WO2013077501A1

WO2013077501A1 - 나노 구조를 갖는 세포 배양용 용기와 그 제조 방법

Info

Publication number: WO2013077501A1
Application number: PCT/KR2012/002267
Authority: WO
Inventors: 김동성; 이수홍; 차경제; 박광숙
Original assignee: POSTECH Academy Industry Foundation
Current assignee: POSTECH Academy Industry Foundation
Priority date: 2011-11-24
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2013-05-30
Anticipated expiration: 2014-05-24
Also published as: KR20130057801A; KR101407605B1; US20140295539A1

Abstract

본 발명에 따른 나노 구조를 갖는 세포 배양용 용기는 성체 줄기세포를 점착하여 줄기세포를 증식 및 분화시키기 위한 세포 배양면을 포함하는 세포 배양용 용기에 있어서, 세포 배양면은 세포 배양면 상에서 일정한 간격을 두고 배치되는 나노 구조물을 포함하고, 나노 구조물은 세포 배양면으로부터 돌출한 나노 기둥을 포함하고, 나노 기둥의 폭은 40 nm 내지 500 nm 사이의 범위이고, 나노 기둥의 높이는 10nm 내지 1 ㎛ 사이의 범위이다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

나노 구조를 갖는 세포 배양용 용기와 그 제조 방법

【기술분야】

<1> 본 발명은 세포 배양용 용기 및 그 제조 방법에 관한 것으로서， 보다 상세하 게는 세포 배양면에 나노구조를 포함하여 부착， 증식 및 분화 효율을 향상시킨 세 포 배양용 용기 및 그 제조 방법에 관한 것 이다. 、

【배경기술】

<2> 현재 사람 몸 속의 세포 (특히， 줄기세포)를 체외에서 배양한 다음 이를 다시 환자의 몸 속에 넣어 질환올 치료하는 세포 치료가 확대되고 있다. 이에 따라 저가 의 쉬운 방법에 의해 세포의 증식과 분화 효율올 향상 시 킬 수 있는 배양 방법과 배양계 (cul ture system)에 대한 관심 이 높아지고 있다. 이 러 한 배양계에는 다양한 기기들이 관계하고 있으며 , 이에 있어서 세포배양액과 세포를 담을 수 있는 세포 배양용 용기가 중요한 요소 중 하나이다.

<3> 일반적으로 많은 동물세포들이 부착 의존성올 갖고 있는데 , 이 런 경우 플라 스틱 이나 글래스 재질의 평판에 세포 부착성 단백질이 균일하게 도포된 세포 배양 용 용기를 이용하여 세포를 바닥에 부착시킨 후 , 증식 및 분화의 과정올 거 치면서 세포를 배양한다. 이와 같이， 인공적으로 만들어진 세포 배양용 용기는 원래 세포 가 안주하고 있는 세포 외 기질과는 다른 표면 특성을 갖고 있어， 세포 증식 및 분 화 효율이 저하될 수 있다. 실제로， 세포들이 인공적으로 증식 한 후 임상 치료에 이용되고 있으나， 환자 치료를 위 한 줄기세포 등을 포함하는 각종 세포의 분화 유 도가 쉽게 성공하지 못하고 있는 문제가 있다 .

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

<4> 본 발명은 상기 한 문제점을 해결하기 위 한 것으로서 , 세포 배양용 용기에 나 노구조를 도입하여 세포가 원래 안주하고 있는 환경올 모사한다. 이를 통해 성체 줄기세포를 비룻한 각종 세포의 부착， 증식 및 분화 효율을 높이는 것올 목적으로 한다.

<5> 또한， 본 발명은 세포 배양용 용기와 나노구조를 동시에 성 형할 수 있는 대 량생산 방식으로 나노구조를 포함하는 세포 배양용 용기를 제작하여 세포의 증식 및 분화에 드는 비용을 절감하는 것올 목적으로 하고 있다.

【기술적 해결방법】 <6> 상기 한 과제를 달성하기 위한 본 발명에 따른 나노 구조를 갖는 세포 배양용 용기는 성 체 줄기세포를 점착하여 줄기세포를 증식 및 분화시 키기 위 한 세포 배양 면을 포함하는 세포 배양용 용기에 있어서， 세포 배양면은 세포 배양면 상에서 일 정 한 간격올 두고 배치되는 나노 구조물올 포함하고， 나노 구조물은 세포 배양면으 로부터 돌출한 나노 기등을 포함하고 , 나노 기등의 폭은 40 nm 내지 500 nm 사이의 범위 이고， 나노 기등의 높이는 10nm 내지 1 jam 사이의 범위 이다.

