelo fato de compreender um tubo (1), que compreende pelo menos, um compartimento (3) compreendendo composição de reação, e o tubo compreendendo uma tampa (2) em que a tampa compreende um microarranjo de ácidos nucleicos em seu interior.
2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos, um compartimento (3) é preenchido com composição de reação que é tampão de hibridização.
3. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, caracterizado pelo fato de que o compartimento (3) pode ser manipulado tal que seu conteúdo é liberado no tubo (1).
4. Dispositivo de acordo com qualquer das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o compartimento (3) compreende uma abertura em seu lado de topo.
5. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado pelo fato de que é integrado em um sistema compreendendo um elemento de aquecimento (4), um leitor (5) e um placa de fundo transparente (6).
6. Sistema para amplificação e detecção de ácidos nucleicos, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos, um, preferencialmente vários dispositivos como definidos em qualquer das reivindicações 1-4.
7. Sistema de acordo com reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ainda compreender, um elemento de aquecimento (4), e um leitor (5).
8. Sistema de acordo com reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ainda compreender um elemento giratório que serve para girar o dispositivo ou dispositivos.
9. Sistema de acordo com reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o leitor é um leitor confocal.
10. Sistema de acordo com reivindicação 6, caracterizado pelo fato de compreender uma superfície da tampa como substrato, em que o substrato é em forma de cunha de modo a permitir excitação de fluoróforos na superfície de microarranjo.
11. Sistema de acordo com reivindicação 6, caracterizado pelo fato de compreender uma superfície da tampa como substrato, em que o substrato é preso a um prisma de modo a permitir excitação de fluoróforos na superfície do arranjo.
12. Sistema de acordo com reivindicação 6, caracterizado pelo fato de compreender uma superfície da tampa como substrato, onde o substrato é coberto na interface faceando o fluido com uma composição padronizada de modo a permitir excitação evanescente em fluoróforos na superfície do arranjo.
13. Sistema de acordo com reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ainda compreender uma placa de fundo transparente.
14. Método para detectar hibridização em tempo real de ácidos nucleicos para uma sonda de captura, caracterizado pelo fato de compreender os estágios de: a) administrar uma amostra compreendendo mistura padrão de PCR, iniciadores de PCR apropriados e ácidos nucleicos gabaritos, preferencialmente DNA, para um compartimento de fundo do dispositivo como definido na reivindicação 1, b) administrar tampão de hibridização ao compartimento (3) c) fechar o dispositivo com a tampa compreendendo um microarranjo de ácidos nucleicos, chamado sondas de captura, em seu interior d) realizar uma reação de PCR para amplificação de ácido nucleico gabarito e) girar o dispositivo tal que o conteúdo do compartimento (3) flui para fora do compartimento f) opcionalmente girar o dispositivo repetidamente para assegurar mistura de seu conteúdo com o conteúdo do dispositivo g) hibridizar o ácido nucleico gabarito amplificado com as sondas de captura h) detectar o ácido nucleico gabarito amplificado hibridizado.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que detecção é realizada usando um leitor por varredura.
16. Método de acordo com reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ser usado na detecção de doenças infecciosas.
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