CN108179154A - 开发病原体-响应嵌合启动子的新型植物来源顺式-调节元件 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进病原体可诱导性或者诱导子可诱导性的分离顺式‑调节元件，该调节元件包含一个核酸分子，其核苷酸序列符合以下一种核心序列基序：a)vaaagtm，b)aaacca，c)scaaam，d)acrcg，e)sktgkact，f)mrtsack，g)ccaccaa，h)tcgtctcttc，i)wwkgwc或者一种与a)至i)互补的核心序列基序。
Description
本申请为申请日为2012年12月21日、申请号为201280070286.X、发明名称为“开发病原体-响应嵌合启动子的新型植物来源顺式-调节元件”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种顺式-调节元件和由该顺式-调节元件生成的具有病原体或者诱导子诱导植物活性的嵌合启动子。此外，上述发明涉及一种宿主细胞、一种转基因植物细胞、一种转基因植物组织以及一种转基因植物和其种子。此外，上述发明还涉及一种用于生成转基因植物，尤其是抗病原体植物的方法。
背景技术
由于真菌、病毒、线虫和细菌导致的植物疾病导致全球大量的作物减产，影响了农产品质量，因此需要大量使用化学杀虫剂，因为植物的自然防御措施(借助该自然防御措施可以防御大量的潜在病原体或者延迟和限制其扩散)通常不足以抵抗病虫害。可以使用基因技术方案创造可抵抗上述病原体的植物。通过在感染点(病原体和植物之间的接触点)有针对性地形成可触发植物较强耐抗反应的蛋白(作用剂)表达或者可自行毒杀病原体或者可抑制病毒生长的分子表达使得植物具有较高的奶抗性。
可触发植物较强耐抗反应的作用剂包括诸如自动活性耐抗基因(R-基因)或者可激活植物内源耐抗基因的非病原性基因蛋白。较强的耐抗反应包括超敏反应(HR)、宿主组织在感染位置的控制性细胞死亡、通过木化作用和形成角质增强植物的细胞壁，形成植物抗毒素和产生PR(病原体相关的)蛋白。
因为该耐抗反应具有较高的能量需求，且可能导致植物细胞死亡(坏死)，因此其触发过程必须进行严格的控制。相同的情况也适用于病原体毒性蛋白或者肽的表达，只要该蛋白或者肽的基本表达对植物或者其农业特性(例如产量)具有不利作用。在一种转基因方案中，可以通过使用具有期望特性的启动子进行控制。
通过使用各种已知的自然病原体诱导启动子，例如PR1-启动子，可以实现转基因(如作用剂)的病原体诱导表达(Rushton等，1996)。尤其是，微阵列技术的发展使得已经可以对大量的病原体诱导启动子进行识别(WO 03/00898，WO 02/50293或者JP 2003284566)。
这一类的自然病原体诱导启动子可能会显示出非特定活性，因为其需要通过大量不同的刺激才可以激活。其原因在于，启动子的分子结构由多种不同的顺式-调节元件组成，存在巨大差异的信号整合于一个复杂的表达方案中。由此，自然病原体诱导启动子也表现出不需要的活性(例如在特定的组织中)或者表现为较高的背景活性。
例如小麦中的抵抗素病原体诱导启动子在种子形成和种子萌芽过程中活动(Kovalchuk等，2010)。上述PR1-启动子不仅通过病原体，而且也通过衰老进行诱导(Morris等，2000)
在其他试验中显示，自然的、因锈病诱发的亚麻Fis1启动子在转化后不适合对亚麻中L6抗锈基因自动活性形式的表达进行针对性调节，并使得除了抗锈性能外不会出现负面的农业特性，例如产量低下(Howles等，2005)。
一种提高启动子最需要特性的可能性是识别负责顺式-调节元件所需的诱导以及由顺式-调节元件组成的嵌合启动子的结构(Venter，2007)。其他刺激的序列基序被去除。
对多种病原体诱导基因的启动子进行了更详细的试验，其中，对促成病原体专有诱导的多种顺式-调节元件进行了识别(Strittmatter等，1996；Eulgem等，2000；Kirsch等，2000，2001；Himmelbach等，2010)。其他示例为通过分步突变自然病原体-诱导启动子识别的顺式-调节元件D-Box，S-Box或者W-Box(WO 00/29592)或者接头分区区域LS10或者LS7(Lebel等，1998)。尤其是W-Box试验情况良好，可以利用其核心序列TTGAC(C/T)对W-Box在自然病原体诱导启动子中的附加变体进行查找。
此外，可以借助程序，例如MEME(Bailey和Elkan，1994；Humphry等，2010)或者BEST(Che等，2005)利用生物信息方法对新型顺式-调节元件进行识别。该方法的优点在于，顺式-调节元件不再识别为较短的单独序列，而是识别为经确定以的序列基序，通过该序列基序可以对多个顺式-调节元件变体，即多个转录因子连接位置的变体进行确定。当然，这一类的生物信息方案也经常用于测定假阳性序列，从而使得仅对潜在序列或者序列基序进行预先选择。但通常必须强制证明和检验顺式-调节元件的功能，并专门对促进病原体诱导的顺式-调节元件的功能进行检验和证明。此外，这一类的实验室分析通常花费不菲。
另外可以通过组合使用不同顺式-调节元件提高启动子特性(Rushton等，2002)。对此，组合使用不会导致活性升高(协助作用)，而是这一类的协助作用仅在特有的、单独的、不可预言的组合中出现，因此在任何情况下均需要根据经验进行测定。例如已经公开的是组合使用顺式-调节元件D-Box和S-Box的嵌合启动子(WO 00/29592)。元件重复的次数调节启动子数量和背景活性。
在开发病原体诱导嵌合启动子的过程中的另一问题是不同植物物种的功能性。一般而言，尽管在几乎所有迄今为止试验的植物类型中通过已知的病原体诱导嵌合启动子均可以确定病原体的可诱导性，但在非病原体侵害条件下会显示其他的背景活性。该背景噪音会根据使用嵌合启动子的植物类型发生波动。同时与诱导率(被感染组织中的启动子活性和未被感染组织中的启动子活性比)和启动子的绝对活性(启动子数量)相关。例如，通过未被感染组织中较强的背景活性仅可以确定受感染组织中较低的病原体-可诱导性。
根据当前的知识水平，对于所述的背景活性、诱导率、启动子数量、诱导动力学和启动子活动的空间延伸方面的波动主要归因于所使用的启动子的顺式-调节元件(Rushton等，2002，Venter，2002)。即使已知的嵌合启动子比自然启动子占优势，仍然存在对嵌合启动子进一步优化的需求，尤其是对顺式-调节元件和/或顺式-调节元件的组合。此外还缺少良好特征化的顺式-调节元件和这一类顺式-调节元件的适当组合，借助该元件或者元件组合可以构成在不同植物物种中确保高度专用和可控、符合需求的病原体诱导转基因表达的嵌合启动子，此外，该表达仅由于病原体侵害以及几乎仅在感染位置进行表达(Gurr&Rushton，2005)。因此，上述发明的任务在于提供这一类新型的促进病原体可诱导性的顺式-调节元件和元件组合。
发明内容
在下文中对于本申请中使用的部分概念进行更详细的说明：
上述发明意义上的“诱导子”是指诱导物或者信使物质，该物质可以诱导对植物病原体的防御措施，例如植物抗毒素的合成。诱导子既可以是内源性的，也可以是外源性的。诱导子(外源)主要来自病原体，并被植物所识别。诱导子也包含PAMP(病原相关分子模式)，例如Flagelin，PEP25和Chitin。使用诱导子模仿病原体感染或者和病原体接触，其方法是通过以人工的方式在存在病原体的情况下进行应用。结合上述发明，诱导子尤其可用于检验催化剂的可诱导性。
“单独序列”是指核苷酸或者碱基(对)的顺序，其中在单独序列中的每个位置仅通过一个单独固定规定的碱基(a，c，g或者t)加以确定。单独序列分离自自然启动子，可说明生物信息分析的结果。单独序列由核心序列和侧面的序列段组成。“单独序列”的概念也指其核苷酸或者碱基(对)顺序符合单独序列的核酸分子。
“核心序列”是指顺式-调节元件特定段落中核苷酸或者碱基(对)的顺序，其中，该段落对于顺式-调节元件的功能而言发挥主要作用。核心序列是单独序列的组成部分。“核心序列”概念也指其核苷酸或者碱基(对)顺序符合核心序列的核酸分子。
“启动子”是指不可翻译DNA-序列，比较典型的为向上的编码区域，该区域包含用于RNA-聚合酶的连接处，且发起DNA的转录。此外，启动子还经常包含其他用作基因表达调节器的元件(例如顺式-调节元件)。
“最小启动子”是指仅具有用于发起转录的基本元件的启动子(例如TATA-Box和/或发起剂)。
“嵌合启动子”是指一种在自然中不存在的由多种元件组成的启动子。该启动子包含最小启动子，且在最小启动子上游具有至少一个顺式-调节元件，该调节元件用作专门的反式作用因子(trans-acting factors，例如转录因子)。嵌合启动子可以根据期望的要求进行设计，并通过不同的因子进行诱导或者复制。顺式-调节元件或者顺式-调节元件的选择对于启动子的特性或者活性水平具有决定性意义。嵌合启动子中的顺式-调节元件即可以与所使用的最小启动子异源，即顺式-调节元件来自于其他有机物或者与所使用的最小启动子不同的物种(例如在图15A-C中所示)，嵌合启动子中的顺式-调节元件也可以与所使用的最小启动子同源，即顺式-调节元件和最小启动子组合出现在自然启动子中，但顺式-调节元件自身或者作为嵌合启动子中的附加元件位于和自然启动子相比不同的基因环境中。嵌合启动子也可以指通过对至少一种顺式-调节元件进行多聚二发生变化的(自然)启动子(例如在图15D中所示)。
“互补”核苷酸序列基于一个双链DNA，与第一个DNA链互补的第二个DNA链符合碱基对规则，且在考虑方向的情况下具有与第一链碱基等同于的核苷酸碱基(例如：5'-gcat-3'和5'-atgc-3'互补)。
“病原体”是指在和植物相互作用的过程中导致在植物一个或者多个部位出现疾病症状的有机物。病原体包含诸如动物类、真菌类、细菌类或者病毒性有机物或者卵菌亚纲真菌。
“病原体感染”是指病原体物质代谢准备渗透至植物宿主组织的最早时间点。对于真菌或者卵菌亚纲真菌包括连接处的生长或者形成专门的感染结构，例如渗透连接处和附着胞。
“病原体/诱导子-可诱导性”或者“病原体/诱导子”可诱导“在本发明中是指启动子的特有性能，在病原体感染或者使用诱导子后可导致至少增强两倍的有效连接基因的转录。此外，“病原体/诱导子-可诱导性”或者“病原体/诱导子”可诱导“在本发明中也可以指在病原体感染或者使用诱导子后至少增强两倍转录的基因性能。
根据本发明，上述任务通过新型的促进病原体和/或诱导子可诱导性的顺式-调节元件加以解决。该调节元件尤其在核心序列中和已知元件存在显著差异，因此，并非已知元件的变体。此外，根据本发明的顺式-调节元件用作新转录因子的识别和/或连接处，这使得，促进的病原体和/或诱导子可诱导性具有了全新的特性。根据本发明的顺式-调节元件通过启动子中的生物信息方案被病原体或者PAMP(诱导子)诱导的拟南芥基因所识别。分离出的顺式-调节元件单独序列由于不同的分析步骤分为八个基序组(基序组1，5，11，12，18，21，27和32)。此外，也可以将多个分离出的单独序列分配给一个基序组21n。在一个包含单独序列的基序组中，与已经识别的基序相比，显示较高程度的可保留性。基序组的单独序列均与一个特征核心序列基序中的单独序列相一致。因此所述的任务通过一种包含核酸分子的分离顺式-调节元件加以解决，其核苷酸序列对应于以下一种核心序列基序：
