BR112014017624B1

BR112014017624B1 - método para agitar uma solução contendo uma substância teste e método para analisar uma substância teste

Info

Publication number: BR112014017624B1
Application number: BR112014017624A
Authority: BR
Inventors: Nobumasa Hitoshi; Kuroda Toshihiko
Original assignee: Toray Industries
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2020-04-14
Also published as: CA2861288C; EP2821794A1; DK2821794T3; EP2821794B1; CA2861288A1; JP6187259B2; KR102039369B1; CN104169722A; US20150045250A1; JPWO2013129469A1; BR112014017624A2; KR20140138112A; CN104169722B; ES2623098T3; US9944976B2; PL2821794T3; EP2821794A4; WO2013129469A1; BR112014017624B8

Abstract

método para agitar uma solução contendo uma substância teste e método para analisar uma substância teste a presente invenção descreve um meio para acelerar a reação de ligação seletiva entre uma substância de ligação seletiva imobilizada sobre um chip de análise e uma substância teste, em particular, um meio para possibilitar a análise de uma substância teste em um curto espaço de tempo. ainda, a presente invenção refere-se a um método de agitação de uma solução da substância teste compreendendo: a injeção de uma solução contendo a substância a um espaço em uma reentrância de um chip de análise, de tal modo que o espaço é parcialmente deixado sem preenchimento; e o chip de análise é rotacionado aplicando-se uma aceleração centrífuga não inferior a 1× g.

Description

“MÉTODO PARA AGITAR UMA SOLUÇÃO CONTENDO UMA SUBSTÂNCIA TESTE E MÉTODO PARA ANALISAR UMA SUBSTÂNCIA TESTE”

Campo da invenção [001] A presente invenção refere-se a um método de agitação de uma solução contendo uma substância teste, cujo método é usado para trazer uma solução contendo uma substância a ser testada em contato com uma substância que se liga seletivamente à substância a ser testada sobre um substrato (a seguir, referido como “substância de ligação seletiva”) e permitindo que elas reajam entre si.

Antecedentes da invenção [002] Um chip de análise compreende um substrato sobre o qual a substância de ligação seletiva (tal como um ácido nucleico, uma proteína, um lipídeo ou um sacarídeo) que se liga seletivamente a uma substância teste é imobilizada. A substância de ligação seletiva sobre o substrato e a substância teste são submetidas a reação de hibridização normalmente em uma solução e, a partir dos resultados da reação são analisados a existência, estado, quantidade ou similares de uma substância contida na substância teste. Como substrato, é geralmente empregado um substrato de vidro, um substrato de metal ou um substrato de resina.

[003] Uma realização preferencial de um chip de análise é chamado de “microarranjo”, em que as moléculas de DNA, tais como proteínas ou cadeias de açúcar são densamente dispostas sobre um substrato com a finalidade de, por exemplo, testar simultaneamente as expressões de diversos genes em um número de várias dezenas a várias dezenas de milhares. A utilização de microarranjos permite a detecção e a quantificação de ácidos nucleicos com base na reação de hibridização ácido nucleico-ácido nucleico ou a detecção e quantificação de proteínas e cadeias de açúcar com base na reação específica proteína-proteína, cadeia de açúcar-cadeia de açúcar ou

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2/49 cadeia de açúcar-proteína, de modo que análise da expressão gênica sistemática e abrangente pode ser realizada em, por exemplo, vários modelos animais de doenças e fenômenos biológicos celulares. Especificamente, as funções dos genes, ou seja, as proteínas codificadas pelos genes pode ser esclarecida, e o momento da expressão das proteínas, bem como os locais de as suas ações podem ser identificados. Usando o microarranjo para analisar as variações na expressão de genes de organismos no nível celular ou tecidual e a combinação dos dados fisiológicos, de fenômenos biológicos e bioquímicos da célula para construir uma base de dados de perfis de expressão gênica, torna-se possível procurar genes de doenças e genes relacionados à terapia e explorar estratégias terapêuticas.

[004] Entre chips de análise, microarranjos de DNA (chips de DNA) são utilizados para a detecção, quantificação e uso similares de ácidos nucleicos com base na reação de hibridização de ácido nucleico-ácido nucleico. Como um chip de DNA, por exemplo, um chip, em que um grande número de fragmentos de DNA é densamente disposto e imobilizado sobre um substrato plano de vidro é empregado. Tal chip de DNA é usado para a detecção de cada gene contido em uma amostra, ou para medir a quantidade do mesmo, por exemplo, um método no qual uma amostra preparada por marcação de genes expressos em uma célula de interesse, ou similares, com um corante fluorescente ou similar é submetida a hibridização de modo a permitir que os ácidos nucleicos complementares (DNA ou RNA) se liguem e a fluorescência dos sítios de ligação seja rapidamente detectada utilizando um dispositivo de detecção de alta resolução (scanner), ou um método de detecção de uma resposta tal como uma corrente elétrica baseada em uma reação eletroquímica. Chips de DNA têm grandes expectativas não só na análise da expressão gênica com base na detecção e quantificação de genes expressos, mas também em seus campos de aplicação, tal como a detecção

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3/49 de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) em genes.

[005] Além disso, chips de análise foram utilizados como um meio para examinar e analisar não apenas os ácidos nucleicos, tal como DNA, mas também proteínas e açúcares. Especialmente, em chips de análise de proteínas, proteínas como anticorpos, antígenos e substratos de enzimas são imobilizados em um substrato.

[006] O Documento de Patente 1 descreve um método de agitação de uma solução que contém a substância teste pela rotação de um chip de análise de estrutura irregular e, deste modo, permitindo que as partículas finas ou bolhas de ar movam do chip de análise. Neste método, permitindo que as partículas finas ou bolhas de ar se movam sem entrar em contato com o substrato imobilizado de uma substância de ligação seletiva, mesmo com uma pequena quantidade de substância teste, podem ser obtidos boa relação S/N e forte sinal de fluorescência.

[007] O Documento de Patente 2 descreve um método que é capaz de realizar uma reação seletiva entre uma substância teste e uma substância de ligação seletiva de uma forma simples e estável, pela rotação de um chip de análise com uma estrutura irregular na direção substancialmente horizontal, e a agitação da solução da substância teste usando partículas finas.

[008] O Documento de Patente 3 descreve um método de hibridização e um aparelho no qual a rotação de um recipiente contendo uma solução de amostra e as partículas finas permite que as partículas finas caiam no sentido da gravidade, a solução de amostra no recipiente é agitada.

[009] O Documento de Patente 4 descreve um método de hibridização em que uma solução de hibridização que é injetada na câmara de hibridização especial em que um microarranjo está disposto de tal maneira que o espaço do mesmo é deixado parcialmente sem preenchimento na câmara, sendo, então, rotacionado de modo a deslocar a posição da espaço preenchido

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4/49 com a solução na câmara, agitando, assim, a solução.

[010] O Documento de Patente 5 descreve um aparelho de hibridização do tipo rotação e revolução, que agita uma solução de amostra, pela rotação do próprio aparelho rotativo enquanto um microarranjo é disposto sobre uma mesa giratória.

Documentos Dos Antecedentes Da Invenção [011] Documentos de Patente:

[Documento de Patente 1] WO 2005/090997 [Documento de Patente 2] JP 2007-285828A [Documento de Patente 3] JP 2003-339375A [Documento de Patente 4] JP 4473007 [Documento de Patente 5] US 6309875

Descrição Resumida da Invenção

Problemas a serem resolvidos pela presente invenção [012] No método de agitação de uma solução de acordo com o Documento de Patente 1, o chip de análise é rotacionado a uma velocidade de rotação relativamente baixa de, por exemplo, 3 rpm, e, neste caso, a reação de hibridização exige 10 horas. Portanto, este método não é adequado para a detecção rápida de uma substância teste. Da mesma forma, o método de agitação de uma solução da substância teste de acordo com o Documento de Patente 2 também não é aplicável para a detecção rápida de uma substância teste, porque a reação de hibridização no presente método requer 16 horas. Além disso, embora o método descrito no Documento de Patente 3 esteja indicado por ter um efeito de reduzir o tempo necessário para a hibridização, a reação de hibridização, na verdade, necessita de 6 horas; portanto, é difícil aplicar este método para uma análise em que o diagnóstico imediato é exigido. Além disso, no método de hibridização descrito no Documento de Patente 4, embora o valor CV seja

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5/49 melhorado pela rotação da câmara ao se comparar com um caso em que a reação é realizada simplesmente deixando a solução de hibridização, não há qualquer alteração na intensidade do sinal e o progresso da reação não é acelerado. O aparelho descrito no Documento de Patente 5 é um aparelho que permite a agitação do microarranjo com uma pequena quantidade de solução de amostra; no entanto, o tempo necessário para a hibridização e encurtamento do mesmo não são mencionados e, portanto, é não fica claro se o aparelho é adaptável para o diagnóstico rápido.

[013] Estes métodos de agitação de solução revelados nos documentos de patente 1 a 5 são todos destinados a melhorar a sensibilidade de detecção, aumentando a eficiência da reação de hibridização; no entanto, a reação de hibridização nestes métodos realmente necessita de 6 a 20 horas. Assim, estes métodos não podem ser vistos como tecnologias para melhorar dramaticamente a velocidade de detecção e quantificação de uma substância teste utilizando um chip de análise. Portanto, até agora, no campo da análise de uma substância teste utilizando um chip de análise, onde é exigido efetuar a detecção ou quantificação em um curto período de tempo, que vai de vários minutos a duas horas, no máximo, por exemplo, nas aplicações de exame e diagnóstico de doenças infecciosas, tal como influenza, sépsis e similares, não foi apresentado um método de agitação de uma solução de substância teste que permita que a análise seja realizada com uma velocidade que satisfaça a demanda.

[014] A presente invenção resolve os problemas descritos acima e um objetivo da presente invenção é o de proporcionar um meio destinado a acelerar o progresso da reação de ligação seletiva (reação de hibridização) entre uma substância de ligação seletiva imobilizada em um chip de análise e uma substância teste, em particular, um meio para permitir a análise de uma substância teste, em um curto espaço de tempo.

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Meios para resolver os problemas [015] A fim de resolver os problemas descritos acima, os presentes inventores estudaram intensivamente o método de agitação de uma solução que contém a substância teste, através da qual, em uma análise de uma substância teste, utilizando um chip de análise, a reação entre a substância teste e uma substância de ligação seletiva imobilizada pode ser acelerada. Como resultado, os presentes inventores verificaram que a reação de ligação seletiva estável pode ser realizada em um curto espaço de tempo, injetando a solução que contém a substância teste em uma reentrância do chip de análise de tal modo que o espaço da reentrância seja parcialmente deixado sem preenchimento e girando o chip de análise pela aplicação de uma aceleração centrífuga não inferior a 1 x g, de modo a agitar a solução, completando assim a presente invenção.

[016] Isto posto, a presente invenção é constituída pelos seguintes (1) a (7).

(1) Um método de agitação de uma solução que contém a substância teste injetada em um chip de análise, em que o chip de análise compreende uma reentrância para que a solução contendo a substância teste seja injetada; e uma substância de ligação seletiva, que se liga seletivamente à substância a ser testada, sendo imobilizada sobre a totalidade ou parte da superfície de fundo da reentrância, compreendendo o método: a injeção da solução que contém a substância teste no espaço de reentrância do chip de análise de tal modo que o espaço seja parcialmente deixado sem preenchimento; e rodando o chip de análise no qual a solução que contém a substância teste é injetada aplicando uma aceleração centrífuga não inferior a 1 ^x g.

