JP2003284566A - 病害ストレス応答性プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 例えば病害ストレス抵抗性植物の分子育種を
可能とする病害ストレス応答性プロモーターを提供す
る。 【解決手段】 以下の(a)、(b)又は(c)のDNAを含む、病
害ストレス応答性プロモーター。（a）植物由来の特定
な塩基配列からなるDNA、（b）植物由来の特定な塩基配
列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは
付加された塩基配列からなり、かつ病害ストレス応答性
プロモーターとして機能するDNA、（c）複数の特定な塩
基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつ病害ストレス応答性プロモーターと
して機能するDNA

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、病害ストレス応答
性プロモーターに関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子の配列決定プロジェクトによっ
て、数種の生物について大量のゲノム配列及びcDNA配列
が決定されており、植物モデルであるシロイヌナズナ(A
rabidopsis thaliana)では、２つの染色体の完全なゲノ
ム配列が決定されている(Lin, X.et al., (1999) Natur
e 402, 761-768.; Mayer, K. et al., (1999) Nature 4
02, 769-777.)。

【０００３】EST(expressed sequence tag)プロジェク
トも、発現遺伝子の発見に大いに貢献している(Hofte,
H. et al., (1993) Plant J. 4, 1051-1061.; Newman,
T. et al., (1994) Plant Physiol. 106, 1241-1255.;
Cooke, R. et al., (1996) Plant J. 9, 1O1-124. Asam
izu, E. et al., (2000) DNA Res. 7, 175-180.)。例え
ば、dbEST(National Center for Biotechnology Inform
ation(NCBI)のESTデータベース)には部分cDNA配列が含
まれており、全遺伝子の半分以上(即ち、約28,000遺伝
子)が再現されている(完全に配列決定されたシロイヌナ
ズナの２番染色体の遺伝子含有量から推定[Lin, X. et
al., (1999) Nature 402, 761-768.])。

【０００４】近年、ゲノムスケールの遺伝子発現を分析
するのにマイクロアレイ（DNAチップ）技術が有用な手
段となっている(Schena, M. et al., (1995) Science 2
70,467-470.; Eisen, M. B. and Brown, P. O. (1999)
Methods Enzymol. 303, 179-205.)。このDNAチップを用
いる技術は、cDNA配列をスライドガラス上に1,000遺伝
子/cm²以上の密度で配列させるものである。このように
配列させたcDNA配列を、異なる細胞型又は組織型のRNA
サンプルから調製した２色蛍光標識cDNAプローブ対に同
時にハイブリダイズさせることで、遺伝子発現を直接か
つ大量に比較分析することが可能となる。この技術は、
最初、48個のシロイヌナズナ遺伝子を根及び苗条におけ
るディファレンシャル発現について分析することで実証
された(Schena, M. et al., (1995) Science 270, 467-
470.)。さらに、マイクロアレイは、熱ショック及びプ
ロテインキナーゼＣ活性化に応答する新規な遺伝子を同
定するため、ヒトcDNAライブラリーからランダムに採取
した1,000個のクローンを調査するのに使用されている
(Schena, M. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 93, 10614-10619.)。

【０００５】一方、このDNAチップを用いる方法によっ
て、各種の誘導条件下における炎症性疾患関連遺伝子の
発現プロフィールの分析が行われている(Heller, R. A.
etal., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 215
0-2155.)。さらに、マイクロアレイを用いて、6,000個
を超えるコード配列からなる酵母ゲノムの動的発現につ
いても分析が行われている(DeRisi, J.L. et al., (199
7) Science 278, 680-686.; Wodicka, L. et al., (199
7) Nature Biotechnol. 15, 1359-1367.)。

【０００６】しかしながら、植物の分野では、マイクロ
アレイ分析に対しては若干の報告がなされているに過ぎ
ない(Schena, M. et al., (1995) Science 270, 467-47
0.;Ruan, Y. et al., (1998) Plant J. 15, 821-833.;
Aharoni. A. et al., (2000) Plant Cell 12, 647-66
1.; Reymond, P. et al., (2000) Plant Cell 12, 707-
719.)。

【０００７】ところで、植物に対する微生物の感染によ
る病害は、植物にとって致命的になりうる重大なストレ
スの一つである。植物は動物のような免疫系等の感染防
御のために特殊化した細胞・組織を有しないが、微生物
等の病原体の侵入に際して感染の拡大を抑制して生体を
防御するために、病原体を非自己として認識して起こる
過敏感反応に代表されるような誘導性の防御反応によっ
て、感染部位の周辺に抗菌性の化学的環境と物理的障壁
を形成して抵抗する植物特有の機構を有している。一
方、病原体は宿主である植物を認識して胞子発芽、付着
器および侵入菌糸の形成、宿主内への侵入、伸展を行
う。

【０００８】特に、黒すす病菌（Alternaria brassicic
ola）は、アブラナ科植物を宿主とする腐生性の糸状菌
であり、感染した植物に“黒いすす”をまぶした様な病
斑を形成する。シロイヌナズナのエコタイプ（生態型）
であるコロンビアは、黒すす病菌に対して抵抗性であ
る。Alternaria brassicicolaをコロンビアに接種する
と、接種後48から72時間後に過敏感細胞死様の病斑を形
成する。この現象は植物特有の抵抗反応として知られて
おり、病原菌の侵入に対し、植物が自ら積極的に細胞
（組織）を殺すことで、病原菌の感染の拡大を阻止す
る、植物におけるアポトーシスとして注目されている。
しかしながら、病原体の感染から過敏感細胞死に至るま
での作用機序に関する研究等の植物における病害ストレ
スに関する研究は十分ではない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、病原菌の感
染によって制御される遺伝子をより多く同定・分析する
ことにより病害耐性の分子機構の解明に有効であり、例
えば病害ストレス抵抗性植物の分子育種を可能とする病
害ストレス応答性プロモーターを提供することを目的と
する。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、cDNAマイクロアレ
イ分析を応用して病害ストレス応答性遺伝子を同定し、
そのプロモーター領域を単離することに成功し、本発明
を完成するに至った。