a)vaaagtm，
b)aaacca，
c)scaaam，
d)acrcg，
e)sktgkact，
f)mrtsack，
g)ccaccaa，
h)tcgtctcttc或者
i)wwkgwc。
在特征化核心序列基序a)至i)中较难保留的碱基位置按照如下方式进行说明：'r'代表鸟嘌呤(g)或者腺嘌呤(a)，即一种嘌呤碱基，'k'代表鸟嘌呤(g)或者胸腺嘧啶(t)/尿嘧啶(u)，'s'代表鸟嘌呤(g)或者胞嘧啶(c)，'m'代表腺嘌呤(a)或者胞嘧啶(c)，'w'代表腺嘌呤(a)或者胸腺嘧啶(t)/尿嘧啶(u)。一种特定的核心序列基序说明至少一种属于核心序列基序的基序组单独序列的核心序列的子序列，其中子序列至少为单独序列的总核心序列的30％。对于包含核心序列基序g)和h)的基序组而言，整个核心序列的核心序列基序和单独序列相同。本发明同时包含一种分离出的顺式-调节元件，该调节元件包含一种核酸分子，其核苷酸序列为a)至i)互补核心序列基序中的一种。特定基序组的特征化的核心序列也可以多次出现在一个单独序列的核心序列中，核心序列基序也可以叠加出现在核心序列中和/或者分别显示不同的方向。例如，基序组1中顺式09的核心序列一方面具有一个与核心序列基序acrcg等同于的子序列，另一方面具有一个叠加两个碱基的和acrcg互补的核心序列基序(即cgygt)等同于的子序列。另一个示例位于基序组11中核心序列21G-2_M1_S2中，核心序列具有两个子序列，每个子序列叠加一个碱基，且分别与aaacca的互补核心序列基序，即等同于tggttt。
对于基序组1，5，11，12，21，21n和27而言，根据功能性实验数据对其中包含特征化核心序列基序的家族基序进行定义。家族基序说明了一种转录因子或者一个转录因子家族的跟踪识别特征。家族基序的优点在于其包含识别/连接区域的可能变体。一个基序组的家族基序优先包含在该基序组中包含的单独序列的所有核心序列。由此，针对单独序列的一部分考虑顺式-调节元件的互补链；为方便理解，这一类已经识别的根据本发明的顺式-调节序列的互补序列在随后使用'(inv)'进行标识。通过该方式定义的家族基序具有至少15个核苷酸，优先为至少13个核苷酸，特别优先为至少11个核苷酸的长度。除了相应的核心序列基序，家族基序具有相应的侧面区域，该侧面区域在根据本发明的顺式-调节元件用于嵌合启动子中时对其性能(例如背景活性和表达强度)具有重要的定量影响。随着侧面区域特定碱基与单独序列中核心序列之间距离的上升，其定量影响会降低。为了对家族基序进行定义，也可以额外考虑其他超出单独序列核心序列的侧面区域中的高保留单独碱基，该单独碱基对家族基序进行扩展。基序组1，5，11，12，21，21n和27的家族基序在表格1的第2栏中作了说明。本发明中也包含一种具有核酸分子的分离的顺式-调节元件，其核苷酸序列：
a)对应于根据SEQ ID NO：1的家族基序，其包含核心序列基序vaaagtm，
b)对应于根据SEQ ID NO：2的家族基序，其包含核心序列基序aaacca，
c)对应于根据SEQ ID NO：3的家族基序，其包含核心序列基序scaaam，
d)对应于根据SEQ ID NO：4的家族基序，其包含核心序列基序acrcg，
e)对应于根据SEQ ID NO：5的家族基序，其包含核心序列基序sktgkact，
f)对应于根据SEQ ID NO：6的家族基序，其包含核心序列基序mrtsack，
g)对应于根据SEQ ID NO：41的家族基序，其包含核心序列基序wwkgwc，
或者对应于与a)至g)中的一种互补的家族基序。
此外家族基序也可以更短。在其最短的形式中，家族基序被定义为最小家族基序，该家族基序根据单独序列的方向等同于共同的核心序列基序仅包含反应碱基位置，该碱基位置在一个基序组的所有单独序列的核心序列中进行复制。在部分情况下，最小家族基序等同于核心序列基序。在表格1第2栏中，家族基序被覆盖，下划线部分为基序组1，5，11，12，21，21n和27的最小家族基序。
表格1：基序组1，5，11，12，21，21n，27和32说明，该说明包含基于基序组的核心序列基序(1)，家族基序(2)和归入基序组的单独序列(3)；最小家族基序使用下划线，核心序列基序在家族基序中加粗显示。
('n'代表任意碱基；'h'代表a，c或者t/u；'d'代表a，g或者t/u；'v'代表a，g或者c；'r'代表g或者a，'k'代表g或者t/u，'s'代表g或者c，'m'代表a或者c；'y'代表t/u或者c；'w'代表a或者t/u)
本发明也涉及所有已经识别和分离出得根据本发明的顺式-调节元件的单独序列和其核心序列(表格1和2)。所述的任务也通过分离处的顺式-调节元件得以解决，该调节元件包含以下核酸分子：
a)核酸分子，含根据以下编号的核苷酸序列：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ IDNO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43或者SEQ ID NO：44，
b)核酸分子，含根据以下编号核心序列的核苷酸序列：SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ IDNO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ IDNO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43或者SEQ ID NO：44，或者
c)核酸分子，含一个与a)或者b)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
包含一具有根据以下编号的核苷酸序列的核酸分子的顺式-调节元件：SEQ IDNO:24，SEQ ID NO:25或者SEQ ID NO:26归入基序组1，包含根据以下编号的核苷酸序列：SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:31或者SEQ ID NO:32归入基序组5，包含根据以下编号的核苷酸序列：SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18或者SEQ ID NO:19归入基序组11，包含根据以下编号的核苷酸序列：SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22或者SEQ ID NO:23归入基序组12，包含根据以下编号的核苷酸序列：SEQ ID NO:33归入基序组18，包含根据以下编号的核苷酸序列：SEQ ID NO:27或者SEQ ID NO:28归入基序组21，包含根据以下编号的核苷酸序列：SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:42或者SEQ ID NO:43归入基序组21n，包含根据以下编号的核苷酸序列：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ IDNO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:44或者SEQID NO:15归入基序组27以及包含根据以下编号的核苷酸序列：SEQ ID NO:34归入基序组32。
根据本发明的顺式-调节元件可以具有少于50个核苷酸，优先为少于40个核苷酸，特别优先为少于30个核苷酸的长度。根据本发明的顺式-调节元件的核心序列可以具有少于20个核苷酸，优先为少于15个核苷酸，特别优先为少于10个核苷酸的长度，但核心序列不短于6个核苷酸。
根据本发明的顺式-调节元件的单独序列除了已经识别的新核心序列也可以额外具有一个已知促进病原体-/诱导子-可诱导性的顺式-调节元件的核心序列，该核心序列可能对新识别的核心序列和/或新是别的单独序列的特性也造成影响。示例为顺式-调节元件顺式05(SEQ ID NO:14)，该调节元件除了已经识别的核苷酸位置14和20之间的核心序列，也具有一个介于核苷酸位置29和35之间的W-Box核心序列。对此需进行全面的突变分析(见图5A，5B和11)。
根据顺式-调节元件可以用于嵌合启动子中，对此，顺式-调节元件促进嵌合启动子专门的病原体和/或诱导子可诱导性。上述发明因此也包含一种适合通过病原体感染或者使用病原体诱导子进行处理在植物细胞中表达有效连接需求核酸分子(例如异源DNA-序列)，且至少包含一个最小启动子和至少一个根据本发明的顺式-调节元件的嵌合启动子。在这一类嵌合启动子中单独的根据本发明的顺式-调节元件已经可以促进明显的病原体-和/或诱导子可诱导性。因此一个顺式-调节元件已经足够结合最小启动子形成病原体-/诱导子-响应的嵌合启动子。
优先使得这一类的包含顺式-调节元件的嵌合启动子仅包含一个或者多个根据本发明的顺式-调节元件，仅对病原体和/或诱导子响应，也就是说该启动子不会或者仅少量通过其他刺激(例如非生物压力)进行诱导。这一类包含一个或者多个根据本发明的顺式-调节元件的启动子诱导在和病原体/诱导子接触后至少2倍于，优先为至少10倍于或者特别优先为至少25倍于无病原体/诱导子-接触诱导(背景活性)的情况。
在一种特别优先的结构中，诱导后的表达仅限诱导点局部，也就是说在与自然PR-基因可控表达类似或者较小规模下进行。特别优先的方法是，通过上述发明的嵌合启动子控制的转录激活仅在和病原体或者病原体诱导子接触的细胞中进行。但根据细胞与细胞的相互作用，转录激活也可以在感染点周围的细胞内进行。
上述发明的嵌合启动子不局限于这一类仅对病原体响应的启动子。通过和其他调节元件进行组合，诱导表达可以进一步专用化，例如通过组合一种顺式-调节元件，如组织特性、存储可诱导性、耐寒或者耐热可诱导性或者在特定发展阶段的一种专用活性。本发明的嵌合启动子也可以包含至少一至少由两个顺式-调节元件组成的组合，至少一个组合包含至少一个根据本发明的顺式-调节元件。组合中的其他顺式-调节元件也可以是已知的促进病原体-/诱导子-可诱导性的顺式-调节元件，例如用于形成嵌合启动子的W-Box，S-Box或者D-Box(见WO 00/29592)。
此外，本发明也包含一种嵌合启动子，该启动子包含一种或者多种根据本发明的顺式-调节元件的单体和/或者多聚体。多聚体的形式优先为二聚物和四聚物。单体本身或者多聚体中的单个单体可以具有不同的方向，也就是说可以对其互补安排。一个多聚体中的根据本发明的顺式-调节元件可以在功能上相互联系，也就是说，在多聚体形式中显示出一种协同的或者对抗的作用，例如对转录因子连接容量的作用，该转录因子此外可以识别特定基序组的特征化核心序列基序。同时，本发明还包含一种嵌合启动子，该启动子适合通过一种病原体感染或者使用病原体诱导子进行处理在植物细胞中表达有效连接需求核酸分子，且包含一个最小启动子和至少两个根据本发明的顺式-调节元件，其中至少两个顺式-调节元件在功能上相互连接为同聚体和/或者异聚体的形式。
