WO2013103144A1 - 細胞捕捉デバイス - Google Patents

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WO2013103144A1
WO2013103144A1 PCT/JP2012/084210 JP2012084210W WO2013103144A1 WO 2013103144 A1 WO2013103144 A1 WO 2013103144A1 JP 2012084210 W JP2012084210 W JP 2012084210W WO 2013103144 A1 WO2013103144 A1 WO 2013103144A1
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filter
cell
capture device
housing
area
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PCT/JP2012/084210
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得仁 菊原
上原　寿茂
鈴木　崇裕
松永　是
知子 吉野
正人 細川
Original Assignee
日立化成株式会社
国立大学法人東京農工大学
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Publication date
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Priority to US14/370,566 priority patent/US20150004687A1/en
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    • G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration

Definitions

  • the present invention relates to a cell capture device for capturing cancer cells contained in a cell dispersion.
  • CTC circulating cancer cells
  • Blood contains a large amount of blood cell components such as red blood cells, white blood cells and platelets, and the number thereof is said to be 3.5 to 9 ⁇ 10 9 in 1 mL of blood. Among them, only a few CTCs exist. In order to efficiently detect CTC from blood cell components, it is necessary to separate blood cell components, making observation and measurement very difficult.
  • Patent Document 1 describes that a cell dispersion liquid containing cancer cells is filtered with a filter made of parylene having fine through holes to capture cancer cells (CTC) for efficient detection. .
  • Cancer cells such as CTCs are one size larger than blood cells in blood, such as red blood cells and white blood cells, or platelets. Therefore, theoretically, it is possible to apply mechanical filtration to remove these blood cell components and to concentrate cancer cells.
  • the device of Patent Document 1 is a method in which a resin filter made of parylene is fixed by being sandwiched between polydimethylsiloxane (PDMS) with low rigidity, so when attaching the filter to the device
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a cell capture device capable of observing cells captured on a filter without degrading the device.
  • a cell dispersion is provided in a housing having an inlet connected to an inflow pipe into which the cell dispersion flows, and an outlet connected to an outflow pipe from which the cell dispersion flows out; And a filter having a capture area for capturing cancer cells contained in the filter, the filter is joined to the housing, and at least a part of the capture area is an observation area for observing the capture area from the outside.
  • the inflow tube and the inflow port are disposed at a position outside the observation area as viewed from the normal direction of the filter, and the inflow tube provides the cell capture device extending along the in-plane direction of the filter.
  • the filter is firmly fixed to the housing by bonding, it is possible to filter the cell dispersion at a higher pressure. This can enhance the CTC collection efficiency. Also, by bonding the filter to the housing of the device, the filter in the device can be flattened. As a result, the depth of focus can be made constant at the time of microscopic observation, and the complexity of adjusting the focus for each target visual field can be eliminated.
  • the inflow tube and the inflow port may be disposed outside the capture area as viewed from the normal direction of the filter.
  • the filter is preferably substantially flat. As a result, the depth of focus can be made constant at the time of microscopic observation, and the complexity of adjusting the focus for each target visual field can be eliminated.
  • the filter is preferably made of metal. This makes it possible to reduce residual blood cell components and concentrate CTCs at a high capture rate.
  • “remaining” means that cells remain on the filter without passing through the filter. Since metal is excellent in processability, the processing accuracy of the filter can be enhanced. Thereby, the survival of blood cell components can be reduced, and a high capture rate of CTC can be realized.
  • high rigidity can be obtained by making the material of the filter metal, so that a predetermined tension can be applied when fixed to the housing. For this reason, it becomes easy to maintain a smooth filter surface without causing a wrinkle and a sagging of a filter, and to ensure the flatness of a filter.
  • At least a portion of the housing is substantially transparent in the visible light range. This allows the capture region on the filter to be observed from the outside without disassembling the device. In addition, since it is not necessary to remove the filter from the device, it is possible to prevent an erroneous determination due to the contamination of the filter with dust and the like. In addition, since it is not necessary to expose the inside of the device to which the sample derived from human adheres, which may be contaminated with various pathogens and viruses, it is possible to reduce the complexity in securing the safety of the operation. Moreover, the complexity in the operation
  • the present invention can provide a cell capture device capable of observing cells captured on a filter without degrading the device.
  • FIG. 1 is a perspective view of an embodiment of a cell capture device.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line II-II in FIG.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of an embodiment of a cell capture device.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of an embodiment of a cell capture device.
  • (A) and (B) are cross-sectional views showing one embodiment of a cell capture device, respectively.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of an embodiment of a cell capture device.
  • (A) is a schematic diagram showing one embodiment of a filter.
  • (B) is a top view of the through-hole of the filter of one Embodiment.
  • FIG. 1 is a perspective view showing an embodiment of a cell capture device of the present embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along the line II-II in FIG.
  • the cell trapping device 100 has an inlet 130 connected to an inlet pipe 125 into which the cell dispersion flows, and an outlet 140 connected to an outlet pipe 135 from which the cell dispersion flows out.
  • a filter 105 disposed in the housing 120 and having a capture area for capturing cancer cells contained in the cell dispersion, at least a portion of the capture area being externally captured from the capture area.
  • the inflow tube 125 and the inflow port 130 are disposed at positions outside the observation region 145 when viewed from the normal direction of the filter 105, and the inflow tube 125 of the filter 105 has an observation region 145 for observation. It extends along the in-plane direction.
  • the in-plane direction means any direction in the plane of the filter 105, and is a two-dimensional all direction on the plane of the filter 105.
  • “along the in-plane direction” means a direction that forms an angle of less than 60 °, preferably less than 45 °, and more preferably less than 30 ° with the in-plane direction.
  • the inflow pipe 125 and the inflow port 130 are disposed at a position outside the observation region 145 when viewed in the normal direction of the filter 105, and the inflow pipe 125 extends along the in-plane direction of the filter 105.
  • the lower member 115 includes an outlet pipe 135 and an outlet 140. Since the outflow tube 135 is disposed on the side of the lower member 115, the cell capture device 100 can be stably fixed directly to the pedestal of the microscope when observing the observation area 145 microscopically.
  • the filter 105 is joined to the upper member 110 and the lower member 115 in the joint area 155.
  • welding is preferable.
  • Welding refers to melting the material itself at high temperature and bonding these directly. Welding may also be called fusion, heat bonding, or heat sealing. Examples of the welding method include heat welding, ultrasonic welding, high frequency welding and the like.
  • the upper member 110, the filter 105 and the lower member 115 are respectively joined by welding. Therefore, the airtightness of the housing 120 can be obtained with certainty, and high liquid sealability can be secured when the cell dispersion liquid is allowed to flow into the cell capture device 100. Moreover, since joining by welding can perform joining processing in a short time, it is excellent also in productivity.
  • the rigidity of the material can be represented, for example, by Young's modulus.
  • the material of the upper member 110 and the lower member 115 is preferably 0.1 GPa or more in Young's modulus, and more preferably 1 GPa or more.
  • a method by application of an adhesive may be mentioned.
  • favorable bonding may be difficult.
  • the adhesive does not extend to the entire required location. For this reason, complete joining can not be performed, and liquid leakage occurs between the upper member 110 and the lower member 115.
  • the amount of adhesive applied is too large, the adhesive may be applied beyond the range of the required portion, and the through hole of the filter 105 may be blocked.
  • application and curing of the adhesive may take time, and the productivity of the cell capture device 100 may be reduced.
  • the capture area of the filter 105 refers to an area capable of capturing cells in a state where the filter 105 is disposed in the housing.
  • the filter 105 may have a through hole on the entire surface thereof, or may have a through hole on only the central portion.
  • the area capable of capturing cells is the central portion of the filter 105 where the through holes are present.
  • the junction region 155 between the filter and the housing 120 can not capture cells, and hence the capture region is the junction region 155 from the entire surface of the filter 105. It is the excluded area.
  • At least a part of the capture area is an observation area 145, and among cells captured in the capture area, cells captured in the observation area 145 are to be observed.
  • the housing 120 is composed of an upper member 110 and a lower member 115.
  • the shape of the housing 120 may be a rectangular solid, a cylinder, or the like, and is not particularly limited.
  • the surface 160 of the upper member 110 and the surface 170 of the lower member 115 are preferably flat and parallel to one another, in particular the surface 160 is preferably smooth. This facilitates fixing the cell capture device 100 directly to the pedestal of the microscope and microscopically observing the observation area 145 on the filter 105 through the surface 160 from the exterior of the cell capture device 100.
  • the space surrounded by the inner wall 150 of the lower member 115 and the filter 105 is a cavity, and there is no structure such as a support for supporting the filter in this space. Therefore, the flow path of the cell dispersion which has passed through the filter 105 is not obstructed, and the resistance when the cell dispersion passes through the filter 105 is minimized, and the filter 105 can be uniformly passed. . As a result, it is possible to suppress unevenness in cell capture performance and local occlusion, and to exert stable capture performance.
  • the top member 110 is made of a material substantially transparent to light of the wavelength used when detecting CTCs.
  • the material of the upper member 110 include, but are not limited to, polymers such as glass, quartz glass, acrylic resin, and polydimethylsiloxane.
  • both the upper and lower members 110 and 115 are comprised of the materials described above.
  • the upper member 110 and the lower member 115 do not necessarily have to be the same material, but are preferably the same material from the viewpoint of ease of bonding process.
  • materials for the upper member 110 and the lower member 115 low self-fluorescent acrylic resin is preferable, and polymethyl methacrylate is particularly preferable, because mass production of devices is possible.
  • the upper member 110 select a material with low auto-fluorescence emitted from the material itself at the time of irradiation with light in the wavelength range (low auto-fluorescent property).