<7> 상기 나노 기등은 반원 형상의 기단과， 기단으로부터 일정 한 폭으로 돌출하 며 상부가 반원 형상을 이루는 기등으로 이루어지는 나노 구조를 가질 수 있다.

<8> 상기한 과제를 달성하기 위한 다른 나노 구조를 갖는 세포 배양용 용기는 성 체 줄기세포를 점착하여 증식 및 분화시 키기 위 한 세포 배양면올 포함하는 세포 배 양용 용기에 있어서， 세포 배양면은 세포 배양면 상에서 일정 한 간격을 두고 배치 되는 나노 구조물을 포함하고， 나노 구조물은 세포 배양면으로부터 오목한 나노 기 공을 포함하고 , 나노 기공의 폭은 40 nm 내지 500 nm 사이의 범위 이고， 나노 기공 의 깊이는 10nm 내지 1/ 사이의 범위 이다.

<9> 상기 세포 배양면은 열가소성 수지， 열경화성 수지 및 탄성중합체 중 적어도 하나로 이루어지는 나노 구조를 가질 수 있다.

<ιο> 상기 세포 배양용 용기는 표면에 플라즈마 처리， 오존 처리 또는 세포 점착 증진 물질의 코팅 중 어느 하나가 처 리되어 있을 수 있다.

<11> 상기 한 다른 과제를 달성하기 위 한 나노 구조를 갖는 세포 배양용 용기의 제 조 방법은 2단계 양극산화알루미늄 공정을 이용하여 예비 기공을 포함하는 알루미 늄 템플릿을 형성하는 단계， 알루미늄 템플릿 위에 고분자 물질층올 형성하고， 고 분자 물질충 상부를 알루미늄 템플릿으로 가압하여 고분자 템플릿을 형성하는 단 계， 고분자 템플릿 및 알루미늄 템풀릿의 표면에 씨 앗층올 형성하는 단계， 씨앗층 위에 금속을 도금한 후 고분자 템플릿과 알루미늄 템플릿올 제거하여 금속 몰드를 형성하는 단계 , 그리고 금속 몰드 위에 세포 배양용 고분자 물질층올 형성 한 후 금 속 몰드를 제거하여 나노 구조물이 형성된 고분자 물질로 이루어지는 세포 배양면 올 형성하는 단계를 포함한다.

<12> 、 상기 금속 몰드는 니켈， 철 구리， 은， 금 및 아연 주석—납 합금 중 적어도 하나를 포함하여 이루어지는 나노 구조를 가진다.

<13> 상기 세포 배양면올 형성하는 단계는 캐비티를 포함하는 게 1 금형 , 캐비티 내에 금속 몰드를 장착하는 단계 , 게 1 금형과 일정 한 간격을 두고 제 2 금형올 정 렬 하는 단계， 제 1 금형과 제 2 금형 사이에 세포 배양용 고분자 물질층을 형성하기 위 한 수지를 주입하는 단계， 수지를 경화시킨 후 제 1 금형과 제 2 금형올 제거하여 세 포 배양면이 바닥에 형성된 세포 배양용 용기를 완성하는 단계를 더 포함한다.

<14> 상기 수지는 열가소성 수지， 열경화성 수지 또는 탄성중합체 중 적어도 하나 로 이루어지는 나노 구조를 가진다.

<15> 상기 세포 배양용 용기는 표면에 플라즈마 처 리， 오존 처 리 및 세포 점착 증 진 물질의 코팅 중 어 느 하나의 처리를 실시하는 단계를 더 포함할 수 있다.

<16> 상기 배양면올 형성하는 단계는 사출 성 형， 핫엠보싱， UV—몰딩， 주조 중 어 느 하나로 형성하는 나노 구조를 가질 수 있다.

【유리 한 효과】

<17> 본 발명의 한 실시 예에 따른 세포 배양용 용기에 의하면， 나노 구조가 세포 의 증식 및 분화에 영 향을 주어 줄기 세포를 특정 세포로의 분화를 유도하거나 그 효율을 높일、수 있다.

<18> 또한，^' 나노구조를 포함하는 세포 배양용 용기는 대량생산이 가능하여 세포 배양을 위 한 비용과 시간을 절감시킬 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

<19> 도 1은 본 발명의 한 실시 예에 따른 세포 배양용 용기를 나타내는 개략도이 다.

<20> 도 2는 본 발명의 한 실시 예에 따른 세포 배양용 용기의 일면에 형성된 세포 배양면을 확대하여 나타내는 도면이다.