包含至少一个根据本发明的顺式-调节元件的嵌合启动子的诱导在和病原体/诱导子-接触后至少2倍于，优先为至少10倍于或者特别优先为至少25倍于无病原体-/诱导子-接触诱导的情况(背景活性)。
在一种优先使用的上述发明的嵌合启动子实施示例中，最小启动子和第一个处于向上状态的根据本发明的顺式-调节元件之间的距离介于0至300个碱基对之间，优先介于0至70个碱基对之间，特别优先为少于10个碱基对。额外使得或者也可以使得，根据本发明的顺式-调节元件在一个多聚体形式中的两个相同单聚体之间的距离优先为0至10个碱基对。本发明的一个嵌合启动子中中的两个单独多聚体可以通过0至50个碱基对进行分离。
根据本发明的顺式-调节元件和其他根据本发明的顺式-调节团速或者和其他已知的调节元件或者片段(例如S-Box，D-Box或者Gst1)的特殊组合在试验分析中显示出在启动子性能方面有利的惊人效果，例如具有较少的背景活性或者特别专有的或者特别强的可诱导性(最高183倍2xCis13-2xCis05)。
此外，部分组合还显示了在特定的启动子性能方面的协同作用，例如诱导因子(比较诸如香菜中的2xCis13-2xCis05，图12和图13)，而部分组合则具有诱导因子方面的对抗作用，但仅形成特别低的背景活性(例如甜菜中的4xCis05-2xD)。此外，本发明还包含根据本发明的顺式-调节元件和其自身以及和已知的对启动子可诱导性具有有利的协同或者对抗作用的顺式-调节元件的所有组合和组合可能性。有利的组合可以从以下分组中进行选择：
4x sCis05，4x 20u_M1_S1，4x 27G-8_M1_S1，4x 38M_M1_S1，4x18H_M2_S3，4x18H_M2_S1，4x GG13_M1_S2，4x 21S_M3_S1，4x30I-8_M1_S2，2x Cis02-2x Cis02，2xCis02-2x Cis05，2x Cis02–2x Cis12，2x Cis02–2x Cis13，2x Cis02–2x D，2x Cis02–2xS，2x Cis02–Gst1，2x Cis02–2x 30I-8_M1_S2，2x Cis05-2x Cis02，2x Cis05-2x Cis05，2x Cis05–2x Cis12，2x Cis05–2x Cis13，2x Cis05–2x D，2x Cis05–2x S，2x Cis05–Gst1，2x Cis05–2x 30I-8_M1_S2，2x Cis12-2x Cis02，2x Cis12-2x Cis05，2x Cis12–2xCis12，2x Cis12–2x Cis13，2x Cis12–2x D，2x Cis12–2x S，2x Cis12–Gst1，2x Cis12–2x30I-8_M1_S2，2x Cis13-2x Cis02，2x Cis13-2x Cis05，2x Cis13–2x Cis12，2x Cis13–2xCis13，2x Cis13–2x D，2x Cis13–2x S，2x Cis13–Gst1，2x Cis13–2x30I-8_M1_S2，2x D-2x Cis02，2x D-2x Cis05，2x D–2x Cis12，2x D–2x Cis13，2x D–2x 30I-8_M1_S2，2x S-2x Cis02，2x S-2x Cis05，2x S–2x Cis12，2x S–2x Cis13，2x S–2x 30I-8_M1_S2，Gst1-2x Cis02，Gst1-2x Cis05，Gst1–2x Cis12，Gst1–2x Cis13，Gst1–2x 30I-8_M1_S2，2x30I-8_M1_S2-2x Cis02，2x 30I-8_M1_S2-2x Cis05，2x 30I-8_M1_S2–2x Cis12，2x 30I-8_M1_S2–2x Cis13，2x 30I-8_M1_S2–2x D，2x30I-8_M1_S2–2x S，2x 30I-8_M1_S2–Gst1和2x 30I-8_M1_S2–2x30I-8_M1_S2。
特别有利的具有惊人的诱导因子和活性效果的组合在表格3中作了说明。
此外，上述发明也针对至少包含一种上述顺式-调节元件的嵌合启动子。
在一种优先使用的上述发明嵌合启动子的实施形式中，最小启动子来自诸如CaMV35S-启动子，对于单子叶植物来自小麦-TaPal-启动子(SEQ ID NO：39)，玉米-ZmUbiquitin-启动子(SEQ ID NO：40)或者水稻-OsGns1-启动子(SEQ ID NO：38)，或者对于双子叶植物来自已知的最小启动子(WO 07/147395)。此外，也可以使用用于形成上述发明意义上的嵌合启动子的其他来源的最小启动子。
上述发明的嵌合启动子在任何情况下均满足在基因技术方案(例如为形成抗病原体-/疾病的植物)中对严格转基因表达调节的重要要求。转基因是一种通过嵌合启动子有效连接需求的核酸分子，例如异源DNA-序列，该序列用于一种抗性基因(R-基因)、自动活性抗性基因、无毒性基因、其他作用剂、对至少一种病原体存在毒性的蛋白、信号转换成分、一种在合成植物抗毒素过程中对双链RNA进行编码形成针对病原体的siRNAs或者一种抗微生物缩氨酸进行编码的蛋白。此外，大量对香菜(Petroselinum erispum)，拟南芥，小麦(Triticum sp.)和甜菜(Beta vulgaris)的试验表明，上述发明的嵌合启动子可以跨物种使用并发挥作用(参加示例：香菜、甜菜和小麦种的4xCis05)。
对于每个基序组1，5，11，12，21，21n和27的家族基序的定义使得专业人员在设计上述发明的嵌合启动子时拥有了新的可能性。对基序组27和12(图8)的不同成员的活性观察显示，侧面的序列区域可以用于对期望的表达水平进行精细调节。这也适用于针对物种的表达水平调节。家族基序反映了单个碱基在侧面区域的变化可能性，并向专业人员表面可以对侧面区域加以改进。此外，专业人员可以从家族基序中获得单个碱基位置在家族基序中保留程度的信息。其出发点在于，改进强保留碱基与改进弱保留碱基相比可以对形成的嵌合启动子的性能形成更明显的效果。
此外，本发明也涉及一种包含上述发明嵌合启动子的重组基因。在构成该重组基因时优先使得，嵌合启动子和核酸序列(例如异源DNA-序列)形成有效连接。这一类的异源DNA-序列尤其针对(多)缩氨酸、细胞毒素蛋白(例如Bt-毒素、无毒性蛋白或者酵素，例如可生成反应性氧气种类的葡萄糖氧化酶)、抗体、反向-RNA、方向-RNA、转录因子、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、酵素抑制剂或者可测量标记(例如：荧光素梅、GFP或者β-牛乳糖)进行编码。最后所述的标记以及其他在当前技术水平下已知的标记可以用于测试系统中，以便对上述发明的嵌合启动子的病原体特性加以确定或者对嵌合启动子诱导起作用或者起抑制作用的作用剂进行识别。
本发明的嵌合启动子也可以在基于RNAi的方法中用于“基因噪音抑制”，其中，有效连接的核需求酸分子对一种反向-RNA、方向-RNA或者双链RNA(dsRNA)进行编码。RNA–分子可以是较短的核苷酸序列(通常至少10个核苷酸，优先至少为14个核苷酸，也可以选择最高100或者更多核苷酸的长度)，该序列本质上和需求基因的专用mRNA-序列和/或者DNA-序列互补。RNAi-技术的标准方法在当前的技术水平中已经做了说明。
原则上也可以对有效连接的编码序列进行改进，并使得翻译产品位于期望的细胞区域，例如细胞核、内质网、线粒体、细胞质或者液泡中以及细胞外(非原质体)。适合的改进方法对于专业人员而言已经在技术水平中作了公开(Gorlich,Science 271(1996),1513-1518；Hicks,Plant Physiol.107(1995),1055-1058；Rachubinski,Cell 83(1995),525-528；Schatz,Science 271(1996),1519-1526；Schnell,Cell 83(1995),521-524；Verner,Science 241(1988),1307-1313；Vitale,BioEssays 14(1992),151-160)。
上述发明的重组基因即可以单独作为载体，也可以作为载体的一部分进行使用。此外，上述发明也涉及一种包含本发明的嵌合启动子或者本发明重组基因的载体。该载体优先为植物表达载体，该载体优先同时包含一植物选择标记。适合的标记已经在上文中作了说明。形成这一类载体的方法在当前的技术水平下对于专业人员而言已经做了公开，如在Sambrook,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory(1989)N.Y.and Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,GreenPublishing Associates and Wiley Interscience,N.V.(1989)中所述。
此外，上述发明还涉及一种原核或者真核宿主细胞，该细胞包含一种根据本发明的嵌合启动子、重组基因或者载体，其中，嵌合启动子本身或者作为重组基因的组成部分或者作为载体的组成部分或者嵌合启动子的组成部分(例如顺式-调节元件)与原核或者真核宿主细胞异源，例如来自一个具有其他基因背景的细胞或者组织；或者与原核或者真核宿主细胞同源，单位与不同的基因环境中，即与自然方式存在的嵌合启动子或者其组成部分存在差异。
根据本发明的嵌合启动子、重组基因或者载体即可以导入原核或者真核宿主细胞的染色体组中，优先为固定导入，也可以以染色体外的形式(例如质体)保留在细胞中。
此外，本发明还提供了一种用于生产转基因植物的方法，包含将根据上述发明的一种嵌合启动子、重组基因或者载体导入至少一种植物细胞中或者包含将根据上述发明的一种嵌合启动子、重组基因或者载体植物导入至少一种植物细胞的细胞培养液中，在该细胞培养液中随后生成转殖植物或者转基因植物。优先将嵌合启动子、重组基因或者载体导入植物的染色体组中，特别优先的方式为固定导入。对于需求核酸分子在上述发明的嵌合启动子的控制下在植物细胞中的表达而言，核酸分子可以和其他调节序列相连，例如在3’-末端和多-A-长列相连。基因或者基因材料导入植物或者植物细胞的方法以及再生转殖植物细胞的方法在当前技术水平下已经作了公开，例如使用T-DNA、原生质体融合、注射、电穿孔、真空渗入或者基因枪等方法促进农杆菌或者毛根农杆菌的转殖。同时，制备适当的将基因或者基因材料植物植物或者植物细胞中的载体的方法专业人员已经非常熟悉(Sambrook,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.and Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,Green PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.V.(1989))。