(2) O método de agitação de uma solução de acordo com (1), em que o chip de análise no qual a solução que contém a substância teste injetada

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7/49 é rotacionado com um raio de rotação de 0,1 mm a 20 mm.

(3) O método de agitação de uma solução de acordo com (1) ou (2), no qual a solução que contém a substância teste é injetada na reentrância descrita acima de modo a que de 10% a 70% do espaço é deixado não preenchido.

(4) O método de agitação de uma solução de acordo com qualquer um de (1) a (3), na qual o chip de análise descrito acima compreende diversas reentrâncias nas quais a solução que contém a substância teste é injetada, sendo as diversas reentrâncias separadas entre si por parede(s).

(5) O método de agitação de uma solução de acordo com qualquer um de (1) a (4), no qual o chip de análise descrito acima está equipado com uma tampa que cobre a totalidade da(s) reentrância(s) descrita(s) acima; e a solução contendo a substância teste descrita acima é selada na(s) reentrância(s).

(6) O método de agitação de uma solução de acordo com qualquer um de (1) a (5), no qual o chip de análise ao qual a solução que contém a substância teste é injetada está disposto de tal modo que a superfície de fundo da reentrância descrita acima é horizontal ou substancialmente horizontal; e o chip de análise é rotacionado na direção horizontal ou substancialmente horizontal.

(7) Um método para analisar uma substância teste, cujo método compreende as etapas de : permitir que a substância teste se ligue a uma substância de ligação seletiva imobilizada em um chip de análise pelo método de agitação de uma solução de acordo com qualquer um de (1) a (6); e detectar se a substância teste se ligou à substância de ligação seletiva.

Efeitos da Invenção [017] De acordo com o método de agitação de solução da substância teste da presente invenção, a reação seletiva entre a substância

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8/49 teste a substância de ligação seletiva imobilizada em um chip de análise pode ser acelerada de forma eficaz e as possibilidades da substância de ligação seletiva e a substância teste se aproximarem entre si podem ser significativamente aumentadas. Portanto, torna-se possível detectar ou quantificar a substância teste contida em uma solução com a substância teste utilizando um chip de análise em um curto período de tempo.

[018] Além disso, de acordo com o método de agitação de solução da substância teste da presente invenção, mesmo quando é utilizado um chip de análise com diversas reentrâncias nas quais uma solução que contém a substância teste é injetada, uma vez que a solução nas respectivas reentrâncias pode ser agitada sob as mesmas condições, a reação entre a substância de ligação seletiva e a substância teste nas respectivas reentrâncias também pode ser realizada sob as mesmas condições, de modo que a ocorrência de variação na reação entre as reentrâncias pode ser inibida.

Breve Descrição Das Figuras [019] Fig. 1 mostra exemplos de realização do chip de análise da presente invenção. Fig. 1 (a) exibe um exemplo de realização em que o chip de análise tem uma reentrância; Fig. 1 (b) exibe um exemplo de realização em que o chip de análise tem diversas reentrâncias; e Fig. 1 (c) é uma vista em corte transversal de uma reentrância.

[020] Fig. 2 mostra exemplos de realização do chip de análise da presente invenção. Fig. 2 (a) exibe um exemplo de realização em que o chip de análise tem uma reentrância; Fig. 2 (b) exibe um exemplo de realização em que o chip de análise tem diversas reentrâncias; e Fig. 2 (c) é uma vista em corte transversal de uma reentrância.

[021] Fig. 3 mostra exemplos de realização do chip de análise da presente invenção. Fig. 3 (a) exibe um exemplo de realização em que o chip de análise tem uma reentrância; Fig. 3 (b) exibe um exemplo de realização em que

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9/49 o chip de análise tem diversas reentrâncias; e Fig. 3 (c) é uma vista em corte transversal de uma reentrância.

[022] Fig. 4 mostra exemplos de realização em que o chip de análise da presente invenção é equipado com uma tampa. Fig. 4 (a) exibe um exemplo de realização em que o chip de análise tem uma reentrância; Fig. 4 (b) exibe um exemplo de realização em que o chip de análise tem diversas reentrâncias; e Fig. 4 (c) é uma vista em corte transversal de uma reentrância.

[023] Fig. 5 ilustra vistas de cima que mostram exemplos de realização preferidos da superfície de fundo de uma reentrância do chip de análise de acordo com a presente invenção. Fig. 5 (a) exibe uma reentrância que possui um fundo hexagonal; Fig. 5 (b) exibe uma reentrância que tem uma fundo parte tetragonal com cantos arredondados; e Fig. 5 (c) exibe uma reentrância possuindo um fundo elíptico.

[024] Fig. 6 é uma vista em corte transversal do chip de análise da presente invenção, que exibe um exemplo de realização em que uma solução que contém a substância teste é injetada no chip de análise.

[025] Fig. 7 é um desenho que ilustra a rotação de acordo com a presente invenção.

[026] Fig. 8 é um desenho que ilustra um modo de rotação incluindo revolução.

[027] Fig. 9 é um gráfico que mostra as relações entre o tempo de reação e a intensidade do sinal nos Exemplos 1 a 4 e Exemplos Comparativos 1 a 3.

[028] Fig. 10 é um gráfico ampliado, que mostra a parte do gráfico da fig. 9, onde o tempo de reação é de 0 a 1 hora.

Modo de Realização da Invenção [029] Na presente invenção, o termo “chip de análise” refere-se a um chip ao qual uma solução que contém a substância teste (a seguir, também

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10/49 pode ser referida como “solução de substância teste”) é injetada com a finalidade de detectar a existência de um substância teste e a medição da quantidade, propriedades e similares, da substância teste. Os exemplos específicos destes incluem os biochips para medir a quantidade ou existência de uma substância teste com base na reação entre uma substância de ligação seletiva imobilizada sobre a superfície do suporte e a substância teste. Exemplos mais específicos incluem chips de DNA, em que os ácidos nucleicos são imobilizados na superfície do suporte; chips de proteína em que a proteína representada pelos anticorpos é imobilizada sobre a superfície do suporte; chips de cadeias de açúcar em que as cadeias de açúcar são imobilizadas na superfície do suporte; e chips de células em que as células são imobilizadas na superfície do suporte.

[030] No chip de análise utilizado na presente invenção, uma(algumas) reentrância(s) na(s) qual(ais) uma solução que contém a substância teste é injetada é(são) formada(s). Cada reentrância forma um espaço constituído por uma superfície de parede, e uma superfície de fundo, e uma substância de ligação seletiva é imobilizada sobre a totalidade ou uma parte da superfície de fundo da reentrância.

[031] Exemplos de realização do chip de análise utilizado na presente invenção serão agora descritos com referência às Figs. de 1 a 6.

[032] Fig. 1 ilustra chips de análise constituídos por um substrato plano 1 (por exemplo, uma lâmina de vidro) e um material de placa (2) possuindo orifício(s) de passagem. O substrato (1) e o material de placa (2) que possui orifício(s) de passagem(ns) são ligados para formar reentrância(s) (6) (ou espaço(s) em reentrância), constituído por uma superfície de fundo (3) e uma superfície de parede (4). A Fig. 1 (a) mostra um exemplo de realização em que o chip de análise tem uma reentrância (6); Fig. 1 (b) mostra um exemplo de realização em que o chip de análise tem diversas reentrâncias (6); e Fig. 1 (c) é

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11/49 uma vista em corte transversal de cada reentrância. Uma substância de ligação seletiva é imobilizada sobre uma parte da superfície (a superfície superior) do substrato 1, e esta superfície forma uma superfície com a substância de ligação seletiva imobilizada 5 sobre uma parte da superfície de fundo (3) de cada reentrância (6), quando o substrato 1 e o material de placa 2 são unidos.

[033] Em tal chip de análise tal como mostrado na Fig. 1, que é constituído por um substrato plano em que uma substância de ligação seletiva é imobilizada e um material de placa que compreende orifício(s) de passagem para a formação de reentrância(s), o material do substrato plano e o material de placa não são particularmente limitados e pode ser utilizado, por exemplo, um material inorgânico, tal como vidro, cerâmica ou silício, ou um material polimérico, tal como tereftalato de polietileno, acetato de celulose, policarbonato, poliestireno, polimetilmetacrilato ou borracha de silicone. O método de ligação do substrato plano e o material de placa também não é particularmente restrito, e o substrato plano e o material de placa podem ser colados usando um adesivo de um modo substancialmente indissociável, ou podem ser colados por meio de uma fita adesiva de dupla face ou uma camada adesiva feita de uma composição de resina ou similar de maneira dissociável. Além disso, o número de reentrâncias por chip de análise pode ser definido de acordo com a finalidade da análise, e uma ou uma pluralidade de reentrâncias podem ser formadas.

[034] As Figs. 2 e 3 mostram chips de análise, em que uma(algumas) reentrância(s) (6) é(são) formada(s) sobre o substrato 1, por exemplo, pela moldagem por injeção, sem utilizar o material de placa que tem orifício(s) representado na fig. 1. Cada reentrância (6) formada sobre o substrato 1 compreende um espaço constituído pela superfície de fundo (3) e a superfície de parede (4), e uma parte da superfície de fundo (3) da reentrância é a superfície onde a substância de ligação seletiva é imobilizada (5). Figs. 2

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12/49 (a) e 3 (a), cada uma mostra um exemplo de realização em que o chip de análise tem uma reentrância; As Figs. 2 (b) e 3 (b) mostram um exemplo de realização em que o chip de análise tem diversas reentrâncias; e as Figs. 2 (c) e 3 (c) mostram um corte transversal da reentrância. O número de reentrâncias por chip de análise pode ser selecionado arbitrariamente de acordo com a finalidade da análise.

[035] Nos chips de análise mostrados nas Figs. 2 e 3, pode ser usado como o material de substrato o mesmo material de substrato utilizado nos chips de análise descritos acima, representados na Fig. 1.

[036] No chip de análise usado no método de agitação de uma solução de acordo com a presente invenção, a profundidade da(s) reentrância(s) não é particularmente restrita; no entanto, está preferencialmente entre 0,1 a 10 mm, mais preferencialmente de 0,5 a 5 mm. A Fig. 2 mostra exemplos de realização do chip de análise de um tipo que tem uma reentrância (6) pouco profunda e a Fig. 3 mostra exemplos de realização do chip de análise de um modelo de reentrância (6) profunda.

[037] Quando o chip de análise ao qual uma solução da substância teste é injetada é rotacionado, nos casos onde o chip de análise com uma reentrância profunda tal como mostrado na fig. 3 é usado, o chip de análise pode ser rotacionado da forma com está, sem a montagem de uma tampa sobre ele. Por outro lado, nos casos em que é utilizado um chip de análise com uma reentrância rasa, tal como mostrado na fig. 2, é preferível que uma tampa que cubra a totalidade da(s) reentrância(s) seja montada para selar a solução da substância teste na(s) reentrância (s). Por exemplo, quando a profundidade da(s) reentrância(s) é de 5 mm ou menos, é preferível que a tampa seja montada de acordo com as condições de rotação do chip de análise (aceleração centrífuga, velocidade de rotação e raio de rotação).

[038] Fig. 4 mostra exemplos de realização em que o chip de

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13/49 análise está equipado com uma tampa (7), que abrange a totalidade da(s) reentrância(s) (6), e a solução da substância teste é selada na(s) reentrância(s0 (6). Mais especificamente, a fig. 4 mostra exemplos de realização em que o chip de análise mostrados na fig. 2 ou 3 é equipado com a tampa de placa plana (7). A Fig. 4 (a) mostra um exemplo de realização em que o chip de análise tem uma reentrância; Fig. 4 (b) mostra um exemplo de realização em que o chip de análise tem diversas reentrâncias; e Fig. 4 (c) é uma vista em corte transversal de uma reentrância. Nestes exemplos de realização, a tampa (7) compreende o orifício de injeção (8) para injetar uma solução da substância teste no interior da(s) reentrância(s).

