WO2013091612A2 - Neue aus pflanzen stammende cis-regulatorische elemente für die entwicklung pathogen-responsiver chimärer promotoren - Google Patents

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Fridtjof WELTMEIER
Reinhard Hehl
Jeanette KOSCHMANN
Julia NIEMEYER
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Kws Saat Ag
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Definitions

  • the present invention relates to cis-regulatory elements and chimeric promoters with pathogen- or elicitor-induced activity in plants prepared from these cis-regulatory elements.
  • the present invention relates to a host cell, a transgenic plant cell, a transgenic plant tissue and a transgenic plant and their seeds.
  • the present invention further relates to a method for producing a transgenic plant which is particularly resistant to a pathogen.
  • Plant diseases caused by fungi, viruses, nematodes and bacteria cause large crop losses worldwide, impair the quality of the harvested products and make a complex use of chemical pesticides necessary, because the natural defenses of the plants, with the help of which the majority of potential
  • Effectors which induce a strong resistance response of the plant are e.g. Proteins of auto-activated resistance genes (R genes) or avirulence genes, which lead to the activation of endogenous resistance genes of the plant.
  • the strong resistance response includes the hypersensitive response (HR), the controlled cell death of the host tissue at the
  • pathogen-induced expression of transgenes such as effectors can be achieved by using various known, natural pathogen-inducible promoters, such as the PR1 promoter (Rushton et al., 1996).
  • pathogen-inducible promoters such as the PR1 promoter (Rushton et al., 1996).
  • the development of microarray technology has led to the identification of a large number of pathogen-inducible promoters (WO 03/00898, WO 02/50293 or JP 2003284566).
  • natural pathogen-inducible promoters can show very nonspecific activities because they can be activated by many different stimuli. This is due to a modular structure of the promoter from several different cis-regulatory elements, which integrate a variety of different signals in a complex expression profile. Thus, natural pathogen-inducible promoters are also characterized by undesired activities such as in certain tissues or by high background activity.
  • pathogen-inducible promoters of wheat defensin genes are also active during seed development and seed germination (Kovalchuk et al., 2010).
  • PR1 promoter is induced not only by pathogens but also by senescence (Morris et al., 2000).
  • One way to increase the desired specificity of a promoter is to identify the cis-regulatory elements responsible for the desired induction, and to construct chimeric promoters from these cis-regulatory elements (Venter, 2007). Sequence motifs for other stimuli are removed.
  • the promoters of many pathogen-induced genes have been studied more closely, with several cis-regulatory elements being able to mediate pathogen-specific induction identified (Strittmatter et al., 1996; Eulgem et al., 2000; Kirsch et al. 2000, 2001; Himmelbach et al., 2010).
  • Further examples are the cis-regulatory elements D-box, S-box or W-box (WO 00/29592) identified by stepwise mutation of natural pathogen inducible promoters or the left scanning regions LS10 or LS7 (Lebel et al., US Pat. 1998).
  • the W box is well studied, and its core sequence TTGAC (C / T) can be used to find additional variants of the W box in natural pathogen inducible promoters.
  • new cis-regulatory elements can be bioinformatically identified using programs such as MEME (Bailey and Elkan, 1994; Humphry et al., 2010) or BEST (Che et al., 2005).
  • MEME Mobile Element
  • BEST Garnier et al., 2005.
  • An advantage here is that a cis-regulatory Element is not identified as a short single sequence, but as a well-defined sequence motif over which several variants of a cis-regulatory element, ie several variants of a binding site of a transcription factor, are detected.
  • pathogen-inducible chimeric promoters Another problem in the development of pathogen-inducible chimeric promoters is their functionality in different plant species. Although it is generally possible to detect pathogen inducibility by the known, pathogen-inducible chimeric promoters in virtually all the plant species investigated so far, these continue to show background activity even under non-infestation conditions by a pathogen. This background activity varies depending on the plant species in which the chimeric promoters are used. The same applies to the induction rate (quotient of the promoter activity in the infected tissue and the promoter activity in the uninfected tissue) and the absolute activity of the promoters (promoter strength). Thus, for example, due to excessive background activity in uninfected tissue, only low pathogen inducibility in the infected tissue can be detected.
  • the described cis-regulatory elements of a promoter are held responsible for the described fluctuations in background activity, induction rate, promoter strength, induction kinetics and the spatial extent of the promoter activation (Rushton et al., 2002, Venter, 2007).
  • the known chimeric promoters are superior to the natural promoters, there continues to be a need for optimization of these chimeric promoters, in particular with regard to the cis-regulatory elements and / or to the combinations of cis-regulatory elements.
  • an “elicitor” in the context of the present invention is an inducer or messenger substance which induces defense measures against plant pathogens, such as, for example, the synthesis of phytoalexins.
  • Elicitors can be either endogenous or exogenous
  • an elicitor is from a pathogen and is recognized by the plant.
  • These elicitors also include the PAMPs (pathogen associated molecular pattern) such as flagelin, PEP25 and chitin.
  • Elicitors can be used to treat a pathogen infection or contact with a person
  • elicitors are used in particular to check the inducibility of promoters.
  • a “single sequence” is a sequence of nucleotides or bases (pairs), each position in the single sequence being defined only by a single, well-defined base (a, c, g or t).
  • a single sequence is isolated from a natural promoter and represents the result of a bioinformatic analysis.
  • a single sequence is from a
  • Single sequence also means a nucleic acid molecule whose nucleotide or
  • a “core sequence” is the sequence of nucleotides or bases (pairs) in one
  • core sequence represents part of the single sequence.
  • core sequence also means a nucleic acid molecule whose nucleotide or base (pair) sequence corresponds to the core sequence.
  • a “promoter” means an untranslated DNA sequence, typically upstream of a coding region that includes the binding site for the RNA polymerase, and the Transcription of the DNA initiated.
  • a promoter often also contains other elements that act as regulators of gene expression (eg, cis-regulatory elements).
  • a "minimal promoter” is a promoter that has only the basic elements needed for transcription initiation (e.g., TATA box and / or initiator).
  • a "chimeric promoter” is a promoter referred to, which does not occur in nature, is composed of several elements. It contains a minimal promoter and has upstream of the minimal promoter at least one cis-regulatory element, which serves as a binding site for special frans-acting factors (trans-acting factors, for example transcription factors).
  • a chimeric promoter is designed to the desired requirements and induced or repressed by various factors. The choice of the cis-regulatory element or combination of cis-regulatory elements is critical, for example, to the specificity or activity level of a promoter.
  • a cis-regulatory element in a chimeric promoter is either heterologous to the minimal promoter used, i. the cis-regulatory element is from a different organism or species than the minimal promoter used (exemplified in Figure 15A-C), or a cis-regulatory element in one
  • Chimeric promoter is homologous to the minimal promoter used, i. the cis-regulatory element and the minimal promoter are also present in a natural promoter, but the cis-regulatory element is located alone or as an additional element within the chimeric promoter in a different genetic environment compared to the natural promoter. Accordingly, a chimeric promoter also means a (natural) promoter which has been altered by multimerizing at least one cis-regulatory element (shown by way of example in FIG. 15D).
  • a "complementary" nucleotide sequence, relative to a double-stranded DNA means that the second DNA strand complementary to the first DNA strand has the nucleotide bases corresponding to the bases of the first strand in accordance with the base pairing rules and taking into account the orientation (eg: 5'-gcat) 3 'is complementary to 5'-atgc-3 ").
  • a "pathogen” means an organism that interacts with a plant
  • pathogens include, for example, animal, fungal, bacterial or viral organisms or oomycetes.
  • a "pathogen infection” is to be understood as the earliest time at which the
  • Metabolism of a pathogen is prepared for a penetration of the plant host tissue.
  • These include e.g. In the case of fungi or oomycetes, the growth of hyphae or the formation of specific infection structures such as penetration hyphae and appressoria.
  • pathogen / elicitor-inducibility or "pathogen / elicitor-inducible” means the specific property of a promoter which
  • pathogen / elicitor inducibility or “pathogen / elicitor inducible” in the sense of the invention means the property of genes which are transcribed at least twice more after pathogen infection or elicitor application.
  • the solution of the problem is achieved by new pathogen and / or elizitor inducibility cis-regulatory elements mediating. These differ, in particular within the core sequence, significantly from already known elements and thus do not represent any variations of the known elements. Accordingly, the cis-regulatory elements according to the invention should serve as recognition and / or binding sites for new transcription factors, with the result that the mediated pathogen and / or elicitor inducibility has a novel specificity.
  • the cis-regulatory elements according to the invention were identified via bioinformatory approaches in promoters of pathogen or PAMP (Elizitor) -induced Arabidopsis thaliana genes.
  • the isolated individual sequences of the cis-regulatory elements could be attributed to eight motif groups (motif group 1, 5, 1 1, 12, 18, 21, 27 and 32) as a result of various analysis steps. Furthermore, several isolated single sequences could be assigned to a motif group 21 n. In a motif group, those are single sequences
  • an isolated cis-regulatory element which comprises a nucleic acid molecule whose nucleotide sequence is one of the core sequence motifs
  • Core sequence motifs a) to i) are given as follows: Y 'is guanine (g) or adenine (a), ie a purine base,' k 'is guanine (g) or thymine (t) / uracil (u),' s' stands for guanine (g) or cytosine (c), 'm' stands for adenine (a) or cytosine (c) and W stands for adenine (a) or thymine (t) / uracil (u).
  • a particular core sequence motif represents at least a subsequence of the core sequence of each single sequence of the motif group belonging to the core sequence motif, wherein the subsequence represents at least 30% of the total core sequence of a
  • the core sequence motif corresponds to the entire core sequence of the individual sequences.
  • the core sequence motif corresponds to the entire core sequence of the individual sequences.
  • the invention is also an isolated cis-regulatory element with
  • the core sequence motif of a specific motif group can also occur multiple times in the core sequence of a single sequence, whereby the core sequence motifs also appear overlapping in the core sequence and / or in each case a different one
  • the core sequence of Cis09 from motif group 1 has, on the one hand, a partial sequence which corresponds to the core sequence motif acrcg and, on the other hand, a partial sequence overlapping two bases, which corresponds to the complementary core sequence motif of acrcg, namely cgygt.
  • a partial sequence overlapping two bases which corresponds to the complementary core sequence motif of acrcg, namely cgygt.
  • motif group 11 21G-2_M1_S2 where the core sequence has two subsequences that overlap one base and correspond to the complementary core sequence motif of aaacca, tggttt, respectively.
  • motif groups 5-11 12, 21, 21 n and 27 a family motif could be defined based on the experimental data on functionality, in which the characteristic core sequence motif is embedded.
  • the family motif represents a derivative
  • a family motive includes one
  • a family motif defined in this way has a length of at least 15 nucleotides, preferably of at least 13 nucleotides, more preferably of at least 11 nucleotides.
  • the family motif has flanking regions which, when using a cis-regulatory element according to the invention in a chimeric promoter, have a substantial quantitative influence on its properties, such as background activity and expression strength. As the distance of a particular base of the flanking regions to the core sequence increases in a single sequence, their quantitative impact decreases.
  • family motifs may also contain more about the core sequences of the
  • the invention also includes an isolated cis-regulatory element which comprises a nucleic acid molecule whose nucleotide sequence
  • g corresponds to a family motif according to SEQ ID NO: 41, comprising the core sequence motif wwkgwc,
  • the family motive can also be shorter. In its shortest form, it is defined as a minimal family motive that, after aligning the individual sequences according to the common core sequence motif, combines only those base positions which are found in the core sequences of all the individual sequences of a motif group. In some cases, the minimal family motive corresponds to the
  • the invention also relates to all identified and isolated individual sequences of cis-regulatory elements according to the invention and their core sequences (Tables 1 and 2).
  • the stated object is thus also achieved by an isolated cis-regulatory element comprising a nucleic acid molecule
  • nucleic acid molecule having a nucleotide sequence complementary to one of the nucleotide sequences from a) or b).
  • a cis-regulatory element comprising a nucleic acid molecule having a
  • Nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 26 is the motif group 1, one having a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 or SEQ ID NO: 32 of motif group 5 , one having a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19 of motif group 1 1, one having a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23 of motif group 12, one having a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 33 of motif group 18, one having a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 28 the motif group 21, one with a
  • Nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 42 or SEQ ID NO: 43 of motif group 21 n one having a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 15 of motif group 27 and a such with the nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 34 assigned to the motif group 32.
  • a cis-regulatory element according to the invention may have a length of less than 50 nucleotides, preferably less than 40 nucleotides, and more preferably of have less than 30 nucleotides.
  • the core sequence of a cis-regulatory element of the invention may have a length of less than 20 nucleotides, preferably less than 15 nucleotides, and more preferably less than 10 nucleotides, but the core sequence should not be shorter than 6 nucleotides.
  • some individual sequences of the cis-regulatory elements according to the invention may additionally also have the core sequence of a cis-regulatory element which mediates known pathogen / elicitor-inducibility, which may also influence the specificity of the new identified core sequence and / or the identified single sequence .
  • a cis-regulatory element which mediates known pathogen / elicitor-inducibility, which may also influence the specificity of the new identified core sequence and / or the identified single sequence
  • An example is the cis-regulatory element Cis05 (SEQ ID NO: 14), that in addition to the identified core sequence between nucleotide positions 14 and 20, a W-box core sequence between the
  • a cis-regulatory element of the invention may be used in a chimeric promoter, wherein the cis-regulatory element mediates specific pathogen and / or elicitor-inducibility to the chimeric promoter.
  • the present invention thus also includes a chimeric promoter which is suitable, induced by pathogen infection or treatment with a pathogenic elicitor, expression of an operably linked nucleic acid molecule of interest, e.g. a heterologous DNA sequence to effect in a plant cell and which comprises a minimal promoter and at least one cis-regulatory element according to the invention.
  • a single cis-regulatory element of this invention in such a chimeric promoter alone is already capable of mediating significant pathogen and / or elicitor inducibility. So this one cis-regulatory element is enough to be able to do so
  • such a chimeric promoter containing as cis-regulatory elements only one or more cis-regulatory elements of the invention is pathogen-responsive and / or elicitor-responsive, i. this promoter is not or only in a small amount
  • Extent inducible by other stimuli such as abiotic stress.
  • the induction of such a chimeric promoter comprising one or more cis-regulatory elements according to the invention after pathogen / elicitor contact is at least 2-fold, preferably at least 10-fold or more preferably at least 25-fold higher than the induction without pathogen / elicitor contact ( background activity).
  • the induced expression occurs only locally limited to the site of infection, ie, in a comparable or to a lesser extent as occurs in the controlled expression of natural PR genes.
  • transcriptional activation controlled by a chimeric promoter of the present invention occurs only in the cells that come in contact with the pathogen or the pathogenic elicitor.
  • transcriptional activation may also take place in cells which cause the transcription activation
  • chimeric promoters of the present invention are not limited to those that are exclusively pathogen responsive. By combining with other regulatory elements, induced expression can be further specified, e.g. by combining with a cis-regulatory element, for example tissue specificity, storage inducibility, cold or heat inducibility or a specific activity at certain developmental stages. Chimeric promoters of the invention may also comprise at least one combination of at least two cis-regulatory elements, said at least one combination comprising at least one cis-regulatory element according to the invention. As further cis-regulatory elements in the
  • Combination may also be known pathogen / Elizitor-Inductibility cis regulatory elements such as W-box, S-box or D-box (see WO 00/29592)
  • Construction of a chimeric promoter can be used.
  • the invention also includes a chimeric promoter comprising one or more monomers and / or one or more multimers of the cis-regulatory elements of the invention.
  • Preferred multimeric forms are dimers and tetramers.
  • Monomers alone or single monomers within a mutimer can be different
  • Cis-regulatory elements of a multimeric form according to the invention may be functionally linked together, i. in a multimeric form they show a synergistic or antagonistic effect, for example on the binding capacity of the transcription factor, which among other things, the characteristic core sequence motif of a particular
  • the invention also includes a chimeric promoter which is suitable, induced by a pathogen infection or a treatment with a pathogenic Elizitor to effect expression of an operably linked nucleic acid molecule of interest in a plant cell and which comprises a minimal promoter and at least two cis comprises regulatory elements, wherein the at least two cis-regulatory elements can be functionally linked in homo- and / or heteromeric form.
  • Cis-regulatory elements according to the invention are at least 2-fold, preferably at least 10-fold or more preferably at least 25-fold higher than the induction without pathogen / Elizitor contact (background activity) after pathogen / Elizitor contact.
  • the distance from the minimal promoter and to the first upstream cis-regulatory element of the invention is between 0 and 300
  • Base pairs preferably between 0 and 70 base pairs, and more preferably less than 10 base pairs. Additionally or alternatively, the distance between two identical monomers of the cis-regulatory elements according to the invention in a multimeric form is preferably 0 to 10 base pairs. Preferably, two separate multimers in a chimeric promoter of the invention are separated by about 0 to 50 base pairs.
  • Induction factor but developed a particularly low background activity (e.g., 4xCis05-2xD in sugar beet).
  • the invention also includes all
  • Promotors have. Advantageous combinations are those which can be selected from the following group: 4x sCis05, 4x 20u_M1_S1, 4x 27G-8_M1_S1, 4x
  • the present invention also relates to chimeric promoters comprising at least one of the above-mentioned combinations of cis-regulatory elements.
  • the minimal promoter originates for example from a CaMV35S promoter, for
  • monocotyledonous plants for example, from the wheat TaPal promoter (SEQ ID NO: 39), the maize ZmUbiquitin promoter (SEQ ID NO: 40) or the rice OsGns1 promoter (SEQ ID NO: 38), or for dicotyledonous plants from known minimal promoters (WO 07/147395).
  • minimal promoters from other sources for the construction of a chimeric promoter in the context of the present invention.
  • a chimeric promoter of the present invention fulfills the essential requirements associated with the stringent expression regulation of a transgene in a genetic engineering approach, e.g. for the production of a pathogen / disease resistant plant.
  • the transgene is a nucleic acid molecule of interest with the chimeric promoter, e.g. a heterologous DNA sequence which
  • Avirulence gene another effector, a protein that is toxic to at least one pathogen, signal transduction components, a protein that encodes the synthesis of phytoalexins, a double-stranded RNA for the formation of pathogen-directed siRNAs, or an antimicrobial peptide.
  • a chimeric promoter of the present invention functions and can be used across species (see, for example, 4xCis05 in parsley, sugar beet and Wheat).
  • the invention also relates to a recombinant gene comprising a chimeric promoter of the present invention.
  • the recombinant gene is designed so that the chimeric promoter is operatively linked to a
  • Nucleic acid molecule e.g. a heterologous DNA sequence.
  • a heterologous DNA sequence encodes a (poly) petid, a cytotoxic protein (such as Bt toxin, avirulence protein or enzymes such as glucose oxidases that produce reactive oxygen species), an antibody, an antisense RNA, a sense RNA, a Transcription factor, a protease, a nuclease, a lipase, an enzyme inhibitor or a measurable marker (such as luciferase, GFP or ß-galactosidase).
  • cytotoxic protein such as Bt toxin, avirulence protein or enzymes such as glucose oxidases that produce reactive oxygen species
  • an antibody an antisense RNA, a sense RNA, a Transcription factor, a protease, a nuclease, a lipase, an enzyme inhibitor or a measurable marker (such as luciferase, G
  • Chimeric promoters of the invention can also be used in RNAi-based gene silencing methods, where the operably linked nucleic acid molecule of interest encodes, for example, an antisense RNA, a sense RNA or a double-stranded RNA (dsRNA).
  • the RNA molecule may then be a short nucleotide sequence (generally at least 10 nucleotides, preferably at least 14 nucleotides and optionally up to 100 or more nucleotides in length), which is substantially complementary to a specific mRNA sequence and / or a DNA sequence a gene of interest.
  • a recombinant gene of the present invention can be used both alone and as part of a vector. Accordingly, the present invention also relates to a vector comprising the chimeric promoter of this invention or the recombinant gene of this invention.