在一种可选的实施形式中，植物细胞在改进时应使得，植物细胞在根据上述发明的嵌合启动子控制或者在一种通过根据本发明的顺式-调节元件改进的原始内源基因的控制下对一种内源基因进行表达。这一类通常无法对特定基因或者特定基因序列表达进行调节的嵌合启动子在植物基因中期望位置的导入或者根据本发明的顺式-调节元件在原始启动子中的导入可疑通过已知的标准方法进行，例如通过有针对性地借助锌-手指-核酸酶(Urnov等,Nature Reviews 2010_Genome editing with engineered zinc fingernucleases；Townsend等,Nature 2009_High-frequency modification of plant genesusing engineered zinc-finger nucleases)或者TAL-作用剂-核酸酶(WO 2010/079430；WO 2011/072246)进行。内源基因原始启动子的改进也包括在原始启动子中附加导入根据本发明的顺式-调节元件，该启动子已经具有根据本发明的顺式-调节元件，即对已经存在的顺式-调节元件进行多聚化。这一类改进的启动子和原始版本相比在特性、表达等级或者背景活性方面具有不同的性能。
由改进后的植物细胞可以借助已知的方法再生出改进的植物。
因此，本发明还涉及一种所述的转基因(转殖)植物，该植物通过根据本发明的嵌合启动子、重组基因或者载体进行转殖，此外还涉及一种通过导入至少一个根据本发明的顺式-调节元件或者根据本发明的嵌合启动子进行改进的植物。转基因或者改进型植物可以来自任何期望的植物种类。这一类植物可以是单子叶植物、双子叶植物或者被子植物等，优先包括农业经济作物或者园艺植物，例如玉米、水稻、小麦、黑麦、大麦、燕麦、高粱、土豆、油菜、向日葵、大豆、棉花或者甜菜。
在本发明一种优先的实施形式中，转基因或者改进型植物相较于相同物种的非转基因或者非改进型植物(野生类型)对一种或者多种病原体具有抗性或者具有更高的抗性。
上述发明此外还包含一种上述发明的转基因和改进型植物的植物组成部分、植物组织、植物细胞或者种子，其中，该植物组成部分、植物组织、植物细胞或者虫子同样包含该植物中的转基因或者实施的改进。
附图说明
上述发明的实施形式通过实验参考相关的图纸和序列进行说明：
图1：作为克隆嵌合启动子单独序列示例显示的是质体和2xCis05元件以及多聚4xCis05元件。质体来源于pBT10-GUS(Sprenger and Weisshaar(2000):The PlantJournal 22,1-8)。其他质体的结构根据Amp:抗氨比西林；WRKY30-Cis05:双单独序列Cis05.35S-最小：35S-最小启动子；Luc-m3:荧光素酶-报告基因；pAnos:Nos-终止剂。
图2：跨物种病原体诱导单独序列(A-X)。在上面的栏目中说明的是单独序列的名称、基序组和单独序列本身。导致选择单独序列基序的核心序列为粗体显示，且有下划线。下方说明的是基本的生物信息识别基序的基序标识以及其基体。如果对一个基序的多个单独序列进行测试，则对其进行综述。
图3：一个基序组所有阳性测试单独序列综述和由此推导出的序列基序和家族基序(图3A-G)。在最上面的栏目中说明了各自的基序组。其下方显示了所有阳性测试单独序列的队列，该单独序列至少包含核心序列以及(如果存在的)其他保留碱基。推导出核心序列基序的碱基具有边框。
图4：已识别基序组的系统树。该系统树通过聚类分析借助网页服务器STAMP进行制定。在基序组的编号后的括号中为基序组中包含的基序数值。
图5：A)Cis05-单独序列的突变形成。所使用的序列除了Cis05-基序(加粗，下划线)还包含一个W-Box(加粗和边框)。在两个基序中导入突变。通过四聚突变衍生物同上文所述通过PAMP PEP25进行香菜诱导试验。PAMP诱导的嵌合启动子活性在4，8和24小时后进行测量(右侧)。Cis05-基序(Cis05mut1)以及W-Box(Cis05mut2)中的突变会导致诱导活性明显降低。只有当两个基序突变(Cis05mut1+2)才会导致可诱导性的完全丧失。B)sCis05是Cis05的较短变体，该变体仅包含Cis05-基序，但不在包含W-Box。对sCis05和突变衍生物的PEP25-可诱导性(如图5A所述)进行测试。两个柱状条代表两次生物复制(与转录无关)。为确定方向，在W-Box的sCis-05衍生物下方说明顺序。
图6A：嵌合启动子4x30I-8_M1_S2和4x18H_M2_S1诱导子响应的报告基因表达和单独序列中的突变。突变的碱基下方划线。诱导过程通过PEP25在香菜原生质体中进行。单独序列突变衍生物的核苷酸-序列在图标下方进行说明。+，含诱导子PEP25；-，无诱导子。2S2D：阳性检验；MS23GUS：阴性检验(空载体)。
图6B：嵌合启动子4x20u_M1_S1和4x27G-8_M1_S1诱导子响应的报告基因表达和单独序列中的突变。突变的碱基下方划线。诱导过程通过PEP25在香菜原生质体中进行。单独序列突变衍生物的核苷酸-序列在图标下方进行说明。
图7：在甜菜中进行嵌合启动子控制时荧光素酶-报告基因的转录双载体。示例为包含嵌合启动子4xCis05的载体。nptII：抗卡那霉素；WRKY30-Cis05：双单独序列Cis05。35S-最小：35S-最小启动子；luc-m3：荧光素酶-报告基因：Anos:Nos-终止剂。
图8A：稳定转殖甜菜中甜菜褐斑病菌诱导的4xCis05和其衍生物的病原体活性。对于4xCis05和其衍生物而言，在甜菜褐斑病菌感染后分别在多个独立的转化株中对荧光素酶活性进行测定(每个转化株和时间点4个复制试样)。从获得的测量值计算中位数。在上部图表中说明了基序组12中的单独序列的结果，在下部图表中说明了基序组27中的要素结果。Ko：控制(模拟感染)；inf：通过甜菜褐斑病菌进行感染；1d-4d：接种后的天数(d.p.i.)。检验：非转基因植物。
图8B：稳定转殖甜菜中甜菜褐斑病菌诱导的4xCis05和其衍生物的病原体活性。对于4xCis05和其衍生物而言，在甜菜褐斑病菌感染后分别在多个独立的转化株中对荧光素酶活性进行测定(每个转化株和时间点4个复制试样)。从获得的测量值计算中位数。不同衍生物的序列在图5A和5B中作了说明。在图标下方额外针对每种不同的衍生物说明了是否包含Cis-05基序或者W-Box。Ko：控制(模拟感染)；inf：通过甜菜褐斑病菌进行感染；1d-4d：接种后的天数(d.p.i.)。非转基因：非转基因检验。
图9：稳定转殖甜菜中甜菜褐斑病菌诱导的嵌合启动子4xGG6_M1_S1启动子活性。针对10种独立的具有4xGG6_M1_S1_luc结构的转化株，在甜菜褐斑病菌感染后由试管植物测定荧光素酶活性(每个转化株和时间点4个复制试样)。Ko：控制(模拟感染)；inf：通过甜菜褐斑病菌进行感染；2d，3d，4d和7d：接种后的天数(d.p.i.)。3DC 4156：非转基因检验植物。
图10：小麦短时间测试所使用质体的质体卡。示例为具有嵌合4xCis05-启动子的质体。Ruc：Renilla-荧光素酶报告基因。AMP：氨比西林抗性。WRKY30-Cis05：双单独序列Cis05。
图11：嵌合启动子4xCis05和在Cis05-基序(Cis05mut1)、在W-Box(Cis05mut2)中或者在两个基序(Cis05mut1+2)中通过镰胞菌突变形成的突变衍生物的诱导测试。相应的构造在小麦中进行短暂的转录，在使用镰胞菌孵化20小时后测量荧光素酶活性。4xCis05-dam/dcm试验中，质体DNA为非甲基化E.Coli来源，以便排除因dam/dcm-甲基DNA(也可能是潜在的PAMP)导致的诱导。如果核心序列被Cis05突变，则可诱导性完全丧失。相反，W-Box中的突变无效果。Cis05和其衍生物序列在右侧进行说明。突变的碱基红色标注。
图12：香菜中PEP25-诱导后嵌合组合启动子诱导和非诱导活性。该测试以三种生物复制试样进行，蓝色线说明的是诱导因子。在图标下方，在下面行中，元件在5’位置进行显示，在上面行中，元件在3’位置进行显示。30I8b是单独序列30I-8_M1_S2的其他名称。
图13：香菜中PEP25-诱导后嵌合组合启动子中单独序列的协同和对抗作用。紫色为实际测量到的诱导因子，蓝色为根据单独元件的诱导因子期望获得的诱导因子。两个数值的比通过黄色线进行说明。如果黄色线的点大于数值1，则单独元件存在协同作用。
图14：具有4xCis05-RFP结构并通过甜菜褐斑病菌诱导的转基因甜菜。该诱导会导致激活嵌合4xCis05-启动子，从而形成红色的荧光RFP-蛋白。该蛋白在显微镜下显示为红色荧光。如图所示，荧光仅限渗透位置或者注射点周围的区域。
图15：本发明意义上的嵌合启动子示意显示。该嵌合启动子和需求的核酸分子进行有效连接，(A)除了最小启动子还包含一个异源顺式-调节元件，(B)除了最小启动子还包含一个异源顺式-调节元件的二聚体/多聚体，(C)除了最小启动子还包含两个具有不同异源顺式-调节元件的二聚体/多聚体。此外，(D)嵌合启动子为自然启动子，包含一个内源最小启动子和一个内源顺式-调节元件，其中，该启动子通过导入一个附加同源顺式-调节元件进行改进。
图16：转基因拟南芥植物，在嵌合启动子中存在一个顺式-调节元件四聚体，该嵌合启动子控制GUS-报告基因的表达，以便对病原体诱导、伤口诱导和植物特有的元件活性进行试验。针对该启动子对10个独立的转化株进行时hi眼。分别显示一条代表线。左侧图片(使用活体营养型卵菌接种后5天)显示了在使用兼容病原体活体营养型卵菌注射后各自启动子的活性，右侧图片(模拟检验)为对应的检验。启动子显示由活体营养型卵菌形成明显的诱导(植物组织颜色发暗)。
此外，在右侧图片上一个叶片被切割。该切割部位变成蓝色说明带有顺式-调节元件Cis05四聚体的启动子具有伤口可诱导性。
根据本发明的顺式-调节元件的生物信息识别：
新型顺式-调节元件的生物信息识别基础为公开可用的微阵列-表达数据。该表达数据保存在数据库TAIR、NASCArrays、GEO或者ArrayExpress中或者可以直接从微阵列试验的响应出版物中获得(例如Rhee等，2003；Craigon等，2004；Barret和Edgar，2006；Brazma等，2006，Zipfel等，2004，2006；Bülow等，2007；Wan等，2008)。对于新顺式-调节元件的生物信息识别，首先根据公开可用的微阵列-表达数据对拟南芥的植物基因组进行定义，其表达通过病原体，例如丁香假单胞菌或者灰霉菌或者PAMPs(例如flg22或者壳质)进行诱导。接着，从拟南芥的染色体组序列中错去基因组启动子的序列(TAIR；http://www.arabidopsis.org)。使用不同的已知算法(MEME，Bioprospector,Alignace,BEST和其他方法)对启动子序列中存在的基序进行试验。
数据库查询：
对于共调节基因识别的数据库查询说明了一种软件工具，该工具可以对最高六种不同刺激共同进行高调节或者诱导的基因进行识别。未识别共调节基因，实施了超过700磁数据库询问。该查询过程提供了超过400组共同诱导的适合使用BEST-软件包识别共同的顺式-调节基序的基因(Che等，2005)。在77个基因组中，通过提高所需的诱导因子，可以讲共同调节基因的数量降低至120个基因。共调节基因(2-120)的基因组总数为510。