<2i> 도 3은 도 2의 I I I -I I I 선을 따라 절단한 단면도이다.

<22> 도 4는 본 발명의 다른 실시 예에 따른 세포 배양용 용기의 세포 배양면의 부 분 확대 단면도이다.

<23> 도 5 내지 도 9는 본 발명의 한 실시 예에 따라 세포 배양용 용기를 제조하는 공정올 순차적으로 나타내는 도면이다.

<24> 도 10은 본 발명의 다른 실시 예에 따라 세포 배양용 용기를 제조하는 공정을 설명하기 위 한 장치의 개략적 인 도면이다.

<25> 도 11은 본 발명의 한 실시예와 비교예에서 각각 지방유래 줄기세포를 배양 하여 광학 현미경을 통해 6일째에 관찰한 사진이다.

- <26> 도 12는 본 발명의 한 실시 예와 비교예에서 각각 지방유래 줄기세포를 배양 하여 지방유래 줄기세포의 부착률과 증식를을 나타낸 그래프이다.

<27> 도 13은 본 발명의 한 실시 예와 비교예에서 각각 지방유래 줄기 세포의 국부 점착 ( local adhesion) 형 태를 비교한 사진이다. <28> 도 14 및 도 15는 본 발명의 한 실시예와 비교예에서 각각 지방유래 줄기세 포를 지방세포로 분화 유도하여 이를 비교한사진과 그래프이다.

<29> 도 16 및 도 17은 본 발명의 한 실시예와 비교예에서 각각 지방유래 줄기세 포를 골세포로 분화 유도하여 이를 비교한사진과 그래프이다.

【발명의 실시를 위한 형태】

<30> 그러면 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속 하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

<31> 도면에서 여러 층 및 영역올 명확하게 표현하기 위하여 두께를 확대하여 나 타내었다. 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 동일한 도면 부호를 붙였 다. 충， 막， 영역， 판 등의 부분이 다른 부분 "위에" 있다고 할 때, 이는 다른 부 분 "바로 위에" 있는 경우 뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포 함한다. 반대로 어떤 부분이 다른 부분 "바로 위에" 있다고 할 때에는 중간에 다른 부분이 없는 것을 뜻한다.

<32> 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며， 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참조 부호를 붙이도록 한다.

<33> 도 1은 본 발명의 한 실시예에 따른 세포 배양용 용기를 나타내 개략도이 다.

<34> 도 1을 참조하면 , 본 실시예에 따른 세포 배양용 용기 (100)는 그 일면에 세 포 배양면 (11)을 포함한다. 상기 일면은 세포 배양용 용기 (100)의 바닥면일 수 있 다.

<35> 세포 배양면 (11)은 인공적으로 세포의 증식 및 분화 효율을 향상시키기 위한 것으로， 배양하고자 하는 세포를 세포 배양면 상에 점착시켜 원하는 방향으로 분화 를 유도하게 된다. 성체 줄기세포에는 골수유래 줄기세포， 태반유래 줄기세포， 지 방유래 줄기세포 등이 있는데， 본 실시예에 따른 세포 배양용 용기는 이러한 성체 줄기세포의 증식 효율올 향상시키고， 목적 세포로의 분화 효율을 향상시키기 위한 것이다.

<36> 도 2 내지 4를 참조하여 본 발명의 한 실시예에 따른 세포 배양용 ·8「기의 세 포 배양면에 대해서 구체적으로 설명한다.

<37> 도 2는 본 발명의 한 실시예에 따른 세포 배양용 용기의 일면에 형성된 세포 배양면올 확대하여 나타내는 도면이고， 도 3은 도 2의 Ι Ι Ι-Π Ι선올 따라 절단한 단 면도이고， 도 4는 본 발명의 다른 실시 예에 따른 세포 배양용 용기의 세포 배양면 의 부분 확대 단면도이다.

<38> 도 2 내지 도 4를 참고하면， 세포 배양면 (11)에는 세포가 점착할 수 있는 나 노 구조물 (22)이 형성되어 있다.

<39> 나노 구조물 (22)은 세포 배양면 (11)의 표면으로부터 도 3에서와 같이 오목한 나노 기공 또는 도 4에서와 같이 돌출한 나노 기둥을 포함한다.

<40> 도 3의 나노 기공 (202)은 세포 배양면 (11)의 하부로 오목하게 형성되어 있 다. 나노 기공 (202)은 일정한 폭의 관형태로 길게 뻗어 있으며， 그 단면의 하부와 상부는 등근 반원 형 태이다. 상부의 등근 반원은 하부의 등근 반원보다 넓은 지름 으로 형성될 수 있으며， 나노 기공과 나노 기공 사이의 단면은 끝이 뾰족한 첨탑구 조를 가질 수 있다.