【００１１】すなわち、本発明は、以下の(a)、(b)又は
(c)のDNAを含む、病害ストレス応答性プロモーターであ
る。 (a) 配列番号１〜２１から選ばれるいずれかの塩基配列
からなるDNA (b) 配列番号１〜２１から選ばれるいずれかの塩基配列
において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付
加された塩基配列からなり、かつ病害ストレス応答性プ
ロモーターとして機能するDNA (c) 配列番号１〜２１から選ばれるいずれかの塩基配列
からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、かつ病害ストレス応答性プロモーターとして機
能するDNA 病害ストレスとしては、黒すす病菌（Alternaria brass
icicola）の感染によるストレスが挙げられる。

【００１２】さらに、本発明は、前記プロモーターを含
む発現ベクター、又は該発現ベクターに、さらに任意の
遺伝子が組み込まれた発現ベクターである。さらに、本
発明は、前記発現ベクターを含む形質転換体である。さ
らに、本発明は、前記発現ベクターを含むトランスジェ
ニック植物（例えば、植物体、植物器官、植物組織又は
植物培養細胞）である。さらに、本発明は、前記トラン
スジェニック植物を培養又は栽培することを特徴とする
ストレス耐性植物の製造方法である。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、種々の環境ストレス条件の異なる植物か
ら、ビオチン化CAPトラッパー法(Carninci. P. et al.,
(1996) Genomics, 37, 327-336.)によってシロイヌナ
ズナの完全長cDNAライブラリーを構築し (Seki. M. et
al., (1998) Plant J. 15, 707-720.)、ストレス誘導性
遺伝子を含む約7,000個の完全長cDNAを用いてシロイヌ
ナズナの完全長cDNAマイクロアレイをそれぞれ調製し
た。

【００１４】そして、病害ストレス下における遺伝子の
発現パターンをモニターし、病害ストレス応答性遺伝子
を網羅的に解析した。そして、これら病害ストレス応答
性遺伝子からプロモーター領域を単離することに成功し
たものである。以上のように、完全長cDNAマイクロアレ
イは、シロイヌナズナの病害ストレス誘導性遺伝子の発
現様式の解析やストレス関連転写制御因子の標的遺伝子
の解析にとって有効なツールである。

【００１５】１．プロモーターの単離 本発明のプロモーターは、病害ストレスにより発現され
るストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子の上流
に存在するシスエレメントであり、転写因子と結合し
て、その下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有する
ものである。本発明のプロモーターを単離するにあた
り、まず、マイクロアレイを用いて病害ストレス応答性
遺伝子を単離する。本発明のプロモーターを単離する際
のマイクロアレイとしては、シロイヌナズナ（Arabidop
sis）の全長cDNAライブラリーから単離した遺伝子のほ
か、RD（Responsive to Dehydration）遺伝子、ERD（Ea
rly Responsive to Dehydration）遺伝子、内部標準と
してλコントロール鋳型DNA断片（TX803、宝酒造株式会
社製）から得られたPCR増幅断片、さらにネガティブコ
ントロールとしてマウスのニコチン酸アセチルコリンレ
セプターのエプシロンサブユニット（nAChRE）遺伝子及
びマウスのグルココルチコイドレセプターの相同性遺伝
子からなる計約7000のcDNAを用いることができる。

【００１６】cDNAを調製する際には、先ず、シロイヌナ
ズナより抽出した全量RNAをポリAセレクションした後、
逆転写反応をおこない2本鎖DNAを合成し、cDNAをベクタ
ーに挿入する。cDNAライブラリ作成用ベクターに挿入さ
れたcDNAを、cDNAの両側のベクターの配列と相補的なプ
ライマーを用いてPCR法により増幅する。ベクターとし
ては、λZAPII、λPS等が挙げられる。

【００１７】Kurabo製プラスミド調製装置を用いて抽出
したプラスミドDNAをシーケンス解析に用いて、DNAシー
ケンサー（ABI PRISM 3700. PE Applied Biosystems, C
A,USA）により配列を決定する。GenBank/EMBLデータベ
ースをもとに、BLASTプログラムを用いて配列のホモロ
ジー検索を行う。マイクロアレイは、通常の方法に従っ
て作製することができ、特に限定されるものではない。
例えば、gene tipマイクロアレイスタンプマシンGTMASS
SYSTEM（Nippon Laser & Electronics Lab.製）を使っ
て、上記PCR産物をマイクロタイタープレートからロー
ドし、マイクロスライドガラスの上に所定間隔でスポッ
トする。その後、非特異的なシグナルの発現を防ぐため
にスライドをブロッキング・ソルーションに浸す。

【００１８】植物材料としては野生型のほか、特定の遺
伝子の破壊株等が挙げられる。特定の遺伝子の破壊株と
しては、例えば、pad 1, 3, 4(phytoalexin deficien
t)、jar 1(jasmonic acid resistant)、eds 1(enhanced
disease susceptibility)などが挙げられる。植物種と
しては、シロイヌナズナ、タバコ，イネ等が挙げられる
が、シロイヌナズナが好ましい。

【００１９】病害ストレス処理は公知方法の方法で行う
ことができる（Thomma et al. (1999) Plant J.19, 163
-171）。病害ストレスとしては、例えば、黒すす病菌
（Alternaria brassicicola）の胞子懸濁液を植物体全
体に直接噴霧する方法を使用することができる。病害ス
トレス処理にさらした後は、植物体をサンプリングし、
液体窒素を用いて凍結保存する。凍結保存した植物体か
らは、公知方法又はキットを用いてmRNAを単離精製する
ことができる。

【００２０】標識用Cy3 dUTP又はCy5 dUTP（Amersham P
harmacia）の存在下でそれぞれのmRNAサンプルの逆転写
を行い、ハイブリダイゼーションに用いる。ハイブリダ
イゼーション後は、走査レーザー顕微鏡等を用いてマイ
クロアレイをスキャンする。マイクロアレイのデータ解
析用プログラムとして、Imagene Ver 2.0（BioDiscover
y）とQuantArray（GSI Lumonics）等を用いることがで
きる。