  • the vector is a plant expression vector, which preferably also further comprises a selection marker for plants. Examples of suitable markers are already listed above. Methods for constructing such vectors are known to those skilled in the art, e.g. described in Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.V. (1989).
  • the present invention also relates to a prokaryotic or a eukaryotic host cell which comprises a chimeric promoter, a recombinant gene or a vector according to the invention, wherein the chimeric promoter itself or as part of the recombinant gene or as part of the vector or in each case a part of the Chimeric promoter such as a cis-regulatory element is heterologous to the prokaryotic or eukaryotic host cell, that is, for example, from a cell or an organism with a different genetic background, or is homologous to the prokaryotic or
  • the chimeric promoter, recombinant gene or vector of the invention may be either integrated into the genome of the prokaryotic or eukaryotic host cell, preferably stably integrated, or may remain in the cell in an extrachromosomal form such as a plasmid.
  • the invention provides a method of producing a transgenic plant comprising introducing a chimeric promoter, a recombinant gene or a vector according to the present invention into at least one cell of the plant or comprising introducing a chimeric promoter, a recombinant gene or a Vector according to the present invention in at least one plant cell in a cell culture, from which subsequently the transformed or transgenic plant is regenerated.
  • the chimeric promoter, the recombinant gene or the vector is integrated into the genome of the plant, particularly preferably stably integrated.
  • Nucleic acid molecule with further regulatory sequences such as at the 3 'end of a poly-A tail be connected.
  • Methods for introducing genes or genetic material into a plant or into a plant cell and methods for the regeneration of transformed plant cells are known from the prior art, for example, Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium z / Zogenes-mediated transformation of plant cells or tissues with T-DNA, the protoplast fusion, injection,
  • a plant cell may be modified such that this plant cell is an endogenous gene under the control of a chimera
  • Promoter according to the present invention or under the control of a modified by cis-regulatory elements of the invention native promoter of the endogenous gene The introduction of such a chimeric promoter, which does not naturally regulate the expression of a particular gene or genomic sequence, to the desired site in the plant genome or the introduction of cis-regulatory elements of the invention into a native promoter of the endogenous gene.
  • Promoter can be synthesized by known standard methods, for example, by gene targeting using zinc finger nucleases (Urnov et al., Nature Reviews 2010, Genome editing with engineered zinc finger nucleases, Townsend et al., Nature 2009_ High-frequency modification of plant genes using engineered zinc-finger nucleases) or TAL effector nucleases (WO 2010/079430, WO 201 1/072246).
  • the modification of a native promoter of an endogenous gene also means the additional introduction of a cis-regulatory element according to the invention into the native promoter, which naturally already has a cis-regulatory element according to the invention, ie a multimerization of existing cis-regulatory elements.
  • Such a modified promoter may have altered properties in terms of, for example, specificity, expression level or background activity compared to the native version.
  • modified plants can be regenerated by known methods.
  • the invention further relates to transgenic (transformed) plants which have been transformed with a chimeric promoter, a recombinant gene, a vector according to the present invention, and described plants modified by the introduction of at least one cis-regulatory element of the invention or of a chimeric promoter according to the invention.
  • Transgenic or modified plants can be derived from any desired plant species. They may be monocotyledonous, dicotyledonous or angiospermic plants, preferably belonging to them
  • Plant species of agricultural or horticultural interest for example maize, rice, wheat, rye, barley, oats, sorghum, potatoes, oilseed rape, sunflower, soybean, cotton or sugarbeet.
  • a transgenic or modified plant is resistant or exhibits increased resistance to one or a plurality of pathogens compared to a non-transgenic or unmodified plant of the same species (wild-type).
  • the present invention further includes a plant part, a plant tissue, a plant cell or a seed of the transgenic and the modified plant of
  • This invention includes, this plant part, this
  • Plant tissue, this plant cell or seeds also have the introduced into the plant transgene or the introduced modification.
  • Figure 1 As an example of cloning of the individual sequences as chimeric promoters, the plasmids are shown with 2xCis05 element and the multimerized 4xCis05 element.
  • the plasmids are derived from pBT10-GUS (Sprenger and Weisshaar (2000): The Plant Journal 22, 1-8). The structure of the other plasmids is corresponding. Amp: ampicillin resistance; WRKY30-Cis05: Double single sequence Cis05. 35S minimal: 35S min promoter; Lucm3: luciferase reporter gene; pAnos: nos-terminator.
  • FIG. 2 Species-spanning pathogen-inducible single sequences (A - X). In the upper lines are each the name of the single sequence, the motif group, and the
  • FIG. 3 Summary of all positively tested individual sequences of a motif group and representation of the sequence and family motifs derived therefrom (FIGS. 3A-G). In the top line is the respective motif group called. Below this, an alignment of all positively tested individual sequences is shown which comprises at least the core sequences and, if present, further conserved bases. The bases that make up the
  • Derived core sequence motif are provided with a frame.
  • FIG. 4 Phylogenetic family tree of the identified motif groups.
  • the family tree was created by a cluster analysis using the web server STAMP. Behind the number of the motif group in parentheses is the number of motifs contained in the motif group.
  • FIG. 5 A) Mutagenesis of the Cis05 single sequence.
  • the sequence used contains, in addition to the Cis05 motifs (bold, underlined) a W box (bold and framed). Mutations were introduced in both motifs.
  • parsley assays were performed on the tetramerized mutant derivatives for induction by the PAMP PEP25. The PAMP-induced activity of the chimeric promoters was measured after 4, 8 and 24 hours (right side). Mutations in the Cis05 motif (Cis05mut1) as well as in the W-box (Cis05mut2) lead to a significant decrease of the induced activity. Only when both motives are mutated (Cis05mut1 + 2) is it completely lost
  • sCis05 is a shortened version of Cis05 that only contains the Cis05 motif but no longer the W-Box.
  • the PEP25 inducibility of sCis05 and mutated derivatives was tested as described in FIG. 5A. The two bars represent two biological replicates (independent transformations). For orientation, the W box consensus is shown under sCis05 derivatives.
  • FIG. 6A Elicitor-responsive reporter gene expression of the chimeric promoters 4x301-8_M1_S2 and 4x18H_M2_S1 with mutations in the individual sequences.
  • the mutated bases are underlined. Elicitation was by PEP25 in parsley protoplasts.
  • the nucleotide sequences of the mutated derivatives of the single sequences are among the
  • FIG. 6B Elicitor-responsive reporter gene expression of the chimeric promoters 4x20u_M1_S1 and 4x27G-8_M1_S1 with mutations in the individual sequences. The mutated bases are underlined. Elicitation was by PEP25 in parsley protoplasts. The nucleotide sequences of the mutated derivatives of the single sequences are shown below the diagrams.
  • FIG. 7 Binary vector for the transformation of the luciferase reporter gene under control of the chimeric promoters in sugar beet.
  • the vector is shown with the chimeric promoter 4xCis05, nptll: kanamycin resistance; WRKY30-Cis05: Double single sequence Cis05. 35S minimal: 35S min promoter; Iuc-m3: luciferase reporter gene; Anos: nos terminator.
  • Fig. 8A Cercospora beticola induced promoter activity in stably transformed
  • Transformants determined the luciferase activity after C. beticola infection of in vitro plants (4 replicates per transformant and time point). The median was calculated from the measured values obtained. In the upper diagram are the results for
  • Fig. 8B Cercospora beticola induced promoter activity of 4xCis05 and its derivatives in stably transformed sugar beets.
  • the luciferase activity after C. beticola infection was determined in each case in several independent transformants (4 replicates per transformant and time). The median was calculated from the measured values obtained.
  • the sequence of the various derivatives is shown in Figs. 5A and 5B. Under the diagram, it is additionally indicated for each of the various derivatives whether it contains the Cis05 motif or the W-box.
  • Ko control (mock infection); inf; Infection with C. beticola; 1d -4d: days after inoculation (d.p.i.).
  • non-transgenic non-transgenic control.
  • FIG. 9 Cercospora beticola induced promoter activity of the chimeric promoter
  • 4xGG6_M1_S1 in stably transformed sugar beet For 10 independent transformants with the construct 4xGG6_M1_S1-luc, the luciferase activity was determined after C. beticola infection of in vitro plants (4 replicates per transformant and time point). Ko: Control (mock infection); inf; Infection with C. beticola; 2d, 3d, 4d and 7d: days after inoculation (dpi). 3DC4156: Non-transgenic control plants.
  • Fig. 10 Plasmid map of the plasmid used for the transient assay in wheat. As an example, the plasmid with the chimeric 4xCis05 promoter is shown. Ruc: Renilla luciferase reporter gene. AMP: ampicillin resistance. WRKY30-Cis05: Double
  • FIG. 1 Test of the induction of the chimeric promoter 4xCis05 and its mutated derivatives with mutations in the Cis05 motif (Cis05mut1), in the W-box (Cis05mut2) or in both motifs (Cis05mut1 +2) by Fusarium.
  • the corresponding constructs were transiently transformed into wheat and the luciferase activity measured 20 hours after incubation with Fusarium.
  • 4xCis05-dam / dcm refers to an experiment in which plasmid DNA was used in a non-methylating E. coli strain to exclude induction by dam / dcm-methylated DNA (also a potential PAMP). If the core sequence of Cis05 is mutated, the inducibility is completely lost. The mutation in the W-box has no effect. The sequences of Cis05 and its mutated derivatives are shown on the right. Mutated bases are highlighted in red.
  • Figure 12 Induced and uninduced activity of chimeric combinatorial promoters after PEP25 induction in parsley. The tests were in three biological replicates
  • the blue line represents the induction factor. Below the diagram, the elements are shown in 5 'position in the lower row and the elements in 3' position in the upper row.
  • 3018b is another name for the single sequence 30I-8_M1_S2.
  • Figure 13 Synergistic and antagonistic interactions of single sequences in the chimeric combinatorial promoters after PEP25 induction in parsley. In Violet the actually measured induction factor is reproduced, in blue the due to the
  • Induction factors of the individual elements expected induction factor.
  • the ratio of both values is represented by the yellow line. If the points of the yellow line are above the value 1, the individual elements show a synergistic interaction.
  • FIG. 14 Transgenic sugar beets with 4xCis05-RFP construct were infected with Cercospora beticola. The infection leads to activation of the chimeric 4xCis05 promoter, resulting in the formation of the red fluorescent RFP protein. The protein can be seen under the microscope as red fluorescence. As can be seen, the induction and thus the fluorescence is limited to the area around the point of penetration or the place of infection.
  • FIG. 15 Exemplary schematic representations of a chimeric promoter within the meaning of the invention.
  • the chimeric promoter is operatively linked to a nucleic acid molecule of interest and comprises (A) a heterologous cis-regulatory element in addition to a minimal promoter, (B) a minimal promoter, a dimer / multimer of a heterologous cis-regulatory element, or (C) a minimal promoter Dimers / multimers, each with different heterologous cis-regulatory elements.
  • (D) exemplifies as a chimeric promoter a natural promoter comprising a minimal endogenous promoter and an endogenous cis-regulatory element, this promoter being modified by integration of an additional homologous cis-regulatory element.
  • FIG. 16 Transgenic Arabidopsis plants with a cis-regulatory tetramer
  • 10 independent transformants were examined. Shown is a representative line. The left picture (5 d.p.i. with H.
  • arabidopsidis in each case shows the activity of the promoter after infection with the compatible pathogen Hyaloperonospora arabidopsidis, the right image (mock control) is the
  • the promoter shows a clear induction by Hyaloperonospora arabidopsidis (darkening of the plant tissue).
  • Interface would indicate a wound inducibility of the promoter with the tetramer of the cis-regulatory element Cis05.
  • Bioinformatic Identification of the cis-regulatory Elements According to the Invention: The basis for the bioinformatory identification of the new cis-regulatory elements are publicly available microarray expression data. These expression data are stored in databases such as TAIR, NASCArrays, Geo or ArrayExpress or can be obtained directly from corresponding publications of microarray experiments (eg Rhee et al., 2003, Craigon et al., 2004, Barret and Edgar, 2006, Brazma et al., 2006, Zipfel et al., 2004, 2006, Bulow et al., 2007; Wan et al., 2008). For the bioinformatory
  • bioinformatic approaches are susceptible to the detection of false-positive sequences, pathogen inducibility must be experimentally confirmed.
  • bioinformatorially identified sequences were cloned into a luciferase reporter gene using standard DNA cloning techniques as tetramer and tested for inducibility by PAMP PEP25 in a transient expression system in parsley.
  • 3C_M1_S1 11 At3g51440 TTTGATACGGTTACGGTTAATTAACG -
  • GG6_M1_S1 11 At2g40140 GACTTTTGACCTAAACCATTTCCAT +
  • GG11_M1_S1 11 At2g40140 GTTTTGACTTTTGACCTAAACCATTTCCATGTAGAA +
  • GG6_M1_S2 11 At5g59820 AAGATTCTCATCCAACCGAAACGACTCTTTCGTTTT -
  • GG11_M1_S3 11 At1g27730 TCTTCTTCATTTTACCAACACCACTTGCACACACAC -
  • 21S_M1_S1 14 At2g 14610 AAGCGATGTTTACGAAC CCCAAAATC -
  • 3D_M1_S1 18 At4g39950 AATAATGTTCAACGTTGGTGGTGGTACTCAAGATGG -
  • GG4_ 2_S1 22 At3g 14990 GAAAAATGTGTGTGTTTGTGTTAATT -
  • GG3_ 1_S1 32 At5g44420 TAGGTTCCTGCCCTCTCCGTTCCTCC -
  • GG3_ 1_S2 32 At4g39980 TCGAAACCAACCCTCTCCCTTATAAA -
  • Normalization vector and 200 ⁇ PEG submitted. 200 ⁇ protoplasts were added, then mixed gently and incubated for 20 min at room temperature in the dark.
  • reaction was stopped by adding 5 ml of 0.275M CaN0 3 -Lsg.
  • the transformed protoplasts were centrifuged off, taken up in 6 ml of P5 medium and divided into 2 aliquots. An aliquot was spiked with Pep25 (final conc .: 300ng / ml;
  • Luciferase activity was determined using the Dual Luciferase Kit (Promega, Mannheim, Germany) in a Sirius luminometer (Berthold Detection System GmbH, Pforzheim, Germany). For this purpose, the parsley cells were pelleted by centrifugation and lysed for 20 minutes at 4 ° C in 150 ⁇ PLB buffer (Passive Lysis Buffer, Promega, Mannheim, Germany). The cell remains are centrifuged for 20 minutes at 13,000 rpm and 4 ° C in a table centrifuge.
  • the lysate was treated differently depending on whether the luciferase reporter gene or the GUS reporter gene was used.
  • the luciferase reporter gene was used, 5 ⁇ of the supernatant containing the luciferase liberated in 5 ml tubes (Sarstedt, Item No. 55,476) with 50 ⁇ M LARII buffer (Promega.
  • the buffer contains the substrate of the luciferase, so that the activity of the enzyme and thus of the promoter can be measured with the luminometer.
  • the measurement takes place with 2 seconds pre-measurement time and 10 seconds
  • Luciferasemesszeit Subsequently 50 ⁇ Stop & Glo Buffers (Promega, Mannheim, Germany) was added and mixed carefully by drawing. This buffer stops the luciferase activity and makes the constitutive Renilla luciferase activity of the
  • the measurement also takes place with 2 seconds pre-measurement time and 10 seconds luciferase measurement time.
  • Table 2 lists all the individual sequences tested. In addition, it is indicated whether they were inducible by the PAMP PEP25 in parsley.
  • the cis-regulatory elements (individual sequences) identified as pathogen-inducible and their motifs are summarized in FIG.
  • Single-sequence mutation analyzes performed. Mutated derivatives of the single sequences were prepared for this purpose. The mutated single sequences were synthesized as oligonucleotides. The cloning of the plasmids was carried out according to the constructs with chimeric promoters without mutations. Subsequently, the constructs were tested for their PEP25 inducibility in parsley as described above. The results of the mutation analyzes are shown in Figs. 5A, 5B, 6A and 6B. For all five investigated elements it could be shown that the identified core sequence is responsible for the inducibility.
  • the core sequence TGAC which is essential for the W-box, is not part of the sequence motif or family motif of group 27 (FIG. 3F).
  • the motifs or the individual sequences of group 27 are not variants of the W-box.
  • Cis05 there is a W-box sequence outside the core sequence. Mutation analyzes showed that this W box mediates PAMP inducibility.
  • mutation of only the Cis05 core sequence or only the W-box leads to a decrease in the inducibility, and only by mutation of both elements does a complete loss of inducibility occur.
  • it is a single sequence with two functional, PAMP and pathogen inducible cis-regulatory elements, the known W box and the new Cis05 motif (Figure 2T). The combination of the two elements shows a significantly higher activity than the
  • the core sequence of motif group 27 is also found in the sequence LS10 (Lehel et al., 1998). There, a 10-base mutation was generated in the native PR-1 promoter in this sequence region, resulting in a sharp decrease in SA or INA inducibility of the native promoter. However, the results shown there do not allow the derivation of a motif or a core sequence. In addition, the
  • the family motif of motif group 27 delimits the motif group from the LS10 sequence.
  • Family motive excludes a C at position 5 while in C LS10 there is a C at that position. Furthermore, it excludes a G at position 17, while in G LS10 there is a G at this position. Finally, at position 18, it requires a T or C while in LS10 there is an A at that position.
  • the new cis-regulatory elements are said to be characterized by the fact that they can be induced in different plant species by different PAMPs and pathogens.
  • the single sequences tested positive in parsley was stably transformed into sugar beet.
  • the chimeric promoters with the tetramerized single sequences including the luc gene via the Asel and Sacl cleavage sites were recloned into the binary vector 1xW1-luc-kan, a plasmid based on the binary vector pGPTV.
  • the vector 4xCis05-luc-kan is shown in FIG.
  • Corresponding vectors were created for all elements studied.
  • the plasmid DNA of the binary vectors were isolated from E. coli and transformed into the Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 using a Gene Pulser® II. Electroporation System with the setting 25 mF and 2.5 kV. The selection of recombinant A. tumefaciens K ⁇ one was carried out using the antibiotic kanamycin (50 mg / l). Sugarbeet transformation was carried out according to Lindsey et al. (1991) using the antibiotic kanamycin.
  • the transgenicity of the plants was checked by PCR.
  • the use of the primers GTGGAGAGGCTATTCGGTA (SEQ ID NO: 36) and CCACCATGATATTCGGCAAG (SEQ ID NO: 37) led to the amplification of a 553 bp DNA fragment from the npt ⁇ gene.
  • PCR was performed using 10 ng of genomic DNA, a
  • Multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, USA). 10 to 20 independent transgenic lines were clonally propagated in in vitro culture and infected with Cercospora beticola (Ahlburg isolate). After 1, 2, 3 and 4 days, 4 plants / line each were harvested and their luciferase activity was monitored with the Promega Luciferase Assay System, 100 assays, Cat. E1500 (LAR) measured. For this purpose, the samples were taken up in 4 volumes of CCLR buffer (Cell Culture Lysis Reagent, 5 ⁇ ) and worked up using a Heidolph (RZR 2020).
  • CCLR buffer Cell Culture Lysis Reagent, 5 ⁇
  • the plant residues were centrifuged for 10 min at 4 ° C and 14000rpm and the supernatant used for the luciferase measurement.
  • 10 ⁇ l of sample were pipetted into a 5 ml tube (Sarstedt, item No. 55,476) and 100 ⁇ l of luciferase assay reagent (LAR; Promega, Mannheim, Germany) added.
  • LAR luciferase assay reagent
  • the mixture was then gently mixed and the luciferase activity determined in a Sirius luminometer (Berthold Detection System GmbH, Pforzheim, Germany).
  • element GG6_M1 (single sequence GG6_M1_S1) was stably transformed into sugar beet and tested for inducibility by Cercospora.