从510个基因组中对500bp或者1000bp长度的共调节基因的转录开始(TSS)的向上启动子序列进行萃取，其转录开始(TSS)已知。通过程序BEST，Cismodule，MD-Scan，BioProspector或者MEME，对共调节基因组的启动子根据保留的序列基序进行试验。对此选择5-10nt，10-15nt和15-20nt基序长度。因此需要进行500x3(基序长度)＝1500次查询。在大部分情况下，延长基序长度不会导致识别出其他未在较短基因长度中出现的基序。在BEST-分析中，如果大部分情况下可以从4个BEST程序中找到两个，则可以对基序进行分类。
对于特定的不同刺激，可以获得相同的共调节基因，因此也可以获得相同的基序。将识别出的冗余基因组(GG)的相同基序总结为新的基序(基序组表格)，以便在所有基序的比较和系统分析过程中依次对单独的基序进行比较。
制定目录，该目录包含所有已经识别出的基序和分析文件以及单独基序的序列图标。序列图标(Crooks等，2004)在http://weblogo.berkeley.edu/中进行制定，说明的是核苷酸在单独基序位置的保留情况。矩阵(Matrix)根据基序组成的序列进行制定，同时说明其序列以及相关的基因。
借助程序STAMP(Mahony和Benos，2007)，见Internet-地址：http:// www.benoslab.pitt.edu/stamp，对已经识别的基序和已知的顺式-调节元件(PLACE，Agris，Athamap)进行比较。此外，可以借助Web服务器STAMP将类似的基序分为一个基序组。该程序可以绘制出一个种系发生树，在该发生树中对基序组的相似性进行总结说明(图4)。
已经识别出的顺式-调节元件的病原体可诱导性证明
因为生物信息方案对于假阳性序列测定存在影响，因此病原体可诱导性必须进行实验证明。对于该实验证明而言，已经识别出的生物信息序列使用标准DNA克隆技术克隆为荧光素酶-报告基因前的四聚体，并在香菜的短时间表达系统中通过PAMP PEP25测试其可诱导性。
对于实验试验而言，选择全新的和于已知病原体促进诱导的顺式-调节元件无类似性的元件。表格2中所述的单独序列使用Spel和Xbal或者使用Spel和Sall Linker在试管中进行合成，并在质体MS23中进行克隆。MS23要么带有β-葡萄糖醛酸酶(GUS)-报告基因，要么带有荧光素酶报告基因和35S最小启动子。所有的元件进行四聚化，并排序，以便进行检验。作为单独序列克隆为嵌合启动子的示例，表格1中说明了带2xCis05元件和多聚4xCis05元件的质体。
表格2：试验的单独序列。在表格中说明了试验的潜在顺式-调节元件的新名称和序列。对生物信息上识别出得核心序列进行了突出显示(加粗和下划线)。在最后一栏说明了PEP25/香菜测试的结果(-：无诱导；+：可诱导)。
在下文中，将通过PAMP PEP25对细胞培养液中短时间转化香菜细胞的四聚但须序列的可诱导性进行测试。除了通常的验证，还需要确保，不同植物物种中的元件可进行诱导，以及可以通过不同的作用剂进行诱导。
对于香菜中的测试，从5天得香菜细胞培养液中对原生质体进行分离。对此，对35ml细胞培养液进行离心分离，并在90ml含0.5％纤维素酶、0.2％混合酶R-10和0.24M氯化钙的已消毒过滤溶液中进行再悬浮，并在26摄氏度的条件下进行摆动过夜培养。然后将释放出的原生质体通过离心分离形成颗粒，使用40ml 0.24M氯化钠进行洗涤，接着在50mlP5-介质(1袋成品介质Gamborgs B-5，1mg 2.4D，96.9蔗糖，使用1M氢氧化钾达到pH5.7，消毒过滤)中进行再悬浮。在离心分离后，原生质体漂浮在P5-介质的表面，可以进行提取。使用P5-介质重复2次清洗过程。
对于其转化过程而言，在10ml的螺旋塞试管中加入5μg待测试启动子结构，2.5μg进行结构Renilla-荧光素酶实验的标准化载体和200μl PEG。加入200μl原生质体，然后小心地进行混合，在室温下置于暗处培养20分钟。接着通过添加5ml0.275M CaNO3-Lsg停止反应。对转化后的原生质体进行离心分离，并在6ml P5-介质中进行提取，并分为2份。一份使用Pep 25(最终浓缩：300ng/ml；序列：VTAGAEVWNQPVRGFKVYEQTEMT)进行抽取，另一份用作对比。在过夜培养后，原生质体通过离心分离进行提取。荧光素酶活性使用双荧光素酶套件(Promega，曼海姆，德国)在Sirius光度计(Berthold检测系统有限责任公司，普福茨海姆，德国)中进行测定。对此，香菜细胞通过离心分离进行形成颗粒，进行细胞溶解，持续20分钟，并在4摄氏度下在150μl PLB-缓冲剂(被动细胞溶解缓冲剂；Promega，曼海姆，德国)中进行细胞溶解。剩余细胞在台式离心机中，，在13000rpm转速和4摄氏度的条件下离心分离20分钟。
根据是使用荧光素酶-报告基因还是GUS-报告基因，对溶菌产物有不同的处理方法。如果使用荧光素酶报告基因，则将5μl含释放出得荧光素酶的剩余物试样在5ml试管(Sarstedt，产品编号55.476)和50μl LARII缓冲剂(Promega，曼海姆，德国)进行混合。缓冲剂包含荧光素酶的培养基，从而可以通过光度计测量酶的活性，进而测量启动子的活性。该测量以2秒的预测量时间和10秒的荧光素酶测量时间。接着加入50μl Stop&Glo缓冲剂(Promega，曼海姆，德国)，小心地通过培养进行混合。缓冲剂会停止荧光素酶的活性，并使得标准化载体的组成Renilla-荧光素酶活性可测量。该测量值用于对不同的转化效率进行标准化。
该测量同样以2秒的预测量时间和10秒的荧光素酶测量时间进行。
如果使用来自大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)-报告基因(Jefferson等，1987)，则在基质MUG水解为4-MU的酶反应中进行证明。然后通过其荧光证明4MU并确认。
根据该方法，针对所有试验的单独序列在有和无PAMP PEP25的情况下测量其活性。
在表格2中，对所有测试的单独序列进行了说明。此外还说明了，是否其通过PAMPPEP 25在香菜中可以被诱导。病原体可诱导的已识别顺式-调节元件(单独序列)和其基序在图2中做了总结。
已识别核心序列的突变分析
为了证明，已识别的核心序列对单独序列的PAMP-和病原体-可诱导性负责，针对所选择的单独序列进行突变分析。对此需要制定单独序列的突变衍生物。突变的单独序列合成为低聚核苷酸。质体的克隆根据结构使用无突变的嵌合启动子进行。接着，对该结构无上文所述测试香菜中的PEP 25-可诱导性。突变分析的结果在图5A，图5B，图6A和图6B中加以说明。所有的五个试验元件显示，已识别的核心序列负责可诱导性。
这对于基序组27的单独序列Cis05和30I-8M1S2具有特别意义。30I-8_M1_S2的核心序列部分和于W-Box(TTGAC；Ruchton等，1996)的互补序列(GTCAA)重叠。重叠的W-Box序列也可以在单独序列30I-8_M1_S3，Cis02和Cis 13中找到。
通过突变分析，尤其是通过变体30I-8_M1_S2_mut2显示，W-Box外的碱基对于PAMP-可诱导性具有决定性意义(图6A)。此外，基序组27的其他成员无叠加的W-Box-序列。与之对应，W-Box强制需要的核心序列TGAC并非基序组27的序列或者家族基序的组成部分(图3F)。因此，对于基序组27的基序或者单独序列不涉及W-Box的变体。
通过其他突变分析也可以对元件20u_M1_S1和27G-8_M1_S1的核心序列进行证明。其试验如上文所述的方法进行。突变分析的结果在图6B(上：20u_M1_S1，下：27G-8_M1_S1)中作了说明。
家族基序的推导
通过将拟南芥-启动子中识别出得顺式-调节元件在香菜中进行测试，可以确保已识别顺式-调节元件的跨植物物种的生物功能。同预期的一样，实验显示，并非所有的生物信息已识别序列都可以发挥作用。大约三分之一的测试DNA序列在香菜中可以通过PEP25进行识别。其他的序列为生物信息分析中的假阳性-序列，或者不显示期望的跨物种生物功能性。这一重要结果可以用作根据功能有效的单独序列对基序组1，5，11，12，21，21n和27的家族基序以及相关的强保留特征核心序列进行识别(图3)。对所有属于一个基序组的功能有效的单独序列进行总结，并从其中推导出一致性和一个基序。首先将所有基本核心序列中为核心序列部分的区域定义为家族基序的特征化核心序列基序。
基序组27的核心序列也可以在序列LS10(Lebel等，1998)中找到。在该序列范围的原始PR-1启动子中生成一个包含突变的10碱基，该碱基可以导致原始启动子SA或者INA-可诱导性的大幅度下降。但此处所示的结果无法推导基序或者核心序列。此外，未显示出LS10对于嵌合启动子的可用性。同时，基序组27的家族基序限制了LS10-序列的基序组。家族基序在位置5不包含C，而在LS10中的该位置则存在C。此外，在位置17不包含G，而在LS10中在该位置存在G。最后，在位置18处要求T或者C，而在LS10中的该位置则存在A。
通过稳定转化的甜菜中的病原体真菌甜菜褐斑病菌证明可诱导性
新型的顺式-调节元件的特征在于，其在不同的植物物种中可以通过不同的PAMP和病原体进行诱导。为了显示其在重要农作物中通过重要农业病原体形成的可诱导性，在香菜中阳性测试的单独序列稳定转化至甜菜中。对此，具有四聚单独序列并包含Iuc-基因的钱和启动子通过Ascl-和Sacl-接口转克隆至双载体1xW1-luc-kan(一种以双载体pGPTV为基础的质体)中。示例为图7中所示的载体4xCis05-luc-kan。相应的载体针对所有的试验元件进行构建。双载体的质体-DNA从大肠杆菌中进行分离，并通过基因II.电穿孔系统以设置25mF和2.5kV转化至来源为GV3101的农杆菌中。使用抗生素卡那霉素(50mg/l)选择重组的农杆菌克隆。甜菜的转化根据Lindsey等(1991)使用抗生素卡那霉素进行。
植物的转基因性通过PCR进行检验。使用引物GTGGAGAGGCTATTCGGTA(SEQ ID NO:36)和CCACCATGATATTCGGCAAG(SEQ ID NO:37)可以应用nptII-基因中553bp较大DNA-片段。PCR在使用10ng基因组DNA，引物浓度为0.2μM的情况下在55摄氏度的热处理温度在多循环装置PTC-200(MJ研究，Watertown,美国)中进行。
10至20个独立转基因列在试管培养液中进行克隆增殖，并使用甜菜褐斑病菌(Isolat Ahlburg)进行感染。在1，2，3和4天后，对每4个植物/列进行采获，并使用Promega荧光素酶试验系统，100次检验，目录编号E1500(LAR)对荧光素酶活性进行测量。对此，将试样加入4倍体积的CCLR缓冲剂(细胞培养液细菌溶解试剂，5x)中，并借助蒸发仪(RZR 2020)进行加工。植物残留物在4摄氏度和14000rpm的条件下进行10分钟的离心分离，剩余物用于荧光素酶测量。在进行测量时，将10μl试样滴入5ml试管(Sarstedt，产品编号55.476)中，并添加100μl荧光素酶试验试剂(LAR；Promega,曼海姆，德国)。然后小心地进行混合，在Sirus光度计(Berthold检测系统有限责任公司，普福茨海姆，德国)对荧光素酶-活性进行测定。