  • organic polymers having an aromatic ring for example, resins such as polystyrene and polycarbonate have high autofluorescence and are often not suitable for the above purpose.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of one embodiment of a cell capture device.
  • the lower member 215 is provided with a step for holding the filter 205.
  • the filter 205 is fitted in the stepped portion, and is joined to the lower member 215 by welding in a joining region 255.
  • the other points are similar to those of the cell capture device 100.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of one embodiment of a cell capture device.
  • the inner wall 350 of the lower member 315 is inclined toward the outlet 340. Thereby, the collectability of the cell dispersion liquid which has passed through the filter 305 can be improved, and liquid pooling can be prevented.
  • the inclination of the inner wall 350 of the lower member 315 is not limited to a straight line, and may be, for example, an arc shape. The other points are similar to those of the cell capture device 100.
  • FIG. 5 (A) is a cross-sectional view showing one embodiment of a cell capture device.
  • a gasket 480 is provided between the filter 405 and the lower member 415. The other points are similar to those of the cell capture device 100.
  • FIG. 5 (B) is a cross-sectional view showing one embodiment of a cell capture device.
  • the filter 405 is bonded to the lower member 415. Further, a gasket 480 is provided between the filter 405 and the upper member 410. The other points are similar to those of the cell capture device 100.
  • the gasket 480 can be used as a fluid tight seal between the top member 410, the bottom member 415, and the filter 405. By installing the gasket 480, leakage of the cell dispersion from the outer peripheral portion of the filter 405 can be more reliably prevented. Similar effects can be expected by using an O-ring instead of the gasket 480.
  • the gasket 480 is preferably made of an elastic material.
  • Examples of the material of the gasket 480 include thermoplastic resin, rubber, elastomer, and the like.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view of one embodiment of a cell capture device.
  • the inflow tube 525 is disposed on the side surface of the upper member 510, that is, at a position outside the capture area as viewed from the normal direction of the filter 505.
  • the outflow pipe 535 is disposed on the side surface of the lower member 515. The other points are similar to those of the cell capture device 100.
  • FIG. 7A is a schematic view showing an embodiment of the filter.
  • the filter 600 comprises a substrate 620 in which a plurality of through holes 610 are formed, and CTC is captured on the surface of the surface 630.
  • the arrangement of the through holes 610 may be an arrangement as shown in FIG. 7A, a staggered arrangement in which the arrangement is shifted for each row, or a random arrangement arranged arbitrarily.
  • FIG. 7B is a top view of the through hole 610 of the filter 600.
  • the opening shape of the through hole 610 is a shape in which two semi-circles having a radius c are joined adjacent to a short side of a rectangle whose short side is a and whose long side is b.
  • a, b, c are 8, 37 and 4 ⁇ m respectively.
  • the material of the substrate 620 of the filter is a natural polymer such as cotton or hemp, nylon, polyester, polyacrylonitrile, polyolefin, halogenated polyolefin, polyurethane, polyamide, polysulfone, polyethersulfone, poly (meth) Synthetic polymers such as acrylates, halogenated polyolefin ethylene-polyvinyl alcohol copolymers, butadiene-acrylonitrile copolymers, etc. or mixtures thereof are mentioned.
  • metals, ceramics, composite materials thereof, and the like can also be exemplified.
  • the material of the substrate 620 of the filter is metal.
  • the metal include, but are not limited to, noble metals such as gold and silver, base metals such as copper, aluminum, tungsten, nickel, chromium and the like, and alloys of these metals.
  • the metal may be used alone, or may be used as an alloy with another metal or an oxide of a metal to impart functionality. It is more preferable to use a metal containing nickel, stainless steel or titanium as a main component, which is less susceptible to oxidation and corrosion.
  • the main component means a component that occupies 50% by weight or more of the material forming the substrate. Through holes can be formed in these metals using a method such as photolithography.
  • Examples of the opening shape of the through hole include a circle, an ellipse, a rectangle, a rounded rectangle, a polygon and the like. From the viewpoint of efficiently capturing cancer cells, a circle, a rectangle or a rounded rectangle is preferable. Also, from the viewpoint of preventing clogging of the filter, a rectangular or rounded rectangle is particularly preferable.
  • the size of a general CTC is 10 ⁇ m or more in diameter.
  • the diameter of the cell refers to the length of the longest straight line among the straight lines connecting any two points on the contour of the cell as observed with a microscope. Therefore, from the viewpoint of blood cell component permeability and CTC capture performance, the average pore diameter of the through holes is preferably 5 to 15 ⁇ m, more preferably 6 to 12 ⁇ m, and particularly preferably 7 to 10 ⁇ m. preferable.
  • the hole diameter in a shape other than a circle, such as an ellipse, a rectangle, or a polygon is defined as the maximum value of the diameter of a sphere that can pass through each through hole.
  • the hole diameter of the through hole is, for example, the length of the short side of the rectangle when the aperture shape is a rectangle, and the diameter of the inscribed circle of the polygon when the aperture shape is a polygon.
  • the opening shape is a rectangle or a rounded rectangle, even in the case where CTC or a white blood cell is captured by the through hole, a gap is formed in the long side direction of the opening shape at the opening. Since the liquid can pass through the gap, clogging of the filter can be prevented.
  • the average aperture ratio of the through holes of the filter is preferably 0.1 to 50%, more preferably 0.5 to 40%, particularly preferably 1 to 30%, and most preferably 1 to 10%.
  • the aperture ratio refers to the area occupied by the through holes with respect to the area of the entire filter.
  • the average aperture ratio is preferably as large as possible from the viewpoint of clogging prevention, but if it exceeds 50%, the strength of the filter may decrease or processing may become difficult. If it is less than 0.1%, clogging tends to occur, which may reduce the cancer cell trapping ability of the filter.
  • the thickness of the filter substrate is preferably 3 to 100 ⁇ m, more preferably 5 to 50 ⁇ m, and particularly preferably 10 to 30 ⁇ m. If the thickness of the substrate is less than 3 ⁇ m, the strength of the filter may be reduced and handling may be difficult. In addition, if the thickness of the substrate exceeds 100 ⁇ m, it consumes more material than necessary or takes a long time for processing, which may be disadvantageous in cost or may make precise processing itself difficult.
  • the flatness of the filter surface is preferably 10 ⁇ m or less as Rz (maximum height roughness) defined by JIS B0601-2001, although it depends on the magnification of the microscope used for observation.
  • the method for producing the filter is not particularly limited, and examples thereof include a method for producing by etching or electroplating using a photolithography method.
  • the manufacturing method using a photolithography method etc. is demonstrated below. First, a photosensitive resist film (photosensitive layer) is bonded to a support made of stainless steel or the like. Next, a mask having a pattern of opening shapes of through holes of the filter is fixed on the photosensitive layer. Subsequently, light (active ray) is irradiated from above the mask.
  • the support After light irradiation, if there is a support on the photosensitive layer, the support is removed, and the unexposed area is removed by wet development or dry development with a developing solution such as an alkaline aqueous solution, an aqueous developing solution and an organic solvent. It develops and forms a resist pattern. Subsequently, using the developed resist pattern as a mask, plating is performed on a substrate that is exposed without being masked. Examples of the plating method include copper plating, solder plating, nickel plating, gold plating and the like. After the plating treatment, the plated layer is peeled off from the support and the photosensitive layer to obtain a plated layer. This plated layer is a filter. The surface of the obtained filter may be roughened. Examples of the method of roughening treatment include chemical etching with an acidic or basic aqueous solution or the like, physical treatment such as sand blast, and the like.
  • the cell dispersion liquid it is possible to use blood, lymph, tissue fluid, umbilical cord blood, etc. which are pooled in bone marrow, spleen, liver etc., but it is most convenient to use peripheral blood circulating in the body. It is. Detecting the presence of CTCs in peripheral blood is a useful tool to determine the progression of cancer pathology.
  • the cell dispersion When detecting the presence or absence of CTC in the cell dispersion, introduce the cell dispersion into the inflow tube of the cell capture device, concentrate the cells containing CTC on the filter, and present the CTC in the concentrated cells It is sufficient to check whether or not to do it.
  • the introduction of the cell dispersion into the inflow pipe can be exemplified by a method using pressurization or depressurization, a method using a peristaltic pump, and the like.
  • the area of the capture area of the filter is, for example, 0.25 to 10 cm 2 when concentrating CTCs from 1 mL of blood.
  • CTCs are concentrated by the above method, not only CTCs but also blood cells such as white blood cells are simultaneously concentrated. For this reason, it is necessary to confirm whether or not the recovered cells contain epithelial cells derived from the primary tumor of cancer.
  • staining with an antibody against a fluorescently labeled epithelial cell marker can be performed to confirm that it is an epithelial cell.
  • antibodies against epithelial cell markers include anti-Cytokeratin antibodies and the like.
  • Staining and observation of concentrated cells can be performed, for example, as follows.
  • the anti-Cytokeratin antibody solution is introduced into the inflow tube of the cell capture device after concentration of cells, and left to stand for a predetermined time.
  • a buffer for washing is introduced into the inflow tube of the cell capture device, and unreacted antibody is washed away.
  • the cell capture device is fixed directly to the pedestal of the microscope and fluorescence microscopy is performed.
  • a blocking buffer may be introduced to suppress nonspecific reaction of the antibody.
  • the cells concentrated by the above-described method may be recovered and analyzed for genes to confirm that they are cancer cells.
  • Cell recovery can be performed, for example, by introducing a buffer from the outflow tube side of the cell capture device and recovering from the inflow tube side.
  • mutations in genes such as p53, K-RAS, H-RAS, N-RAS, BRAF, APC and the like can be analyzed to confirm that they are cancer cells.
  • the results of these genetic analyzes can also be used to determine the patient's treatment plan, etc. thereafter.
  • a cancer cell may be confirmed by measuring the telomerase activity and the like of the cell concentrated by the above method.
  • wash buffer is introduced from the outflow tube side of the cell capture device, and the cells trapped on the filter are washed away by discharging from the inflow tube side. It is also possible to recycle cell capture devices.
  • observation region 150, 250, 350, 450, 550 ... inner wall of lower member, 155 , 255, 355, 455, 555 ... junction area, 160, 170, 260, 270, 360, 370 460,470,560,570,630 ... surface, 480 ... gasket, 610 ... through hole, 620 ... substrate, a ... short sides, b ... long sides, c ... radius.