  • 10 independent transgenic sugar beet were clonally propagated in vitro culture and infected with Cercospora beticola (Ahlburg isolate). After 2, 3, 4 and 7 days, 4 plants / line each were harvested and their luciferase activity was monitored with the Promega Luciferase Assay System, 100 assays, Cat. E1500 (LAR) measured.
  • the results are shown in FIG. 9 and show a clear inducibility of the single sequence GG6_M1_S1 in sugar beet by Cercospora beticola. Furthermore, a histochemical analysis showed that the induction is largely in the Leitgewebe.
  • FIG. 14 shows the pathogen-induced activity is restricted to the area of the site of infection.
  • This is shown in FIG. 14 using the example of the promoter according to the invention, 4xCis05.
  • This promoter was fused with the red fluorescent reporter gene RFP, and the resulting construct was stably transformed into sugar beet. Under the laser scanning microscope, the activity can be observed as red fluorescence.
  • FIG. 14 shows the local induction of the 4xCis05 promoter around the penetration site of a Cercospora hyphe.
  • Cis05 was used in transient experiments
  • Cis05 elements had to be recloned. For this they were excised with the enzymes Eco31 1 and Xbal from the plasmids used for the parsley tests and cloned into the vector pubiTATARucll which was opened with Eco31 l and Beul (FIG. 10). Corresponding constructs were prepared for Cis05 and the mutated Cis05 single sequences Cis05mut1 and Cis05mut2, in which either the Cis05 motif or the W-box is mutated. These constructs were biolistically transformed into Fusarium graminearum infected primary leaves of the wheat variety "Typhoon" and uninfected control leaves.
  • Fusarium graminearum mycelium was coated with a microscope slide
  • the wheat leaves were then incubated overnight at 25 ° C. To determine the luciferase activities, the leaves are resorbed in 1 ml of PLB buffer with sea sand. After centrifugation for 20 minutes at 4 ° C., of the supernatant containing the released luciferase, 5 ⁇ l sample in 5 ml tubes (Sarstedt, item No. 55,476) are mixed with 50 ⁇ l LARII buffer (Promega, Mannheim, Germany). The buffer contains the substrate of
  • Luciferase so that the activity of the normalization vector can be measured. This metric is used to normalize the different transformation efficiencies. The measurement takes place with 2 seconds pre-measurement time and 10 seconds
  • Stop & Glo buffer Promega, Mannheim, Germany
  • This buffer stops the luciferase activity and makes Renilla luciferase activity, which corresponds to the activity of the Cis05 promoters, measurable.
  • the measurement also takes place with 2 seconds pre-measurement time and 10 seconds luciferase measurement time.
  • the new cis-regulatory elements are said to be characterized by the fact that they can be induced in different plant species by different PAMPs and pathogens.
  • 6 promoters with tetramerized single sequences were stably transformed into Arabidopsis.
  • the tetramerized elements Cis02, Cis05, Cis09, Cis12 or Cis13 were cloned with 35S minimal promoter before the GUS reporter gene in the transformation vector pBIN-GUS.
  • the finished construct was transformed into agrobacteria. The following was a floral-dip transformation (Clough and Bent, 1998) of Arabidopsis plants
  • the element Cis02 showed good pathogen inducibility and only low wound inducibility.
  • the element Cis05 showed a generally strong activity and is also strongly induced by H. Arabidopsidis.
  • the element Cis09 showed a good induction of the promoter after infection, and hardly any unwanted activity after wounding.
  • the element Cis12 like element Cis09, showed little unwanted wounding activity in all lines examined, while a clear induction by the pathogen H.
  • FIG. 16 shows the GUS staining of transgenic A. thaliana plants expressing the GUS reporter gene under the control of a chimeric promoter with 4x Cis05.
  • chimeric combinatorial promoters composed of different cis-regulatory elements are, have a higher specificity and / or activity than the individual elements present in them (Rushton et al., 2002).
  • WO 00/29592 (Max Planck Society for the Advancement of Science e.V.). Chimeric Promoters capable of mediating gene expression in plants after pathogen infection and uses thereof.
  • WO 10/079430 (U. Bonas et al.). Modular DNA-binding domains and methods of use.
  • WO 11/072246 (Regents of the University of Minnesota; Iowa State University Research Foundation Inc.). TAL effector-mediated DNA modification.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein isoliertes Pathogeninduzierbarkeit- oder Elikitorinduzierbarkeit-vermittelndes cis-regulatorisches Element, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, dessen Nukleotidsequenz einem der Kernsequenzmotive aus a) vaaagtm, b) aaacca, c) scaaam, d) acrcg, e) sktgkact, f) mrtsack, g) ccaccaa, h) tcgtctcttc, i) wwkgwc oder einem zu a) bis i) komplementären Kernsequenzmotiv entspricht.

Description

Neue aus Pflanzen stammende cis-regulatorische Elemente für die Entwicklung Pathogen-responsiver chimärer Promotoren
Die vorliegende Erfindung betrifft cis-regulatorische Elemente und aus diesen cis- regulatorischen Elementen erstellte Chimäre Promotoren mit einer Pathogen- oder Elizitor- induzierten Aktivität in Pflanzen. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle, eine transgene Pflanzenzelle, ein transgenes Pflanzengewebe sowie eine transgene Pflanze und deren Samen. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, welche insbesondere resistent ist gegenüber einem Pathogen.
Durch Pilze, Viren, Nematoden und Bakterien hervorgerufene Pflanzenkrankheiten bewirken weltweit große Ernteverluste, beeinträchtigen die Qualität der Ernteprodukte und machen einen aufwendigen Einsatz chemischer Pflanzenschutzmittel notwendig, weil die natürlichen Abwehrmaßnahmen der Pflanzen, mit deren Hilfe sie die Mehrzahl potentieller
Krankheitserreger abwehren oder deren Ausbreitung verzögern und einschränken können, häufig nicht ausreichen. Gentechnische Ansätze können zur Erzeugung von Pflanzen, die resistent gegenüber genannten Pathogenen sind, genutzt werden. Diese Pflanzen weisen eine erhöhte Resistenz auf, indem sie eine spezifisch am Infektionsort (Kontaktstelle zwischen Pathogen und Pflanze) erfolgende Expression von Proteinen (Effektoren) erzeugen, die eine starke Resistenzreaktion der Pflanze auslösen, oder von Molekülen, die selbst toxisch gegen Pathogene sind oder deren Wachstum oder Virulenz hemmen.
Effektoren, die eine starke Resistenzreaktion der Pflanze auslösen, sind z.B. Proteine von autoaktivierten Resistenzgenen (R-Genen) oder Avirulenzgene, die zur Aktivierung endogener Resistenzgene der Pflanze führen. Zu der starken Resistenzreaktion gehören die hypersensitive Reaktion (HR), der kontrollierte Zelltod des Wirtsgewebes an der
Infektionsstelle, die Verstärkung der pflanzlichen Zellwand durch Lignifizierung und
Kallosebildung, die Bildung von Phytoalexinen und die Produktion von PR-(pathogenesis- related)-Proteinen.
Da diese Resistenzreaktion einen hohen Energiebedarf darstellen und zum Absterben von Pflanzenzellen (Nekrose) führen können, muss ihre Auslösung einer strengen Kontrolle unterliegen. Dasselbe gilt auch für die Expression von für Pathogene toxischen Proteinen oder Peptiden, sofern eine konstitutive Expression dieser Proteine oder Peptide eine nachteilige Wirkung auf die Pflanze bzw. deren agronomische Eigenschaften wie z.B. Ertrag hat. In einem transgenen Ansatz ist diese Kontrolle durch Verwendung von Promotoren mit der gewünschten Spezifität möglich.
BESTÄTIGUNGSKOPIE So lässt sich eine Pathogen-induzierte Expression von Transgenen wie Effektoren durch Verwendung verschiedener bekannter, natürlicher Pathogen-induzierbarer Promotoren, wie z.B. des PR1 -Promotors, erreichen (Rushton et al., 1996). Insbesondere die Entwicklung der Mikroarraytechnologie hat zur Identifikation einer Vielzahl von Pathogen-induzierbaren Promotoren geführt (WO 03/00898, WO 02/50293 oder JP 2003284566).
Solche natürlichen Pathogen-induzierbaren Promotoren können jedoch sehr unspezifische Aktivitäten zeigen, da sie durch zahlreiche unterschiedliche Stimuli aktiviert werden können. Zurückzuführen ist dies auf einen modularen Aufbau des Promotors aus mehreren unterschiedlichen cis-regulatorischen Elementen, welche verschiedenste unterschiedliche Signale in ein komplexes Expressionsprofil integrieren. Folglich sind natürliche Pathogen- induzierbare Promotoren auch durch unerwünschte Aktivitäten wie etwa in bestimmten Geweben oder durch eine hohe Hintergrundaktivität gekennzeichnet.
So sind beispielsweise Pathogen-induzierbare Promotoren von Defensin-Genen aus Weizen auch während der Samenentwicklung und Samenkeimung aktiv (Kovalchuk et al., 2010). Der bereits erwähnte PR1 -Promotor wird nicht nur durch Pathogene, sondern auch durch Seneszenz induziert (Morris et al. 2000)
In anderen Untersuchungen zeigte sich, dass der natürliche, durch Rost induzierbare Fis1 Promotor aus Lein nach Transformation nicht dazu geeignet war, die Expression von autoaktiven Formen des L6 Rostresistenzgens in Linum usitatissimum so spezifisch zu regulieren, dass neben der Rostresistenz keine negative agronomischen Eigenschaften wie Kleinwüchsigkeit auftraten (Howles et al., 2005).
Eine Möglichkeit, die gewünschte Spezifität eines Promotors zu erhöhen, ist die Identifikation der für die gewünschte Induktion verantwortlichen cis-regulatorischen Elemente, und der Aufbau chimärer Promotoren aus diesen cis-regulatorischen Elementen (Venter, 2007). Sequenzmotive für andere Stimuli werden dagegen entfernt.
Die Promotoren vieler Pathogen-induzierter Gene sind genauer untersucht worden, wobei mehrere cis-regulatorische Elemente, die eine Pathogen-spezifische Induktion vermitteln können, identifiziert wurden (Strittmatter et al., 1996; Eulgem et al., 2000; Kirsch et al., 2000, 2001 ; Himmelbach et al., 2010). Weitere Bespiele sind auch die durch schrittweises Mutieren von natürlichen Pathogen-induzierbaren Promotoren identifizierten cis-regulatorischen Elemente D-Box, S-Box oder W-Box (WO 00/29592) oder die linker scanning Regionen LS10 oder LS7 (Lebel et al., 1998). Insbesondere die W-Box ist gut untersucht, und deren Kernsequenz TTGAC(C/T) kann genutzt werden, um zusätzliche Varianten der W-Box in natürlichen Pathogen-induzierbaren Promotoren aufzufinden.
Des Weiteren können neue cis-regulatorische Elemente bioinformatorisch mit Hilfe von Programmen wie MEME (Bailey und Elkan, 1994; Humphry et al., 2010) oder BEST (Che et al., 2005) identifiziert werden. Ein Vorteil hierbei liegt darin, dass ein cis-regulatorisches Element nicht als kurze Einzelsequenz, sondern als ein genau definiertes Sequenzmotiv identifiziert wird, über das gleich mehrere Varianten eines cis-regulatorischen Elementes, also mehrere Varianten einer Bindestelle eines Transkriptionsfaktors, erfasst werden.
Allerdings sind solche bioinformatorischen Ansätze auch hochanfällig für die Bestimmung falsch-positiver Sequenzen, so dass sie lediglich zu einer Vorauswahl von potentiellen Sequenzen bzw. Sequenzmotiven führen. Zwingend und unerlässlich bleiben dann aber Nachweis und Überprüfung der Funktionalität als cis-regulatorisches Element im
Allgemeinen und als Pathogeninduzierbarkeit-vermittelndes cis-regulatorisches Element im Speziellen. Solche experimentellen Analysen sind zudem mit nicht unerheblichem Aufwand verbunden.
Eine weitere Erhöhung der Spezifität eines Promotors ist durch die Verwendung von
Kombinationen unterschiedlicher cis-regulatorischer Elemente möglich (Rushton et al., 2002). Dabei führt nicht die Kombination an sich zu einer Erhöhung der Aktivität
(Synergismus), sondern ein solcher Synergismus tritt nur bei spezifischen einzelnen, nicht- vorhersagbaren Kombinationen auf und muss in jedem Fall empirisch bestimmt werden. Bekannt sind z.B. chimäre Promotoren mit Kombinationen aus den cis-regulatorischen Elementen D-Box und S-Box (WO 00/29592). Die Zahl der Elementwiederholungen moduliert die Promotorstärke und die Hintergrundaktivität.
Ein weiteres Problem bei der Entwicklung von Pathogen-induzierbaren Chimären Promotoren ist deren Funktionalität in unterschiedlichen Pflanzenspezies. Generell kann zwar in nahezu allen bisher untersuchten Pflanzenarten eine Pathogen-Induzierbarkeit durch die bekannten, Pathogen-induzierbaren Chimären Promotoren festgestellt werden, jedoch zeigen diese weiterhin Hintergrundaktivität auch unter Nichtbefallsbedingungen durch einen Pathogen. Diese Hintergrundaktivität schwankt in Abhängigkeit von der Pflanzenart, in welcher die Chimären Promotoren verwendet werden. Ebenso verhält es sich mit der Induktionsrate (Quotient aus der Promotoraktivität im infizierten Gewebe und die Promotoraktivität im nicht infizierten Gewebe) und der absoluten Aktivität der Promotoren (Promotorstärke). So kann beispielsweise durch eine zu starke Hintergrundaktivität in nicht infiziertem Gewebe dann nur noch eine geringe Pathogen-Induzierbarkeit im infizierten Gewebe festgestellt werden.
Nach heutigem Wissensstand werden für die beschriebenen Schwankungen bezüglich Hintergrundaktivität, Induktionsrate, Promotorstärke, Induktionskinetik und der räumliche Ausdehnung der Promotoraktivierung die verwendeten cis-regulatorischen Elemente eines Promotors verantwortlich gemacht (Rushton et al., 2002, Venter, 2007). Auch wenn die bekannten Chimären Promotoren den natürlichen Promotoren überlegen sind, besteht weiterhin ein Optimierungsbedarf dieser Chimären Promotoren insbesondere im Hinblick auf die cis-regulatorischen Elemente und/oder auf die Kombinationen von cis-regulatorischen Elementen. Es fehlt weiterhin an gut charakterisierten cis-regulatorischen Elementen und an geeigneten Kombinationen solcher cis-regulatorischer Elemente, mit deren Hilfe Chimäre Promotoren konstruiert werden können, welche eine hochspezifische und kontrollierte, bedarfsgerechte Pathogen-induzierte Expression von Transgenen an sich und auch in diversen Pflanzenspezies gewährleisten, wobei die Expression lediglich infolge eines Pathogenbefalls und nahezu ausschließlich an der Infektionsstelle stattfindet soll (Gurr & Rushton, 2005). Daher ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung solche neuen
Pathogeninduzierbarkeit-vermittelnden cis-regulatorischen Elemente und Kombinationen davon bereitzustellen.
Einige der in dieser Anmeldung verwendeten Begriffe werden nachfolgend zunächst näher erläutert:
Ein "Elizitor" im Sinne der vorliegenden Erfindung stellt einen Induktor oder Botenstoff dar, welcher Abwehrmaßnahmen gegen pflanzliche Pathogene wie beispielsweise die Synthese von Phytoalexinen induziert. Elizitoren können entweder endogenen oder exogenen
Ursprungs sein. Vorzugsweise stammt ein Elizitor (exogen) aus einem Pathogen und wird von der Pflanze erkannt. Zu diesen Elizitoren gehören auch die PAMPs (pathogen associated molucular pattern) wie beispielsweise Flagelin, PEP25 und Chitin. Elizitoren können verwendet werden, um eine Pathogeninfektion oder einen Kontakt mit einem
Pathogen zu imitieren, indem der Elizitor künstlich, in der Abwesenheit des Pathogens, appliziert wird. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden Elizitoren insbesondere genutzt um die Induzierbarkeit von Promotoren zu überprüfen.
Eine "Einzelsequenz" ist eine Abfolge von Nukleotiden oder Basen(paaren), wobei jede Position in der Einzelsequenz nur durch eine einzelne fest definierte Base (a, c, g oder t) festgelegt ist. Eine Einzelsequenz wird isoliert aus einem natürlichen Promotor und stellt das Ergebnis einer bioinformatorischen Analyse dar. Eine Einzelsequenz ist aus einer
Kernsequenz und flankierenden Sequenzbereichen zusammengesetzt. Der Begriff
"Einzelsequenz" meint auch ein Nukleinsäuremolekül, dessen Nukleotid- oder
Basen(paaren)abfolge der Einzelsequenz entspricht.
Eine "Kernsequenz" ist die Abfolge von Nukleotiden oder Basen(paaren) in einem
bestimmten Abschnitt eines cis-regulatorischen Elementes, wobei dieser Abschnitt für die Funktionalität des cis-regulatorischen Elementes essentiell ist. Die Kernsequenz stellt einen Teil der Einzelsequenz dar. Der Begriff "Kernsequenz" meint auch ein Nukleinsäuremolekül, dessen Nukleotid- oder Basen(paaren)abfolge der Kernsequenz entspricht.
Ein "Promotor" meint eine nicht-translatierte DNA-Sequenz, typischerweise stromaufwärts einer kodierenden Region, welche die Bindestelle für die RNA-Polymerase beinhaltet und die Transkription der DNA initiiert. Ein Promotor enthält häufig zudem andere Elemente, die als Regulatoren der Genexpression fungieren (z.B. cis-regulatorische Elemente).
Ein "Minimalpromotor" ist ein Promotor, der lediglich die Grundelemente, welche für die Transkriptionsinitiation gebraucht werden, aufweist (z.B. TATA-Box und/oder Initiator).
Als "chimärer Promotor" wird ein Promotor bezeichnet, der so in der Natur nicht vorkommt, aus mehreren Elementen zusammengesetzt wird. Er beinhaltet einen Minimalpromotor und weist stromaufwärts des Minimalpromotors mindestens ein cis-regulatorisches Element auf, welches als Bindungsstelle für spezielle frans-wirkende Faktoren (trans-acting factors, z.B. Transkriptionsfaktoren) dient. Ein chimärer Promotor wird den gewünschten Anforderungen nach konzipiert und durch unterschiedliche Faktoren induziert oder reprimiert. Die Wahl des cis-regulatorischen Elements oder einer Kombination von cis-regulatorischen Elementen ist entscheidend beispielsweise für die Spezifität oder das Aktivitätslevel eines Promotors. Ein cis-regulatorisches Element in einem Chimären Promotor ist entweder heterolog zu dem verwendeten Minimalpromotor, d.h. das cis-regulatorische Element stammt aus einem anderen Organismus oder einer anderen Spezies als der verwendete Minimalpromotor (beispielhaft in Fig. 15A-C dargestellt), oder ein cis-regulatorisches Element in einem
Chimären Promotor ist homolog zu dem verwendeten Minimalpromotor, d.h. das cis- regulatorische Element und der Minimalpromotor kommen auch in einem natürlichen Promotor zusammengesetzt vor, jedoch ist das cis-regulatorische Element für sich oder als zusätzliches Element innerhalb des Chimären Promotor in einer unterschiedlichen genetischen Umgebung im Vergleich zu dem natürlichen Promotor lokalisiert. Ein chimärer Promotor meint demnach auch einen (natürlichen) Promotor, welcher durch Multimerisieren von mindestens einem cis-regulatorischen Element verändert wurde (beispielhaft in Fig. 15D dargestellt).