[039] Como tampa, pode ser usada uma placa plana feita de uma resina, borracha, vidro ou similar, ou de um material de vedação tal como uma fita adesiva. Ao fornecer a tampa com orifício(s) de injeção para injetar uma solução da substância teste no interior da(s) reentrância(s), a tampa pode ser montada antes da solução da substância teste ser injetada dentro da reentrância. Neste caso, é preferível que a tampa tenha diversos orifícios de injeção e, por exemplo, podem ser formados 2 a 4 orifícios de injeção por encaixe. Por outro lado, nos casos em que a tampa é montada após a solução da substância teste ser injetada, um orifício de injeção pode ou não ser formado sobre a tampa e, por exemplo, pode ser empregado de maneira adequada um método para cobrir e selar a abertura com uma fita adesiva, um método para vedar a abertura, colocando um material de placa em que um anel de vedação seguindo o formato da abertura é fixado em contato íntimo com a abertura, ou um método para cobrir e selar a abertura com uma substância semelhante a argila.

[040] Ao realizar a reação de hibridização, nos casos em que é necessário evitar a evaporação da solução da substância teste ou de manter rigorosamente constante a temperatura de reação, é preferível que o espaço

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14/49 da(s) reentrância(s) de análise do chip seja selado e, neste caso, é preferível que o chip de análise esteja equipado com uma tampa.

[041] No chip de análise usado no método de agitação de uma solução de acordo com a presente invenção, é preferível que a superfície de fundo de cada reentrância tenha uma forma que permita que o espaço (ou bolha de ar) na reentrância deixado não preenchido com a solução da substância teste se mova facilmente quando o chip de análise é rotacionado. Por exemplo, conforme mostrado na fig. 5, é preferível usar um chip de análise no qual a superfície de fundo de cada reentrância tenha (a) uma forma hexagonal, (b) uma forma tetragonal ou (c) uma forma elíptica, uma vez que esta permite que um espaço (ou bolha de ar) (9) na reentrância se mova facilmente. Além disso, nos casos em que a superfície de fundo de cada reentrância tem uma forma poligonal, prefere-se que os cantos da mesma sejam arredondados (por exemplo, como na fig. 5 (b)) uma vez que isto também permite que o espaço (ou bolha de ar) na reentrância deixada sem preenchimento com a solução de teste se mova facilmente.

[042] Fig. 6 é uma vista em corte transversal obtida na proximidade de uma reentrância do chip de análise, que mostra um exemplo de realização em que uma solução que contém a substância teste é injetada com o chip de análise montado com a tampa. A figura ilustra uma condição em que uma solução que contém a substância teste é injetada no espaço da reentrância (6) do chip de análise; um espaço (ou bolha de ar) (9) que não está preenchido com a solução é formado; e a tampa (7) é instalada. Ao rodar o chip de análise na condição mostrada na Fig. 6, a solução da substância teste pode ser agitada para realizar a reação de hibridização.

[043] Na presente invenção, o termo “substância de ligação seletiva” significa uma substância que pode se ligar seletivamente a uma substância teste diretamente ou indiretamente. Exemplos representativos da

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15/49 substância de ligação seletiva que pode se ligar à superfície de um suporte incluem; ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos, açúcares e lipídeos.

[044] Exemplos dos ácidos nucleicos incluem DNA e RNA, e os ácidos nucleicos também podem ser PNA ou LNA. Exemplos de DNA que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a, DNAs cromossômicos, DNAs virais e DNAs bacterianos, de fungos e similares, bem como os cDNAs obtidos por transcrição reversa de RNA e fragmentos parciais destes DNAs. Além disso, exemplos de RNAs que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a, RNA mensageiro, RNA ribossomal, pequenos RNAs, micro RNAs e fragmentos parciais destes RNAs. Além disso, os DNA, RNAs e similares sintetizados quimicamente também estão incluídos nos exemplos. Um ácido nucleico de cadeia simples possuindo uma sequência específica de bases hibridiza seletivamente e se liga com uma fita única de ácido nucleico possuindo uma sequência de bases que é complementar à sequência de bases específica ou á uma parte dela; consequentemente, uma fita simples de tal ácido nucleico também corresponde a “substância de ligação seletiva” definida na presente invenção. O ácido nucleico pode ser um derivado de um produto natural, tal como uma célula viva, ou pode ser sintetizado utilizando um sintetizador de ácidos nucleicos. A preparação de DNA ou RNA a partir de uma célula viva pode ser realizada por um método conhecido. Por exemplo, o DNA pode ser extraído pelo método de Blin et al. (Blin et al., Nucleic Acids Res. 3:2303 (1976)) ou similares e o RNA pode ser extraído pelo método de Favaloro et al. (Favaloro et al., Methods Enzymol. 65:718 (1980)) ou similar. Como ácido nucleico a ser imobilizado também podem ser utilizados, por exemplo, um DNA de plasmídeo, linear ou circular, ou DNA cromossômico, um fragmento de DNA obtido por clivagem destes DNAs com uma enzima de restrição ou pela clivagem química destes DNAs, um DNA sintético preparado in vitro usando uma enzima ou similar, ou um oligonucleotídeo sintetizado

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16/49 quimicamente.

[045] Exemplos de proteínas incluem anticorpos, fragmentos de ligação à antígenos de anticorpos, tal como fragmentos Fab e fragmentos F(ab')2 , e diversos antígenos. Um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga seletivamente ao seu antígeno correspondente e um antígeno se liga seletivamente ao seu anticorpo correspondente; portanto, eles também correspondem a “substância de ligação seletiva”.

[046] Exemplos de sacarídeos incluem vários monossacarídeos e cadeias de açúcares, tais como oligossacarídeos e polissacarídeos.

[047] Os exemplos de lipídeos incluem lipídeos simples e lipídeos complexos.

[048] Além disso, uma substância antigênica diferente das descritas acima de ácidos nucleicos, proteínas, sacarídeos e lipídeos também pode ser imobilizada. Além disso, como substância de ligação seletiva, as células também podem ser imobilizadas na superfície do suporte.

[049] Entre estas substâncias de ligação seletivas, as particularmente preferidas incluem DNA, RNA, proteínas, peptídeos, sacarídeos, cadeias de açúcar e lipídeos.

[050] Exemplos da substância teste utilizada na presente invenção incluem, mas não se limitam a, ácidos nucleicos a serem mensurados (ácidos nucleicos alvo), tais como os genes de bactérias patogênicas, vírus e similares, os genes causadores de doenças hereditárias, e partes dos mesmos; vários componentes biológicos antigênicos; e anticorpos contra as bactérias patogênicas, vírus e similares.

[051] No método de agitação de uma solução de acordo com a presente invenção, exemplos das soluções que contêm as substâncias teste que podem ser utilizadas incluem, mas não se limitam a, fluidos corporais, tais como sangue, soro, plasma, urina, fezes, liquor, saliva e diversos líquidos

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17/49 teciduais; diversos alimentos e bebidas; e diluições dos mesmos. Aqui, a viscosidade da solução que contém a substância teste não é particularmente restringida, desde que o(s) espaço(s) da(s) reentrância(s) de análise do chip não preenchido(s) com a solução da substância teste seja(m) móveis quando o chip de análise é rotacionado pela aplicação de aceleração centrífuga.

[052] O ácido nucleico utilizado como substância teste pode ser um que é extraído a partir de sangue ou de uma célula por um método convencional e, em seguida, marcado, ou pode ser um que é amplificado por um método de amplificação de ácidos nucleicos, tal como a PCR, utilizando o ácido nucleico como molde. Neste último caso, após a realização do método de agitação da presente invenção, a sensibilidade de medição pode ser largamente melhorada. Nos casos em que um produto da amplificação de um ácido nucleico é usado como substância teste, após a realização da amplificação na presença de trifosfato de nucleosídeo marcado com uma substância fluorescente ou similar, o ácido nucleico amplificado resultante pode ser marcado. Além disso, nos casos em que a substância teste é um antígeno ou um anticorpo, o antígeno ou o anticorpo utilizado como substância teste pode ser marcado diretamente por um método convencional. Alternativamente, pode também ser empregado um método em que, após a ligação do antígeno ou do anticorpo da substância teste com uma substância de ligação seletiva, o suporte é lavado e o anticorpo ou antígeno marcado é submetido a reação antígeno-anticorpo com o antígeno ou anticorpo, seguido pela medição do marcador ligado ao suporte. Além disso, nos casos em que um ácido nucleico não amplificado é usado como substância teste, pode ser preferivelmente utilizado, por exemplo, um método no qual após a remoção do grupo fosfato da extremidade 5' do ácido nucleico com fosfatase alcalina, a substância teste marcada com uma substância fluorescente é deixada reagir com uma substância de ligação seletiva e o marcador ligado é então mensurado, ou um

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18/49 método em que após a captura da substância teste por uma substância de ligação seletiva (sonda de captura), uma sonda de detecção marcada com uma substância fluorescente ou similar é deixada se ligar à substância teste e a sonda de detecção é então mensurada (método de hibridização tipo sanduíche).

[053] No método de agitação de uma solução de acordo com a presente invenção, uma substância submetida a marcação descrita acima, a amplificação e similares são dissolvidos em uma solução aquosa, um tampão apropriado ou similar para preparar uma solução contendo a substância teste (solução da substância teste).

[054] No método de agitação de uma solução de acordo com a presente invenção, a solução da substância teste é injetada no(s) espaço(s) da(s) reentrância(s) de análise do chip de modo a que o(s) espaço(s) da(s) reentrância(s) é(são) parcialmente deixado(s) não preenchidos, de modo que um espaço não preenchido com a solução da substância teste é formado na(s) reêntrância(s). Por não preencher completamente o(s) espaço(s) da(s) reentrância(s) com a solução da substância teste de modo a formar um espaço não preenchido com a solução da substância teste, esta se movimenta nos espaço vazios dentro de cada reentrância quando o chip de análise é rotacionado, e desse modo a solução da substância teste pode ser agitada. Quando o chip de análise é rotacionado, o espaço não preenchido formado em cada reentrância pode existir como um espaço único, ou pode existir como uma pluralidade de espaços divididos, ou seja, como uma pluralidade de bolhas de ar.

[055] Para a relação entre o espaço não preenchido com a solução da substância teste e o(s) espaço(s) da(s) reentrância(s), o limite inferior do mesmo não é, de preferência, inferior a 10%, e mais preferivelmente não menos do que 20%, e o limite superior do mesmo é preferencialmente não

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19/49 superior a 90%, mais preferivelmente não superior a 80%, ainda mais preferivelmente não superior a 70%. A relação entre o espaço não preenchido com a solução da substância teste está preferencialmente no intervalo de 10% a 90%, mais preferencialmente de 15% a 80%, ainda mais preferencialmente de 20% a 70%. Quando esta relação é inferior a 5%, a solução da substância teste não é suficiente para se mover dentro do espaço durante a rotação do chip de análise, de modo que a solução da substância teste não pode ser substancialmente agitada. Por outro lado, quando a proporção é superior a 90%, a possibilidade de que a solução contendo a substância teste entre em contato com a região onde a substância de ligação seletiva está imobilizada é reduzida, o que impede o progresso da reação. Além disso, nos casos em que tal chip de análise com uma reentrância profunda, tal como mostrado na fig. 3, é rotacionado sem a montagem de uma tampa, a relação de espaço não preenchido com a solução da substância teste é, por exemplo, preferencialmente de 30% a 90%, mais preferencialmente de 40% a 80%.