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Abstract

　デバイスを分解することなく、フィルター上に捕捉した細胞を観察可能な、細胞捕捉デバイスを提供する。　細胞分散液が流入する流入管１２５が接続された流入口１３０と、細胞分散液が流出する流出管１３５が接続された流出口１４０とを有する筐体１２０と、筐体１２０内に配置され、細胞分散液に含まれる癌細胞を捕捉する捕捉領域を有するフィルター１０５とを備え、フィルター１０５は筐体１２０に接合されており、捕捉領域の少なくとも一部は外部から前記捕捉領域を観察するための観察領域となっており、流入管１２５及び流入口１３０は、フィルター１０５の法線方向から見て観察領域よりも外側の位置に配置され、流入管１２５は、フィルター１０５の面内方向に沿って延びている、細胞捕捉デバイス。

Description

細胞捕捉デバイス
　本発明は、細胞分散液中に含まれる癌細胞を捕捉する細胞捕捉デバイスに関する。
　癌は世界各国で死因の上位を占め、わが国においては年間３０万人以上が癌によって死亡しており、その早期発見および治療が望まれている。癌による人の死亡は、癌の転移再発によるものがほとんどである。癌の転移再発は、癌細胞が原発巣から血管またはリンパ管を経由して、別臓器組織の血管壁に定着、浸潤して微小転移巣を形成することで起こる。このような血管やリンパ管を通じての人の体内を循環する癌細胞は、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌ、以下、場合により「ＣＴＣ」という。）と呼ばれている。
　血液には赤血球や白血球および血小板等の血球成分が多く含まれ、その個数は血液１ｍＬ中に３．５～９×１０９個ともいわれている。その中でＣＴＣは僅か数個程度しか存在しない。血球成分の中からＣＴＣを効率的に検出するためには血球成分を分離する必要があり、観察および測定が非常に困難であった。
　ＣＴＣの検出により癌の早期発見等が期待されることから、様々な検討がなされている。例えば、特許文献１には、微細な貫通孔を有するパリレン製のフィルターで癌細胞を含む細胞分散液をろ過し、癌細胞（ＣＴＣ）を捕捉して効率的に検出することが記載されている。
国際公開第２０１０／１３５６０３号
　ＣＴＣ等の癌細胞は、血液中の血球細胞、例えば赤血球や白血球、あるいは血小板等に比べてサイズが一回り大きい。したがって、理論的には、機械的濾過法を適用してこれらの血球成分を除去し、癌細胞を濃縮することが可能である。
　しかしながら、文献１に記載のフィルターを組み込んだデバイスは、上下に細胞分散液が流入する流入管及び流出する流出管が突出している。このため、流入管や流出管が障害となり、顕微鏡の対物レンズをフィルターの観察位置に移動することができない場合があった。また、デバイスを顕微鏡の台座に直接固定することが困難な場合があった。
　また、上記の問題を別にしても、特許文献１のデバイスは、パリレン製の樹脂フィルターを剛性の低いポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で挟み込んで固定する方式であるため、フィルターのデバイスへの取り付け時にフィルターの平坦度が得られず、顕微鏡等による直接観察を行う場合は、観察時に焦点深度がずれてしまい、対象視野ごとに焦点を調整する必要があり、作業効率が低下する場合があった。
　以上のことから、特許文献１のデバイスでは、ＣＴＣを捕捉後のフィルターを観察するために、デバイスを分解してフィルターを取り出す必要があった。このため、取り出したフィルターに作業雰囲気環境からゴミなどが汚染し、誤判定してしまう場合があった。また、デバイスの分解において、各種病原菌やウイルスで汚染されている可能性のある、ヒト由来のサンプルが付着したデバイス内部が露出するため、作業の安全性を確保することが煩雑な場合があった。また、フィルターが極薄膜であるため、その取り扱いが煩雑な場合があった。
　本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、デバイスを分解することなく、フィルター上に捕捉した細胞を観察可能な、細胞捕捉デバイスを提供することを目的とする。
　本発明は、細胞分散液が流入する流入管が接続された流入口と、細胞分散液が流出する流出管が接続された流出口とを有する筐体と、筐体内に配置され、細胞分散液に含まれる癌細胞を捕捉する捕捉領域を有するフィルターとを備え、フィルターは筐体に接合されており、捕捉領域の少なくとも一部は外部から前記捕捉領域を観察するための観察領域となっており、流入管及び流入口は、フィルターの法線方向から見て観察領域よりも外側の位置に配置され、流入管は、フィルターの面内方向に沿って延びている、細胞捕捉デバイスを提供する。
　上記本発明の細胞捕捉デバイスによれば、デバイスを分解することなく、直接顕微鏡の台座に固定して、フィルター上に捕捉した細胞を観察することができる。また、フィルターが、接合により筐体に強固に固定されていることから、より高い圧力で細胞分散液をろ過することが可能となる。これにより、ＣＴＣの回収効率を高めることができる。また、フィルターをデバイスの筐体に接合することにより、デバイス内のフィルターを平坦にすることができる。これにより、顕微鏡観察時に焦点深度を一定にすることができ、対象視野ごとに焦点を調整する煩雑さを解消することができる。
　流入管及び流入口は、フィルターの法線方向から見て捕捉領域よりも外側の位置に配置されていてもよい。
　これにより、より広い観察領域を確保することができ、ＣＴＣの検出精度を高めることができる。
　フィルターは、実質的に平坦であることが好ましい。これにより、顕微鏡観察時に焦点深度を一定にすることができ、対象視野ごとに焦点を調整する煩雑さを解消することができる。
　フィルターは、金属からなることが好ましい。これにより、血球成分の残存を低減し、ＣＴＣを高い捕獲率で濃縮することができる。ここで、残存とは、細胞が、フィルターを通過せずにフィルター上に残ることをいう。金属は加工性に優れているため、フィルターの加工精度を高めることができる。これにより、血球成分の残存を低減させ、ＣＴＣの高い捕獲率を実現することができる。
　また、金属はプラスチックなどの他の材料と比べて剛直であるため、外部から力が加わってもそのサイズや形状が維持される。このため、フィルターの孔（貫通孔）よりも若干大きな血液成分（特に白血球）を変形させて通過させ、高精度の分離・濃縮が可能になると考えられる。白血球の中にはＣＴＣと同じ程度のサイズを有する細胞が存在し、サイズの違いだけではＣＴＣのみを高精度で区別できない場合がある。しかしながら、白血球は癌細胞よりも変形能が大きいため、吸引や加圧などによる外部の力により、自分より小さな孔を通過することができ、ＣＴＣと分離することが可能となる。