Eine "komplementäre" Nukleotidsequenz bedeutet bezogen auf eine doppelsträngige DNA, dass der zum ersten DNA Strang komplementäre zweite DNA Strang entsprechend den Basenpaarungsregeln und unter Berücksichtigung der Orientierung die Nukleotidbasen aufweist, die zu den Basen des ersten Stranges korrespondieren (Bsp: 5'-gcat-3' ist komplementär zu 5'-atgc-3").
Ein "Pathogen" meint einen Organismus, der in Interaktionen mit einer Pflanze zu
Krankheitssymptomen an einem oder mehreren Organen bei der Pflanze führt. Zu diesen Pathogenen zählen beipielsweise tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Organismen oder Oomyceten. Unter einer "Pathogeninfektion" ist der früheste Zeitpunkt zu verstehen, bei dem der
Stoffwechsel eines Pathogens auf eine Penetration des pflanzlichen Wirtsgewebes vorbereitet wird. Dazu gehören z.B. bei Pilzen oder bei Oomyceten das Auswachsen von Hyphen oder die Bildung von spezifischen Infektionsstrukturen wie Penetrationshyphen und Appressorien.
Unter "Pathogen-/Elizitor-lnduzierbarkeit" oder unter "Pathogen-/Elizitor-induzierbar" meint im Sinne der Erfindung die spezifische Eigenschaft eines Promotors, welcher nach
Pathogeninfektion oder Elizitor-Applikation eine mindestens zweifach verstärkte
Transkription eines operativ verknüpften Gens verursacht. Des Weiteren ist unter "Pathogen- /Elizitor-Induzierbarkeit" oder unter "Pathogen-/Elizitor-induzierbar" im Sinne der Erfindung die Eigenschaft von Genen zu verstehen, die nach Pathogeninfektion oder Elizitor- Applikation mindestens zweifach verstärkt transkribiert werden.
Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der gestellten Aufgabe durch neue Pathogen- und/oder Elizitor-Induzierbarkeit vermittelnde cis-regulatorische Elemente. Diese unterscheiden sich insbesondere innerhalb der Kernsequenz signifikant von bereits bekannten Elementen und stellen somit auch keine Variationen der bekannten Elemente dar. Demnach sollten die erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Elemente als Erkennungs- und/oder Bindestellen für neue Transkriptionsfaktoren dienen, was zur Folge hat, dass die vermittelte Pathogen- und/oder Elizitor-Induzierbarkeit eine neuartige Spezifität aufweist. Die erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Elemente wurden über bioinformatorische Ansätze in Promotoren von Pathogen- oder PAMP (Elizitor)-induzierten Genen aus Arabidopsis thaliana identifiziert. Die isolierten Einzelsequenzen der cis-regulatorischen Elemente konnten infolge diverser Analyseschritte acht Motivgruppen (Motivgruppe 1 , 5, 1 1 , 12, 18, 21 , 27 und 32) zugeordnet werden. Weiterhin konnten auch mehrere isolierte Einzelsequenzen einer Motivgruppe 21 n zugeordnet werden. In einer Motivgruppe sind, diejenigen Einzelsequenzen
zusammengefasst, welche beim Vergleich der identifizierten Motive ein hohes Maß an Konserviertheit aufzeigen. Einzelsequenzen einer Motivgruppe stimmen alle demnach in einem charakteristischen Kernsequenzmotiv überein. Somit wird die gestellte Aufgabe durch ein isoliertes cis-regulatorisches Element, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, dessen Nukleotidsequenz einem der Kernsequenzmotive aus
a) vaaagtm,
b) aaacca,
c) scaaam,
d) acrcg,
e) sktgkact,
f) mrtsack, g) ccaccaa,
h) tcgtctcttc oder
i) wwkgwc
entspricht.
Weniger stark konservierte Basenpositionen innerhalb der charakteristischen
Kernsequenzmotive a) bis i) sind wie folgt angegeben: Y' steht für Guanin (g) oder Adenin (a), also eine Purinbase, 'k' steht für Guanin (g) oder Thymin (t)/Uracil (u), 's' steht für Guanin (g) oder Cytosin (c), 'm' steht für Adenin (a) oder Cytosin (c) und W steht für Adenin (a) oder Thymin (t)/Uracil (u). Ein bestimmtes Kernsequenzmotiv gibt zumindest eine Teilsequenz der Kernsequenz einer jeden Einzelsequenz der zum Kernsequenzmotiv gehörigen Motivgruppe wieder, wobei die Teilsequenz mindestens 30% der Gesamtkernsequenz einer
Einzelsequenz ausmachen kann. Für die Motivgruppen mit den Kernsequenzmotiven g) und h) entspricht das Kernsequenzmotiv der gesamten Kernsequenz der Einzelsequenzen. Von der Erfindung ist weiterhin auch ein isoliertes cis-regulatorisches Element mit
eingeschlossen, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, dessen Nukleotidsequenz einem zu a) bis i) komplementären Kernsequenzmotiv entspricht. Ein charakteristisches
Kernsequenzmotiv einer bestimmten Motivgruppe kann zudem auch mehrfach in der Kernsequenz einer Einzelsequenz vorkommen, wobei die Kernsequenzmotive auch überlappend in der Kernsequenz auftauchen und/oder jeweils eine unterschiedliche
Orientierung aufzeigen können. Beispielsweise weist die Kernsequenz des Cis09 aus Motivgruppe 1 zum einen eine Teilsequenz auf, welche dem Kernsequenzmotiv acrcg entspricht und zum anderen eine um zwei Basen überlappende Teilsequenz, welche dem komplementären Kernsequenzmotiv von acrcg, nämlich cgygt, entspricht. Ein weiteres Beispiel findet sich in der Kernsequenz des 21G-2_M1_S2 aus Motivgruppe 11 , wo die Kernsequenz zwei Teilsequenzen aufweist, welche um eine Base überlappen und jeweils dem komplementären Kernsequenzmotiv von aaacca, nämlich tggttt, entsprechen.
Für Motivgruppen , 5, 11 , 12, 21 , 21 n und 27 konnte auf Basis der experimentellen Daten zur Funktionalität ein Familienmotiv definiert werden, in welchem das charakteristische Kernsequenzmotiv eingebettet ist. Das Familienmotiv stellt ein abgeleitetes
Erkennungsmerkmal für einen Transkriptionsfaktor oder eine Transkriptionsfaktorfamilie dar. Der Vorteil eines Familienmotivs liegt darin, dass es mögliche Varianten eines Erkennungs- /Bindungsbereichs zusammenfasst. Vorzugsweise umfasst ein Familienmotiv einer
Motivgruppe alle Kernsequenzen der in der Motivgruppe zusammengefassten
Einzelsequenzen. Hierfür wurde für einen Teil der Einzelsequenzen der komplementäre Strang des cis-regulatorischen Elements berücksichtigt; solche komplementären Sequenzen von identifizierten erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Sequenzen sind, sofern es zum Verständnis notwendig ist, im Weiteren mit '(inv)' gekennzeichnet. Ein auf diese Weise definiertes Familienmotiv weist eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden, bevorzugt von mindestens 13 Nukleotiden, besonders bevorzugt von mindestens 11 Nukleotiden auf.
Neben dem entsprechenden Kernsequenzmotiv weist das Familienmotiv flankierende Bereiche auf, welche bei der Verwendung eines erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Elementes in einem Chimären Promotor einen wesentlichen quantitativen Einfluss auf dessen Eigenschaften wie Hintergrundaktivität und Expressionsstärke haben. Mit zunehmendem Abstand einer bestimmten Base der flankierenden Bereiche zur Kernsequenz in einer Einzelsequenz nimmt deren quantitativer Einfluss ab. Zur Definition des
Familienmotivs können zusätzlich auch weitere über die Kernsequenzen der
Einzelsequenzen hinausgehende hochkonservierte Einzelbasen aus den flankierenden Bereichen berücksichtigt werden, die dann das Familienmotiv erweitern. Die Familienmotive für die Motivgruppen 1 , 5, 11 , 12, 21 , 21 n und 27 sind in Spalte 2 der Tabelle 1 dargestellt. Von der Erfindung ist demnach auch ein isoliertes cis-regulatorisches Element mit eingeschlossen, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, dessen Nukleotidsequenz
a) einem Familienmotiv gemäß SEQ ID NO: 1 , umfassend das Kernsequenzmotiv
vaaagtm, entspricht,
b) einem Familienmotiv gemäß SEQ ID NO: 2, umfassend das Kernsequenzmotiv
aaacca, entspricht,
c) einem Familienmotiv gemäß SEQ ID NO: 3, umfassend das Kernsequenzmotiv
scaaam, entspricht,
d) einem Familienmotiv gemäß SEQ ID NO: 4, umfassend das Kernsequenzmotiv
acrcg, entspricht,
e) einem Familienmotiv gemäß SEQ ID NO: 5, umfassend das Kernsequenzmotiv
sktgkact, entspricht,
f) einem Familienmotiv gemäß SEQ ID NO: 6, umfassend das Kernsequenzmotiv
mrtsack, entspricht,
g) einem Familienmotiv gemäß SEQ ID NO: 41 , umfassend das Kernsequenzmotiv wwkgwc, entspricht,
oder dessen Nukleotidsequenz einem zu a) bis g) komplementären Familienmotiv entspricht. Zudem kann das Familienmotiv auch kürzer sein. In seiner kürzesten Form ist es definiert als ein minimales Familienmotiv, das nach Ausrichtung der Einzelsequenzen entsprechend dem gemeinsamen Kernsequenzmotiv nur diejenigen Basenpositionen in sich zusammenfasst, welche sich in den Kernsequenzen sämtlicher Einzelsequenzen einer Motivgruppe wiederfinden. In einigen Fällen entspricht das minimale Familienmotiv dem
Kernsequenzmotiv. Tabelle 1 gibt in Spalte 2, überschrieben mit Familienmotiv, unterstrichen die minimalen Familienmotive der Motivgruppen 1 , 5, 11 , 12, 21 , 21 n und 27 wieder. Tabelle 1 : Darstellung der otivgruppen 1 , 5, 11 , 12, 18, 21 , 21 n, 27 und 32, der den Gruppen zugrundeliegenden Kernsequenzmotive (1 ), Familienmotive (2) und der den Motivgruppen zugeordneten Einzelsequenzen (3); minimales Familienmotiv ist unterstrichen, Kernsequenzmotiv innerhalb des Familienmotivs ist fett gedruckt.
('n' steht für eine beliebige Base; 'h' steht für a, c oder t/u; 'd' steht für a, g oder t/u; V steht für a, g oder c; Y' steht für g oder a, 'k' steht für g oder t/u, 's' steht für g oder c und 'm' steht für a oder c; 'y' steht für t/u oder c; V steht für a oder t/u)
Figure imgf000010_0001
Die Erfindung betrifft zudem auch alle identifizierten und isolierten Einzelsequenzen von erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Elementen und deren Kernsequenzen (Tabelle 1 und 2). Die gestellte Aufgabe wird somit auch gelöst durch ein isoliertes cis-regulatorisches Element, umfassend ein Nukleinsäuremolekül
a) ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 oder SEQ ID NO: 44, b) ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz gemäß der Kernsequenz aus SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 oder SEQ ID NO: 44, oder
c) ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz komplementär zu einer der Nukleotidsequenzen aus a) oder b).
Ein cis-regulatorisches Element, umfassend ein Nukleinsäuremoleküle mit einer
Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 oder SEQ ID NO: 26 ist der Motivgruppe 1 , ein solches mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 oder SEQ ID NO: 32 der Motivgruppe 5, ein solches mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 oder SEQ ID NO: 19 der Motivgruppe 1 1 , ein solches mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22 oder SEQ ID NO: 23 der Motivgruppe 12, ein solches mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 33 der Motivgruppe 18, ein solches mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 27 oder SEQ ID NO: 28 der Motivgruppe 21 , ein solches mit einer
Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 42 oder SEQ ID NO: 43 der Motivgruppe 21 n, ein solches mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 44 oder SEQ ID NO: 15 der Motivgruppe 27 und ein solches mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 34 der Motivgruppe 32 zugeordnet. Ein erfindungsgemäßes cis-regulatorisches Element kann eine Länge von weniger als 50 Nukleotiden, bevorzugt von weniger als 40 Nukleotiden und besonders bevorzugt von weniger als 30 Nukleotiden aufweisen. Die Kernsequenz eines erfindungsgemäßen cis- regulatorischen Elementes kann eine Länge von weniger als 20 Nukleotiden, bevorzugt von weniger als 15 Nukleotiden und besonders bevorzugt von weniger als 10 Nukleotiden aufweisen, jedoch sollte die Kernsequenz nicht kürzer sein als 6 Nukleotide.
Einige Einzelsequenzen der erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Elemente können neben der identifizierten neuen Kernsequenz auch zusätzlich die Kernsequenz eines bekannten Pathogen-/Elizitor-lnduzierbarkeit vermittelnden cis-regulatorischen Elements aufweisen, das unter Umständen auch die Spezifität der neuen identifizierten Kernsequenz und/oder der identifizierten Einzelsequenz beeinflusst. Ein Beispiel ist das cis-regulatorische Element Cis05 (SEQ ID NO: 14), dass neben der identifizierten Kernsequenz zwischen den Nukleotidpositionen 14 und 20 auch eine W-Box Kernsequenz zwischen den
Nukleotidpositionen 29 und 35 aufweist. Hierzu wurden umfangreiche Mutationsanalysen durchgeführt (siehe Fig. 5A, 5B und 11 ).
Ein erfindungsgemäßes cis-regulatorisches Element kann in einem Chimären Promotor verwendet werden, wobei das cis-regulatorische Element dem Chimären Promotor eine spezifische Pathogen- und/oder Elizitorinduzierbarkeit vermittelt. Die vorliegende Erfindung schließt somit auch einen Chimären Promotor mit ein, welcher geeignet ist, induziert durch eine Pathogeninfektion oder eine Behandlung mit einem pathogenen Elizitor eine Expression eines operativ verknüpften Nukleinsäuremoleküls von Interesse, z.B. einer heterologen DNA- Sequenz, in einer pflanzlichen Zelle zu bewirken und welcher einen Minimalpromotor und mindestens ein erfindungsgemäßes cis-regulatorisches Element umfasst. Ein einzelnes erfindungsgemäßes cis-regulatorisches Element in einem solchen Chimären Promotor allein ist bereits in der Lage eine signifikante Pathogen- und/oder Elizitorinduzierbarkeit zu vermitteln. So reicht dieses eine cis-regulatorische Element schon aus, um damit in
Kombination mit einem Minimalpromotor einen Pathogen-/Elizitor-responsiven Chimären Promotor zu konstruieren.
Vorzugsweise ist ein solcher chimärer Promotor, enthaltend als cis-regulatorische Elemente lediglich ein oder mehrere erfindungsgemäße cis-regulatorische Elemente, nur Pathogen und/oder Elizitor-responsiv, d.h. dieser Promotor ist nicht oder nur in einem geringen
Ausmaß durch andere Stimuli wie abiotischen Stress induzierbar. Die Induktion eines solchen Chimären Promotors umfassend ein oder mehrere erfindungsgemäße cis- regulatorische Elemente ist nach Pathogen/Elizitor-Kontakt mindestens 2-fach, bevorzugt mindestens 10-fach oder besonders bevorzugt mindestens 25-fach höher als die Induktion ohne Pathogen/Elizitor-Kontakt (Hintergrundaktivität).
In einer bevorzugten Ausgestaltung erfolgt die induzierte Expression nur lokal begrenzt auf den Infektionsort, d.h. in einem vergleichbarem oder in einem geringeren Ausmaß wie dies bei der kontrollierten Expression von natürlichen PR-Genen stattfindet. Besonders bevorzugt findet die Transkriptionsaktivierung kontrolliert durch einen Chimären Promotor der vorliegenden Erfindung lediglich in den Zellen statt, die mit dem Pathogen oder dem pathogenen Elizitor in Kontakt kommen. Es kann jedoch auch aufgrund von Zell-Zell- Interaktionen eine Transkriptionsaktivierung in Zellen stattfinden, welche die
Infektionsstelle(n) umgeben.
Chimäre Promotoren der vorliegenden Erfindung sind jedoch nicht beschränkt auf solche, die ausschließlich Pathogen-responsiv sind. Durch Kombination mit weiteren regulatorischen Elementen kann die induzierte Expression weiter spezifiziert werden, z.B. durch Kombintion mit einem cis-regulatorisches Element, das beispielsweise Gewebespezifität, Lagerungs- induzierbarkeit, Kälte- oder Hitzeinduzierbarkeit oder einer spezifischen Aktivität in bestimmten Entwicklungsstadien. Chimäre Promotoren der Erfindung können auch mindestens eine Kombination aus mindestens zwei cis-regulatorischen Elementen umfassen, wobei diese mindestens eine Kombination mindestens ein erfindungsgemäßes cis-regulatorischen Element umfasst. Als weitere cis-regulatorische Elemente in der
Kombination können auch bekannten Pathogen-/Elizitor-lnduzierbarkeit vermittelnde cis- regulatorische Elemente wie W-Box, S-Box oder D-Box (siehe WO 00/29592) zur
Konstruktion eines Chimären Promotors verwendet werden.
Zudem schließt die Erfindung auch einen Chimären Promotor mit ein, der ein oder mehrere Monomere und/oder ein oder mehrere Multimere der erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Elemente umfassen. Bevorzugte multimere Formen sind Dimere und Tetramere. Monomere für sich oder einzelne Monomere innerhalb eines Mutimers können unterschiedliche
Orientierungen aufweisen, d.h. sie können beispielsweise komplementär angeordnet sein. Erfindungsgemäße cis-regulatorische Elemente einer multimeren Form können funktionell miteinander verknüpft sein, d.h. in multimerer Form zeigen sie eine synergistische oder antagonistische Wirkung beispielsweise auf die Bindekapazität des Transkriptionsfaktors, welcher unter anderem das charakteristische Kernsequenzmotiv einer bestimmten
Motivgruppe erkennt. So schließt die Erfindung ebenfalls einen Chimären Promotor mit ein, welcher geeignet ist, induziert durch eine Pathogeninfektion oder eine Behandlung mit einem pathogenen Elizitor eine Expression eines operativ verknüpften Nukleinsäuremoleküls von Interesse in einer pflanzlichen Zelle zu bewirken und welcher einen Minimalpromotor und mindestens zwei erfindungsgemäße cis-regulatorische Elemente umfasst, wobei die mindestens zwei cis-regulatorische Elemente funktionell verknüpft in homo- und/oder heteromerer Form vorliegen können.
Die Induktion eines Chimären Promotors umfassend mindestens ein Multimer der
erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Elemente ist nach Pathogen/Elizitor-Kontakt mindestens 2-fach, bevorzugt mindestens 10-fach oder besonders bevorzugt mindestens 25- fach höher als die Induktion ohne Pathogen/Elizitor-Kontakt (Hintergrundaktivität). In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Chimären Promotoren der vorliegenden Erfindung beträgt der Abstand vom Minimalpromotor und zum ersten stromaufwärts befindlichen erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Element zwischen 0 und 300
Basenpaaren, bevorzugt zwischen 0 und 70 Basenpaaren und besonders bevorzugt weniger als 10 Basenpaaren. Zusätzlich oder alternativ beträgt der Abstand zwischen zwei gleichen Monomeren der erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Elemente in einer multimeren Form bevorzugt 0 bis 10 Basenpaare. Vorzugsweise sind zwei separate Multimere in einem Chimären Promotor der Erfindung durch etwa 0 bis 50 Basenpaare getrennt.