【００２１】スキャン後は、目的とする遺伝子をもつプ
ラスミドを調製することにより、遺伝子が単離される。
単離された遺伝子は、定法にしたがって塩基配列を解析
する。その後、決定した遺伝子の塩基配列に基づいて、
データベース（GenBank/EMBL, ABRC）のゲノム情報か
ら、遺伝子解析用プログラムを用いて当該遺伝子を同定
する。その結果、単離された遺伝子には、転写因子や抗
菌性タンパク質等をコードする遺伝子が含まれている。
これら病害ストレス誘導性遺伝子の中から２１種の新規
な遺伝子（RAFL02-02-B06、RAFL04-16-P21、RAFL05-04-
E02、RAFL05-07-A18、RAFL05-07-L13、RAFL05-08-N24、
RAFL05-10-H24、RAFL05-15-F19、RAFL05-18-N16、RAFL0
5-21-N20、RAFL06-08-I05、RAFL07-15-D01、RAFL07-16-
B09、RAFL08-11-M14、RAFL08-17-G11、RAFL09-11-E10、
RAFL09-15-D03、RAFL09-18-K24及びRAFL11-07-N15、RAF
L05-12-B21、RAFL09-14-P05）が同定される。これらの
遺伝子について、データベース（GenBank/EMBL, ABRC）
のゲノム情報から遺伝子解析用プログラムを用いてプロ
モータ領域を同定した。これら２１種の遺伝子のプロモ
ーター領域の塩基配列を、表１のように、それぞれ配列
番号１〜２１に示す。

【００２２】

【表１】

【００２３】但し、本発明のプロモーターが病害ストレ
ス応答性プロモーターとして機能する限り、配列番号１
〜２１から選ばれるいずれかの塩基配列において１又は
複数個、好ましくは１又は数個（例えば１〜１０個、１
〜５個）の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を
有するものでもよい。さらに、配列番号１〜２１から選
ばれるいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつ病害ストレス応
答性プロモーターとして機能するDNAも、本発明のプロ
モーターに含まれる。

【００２４】一旦本発明のプロモーターの塩基配列が確
定されると、その後は化学合成によって、又はクローニ
ングされたプローブを鋳型としたPCRによって、あるい
は該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブ
リダイズさせることによって、本発明のプロモーターを
得ることができる。さらに、部位特異的突然変異誘発法
等によって本発明のプロモーターの変異型であって変異
前のプロモーターと同等の機能を有するものを合成する
こともできる。

【００２５】なお、プロモーター配列に変異を導入する
には、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又は
これに準ずる方法を採用することができる。例えば部位
特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例
えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)
などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro
Mutagenesis シリーズキットを用いて変異の導入が行わ
れる。ここで、「病害ストレス応答性プロモーターとし
て機能する」とは、病害ストレス条件下にプロモーター
をさらしたときに、RNAポリメラーゼがプロモーターに
結合し、転写開始させる機能をいう。

【００２６】「病害ストレス」とは、一般には病原体の
感染によるストレスを意味する。病原体としては、黒す
す病菌（Alternaria brassicicola）、べと病菌（Peron
ospora parasitica）、うどんこ病菌（Erysiphe oronti
i）、灰色かび病菌（Botrytis cinerea）、炭そ病菌（C
olletotrichum higginsianum）等を挙げることができ
る。本発明の植物プロモーターは、配列番号１〜２１の
いずれかの塩基配列において、これらの３'末端に翻訳
効率を上げる塩基配列などを付加したものや、プロモー
ター活性を失うことなく、その５'末端を欠失したもの
を含む。

【００２７】さらに、本発明のプロモーターは、配列番
号１〜２１のいずれかの塩基配列からなるDNAとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ病害スト
レス応答性プロモーターとして機能するDNAを含む。こ
こで、ストリンジェントな条件とは、ナトリウム濃度が
25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68
℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×S
SC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃で
ある。

【００２８】２．発現ベクターの構築 本発明の発現ベクターは、適当なベクターに本発明のプ
ロモーターを連結(挿入)することにより得ることができ
る。本発明のプロモーターを挿入するためのベクター
は、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、
例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラス
ミドなどが挙げられる。

【００２９】プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプ
ラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pU
C18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミ
ド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド
（例えばYEp13、YCp50等)などが挙げられ、ファージDNA
としてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EM
BL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さら
に、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物
ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクタ
ーを用いることもできる。ベクターに本発明のプロモー
ターを挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制
限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又
はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結
する方法などが採用される。

【００３０】本発明においては、任意遺伝子を発現させ
るため、上記発現ベクターに、さらに当該任意遺伝子を
挿入することができる。任意の遺伝子を挿入する手法
は、ベクターにプロモーターを挿入する方法と同様であ
る。本発明のプロモーターは、その3'末端にレポーター
遺伝子、例えば、植物で広く用いられているGUS遺伝子
を連結して用いれば、GUS活性を調べることでプロモー
ターの強さを容易に評価することができる。なお、レポ
ーター遺伝子としては、GUS遺伝子以外にも、ルシフェ
ラーゼ、グリーンフルオレセイントプロテインなども用
いることができる。

【００３１】このように、本発明においては、様々なベ
クターを用いることができる。さらに、本発明のプロモ
ーターに目的の任意遺伝子をセンス又はアンチセンス方
向で接続したものを作製し、これをバイナリーベクター
と呼ばれるpBI101(Clonetech社)などのベクターに挿入
することができる。

【００３２】３．形質転換体の作製 本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを宿主中
に導入することにより得ることができる。ここで、宿主
としては、プロモーター又は目的遺伝子を発現できるも
のであれば特に限定されるものではないが、植物が好ま
しい。宿主が植物である場合は、形質転換植物（トラン
スジェニック植物）は以下のようにして得ることができ
る。

【００３３】本発明において形質転換の対象となる植物
は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、
種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、
維管束等)又は植物培養細胞のいずれをも意味するもの
である。形質転換に用いられる植物としては、アブラナ
科、イネ科、ナス科、マメ科等に属する植物（下記参
照）が挙げられるが、これらの植物に限定されるもので
はない。

【００３４】 アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana) ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum） イネ科：トウモロコシ(Zea mays) 、イネ(Oryza sativ
a) マメ科：ダイズ(Glycine max)

【００３５】上記組換えベクターは、通常の形質転換方
法、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、
アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法等
によって植物中に導入することができる。例えばエレク
トロポレーション法を用いる場合は、パルスコントロー
ラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧
500〜1600V、25〜1000μF、20〜30msecの条件で処理
し、遺伝子を宿主に導入する。