为了对W-Box序列在稳定转化植物中单独序列Cis05中的影响，对香菜测试中突变的衍生物Cis05mut1和Cis05mut2以及较短的单独序列sCis05稳定转化至甜菜中。结构构建和转录按照上述说明进行。对各18个独立的转基因列在试管中进行克隆增殖，并使用甜菜褐斑病菌(Isolat Ahlburg)进行感染。在1，2，3和4天后，对每4个植物/列进行采获，并使用Promega荧光素酶试验系统如上文所述进行测量(图8B)。
稳定转化植物的突变分析显示，W-Box单独，也就是说通过突变Cis05-基序，仅通过褐斑病菌形成较弱的病原体-可诱导性。Cis05-基序单独(突变的W-Box活着较短的无W-Box的元件)相反则存在明显的可诱导性。完整的带W-Box的Cis05-单独序列同样可进行诱导，但相对于无W-Box的衍生物具有较高的背景活性。因此，在稳定转化的甜菜中，Cis05基序单独诱导相比和W-Box组合具有类似的效果或者甚至更好地效果。
根据本发明的嵌合启动子的另一重要特征是，病原体诱导的活性限制于感染点区域。该特征在图14根据本发明的启动子4xCis05示例作了显示。该启动子和红色荧光的报告基因RFP进行结合，获得的结构可以稳定转化至甜菜中。在激光扫描显微镜下，其活性被观察为红色荧光。在图14中显示4xCis05启动子的诱导围绕褐斑病菌菌丝的侵入点周围。
扩展的跨物种病原体可诱导性
顺式-调节元件在不同植物物种中较宽范围可用性的另一示例针对Cis05在转基因试验中显示为单子叶植物小麦因黄色镰刀菌导致的可诱导性。因为35S最小启动子在小麦种仅提供了较低的活性，因此必须对Cis05-元件进行转克隆。对此，该元件使用香菜测试中所使用的质体中的酶Eco311和Xbal进行切割，并在通过Eco31l和Bcul打开的载体pubiTATRucll中进行克隆(图10)。相应的结构针对Cis05以及突变的Cis05-单独序列Cis05mut1和Cis05mut2进行构建，在该单独序列中Cis05-基序或者W-Box发生了突变。该结构利用基因枪转化至通过小麦赤霉病感染的种类为“台风”的小麦一次叶片上以及未感染的对比叶片上。
在感染过程中，小麦赤霉病菌丝通过玻片从生长菌板上被刮下，并在200ml的水中短暂地使用均质机进行切割，并使其悬浮。接着加入200μl的2％氚核，小麦一次叶片在悬浮液中摆动1分钟。接着将感染的叶片和未感染的对比叶片置于H2O-琼脂板上，并使用Bioradparticle枪根据生产上说明使用1100Psi的波斯特玻璃进行短时间转化。使用基本的荧光素酶试验载体作为标准化载体。
接着，将小麦叶片在25摄氏度下进行过夜孵化。为了测定其荧光素酶-活性，叶片在各1ml带海沙的PLB-缓冲剂进行打碎。在4摄氏度下进行20分钟的离心分离后，将包含荧光素酶的5μl剩余物试样在5ml试管(Sarstedt，产品编号55.476)和50μl LARII缓冲剂(Promega，曼海姆，德国)进行混合。缓冲剂包含荧光素酶的培养基，从而可以通过光度计测量酶的活性，进而测量启动子的活性。该测量以2秒的预测量时间和10秒的荧光素酶测量时间。接着加入50μl Stop&Glo缓冲剂(Promega，曼海姆，德国)，小心地通过培养进行混合。缓冲剂会停止荧光素酶的活性，并使得标准化载体的组成Renilla-荧光素酶活性可测量，该活性和Cis05-启动子的活性。该测量值用于对不同的转化效率进行标准化。该测量同样以2秒的预测量时间和10秒的荧光素酶测量时间进行。
诱导的或者非诱导的4xCis05-启动子及其衍生物的活性进行5次生物重复测量(图11)。接着再次重复完整的试验。两次重复显示，在小麦中，病原体诱导的活性来自Cis05-基序，而W-Box基序对禾谷镰孢菌诱导的活性无诱导作用。
拟南芥中Cis02,Cis05,Cis09,Cis12或者Cis13元件的病原体或者伤口诱导和组
织特有活性分析
新型顺式-调节元件的特征在于，该调节元件可以在不同的植物物种中通过不同的PAMP和病原体进行诱导。使用在拟南芥中稳定转化的包含四聚单独序列的6个启动子作为嵌合启动子进一步的活性对比试验。对此，将四聚元件Cis02，Cis05，Cis09，Cis12或者Cis13和GUS-报告基因前的35S-最小启动子在转化载体pBIN-GUS中进行克隆。生成的结构在农杆菌中进行转化。随后进行拟南芥植物的花序浸渍转化(Clough和Bent，1998)，以便将启动子GUS结构稳定低导入植物基因中。转基因植物的选择使用抗生素卡那霉素。
对于每个元件试验10个独立的转化。
GUS-报告基因和启动子的活性通过GUS-染色进行查看(Jefferson等，1987)。各自嵌合启动子的活动会形成酶(GUS)的表达，从而形成蓝色染色。染色过程由此显示各自嵌合启动子的活性。
为了对启动子病原体-可诱导性进行测试，转基因拟南芥植物使用相容的病原体活体营养型卵菌进行感染。感染5天后，通过GUS-染色对启动子的活性进行证明。此外，单独的叶片使用剪刀剪出伤口，以便测试启动子的伤口可诱导性(图16)。
元件Cis02显示具有良好的病原体-可诱导性，但仅有较小的伤口可诱导性。元件Cis05显示较强的活性，同时可以通过活体营养型卵菌进行良好的诱导。元件Cis09显示了启动子在感染后良好的诱导，在受伤后几乎无不期望的活性。元件Cisterna12同元件Cis09一样在所有的试验列中，在受伤后几乎无不期望的活性出现，但可以观察到因病原体活体营养型卵菌的明显诱导。元件Cis12和Cis09划入一个共同的家族基序。同时元件Cis13也可以通过活体营养型卵菌感染进行良好的诱导。但未观察到明显的伤口可诱导性。在图16中显示了转基因拟南芥植物的GUS-染色，该GUS-报告基因在4xCis05嵌合启动子的对比下进行试验。
通过协同相互作用或者通过导入不同的信号通道(假设一种可以感知和导入信号“ET-Tu”和“flg22”，以便对其进行激活的启动子)，由不同顺式-调节元件组成的嵌合组合启动子可以比其中存在的单独元件具有更高的特性和/或者活性(Rushton等，2002)。为了确定嵌合组合启动子中新型顺式-调节元件的最佳组合，使用标准DNA-克隆技术对此处所述的顺式-调节元件Cis02，Cis05，Cis12，Cis13和30I-8_M1_S2以及已经公开的元件D-Box(Rushton等，2002)，S–Box(Kirsch等，2000)和Gst1-Box(Strittmatter等，1996)的所有可能的2x2-组合生成嵌合组合启动子。其过程如单独序列四聚化过程所述，但不是对两个相同的二聚体(例如2x30I-8_M1_S2和2x30I-8_M1_S2)，而是对两个不同的二聚体(例如z.B.2xCis05和2x30I-8_M1_S2)相互进行克隆。由此形成的嵌合组合启动子在香菜的短时间表达系统中使用PAMP PEP25对其可诱导性进行测试。其结果(嵌合组合启动子的绝对非诱导和诱导活性和诱导因子)在图12中作了说明。可以对具有特别强的和专有可诱导性的嵌合组合-启动子进行识别，其诱导因子和活性高于仅复制单独的顺式-调节元件构成的嵌合启动子(图13)。具有最高诱导因子和最强活性的嵌合组合启动子在表格3中进行了总结。
表格3：具有最高诱导因子和诱导活性的病原体诱导单独序列组合
序列表
<110> KWS种子股份有限公司
<120> 开发病原体-响应嵌合启动子的新型植物来源顺式-调节元件
<130> KWS 0200 PCT
<150> DE 102011122267.0
<151> 2011-12-23
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Familienmotiv Gruppe 27
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(14)
<223> Kernsequenzmotiv
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
nnhkdnnvaa agtmndhy 18
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Familienmotiv Gruppe 11
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(12)
<223> Kernsequenzmotiv
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
ynamcnaaac cawwny 16
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Familienmotiv Gruppe 12
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(10)
<223> Kernsequenzmotiv
<400> 3
wnrmscaaam smw 13
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Familienmotiv Gruppe 1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(9)
<223> Kernsequenzmotiv
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
nnmsacrcgy nwm 13
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Familienmotiv Gruppe 21
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(9)
<223> Kernsequenzmotiv
<400> 5
asktgkactw kgwm 14
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Familienmotiv Gruppe 5
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(12)
<223> Kernsequenzmotiv
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 6
knwymmrtsa ckwmn 15
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(16)
<223> Kernsequenz