Spezifische Kombinationen von erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Elementen mit anderen erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Elementen oder mit anderen bekannten regulatorischen Elementen oder Fragmenten wie S-Box, D-Box oder Gst1 zeigten in den experimentellen Analysen eine vorteilhaft und überraschende Wirkung im Hinblick auf Promotoreigenschaften wie eine geringe Hintergrundaktivität oder eine besonders spezifische oder eine besonders starke Induzierbarkeit (bis zum 183-fach 2xCis13-2xCis05). Dabei zeigten einige Kombinationen eine synergistische Wirkung hinsichtlich einer bestimmten Promotoreigenschaft wie beispielsweise hinsichtlich des Induktionsfaktors (vergleiche z.B. 2xCis13-2xCis05 in Petersilie, Figuren 12 und 13), während einige
Kombinationen zwar eine antagonistische Wirkung beispielsweise hinsichtlich des
Induktionsfaktor hatten, dabei aber eine besonders niedrige Hintergrundaktivität entwickelten (z.B. 4xCis05-2xD in Zuckerrübe). Die Erfindung schließt darüber hinaus sämtliche
Kombination und Kombinationsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Elemente mit sich selbst und mit bekannten cis-regulatorischen Elementen ein, die eine vorteilhafte synergistische oder antagonistische Wirkung auf die Induzierbarkeit des
Promotors haben. Vorteilhafte Kombinationen sind solche, welche ausgewählt werden können aus folgender Gruppe: 4x sCis05, 4x 20u_M1_S1 , 4x 27G-8_M1_S1 , 4x
38M_M1_S1 , 4x 18H_M2_S3, 4x 18H_M2_S1 , 4x GG13_M1_S2, 4x 21S_M3_S1 , 4x 30I- 8_M1_S2, 2x Cis02 - 2x Cis02, 2x Cis02 - 2x Cis05, 2x Cis02 - 2x Cis12, 2x Cis02 - 2x Cis13, 2x Cis02 - 2x D, 2x Cis02 - 2x S, 2x Cis02 - Gst1 , 2x Cis02 - 2x 30I-8_M1_S2, 2x Cis05 - 2x Cis02, 2x Cis05 - 2x Cis05, 2x Cis05 - 2x Cis12, 2x Cis05 - 2x Cis13, 2x Cis05 - 2x D, 2x Cis05 - 2x S, 2x Cis05 - Gst1 , 2x Cis05 - 2x 30I-8_M1_S2, 2x Cis12 - 2x Cis02, 2x Cis12 - 2x Cis05, 2x Cis12 - 2x Cis12, 2x Cis12 - 2x Cis13, 2x Cis12 - 2x D, 2x Cis12 - 2x S, 2x Cis12 - Gst1 , 2x Cis12 - 2x 30I-8_M1_S2, 2x Cis13 - 2x Cis02, 2x Cis13 - 2x Cis05, 2x Cis13 - 2x Cis12, 2x Cis13 - 2x Cis13, 2x Cis13 - 2x D, 2x Cis13 - 2x S, 2x Cis13 - Gst1 , 2x Cis13 - 2x 30I-8_M1_S2, 2x D - 2x Cis02, 2x D - 2x Cis05, 2x D - 2x Cis12, 2x D - 2x Cis13, 2x D - 2x 30I-8_M1_S2, 2x S - 2x Cis02, 2x S - 2x Cis05, 2x S - 2x Cis12, 2x S - 2x Cis13, 2x S - 2x 30I-8_M1_S2, Gst1 - 2x Cis02, Gst1 - 2x Cis05, Gst1 - 2x Cis12, Gst1 - 2x Cis13, Gst1 - 2x 30I-8_M1_S2, 2x 30I-8_M1_S2 - 2x Cis02, 2x 30I-8_M1_S2 - 2x Cis05, 2x 30I-8_M1_S2 - 2x Cis12, 2x 30I-8_M1_S2 - 2x Cis13, 2x 30I-8_M1_S2 - 2x D, 2x 30I- 8_M1_S2 - 2x S, 2x 30I-8_M1_S2 - Gst1 und 2x 30I-8_M1_S2 - 2x 30I-8_M1_S2.
Besonders vorteilhafte Kombinationen mit überraschender Wirkung im Hinblick auf
Induktionsfaktor und Aktivität sind in der Tabelle 3 aufgeführt.
Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf chimäre Promotoren, die mindestens eine der oben genannten Kombinationen von cis-regulatorischen Elementen umfassen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Chimären Promotoren der vorliegenden Erfindung stammt der Minimalpromotor beispielsweise aus einem CaMV35S-Promotor, für
monocotyledone Pflanzen beispielsweise aus dem Weizen-TaPal-Promotor (SEQ ID NO: 39), dem Mais-ZmUbiquitin-Promotor (SEQ ID NO: 40) oder dem Reis-OsGns1 -Promotor (SEQ ID NO: 38), oder für dicotyledone Pflanzen aus bekannten Minimalpromotoren (WO 07/147395). Darüber hinaus können aber auch Minimalpromotoren aus anderen Quellen zur Konstruktion eines Chimären Promotors im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Ein chimärer Promotor der vorliegenden Erfindung erfüllt in jedem Fall die wesentlichen Erfordernisse, die an die stringente Expressionsregulation eines Transgens in einem gentechnischen Ansatz, z.B. zur Herstellung einer Pathogen-/Krankheits-resistenten Pflanze, gestellt werden. Das Transgen ist ein mit dem Chimären Promotor operativ verknüpftes Nukleinsäuremolekül von Interesse, z.B. eine heterologe DNA-Sequenz, welche
beispielsweise für ein Resistenzgen (R-Gen), ein autoaktiviertes Resistenzgen, ein
Avirulenzgen, einen anderen Effektor, ein Protein, das toxisch gegenüber mindestens einem Pathogen ist, Signaltransduktionskomponenten, ein Protein welches an der Synthese von Phytoalexinen, eine doppelsträngige RNA für die Bildung von gegen einen Pathogen gerichteten siRNAs oder ein antimikrobielles Peptid kodiert. Zudem zeigten zahlreiche Versuche an Petersilie (Petroselinum erispum), Arabidopsis thaliana, Weizen (Triticum sp.) und Zuckerrübe {Beta vulgaris), dass ein chimärer Promotor der vorliegenden Erfindung speziesübergreifend funktioniert und verwendet werden kann (siehe zum Beispiele 4xCis05 in Petersilie, Zuckerrübe und Weizen).
Die Definition eines Familienmotivs für eine jede Motivgruppe 1 , 5, 1 1 , 12, 21 , 21 n und 27 eröffnet einem Fachmann neue Möglichkeiten bei der Konstruktion von Chimären
Promotoren der vorliegenden Erfindung. Die beobachteten Aktivitäten der verschiedenen Mitglieder der Motivgruppen 27 und 12 (Fig. 8) zeigen, dass die flankierenden Sequenzbereiche zur bedarfgerechten Feinabstimmung des gewünschten Expressionslevels herangezogen werden können. Dies gilt auch für eine spezies-abhängige Abstimmung des Expressionslevels. Das Familienmotiv gibt die Variationsmöglichkeiten einzelner Basen in diesen flankierenden Bereichen wieder und lehrt damit dem Fachmann, inwieweit die flankierenden Bereiche modifiziert werden können. Zudem erhält der Fachmann aus dem Familienmotiv Informationen darüber wie stark einzelne Basenpositionen innerhalb des Familienmotivs konserviert vorliegen. Dabei ist davon auszugehen, dass die Modifikation einer stark-konservierten Base eine deutlichere Auswirkung auf die resultierenden
Eigenschaften des Chimären Promotors hat als eine schwach konservierte Base.
Weiterhin betrifft die Erfindung auch ein rekombinantes Gen, welches einen Chimären Promotor der vorliegenden Erfindung umfasst. Vorzugsweise ist das rekombinante Gen derart gestaltet, dass der Chimäre Promotor operativ verknüpft ist mit einem
Nukleinsäuremolekül, z.B. einer heterologen DNA-Sequenz. Eine solche heterologe DNA- Sequenz kodiert insbesondere für ein (Poly)petid, ein cytotoxisches Protein (wie Bt-Toxin, Avirulenzprotein oder Enzyme wie Glucoseoxidasen, welche reaktive Sauerstoffspezies erzeugen), einen Antikörper, eine Antisinn-RNA, eine Sinn-RNA, einen Transkriptionsfaktor, eine Protease, eine Nuklease, eine Lipase, einen Enzyminhibitor oder einen messbaren Marker (wie Luziferase, GFP oder ß-Galactosidase). Letztgenannte Marker sowie andere aus dem Stand der Technik bekannte Marker können in Testsystemen verwendet werden, um die Pathogenspezifität eines Chimären Promotors der vorliegenden Erfindung zu ermitteln oder Effektoren zu identifizieren, die eine Induktion des Chimären Promotors bewirken oder hemmen.
Chimäre Promotoren der Erfindung können auch in RNAi-basierten Verfahren zum 'Gene Silencing' genutzt werden, wobei das operativ verknüpfte Nukleinsäuremolekül von Interesse beispielsweise eine Antisinn-RNA, eine Sinn-RNA oder eine doppelsträngige RNA (dsRNA) kodiert. Das RNA-Molekül kann dann eine kurze Nukleotidsequenz (im Allgemeinen mindestens 10 Nukleotide, bevorzugt mindestens 14 Nukleotide und optionell bis zu 100 oder mehr Nukleotide lang) darstellen, welche im Wesentlichen komplementär ist zu einer spezifischen mRNA-Sequenz und/oder einer DNA-Sequenz eines Gens von Interesse.
Standardmethoden der RNAi-Technologie sind im Stand der Technik beschrieben.
Prinzipiell ist es möglich die operativ verknüpfte kodierende Sequenz derart zu modifizieren, dass das Produkt der Translation in einem gewünschten Zellkompartiment wie Nukleus, endoplasmatisches Retikulum, Mitochondrium, Cytoplasma oder Vakuole oder auch extrazellulär (apoplastisch) lokalisiert wird. Hierfür geeignete Verfahren zur Modifikation sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt (Gorlich, Science 271 (1996), 1513- 1518; Hicks, Plant Physiol. 107 (1995), 1055-1058; Rachubinski, Cell 83 (1995), 525-528; Schatz, Science 271 (1996), 1519-1526; Schnell, Cell 83 (1995), 521-524; Verner, Science 241 (1988), 1307-1313; Vitale, BioEssays 14 (1992),151-160).
Ein rekombinantes Gen der vorliegenden Erfindung kann sowohl allein als auch als ein Teil eines Vektors genutzt werden. Demnach betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Vektor, welcher den Chimären Promotor dieser Erfindung oder das rekombinante Gen dieser Erfindung umfasst. Bevorzugt ist der Vektor ein pflanzlicher Expressionsvektor, welcher vorzugsweise weiterhin auch einen Selektionsmarker für Pflanzen umfasst. Beispiele für geeignete Marker sind bereits weiter oben aufgeführt. Verfahren zur Konstruktion solcher Vektoren sind aus dem Stand der Technik dem Fachmann bekannt, z.B. beschrieben in Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.V. (1989).
Die vorliegende Erfindung betrifft zudem eine prokaryotische oder eine eukaryotische Wirtszelle, welche einen Chimären Promotor, ein rekombinantes Gen oder einen Vektor gemäß der Erfindung umfasst, wobei der chimäre Promotor an sich oder als Teil des rekombinanten Gens oder als Teil des Vektors oder jeweils ein Teil des Chimären Promotors wie ein cis-regulatorisches Element heterolog ist zu der prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle, also beispielsweise von einer Zelle oder einem Organismus mit einem anderen genetischen Hintergrund stammt, oder homolog ist zu der prokaryotischen oder
eukaryotischen Wirtszelle, dann aber in einer unterschiedlichen genetischen Umgebung lokalisiert ist und sich so von dem natürlicherweise vorhandenen Chimären Promotor oder dessem Teil unterscheidet.
Der chimäre Promotor, das rekombinante Gen oder der Vektor gemäß der Erfindung können entweder in das Genom der prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle intergriert sein, bevorzugt stabil integriert, oder können in einer extrachromosomalen Form wie einem Plasmid in der Zelle verbleiben.
Weiterhin stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze zu Verfügung, umfassend das Einbringen eines Chimären Promotors, eines rekombinanten Gens oder eines Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung in mindestens eine Zelle der Pflanze oder umfassend das Einbringen eines Chimären Promotors, eines rekombinanten Gens oder eines Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung in mindestens eine pflanzliche Zelle in einer Zellkultur, aus welcher anschließend die transformierte bzw. transgene Pflanze regeneriert wird. Vorzugsweise wird der chimäre Promotor, das rekombinante Gen oder der Vektors in das Genom der Pflanze integriert, besonders bevorzugt stabil integriert. Für die Expression des Nukleinsäuremoleküls von Interesse unter der Kontrolle eines Chimären Promotors gemäß der vorliegenden Erfindung in Pflanzenzellen, kann das
Nukleinsäuremolekül mit weiteren regulatorischen Sequenzen wie am 3'-Ende einem Poly-A- Schwanz verbunden sein. Verfahren zum Einbringen von Genen oder genetischem Material in eine Pflanze oder in eine pflanzliche Zelle sowie Verfahren zur Regeneration von transformierten pflanzliche Zellen sind aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise Agrobacterium tumefaciens- oder Agrobacterium ΛΛ/zogenes-vermittelte Transformation von pflanzlichen Zellen oder Geweben mit T-DNA, die Protoplastenfusion, Injektion,
Elektroporation, Vakuuminfiltration oder biolistische Methoden. Ebenso sind Verfahren zur Präparation von geeigneten Vektoren zum Einbringen von Genen oder genetischem Material in eine Pflanze oder in eine pflanzliche Zelle dem Fachmann geläufig (Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.V. (1989)).
In einer alternativen Ausführungsform kann eine pflanzliche Zelle derart modifiziert werden, dass diese pflanzliche Zelle ein endogenes Gen unter der Kontrolle eines Chimären
Promotors gemäß der vorliegenden Erfindung oder unter der Kontrolle eines durch erfindungsgemäße cis-regulatorische Elemente modifizierten nativen Promotors des endogenen Gens exprimiert. Das Einbringen eines solchen Chimären Promotors, welcher natürlicherweise nicht die Expression eines bestimmten Gens oder einer bestimmten genomischen Sequenz reguliert, an die gewünschte Stelle im Pflanzengenom oder das Einbringen von erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Elementen in einen nativen
Promotor, kann über bekannte Standardverfahren beispielsweise durch gezielte Integration ('gene targeting') mittels Zink-Finger-Nukleasen (Urnov et al., Nature Reviews 2010_Genome editing with engineered zinc finger nucleases; Townsend et al., Nature 2009_High-frequency modification of plant genes using engineered zinc-finger nucleases) oder TAL-Effektor- Nukleasen (WO 2010/079430; WO 201 1/072246) erfolgen. Die Modifikation eines nativen Promotors eines endogenen Gens meint dabei auch das zusätzliche Einbringen eines erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Elements in den nativen Promotor, welcher bereits ein erfindungsgemäße cis-regulatorischen Element natürlicherweise aufweist, also eine Multimerisierung vorhandener cis-regulatorischer Elemente. Ein solcher modifizierter Promotor kann im Vergleich mit der nativen Version geänderte Eigenschaften hinsichtlich beispielsweise Spezifität, Expressionslevel oder Hintergrundaktivität aufweisen.
Aus den modifizierten pflanzlichen Zellen können mit Hilfe bekannter Verfahren modifizierte Pflanzen regeneriert werden. Somit betrifft die Erfindung weiterhin beschriebene transgene (transformierte) Pflanzen, welche mit einem Chimären Promotor, einem rekombinanten Gen einen Vektor gemäß vorliegender Erfindung transformiert wurden, und beschriebene Pflanzen, modifiziert durch das Einbringen von mindestens einem erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Element oder von einem Chimären Promotor gemäß der Erfindung. Transgene bzw. modifizierte Pflanzen können aus jeder gewünschten Pflanzenspezies stammen. Sie können monokotyledone, dikotyledone oder angiosperme Pflanzen sein, vorzugsweise gehören sie zu
Pflanzenspezies von agrarwirtschaftlichem oder hortikulturellem Interesse, beispielsweise Mais, Reis, Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Sorghum, Kartoffeln, Ölraps, Sonnenblume, Sojabohne, Baumwolle oder Zuckerrübe.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist eine transgene oder modifizierte Pflanze resistent oder zeigt eine gesteigerte Resistenz gegenüber einem oder einer Vielzahl von Pathogenen im Vergleich zu einer nicht-transgenen oder nicht-modifizierten Pflanze derselben Spezies (Wildtyp).
Von der vorliegenden Erfindung sind weiterhin ein Pflanzenteil, ein Pflanzengewebe, eine Pflanzenzelle oder ein Samen der transgenen und der modifizierten Pflanze der
vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen, wobei dieser Pflanzenteil, dieses
Pflanzengewebe, diese Pflanzenzelle oder dieser Samen ebenfalls das in die Pflanze eingebrachte Transgen oder die eingebrachte Modifikation aufweisen.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die angehängten Figuren und Sequenzen beschrieben:
Fig 1 : Als Beispiel für Klonierung der Einzelsequenzen als Chimäre Promotoren sind die Plasmide mit 2xCis05 Element und dem multimerisierten 4xCis05 Element gezeigt. Die Plasmide leiten sich von pBT10-GUS (Sprenger and Weisshaar (2000): The Plant Journal 22, 1-8) ab. Der Aufbau der anderen Plasmide ist entsprechend. Amp: Ampicilin-Resistenz; WRKY30-Cis05: Doppelte Einzelsequenz Cis05. 35S-minimal: 35S-Minmalpromotor; Luc- m3: Luziferase-Reportergen; pAnos: Nos-terminator.
Fig 2: Spezies-übergreifend Pathogen-induzierbare Einzelsequenzen (A - X). In den oberen Zeilen sind jeweils die Bezeichnung der Einzelsequenz, die Motivgruppe, und die
Einzelsequenzen selbst wiedergegeben. Die Kernsequenzen des Motivs, das zur Auswahl der Einzelsequenz geführt hat, ist fett geschrieben und unterstrichen. Darunter ist jeweils das Motivlogo des zugrundeliegenden bio informatorisch identifizierten Motivs sowie dessen Matrize wiedergegeben. Sind mehrere Einzelsequenzen von einem Motiv getestet worden, so sind diese zusammengefasst.
Fig 3: Zusammenfassung aller positiv getesteten Einzelsequenzen einer Motivgruppe und Darstellung der daraus abgeleiteten Sequenz- und Familienmotive (Fig. 3 A - G). In der obersten Zeile ist die jeweilige Motivgruppe genannt. Darunter ist eine Alignment aller positiv getesteter Einzelsequenzen gezeigt, das mindestens die Kernsequenzen und, falls vorhanden, weitere konservierte Basen umfasst. Die Basen, aus denen sich das
Kernsequenzmotiv ableitet, sind mit einem Rahmen versehen.
Fig 4: Phylogenetischer Stammbaum der identifizierten Motivgruppen. Der Stammbaum wurde durch eine Clusteranalyse mithilfe des Webservers STAMP erstellt. Hinter der Nummer der Motivgruppe ist in Klammern die Zahl der in der Motivgruppe enthaltenen Motive wiedergegeben.
Fig 5: A) Mutagenese der Cis05-Einzelsequenz. Die verwendete Sequenz enthält neben dem Cis05-Motive (Fett, unterstrichen) eine W-Box (fett und umrahmt). In beide Motive wurden Mutationen eingeführt. Mit den tetramerisierten mutierten Derivaten wurden wie beschrieben Petersilien-Assays auf Induktion durch das PAMP PEP25 durchgeführt. Die PAMP-induzierte Aktivität der Chimären Promotoren wurde nach 4, 8 und 24 Stunden gemessen (rechte Seite). Mutationen in dem Cis05-Motiv (Cis05mut1 ) sowie in der W-Box (Cis05mut2) führen zu einem deutlichen Rückgang der induzierten Aktivität. Nur wenn beide Motive mutiert sind (Cis05mut1+2) kommt es zu einem vollständigen Verlust der
Induzierbarkeit. B) sCis05 ist eine verkürzte Variante von Cis05, die nur das Cis05-Motiv, aber nicht mehr die W-Box enthält. Die PEP25-Induzierbarkeit von sCis05 und mutierten Derivaten wurde, wie in 5A beschrieben, getestet. Die beiden Balken stehen für zwei biologische Replikate (unabhängige Transformationen). Zur Orientierung ist unter sCis05- Derivaten der W-Box Konsensus dargestellt.