【００３６】また、パーティクルガン法を用いる場合
は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用し
てもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロト
プラストを調製して使用してもよい。このように調製し
た試料を遺伝子導入装置（例えばBio-Rad社のPDS-1000/
He等）を用いて処理することができる。処理条件は植物
又は試料により異なるが、通常は1000〜1800psi程度の
圧力、5〜6cm程度の距離で行う。

【００３７】また、植物ウイルスをベクターとして利用
することによって、目的遺伝子を植物体に導入すること
ができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、
カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわ
ち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなど
に挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中
に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修
飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって組換え体か
ら切り出し、植物宿主に接種することによって、目的遺
伝子を植物宿主に導入することができる。

【００３８】アグロバクテリウムのTiプラスミドを利用
する方法においては、アグロバクテリウム(Agrobacteri
um)属に属する細菌が植物に感染すると、それが有する
プラスミドDNAの一部を植物ゲノム中に移行させるとい
う性質を利用して、目的遺伝子を植物宿主に導入する。
アグロバクテリウム属に属する細菌のうちアグロバクテ
リウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacien
s)は、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を
形成し、また、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrob
acteriumu rhizogenes)は、植物に感染して毛状根を発
生させる。これらは、感染の際にTiプラスミド又はRiプ
ラスミドと呼ばれる各々の細菌中に存在するプラスミド
上のT-DNA領域(Transferred DNA)と呼ばれる領域が植物
中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因
するものである。Ti又はRiプラスミド上のT-DNA領域中
に、植物ゲノム中に組み込みたいDNAを挿入しておけ
ば、アグロバクテリウム属の細菌が植物宿主に感染する
際に目的とするDNAを植物ゲノム中に組込むことができ
る。

【００３９】形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュー
ト、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器
官培養に用いることが可能であり、また従来知られてい
る植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン
（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジ
ン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより
植物体に再生させることができる。

【００４０】本発明のベクターは、上記植物宿主に導入
するのみならず、大腸菌(Escherichia coli）等のエッ
シェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtil
is)等のバチルス属、又はシュードモナス・プチダ(Pseu
domonas putida)等のシュードモナス属に属する細菌、
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces
pombe)等の酵母、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あ
るいはSf9等の昆虫細胞などに導入して形質転換体を得
ることもできる。大腸菌、酵母等の細菌を宿主とする場
合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可
能であると同時に、本発明のプロモーター、リボソーム
結合配列、目的遺伝子、転写終結配列により構成されて
いることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺
伝子が含まれていてもよい。

【００４１】細菌への組換えベクターの導入方法は、細
菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるもので
はない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレク
トロポレーション法等が挙げられる。

【００４２】酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロ
ミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾ
サッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)
などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法
は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定され
ず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラス
ト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。

【００４３】動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞CO
S-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細
胞）、マウスL細胞などが用いられる。動物細胞への組
換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポ
レーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション
法等が挙げられる。

【００４４】昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞な
どが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方
法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクシ
ョン法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。

【００４５】遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認
は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザ
ンハイブリダイゼーション法等により行うことができ
る。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プ
ライマーを設計してPCRを行う。PCRは、前記プラスミド
を調製するために使用した条件と同様の条件で行われ
る。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳
動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー
電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等に
より染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出
することにより、形質転換されたことを確認する。ま
た、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いて
PCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さら
に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、
蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採
用してもよい。

【００４６】４．植物の製造 本発明においては、上記形質転換植物細胞等から形質転
換植物体に再生することができる。再生方法としては、
カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変え
た培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物
体を得る方法が採用される。使用する培地としては、LS
培地、MS培地などが例示される。

【００４７】本発明の「植物体を製造する方法」は、上
記植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主
細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植
物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換
植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生
産する工程を含む。

【００４８】形質転換植物体から植物種子を得るには、
例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含
んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させ
て、花を形成させ、最終的に種子を形成させる。また、
種子から植物体を生産するには、例えば、形質転換植物
体上で形成された種子が成熟したところで、単離して、
水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させる
ことにより、植物体を生産する。このようにして育種さ
れた植物は、導入されたプロモーターのストレス応答性
に応じて、当該プロモーターの下流に位置する遺伝子を
発現することができる。例えば、当該プロモーターの下
流にキチナーゼ、グルカナーゼ等の植物体に病原性に対
する抵抗性を付与する機能を有する遺伝子を位置させる
ことによって、病害ストレス耐性植物となる。

【００４９】この病害ストレス耐性植物は、当該プロモ
ーターの下流に位置する抵抗性遺伝子によって獲得され
た抵抗性の効果が永続的に期待される。したがって、当
該病害ストレス耐性植物を用いれば、農薬による環境影
響を最低限に抑え、低投入持続型の農業生産を行うこと
が可能となる。

【００５０】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。 〔実施例1〕 プロモーターの単離 １．材料と方法 (1) Arabidopsis cDNAクローン Arabidopsisの全長cDNAライブラリーから単離した遺伝
子に加えて、RD（Responsive to Dehydration）遺伝
子、ERD（Early Responsive to Dehydration）遺伝子、
kin1遺伝子、kin2遺伝子、cor15a遺伝子、また内部標準
としてα-tubulin遺伝子、さらにネガティブコントロー
ルとしてマウスのニコチン酸アセチルコリンレセプター
のエプシロンサブユニット（nAChRE）遺伝子及びマウス
のグルココルチコイドレセプターの相同性遺伝子の計約
７０００個のcDNAをマイクロアレイ作成に用いた。

【００５１】陽性対照：乾燥誘導遺伝子（脱水応答性：
rd、及び初期脱水応答遺伝子：erd） 外部標準：λコントロール断片（Takara社製、TX803） 陰性対照：非特異的ハイブリダイゼーションを評価する
ためにArabidopsisのデータベースにある任意の配列と
は実質的にホモロジーを有さないニコチン性アセチルコ
リン受容体εサブユニット(nAChRE)遺伝子及びマウスグ
ルココルチコイド受容体ホモログ遺伝子