　また、フィルターの材質を金属とすることで高い剛性が得られることから、筐体に固定する時に所定の張力を加えることができる。このため、フィルターがしわやたるみを生じることなく平滑なフィルター面を維持し、フィルターの平坦性を確保することが容易になる。
　筐体の少なくとも一部は、可視光領域において実質的に透明であることが好ましい。これにより、デバイスを分解することなく、外部からフィルター上の捕捉領域を観察することができる。また、フィルターをデバイスから取り出す必要がないため、フィルターへのゴミなどの汚染による誤判定を防止することができる。また、各種病原菌やウイルスで汚染されている可能性のある、ヒト由来のサンプルが付着したデバイス内部を露出する必要がないことから、作業の安全性の確保における煩雑さを低減することができる。また、極薄膜であるフィルターを取り扱う作業における煩雑さを低減することができる。
　本発明により、デバイスを分解することなく、フィルター上に捕捉した細胞を観察可能な、細胞捕捉デバイスを提供することができる。
細胞捕捉デバイスの一実施形態を示す斜視図である。 図１におけるＩＩ－ＩＩ線断面図である。 細胞捕捉デバイスの一実施形態を示す断面図である。 細胞捕捉デバイスの一実施形態を示す断面図である。 （Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ細胞捕捉デバイスの一実施形態を示す断面図である。 細胞捕捉デバイスの一実施形態を示す断面図である。 （Ａ）は、フィルターの一実施形態を示す概略図である。（Ｂ）は、一実施形態のフィルターの貫通孔の上面図である。
　以下、本発明の細胞捕捉デバイスの好適な実施形態について図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
　図１は本実施の細胞捕捉デバイスの一実施形態を示す斜視図である。図２は図１におけるＩＩ－ＩＩ線断面図である。
　図１および図２に示すように、細胞捕捉デバイス１００は、細胞分散液が流入する流入管１２５が接続された流入口１３０と、細胞分散液が流出する流出管１３５が接続された流出口１４０とを有する筐体１２０と、筐体１２０内に配置され、細胞分散液に含まれる癌細胞を捕捉する捕捉領域を有するフィルター１０５とを備え、捕捉領域の少なくとも一部は外部から前記捕捉領域を観察するための観察領域１４５となっており、流入管１２５及び流入口１３０は、フィルター１０５の法線方向から見て観察領域１４５よりも外側の位置に配置され、流入管１２５は、フィルター１０５の面内方向に沿って延びている。
　ここで、面内方向とは、フィルター１０５の面内のあらゆる方向をいい、フィルター１０５の面上の２次元の全方向である。本明細書において「面内方向に沿って」とは、面内方向に対して６０°未満、好ましくは４５°未満、さらに好ましくは３０°未満の角度をなす方向であることを意味する。流入管１２５及び流入口１３０が、フィルター１０５の法線方向から見て観察領域１４５よりも外側の位置に配置され、流入管１２５が、フィルター１０５の面内方向に沿って延びていることにより、細胞捕捉デバイス１００の外部から、面１６０を通してフィルター１０５上の観察領域１４５を顕微鏡観察する場合に、観察の障害となる構造物が存在しないため、細胞捕捉デバイスを分解することなく観察することができる。
　一方、下部部材１１５は、流出管１３５及び流出口１４０を備える。流出管１３５は下部部材１１５の側面に配置されているため、観察領域１４５を顕微鏡観察する際に、細胞捕捉デバイス１００を直接顕微鏡の台座に安定的に固定することができる。
　フィルター１０５は、接合領域１５５において、上部部材１１０及び下部部材１１５と接合されている。接合方法としては溶着が好ましい。溶着とは、高温で材料自体を溶かしてこれらを直接に結合することをいう。溶着は、融着、熱接着、ヒートシールと呼ばれる場合もある。溶着方法としては、熱溶着、超音波溶着、高周波溶着等が挙げられる。フィルター１０５の周囲を熱または超音波等の処理によって溶着し固定することにより、フィルター１０５を、しわやたるみのない張力のかかった平坦な状態で配置することができる。これにより、フィルター１０５を顕微鏡観察する場合の焦点深度が一定となるため、フィルター上に捕捉された細胞の顕微鏡または拡大鏡による観察において焦点の調整を頻繁に行う必要がなく、効率的にＣＴＣを検出することができる。
　本実施形態では、上部部材１１０、フィルター１０５及び下部部材１１５が、それぞれ溶着により接合されている。このため、筐体１２０の気密性を確実に得ることができ、細胞捕捉デバイス１００内に細胞分散液を流入させた時の高い液シール性を確保することができる。また、溶着による接合は、短時間で接合処理が可能であるため生産性にも優れる。
　また、上部部材１１０及び下部部材１１５の材料として、剛性の高いものを選定することにより、フィルター１０５を接合する時の加圧や熱による変形を抑制することができる。ここで、材料の剛性は、例えばヤング率で表すことができる。上部部材１１０及び下部部材１１５の材料としては、ヤング率で０．１ＧＰａ以上のものが好ましく、１ＧＰａ以上のものがより好ましい。
　溶着以外の接合方法としては、接着剤の塗布による方法が挙げられる。しかしながら、接着剤による接合では、好ましい接合が困難な場合がある。例えば、接着剤の塗布量が少なすぎる場合には、接着剤が必要箇所の全体に行き渡らない。このため、完全な接合ができず、上部部材１１０と下部部材１１５の間から液漏れが生じる。反対に、接着剤の塗布量が多すぎる場合には、接着剤が必要箇所の範囲を超えて塗布され、フィルター１０５の貫通孔を塞いでしまう恐れがある。また、接着剤の塗布及び硬化に時間を要し、細胞捕捉デバイス１００の生産性が低下する場合がある。
　フィルター１０５の捕捉領域とは、フィルター１０５が筐体内に配置された状態において、細胞を捕捉可能な領域をいう。フィルター１０５は、その全面に貫通孔が存在してもよいし、中央部分のみに貫通孔が存在してもよい。例えば、中央部分のみに貫通孔が存在する場合には、細胞を捕捉可能な領域は、フィルター１０５の貫通孔が存在する中央部分である。また、フィルター１０５の全面に貫通孔が存在する場合には、フィルターと筐体１２０との接合領域１５５は、細胞を捕捉することができないため、捕捉領域は、フィルター１０５の全面から接合領域１５５を除いた領域である。捕捉領域の少なくとも一部は観察領域１４５であり、捕捉領域内に捕捉された細胞のうち、観察領域１４５内に捕捉された細胞を観察対象とする。
　筐体１２０は、上部部材１１０及び下部部材１１５から構成される。筐体１２０の形状は直方体や円筒等であってよく、特に制約はない。上部部材１１０の面１６０及び下部部材１１５の面１７０は、平坦で、かつ互いに平行であることが好ましく、特に面１６０は平滑であることが好ましい。これにより、細胞捕捉デバイス１００を顕微鏡の台座に直接固定して、細胞捕捉デバイス１００の外部から、面１６０を通してフィルター１０５上の観察領域１４５を顕微鏡観察することが容易になる。