[056] No método de agitação de uma solução de acordo com a presente invenção, o chip de análise no qual uma solução que contém a substância teste é injetada é submetido a rotação para agitar a solução. O termo “rotação” utilizado na presente invenção significa que o próprio chip de análise é rotacionado em torno de um eixo de rotação pelo movimento circular ou movimento elíptico. Mais particularmente, o termo “rotação” utilizado na presente invenção refere-se a um modo de rotação que é realizado de tal maneira que o movimento circular possui o mesmo raio com um centro de rotação único e o mesmo raio é observado para qualquer ponto arbitrário do chip de análise. A Fig. 7 mostra um exemplo de realização da rotação de acordo com a presente invenção. No que diz respeito aos pontos arbitrários A e B sobre um chip de análise (10), o ponto A roda a uma velocidade de rotação fixa em uma órbita circular com o seu centro em OA e um raio, r. Da mesma

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20/49 maneira, o ponto B também roda a uma velocidade de rotação fixa em uma órbita circular com o seu centro em OB e um raio, r. Neste caso, as linhas retas AB que conectam os pontos arbitrários A e B sobre o chip de análise são sempre paralelas em uma órbita arbitrária do movimento circular. Por exemplo, na fig. 7, mesmo quando o chip de análise (10) está localizado em qualquer uma das posições P1, P2, P3 e P4, as linhas retas AB são paralelas entre si. Por outro lado, nos casos em que o modo de rotação inclui a revolução tal como a rotação orbital ou revolução rotativa, conforme mostrado na fig. 8, as distâncias entre o centro de rotação, O, e os respectivos pontos arbitrários A e B sobre o chip de análise (10) (ra, rb) são diferentes. Ou seja, no modo de rotação que inclui a revolução, o raio do movimento circular de rotação varia, dependendo da posição no chip de análise.

[057] Quando o chip de análise é rotacionado, prefere-se que o chip de análise esteja disposto de tal modo que a sua superfície sobre a qual a substância de ligação seletiva é imobilizada seja paralela ou substancialmente paralela ao plano de rotação.

[058] Nos casos em que um chip de análise com diversas reentrâncias nas quais a solução que contém a substância teste é injetada é utilizado, uma vez que a solução nas respectivas reentrâncias pode ser agitada sob as mesmas condições, rodando o chip de análise, a reação entre a substância de ligação seletiva e a substância teste nas respectivas reentrâncias também pode ser realizada sob as mesmas condições, de modo que a variação da reação entre as reentrâncias possa ser preferencialmente reduzida. Por outro lado, nos casos em que a agitação é realizada por um método de rotação de revolução, onde o chip de análise é rotacionado ao mesmo tempo que está sendo revolvido ou um método de revolução em que o centro de rotação está localizado fora do chip de análise, uma vez que as diversas reentrâncias são agitadas sob diferentes condições, podem ocorrer

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21/49 variações de reação entre as reentrâncias.

[059] A direção da rotação do plano de rotação do chip de análise não se encontra particularmente restringido e o chip de análise pode ser rotacionado, por exemplo, na direção horizontal ou substancialmente horizontal, no sentido inclinado a 15° em relação à direção horizontal, no sentido inclinado a 30° em relação à direção horizontal, no sentido inclinado a 45° em relação à direção horizontal, no sentido inclinado a 60° em relação à direção horizontal, no sentido inclinado a 75° em relação à direção horizontal, ou no sentido vertical ou substancialmente vertical. A direção do plano de rotação está preferencialmente na direção horizontal ou substancialmente horizontal. Aqui, o termo “substancialmente horizontal” significa uma direção que é quase horizontal com a superfície do chip de análise no qual a substância de ligação seletiva é imobilizada e que é de preferência, por exemplo, uma direção inclinada em um intervalo de 0°C a 3°C em relação ao plano horizontal. Além disso, o termo “substancialmente vertical” significa uma direção que é quase vertical em relação à superfície do chip de análise no qual a substância de ligação seletiva é imobilizada e que é de preferência, por exemplo, uma direção inclinada em um intervalo de 0°C a 3°C em relação ao plano vertical.

[060] Na presente invenção, o chip de análise pode ser rotacionado a uma velocidade de rotação constante ou em taxas de rotação diferentes. Alternativamente, o chip de análise pode ser rotacionado de forma intermitente, por exemplo, parando a rotação durante um certo período de tempo. Além disso, a direção da rotação não está particularmente restrita e pode estar no sentido horário ou anti-horário, ou uma combinação dos mesmos.

[061] O tempo da rotação do chip de análise para a realização da reação não é particularmente restringida e pode ser adequadamente

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22/49 determinada dentro de um intervalo que é suficiente para permitir que a substância de ligação seletiva e a substância teste reaja entre si. Por exemplo, nos casos em que a substância teste é um ácido nucleico, o tempo de rotação pode ser ajustado de acordo com o tempo necessário para que a reação de hibridização ocorra entre o ácido nucleico e uma sonda de ácido nucleico que é a substância de ligação seletiva. O método de agitação de uma solução de acordo com a presente invenção é caracterizado pelo fato de que, pela aplicação de uma aceleração centrífuga não inferior a 1 χ g no momento da rotação do chip de análise, a reação seletiva entre a substância teste e a substância de ligação seletiva pode eficazmente ser acelerada e a substância teste pode, portanto, ser detectada ou quantificada em um curto período de tempo. Tirando proveito desta característica, especialmente nos casos em que a detecção ou quantificação de exigida de maneira rápida, tal como quando o chip de análise é usado em um aplicativo diagnóstico de exame, é preferível que o chip de análise seja rotacionado por um tempo curto. Por exemplo, no caso da hibridização de ácidos nucleicos, o tempo de reação é preferencialmente de 3 horas a 4 horas, mais preferencialmente de 2 horas ou ainda mais curto, mais preferivelmente de 1 hora ou menos, preferencialmente 0,5 hora ou menos.

[062] De modo geral, a aceleração centrífuga representa, em um sistema de movimento rotativo, o tamanho da força centrífuga aplicada a um objeto na forma de aceleração e a aceleração centrífuga é proporcional ao valor absoluto da distância do centro de rotação e o quadrado da velocidade angular do movimento rotacional. Na presente invenção, a aceleração centrífuga, uma força centrífuga, ou seja, uma força centrífuga relativa (RCF), é calculada pela seguinte equação 1.

RCF = 1,118 χ R χ N2 χ 10-8 (Equação 1)

RCF: força centrífuga relativa (χ g)

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R: raio de rotação (cm)

N: velocidade de rotação (rpm) [063] No método de agitação de uma solução de acordo com a presente invenção, uma aceleração centrífuga não inferior a 1 x g é aplicada quando o chip de análise é rotacionado. O limite inferior da aceleração centrífuga preferencialmente não é inferior a 5 χ g, preferencialmente, não é inferior a 10 x g. O limite superior da aceleração centrífuga não se encontra particularmente restringido; no entanto, é preferencialmente de 50 x g ou menos, mais preferencialmente de 40 x g ou menos, ainda mais preferencialmente de 30 x g ou menos. A aceleração centrífuga está preferencialmente no intervalo de 1 χ g a 50 x g, mais preferencialmente no intervalo de 5 g χ a 40 χ g, ainda mais preferivelmente de 10 χ g a 30 χ g.

[064] No método de agitação de uma solução de acordo com a presente invenção, a aceleração centrífuga desejada pode ser aplicada de forma adequada pela fixação da velocidade de rotação e do raio de rotação durante a rotação do chip de análise. Portanto, a velocidade de rotação e o raio de rotação pode ser escolhido de acordo com as especificações do dispositivo de agitação usadas para agitar o chip análise. Por exemplo, quando o raio de rotação é pequeno, uma grande aceleração centrífuga pode ser transmitida através do aumento da velocidade de rotação.

[065] O valor do raio de rotação pode ser adequadamente selecionado, em combinação com a velocidade de rotação de tal modo que a aceleração centrífuga desejada seja atingida. O limite inferior do raio de rotação preferencialmente não é menor que 0,1 mm, mais preferencialmente não é menor que 0,2 mm, ainda mais preferencialmente não é menor do que 0,3 mm. Além disso, o limite superior do raio de rotação é de preferência de 20 mm ou menos, mais preferencialmente de 10 mm ou menos, ainda mais preferencialmente de 5 mm ou menos. O raio de rotação está, portanto, na

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24/49 faixa de 0,1 a 20 mm, mais preferencialmente de 0,2 a 10 mm, ainda mais preferencialmente de 0,3 a 5 mm. Quando o raio de rotação é maior que 20 mm, visto que a força centrífuga é predominante, o espaço não preenchido com a solução da substância teste tende a ser empurrado contra a periferia da reentrância, de modo que a eficiência de agitação pode ser reduzida e variações na agitação podem ocorrer dentro de uma reentrância. Entretanto, quando o raio de rotação é inferior a 0,1 mm, uma vez que a força que atua na direção da rotação é predominante, o espaço não preenchido com a solução da substância teste tende a permanecer na parte central da reentrância, de modo que a eficiência da agitação pode ser reduzida e variações na agitação podem ocorrer.

[066] Além disso, o valor da velocidade ou velocidade de rotação também pode ser apropriadamente selecionado juntamente com o raio de rotação de tal modo que a aceleração centrífuga desejada seja atingida, e que é de preferência de 500 rpm a 10.000 rpm, mais preferencialmente de 750 rpm a 8000 rpm. O menor o raio de rotação é o mais preferido, isto porque o aparelho de reação e o aparelho de agitação pode ter seus tamanhos reduzidos e o aparelho para realizar o método de agitação de uma solução de acordo com a presente invenção pode ser feito na forma compacta.

[067] Nos casos em que o chip de análise é rotacionado sem montagem de uma tampa, a fim de evitar o derramamento da solução da substância teste injetada, um aparelho de agitação com um pequeno raio de rotação é preferencialmente utilizado. Por exemplo, o raio de rotação é de preferência de 0,1 mm a 5 mm, mais preferencialmente de 0,2 mm a 4 mm, ainda mais preferencialmente entre 0,3 mm a 3 mm.

[068] O aparelho de agitação usado na presente invenção para agitar o chip de análise não se encontra particularmente restringido,

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25/49 desde que seja capaz de proporcionar uma aceleração centrífuga não inferior a 1 x g pela combinação da velocidade de rotação e raio de rotação. Como produto comercialmente disponível, um agitador de placas pode ser preferencialmente utilizado, e exemplos destes incluem: “BioShake 5000 olmo”, “BioShake 3000-T olmo” e “BioShake 3000 olmo” (todos os quais são produzidos por Q. Instruments GmbH) ; “Monoshake”, “Teleshake” e “Teleshake 1536” (todos os quais são fabricados pela Thermo Fisher Scientific, Inc.); “MS3 base”, “MS3 digital”, “base Vibrax VXR” (marca registrada) e “VORTEX 3” (todos fabricados pela IKA); “Micro agitador de placas N-704” (fabricado pela Nissinrika Co., Ltd.); “Agitador de placas KM-M01” (fabricado pela Kajixx Corporation); e “Placa Misturador P10” (fabricado pela Juji Field Inc). Nos casos em que o aparelho de agitação está integrado a um sistema automatizado, o aparelho é preferencialmente um cuja velocidade de rotação, tempo de funcionamento e similares, podem ser controlados pela parte externa.