Fig 6 A: Elizitor-responsive Reportergenexpression der Chimären Promotoren 4x301- 8_M1_S2 und 4x18H_M2_S1 mit Mutationen in den Einzelsequenzen. Die mutierten Basen sind unterstrichen. Die Elizitierung erfolgte durch PEP25 in Petersilienprotoplasten. Die Nukleotid-Sequenzen der mutierten Derivate der Einzelsequenzen sind unter den
Diagrammen wiedergegeben. +, mit Elizitor PEP25; -, ohne Elizitor. 2S2D: Positivkontrolle; MS23GUS: Negativkontrolle (Leervektor). Fig 6 B: Elizitor-responsive Reportergenexpression der Chimären Promotoren 4x20u_M1_S1 und 4x27G-8_M1_S1 mit Mutationen in den Einzelsequenzen. Die mutierten Basen sind unterstrichen. Die Elizitierung erfolgte durch PEP25 in Petersilienprotoplasten. Die Nukleotid- Sequenzen der mutierten Derivate der Einzelsequenzen sind unter den Diagrammen wiedergegeben.
Fig 7: Binärer Vektor für die Transformation des Luziferase-Reportergens unter Kontrolle der Chimären Promotoren in Zuckerrübe. Als Beispiel ist der Vektor mit dem Chimären Promotor 4xCis05 gezeigt, nptll: Kanamycin-Resistenz; WRKY30-Cis05: Doppelte Einzelsequenz Cis05. 35S-minimal: 35S-Minmalpromotor; Iuc-m3: Luziferase-Reportergen; Anos: Nos- terminator.
Fig 8 A: Cercospora beticola induzierte Promotoraktivität in stabil transformierten
Zuckerrüben. Von den angegebenen Konstrukten wurde für mehrere unabhängige
Transformanten die Luziferase-Aktivität nach C. beticola Infektion von in vitro-Pflanzen bestimmt (4 Replikate pro Transformante und Zeitpunkt). Aus den erhaltenen Messwerten wurde der Median berechnet. In dem oberen Diagramm sind die Ergebnisse für
Einzelseq uenzen aus der Motivgruppe 12 zusammengefasst, in dem unteren Diagramm die Ergebnisse für Elemente aus der Motivgruppe 27. Ko: Kontrolle (Mock-Infektion); inf;
Infektion mit C. beticola; 1d -4d: Tage nach Inokulation (d.p.i.). Kontrolle: Nicht transgene Pflanzen.
Fig 8 B: Cercospora beticola induzierte Promotoraktivität von 4xCis05 und seinen Derivaten in stabil transformierten Zuckerrüben. Für 4xCis05 und seine Derivate wurde die Luziferase- Aktivität nach C. beticola Infektion jeweils in mehreren unabhängige Transformanten bestimmt (4 Replikate pro Transformante und Zeitpunkt). Aus den erhaltenen Messwerten wurde der Median berechnet. Die Sequenz der verschiedenen Derivate ist in Fig. 5A und 5B wiedergegeben. Unter dem Diagramm ist zusätzlich für jedes der verschiedenen Derivate angegeben, ob es das Cis05-Motiv oder die W-Box enthält. Ko: Kontrolle (Mock-Infektion); inf; Infektion mit C. beticola; 1d -4d: Tage nach Inokulation (d.p.i.). non transgenic: Nicht transgene Kontrolle.
Fig 9: Cercospora beticola induzierte Promotoraktivität des Chimären Promotors
4xGG6_M1_S1 in stabil transformierten Zuckerrüben. Für 10 unabhängige Transformanten mit dem Konstrukt 4xGG6_M1_S1-luc wurde die Luziferase-Aktivität nach C. beticola Infektion von in vitro-Pflanzen bestimmt (4 Replikate pro Transformante und Zeitpunkt). Ko: Kontrolle (Mock-Infektion); inf; Infektion mit C. beticola; 2d, 3d, 4d und 7d: Tage nach Inokulation (d.p.i.). 3DC4156: Nicht transgene Kontroll-Pflanzen.
Fig 10: Plasmidkarte des für die transienten Tests in Weizen verwendeten Plasmids. Als Beispiel wird das Plasmid mit dem Chimären 4xCis05-Promotor gezeigt. Ruc: Renilla- Luziferase Reportergen. AMP: Ampicilin-Resistenz. WRKY30-Cis05: Doppelte
Einzelsequenz Cis05.
Fig 1 1 : Test der Induktion des Chimären Promotors 4xCis05 und seiner mutierten Derivate mit Mutationen in dem Cis05-Motiv (Cis05mut1 ), in der W-Box (Cis05mut2) oder in beiden Motiven (Cis05mut1 +2) durch Fusarium. Die entsprechenden Konstrukte wurde transient in Weizen transformiert, und die Luziferase-Aktivität 20 Stunden nach Inkubation mit Fusarium gemessen. 4xCis05-dam/dcm bezeichnet einen Versuch, bei dem Plasmid-DNA einem nicht methylierenden E.Coli-Stamm verwendet wurde um eine Induktion durch dam/dcm- methylierte DNA (ebenfalls ein potentielles PAMP) auszuschließen. Wird die Kernsequenz von Cis05 mutiert, so geht die Induzierbarkeit vollständig verloren. Die Mutation in der W-Box hingegen hat keinen Effekt. Die Sequenzen von Cis05 und seinen mutierten Derivaten sind rechts wiedergegeben. Mutierte Basen sind rot unterlegt.
Fig 12: Induzierte und nicht-induzierte Aktivität der Chimären Kombinatorik-Promotoren nach PEP25-lnduktion in Petersilie. Die Tests wurden in drei biologischen Replikaten
durchgeführt, die blaue Linie gibt den Induktionsfaktor wieder. Unter dem Diagramm sind in unteren Reihe die Elemente in 5' Position und in der oberen Reihe die Elemente in 3' Position angegeben. 3018b ist eine andere Bezeichnung für die Einzelsequenz 30I-8_M1_S2.
Fig 13: Synergistische und antagonistische Interaktionen von Einzelsequenzen in den Chimären Kombinatorik-Promotoren nach PEP25-lnduktion in Petersilie. In Violet ist der tatsächlich gemessene Induktionsfaktor wiedergegeben, in Blau der auf Grund der
Induktionsfaktoren der Einzelelemente erwartete Induktionsfaktor. Das Verhältnis beider Werte ist durch die gelbe Linie dargestellt. Liegen die Punkte der gelben Linie über dem Wert 1 , so zeigen die Einzelelemente eine synergistische Interaktion.
Fig 14: Transgene Zuckerrüben mit 4xCis05-RFP Konstrukt wurden mit Cercospora beticola infiziert. Die Infektion führt zur Aktivierung des Chimären 4xCis05-Promotors, was zur Bildung des rot fluoreszierenden RFP-Proteins führt. Das Protein ist unter dem Mikroskop als rote Fluoreszenz zu sehen. Wie zu erkennen ist, ist die Induktion und damit die Fluoreszenz auf den Bereich um die Penetrationsstelle bzw. den Infektionsort beschränkt. Fig 15: Beispielhafte schematische Darstellungen eines Chimären Promotors im Sinne der Erfindung. Der chimäre Promotor ist operativ mit einem Nukleinsäuremolekül von Interesse verknüpft und umfasst (A) neben einem Minimalpromotor ein heterologes cis-regulatorisches Element, (B) neben einem Minimalpromotor ein Dimer/Multimer eines heterologen cis- regulatorisches Elements oder (C) neben einem Minimalpromotor zwei Dimere/Multimere mit jeweils unterschiedlichen heterologen cis-regulatorischen Elementen. Zudem zeigt (D) beispielhaft als Chimären Promotor einen natürlichen Promotor, umfassend einen endogenen Minimalpromotor und ein endogenes cis-regulatorisches Element, wobei dieser Promotor durch Integration eines zusätzlichen homologen cis-regulatorischen Elements modifiziert wurde.
Fig 16: Transgene Arabidopsis-Pflanzen mit einem Tetramer des cis-regulatorischen
Elements Cis05 in einem chimäre Promotoren, der die Expression des GUS-Reportergens kontrolliert, um die Pathogen-induzierte, Wund-induzierte und Gewebe-spezifische Aktivität des Elements zu untersuchen. Für den Promotor wurden 10 unabhängige Transformanten untersucht. Gezeigt ist jeweils eine repräsentative Linie. Das linke Bild (5 d.p.i. with H.
arabidopsidis) zeigt jeweils die Aktivität des Promotors nach Infektion mit dem kompatiblen Pathogen Hyaloperonospora arabidopsidis, das rechte Bild (Mock control) ist die
entsprechende Kontrolle. Der Promotor zeigt eine klare Induktion durch Hyaloperonospora arabidopsidis (Dunkelfärbung des pflanzlichen Gewebes).
Zudem ist auf dem rechten Bild ein Blatt eingeschnitten. Eine Blaufärbung an dieser
Schnittstelle würde eine Wundinduzierbarkeit des Promotors mit dem Tetramer des cis- regulatorischen Elements Cis05 anzeigen.
Bioinformatorische Identifizierung der erfindungsgemäßen cis-regulatorischen Elemente: Grundlage für die bioinformatorische Identifizierung der neuen cis-regulatorischen Elemente sind öffentlich verfügbare Mikroarray-Expressionsdaten. Diese Expressionsdaten sind in Datenbanken wie TAIR, NASCArrays, Geo oder ArrayExpress hinterlegt oder können direkt aus entsprechenden Publikationen von Mikroarray-Experimenten bezogen werden (z.B. Rhee et al., 2003; Craigon et al., 2004; Barret und Edgar, 2006; Brazma et al., 2006, Zipfel et al., 2004, 2006; Bülow et al., 2007; Wan et al., 2008). Für die bioinformatorische
Identifizierung neuer cis-regulatorischer Elemente wurden zunächst anhand der öffentlich verfügbaren Mikroarray-Expressionsdaten Gruppen von Genen der Pflanze Arabidopsis thaliana definiert, deren Expression durch Pathogene wie P. syringae oder B. cinerea oder PAMPs wie flg22 oder Chitin induziert wird. Anschließend wurden die Sequenzen der Promotoren dieser Gen-Gruppen aus der Genom-Sequenz von Arabidopsis thaliana extrahiert (TAIR; http://www.arabidopsis.org). Unter Verwendung unterschiedlicher bekannter Algorithmen (MEME, Bioprospector, Alignace, BEST u. Ä.) wurden die Promotorsequenzen auf angereicherte Motive hin untersucht.
Datenbankabfragen
Für die Datenbankabfrage zur Identifizierung koagulierter Gene wurde ein Softwaretool geschrieben, welches es erlaubt Gene zu identifizieren, die bei bis zu sechs verschiedenen Stimuli gemeinsam hochreguliert bzw. induziert werden. Es wurden mehr als 700
Datenbankabfragen zur Identifizierung koregulierter Gene durchgeführt. Dieser
Abfrageprozess lieferte mehr als 400 Gruppen von gemeinsam induzierten Genen, die für eine Identifizierung gemeinsamer c/s-regulatorischer Motive mit dem BEST-Softwarepaket geeignet sind (Che et al., 2005). Bei 77 Gruppen wurde durch ein Anheben des notwendigen Induktionsfaktors die Anzahl von gemeinsam regulierten Genen auf 120 Gene reduziert. Die Gesamtanzahl von Gengruppen koregulierter Gene (2-120) lag danach bei 510.
Von diesen 510 Gengruppen wurden 500 bp oder 1000 bp lange Promotorsequenzen stromaufwärts vom Transkriptionsstart (TSS) der koregulierten Gene extrahiert, deren TSS bekannt war. Mit den Programmen BEST, Cismodule, MD-Scan, BioProspector oder MEME wurden die Promotorsequenzen der koregulierten Gengruppen nach konservierten
Sequenzmotiven untersucht. Dabei wurden Motivlängen von 5-1 Ont, 10-15nt und 15-20nt gewählt. Es wurden also etwa 500 x 3 (Motivlängen) = 1500 Abfragen durchgeführt. In den meisten Fällen wurden durch Verlängerung der Motivlängen keine weiteren Motive identifiziert, die nicht schon bei den kürzeren Motivlängen auftraten. In den BEST-Analysen wurde immer dann ein Motiv klassifiziert, wenn es von mindestens zwei der insgesamt 4 BEST-Programme gefunden wurde.
Bei bestimmten unterschiedlichen Stimuli wurden die gleichen koregulierten Gene, und daher auch die gleichen Motive erhalten. Es folgte eine Zusammenfassung der identischen Motive redundanter Gengruppen (GG) zu neuen Motiven (Tabelle Gengruppen), damit bei der vergleichenden, systematisierenden Analyse aller Motive untereinander nur einzigartige Motive verglichen wurden.
Es wurde ein Katalog erstellt, welcher alle identifizierten Motive plus Auswertungsdatei und die Sequenzlogos der einzelnen Motive enthält. Die Sequenzlogos (Crooks et al., 2004), erstellt unter http://weblogo.berkeley.edu/, spiegeln die Konserviertheit der Nukleotide an den einzelnen Positionen des Motivs wieder. Die Matrize (Matrix) wurde aus den Motiv bildenden Sequenzen erstellt, deren Sequenzen sowie deren zugehörige Gene ebenfalls
wiedergegeben sind.
Mittels des Programms STAMP (Mahony and Benos, 2007), das unter der Internet-Adresse http://www.benoslab.pitt.edu/stamp aufgerufen werden kann, wurden die identifizierten Motive mit bereits bekannten c/'s-regulatorischen Elementen (PLACE, Agris, Athamap) verglichen. Darüber hinaus können mithilfe des Webservers STAMP ähnliche Motive zu einer Motivgruppe gruppiert werden. Das Programm gibt einen phylogenetischen
Stammbaum heraus, an dem die Ähnlichkeiten der Motivgruppen zusammen gefasst dargestellt werden (Fig. 4).
Nachweis der Pathoqen-Induzierbarkeit der identifizierten Cis-regulatorischen Elemente Da bioinformatorische Ansätze anfällig für die Bestimmung falsch-positiver Sequenzen sind muss die Pathogen-Induzierbarkeit experimentell bestätigt werden. Für die experimentelle Bestätigung wurden die bioinformatorisch identifizierten Sequenzen unter Nutzung von Standard DNA Klonierungstechniken als Tetramer vor ein Luciferase-Reportergen kloniert und in einem transienten Expressionssystemen in Petersilie auf ihre Induzierbarkeit durch das PAMP PEP25 getestet.
Für die experimentelle Untersuchung wurden Elemente ausgewählt, die neu sind und keine Ähnlichkeit zu bekannten cis-regulatorischen Elementen der Pathogen-vermittelten Induktion zeigen. Die in Tabelle 2 aufgeführten Einzelsequenzen wurden mit Spei und Xbal oder mit Spei und Sali Linkern in vitro synthetisiert und in das Plasmid MS23 kloniert. MS23 trägt dabei entweder ein ß-Glucuronidase (GUS)-Reportergen oder ein Luziferase Reportergen mit einem 35S Minimalpromotor. Alle Elemente wurden tetramerisiert und zur Überprüfung sequenziert. Als Beispiel für Klonierung der Einzelseq Uenzen als chimäre Promotoren sind in Fig. 1 die Plasmide mit 2xCis05 Element und dem multimerisierten 4xCis05 Element gezeigt.
Tabelle 2: Untersuchte Einzelsequenzen. In der Tabelle sind die neuen Bezeichnungen und
Sequenzen der untersuchten potentiell cis-regulatorischen Elemente aufgeführt. Die bioinformatisch identifizierten Kernsequenzen sind hervorgehoben (fett und unterstrichen). In der letzten Spalte ist das Ergebnis des PEP25/Petersilien Tests wiedergegeben (-: keine Induktion; +:lnduzierbar).