　下部部材１１５の内壁１５０及びフィルター１０５により囲まれる空間は空洞であり、この空間内にはフィルターを支える支持体等の構造物が存在しない。このため、フィルター１０５を通過した細胞分散液の流路が妨げられることがなく、細胞分散液がフィルター１０５を通過する場合の抵抗が最小限に抑えられ、均一にフィルター１０５を通過することができる。これにより、細胞捕捉性能のむらや局所的な閉塞を抑制でき、安定した捕捉性能を発揮することができる。
　上部部材１１０はＣＴＣを検出する時に使用する波長の光に対して実質的に透明な材料からなる。上部部材１１０の材料としては、ガラス、石英ガラス、アクリル樹脂、ポリジメチルシロキサン等の高分子が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態において、上部部材１１０及び下部部材１１５の双方が上記の材料からなる。上部部材１１０と下部部材１１５とは必ずしも同一材料である必要はないが、接合処理のしやすさの観点から同一材料であることが好ましい。上部部材１１０及び下部部材１１５の材料としては、デバイスの量産が可能であることから、低自家蛍光性のアクリル樹脂が好ましく、ポリメチルメタクリレートが特に好ましい。一般的に、癌細胞等を観察する場合には、対象となる細胞に蛍光試薬による染色処理を行った後、波長が３００から８００ｎｍの紫外または可視光領域の光を照射して、蛍光観察を行う。そのため、上部部材１１０は前記波長域の光の照射時に材料自体が発する自家蛍光が低い材料を選定することが好ましい（低自家蛍光性）。一般的に、芳香環を有する有機高分子、例えばポリスチレン、ポリカーボネート等の樹脂は、自家蛍光性が強く、上記の目的に適さない場合が多い。
　続いて、本発明の細胞捕捉デバイスの変形例について説明する。
　図３は細胞捕捉デバイスの一実施形態を示す断面図である。細胞捕捉デバイス２００においては、下部部材２１５にフィルター２０５を保持する段差が設けられている。フィルター２０５は、この段差部分にはめ込まれ、接合領域２５５で溶着により下部部材２１５と接合されている。その他の点については細胞捕捉デバイス１００と同様である。
　図４は細胞捕捉デバイスの一実施形態を示す断面図である。細胞捕捉デバイス３００においては、下部部材３１５の内壁３５０に、流出口３４０に向かう傾斜が付けられている。これにより、フィルター３０５を通過した細胞分散液の収集性を向上させ、液だまりを防止することができる。下部部材３１５の内壁３５０の傾斜は、直線に限られず、例えば円弧状であってもよい。その他の点については細胞捕捉デバイス１００と同様である。
　図５（Ａ）は細胞捕捉デバイスの一実施形態を示す断面図である。細胞捕捉デバイス４００においては、フィルター４０５及び下部部材４１５の間にガスケット４８０が設けられている。その他の点については細胞捕捉デバイス１００と同様である。
　図５（Ｂ）は細胞捕捉デバイスの一実施形態を示す断面図である。細胞捕捉デバイス４０１においては、フィルター４０５は下部部材４１５に接合されている。そして、フィルター４０５及び上部部材４１０の間にガスケット４８０が設けられている。その他の点については細胞捕捉デバイス１００と同様である。
　ガスケット４８０は、上部部材４１０、下部部材４１５、及びフィルター４０５の間の耐流体用シールとして用いることができる。ガスケット４８０を設置することにより、フィルター４０５の外周部からの細胞分散液の漏れを、より確実に防止することができる。ガスケット４８０の代わりにＯリングを用いても同様の効果が期待できる。
　ガスケット４８０は弾性のある材料からなることが好ましい。ガスケット４８０の材料としては、例えば、熱可塑性樹脂、ゴム、エラストマ等が挙げられる。
　図６は細胞捕捉デバイスの一実施形態を示す断面図である。細胞捕捉デバイス５００においては、流入管５２５が上部部材５１０の側面、すなわち、フィルター５０５の法線方向から見て捕捉領域よりも外側の位置に配置されている。この構成においては、細胞捕捉デバイス５００の外部から、面５６０を通してフィルター５０５上の観察領域５４５を顕微鏡観察する場合に、観察の障害となる構造物が存在しない。このため、観察領域５４５をより広く設定することが可能であり、最大で、フィルター５０５の捕捉領域と同一の領域にまで広げることが可能となる。また、流出管５３５は下部部材５１５の側面に配置されている。その他の点については細胞捕捉デバイス１００と同様である。
　続いてフィルターについて説明する。
　図７（Ａ）は、フィルターの一実施形態を示す概略図である。フィルター６００は、複数の貫通孔６１０が形成された基板６２０からなり、面６３０の表面にＣＴＣが捕獲される。貫通孔６１０の配置は、図７（Ａ）のような整列配置でもよく、列毎に配置がずれた千鳥配置でもよく、任意に配置されたランダム配置であってもよい。
　図７（Ｂ）は、フィルター６００の貫通孔６１０の上面図である。貫通孔６１０の開口形状は、短辺がａ、長辺がｂである長方形の短辺に隣接して、半径がｃである２つの半円形が結合した形状である。一実施形態において、ａ、ｂ、ｃはそれぞれ８、３７及び４μｍである。
　一実施形態において、フィルターの基板６２０の材質としては、木綿、麻等の天然高分子、ナイロン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリオレフィン、ハロゲン化ポリオレフィン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリ（メタ）アクリレート、ハロゲン化ポリオレフィンエチレン－ポリビニルアルコール共重合体、ブタジエン－アクリロニトリル共重合体等の合成高分子あるいはこれらの混合物が挙げられる。また、金属、セラミックス及びこれらの複合材料等も例示できる。
　一実施形態において、フィルターの基板６２０の材質は金属である。金属としては、金、銀等の貴金属、銅、アルミニウム、タングステン、ニッケル、クロム等の卑金属、及びこれらの金属の合金が例示できるがこれらに限定するものではない。金属は単体で用いてもよく、機能性を付与するために他の金属との合金又は金属の酸化物として用いてもよい。酸化や腐食の影響を受けにくいニッケルやステンレス、チタンを主成分とする金属を用いることがより好ましい。ここで、主成分とは、上記基板を形成する材料のうち５０重量％以上を占める成分をいう。これらの金属にフォトリソグラフィーなどの方法を使って、貫通孔を形成することができる。
　貫通孔の開口形状として、円、楕円、長方形、角丸長方形、多角形等が例示できる。効率良く癌細胞を捕獲できる観点からは、円、長方形又は角丸長方形が好ましい。また、フィルターの目詰まり防止の観点からは、長方形又は角丸長方形が特に好ましい。