【００５２】(2) Arabidopsis 全長cDNAマイクロアレイ ビオチニル化CAPトラッパー法を用いて、本発明者はAra
bidopsisの植物体から、異なる条件（例えば、発芽から
成熟種子までの種々の成長段階における乾燥処理、低温
処理及び未処理）で全長cDNAライブラリーを構築した。
全長cDNAライブラリーから、本発明者は、約７０００個
の独立したArabidopsis全長cDNAをそれぞれ単離した。
公知の手法（Eisen and Brown, 1999）に従って、PCRで
増幅したcDNA断片をスライドグラス上の整列させた。本
発明者は、以下の遺伝子を含む約７０００個のArabidop
sisの全長cDNAを含有する全長cDNAマイクロアレイを調
製した。

【００５３】(3) cDNAマイクロアレイを用いた病害スト
レス誘導性遺伝子の単離 本例では、約７０００個のArabidopsisの全長cDNAを含
有する全長cDNAマイクロアレイを用いて、病害ストレス
誘導性遺伝子を単離した。病害ストレスを受けた植物及
びストレスを受けていない植物のCy3及びCy5蛍光標識プ
ローブを混合し、約７０００個のArabidopsisの全長cDN
Aを含有する全長cDNAマイクロアレイとハイブリダイズ
させた。一方のmRNAサンプルをCy3-dUTPで標識し、他方
のmRNAサンプルをCy5-dUTPで標識するcDNAプローブ対の
二重標識によって、マイクロアレイ上のDNAエレメント
への同時ハイブリダイゼーションが可能となり、２種の
異なる条件間(即ち、ストレス有り又はストレス無し)に
おける遺伝子発現の直接的な定量測定が容易になる。ハ
イブリダイズさせたマイクロアレイを、各DNAエレメン
トからのCy3及びCy5発光について２つの別個のレーザー
チャネルによって走査した。次いで、各DNAエレメント
の２つの蛍光シグナルの強度比を相対値として測定し、
マイクロアレイ上のcDNAスポットで表される遺伝子のデ
ィファレンシャル発現の変化を判定した。本実施例で
は、分析を行う２種の実験条件下で発現レベルがほぼ同
等であるλコントロール断片を外部対照遺伝子として使
用し、分析を行う２種の実験条件下で発現レベルを同等
に補正した。

【００５４】約７０００個のArabidopsisの全長cDNAを
含有する全長cDNAマイクロアレイにおける、病害ストレ
ス誘導性遺伝子の同定手順を示す。病害ストレスを負荷
した植物由来のmRNA及びストレスを受けていない野生型
植物由来のmRNAを、それぞれCy3-標識cDNAプローブ及び
Cy5-標識cDNAプローブの調製に使用した。これらのcDNA
プローブを混合し、cDNAマイクロアレイとハイブリダイ
ズさせた。本実施例では、２種の条件下で発現レベルが
ほぼ同等であるλコントロール断片を外部対照遺伝子と
して使用した。発現比率(ストレス有り／ストレス無
し、又は、ストレス無し／ストレス有り)が陰性対照の
３倍を超える遺伝子を、病害ストレスによって誘導され
る遺伝子とした。

【００５５】(4) 配列の解析 遺伝子配列のホモロジー検索をおこなうため、Kurabo製
プラスミド調製装置（NA 100）を用いて抽出したプラス
ミド DNAを配列解析に用いた。DNAシーケンサー（ABI P
RISM 3700. PE Applied Biosystems, CA, USA）を用い
てダイターミネーターサイクルシーケンス法によりDNA
配列を決定した。GenBank/EMBLデータベースをもとに、
BLASTプログラムを用いて配列のホモロジー検索を行っ
た。

【００５６】（5) cDNAの増幅 cDNAライブラリ作成用ベクターとして、λZAPII（Carni
nci et al.1996）を用いた。ライブラリー用のベクター
に挿入されたcDNAを、cDNAの両側のベクターの配列と相
補的なプライマーを用いてPCR法により増幅した。

【００５７】プライマーの配列は以下の通りである。 FL forward 1224：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA(配列番
号２２) FL reverse 1233：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA（配列
番号２３）

【００５８】100 μl のPCR混合液（0.25 mM dNTP，0.2
μM PCRプライマー，1 X Ex Taqバッファー，1.25 U E
x Taqポリメラーゼ （宝酒造製））に、テンプレートと
してプラスミド（1-2 ng）を加えた。PCRは、最初に94
℃で3分反応させた後、続いて95℃で1分、60℃で30秒及
び72℃で3分のサイクルを35サイクル、最後に72℃で3分
の条件で行った。PCR産物をエタノール沈澱させた後、2
5μlの3 X SSCに溶かした。0.7%アガロースゲルを用い
た電気泳動により、得られたDNAの質とPCRの増幅効率を
確認した。

【００５９】(6) cDNAマイクロアレイの作成 gene tipマイクロアレイスタンプマシンGTMASS SYSTEM
（Nippon Laser & Electronics Lab.製）を使って、0.5
μlのPCR産物（100-500 ng／ml）を384穴のマイクロタ
イタープレートからロードし、６枚のポリ-L-リジンで
コートしたマイクロスライドガラス（Matsunami製，S74
44）の上に280μmの間隔で5nlずつスポットした。DNAを
より等しくスポットするために、プリント後のスライド
を、熱した蒸留水を入れたビーカー内で湿らした後、10
0℃で3秒間乾燥させた。その後、スライドをスライドラ
ックに置きスライドラックをガラスチャンバーに入れ、
ブロッキング溶液（15mlの1 Mナトリウムホウ酸塩（pH
8.0），5.5g 琥珀酸無水化合物（Wako），及び335mlの1
-メチル-2-ピロリドン（Wako）を含む）をガラスチャン
バー注いだ。スライドラックを入れたガラスチャンバー
を上下に5回振ってさらに15分間静かに震盪し、その
後、熱湯を入れたガラスチャンバーにスライドラックを
移して5回振った後、2分間静置した。さらにその後、ス
ライドラックを95%エタノールを入れたガラスチャンバ
ーに移して5回振った後、30分間遠心（800rpm）した。