Einzelsequenz- MotivAGI Einzelsequenz InduzierBezeichnung gruppe barkeit
12i_M1_S1 1 At5g04340 TCTCATCTCTCGACACGCAACTTCC +
Cis09 1 At1g27730 TGCACACACACACACGTGTACTAGGTCAAACCAAACGT +
Cis12 1 At2g33580 CAAAAAGTCAACACATACGACGCGTTTCCATTGACTAAATA +
12c_M1_S1 4 At1g21100 TCTACTAGAGGCCCATTAGGACCGGCAT -
20u_M1_S1 5 At1g 13990 I 1 I GAG 1 CG 1 1 1 ACGTCACG 1 CGAGAA I 1 1 I I +
20u_M1_S2 5 At4g05020 TGTCATTATTAATACGTGACGAAACTGTAGCTCTG +
28M-1_M1_S1 5 At1g09080 TTACGTGTCAAGAAGTGATTGGAGAGGACACTCTAC +
28M-1_M1_S2 5 At4g 17500 AAGACAAGTTGAGAGAGACGAGACCAATCACAACA -
28M-8_M1_S1 6 At3g21520 ATCCAACATCTCGGACCGGATCAATGATTTATCAT -
24F_M1_S1 7 At2g40750 TCATCAATGTGACATAAGCAAAGCT -
3C_M1_S1 11 At3g51440 TTTGATACGGTTACGGTTAATTAACG -
GG6_M1_S1 11 At2g40140 GACTTTTGACCTAAACCATTTCCAT +
GG11_M1_S1 11 At2g40140 GTTTTGACTTTTGACCTAAACCATTTCCATGTAGAA +
GG6_M1_S2 11 At5g59820 AAGATTCTCATCCAACCGAAACGACTCTTTCGTTTT -
GG11_M1_S2 11 At5g59820 AGATTCTCATCCAACCGAAACGACTCTTTCGTTTTT -
GG11_M1_S3 11 At1g27730 TCTTCTTCATTTTACCAACACCACTTGCACACACAC -
22DDD_M1_S1 11 At3g 14990 CCGTCTTAGTTTACCGAAACCAAAGTGGCTTTTTCT + 21G-2_ 1_S1 11 At1g01560 AGTTGAATTAGTTCGGTTCGGTTCGGTTGATATTG -
21 G-2_ 1_S2 11 At3g55470 CGTAATAATGGTTTGGTTTGGTTTGATCAAGTCTT +
37E_ 1_S1 12 At2g39200 CGATAAACTTGCG AAAC CCT AAAA -
18H_ 2_S1 12 At1g70170 CAACACAAAACGCAAACGCAGACCTC +
18H_ 2_S2 12 At2g35980 TATTGGAAGTTTGGGGCAACATCAC -
16MM_ 1_S1 12 At5g05340 TTCAACCCTATAAACCAAAACAAATAACAGAATGC -
38 _ 1_S1 12 At4g23810 AAATAATTATTTATGGTTTGGTCATTTGGTCAAAT +
3I_ 3_S1 12 At1g26390 CGCCTCAATCATGAAAACGAATCCTCTGTAGTAGTG -
18H_ 2_S3 12 At1g70170 AATTGACAAAAGACACGCAAACGATTCCAACGACC +
26LLL_ 1_S1 12 At1g67920 TTACCGACACGTAACCAAAACTCACCGAACACCGT -
38 _ 1_S2 12 At2g29460 GTTTCGAACGGGAACCAAACCATAATATGCGATGC -
38 _ 1_S3 12 At3g54960 ACACTATTGGTCTTGGTTTGGTTTATATGCACGAC -
23LLL_ 1_S1 12 At2g30770 GAAAACGATGGGTTCC AAAAC TGTCGCTAATAAACT -
37D_ 1_S1 12 At1g32940 TCTCCACTCGTTGTGATTTGGTCTGCAAGAAAACTA -
23LLL_ 1_S2 12 At1g01480 ACG I I I I GAAAI A I IG I 1 1 I GA I GAGA I 1 1 1 1 I C -
34G-4_ 1_S1 12 At3g28740 ATTTTTCATTTCGCCCAAAACAATTATCCTAACGTT -
26LLL_ 1_S2 12 At4g01700 AGTCAAAACGTAGACCAAAACAAAAACATGTAACT +
27H-8_ 1_S1 12 At4g 18430 TTTTATAACACTACCAAAACCAATAAGCCCTTTCGT -
26KKK_ 1_S1 12 At2g43510 TCATCAAACCAATCGGTTTGGTCCTAAAGATAATT -
19Q_ 1_S1 13 At4g35180 GTCAATATACACAGCCACCGAACAAATTACTCTAT -
21S_M1_S1 14 At2g 14610 AAGCGATGTTTACGAAC CCCAAAATC -
28H-9_ 1_S1 14 At1g 19020 AGATTTGTTCGAGAACCTTGAGAAA -
28H-9_ 1_S2 14 At4g37370 TTGCTACTTCGAGAACATTGGTCAA -
20a_ 1_S1 15 At5g04340 TTAGAAGTGGCTCGAGTGTTCTACTT -
20a_ 1_S2 15 At5g20230 AAGAAAGACAATCGAGCCTAGAAATT -
12G_ 2_S1 18 At1g61800 CCATACAATATAAACCACCAAACCATAACCACAAA +
3D_M1_S1 18 At4g39950 AATAATGTTCAACGTTGGTGGTGGTACTCAAGATGG -
41J_ 1_S1 19 At3g09940 TCAAATACAGGCAACCAAGACTCGAGATCCTCATCG -
37C_ 1_S1 20 At3g51440 AGAAAAATATTGGGCCTACTGGGAA -
3 _M3_S1 20 At3g02800 AGATTCCTGAAGTGAGGTCCACCCTAAAATCCATTT -
GG8_ 1_S1 21/21Π At1g27730 CACACACGTGTACTAGGTCAAACCA +
27G-8_ 1_S1 21/21n At2g38860 AGGACTTTTCACCAGTTGGACTTTGAAGCCACCAA +
27G-8_ 1_S2 21 At1g72060 GGTTTAGTCAAAGTAAACAAGACTTTGACTGTTCA -
27B-10_ 1_S1 21 At1g22890 TGAACTTAATCACTGTCATTGTTTTCGTAACAATTT -
26WW_ 2_S1 21n At4g02380 CTCAAAGGCCAGAATTGACGCAGCCGTTT +
27B-10_ 1_S3 21n At1g21120 CCTTGGCCCAGTCCTTGGTCGTCGTATC +
GG4_ 2_S1 22 At3g 14990 GAAAAATGTGTGTGTTTGTGTTAATT -
GG4_ 2_S2 22 At5g59820 ATAGTTCCCAAACGGACACGAACACA -
30A-8_ 1_S1 24 At3g49620 GCAAACTAACGCCGGCGGCCGTCTTG -
30I-8_ 1_S1 27 At5g 12930 ACAACAGACGACTTTTCATAATTCA +
30I-8_ 1_S2 27 At1g26390 CTATATGACAAAAGTCAAACATAAA +
GG13_ 1_S2 27 At3g26830 TGTTCACTTTGAAAAGTATTCTTTGAG +
30H-8_ 1_S1 27 At1g35230 TAGCTGTTGAAATTTCCAAGAAAAT -
14S_ 1_S1 27 At1g76960 CGATCAGACTTTTCTACGCAAGAGAA +
21S_ 3_S1 27 At1g76960 TAATTTCTCTTGCGTAGAAAAGTCTGATCGGGAAG +
30I-8_ 1_S3 27 At5g24110 TCGTTCTTCAGTCAAAAAGTCAAACTATCTCTCTC +
Cis02 27 At5g 64905 GAGCGTGAATTGACTTTGACCAAAACCAAA +
Cis05 27 At5g24110 GGTCAGCATGTTGGACTTTCCAAATTCATTGACCAAAG +
Cis13 27 At1g26380 AAAATAAACAGCTACTTGACGAAAAGTCAAACCAAATTC +
22AAA_ 1_S1 31 At2g40000 TTTTTCTCGTCCCCATCCTCTATCC -
12r_M1_S1 32 At1g73480 CAATCTACTCGTCTCTTCTCTTACAT +
GG3_ 1_S1 32 At5g44420 TAGGTTCCTGCCCTCTCCGTTCCTCC -
GG3_ 1_S2 32 At4g39980 TCGAAACCAACCCTCTCCCTTATAAA -
20EE_ 1_S1 32 At4g39980 GAAACCAACCCTCTCCCTTATAAATA -
24P_ 1_S1 32 At1g30135 I G I 1 1 I GI 1 1 CCACCGTCTCTCCC 1 G1CC 1 C 1 CT C - Im Folgenden wurden die tetramerisierten Einzelsequenzen in transient transformierten Petersiliezellen aus einer Zellkultur auf ihre Induzierbarkeit durch das PAMP PEP25 getestet. So sollte neben einer generellen Validierung sichergestellt werden, dass sich die Elemente in verschiedenen Pflanzenspezies und durch verschiedene Elizitoren induzieren lassen.
Für den Test in Petersilie wurden aus einer 5 Tage alten Petersilienzellkultur Protoplasten isoliert. Dazu wurden 35 ml Zellkultur abzentrifugiert und in 90 ml einer sterilfiltrierten Lösung mit 0,5% Cellulase, 0,2% Macerozyme R-10 und 0,24 M CaCI2 resuspendiert und über Nacht unter Schwenken bei 26°C inkubiert. Danach wurden die freigesetzten Protoplasten durch Zentrifugation pelletiert, mit 40 ml 0,24 M CaCI2 gewaschen und anschließend in 50 ml P5- Medium (1 Tüte Fertigmedium Gamborgs B-5, 1 mg 2,4 D, 96,9 g Sacharose, pH 5,7 mit 1 M KOH, steril filtrieren) resuspendiert. Nach Zentrifugation schwimmen die Protoplasten an der Oberfläche des P5-Mediums und können abgenommen werden. Die Aufreinigung mit P5- Medium wurde 2x wiederholt.
Für die Transformation wurden in 10 ml Schraubdeckelröhrchen 5 μg des zu testenden Promotorkonstrukts, 2,5 g eines konstitutiv Renilla-Luciferase exprimierenden
Normalisierungsvektors und 200 μΙ PEG vorgelegt. 200 μΙ Protoplasten wurden zugegeben, dann wurde vorsichtig gemischt und 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.
Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe von 5 ml 0,275M CaN03-Lsg gestoppt. Die transformierten Protoplasten wurden abzentrifugiert, in 6ml P5-Medium aufgenommen und in 2 Aliquots aufgeteilt. Ein Aliquot wurde mit Pep25 (Endkonz: 300ng/ml; Sequenz:
VTAG AE VWNQPVRG FKVYEQTE MT) elizitiert, das andere dient als Kontrolle. Nach
Inkubation über Nacht wurden die Protoplasten durch Zentrifugation geerntet. Die
Luziferaseaktivität wurde mit dem Dual Luziferase Kit (Promega, Mannheim, Deutschland) in einem Sirius Luminometer (Berthold Detection System GmbH, Pforzheim, Deutschland) bestimmt. Dazu wurde die Petersilienzellen durch Zentrifugation pelletiert und für 20 Minuten bei 4°C in 150 μΙ PLB-Puffer (Passive Lysis Buffer; Promega, Mannheim, Deutschland) lysiert. Die Zellreste werden für 20 Minuten bei 13.000 rpm und 4°C in einer Tischzentrifuge abzentrifugiert.
Mit dem Lysat wurde abhängig davon, ob das Luziferase-Reportergen oder das GUS- Reportergen verwendet wurde, unterschiedlich verfahren. Wurde das Luziferase- Reportergen verwendet, wurden von dem Überstand mit der freigesetzten Luziferase 5μΙ Probe in 5ml Röhrchen (Sarstedt, Art.Nr. 55.476) mit 50 μΙ LARII Puffer (Promega,
Mannheim, Deutschland) gemischt. Der Puffer enthält das Substrat der Luziferase, so dass die Aktivität des Enzyms und damit des Promotors mit dem Luminometer gemessen werden kann. Die Messung erfolgt mit 2 Sekunden Vormesszeit und 10 Sekunden
Luciferasemesszeit. Anschließend werden 50μΙ Stop & Glo Puffer (Promega, Mannheim, Deutschland) zugegeben und vorsichtig durch aufziehen gemischt. Dieser Puffer stoppt die Luziferaseaktivität und macht die konstitutive Renilla-Luciferase Aktivität des
Normalisierungsvektors messbar. Dieser Messwert wird zur Normalisierung der
unterschiedlichen Transformationseffizienzen verwendet. Die Messung erfolgt ebenfalls mit 2 Sekunden Vormesszeit und 10 Sekunden Luciferasemesszeit.
Wurde das ß-Glucuronidase (GUS) Reportergen aus E. coli verwendet (Jefferson et al., 1987), erfolgte der Nachweis in einer Enzymreaktion, in der das Substrat MUG zu 4-MU hydrolysiert wird. Dann wird 4-MU durch seine Fluoreszenz nachgewiesen und quantifiziert. Nach diesen Methoden wurde für alle untersuchten Einzelsequenzen die Aktivität mit und ohne das PAMP PEP25 gemessen.
In Tabelle 2 sind alle getesteten Einzelsequenzen aufgeführt. Zudem ist angegeben, ob sie durch das PAMP PEP25 in Petersilie induzierbar waren. Die als Pathogen-Induzierbar identifizierten cis-regulatorische Elemente (Einzelsequenzen) und ihre Motive sind in Fig. 2 zusammengefasst.
Mutationsanalvsen der identifizierten Kernsequenzen
Um nachzuweisen, dass jeweils die identifizierte Kernsequenz für die PAMP- und Pathogen- Induzierbarkeit der Einzelsequenzen verantwortlich ist, wurden für ausgewählte
Einzelsequenzen Mutationsanalysen durchgeführt. Dafür wurden mutierte Derivate der Einzelseq uenzen erstellt. Die mutierten Einzelsequenzen wurden als Oligonukleotide synthetisiert. Die Klonierung der Plasmide wurde entsprechend zu den Konstrukten mit Chimären Promotoren ohne Mutationen durchgeführt. Anschließend wurden die Konstrukte wie zuvor oben beschrieben auf ihre PEP25-Induzierbarkeit in Petersilie getestet. Die Ergebnisse der Mutationsanalysen sind in den Fig. 5A, Fig. 5B, Fig. 6A und Fig. 6B wiedergegeben. Für alle fünf untersuchten Elemente konnte gezeigt werden, dass die identifizierte Kernsequenz für die Induzierbarkeit verantwortlich ist.
Besondere Bedeutung hat dies für die Einzelsequenzen Cis05 und 30I-8 M1 S2 der Gruppe 27. Die Kernsequenz von 30I-8_M1_S2 überlappt teilweise mit einer zur W-Box (TTGAC; Rushton et al., 1996) komplementären Sequenz (GTCAA). Eine überlappende W-Box Sequenz wurde auch in den Einzelsequenzen 30I-8_M1_S3, Cis02 und Cis13 gefunden. Es konnte jedoch durch die Mutationsanalysen, insbesondere durch die Variante 30I- 8_M1_S2_mut2, gezeigt werden, dass Basen außerhalb der W-Box entscheidend für die PAMP-Induzierbarkeit sind (Fig. 6A). Zudem zeigen andere Mitglieder der Gruppe 27 keine überlappende W-Box-Sequenz. Entsprechend ist die für die W-Box zwingend notwendige Kernsequenz TGAC nicht Teil des Sequenz- oder Familienmotivs der Gruppe 27 (Fig. 3F). Somit handelt es sich bei den Motiven bzw. den Einzelsequenzen der Gruppe 27 nicht um Varianten der W-Box. In der Einzelsequenz Cis05 findet sich eine W-Box Sequenz außerhalb der Kernsequenz. Hier konnte durch die Mutationsanalysen gezeigt werden, das diese W-Box zwar PAMP- Induzierbarkeit vermittelt. Jedoch führt die Mutation nur der Cis05 Kernsequenz oder nur der W-Box zu einer Abnahme der Induzierbarkeit, und nur durch Mutation beider Elemente kommt es zu einem vollständigen Verlust der Induzierbarkeit. Somit handelt es sich um eine Einzelsequenz mit zwei funktionellen, PAMP- und Pathogen-induzierbaren cis- regulatorischen Elementen, der bekannten W-Box und dem neuen Cis05-Motiv (Fig. 2T). Dabei zeigt die Kombination beider Elemente eine deutlich höhere Aktivität als die
Einzelelemente allein.
Um den Sequenzbereich des Elements Cis05-Motivs (Fig. 2T) einzugrenzen, der die Induzierbarkeit vermittelt, wurde dieses separat von der W-Box tetramerisiert (sCis05) und es wurden vier weitere mutierte Derivate des Cis05-Motivs erstellt. Die Derivate wurden wie zuvor beschrieben in Petersilie auf ihre Induzierbarkeit durch das PAMP PEP25 getestet (Fig. 5B). Dabei konnte neben der entscheidenden Bedeutung der Kernsequenz für die Induzierbarkeit gezeigt werden, dass auch die beiden in 5'-Richtung vor der Kernsequenz liegenden Basen essentiell für die Induzierbarkeit von Cis05 sind, was weiter bestätigt, das es sich nicht um ein W-Box-Variante handelt.
Durch weitere Mutationsanalysen konnten auch die Kernsequenzen von den Elementen 20u_M1_S1 und 27G-8_M1_S1 bestätigt werden. Die Versuche wurden wie oben bereits beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Mutationsanalysen sind in Fig. 6B (oben: 20u_M1_S1 ; unten: 27G-8_M1_S1) wiedergegeben.
Ableitung von Familienmotiven
Dadurch, dass die in Äraö/'c/ops/s-Promotoren identifizierten cis-regulatorischen Elemente in Petersilie getestet wurden, wurde eine Pflanzen-Spezies übergreifende biologische
Funktionalität der identifizierten cis-regulatorischen Elemente sichergestellt. Wie erwartet zeigten die Experimente, dass nicht alle der bioinformatorisch identifizierten Sequenzen funktionell sind. Etwa ein Drittel der getesteten DNA Sequenzen waren in Petersilie durch PEP25 induzierbar. Die anderen Sequenzen waren falsch-positive Sequenzen aus der bioinformatorischen Analyse, oder zeigten nicht die gewünschte Spezies-übergreifende biologische Funktionalität. Diese wichtigen Ergebnisse konnten genutzt werden, um auf der Grundlage der funktionell wirksamen Einzelsequenzen die Familienmotive der Motivgruppen 1, 5, 1 1 , 12, 21 , 21 n und 27 sowie die dazugehörigen stark konservierten, charakteristischen Kernsequenzen zu identifizieren (Fig. 3). Dafür wurden alle zu einer Motivgruppe
gehörenden funktionell wirksamen Einzelsequenzen zusammengefasst und aus ihnen ein Konsensus und ein Motiv abgeleitet. Als charakteristisches Kernsequenzmotiv der Familienmotive wurde zunächst der Bereich definiert, der in allen zugrundeliegenden Einzelsequenzen Teil der Kernsequenz ist.
Die Kernsequenz von Motivgruppe 27 findet sich auch in der Sequenz LS10 (Lehel et al., 1998). Dort wurde in dem nativen PR-1 Promotor in diesem Sequenzbereich eine 10 Basen umfassende Mutation erzeugt, die zu einem starken Rückgang einer SA- oder INA- Induzierbarkeit des nativen Promotors führte. Die dort gezeigten Ergebnisse ermöglichen jedoch nicht die Ableitung eines Motivs oder einer Kernsequenz. Zudem ist die
Verwendbarkeit von LS10 für chimäre Promotoren nicht gezeigt. Des Weiteren grenzt das Familienmotiv der Motivgruppe 27 die Motivgruppe von der LS10-Sequenz ab. Das
Familienmotiv schließt an der Position 5 ein C aus, während in LS10 an dieser Position ein C vorhanden ist. Des Weiteren schließt es an der Position 17 ein G aus, während in LS10 an dieser Position ein G vorhanden ist. Schließlich erfordert es an Position 18 ein T oder C, während in LS10 an dieser Position ein A vorhanden ist.
Nachweis der Induzierbarkeit durch den pathogenen Pilz Cercospora beticola in stabil transformierten Zuckerrüben
Die neuen cis-regulatorischen Elemente sollen sich dadurch auszeichnen, dass sie in verschiedenen Pflanzenspezies durch unterschiedliche PAMPs und Pathogene induziert werden können. Um die Induzierbarkeit in einer agronomisch wichtigen Pflanze durch ein agronomisch wichtiges Pathogen zu zeigen, wurde die in Petersilie positiv getesteten Einzelsequenzen stabil in Zuckerrüben transformiert. Dazu wurden die Chimären Promotoren mit den tetramerisierten Einzelsequenzen inklusive des luc-Gens über die Asel- und Sacl- Schnittstellen in den binären Vektor 1xW1-luc-kan, ein auf dem binären Vektor pGPTV basierendes Plasmid, umkloniert. Als Beispiel ist in Fig. 7 der Vektor 4xCis05-luc-kan gezeigt. Entsprechende Vektoren wurden für alle untersuchten Elemente erstellt. Die Plasmid-DNA der binären Vektoren wurden aus E. Coli isoliert und mit einem Gene Pulser® II. Electroporation System mit den Einstellung 25 mF und 2.5 kV in den Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 transformiert. Die Selektion rekombinater A. tumefaciens-K\one erfolgte unter Verwendung des Antibiotikums Kanamycin (50 mg/l). Die Transformation der Zuckerrüben erfolgte nach Lindsey et al. (1991 ) unter Verwendung des Antibiotikums Kanamycin.
Die Transgenität der Pflanzen wurde durch PCR überprüft. Die Verwendung der Primer GTGGAGAGGCTATTCGGTA (SEQ ID NO: 36) und CCACCATGATATTCGGCAAG (SEQ ID NO: 37) führte zu der Amplifikation eines 553 bp großen DNA-Fragments aus dem npt\\- Gen. Die PCR wurde unter Verwendung von 10 ng genomischer DNA, einer
Primerkonzentration von 0,2 μΜ bei einer Annealingtemperatur von 55 °C in einem
Multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, USA) durchgeführt. 10 bis 20 unabhängige transgene Linien wurden in in vitro Kultur klonal vermehrt und mit Cercospora beticola (Isolat Ahlburg) infiziert. Nach 1 , 2, 3 und 4 Tagen wurden je 4 Pflanzen / Linie geerntet und ihre Luziferase-Aktivität mit dem Promega Luciferase Assay System, 100 assays, Kat.Nr. E1500 (LAR) gemessen. Dazu wurden die Proben in 4 Volumen CCLR- Buffer (Cell Culture Lysis Reagent, 5x) aufgenommen und mit Hilfe eines Heidolph (RZR 2020) aufgearbeitet. Die Pflanzenreste wurden 10min bei 4°C und 14000rpm abzentrifugiert und der Überstand für die Luziferase-Messung eingesetzt. Zur Messung wurden 10μΙ Probe in ein 5ml Röhrchen (Sarstedt, Art.Nr. 55.476) pipettiert und 100μΙ Luziferase Assay Reagent (LAR; Promega, Mannheim, Deutschland) zugeben. Dann wurde vorsichtig gemischt und die Luziferase-Aktivität in einem Sirius Luminometer (Berthold Detection System GmbH, Pforzheim, Deutschland) bestimmt.