[069] Na presente invenção, um elemento de agitação pode também ser adicionado ao espaço no interior da(s) reentrância(s). Exemplos de elemento de agitação incluem partículas (grânulos) e microrods (micro-hastes), sendo as partículas particularmente preferidas. A forma das partículas e microrods não é particularmente restringidas, desde que ela permita que as partículas e os microrods se desloquem dentro da(s) reentrância(s) de análise do chip, e assim, agitando a solução que contém a substância teste. No caso das partículas, elas podem ter uma forma esférica e uma forma poligonal, e no caso de microrods, eles podem ter uma forma arbitrária, tal como uma forma cilíndrica ou uma forma prismática; no entanto, o elemento de agitação tem preferencialmente uma forma esférica. Além disso, o tamanho das partículas também não é particularmente restringido; no entanto, por exemplo, no caso de partículas

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26/49 esféricas, o diâmetro destas pode ser ajustado para o intervalo de 0,1 pm a 1000 pm e, levando em conta a eficiência de agitação, o diâmetro é de um modo mais preferido de 50 pm a 500 pm. No caso de microrods, o diâmetro e comprimento pode ser preferencialmente definido nas faixas de 50 pm a 5000 pm e de 10 pm a 300 pm, respectivamente. Do ponto de vista da eficiência da agitação e similares, um único tipo de partículas ou microrods pode ser selecionado para utilização, ou dois ou mais tipos de partículas ou microrods podem ser utilizados em combinação.

[070] O material das partículas e microrods descritos acima também não é particularmente restringido e, por exemplo, pode ser utilizado vidro, cerâmica (por exemplo, zircônio parcialmente estabilizado com ítria), metais (por exemplo, ouro, platina e aço inoxidável) e plástico (por exemplo, nylons e poliestirenos).

[071] O chip de análise usados na presente invenção podem também compreender saliência(s) para imobilizar a substância de ligação seletiva à superfície superior do mesmo. Ao utilizar um chip de análise possuindo tal estrutura na análise de uma substância teste, na detecção de um sinal o digitalizador (scanner) pode ser focado sobre a superfície superior da(s) saliência(s) onde a substância de ligação seletiva é imobilizada, de modo que a detecção de ruído pode ser amplamente reduzido e a relação S/N pode ser melhorada. Além disso, o chip de análise utilizado na presente invenção é preferencialmente produzido a partir de um material capaz de reduzir a autofluorescência e, por exemplo, pelo menos uma parte da(s) saliência(s) onde a substância de ligação seletiva deve ser imobilizado é de preferência de cor preta.

[072] Na presente invenção, como um índice para indicar a sensibilidade de detecção do sinal, a relação S/N (relação sinal/ruído) pode ser utilizada. Neste caso, é preferível que a sensibilidade seja julgada possuindo

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27/49 uma S/N = 2 como limiar de detecção. Em geral, a concentração ou a quantidade de uma substância teste na qual a relação S/N se torna superior a 2 a 3 é adotada como o limiar de detecção e, quando a relação S/N é 2 ou superior, pode ser julgado que a detecção fiável foi obtida em um nível limiar de detecção ou superior (por exemplo, Makoto Niwa, “Korenara Wakaru Kagakuno Tameno Toukei Shuhou - Tadashii Data no Atsukaikata-“, 2008, editado por Kagaku-Dojin Publishing Company, Inc., p.101).

[073] No método de agitação de uma solução de acordo com a presente invenção, uma vez que o progresso da reação seletiva entre uma substância de ligação seletiva imobilizada no chip de análise e uma substância teste pode ser acelerado, em comparação com os métodos convencionais, a substância teste pode ser detectada ou quantificada em um curto espaço de tempo. Por exemplo, a hibridização de ácidos nucleicos, o tempo de reação, que convencionalmente exigia 6 a 20 horas, pode ser largamente reduzido. Portanto, por exemplo, quando é efetuada uma análise utilizando um chip de análise na área de análise e diagnóstico, onde é necessário que um grande número de amostras seja analisado de imediato, é preferível utilizar o método de agitação de uma solução de acordo com a presente invenção. O método de agitação de uma solução de acordo com a presente invenção pode ser preferencialmente utilizado na análise e no diagnóstico de doenças infecciosas, tais como influenza, sépsis e semelhantes. Além disso, tambémno processamento de um grande número de amostras em um centro de análise, a partir do ponto de vista de redução de custos, a presente invençãoé preferencialmente aplicada, uma vez que permite realizar rapidamentea análise.

Exemplos [074] A presente invenção será agora descrita em maiores detalhes por meio de exemplos. No entanto, a presente invenção não está

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28/49 restrita aos exemplos a seguir.

Exemplo de Referência 1 (1) Preparação do substrato do Chip de Análise [075] Utilizando um processo LIGA (Lithographie

Galvanoformung Abformung) conhecido, um molde para moldagem por injeção foi preparado e um substrato feito de polimetilmetacrilato (PMMA), que tinha a forma descrita abaixo, foi obtido pela moldagem por injeção. O peso molecular médio do PMMA utilizado na presente invenção foi de 50.000 e o carbono negro (#3050B, fabricado pela Mitsubishi Chemical Corporation), foi incorporado o PMMA em uma quantidade de 1% em peso, para tornar o substrato em cor preta. Quando a refletância e a transmissão espectral do substrato preto assim obtido foram mensuradas, a refletância foi encontrado como sendo de 5% ou menos, em qualquer comprimento de onda na faixa da luz visível (comprimento de onda de 400 nm a 800 nm) e a transmissão foi encontrado como sendo de 0,5% ou menos no mesmo intervalo de comprimento de onda. Nem a refletância nem a transmissão espectral tinham um padrão espectral especial (tal como um pico) na faixa de luz visível e o espectro foi uniformemente plano. Aqui, a refletância espectral foi mensurada para a luz refletida regularmente a partir do substrato utilizando um aparelho (CM-2002, fabricado pela Minolta Camera Co., Ltd.) equipado com um sistema óptico de recepção de luz de acordo com a condição C da JIS Z8722.

[076] O substrato usado aqui possui dimensões externas de 76 mm de comprimento, 26 mm de largura e 1 mm de espessura e uma reentrância de 6,48 mm de comprimento, 6,90 mm de largura e 0,12 mm de profundidade, na qual saliências 576 na reentrância de 0,1 mm de diâmetro e 0,12 mm de altura foram formadas (doravante, este substrato é referido como “substrato A”). Neste substrato A, a diferença de altura entre a superfície superior das saliências e a superfície superior da parte plana era de 3 pm ou

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29/49 menos. Além disso, a variação da altura das superfícies superiores nas saliências era de 3 pm ou menos, e as saliências foram formadas com um passo de 0,18 mm.

[077] O substrato A descrito acima foi imerso em solução de hidróxido de sódio aquoso 10N, durante 12 horas a 70°C. O substrato A resultante foi sequencialmente lavado com água pura, solução aquosa de HCl 0,1N e água pura, gerando, assim, os grupos carboxila na superfície do substrato.

(2) IMOBILIZAÇÃO DA SUBSTÂNCIA DE LIGAÇÃO SELETIVA [078] Sobre o substrato A, oligonucleotídeos foram imobilizados como as respectivas substâncias de ligação seletiva (sondas de DNAs) sob as seguintes condições. Como oligonucleotídeos que correspondem a quatro genes de a d, foram utilizados os oligonucleotídeos com as sequências de bases mostradas na SEQ ID NOs: 1 a 4 (fabricados pela Operon Biotechnologies Inc.; conjunto de oligonucleotídeos para microarranjos de DNA, “ Homo sapience (humano) AROS V4. 0 (60 bases cada)“). Cada um destes oligonucleotídeos foram dissolvidos em água pura a uma concentração de 0,3 nmol/pL para preparar soluções de estoque. No momento da visualização, as soluções estoque foram diluídas 10 vezes com PBS (preparado por dissolução de 8 g de NaCl, 2,9 g de Na2HPO4 · I2H2O, 0,2 g de KCl e 0,2 g de KH2PO4 completamente em água pura, ajustando o volume para 1 L e, em seguida, ajustando o pH da solução resultante para 5,5 pela adição de ácido clorídrico) a uma concentração final da sonda de DNA de 0,03 nmol/pL. Além disso, a fim de realizar a condensação entre os grupos carboxila gerados na superfície do substrato feito de PMMA e o grupo amino-terminal da sonda de DNA, foi adicionado 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) em uma concentração final de 50 mg/mL. Em seguida, utilizando um arrayer (observador) (“Gene Stamp-II”, fabricado pela Nippon Laser & Electronics Lab),

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30/49 as soluções resultantes foram visualizadas nas superfícies superiores das saliências do substrato A, para preparar um substrato sobre o qual a sonda correspondendo para o gene que possui a sequência de bases mostrada na SEQ ID NO: 1 foi visualizado a N = 4 (a seguir, referido como “chip de análise 1”) e um substrato sobre o qual as sondas correspondentes aos genes de b a d e possuindo as sequências de bases mostradas na SEQ ID NOs: 2 e 4 foram cada visualizados em N = 2 (a seguir, referido como “chip de análise 2”).

[079] Depois disso, os substratos visualizados foram colocados em um recipiente de plástico vedado e incubados sob condições de 37°C e 100% de umidade durante cerca de 20 horas. Finalmente, os substratos resultantes foram lavados com água pura e secados por centrifugação através de um secador rotativo.

(3) Fixação do Elemento Tampa ao substrato do Chip de Análise [080] Para cada um dos chips de análise descritos acima 1 e 2 imobilizados com a substância de ligação seletiva, um elemento tampa foi acoplado da seguinte forma. O elemento tampa foi preparado cortando uma placa de PMMA. No elemento tampa assim obtido foram feitos orifícios de passagem e câmaras de retenção de nível líquido. Como elemento adesivo, uma fita adesiva de dupla face foi colada sobre o elemento tampa, de tal maneira que a fita foi laminada ao longo da margem do elemento de tampa com uma espessura de 50 pm, e o elemento tampa foi então acoplado ao Chip de Análises 1 e 2.

(4) Preparação da Substância Teste [081] A substância teste foi preparada usando um RNAa (RNA antisense), vulgarmente utilizado como uma substância teste de microarranjo. A partir de 5 pg de RNA total comercialmente disponível derivado de células humanas cultivadas (“RNA humano de referência”, fabricado pela Clontech Laboratories, Inc.), um RNAa foi preparado usando um kit de preparação RNAa

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31/49 fabricado pela Ambion, “Kit MessageAmp II RNAa Amplification’’ , e este RNAa foi marcado com fluorescência usando o Cy5 (fabricado pela GE Healthcare) para se obter um RNAa marcado com Cy5.

(5) Solução de reação para a hibridização entre a substância de ligação SELETIVA E A SUBSTÂNCIA TESTE [082] Nos seguintes exemplos e exemplos comparativos, a menos que especificado de outra forma, foi usada uma solução obtida pela diluição do RNAa marcado preparado acima com uma solução de hibridização contendo 1% em peso de BSA, 5 x SSC, 0,01% em peso de DNA de esperma de salmão e 0,1% em peso de SDS (todas as concentrações são concentrações finais).