【００６０】(7) 植物材料とRNAの単離 植物材料として、Murashige-Skoog塩、2%のショ糖（和
光純薬社製）及び0.8%のバクトアガー(Difco社製)を含
むGM培地に播種して、24時間の明暗サイクルを明時間16
時間及び暗時間8時間として3週間栽培した（Yamaguchi-
ShinozakiとShinozaki，1994）野生型、シロイヌナズナ
（生態型：コロンビア）を用いた。病害ストレス処理に
は、黒すす病菌（Alternaria brassicicola (isolate O
-264)）を使用した。黒すす病菌は、不純物を除いたV8
vegetable juice (Campbell Soup社製)を含むアガー培
地で培養した。病害ストレスの付加は、5x10⁵胞子／ml
DWに調製した黒すす病菌を、上述したように培養したシ
ロイヌナズナに噴霧することで行った。接種後、22℃で
明時間16時間及び暗時間8時間のサイクルの条件下で、
静置し5、１０、２４及び４８時間後にサンプリングし
た。サンプリングした植物体は液体窒素で凍結し、TRIZ
OL Reagent (Life Technologies社製)を用いて全量RNA
を抽出した。続いて、mRNA isolation kit (Miltenyi B
iotec社製)を用いて全量RNAからmRNAを抽出した。

【００６１】(8) プローブの蛍光標識 Cy3 dUTP又はCy5 dUTP（Amersham Pharmacia）の存在下
でそれぞれのmRNAサンプルの逆転写を行った。逆転写反
応のバッファー（30μl）組成は表２の通りである。

【００６２】

【表２】

【００６３】42℃で1時間の反応を行った後、2つのサン
プル（Cy3でラベルしたもの及びCy5でラベルしたもの）
を混ぜ、15 μlの0.1 M NaOHと1.5 μlの20 mM EDTAを
加えて70℃で10分間処理し、さらにその後15μlの0.1 M
HClを加えた後、サンプルをMicro con 30 micro conce
ntrator（Amicon）に移した。400μlのTEバッファーを
加えてバッファー量が10〜20μlになるまで遠心し、流
出液を捨てた。400μlのTEバッファーと20μlの1mg/ml
ヒトCot-1 DNA (Gibco BRL)を加えて再び遠心した。ラ
ベリングの完了したサンプルを遠心によって回収し数μ
lの蒸留水を加えた。得られたプローブに2μlの10μg/
μl 酵母 tRNA 、2μlの1μg／μl pd（A）_12-18（Amer
sham Pharmacia）、3.4mlの20 X SSC、及び0.6μlの10%
SDSを加えた。さらに、サンプルを100℃で1分間変成処
理し、室温に30分間置いた後ハイブリダイゼーションに
用いた。

【００６４】(9) マイクロアレイハイブリダイゼーショ
ン及びスキャニング プローブをbenchtop micro centrifugeを用いて1分間の
高速遠心にかけた。泡の発生を避けるために、プローブ
をアレイの中央に置きその上にカバースリップをかぶせ
た。スライドガラス上に5μlの3 X SSCを4滴落として、
チェンバーを適度な湿度に保ち、ハイブリダイゼーショ
ン中のプローブの乾燥を防いだ。スライドガラスをハイ
ブリダイゼーション用のカセット（THC-1，BM機器）に
入れて密封した後、65℃で12〜16時間処理した。スライ
ドガラスを取り出してスライドラックに置き、溶液１
（2 X SSC，0.1%SDS）中でカバースリップを慎重にはず
した後ラックを振って洗浄し、ラックを溶液２（1 X SS
C）中に移して2分間洗浄した。さらにラックを溶液３
（0.2 X SSC）に移して2分間放置し、遠心（800rpm, 1m
in）にかけて乾燥させた。

【００６５】走査レーザー顕微鏡(ScanArray4000; GSI
Lumonics，Watertown，MA)を用いて1ピクセルあたり10
μmの解像度でマイクロアレイをスキャンした。マイク
ロアレイのデータ解析用プログラムとして、QuantArray
version 2.0 (GSI Lumonics社製）を用いた。

【００６６】(10) ノーザン解析 全量RNAを用いてノーザン解析を行った（Yamaguchi-Shi
nozakiとShinozaki，1994）。シロイヌナズナの全長cDN
AライブラリーからPCR法によって単離したDNA断片をノ
ーザンハイブリダイゼーションのプローブとして用い
た。

【００６７】(11) プロモーター領域の決定 データベース（GenBank/EMBL, ABRC）のシロイヌナズナ
のゲノム情報をもとに、遺伝子解析用プログラムBLAST
を用いてプロモーター領域を解析した。

【００６８】２．結果 (1) 病害ストレス誘導性遺伝子 ストレスを受けていないシロイヌナズナ植物から単離し
たmRNAから、Cy5-dUTPの存在下で逆転写を行って蛍光標
識cDNAを調製した。病害ストレス負荷後48時間から葉上
に過敏感細胞死様の病斑を形成し始めた。cDNAマイクロ
アレイによる解析の結果、病害ストレス負荷5時間後か
ら発現が上昇する遺伝子が多数認められた。

【００６９】なお、ストレスによって誘導された遺伝子
及び抑制された遺伝子は、それぞれ赤色及び緑色のシグ
ナルで表される。両方の処理においてほぼ同レベルで発
現した遺伝子は、黄色のシグナルとなる。各スポットの
強度は、各遺伝子の発現量の絶対値に相当する。低温誘
導性遺伝子(rd29A)は赤色のシグナルでとなり、λコン
トロール断片(外部対照)は黄色シグナルとなる。

【００７０】(2) プロモーター領域の同定 プロモーター領域を同定した結果、約７０００個のArab
idopsisの全長cDNAを含有する全長cDNAマイクロアレイ
において得られた、病害ストレス応答性を示す２１種の
遺伝子のプロモーター領域が得られた。これら２１種類
の遺伝子名とそのプロモーターの配列を表３にまとめ
た。

【００７１】

【表３】

【００７２】(3) ストレス処理と発現比率との関係 上述したように単離された２１種類の病害ストレス誘導
性遺伝子について、以下のように、病害ストレス負荷後
の経過時間と発現比率との関係を検討した結果を図１〜
図２１に示す。なお、２１種類の遺伝子と図面番号との
関係を表４に示した。