　一般的なＣＴＣの大きさは直径１０μｍ以上である。ここで、細胞の直径とは、顕微鏡で観察した場合の細胞の輪郭上の任意の２点を結ぶ直線のうち最も長い直線の長さをいう。そこで、血球成分の透過性とＣＴＣの捕捉性能の観点から、貫通孔の平均孔径は、５～１５μｍであることが好ましく、６～１２μｍであることがより好ましく、７～１０μｍであることが特に好ましい。本明細書において、開口形状が楕円、長方形、多角形等の円以外の形状における孔径とは、それぞれの貫通孔を通過できる球の直径の最大値とする。貫通孔の孔径は、例えば開口形状が長方形の場合には、その長方形の短辺の長さとなり、開口形状が多角形の場合には、その多角形の内接円の直径となる。開口形状が長方形や角丸長方形の場合、ＣＴＣや白血球が貫通孔に捕捉された場合であっても、開口部において、開口形状の長辺方向に隙間ができる。この隙間を通して液体が通過可能であるため、フィルターの目詰まりを防止することが可能になる。
　フィルターの貫通孔の平均開口率は０．１～５０％が好ましく、０．５～４０％がより好ましく、１～３０％が特に好ましく、１～１０％が最も好ましい。ここで、開口率とは、フィルター全体の面積に対する貫通孔が占める面積をいう。平均開口率は、目詰まり防止の観点から、大きいほど好ましいが、５０％を超えると、フィルターの強度が低下したり、加工が困難になる場合がある。また０．１％より小さいと目詰まりを発生しやすくなるため、フィルターの癌細胞捕捉性能が低下する場合がある。
　フィルターの基板の厚さは３～１００μｍであることが好ましく、５～５０μｍであることがより好ましく、１０～３０μｍであることが特に好ましい。基板の厚さが３μｍより薄いと、フィルターの強度が低下し、取り扱いが困難になる場合がある。また、基板の厚さが１００μｍを超えると、必要以上の材料を消費したり、加工に長時間かかったりするため、コスト的に不利になったり、精密加工そのものが困難になる場合がある。
　フィルター表面の平坦度は、観察に使用する顕微鏡の倍率にもよるが、ＪＩＳ　Ｂ０６０１－２００１で規定されるＲｚ（最大高さ粗さ）として１０μｍ以下であることが好ましい。
　続いて、本実施形態のフィルターの製造方法を説明する。フィルターの製造方法は特に制限されず、例えば、フォトリソグラフィー法を利用して、エッチングや電気めっきを施すことによる製造方法が挙げられる。フォトリソグラフィー法等を利用した製造方法を以下に説明する。まず、ステンレス等からなる支持体上に感光性のレジストフィルム（感光層）を貼り合わせる。次に、フィルターの貫通孔の開口形状のパターンを有するマスクを感光層上に固定する。続いて、マスク上から光（活性光線）を照射する。光照射後、感光層上に支持体がある場合にはこれを除去し、アルカリ性水溶液、水系現像液及び有機溶剤等の現像液によるウエット現像、又はドライ現像等で未露光部を除去することによって現像し、レジストパターンを形成する。続いて、現像されたレジストパターンをマスクとして、マスクされずに露出している基板上にめっきを行う。めっきの方法としては、例えば、銅めっき、はんだめっき、ニッケルめっき、金めっきなどが挙げられる。めっき処理後、めっき層を支持体及び感光層から剥離すると、めっき層が得られる。このめっき層がフィルターである。得られたフィルターの表面を粗化処理してもよい。粗化処理の方法としては、酸性又は塩基性水溶液等による化学エッチング、サンドブラスト等の物理的処理等が挙げられる。
　続いて細胞捕捉デバイスの使用方法について説明する。
　細胞分散液としては、骨髄、脾臓、肝臓等にプールされている血液、リンパ、組織液、臍帯血等を利用することが可能であるが、体内を循環している末梢血を使うことが最も簡便である。末梢血中のＣＴＣの存在を検出することは、癌の病状進行を判断する有用な手段である。
　細胞分散液中のＣＴＣの存在の有無を検出する場合、細胞捕捉デバイスの流入管に細胞分散液を導入し、フィルター上にＣＴＣを含む細胞を濃縮し、濃縮された細胞の中にＣＴＣが存在するか否かを確認すればよい。流入管への細胞分散液の導入には、加圧又は減圧による方法、ペリスタルティックポンプを使用する方法等が例示できる。また、フィルターの捕捉領域の面積は、例えば１ｍＬの血液からＣＴＣを濃縮する場合、０．２５～１０ｃｍ２が適している。
　上記の方法でＣＴＣを濃縮した場合、ＣＴＣだけでなく白血球等の血球細胞も同時に濃縮される。このため、回収された細胞に癌原発巣に由来する上皮細胞が含まれているか否かを確認することが必要である。例えば、上記の方法でＣＴＣを濃縮した後、蛍光標識された上皮細胞マーカーに対する抗体で染色し、上皮細胞であることを確認することができる。上皮細胞マーカーに対する抗体としては、抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体等が例示できる。
　濃縮した細胞の染色及び観察は、例えば次のようにして行うことができる。細胞を濃縮後の細胞捕捉デバイスの流入管に抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体溶液を導入し、所定時間静置する。続いて、細胞捕捉デバイスの流入管に、洗浄用のバッファーを導入し、未反応の抗体を洗浄除去する。続いて、細胞捕捉デバイスを直接顕微鏡の台座に固定し、蛍光顕微鏡観察を行う。細胞捕捉デバイスに抗体溶液を導入する前に、抗体の非特異的な反応を抑制するためのブロッキング用バッファーを導入してもよい。
　また、上記の方法で濃縮された細胞を回収し、遺伝子を解析することにより、癌細胞であることを確認してもよい。細胞の回収は、例えば、細胞捕捉デバイスの流出管側からバッファーを導入し、流入管側から回収することにより行うことができる。例えば、ｐ５３、Ｋ－ＲＡＳ、Ｈ－ＲＡＳ、Ｎ－ＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＡＰＣ等の遺伝子における変異を解析し、癌細胞であることを確認できる。また、これらの遺伝子解析の結果は、その後の患者の治療方針の決定等にも利用することができる。あるいは、上記の方法で濃縮した細胞のテロメラーゼ活性等を測定することにより、癌細胞であることを確認してもよい。
　細胞分散液中のＣＴＣの存在の有無の検出が終了した後、細胞捕捉デバイスの流出管側から洗浄バッファーを導入し、流入管側から排出することにより、フィルターに捕捉された細胞を洗浄除去し、細胞捕捉デバイスを再利用することも可能である。
１００，２００，３００，４００，４０１，５００…細胞捕捉デバイス、１０５，２０５，３０５，４０５，５０５，６００…フィルター、１１０，２１０，３１０，４１０，５１０…上部部材、１１５，２１５，３１５，４１５，５１５…下部部材、１２０，２２０，３２０，４２０，５２０…筐体、１２５，２２５，３２５，４２５，５２５…流入管、１３０，２３０，３３０，４３０，５３０…流入口、１３５，２３５，３３５，４３５，５３５…流出管、１４０，２４０，３４０，４４０，５５０…流出口、１４５，２４５，３４５，４４５，５４５…観察領域、１５０，２５０，３５０，４５０，５５０…下部部材の内壁、１５５，２５５，３５５，４５５，５５５…接合領域、１６０，１７０，２６０，２７０，３６０，３７０，４６０，４７０，５６０，５７０，６３０…面、４８０…ガスケット、６１０…貫通孔、６２０…基板、ａ…短辺、ｂ…長辺、ｃ…半径。