Unter anderem wurden neue Elemente aus den Gruppen 12 und 27 (Zur Gruppen-Einteilung siehe Fig. 3 D und F) getestet. Aus den gemessenen Luziferase-Aktivitäten der etwa 10 bis 20 unabhängige transgene Linien mit einem Chimären Promotor wurde der Median berechnet. Die Tests der verschiedenen Promotoren sind nach den Gruppen, aus denen die Elemente stammen, zusammengefasst. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 A gezeigt. Der direkte Vergleich zeigt, dass die Einzelsequenzen einer Motivgruppe trotz der hohen Homologie der in ihnen enthaltenen Motive deutlich unterschiedliche Aktivitäten aufweisen. Die an die Kernsequenz angrenzenden Nukleotide des Familenmotivs können die Promotorstärke und die Hintergrundaktivität also stark beeinflussen. Die verschiedenen Sequenzen einer Motivgruppe sind somit in ihrer Funktion nicht identisch sondern erlauben die Entwicklung von Chimären Promotoren mit quantitativen Unterschieden in der Regulation der
Genexpression.
Um eine weitere Motivgruppe zu testen, wurde das Elemente GG6_M1 (Einzelsequenz GG6_M1_S1 ) entsprechend den Angaben oben stabil in Zuckerrübe transformiert und auf die Induzierbarkeit durch Cercospora getestet. Dazu wurden 10 unabhängige transgene Zuckerrüben wurden in in vitro Kultur klonal vermehrt und mit Cercospora beticola (Isolat Ahlburg) infiziert. Nach 2, 3, 4 und 7 Tagen wurden je 4 Pflanzen / Linie geerntet und ihre Luziferase-Aktivität mit dem Promega Luciferase Assay System, 100 assays, Kat.Nr. E1500 (LAR) gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 gezeigt und zeigen eine klare Induzierbarkeit der Einzelsequenz GG6_M1_S1 in Zuckerrübe durch Cercospora beticola. Des Weiteren zeigte eine histochemische Analyse, dass die Induktion weitestgehend im Leitgewebe erfolgt.
Um den Einfluss der W-Box Sequenz in der Einzelsequenz Cis05 in stabil transformierten Pflanzen zu untersuchen, wurden die mutierten Derivate Cis05mut1 und Cis05mut2 sowie die verkürzte Einzelsequenz sCis05 aus den Petersilientests stabil in Zuckerrübe transformiert. Konstrukterstellung und Transformation wurden wie oben beschreiben durchgeführt. Jeweils 18 unabhängige transgene Linien wurden in vitro klonal vermehrt und mit Cercospora beticola (Isolat Ahlburg) infiziert. Nach 1 , 2, 3 und 4 Tagen wurden je 4 Pflanzen / Linie geerntet und ihre Luziferase-Aktivität wie oben beschrieben gemessen (Fig. 8 B).
Die Mutationsanalyse in stabil transformierten Pflanzen zeigt, dass diese W-Box alleine, d. h. mit mutiertem Cis05-Motiv, nur eine schwache Pathogen-Induzierbarkeit durch Cercospora vermittelt. Das Cis05-Motiv alleine (mutierte W-Box oder verkürztes Element ohne W-Box) ist hingegen deutlich induzierbar. Die komplette Cis05-Einzelsequenz mit W-Box ist ebenfalls induzierbar, zeigt aber relativ zu den Derivaten ohne W-Box eine erhöhte
Hintergrundaktivität. Somit ist in stabil transformierten Zuckerrüben das Cis05 Motiv alleine der Kombination mit der W-Box gleichwertig oder sogar überlegen.
Ein weiteres wichtiges Merkmal der erfindungsgemäßen Chimären Promotoren ist, dass die Pathogen-induzierte Aktivität auf den Bereich der Infektionsstelle beschränkt ist. Dies wird in Fig. 14 am Beispiel des Erfindungsgemäßen Promotor 4xCis05 gezeigt. Dieser Promotor wurde mit dem rot Fluoreszierenden Reportergen RFP fusioniert, und das so erhaltene Konstrukt stabil in Zuckerrübe transformiert. Unter dem Laser Scanning Mikroskop lässt sich die Aktivität als rote Fluoreszenz beobachten. In Fig. 14 ist die lokale Induktion des 4xCis05 Promotors rund um die Penetrationsstelle einer Cercospora-Hyphe gezeigt.
Erweiterte Speziesüberqreifende Pathoqeninduzierbarkeit
Als weiteres Beispiel für breite Verwendbarkeit der cis-regulatorischen Elemente in unterschiedlichen Pflanzenspezies wurde für Cis05 in transienten Versuchen die
Induzierbarkeit in der Monokotylen Pflanze Weizen durch den Pilz Fusarium culmorum gezeigt. Da der 35S minimal Promotor in Weizen eine unzureichende Aktivität vermittelt mussten die Cis05-Elemente umkloniert werden. Dazu wurden sie mit den Enzymen Eco31 1 und Xbal aus den für die Petersilien-Tests verwendeten Plasmiden ausgeschnitten und in den mit Eco31 l und Beul geöffneten Vektor pubiTATARucll kloniert (Fig. 10). Entsprechende Konstrukte wurden für Cis05 sowie die mutierten Cis05-Einzelsequenzen Cis05mut1 und Cis05mut2 erstellt, in denen entweder das Cis05-Motiv bzw. die W-Box mutiert ist. Diese Konstrukte wurden biolistisch in mit Fusarium graminearum infizierte Primärblätter der Weizensorte "Taifun" sowie nicht infizierte Kontroll-Blätter transformiert.
Für die Infektion wurde Fusarium graminearum Mycel mit einem Objektträger von
bewachsene Pilzplatte abgekratzt und in 200 ml Wasser kurz mit einem Ultraturrax zerkleinern und suspendiert. Anschließend wurden 200μΙ 2% Triton zugegeben und die Weizen-Primärblätter 1 Minute in der Suspension geschwenkt. Anschließend wurden die infizierten Blattstückchen und nicht infizierte Kontroll-Blattstückchen auf H20-Agarplatten aufgelegt und mit einer Biorad particle gun nach Herstellerangaben unter Verwendung von 1 100 Psi Berstscheiben transient transformiert. Als Normalisierungsvektor wurde ein konstitutiv Luziferase exprimierender Vektor verwendet.
Die Weizenblätter wurden anschließend über Nacht bei 25°C inkubiert. Zur Bestimmung der Luciferase-Aktivitäten werden die Blätter in je 1 ml PLB-Puffer mit Seesand aufgemörsert. Nach Zentrifugation für 20 Minuten bei 4°C werden von dem Überstand mit der freigesetzten Luziferase 5μΙ Probe in 5ml Röhrchen (Sarstedt, Art.Nr. 55.476) mit 50 μΙ LARII Puffer (Promega, Mannheim, Deutschland) gemischt. Der Puffer enthält das Substrat der
Luziferase, so dass die Aktivität des Normalisierungsvektors gemessen werden kann. Dieser Messwert wird zur Normalisierung der unterschiedlichen Transformationseffizienzen verwendet. Die Messung erfolgt mit 2 Sekunden Vormesszeit und 10 Sekunden
Luziferasemesszeit. Anschließend werden 50μΙ Stop & Glo Puffer (Promega, Mannheim, Deutschland) zugegeben und vorsichtig durch aufziehen gemischt. Dieser Puffer stoppt die Luziferaseaktivität und macht die Renilla-Luciferase Aktivität, die der Aktivität der Cis05- Promotoren entspricht, messbar. Die Messung erfolgt ebenfalls mit 2 Sekunden Vormesszeit und 10 Sekunden Luciferasemesszeit.
Die induzierten bzw. nicht induzierten Aktivitäten des 4xCis05-Promotors sowie seiner mutierten Derivate wurde in 5 biologischen Wiederholungen gemessen (Fig. 1 1 ).
Anschließend wurde der komplette Versuch noch einmal wiederholt. Beide Wiederholungen zeigen, dass in Weizen die Pathogen-induzierte Aktivität von dem Cis05-Motiv stammt, während das W-Box Motiv keine von Fusarium graminearum induzierte Aktivität vermittelt.
Analyse der Pathogen- oder Wund-induzierten und der gewebespezifischen Aktivität der Elemente Cis02. Cis05. Cis09. Cis12 oder Cis13 in Arabidopsis
Die neuen cis-regulatorischen Elemente sollen sich dadurch auszeichnen, dass sie in verschiedenen Pflanzenspezies durch unterschiedliche PAMPs und Pathogene induziert werden können. Als weitere Kontrolle für die Aktivität der Chimären Promotoren wurden 6 Promotoren mit tetramerisierten Einzelsequenzen stabil in Arabidopsis transformiert. Dazu wurden die tetramerisierten Elemente Cis02, Cis05, Cis09, Cis12 oder Cis13 mit 35S- Minimalpromotor vor das GUS-Reportergen in den Transformationsvektor pBIN-GUS kloniert. Das fertige Konstrukt wurde in Agrobakterien transformiert. Im Folgenden wurde eine floral-dip Transformation (Clough and Bent, 1998) von Arabidopsis Pflanzen
durchgeführt, um die Promotor-GUS Konstrukte stabil in das Pflanzengenom zu integrieren. Die Selektion transgener Pflanzen erfolgte unter Verwendung des Antibiotikums Kanamycin. Für jedes Element wurden 10 unabhängige Transformaten untersucht. Die Aktivität des GUS-Reportergens und damit der Promotoren lässt sich durch eine GUS- Färbung sichtbar machen (Jefferson et al., 1987). Die Aktivierung der jeweiligen Chimären Promotoren führt zur Expression eines Enzyms (GUS), welches einen blauen Farbstoff bildet. Die Färbung zeigt somit die Aktivität des jeweiligen Chimären Promotors an.
Um die Pathogen-Induzierbarkeit der Promotoren zu testen, wurden die transgenen
Arabidopsis-Pflanzen mit dem kompatiblen Pathogen Hyaloperonospora arabidopsidis infiziert. 5 Tage nach Infektion wurde die Aktivität der Promotoren durch einen GUS-Färbung nachgewiesen. Zudem wurden einzelne Blätter durch Einschneiden mit einer Schere verwundet, um die Wundinduzierbarkeit der Promotoren zu testen (Fig. 16).
Das Element Cis02 zeigte eine gute Pathogen-Induzierbarkeit und nur eine geringe Wundinduzierbarkeit. Das Element Cis05 zeigte eine generell starke Aktivität und wird ebenfalls stark durch H. Arabidopsidis induziert. Das Elemente Cis09 zeigte eine gute Induktion des Promotors nach Infektion, und kaum unerwünschte Aktivität nach Verwundung. Das Elemente Cis12 zeigte wie Element Cis09 in allen untersuchten Linien kaum unerwünschte Aktivität nach Verwundung, während eine klare Induktion durch das Pathogen H.
arabidopsidis zu beobachten war. Die Elemente Cis12 und Cis09 teilen ein gemeinsames Familienmotiv. Auch das Element Cis13 wird stark durch Infektion mit H. arabidopsidis induziert. Eine klare Wundinduzierbarkeit ist jedoch nicht zu beobachten. Exemplarisch ist in Fig. 16 die GUS-Färbung von transgenen A. thaliana-Pflanzen gezeigt, die das GUS- Reportergen unter der Kontrolle eines Chimären Promotors mit 4x Cis05 exprimieren.
Kombinatorik der cis-requlatorischen Elemente
Durch eine synergistische Interaktion oder durch Integration verschiedener Signalwege (denkbar wäre ein Promotor, der Signale„EF-Tu" UND„flg22" wahrnehmen und integrieren muss, um aktiviert zu werden) können Chimären Kombinatorik-Promotoren, die aus verschiedenen cis-regulatorische Elementen zusammengesetzt sind, eine höhere Spezifität und/oder Aktivität zeigen als die in Ihnen vorhandenen Einzel-Elemente (Rushton et al., 2002). Um optimale Kombinationen der neuen cis-regulatorischen Elemente für Chimären Kombinatorik-Promotoren zu ermitteln, wurden unter Nutzung von Standard DNA
Klonierungstechniken chimäre Kombinatorik-Promotoren mit allen möglichen 2x2- Kombination der hier beschriebenen cis-regulatorischen Elemente Cis02, Cis05, Cis12, Cis13 und 30I-8_M1_S2 sowie der bereits veröffentlichten Elemente D-Box (Rushton et al., 2002), S-Box (Kirsch et al., 2000) und Gst1-Box (Strittmatter et al., 1996) erzeugt. Dabei wurde so vorgegangen, wie für die Tetramerisierung der Einzelsequenzen beschrieben, nur das nicht zwei identische Dimere (z.B. 2x30l-8_M1_S2 und 2x30l-8_M1_S2), sondern zwei unterschiedliche Dimere (z.B. 2xCis05 und 2x30l-8_M1_S2) aneinander kloniert werden. Die so entstandenen Chimären Kombinatorik-Promotoren wurden in dem transienten Expressionssystemen in Petersilie auf ihre Induzierbarkeit durch das PAMP PEP25 getestet. Die Ergebnisse (absolute nicht-induzierte und induzierte Aktivität der chimären Kombinatorik- Promotoren und der Induktionsfaktor) sind in Fig. 12 wiedergegeben. Es konnten chimäre Kombinatorik-Promotoren mit besonders starker und spezifischer Induzierbarkeit identifiziert werden, deren Induktionsfaktor und Aktivität höher ist als bei chimären Promotoren, die nur aus Wiederholungen der einzelnen cis-regulatorischen Elemente aufgebaut sind (Fig. 13). Die chimären Kombinatorik-Promotoren mit den höchsten Induktionsfaktoren und den stärksten Aktivitäten sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3: Kombinationen von Pathogen-induzierbare Einzelsequenzen mit den höchsten
Induktionsfaktoren und induzierten Aktivitäten.
Kombinationen mit dem höchsten Induktionsfaktor
MW stabw Varianzkoeffizient Induktion
2xCis05-2xCis05 - 3,23 2,06 0,64 149,58
2xCis05-2xCis05 + 482,53 398,05 0,82
2xCis05-2xS - 2,00 1 ,51 0,76 115,63
2xCis05-2xS + 231 ,82 48,39 0,21
2xCis05-2x30l8b - 2,47 1 ,42 0,58 123,16
2xCis05-2x30l8b + 304,21 45,38 0,15
2xCis13-2xCis02 - 2,50 0,50 0,20 124,53
2xCis13-2xCis02 + 311 ,48 37,76 0,12
2xCis13-2xCis05 - 2,33 0,41 0,18 182,59
2xCis13-2xCis05 + 425,23 258,29 0,61
2xCis13-2xS - 4,55 0,65 0,14 139,85
2xCis13-2xS + 636,85 364,80 0,57
2xS-2xCis02 - 5,28 3,36 0,64 106,32
2xS-2xCis02 + 561 ,76 440,81 0,78
2xS-2xS - 2,76 0,49 0, 18 138,80
2xS-2xS + 382,69 92,20 0,24
Gst1-2xS - 2,41 0,87 0,36 258,83
Gst1-2xS + 624,18 274,19 0,44
2x3018b-2xCis05 - 0,90 0,30 0,34 135,12
2x30l8b-2xCis05 + 121 ,20 88,90 0,73
Kombinationen mit der höchsten Aktivität (induziert)
MW stabw Varianzkoeffizient Induktion
2xD-2xCis05 - 84,57 49,56 0,59 17,88
2xD-2xCis05 + 1511,90 580,33 0,38
2xD-2xS - 23,96 17,66 0,74 57,72
2xD-2xS + 1382,94 1180,84 0,85
2xD-Gst1 - 19,25 20,18 1 ,05 62,10
2xD-Gst1 + 1195,21 486,92 0,41
2xS-2xCis12 - 36,84 19,34 0,53 29,05
2xS-2xCis12 + 1070,08 1043,46 0,98
2xS-2xD - 22,13 23,38 1 ,06 65,56
2xS-2xD + 1450,50 1085,69 0,75 Referenzen
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Claims

ANSPRÜCHE:
1. Isoliertes Pathogeninduzierbarkeit- oder Elikitorinduzierbarkeit-vermittelndes cis- regulatorisches Element, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, dessen Nukleotidsequenz einem der Kernsequenzmotive aus
a) vaaagtm,
b) aaacca,
c) scaaam,
d) acrcg,
e) sktgkact,
f) mrtsack,
g) ccaccaa,
h) tcgtctcttc, oder
i) wwkgwc
oder einem zu a) bis i) komplementären Kernsequenzmotiv entspricht.
2. Isoliertes cis-regularisches Element gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls eine Teilsequenz der Kernsequenz oder die Kernsequenz des cis-regulatorischen Elementes darstellt.
3. Isoliertes cis-regularisches Element, welches ein Nukleinsäuremolekül umfasst, dessen Nukleotidsequenz
a) einem Familienmotiv gemäß SEQ ID NO: 1 , umfassend das Kernsequenzmotiv vaaagtm gemäß Anspruch 1 , entspricht,
b) einem Familienmotiv gemäß SEQ ID NO: 2, umfassend das Kernsequenzmotiv aaacca gemäß Anspruch 1 , entspricht,
c) einem Familienmotiv gemäß SEQ ID NO: 3, umfassend das Kernsequenzmotiv scaaam gemäß Anspruch 1 , entspricht,
d) einem Familienmotiv gemäß SEQ ID NO: 4, umfassend das Kernsequenzmotiv acrcg gemäß Anspruch 1 , entspricht,
e) einem Familienmotiv gemäß SEQ ID NO: 5, umfassend das Kernsequenzmotiv sktgkact gemäß Anspruch 1 , entspricht,
f) einem Familienmotiv gemäß SEQ ID NO: 6, umfassend das Kernsequenzmotiv mrtsack gemäß Anspruch 1 , entspricht,
g) einem Familienmotiv gemäß SEQ ID NO: 41 , umfassend das Kernsequenzmotiv wwkgwc gemäß Anspruch 1 , entspricht oder
h) einem zu a) bis f) komplementären Familienmotiv entspricht.
4. Isoliertes cis-regularisches Element gemäß Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass das Familienmotiv die Kernsequenz des cis-regulatorischen Elements umfasst.
5. Isoliertes cis-regularisches Element, umfassend ein Nukleinsäuremolekül
a) mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 oder SEQ ID NO: 44,
b) mit einer Nukleotidsequenz gemäß der Kernsequenz aus SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:
8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 oder SEQ ID NO: 44, oder c) mit einer Nukleotidsequenz komplementär zu einer Nukleotidsequenz aus a) oder b).
6. Chimärer Promotor, welcher geeignet ist, induziert durch eine Pathogeninfektion oder eine Behandlung mit einem pathogenen Elizitor eine Expression eines operativ verknüpften Nukleinsäuremoleküls in einer pflanzlichen Zelle zu bewirken und welcher einen Minimalpromotor und mindestens ein cis-regulatorisches Element nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
7. Chimärer Promotor nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass der Chimäre Promotor mindestens ein Multimer von cis-regulatorischen Elementen umfasst, wobei mindestens eines der cis-regulatorischen Elemente ein cis-regulatorisches Element nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ist.
8. Chimärer Promotor nach Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, dass das Multimer ein Dimer oder Tetramer ist.
9. Ein rekombinantes Gen, welches den Chimären Promotor nach einem der Ansprüche 6 bis 8 umfasst.
10. Ein Vektor, welcher den Chimären Promotor nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder das rekombinante Gen nach Anspruch 9 umfasst.
11. Eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle, welche den Chimären Promotor nach einem der Ansprüche 6 bis 8, das rekombinante Gen nach Anspruch 9 oder den Vektor nach Anspruch 10 umfasst.
12. Eine transgene Pflanze, transformiert mit dem Chimären Promotor nach einem der Ansprüche 6 bis 8, mit dem rekombinanten Gen nach Anspruch 9 oder mit dem Vektor nach Anspruch 10.
13. Samen, Zelle, Gewebe oder Teil der Pflanze nach Anspruch 12.
14. Methode zur Herstellung einer Pflanze nach Anspruch 12, umfassend
a) das Einbringen des Chimären Promotors nach einem der Ansprüche 6 bis 8, des rekombinanten Gens nach Anspruch 9 oder des Vektors gemäß Anspruch 10 in mindestens eine Zelle der Pflanze und
b) das Regenerieren der Pflanze.
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