Exemplo 1 [083] Em uma solução contendo 100 ng do RNAa marcado com Cy5 descrito no Exemplo de Referência 1, foi misturada a solução de hibridização com um volume de 25 pL para preparar uma solução da substância teste. Em seguida, 10 pL da solução da substância teste assim obtida foram injetados ao chip de análise 1. O espaço da reentrância que não foi preenchido com a solução da substância teste tinha um volume de aproximadamente 3 pL e a relação entre o espaço não preenchido com o solução da substância teste na reentrância foi de cerca de 23%. Preparou-se um total de seis conjuntos de chips de análise 1 descrito acima. Com os orifícios de injeção selados e a reentrância bem fechada, os chips de análise foram colocados em um aparelho de agitação “BioShake 5000” (fabricado pela Q. Instruments GmbH; velocidade de rotação máxima: 5.000 rpm, raio de rotação: 0.6 mm), que foi colocado em um forno com uma temperatura controlada de 37°C. Em seguida, cada um dos chips de análise foram agitados a 5000 rpm durante 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h ou 16 h para realizar reação. Neste processo, uma aceleração centrífuga de cerca de 17,7 x g foi aplicada a cada

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32/49 chip de análise. Para cada um dos chips de análise resultante, a intensidade de sinal (intensidade de fluorescência) do RNAa hibridizado marcado foi medida usando um detector de fluorescência de alta-resolução (“3D-Gene (marca registrada) scanner’, fabricado pela Toray Industries, Inc.) . Os resultados encontram-se indicados nas Figs. 9 e 10 e na Tabela 1 Um sinal com uma intensidade no valor limiar (ponto branco médio + 2DP) ou superior foi detectado 0,5 h após o início da reação; Portanto, foi demonstrado que a reação prosseguiu rapidamente.

Exemplo 2 [084] A solução da substância teste foi injetada ao chip de análise 1s (conjuntos de 6) da mesma forma que no Exemplo 1. Os chips de análise resultantes foram colocados em um aparelho de agitação “BioShake 5000”, que foi colocado em um forno em uma temperatura controlada de 37°C, e, em seguida, cada chip foi agitado a 3000 rpm durante 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h ou 16 h para efetuar a reação. Neste processo, uma aceleração centrífuga de cerca de 6,04 x g foi aplicada a cada chip de análise. Para cada um dos chips de análise, a intensidade do sinal (intensidade de fluorescência) do RNAa hibridizado marcado foi medida usando um detector de fluorescência de altaresolução. Os resultados estão indicados nas Figs. 9 e 10 e na Tabela 1 Um sinal possuindo a intensidade do valor limiar ou superior foi detectado 0,5 h após o início da reação; Portanto, foi demonstrado que a reação prosseguiu rapidamente.

Exemplo 3 [085] A solução da substância teste foi injetada ao chip de análise 1s (6 conjuntos) da mesma forma que no Exemplo 1 Os chips de análise resultantes foram colocados em um aparelho de agitação “MS3 digital” (fabricado pela IKA; velocidade de rotação máxima:. 3.000 rpm, raio de rotação: 2,25 mm), que foi colocado em um forno com uma temperatura

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33/49 controlada de 37°C, e, em seguida, cada chip foi agitado a 3000 rpm durante 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h ou 16 h para realizar reação. Neste processo, uma aceleração centrífuga de cerca de 22,6 x g foi aplicada a cada chip de análise. Para cada um dos chips de análise, a intensidade de sinal (intensidade de fluorescência) do RNAa hibridizado marcado foi medida usando um detector de fluorescência de alta-resolução. Os resultados estão indicados nas Figs. 9 e 10 e na Tabela 1. Um sinal possuindo uma intensidade do valor limiar ou superior foi detectado 0,5 h após o início da reação; Portanto, foi demonstrado que a reação prosseguiu rapidamente.

Exemplo 4 [086] A solução da substância teste foi injetada ao chip de análise 1s (6 conjuntos) da mesma forma que no Exemplo 1. Os chips de análise resultantes foram colocados em um aparelho de agitação “MS3 digital”, que foi colocado em um forno com uma temperatura controlada de 37°C, e, em seguida, cada chip foi agitado a 1000 rpm durante 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h ou 16 h para realizar reação. Neste processo, uma aceleração centrífuga de cerca de 2,52 x g foi aplicada a cada chip de análise. Para cada um dos chips de análise, a intensidade do sinal (intensidade de fluorescência) do RNAa hibridizado marcado foi medida usando um detector de fluorescência de altaresolução. Os resultados estão indicados nas Figs. 9 e 10 e na Tabela 1 Um sinal possuindo uma intensidade do valor limiar ou superior foi detectado 0,5 h após o início da reação; Portanto, foi demonstrado que a reação prosseguiu rapidamente.

Exemplo Comparativo 1 [087] A solução da substância teste foi injetada ao chip de análise 1s (6 conjuntos) da mesma forma que no Exemplo 1. Os chips de análise resultantes foram colocados em um aparelho de agitação “BioShake 5000”, que foi colocado em um forno com uma temperatura controlada de

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37°C, e, em seguida, cada chip foi agitado a 1000 rpm durante 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h ou 16 h para realizar reação. Neste processo, uma aceleração centrífuga de cerca de 0.671 x g foi aplicada a cada chip de análise. Para cada um dos chips de análise, a intensidade do sinal (intensidade de fluorescência) do RNAa hibridizado marcado foi medida usando um detector de fluorescência de altaresolução. Os resultados estão indicados nas Figs. 9 e 10 e na Tabela 1. 0,5 hora após o início da reação, nenhum sinal possuindo uma intensidade do valor limiar ou superior foi detectado. Um sinal possuindo uma intensidade do valor limiar ou superior foi detectado após 1 hora a partir do início da reação.

Exemplo Comparativo 2 [088] A solução da substância teste foi injetada ao chip de análise 1s (6 conjuntos) da mesma forma que no Exemplo 1. Os chips de análise resultantes foram colocados em um aparelho de agitação “BioShake 5000”, que foi colocado em um forno com uma temperatura controlada de 37°C, e, em seguida, cada um foi agitado a 250 rpm durante 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h ou 16 h para realizar reação. Neste processo, uma aceleração centrífuga de cerca de 0.042 x g foi aplicada a cada chip de análise. Para cada um dos chips de análise, a intensidade do sinal (intensidade de fluorescência) do RNAa hibridizado marcado foi medida usando um detector de fluorescência de altaresolução. Os resultados estão indicados nas Figs. 9 e 10 e na Tabela 1. 0,5 hora após o início da reação, nenhum sinal possuindo uma intensidade do valor limiar ou superior foi detectado. Um sinal possuindo uma intensidade do valor limiar ou superior foi detectado após 1 hora a partir do início da reação.

Exemplo Comparativo 3 [089] A solução da substância teste foi injetada ao chip de análise 1s (6 conjuntos) da mesma forma que no Exemplo 1. Os chips de análise resultantes foram colocados em um aparelho de agitação “MS3 digital”, que foi colocado em um forno com uma temperatura controlada de 37°C, e, em

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35/49 seguida, cada um foi agitado a 250 rpm durante 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h ou 16 h para realizar reação. Neste processo, uma aceleração centrífuga de cerca de 0.157 x g foi aplicada a cada chip de análise. Para cada um dos chips de análise, a intensidade do sinal (intensidade de fluorescência) do RNAa hibridizado marcado foi medida usando um detector de fluorescência de altaresolução. Os resultados estão indicados nas Figs. 9 e 10 e na Tabela 1. 0,5 hora após o início da reação, nenhum sinal possuindo uma intensidade do valor limiar ou superior foi detectado. Um sinal possuindo uma intensidade do valor limiar ou superior foi detectado após 1 hora a partir do início da reação.

Tabela 1

Tempo de reação e intensidade do sinal

Tempo de reação (h)	0,5	1	2	4	8	16
Exemplo 1	52,5	97,8	182,5	232,3	285,5	309,0
Exemplo 2	41,3	85,5	171,3	218,3	279,2	305,4
Exemplo 3	61,7	101,9	192,1	247,9	296,4	312,3
Exemplo 4	35,3	67,5	150,9	193,5	265,4	296,4
Exemplo comparativo 1	22,8	35,3	71,2	136,7	207,2	286,4
Exemplo comparativo 2	17,8	31,2	62,9	108,3	176,1	279,0
Exemplo comparativo 3	20,5	33,9	76,8	145,4	218,9	272,9

Exemplo 5 [090] Em uma solução contendo 60 ng do RNAa marcado com Cy5 descrito no Exemplo de Referência 1, foi misturada a solução de hibridização com um volume de 10 mL, e 6,7 pL da solução resultante foi injetada ao chip de análise 2s (2 conjuntos). A quantidade de RNAa marcado com Cy5 injetado foi de 40 ng, que foi a mesma quantidade utilizada nos Exemplos 1 a 4. O espaço da reentrância que não foi preenchido com a solução da substância teste tinha um volume de aproximadamente 6,3 pL e a

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36/49 relação entre o espaço não preenchido com a solução da substância teste e o espaço total da reentrância foi de cerca de 48%. Da mesma maneira que no Exemplo 1, os chips de análise foram colocados em um aparelho de agitação “BioShake 5000” e agitados a 5000 rpm durante 1 hora para realizar reação. Para cada um dos chips de análise, as intensidades de sinal (as intensidades de fluorescência) do RNAa marcado que hibridizou com os três genes de b a d foram mensuradas utilizando um detector de fluorescência de alta-resolução. Os resultados estão indicados na Tabela 2. Após 1 hora de tempo de reação, os sinais de todos os genes tinham uma intensidade do valor limiar ou superior e, portanto, foram eficazes.

Exemplo 6 [091] Em uma solução contendo 60 ng do RNAa marcado com Cy5 descrito no Exemplo de Referência 1, foi misturada a solução de hibridização com um volume de 15 mL, e 10 pL da solução resultante foi injetada ao chip de análise 2s (2 conjuntos). A quantidade de RNAa marcado com Cy5 injetado foi de 40 ng, que foi a mesma quantidade utilizada nos Exemplos 1 a 4. O espaço da reentrância que não foi preenchido com a solução da substância teste tinha um volume de aproximadamente 6,3 pL e a relação entre o espaço não preenchido com a solução da substância teste e o espaço total da reentrância foi de aproximadamente 23%. Da mesma maneira que no Exemplo 1, os chips de análise foram colocados em um aparelho de agitação “BioShake 5000” e agitados a 5000 rpm durante 1 hora para realizar reação. Para cada um dos chips de análise, as intensidades de sinal (as intensidades de fluorescência) do RNAa marcado que hibridizou com os três genes de b a d foram mensuradas utilizando um detector de fluorescência de alta-resolução. Os resultados estão indicados na Tabela 2. Após 1 hora de tempo de reação, os sinais de todos os genes tinham uma intensidade do valor limiar ou superior e, portanto, foram eficazes.

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Exemplo comparativo 4 [092] Em uma solução contendo 60 ng do RNAa marcado com

Cy5 descrito no Exemplo de Referência 1, foi misturada a solução de hibridização com um volume de 20 pL, e 13 pL da solução resultante foi injetada aos chips de análise 2s (2 conjuntos) para preencher a reentrância de cada chip de análise (a razão entre o espaço não preenchido com a solução da substância teste em relação a toda a reentrância foi de 0%). Da mesma maneira que no Exemplo 1, os chips de análise foram colocados em um aparelho de agitação “BioShake 5000” e agitados a 5000 rpm durante 1 hora para realizar reação. Para cada um dos chips de análise, as intensidades de sinal do RNAa marcado que hibridizou com os três genes de b a d foram mensuradas utilizando um detector de fluorescência de alta-resolução. Os resultados estão indicados na Tabela 2, após 1 hora de tempo de reação, o sinal do gene b teve a intensidade do valor limiar ou superior e, portanto, foi eficaz. No entanto, a intensidade do sinal foi mais fraca do que aquela mensurada nos Exemplos 5 e 6. Além disso, as intensidades de sinal dos genes c e d foram menores do que o valor limiar e, portanto, inválidas.