<4i> 나노 기공은 40nm 내지 500nm의 범위에서 균일한 직경 (D)으로 형성될 수 있 으며， 바람직하게는 200nm일 수 있다. 그리고 깊이 (H1)는 10nm 내지 1皿 범위로 형성될 수 있으며， 바람직하게는 500nm일 수 있다. 이 때， 나노 기공의 종횡비는 1 내지 5일 수 있다. 또한， 본 발명의 한 실시 예에서 나노 기공은 약 500nm 정도의 일정 한 간격 (W)을 두고 배치 된다.

<42> 그리고 도 4의 나노 기둥 (204)은 기단부 (204a)와， 기단부 (204a)로부터 일정 한 폭으로 돌출하며 상부가 반원인 돌출부 (204b)로 이루어진다.

<43> 도 4의 나노 기등 (204)은 40nm 내지 500nra의 범위에서 균일한 직경 (D)으로 형성될 수 있으며， 바람직하게는 200ηηι일 수 있다. 그리고 높이 (H)는 10nm 내지 1 범위로 형성될 수 있으며， 바람직 하게는 500nm일 수 있다. 이 때， 나노 기둥의 종 횡비는 1 내지 5일 수 있다. 또한， 본 발명의 한 실시 예에서 나노 구조는 약 500nm 정도의 일정 한 간격 (W)을 두고 배치된다.

<44> 세포 배양면은 열가소성 수지 인 폴리스티 렌 (polystyrene, PS)으로 형성될 수 있으며， 폴리 메틸메타크릴레이트 (polymethyl methacrylate , P醒 A)， 폴리카보네이트 (polycarbonate , PC) 등의 열가소성 수지 또는 열경화성 수지를 사용할 수 있다. 또한 폴리디메틸실록산과 같은 탄성중합체로 형성할 수도 있다.

<45> 본 발명에서와 같이 다수의 나노 구조몰 (22)들이 균일한 크기로 형성되고 일 정 한 간격을 두고 배치됨으로써， 세포의 부착， 증식 및 분화에 영 향을 주어 세포의 분화를 원하는 방향으로 유도하거나 그 효율을 높이는 역할올 한다. 그리고 세포 배양면 상에서 세포의 부착력을 향상시 키기 위 한 표면의 플라즈마 처리， 오존 처 리 또는 세포 점착 증진 물질의 코팅 등의 추가적인 처리를 할수도 있다.

<46> 이하에서는 도 5 내지 도 9를 참조하여 본 발명의 한 실시예에 따라 세포 배 양용 용기를 제조하는 방법을 설명한다.

<47> 도 5 내지 도 9는 본 발명의 한 실시예에 따라 세포 배양용 용기를 제조하는 공정을 순차적으로 나타내는 도면이다.

<48> 먼저, 도 5에 도시한 바와 같이， 2단계 알루미늄 양극산화(^0^ 3^0 공 정을 통해서 알루미늄 템플릿 (alumina template)(10)을 제작한다. 양극 산화 알루 미늄 공정올 실시하면 알루미늄 기판 위에 양극산화된 알루미나가 부착되면서 예비 기공 (2)을 포함하는 알루미나층이 형성된다. .

<49> 예비 기공 (2)은 알루미늄 양극 산화 공정에서 사용되는 전해질, 양극산화 전 압， 시간, 확장 시간 등에 의해 조절할 수 있다. 본 발명의 한 실시예에서는 2단계 알루미늄 양극 산화 공정 조건을 조절하여 예비 기공 (2)의 직경은 200 nm으로 깊이 는 500 nm으로 조절하였다.

<50> 다음으로， 도 6에 도시한 바와 같이， 핫 엠보싱 (hot embossing) 공정을 통해 고분자 물질층의 상부에 알루미늄 템플릿 (10)의 형상을 전사한다. 이후 알루미늄 템플릿 (10)을 제거하여 고분자물질로 이루어진 고분자 템폴릿 (20)을 완성한다.

<5i> 다음으로, 도 7에 도시한 바와 같이， 알루미늄 템풀릿 (10)과 고분자 템플릿

(20) 위에 씨앗충 (seed layer)(30)올 형성한다. 씨앗충 (30)은 전기 전도성 물질인 금， 구리， 또는 니 을 CVD( chemical vapor deposit ion) 또 ALD(atomic layer deposition) 등의 방법으로 증착하여 형성할 수 있다. 씨앗층은 약 20 nm로 형성한 다.