<400> 7
acaacagacg acttttcata attca 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(16)
<223> Kernsequenz
<400> 8
ctatatgaca aaagtcaaac ataaa 25
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(21)
<223> Kernsequenz
<400> 9
tgttcacttt gaaaagtatt ctttgag 27
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(20)
<223> Kernsequenz
<400> 10
cgatcagact tttctacgca agagaa 26
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(24)
<223> Kernsequenz
<400> 11
taatttctct tgcgtagaaa agtctgatcg ggaag 35
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(21)
<223> Kernsequenz
<400> 12
tcgttcttca gtcaaaaagt caaactatct ctctc 35
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(18)
<223> Kernsequenz
<400> 13
gagcgtgaat tgactttgac caaaaccaaa 30
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(20)
<223> Kernsequenz
<400> 14
ggtcagcatg ttggactttc caaattcatt gaccaaag 38
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(29)
<223> Kernsequenz
<400> 15
aaaataaaca gctacttgac gaaaagtcaa accaaattc 39
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(23)
<223> Kernsequenz
<400> 16
gttttgactt ttgacctaaa ccatttccat gtagaa 36
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(24)
<223> Kernsequenz
<400> 17
ccgtcttagt ttaccgaaac caaagtggct ttttct 36
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(25)
<223> Kernsequenz
<400> 18
cgtaataatg gtttggtttg gtttgatcaa gtctt 35
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(18)
<223> Kernsequenz
<400> 19
gacttttgac ctaaaccatt tccat 25
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(17)
<223> Kernsequenz
<400> 20
caacacaaaa cgcaaacgca gacctc 26
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(22)
<223> Kernsequenz
<400> 21
aattgacaaa agacacgcaa acgattccaa cgacc 35
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(22)
<223> Kernsequenz
<400> 22
aaataattat ttatggtttg gtcatttggt caaat 35
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(21)
<223> Kernsequenz
<400> 23
agtcaaaacg tagaccaaaa caaaaacatg taact 35
<210> 24
<211> 38
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(19)
<223> Kernsequenz
<400> 24
tgcacacaca cacacgtgta ctaggtcaaa ccaaacgt 38
<210> 25
<211> 41
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(25)
<223> Kernsequenz
<400> 25
caaaaagtca acacatacga cgcgtttcca ttgactaaat a 41
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(17)
<223> Kernsequenz
<400> 26
tctcatctct cgacacgcaa cttcc 25
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(19)
<223> Kernsequenz
<400> 27
cacacacgtg tactaggtca aacca 25
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(22)
<223> Kernsequenz
<400> 28
aggacttttc accagttgga ctttgaagcc accaa 35
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(19)
<223> Kernsequenz
<400> 29
aagtctaaat ctttgacccc aaaaaagaga gcaa 34
<210> 30
<211> 35
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(21)
<223> Kernsequenz
<400> 30
tgttgagtcg tttacgtcac gtcgagaatt ttctc 35
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(21)
<223> Kernsequenz
<400> 31
tgtcattatt aatacgtgac gaaactgtag ctctg 35
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(25)
<223> Kernsequenz
<400> 32
ttacgtgtca agaagtgatt ggagaggaca ctctac 36
<210> 33
<211> 35
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(21)
<223> Kernsequenz
<400> 33
ccatacaata taaaccacca aaccataacc acaaa 35
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(18)
<223> Kernsequenz
<400> 34
caatctactc gtctcttctc ttacat 26
<210> 35
<211> 10
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 35
tcgtctcttc 10
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR Primer
<400> 36
gtggagaggc tattcggta 19
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR Primer
<400> 37
ccaccatgat attcggcaag 20
<210> 38
<211> 182
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 38
tcctctctac tcctcagcat ctatataagg gccttgcagg cagtggctct cacaccaacg 60
aaacaaggag agactcagag aggaggcgtg ttggttagct cattggcagc agcacacaca 120
aaccacatct cctatatata gctcattttt agcttttgga attgagagag gttttgagag 180
aa 182
<210> 39
<211> 149
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 39
atctgcaggc gctgcctatt taatcccttc ccctccctcc attcccctcc aagaagagcc 60
acagcttcat ctgcagctac agctcctctt cgtcttcgac acacaagtat tttttcagga 120
caaagatcaa tccagataca catacacct 149
<210> 40
<211> 1133
<212> DNA
<213> Zea mays
<220>
<221> Intron
<222> (129)..(1133)
<400> 40
cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg 60
ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc 120
gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc 180
ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt 240
gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc 300
tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct agccgttccg 360
cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt 420
tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt 480
tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct 540
gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt 600
catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg 660
atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgcttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg 720
gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc 780
tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt 840
ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga 900
tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc 960
tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc 1020
atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt 1080
ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg cag 1133
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Familienmotiv Gruppe 21n
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(12)
<223> Kernsequenzmotiv
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 41
snsnnnwwkg wcnnnsnm 18
<210> 42
<211> 29
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(25)
<223> Kernsequenzmotiv
<400> 42
ctcaaaggcc agaattgacg cagccgttt 29
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(22)
<223> Kernsequenzmotiv
<400> 43
ccttggccca gtccttggtc gtcgtatc 28
<210> 44
<211> 11
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(11)
<223> Kernsequenzmotiv
<400> 44
gttggacttt c 11
Claims (29)
1.赋予病原体可诱导性或者诱导子可诱导性的分离的顺式-调节元件，该调节元件包含核酸分子，其核苷酸序列包含核心序列基序scaaam或与其互补的核心序列基序，其中“s”代表鸟嘌呤(g)或胞嘧啶，且“m”代表腺嘌呤或胞嘧啶(c)。
2.权利要求1的分离的顺式-调节元件，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列代表所述顺式-调节元件的核心序列。
3.权利要求1或2的分离的顺式-调节元件，其特征在于所述分离的顺式-调节元件包含核酸分子，其核苷酸序列包括根据SEQ ID NO：3的家族基序或与其互补的家族基序，所述根据SEQ ID NO：3的家族基序包含权利要求1限定的核心序列基序scaaam。
4.权利要求3的分离的顺式-调节元件，其特征在于，所述家族基序包含所述顺式-调节元件的核心序列，其中所述核心序列选自AACGCAAAC、TGGTTTGGT、CACGCAAAC、CCAAAAC。
5.权利要求1-4任一项的分离的顺式-调节元件，其包含核酸分子，所述核酸分子
a)含根据SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23的核苷酸序列，或
b)含与a)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
6.嵌合启动子，该嵌合启动子适合通过病原体感染或者使用病原体诱导子进行处理在植物细胞中表达有效连接的核酸分子，且包含最小启动子和至少一个根据权利要求1至5中一项的顺式-调节元件。
7.根据权利要求6的嵌合启动子，其特征在于，所述嵌合启动子至少包含一种顺式-调节元件的多聚体，其中的至少一个顺式-调节元件为根据权利要求1至5中一项的顺式-调节元件。
8.根据权利要求7的嵌合启动子，其特征在于，所述多聚体为一种二聚体或者四聚体。
9.一种重组基因，该基因包含根据权利要求6至8中一项的嵌合启动子。
10.一种载体，该载体包含根据权利要求6至8中一项的嵌合启动子或者根据权利要求9的重组基因。
11.一种原核宿主细胞，该细胞包含根据权利要求6至8中一项的嵌合启动子，根据权利要求9的重组基因或者根据权利要求10的载体。
12.一种转基因基因组，其转化有根据权利要求6至8中一项的嵌合启动子，根据权利要求9的重组基因或者根据权利要求10的载体。
13.用于生成植物的方法，包含：
a)在至少一个植物细胞中导入根据权利要求6至8中一项的嵌合启动子，根据权利要求9的重组基因或者根据权利要求10的载体，和
b)植物的再生。
14.一种用于在经顺式-调节元件修饰的天然启动子控制下病原体诱导或者诱导子诱导表达内源基因的方法，其中所述方法包括将包含权利要求1定义的核心序列基序scaaam的顺式-调节元件导入所述内源基因的天然启动子中。
15.分离的DNA序列作为嵌合启动子中介导病原体可诱导性或者诱导子可诱导性的顺式-调节元件的用途，所述分离的DNA序列包含核酸分子，其核苷酸序列具有权利要求1限定的核心序列基序scaaam或与其互补的核心序列基序。
16.赋予病原体可诱导性或者诱导子可诱导性的分离的顺式-调节元件，该调节元件包含核酸分子，其核苷酸序列对应于以下一种核心序列基序：
a)vaaagtm，
b)aaacca，
c)acrcg，
d)sktgkact，
e)mrtsack，
f)ccaccaa，
g)tcgtctcttc，
h)wwkgwc，或者
对应于与a)至h)互补的核心序列基序。
17.根据权利要求16的分离的顺式-调节元件，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列代表所述核心序列的部分序列或所述顺式-调节元件核心序列。
18.分离的顺式-调节元件，包含核酸分子，其核苷酸序列：
a)对应于根据SEQ ID NO：1的家族基序，其包含根据权利要求16的核心序列基序vaaagtm，
b)对应于根据SEQ ID NO：2的家族基序，其包含根据权利要求16的核心序列基序aaacca，
c)对应于根据SEQ ID NO：4的家族基序，其包含根据权利要求16的核心序列基序acrcg，
d)对应于根据SEQ ID NO：5的家族基序，其包含根据权利要求16的核心序列基序sktgkact，
e)对应于根据SEQ ID NO：6的家族基序，其包含根据权利要求16的核心序列基序mrtsack，
f)对应于根据SEQ ID NO：41的家族基序，其包含根据权利要求16的核心序列基序wwkgwc，
g)对应于与a)至f)中的一种互补的家族基序。
19.根据权利要求18的分离的顺式-调节元件，其特征在于，所述家族基序包含所述顺式-调节元件的核心序列。
20.分离的顺式-调节元件，包含核酸分子，所述核酸分子：
a)含根据以下编号的核苷酸序列：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ IDNO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ IDNO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ IDNO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ IDNO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43或者SEQ ID NO：44，
b)含根据以下编号核心序列的核苷酸序列：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：24，SEQ IDNO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ IDNO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43或者SEQID NO：44，或者
c)含与a)或者b)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
21.嵌合启动子，该嵌合启动子适合通过病原体感染或者使用病原体诱导子进行处理在植物细胞中表达有效连接的核酸分子，且包含最小启动子和至少一个根据权利要求16至20中一项的顺式-调节元件。
22.根据权利要求21的嵌合启动子，其特征在于，所述嵌合启动子至少包含一种顺式-调节元件的多聚体，其中的至少一个顺式-调节元件为根据权利要求16至20中一项的顺式-调节元件。
23.根据权利要求22的嵌合启动子，其特征在于，多聚体为二聚体或者四聚体。
24.一种重组基因，该基因包含根据权利要求21至23中一项的嵌合启动子。
25.一种载体，该载体包含根据权利要求21至23中一项的嵌合启动子或者根据权利要求24的重组基因。
26.一种原核或者真核宿主细胞，该细胞包含根据权利要求21至23中一项的嵌合启动子，根据权利要求24的重组基因或者根据权利要求25的载体。
27.一种转基因植物，其转化有根据权利要求21至23中一项的嵌合启动子，根据权利要求24的重组基因或者根据权利要求25的载体。
28.根据权利要求27的植物的种子、细胞、组织或者部分。
29.用于生成根据权利要求27的植物的方法，包含：
a)在至少一个植物细胞中导入根据权利要求21至23中一项的嵌合启动子，根据权利要求24的重组基因或者根据权利要求25的载体，和
b)植物的再生。
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