Tabela 2

Índice de espaço não preenchido com solução da substância teste na reentrância e intensidade de sinal de cada gene

	Exemplo 5	Exemplo 6	Exemplo Comparativo 4
Relação do espaço não preenchido com solução da substância teste na reentrância	48	23	0
Gene b	430,3	361,0	151,6
432,2	343,9	155,4
Gene c	139,3	129,2	107,6
147,3	132,5	107,6
Gene d	148,7	126,3	999
150,6	136,5	101,7
Valor limiar (média + 2DP)	111,0	107,7	108,8

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Exemplo de referência 2 (1) Preparação de substrato Do Chip de análise [093] Usando o mesmo material que foi utilizado no Exemplo de Referência 1, um substrato com as dimensões externas de 76 mm de comprimento, 26 mm de largura e 2,5 mm de espessura, foi preparado pela moldagem por injeção. Nesta substrato, quatro reentrâncias elípticas possuindo um lado maior de 4,8 mm, um lado mais curto de 2,40 mm e uma profundidade de 1,5 mm, foram formadas e, em cada uma das reentrâncias, 98 saliências de 0,1 mm de diâmetro e 0,12 mm de altura foram formadas (a seguir, este substrato é referida como “substrato B”). Nesta substrato B, o volume das reentrâncias foi de cerca de 13,5 pL. A diferença de altura entre as superfícies superiores das saliências e a superfície superior da parte plana e a variação da altura das superfícies superiores das saliências eram ambos de 3 um ou menos. Além disso, as saliências foram formadas com um passo de 0,18 mm.

(2) Imobiliza ção da substância de ligação seletiva (sonda de captura) [094] Pelo mesmo método de preparação utilizado no Exemplo de Referência 1, como substância de ligação seletiva (sonda de captura), um oligonucleotídeo modificado com um grupo amino na extremidade 5', que foi descrito em um artigo relatando a pesquisa sobre a diferenciação dos tipos de papilomavírus humano (J. Clin Microbiol, 1995 p.901-905) e possuía a sequência de bases mostrada na SEQ ID NO: 5 (uma sequência complementar a uma parte da sequência da região do gene L1 do papilomavírus humano tipo 16, foi usada como uma substância teste), foi sintetizado. O oligonucleotídeo assim obtido foi marcado e imobilizado em 22 das 98 saliências do substrato B para se obter um chip de análise (daqui em diante denominado “chip de análise 3”).

(3) Preparação da substância teste [095] Como substância teste, um plasmídeo recombinante

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39/49 adquirido da Health Science Research Resources Bank (pHPV16 (comprimento completo: 16.600 pares de bases), em que o DNA genômico do papilomavírus humano foi clonado, foi submetido a fragmentação ultrassônica. A fragmentação resultante foi diluída com solução de hibridização 1x (1% em peso de albumina de soro bovino (BSA), 5 x SSC, 1% em peso de dodecil sulfato de sódio (SDS), 50 ng/mL de solução de DNA de esperma de salmão, 5% em peso de dextrano-sulfato de sódio e 30% de formamida) a uma concentração de ácido nucleico de 0,1 amol/pL, preparando-se assim uma solução de DNA da amostra.

(4) Preparação das soluções de sonda de detecção [096] Como sondas de detecção para uso na hibridização tipo sanduíche, foram sintetizadas sondas MY11 (SEQ ID NO: 6; baseada na posição da base da extremidade 5', quando a substância teste ligada com a sonda de captura, de uma sequência complementar à das bases 50 a 69 na extremidade 5'), GP5 (SEQ ID NO: 7, similarmente ao MY11, a sequência complementar para as bases 10 a 34 na extremidade 5'), GP6 (SEQ ID NO: 8; baseado no posição da base da extremidade 3' quando a substância teste ligada com a sonda de captura, de uma sequência complementar às bases 60 a 82 na extremidade 3') e MY09 (SEQ ID NO: 9, da mesma forma que GP6, um sequência complementar às bases 340 a 359 na extremidade 3'), marcadas com biotina, tanto na extremidade 3' quanto na extremidade 5'. Estas sondas de detecção foram cada uma diluídas em água esterilizada a uma concentração de 100 pmol para preparar soluções de sonda de detecção.

Exemplo 7 [097] Para 1 pL da solução de amostra de DNA descrita no Exemplo de Referência 2, 1 pL de cada uma das soluções da sonda de detecção descritas no Exemplo de Referência 2, foi adicionado e misturado, e a mistura resultante foi aquecida no termociclador a 95°C durante 5 minutos .

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Depois de deixar a mistura em repouso até que foi arrefecida até à temperatura ambiente, 8 mL de 1 χ solução de hibridização descrita no Exemplo de Referência 2 foram adicionados e misturados, preparando assim cada solução de hibridização contendo a substância teste. A totalidade das respectivas soluções de hibridização contendo a substância teste foi injetada em uma das reentrâncias do chip de análise 3 e a abertura foi vedada com uma película de PET revestida com um adesivo acrílico. Aqui, o espaço da reentrância que não foi preenchido com a solução tinha um volume de cerca de 3,5 pL e a relação entre o espaço não preenchido e a solução na reentrância foi de cerca de 26%. Por um método de hibridização tipo sanduíche, a detecção da substância teste foi realizada. Os chips de análise foram colocados em um aparelho de agitação “BioShake 5000” (fabricado pela Q. Instruments GmbH), que foi colocado em um forno com uma temperatura controlada de 32°C, e agitados a 3000 rpm durante 2 horas para permitir que a sonda de captura e a substância teste sofressem a reação de hibridização. Neste processo, uma aceleração centrífuga de cerca de 6,04 x g foi aplicada a cada chip de análise. Após a reação, a vedação que cobre a abertura foi removida e os chips de análise foram lavados durante 5 minutos com uma solução de lavagem A aquecida a 30°C (0,5 x SSC e 1% em peso de SDS). Após a secagem dos chips de análise, 10 pL de solução de estreptavidina ficoeritrina 50 ng/pL, o qual foi preparado pela mistura de um reagente de coloração (estreptavidina ficoeritrina) e um diluente (100 mM de MES, 1 M de NaCl, 0,05% em peso de Tween 20 e 2 mg/mL de BSA), foram adicionados gota a gota à reentrância, e os chips de análise foram incubados no escuro a 35°C durante 5 minutos. Subsequentemente, os chips de análise foram lavados durante 5 minutos com uma solução de lavagem B aquecidos a 30°C (6 χ SSPE e 0,01% em peso de Tween-20) e em seguida secos. A intensidade do sinal (intensidade de fluorescência) foi medida usando um detector de fluorescência de alta

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41/49 resolução (“3D-Gene (marca registrada) scanner”, fabricado pela Toray Industries, Inc.). Os valores foram lidos para as saliências nas quais a substância de ligação seletiva foi imobilizada (sinal) e para as saliências nas quais a substância de ligação seletiva não foi imobilizada (ruído) a fim de calcular a relação sinal/ruído (relação S/N). Os resultados estão indicados na Tabela 3. A relação S/N foi de 2,80, que foi maior do que o limiar de detecção S/N = 2.

Exemplo 8 [098] As mesmas operações do Exemplo 7 foram realizadas, com exceção de que a velocidade de rotação do dispositivo de agitação, no momento da realização da reação de hibridização foi alterada para 5000 rpm. Neste caso, a aceleração centrífuga é 16,77 χ g. O resultado do cálculo da relação S/N é mostrado na Tabela 3. A relação S/N foi de 2,53, que foi maior do que o limiar de detecção S/N = 2.

Exemplo comparativo 5 [099] As mesmas operações do Exemplo 7 foram realizadas, com exceção de que a velocidade de rotação do dispositivo de agitação, no momento da realização da reação de hibridização foi alterada para 1000 rpm. Neste caso, a aceleração centrífuga é 0,67 χ g. O resultado do cálculo da relação S/N é mostrado na Tabela 3. A relação S/N foi de 1,56, que foi maior do que o limiar de detecção S/N = 2.

Exemplo 9 [0100] As mesmas operações do Exemplo 7 foram realizadas com exceção de que o “Mix-EVR” (produzido pela Taitec Corporation; velocidade máxima de rotação: 2500 rpm, raio de rotação: 1 mm) foi usado como aparelho de agitação e a velocidade de rotação do dispositivo de agitação, no momento da realização da reação de hibridização foi alterada para 2000 rpm. Neste caso, a aceleração centrífuga é 4,47 χ g. O resultado do cálculo da relação S/N

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42/49 é mostrado na Tabela 3. A relação S/N foi de 2,24, que foi maior do que o limiar de detecção S/N = 2.

Exemplo 10 [0101] As mesmas operações do Exemplo 9 foram realizadas, com exceção de que a velocidade de rotação do dispositivo de agitação, no momento da realização da reação de hibridização foi alterada para 2500 rpm. Neste caso, a aceleração centrífuga é 6,99 χ g. O resultado do cálculo da relação S/N é mostrado na Tabela 3. A relação S/N foi de 2,76, que foi maior do que o limiar de detecção S/N = 2.

Exemplo comparativo 6 [0102] As mesmas operações do Exemplo 9 foram realizadas, com exceção de que a velocidade de rotação do dispositivo de agitação, no momento da realização da reação de hibridização foi alterada para 500 rpm. Neste caso, a aceleração centrífuga é 0,28 χ g. O resultado do cálculo da relação S/N é mostrado na Tabela 3. A relação S/N foi de 1,48, que foi menor do que o limiar de detecção S/N = 2.

Exemplo 11 [0103] As mesmas operações do Exemplo 7 foram realizadas com exceção de que o “MS3 digital” (produzido pela IKA) foi usado como aparelho de agitação e a velocidade de rotação do dispositivo de agitação, no momento da realização da reação de hibridização foi alterada para 2000 rpm. Neste caso, a aceleração centrífuga é 10,06 χ g. O resultado do cálculo da relação S/N é mostrado na Tabela 3. A relação S/N foi de 3,25, que foi maior do que o limiar de detecção S/N = 2.

Exemplo 12 [0104]As mesmas operações do Exemplo 10 foram realizadas, com exceção de que a velocidade de rotação do dispositivo de agitação, no

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43/49 momento da realização da reação de hibridização foi alterada para 3000 rpm. Neste caso, a aceleração centrífuga é 22,64 χ g. O resultado do cálculo da relação S/N é mostrado na Tabela 3. A relação S/N foi de 2,72, que foi maior do que o limiar de detecção S/N = 2.

Exemplo comparativo 7 [0105] As mesmas operações do Exemplo 11 foram realizadas, com exceção de que a velocidade de rotação do dispositivo de agitação, no momento da realização da reação de hibridização foi alterada para 500 rpm. Neste caso, a aceleração centrífuga é 0,63 χ g. O resultado do cálculo da relação S/N é mostrado na Tabela 3. A relação S/N foi de 1,61, que foi menor do que o limiar de detecção S/N = 2.

Exemplo 13 [0106] As mesmas operações do Exemplo 7 foram realizadas com exceção de que um aparelho de agitação produzido (velocidade máxima de rotação: 1000 rpm, raio de rotação: 5 mm) foi usado como aparelho de agitação e a velocidade de rotação do dispositivo de agitação, no momento da realização da reação de hibridização foi alterada para 1000 rpm. Neste caso, a aceleração centrífuga é 5,59 χ g. O resultado do cálculo da relação S/N é mostrado na Tabela 3. A relação S/N foi de 2,39, que foi maior do que o limiar de detecção S/N = 2.

Exemplo comparativo 8 [0107] As mesmas operações do Exemplo 13 foram realizadas, com exceção de que a velocidade de rotação do dispositivo de agitação, no momento da realização da reação de hibridização foi alterada para 250 rpm. Neste caso, a aceleração centrífuga é 0,35 χ g. O resultado do cálculo da relação S/N é mostrado na Tabela 3. A relação S/N foi de 1,49, que foi menor do que o limiar de detecção S/N = 2.