【００７３】

【表４】

【００７４】図１〜図２１において、縦軸は遺伝子の発
現比率を比較比率示しており、以下のように算出され
る。なお、下記式においてFIは、蛍光強度を示す。

【００７５】発現比率＝[（ストレス負荷条件での各cDN
AのFI）/（ストレスを負荷しない条件での各cDNAのF
I）]÷[(ストレス負荷条件でのλコントロール断片のF
I)/(ストレスを負荷しない条件でのλコントロール断片
のFI)]

【００７６】これら図１〜図２１に示すように、本方法
により単離されたストレス誘導性遺伝子は、それぞれ異
なるプロファイルであるが、病害ストレスの負荷により
発現誘導されていることが判る。このことから、これら
２１個の遺伝子の上流に位置し、配列番号１〜２１で示
される塩基配列は、病害ストレス応答性プロモーターと
して機能していることがわかった。

【００７７】

【発明の効果】本発明により、病害ストレス応答性プロ
モーターが提供される。本発明のプロモーターは、病害
ストレス耐性植物の分子育種に使用できる点で有用であ
る。本発明により、高等植物の病害ストレス応答・抵抗
性の分子機構の解明が前進すると考えられる。

【００７８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> A STRESS-RESPONSIVE PROMOTER <130> RJH13-160T <140> <141> <160> 23 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1000 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 tcttaaaaaa tattttctat aatgaaaaaa tcttaaattt tttttaaaag ttaataaatt 60 agaaaaatat ctctataaat taattaatta atcgataaat taaaacctct ataaattaat 120 ataatttttc ggtcctaaca ttattaattt atagaagttt tactgtaagt agaaagtggt 180 ttttggttta ggataaagtg catacgtttt gtgtacagtt ttggaattag ttttatcttt 240 ttcaaacatt ttagtgaatc atttggacta tgatcattag gacatcatga acttattatc 300 tatggtgggt ttgtggaaaa ctatttgatt agagttactg ttgcttaata atattaactt 360 cacaaaataa tcaaaatatg tttgttgttc ctataatact tttccacgaa agacttggga 420 ttcttttgat ttaagggtcc ctacacttta tgactcgtcg tccttatcca tatctccagc 480 tctataccca ccttgcattt tttttatttc cacacttctc cctcactgct cacgcttctc 540 atgatcaatg gtttgatcta tattataaca ttaatgttat atattaaggt cctttaaagt 600 aggcttatcc acatcctaat ttccaaagat ggcgtgtatt ttagctctaa accctggaag 660 ttgcatgtta tattaaaatg ttgtaaaatg 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Arabidopsis thaliana <400> 13 atgttgggaa tataatacgg acagtgttac acggtgtaac ttacaccgtt ggtccagctc 60 aatacacaaa tcaaatagaa cattatctat gttaaattct tatgcatgtt acaccaagtc 120 ggtaatatat attaaaaggt ttaaaacaaa tataagcaat tgaaattaaa tacaaaattg 180 agcttgttag tgggacattg tttaactaac ttctcatgga aattaaactc atcactcttg 240 ctatggttga gacattgttt aactaagttc tcatggaaaa aatggggcgc cacttaaggt 300 ataaaccaaa atatttgcgt taaaccctag ataagctaag atgccatgga aacaaaacac 360 tgggcgagtt ttcttctcgt gacaattatc atcaaaaatt atggaacaag ttgatcctaa 420 tcctaatcct cttatcaata tctttgattg tcttaaagtt tttatttatt ttatttcgtg 480 ataattgcat tgtcttaaag ttcatagttg cataataact ttatccccaa actttcatga 540 tctccacgga ccaaaaaaaa aaaaacttag gaattagttt accaaaaact ccaactactt 600 aaaatttcag atatttgttg tcagtattca aatactacac tcggaagttt cgttcgacta 660 tgatacatat tctcagttct tttttgatga ttcatggaag ataaatttga atatgaattc 720 tcctgttcgt tataaattat tgtaataaag acttaaagag tgatccagct tcatctcttt 780 atccacaaat gctattcccg tcacataaaa atgccaaaaa aagaaaaaaa 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attaagaaga aaatacataa ttattactaa 480 ataatgtgta ttattatacg attccaactt ttatttgata atgatttttg agcaaatcag 540 gttgataggt atgattgaga ccatcgccca aactacacct taaggtctta ctattagaaa 600 caaacaattc atttgggaat tgaaaccaaa gtcatctatg gaagtaacct caaaatttat 660 ctaagaaaca gtgatgtatt agaatggtca agtcaactta ttcacaaaat tacaaaacta 720 tcgtttataa atatataatc tatttttcac ttgtgttaca cgattcctct tttgatatgc 780 aggaagaaga gaagatctta caacggctag aaatagaaaa cttaatgtgc tattaattac 840 aacttaccaa ctaattagaa ctttctatat gaaccggatc ttctacagca aatcacggtc 900 aattcaaaat attcatctct ctctctctct ccacatggac aagacatgat taagaaagta 960 tataaaagaa acagagcaga gaaagacatt ttgttccggt 1000 <210> 20 <211> 1000 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 20 gacccatttg gactacaatg tgtggaaaat tactgcatgt tcaatatcag aaaacttgga 60 taacatgtct tcgatatggg cttttcttat tttgtacccg tgtaatttcg ctggcccaaa 120 atccaaagca acaagggtaa atttgtatgc agtacatgtg gcatgttggg tcatatggaa 180 acaggtcaca agactcagat tctttacatt gcggcgggta gtagtagctt tctagtctac 240 cttgagattg cccctgcccg tgattcttga gtcgggcaca ggaagtggtt ttctgtcaac 300 tttacttgct caagccatcc ccgcaaggta gaaacttctg tggtctttct cgttatttct 360 tatgtaccat gtttttggtc gtttgtgtag tttcttctaa ccttccacac acttgtcttg 420 cgaattcctt ccacagcaga gatgttaaat caggaatatt caggatgtag aaacttctct 480 gctctttctc aagtagaatg cacttgtgga atccctcaga tcagatttca ttggtaacgt 540 tcgttaactt caacaacaac actttactaa acatgtgcta atcaattgtc atacgcttgt 600 atttcttcga ttcattttta tcttatgcaa gtgttttctc tattatgatt tatttagttt 660 tgcataaata aggacactcc ttcggagtca gtataagaaa actataacct aaaatataaa 720 ttaggcaaat gtccactcac ccatccaaaa ttccattgta aataaatgtt tctttcaaat 780 aaatgaaaaa aaaaaaaaaa aacaagttgg aagaaggaac caaccaagta attgccagtc 840 aaaggaggcg actcacactt gaaaggataa gctgacatgg cagacaacga tcctgcgtag 900 aaattgcgtg aacgtggaaa agtttgagga tatagccgtc atttcaaata attcgggtac 960 tattatataa ggcttcaagt cctggttcgt agtacaaatt 1000 <210> 21 <211> 1000 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 21 caccatgcca aagtataatc aaattgctac aaaattgtat tttgtaggca agtatatcta 60 gcgaaaggta taactggtag ttgcctaaaa ataagaagaa ggtataactg gtataaagaa 120 aaacatgtgg gaagttcata ttcaaggaag gcaaacaaac ctatgtgttg atttgttata 180 tataagaaaa aataaactcc actagctgcg tatgagataa gtttcttaag ttcgcaagct 240 gtgtatgagg tgtacgtcaa agcgaaagat ccctaattag taattttatt tggtgaaact 300 cttgtaaccg attttatagc cataagtaaa aatgtttgtt tttataactg ttaaaattta 360 aaacaatatt tcattgtgag agagttacac acaagaatat atgtctttaa ttttttttta 420 gttccctaca aaatcatttg gtaaatactg tatatatagt tacattgagc gttaaattat 480 tttcaagaaa ataattttcc gatgttgtgc atgcaatttc ccacctagga tattattatg 540 tttcccaacc ccgaaatatc attaaaaaaa aaaaattagt ttgagaggga attactttta 600 aatcttagta tatttcctga ctccaaaata ttacgaattt tggtctaact ttttttggtc 660 atctaaacga aaactgtctg caaaaaaaaa aaaacgttta caatttacct tcacaaataa 720 caaaactcgt tatctaagat atgagaaagt ataatttatt tcaaatatat taatttaatt 780 tgatgaaaaa attgtattcg ttcccttcaa atgtaaccct tggcttagat ttatttttgt 840 caattactat aaacttactg taaattacat acaaccttaa aatctccaaa atgaaactat 900 tgaccaaaaa aaaaaaaaaa aaattttaat aaacctgaaa attaagtaag aaaacgtgta 960 tgttaagtgt atatatatta cagtcacctt ccattactct 1000 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 22 cgccagggtt ttcccagtca cga 23 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 23 agcggataac aatttcacac agga 24