Claims (5)

  1. 　細胞分散液が流入する流入管が接続された流入口と、前記細胞分散液が流出する流出管が接続された流出口とを有する筐体と、
    　前記筐体内に配置され、前記細胞分散液に含まれる癌細胞を捕捉する捕捉領域を有するフィルターとを備え、
    　前記フィルターは、前記筐体に接合されており、
    　前記捕捉領域の少なくとも一部は外部から前記捕捉領域を観察するための観察領域となっており、
    　前記流入管及び前記流入口は、前記フィルターの法線方向から見て前記観察領域よりも外側の位置に配置され、
    　前記流入管は、前記フィルターの面内方向に沿って延びている、細胞捕捉デバイス。
  2. 　前記流入管及び前記流入口は、前記フィルターの法線方向から見て前記捕捉領域よりも外側の位置に配置されている、請求項１に記載の細胞捕捉デバイス。
  3. 　前記フィルターは、実質的に平坦である、請求項１又は２に記載の細胞捕捉デバイス。
  4. 　前記フィルターは、金属からなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞捕捉デバイス。
  5. 　前記筐体の少なくとも一部は、可視光領域において実質的に透明である、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞捕捉デバイス。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013172265A1 (ja) * 2012-05-14 2013-11-21 日立化成株式会社 癌細胞捕捉金属フィルタ、癌細胞捕捉金属フィルタシート、癌細胞捕捉デバイス、及び、それらの製造方法
WO2015145793A1 (ja) * 2014-03-28 2015-10-01 日立化成株式会社 細胞捕捉装置、前処理部付き細胞捕捉デバイス、及び前処理部
JP2015198595A (ja) * 2014-04-07 2015-11-12 日立化成株式会社 細胞捕捉デバイス及び細胞捕捉装置
CN105452439A (zh) * 2013-08-09 2016-03-30 日立化成株式会社 细胞捕获设备、细胞捕获系统及细胞捕获设备的制造方法
WO2016056512A1 (ja) * 2014-10-08 2016-04-14 日立化成株式会社 細胞捕捉デバイス
WO2016125254A1 (ja) * 2015-02-03 2016-08-11 株式会社日立製作所 細胞処理デバイス、及び細胞処理システム
WO2017022484A1 (ja) * 2015-07-31 2017-02-09 株式会社村田製作所 濾過フィルタデバイス