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Exemplo comparativo 9 [0108] As mesmas operações do Exemplo 7 foram realizadas com exceção de que o “Multi Shaker MMS-210” (produzido pela Tokyo Rikakikai Co., Ltd.; velocidade máxima de rotação: 250 rpm, raio de rotação: 12,5 mm) foi usado como aparelho de agitação e a velocidade de rotação do dispositivo de agitação, no momento da realização da reação de hibridização foi alterada para 2000 rpm. Neste caso, a aceleração centrífuga é 0,87 χ g. O resultado do cálculo da relação S/N é mostrado na Tabela 3. A relação S/N foi de 1,56, que foi menor do que o limiar de detecção S/N = 2.

Exemplo comparativo 10 [0109] As mesmas operações do Exemplo 7 foram realizadas com exceção de que um aparelho de agitação produzido (velocidade máxima de rotação: 1000 rpm, raio de rotação: 24 mm) foi usado como aparelho de agitação e a velocidade de rotação do dispositivo de agitação, no momento da realização da reação de hibridização foi alterada para 100 rpm. Neste caso, a aceleração centrífuga é 0,27 χ g. O resultado do cálculo da relação S/N é mostrado na Tabela 3. A relação S/N foi de 1,39, que foi menor do que o limiar de detecção S/N = 2.

Exemplo comparativo 11 [0110] As mesmas operações do Exemplo 7 foram realizadas com exceção de que um aparelho de agitação produzido (velocidade máxima de rotação: 1000 rpm, raio de rotação: 72 mm) foi usado como aparelho de agitação e a velocidade de rotação do dispositivo de agitação, no momento da realização da reação de hibridização foi alterada para 100 rpm. Neste caso, a aceleração centrífuga é 0,80 χ g. O resultado do cálculo da relação S/N é mostrado na Tabela 3. A relação S/N foi de 1,57, que foi menor do que o limiar de detecção S/N = 2.

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Tabela 3

Raio de rotação, velocidade de rotação, aceleração centrífuga e intensidade do sinal

	Raio de rotação (mm)	Velocidade de rotação (rpm)	Aceleração centrífuga (χ g)	Intensidade do sinal
Sinal	Ruído	Relação S/N
Exemplo comparativo 5	0,6	1.000	0,67	2.841	1.821	1,56
Exemplo 7	0,6	3.000	6,04	5.110	1.825	2,80
Exemplo 8	0,6	5.000	16,77	4.625	1.828	2,53
Exemplo comparativo 6	1	500	0,28	2.700	1.824	1,48
Exemplo 9	1	2.000	4,47	4.036	1.802	2,24
Exemplo 10	1	2.500	6,99	5.029	1.822	2,76
Exemplo comparativo 7	2,25	500	0,63	2.924	1.816	1,61
Exemplo 11	2,25	2,000	10,06	5.879	1.809	3,25
Exemplo 12	2,25	3.000	22,64	4.967	1.826	2,72
Exemplo comparativo 8	5	250	0,35	2.713	1.821	1,49
Exemplo 13	5	1.000	5,59	4.338	1.815	2,39
Exemplo comparativo 9	12,5	250	0,87	2.838	1.819	1,56
Exemplo comparativo 10	24	100	0,27	2.538	1.826	1,39
Exemplo comparativo 11	72	100	0,80	2.820	1.796	1,57

Exemplo 14 [0111]Em 4 pL da solução de amostra de DNA descrita no

Exemplo de Referência 2, 4 pL de cada uma das soluções da sonda de detecção descritas no Exemplo de Referência 2, foram adicionados e

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46/49 misturados, e a mistura resultante foi aquecida no termociclador a 95°C durante 5 minutos. Depois de deixar a mistura em repouso até que fosse arrefecida à temperatura ambiente, 32 pL de solução de hibridização 1 χ descrita no Exemplo de Referência 2, foram adicionados e misturados, preparando assim cada solução de hibridização contendo a substância teste. Para cada uma das quatro reentrâncias (reentrâncias n° 1 a 4) do chip de análise 3, 10 pL de cada solução contendo a substância teste foram injetados e as aberturas foram seladas com um filme de PET revestido com um adesivo acrílico. Aqui, o espaço de cada uma das reentrâncias que não foi preenchido com a solução tinha um volume de cerca de 3,5 pL e a relação entre o espaço não preenchido com a solução em cada reentrância foi de cerca de 26%. Por um método de hibridização tipo sanduíche, a detecção da substância teste foi realizada. O chip de análise foi colocado em um aparelho de agitação “MS3 digital” (produzido pela IKA), que foi colocado em um forno com uma temperatura controlada de 32°C, e agitado a 2000 rpm durante 2 horas para permitir que a sonda de captura e a substância teste sofressem a reação de hibridização. Neste processo, uma aceleração centrífuga de cerca de 10,1 x g foi aplicada ao chip de análise. Após a reação, a vedação que cobre as aberturas foi removida e os chips de análise foram lavados por 5 minutos com a solução de lavagem A aquecida a 30°C (0,5 x SSC e 1% em peso de SDS). Após a secagem do chip de análise, 10 pL de 50 ng/pL de solução de estreptavidina ficoeritrina, que foi preparada pela mistura de um reagente de coloração (estreptavidina ficoeritrina) e um diluente (100 mM de MES, 1 M de NaCl, 0,05% em peso de Tween 20 e 2 mg/mL de BSA) foi adicionado gota a gota em cada reentrância, e o chip de análise foi incubado no escuro a 35°C durante 5 minutos. Depois disso, o chip de análise foi lavado durante 5 minutos, com a solução de lavagem B

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47/49 aquecidos a 30°C (6 χ SSPE e 0,01% em peso de Tween-20) e em seguida secos. A intensidade do sinal (intensidade de fluorescência) foi medida usando um detector de fluorescência de alta resolução (“3D-Gene (marca registrada) Scanner”, fabricado pela Toray Industries, Inc). Os valores foram lidos para as saliências nas quais a substância de ligação seletiva foi imobilizada (sinal) e para as saliências nas quais a substância de ligação seletiva não foi imobilizada (ruído) a fim de calcular a relação sinal/ruído (relação S/N) para cada uma das quatro reentrâncias (reentrâncias n° 1 a

4). Os resultados estão indicados na Tabela 4. A relação S/N foi encontrada como sendo de 2,9, 2,7, 2,8 e 2,8 para as reentrâncias n° 1 a 4, respectivamente, todas elas foram superiores ao limiar de detecção S/N = 2. Além disso, os valores CV dos sinais de 22 pontos protuberantes (saliências) nas respectivas reentrâncias foram todos inferiores a 10%, e a variação do sinal dentro de cada reentrância foi pequena. Além disso, o valor CV dos sinais de todas as quatro reentrâncias (88 sinais) também foram pequenos a 7,5%; consequentemente, foi demonstrado que a variação entre as reentrâncias também era pequena.

Exemplo comparativo 12 [0112] As mesmas operações do Exemplo 14 foram realizadas, com exceção de que um aparelho de agitação do tipo que realiza rotação e revolução (raio de revolução: 72 mm) foi utilizado e a velocidade de rotação foi de 350 rpm. Neste caso, a aceleração centrífuga foi de 9,9 χ g. Os resultados do cálculo da relação S/N para as quatro reentrâncias (reentrâncias n° 1 a 4) são apresentados na Tabela 4. A relação S/N foi de 1,8, 1,9, 1,7 e 1,5 para as quatro reentrâncias, respectivamente, todos os valores foram inferiores ao limiar de detecção S/N = 2. Além disso, os valores de CV dos sinais de 22 pontos protuberantes nas respectivas reentrâncias foram variáveis em torno de 10% e o valor CV dos sinais de todas as quatro reentrâncias (88 sinais) foi elevado em 15,3%;

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48/49 consequentemente, foi demonstrado que a variação entre as reentrâncias foi grande.

Tabela 4

Modo de rotação da agitação, intensidade do sinal, variação e relação S/N

	Exemplo 14	Exemplo comparativo 12
Modo de rotação	rotação	rotação e revolução
Raio de rotação	2,25 mm	72 mm
Velocidade de rotação	2.000 rpm	350 rpm
Aceleração centrífuga	10,1 χ g	9,9 χ g
No. de reentrância	#1	#2	#3	#4	#1	#2	#3	#4
Sinal de cada reentrância	Média	5395	5273	5262	5132	3322	3566	3018	2747
Desvio padrão	453	339	452	302	299	283	297	476
CV (%)	8,4	6,4	8,6	5,9	9,0	7,9	9,9	10,8
Sinal total	Média	5266	3112
Desvio padrão	396,6	475,6
CV (%)	7,5	15,3
Média de ruído de cada reentrância	1874	1938	1859	1862	1820	1847	1757	1777
Relação S/N	2,9	2,7	2,8	2,8	1,8	1,9	1,7	1,5

Aplicação Industrial [0113] O método de agitação de uma solução de acordo com a presente invenção, em comparação com os métodos da anterioridade, é capaz de encurtar em grande parte o tempo necessário para a detecção ou quantificação de uma substância teste utilizando um chip de análise, tal como um chip de DNA. Portanto, a presente invenção é útil uma vez que permite um rápido diagnóstico, análise e similares de doenças na prática clínica, bem como nos centros de exame.

Descrição dos símbolos

1: Substrato

2: Material de placa com um(alguns) orifício(s) de passagem

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3: Superfície de fundo da reentrância

4: Superfície de parede da reentrância

5: Superfície com a substância de ligação seletiva imobilizada

6: Reentrância (ou espaço de reentrância)

7: Tampa

8: Orifício de injeção

9: Espaço (ou bolha de ar) não preenchido com solução

10: Chip de análise

Claims

Reivindicações

1. MÉTODO PARA AGITAR UMA SOLUÇÃO CONTENDO UMA SUBSTÂNCIA TESTE, injetada em um chip de análise, caracterizado por:

o referido chip de análise compreender uma reentrância ao qual a referida solução contendo a substância teste é injetada; e uma substância de ligação seletiva, que se liga seletivamente à referida substância teste, ser imobilizada sobre a totalidade ou parte da superfície de fundo da referida reentrância, referido método compreendendo:

a injeção da referida solução contendo a substância teste ao espaço na referida reentrância do referido chip de análise de modo que tal espaço seja parcialmente deixado sem preenchimento; e rotação do referido chip de análise ao qual a referida solução contendo a substância teste é injetada pela aplicação de uma aceleração centrífuga a partir de 1 χ g, em que referido chip de análise, ao qual a referida solução contendo a substância teste é injetada, é rotacionado com um raio de rotação de 0,1 mm a 10 mm; e em que referida solução contendo a substância teste é injetada na referida reentrância de modo que 10% a 70% do referido espaço é deixado sem preenchimento.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referido chip de análise compreender diversas reentrâncias nas quais a referida solução contendo a substância teste é injetada, sendo que as referidas diversas reentrâncias são separadas entre si por paredes.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 2, caracterizado pelo referido chip de análise estar equipado com uma tampa que cobre a totalidade da(s) referida(s) reentrância(s); e em que a

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2/2 referida solução contendo a substância teste é selada na(s) referida(s) reentrância(s).
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo referido chip de análise ao qual a referida solução contendo a substância teste é injetada ser arranjado de tal forma que a(s) superfície(s) de fundo da(s) referida(s) reentrância(s) é(são) horizontais ou substancialmente horizontais; e o referido chip de análise é rotacionado na direção horizontal ou substancialmente horizontal.
5. MÉTODO PARA ANALISAR UMA SUBSTÂNCIA TESTE, caracterizado por compreender as etapas de:

permitir que a referida substância teste se ligue à substância de ligação seletiva imobilizada sobre um chip de análise pelo método para agitar uma solução, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e detectar a ligação da referida substância teste na referida substância de ligação seletiva.