【００７９】

【配列表フリーテキスト】配列番号22及び23は合成プラ
イマーである。

【図面の簡単な説明】

【図１】RAFL02-02-B06について病害ストレス負荷経過
時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図２】RAFL04-16-P21について病害ストレス負荷経過
時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図３】RAFL05-04-E02について病害ストレス負荷経過
時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図４】RAFL05-07-A18について病害ストレス負荷経過
時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図５】RAFL05-07-L13について病害ストレス負荷経過
時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図６】RAFL05-08-N24について病害ストレス負荷経過
時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図７】RAFL05-10-H24について病害ストレス負荷経過
時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図８】RAFL05-15-F19について病害ストレス負荷経過
時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図９】RAFL05-18-N16について病害ストレス負荷経過
時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図１０】RAFL05-21-N20について病害ストレス負荷経
過時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図１１】RAFL06-08-I05について病害ストレス負荷経
過時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図１２】RAFL07-15-D01について病害ストレス負荷経
過時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図１３】RAFL07-16-B09について病害ストレス負荷経
過時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図１４】RAFL08-11-M14について病害ストレス負荷経
過時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図１５】RAFL08-17-G11について病害ストレス負荷経
過時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図１６】RAFL09-11-E10について病害ストレス負荷経
過時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図１７】RAFL09-15-D03について病害ストレス負荷経
過時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図１８】RAFL09-18-K24について病害ストレス負荷経
過時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図１９】RAFL11-07-N15について病害ストレス負荷経
過時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図２０】RAFL05-12-B21について病害ストレス負荷経
過時間と発現比率との関係を示す特性図である。

【図２１】RAFL09-14-P05について病害ストレス負荷経
過時間と発現比率との関係を示す特性図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ (72)発明者 鳴坂 義弘 兵庫県神戸市東灘区住吉山手７−３−４ 神戸大学住吉宿舎Ａ301 (72)発明者 鳴坂 真理 兵庫県神戸市東灘区住吉山手７−３−４ 神戸大学住吉宿舎Ａ301 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD10 4B024 AA08 CA04 DA01 FA02 GA11 HA12 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC20 BA02 CA53

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)、(b)又は(c)のDNAを含む、病
   害ストレス応答性プロモーター。 (a) 配列番号１〜２１から選ばれるいずれかの塩基配列
   からなるDNA (b) 配列番号１〜２１から選ばれるいずれかの塩基配列
   において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付
   加された塩基配列からなり、かつ病害ストレス応答性プ
   ロモーターとして機能するDNA (c) 配列番号１〜２１から選ばれるいずれかの塩基配列
   からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ
   イズし、かつ病害プロモーターとして機能するDNA
2. 【請求項２】 病害ストレスが黒すす病菌（Alternaria
   brassicicola）の感染によるストレスである請求項１
   記載のプロモーター。
3. 【請求項３】 請求項１又は２いずれか一項記載のプロ
   モーターを含む発現ベクター。
4. 【請求項４】 請求項３記載の発現ベクターに、さらに
   任意の遺伝子が組み込まれた発現ベクター。
5. 【請求項５】 請求項３又は４記載の発現ベクターを含
   む形質転換体。
6. 【請求項６】 請求項３又は４記載の記載の発現ベクタ
   ーを含むトランスジェニック植物。
7. 【請求項７】 植物が、植物体、植物器官、植物組織又
   は植物培養細胞である請求項６記載のトランスジェニッ
   ク植物。
8. 【請求項８】 請求項６又は７記載のトランスジェニッ
   ク植物を培養又は栽培することを特徴とするストレス耐
   性植物の製造方法。