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6393492B2 (ja) * 2014-03-07 2018-09-19 国立大学法人 東京大学 試料台及び走査型プローブ顕微鏡
CN106164240B (zh) * 2014-03-27 2018-09-14 日立化成株式会社 细胞捕获器件、细胞捕获过滤器、细胞捕获装置及细胞捕获器件的制造方法
JP6413288B2 (ja) * 2014-03-27 2018-10-31 日立化成株式会社 細胞捕捉装置を有する細胞捕捉処理システム及び該細胞捕捉処理システムの組込用処理液供給キット
USD750785S1 (en) 2014-04-04 2016-03-01 Hitachi Chemical Company, Ltd. Filter sheet for a cell collecting cartridge
USD748801S1 (en) 2014-04-04 2016-02-02 Hitachi Chemical Company, Ltd. Filter sheet for a cell collecting cartridge
USD747487S1 (en) 2014-04-04 2016-01-12 Hitachi Chemical Company, Ltd. Filter sheet for a cell collecting cartridge
USD748267S1 (en) 2014-04-04 2016-01-26 Hitachi Chemical Company, Ltd. Filter sheet for a cell collecting cartridge
USD746467S1 (en) 2014-04-04 2015-12-29 Hitachi Chemical Company, Ltd. Filter sheet for a cell collecting cartridge
SG11201701562WA (en) * 2014-08-29 2017-04-27 Hitachi Chemical Co Ltd Cell trapping method, method for producing specific cell-trapping device, and method for producing specific cell-containing solution
JP2016052300A (ja) * 2014-09-03 2016-04-14 日立化成株式会社 生体物質捕獲システム
EP3072578B1 (en) * 2015-03-23 2020-04-29 ARKRAY, Inc. Method for isolating or detecting rare cell
JP6619271B2 (ja) 2015-03-23 2019-12-11 アークレイ株式会社 稀少細胞を分離又は検出する方法
EP3260201A1 (en) * 2016-06-21 2017-12-27 Hifibio Microfluidic filtration unit and related microfluidic system
CN107881104B (zh) * 2016-09-30 2023-04-14 国立大学法人东京大学 粒子捕获用微装置以及使用它的粒子的捕获、浓缩或分离方法
CN106754245B (zh) * 2016-12-07 2019-04-05 中国科学院深圳先进技术研究院 基于海藻胶液滴的数字pcr芯片及其应用
US20180335434A1 (en) * 2017-05-17 2018-11-22 Hitachi Chemical Company, Ltd. Methods of Detecting Circulating Tumor Cells
CN107099450A (zh) * 2017-05-25 2017-08-29 南方科技大学 一种用于循环肿瘤细胞分离的微流控芯片，一种循环肿瘤细胞分离方法以及计数方法
CN108562743B (zh) * 2018-04-18 2020-12-11 大连理工大学 一种模块化小室及其对血液中稀有细胞高效捕获的应用
CN109107391B (zh) * 2018-10-09 2021-03-23 中南大学湘雅二医院 一种可在显微镜下使用的过滤装置
JP2021019513A (ja) * 2019-07-25 2021-02-18 東ソー株式会社 標的粒子の解析方法
JP7408133B2 (ja) 2019-12-10 2024-01-05 Ｏｒｂｒａｙ株式会社 生体組織の採取方法
CN113546232B (zh) * 2020-04-24 2023-10-27 京东方科技集团股份有限公司 治疗设备及细胞滤膜的制备方法
CN112899146B (zh) * 2021-01-27 2023-06-13 广州安方生物科技有限公司 一种全自动细胞分离系统

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005533502A (ja) * 2002-07-24 2005-11-10 ボード オブ レジェンツ，ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム 膜法による微生物の捕捉と検出
JP2008067622A (ja) * 2006-09-13 2008-03-27 Fujitsu Ltd 細胞捕捉装置および細胞捕捉装置の温度制御方法
WO2010135603A2 (en) 2009-05-20 2010-11-25 California Institute Of Technology Method for cancer detection, diagnosis and prognosis
JP2013042689A (ja) * 2011-08-23 2013-03-04 Hitachi Chemical Co Ltd 癌細胞濃縮フィルター

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0364498B1 (en) * 1987-08-27 1993-03-10 Polyfiltronics Limited Filter units for biological sample preparation
DE69305947T2 (de) * 1992-09-18 1997-03-13 Amersham Int Plc Vorrichtung und Methode zur Affinitätstrennung
US5437998A (en) * 1993-09-09 1995-08-01 Synthecon, Inc. Gas permeable bioreactor and method of use
US5882943A (en) * 1996-07-31 1999-03-16 Aldeen; William Erick Filtration apparatus, kit and method for processing parasite samples
DE102006053540B3 (de) * 2006-11-14 2008-01-31 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Vorrichtung und Verfahren zur Analyse biologischer Proben
EP2350309A4 (en) * 2008-10-20 2012-12-05 Photonic Biosystems Inc FILTER TEST METHOD AND DEVICE
SG181676A1 (en) * 2009-12-23 2012-07-30 Cytovera Inc A system and method for particle filtration
JP5704590B2 (ja) * 2010-02-05 2015-04-22 国立大学法人東京農工大学 サイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた循環腫瘍細胞の検出

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005533502A (ja) * 2002-07-24 2005-11-10 ボード オブ レジェンツ，ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム 膜法による微生物の捕捉と検出
JP2008067622A (ja) * 2006-09-13 2008-03-27 Fujitsu Ltd 細胞捕捉装置および細胞捕捉装置の温度制御方法
WO2010135603A2 (en) 2009-05-20 2010-11-25 California Institute Of Technology Method for cancer detection, diagnosis and prognosis
JP2013042689A (ja) * 2011-08-23 2013-03-04 Hitachi Chemical Co Ltd 癌細胞濃縮フィルター

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP2818542A4

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013172265A1 (ja) * 2012-05-14 2013-11-21 日立化成株式会社 癌細胞捕捉金属フィルタ、癌細胞捕捉金属フィルタシート、癌細胞捕捉デバイス、及び、それらの製造方法
US10246684B2 (en) 2012-05-14 2019-04-02 Hitachi Chemical Company, Ltd. Cancer cell-trapping metal filter, cancer cell-trapping metal filter sheet, cancer cell-trapping device, and manufacturing methods therefor
CN105452439A (zh) * 2013-08-09 2016-03-30 日立化成株式会社 细胞捕获设备、细胞捕获系统及细胞捕获设备的制造方法
CN105452439B (zh) * 2013-08-09 2018-06-08 日立化成株式会社 细胞捕获设备、细胞捕获系统及细胞捕获设备的制造方法
US10247647B2 (en) 2013-08-09 2019-04-02 Hitachi Chemical Company, Ltd. Cell trapping device, cell trapping system, and production method for cell trapping device
WO2015145793A1 (ja) * 2014-03-28 2015-10-01 日立化成株式会社 細胞捕捉装置、前処理部付き細胞捕捉デバイス、及び前処理部
JP2015198595A (ja) * 2014-04-07 2015-11-12 日立化成株式会社 細胞捕捉デバイス及び細胞捕捉装置
WO2016056512A1 (ja) * 2014-10-08 2016-04-14 日立化成株式会社 細胞捕捉デバイス
JPWO2016056512A1 (ja) * 2014-10-08 2017-07-06 日立化成株式会社 細胞捕捉デバイス
WO2016125254A1 (ja) * 2015-02-03 2016-08-11 株式会社日立製作所 細胞処理デバイス、及び細胞処理システム
WO2017022484A1 (ja) * 2015-07-31 2017-02-09 株式会社村田製作所 濾過フィルタデバイス

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Publication number Publication date
CN107917859A (zh) 2018-04-17
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JP2013138658A (ja) 2013-07-18

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