<52> 다음으로， 도 8에 도시한 바와 같이, 씨앗층 (30)이 증착된 알루미늄 템플릿

(10)과 고분자 템플릿 (20) 위에 금속을 도금한다.

<53> 금속은 알루미늄 보다 경도가높아마모성이 우수한 금속으로 형성하는 것이 바람직하며， 예를 들어 니켈， 철， 구리， 은， 금， 아연 주석—납 합금 동올 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

<54> 본 발명의 한 실시예에서는 니켈 도금 공정을 실시할 수 있으며， 니켈 도금 공정에서 니켈 도금 용액은 50^° C 내지 55^° C의 온도， 3.7 pH 내지 4.2pH 조건하에 서 실시한다. 또한 전류 밀도는 ImA/m² 이하에서 실시하며， 이때 도금 공정 과정에 서 생기는 잔류 응력을 최소화하기 위해서 전류 밀도를 단계별로 증가시키면서 도 금 공정을 실시한다.

<55> 이어서, 금속 도금충으로부터 알루미늄 템플릿 (10)과 고분자 템플릿 (20)올 제거하여 금속 몰드 (300)를 얻는다.

<56> 다음으로， 도 9에 도시한 바와 같이， 금속 몰드 (300)를 이용하여 나노 구조 물 (22)이 형성된 세포 배양면 (11)을 포함하는 기판을 제작한다.

<57> 금속 몰드 (300) 위에 세포 배양용 고분자물질충올 형성한 후 핫엠보싱 방법 으로 가압하면 고분자 물질층의 상부는 금속 몰드 (300)의 상부와 동일한 형태로 전 사된다.

<58> 본 발명의 한 실시예는 고분자 물질층올 폴리스티렌으로 형성할 수 있다. 이때， 폴리스티렌의 유리전이은도 (glass transition temperature: Tg) 보다 5° C 내지 20^° _. C 높은 온도의 엠보싱 온도와 5 MPa 내지 10 MPa 범위의 엠보싱 압력으로 가압하였다.

<59> 본 발명의 한 실시예에서는 세포 배양면올 폴리스티렌올 이용하지만， 이에 한정되는 것은 아니다. 즉， 세포 배양면을 폴리스티렌 이외의 열가소성 수지 또는 열경화성 수지를 사용하여 형성할 수 있으며， 폴리디메틸실록산과 같인 탄성증합체 로도 형성할수 있다.

<60> 한편， 본 발명의 한 실시예에서 세포 배양용 용기는 세포 배양용 고분자 물 질로 이루어지는 세포 배양면올 포함하는 기판을 별도로 제작하여 용기에 부착하는 것이 아니라 일체로 형성할수 있다.

<61> 이에 대해서는 도 10을 참조하여 구체적으로 설명한다.

<62> 도 10은 본 발명의 다른 실시예에 따라 세포 배양용 용기를 제조하는 공정을 설명하기 위한 장치의 개략적인 도면이다.

<63> 도 10에 도시한 바와 같이, 캐비티 (40)를 포함하는 금형 (400)을 준비한다.

<64> 금형 (400)은 캐비티 (40)를 포함하는 제 1 금형 (402)과 제 1 금형 (402)과 일정 한 간극 (S)을 두고 맞물리도록 배치되는 제 2 금형 (404)을 포함한다. 제 2 금형

(404)은수지가주입되는 주입구 (42)가 형성되어 있다.

<65> 이후 캐비티 (40) 내에 도 5 내지 도 9의 방법으로 형성한 금속 몰드 (300)를 배치한다.

<66> 그리고 제 2 금형 (404)의 주입구 (42)를 통해서 세포 배양용 용기를 형성하기 위한성형용수지를 주입한다.

<67> 수지는 수지 주입 장치 (500)를 통해서 주입되며, 수지 주입 장치 (500)는 수 지를 담는 호퍼 (52)， 호퍼 (52)의 하부와 연결되어 있으며 금형의 주입구 (42)에 삽 입 가능한 노즐 (도시하지 않음)올 포함하는 실린더 (54)로 이루어진다. 실린더 내에 는수지를 이동시키기 위한 스크류 (도시하지 않음)가위치한다. <68> 호퍼 (52)로부터 수지가 실린더 (54) 내부로 공급되면， 수지는 실린더 (54) 내 에서 히터를 통해 가열되어 유동 상태가 된다. 그러면 스크류에 의해서 수지가 노 즐 쪽으로 이동하고， 노즐올 통해서 유동 상태의 수지가 금형의 간극 (S)과 캐비티 (40) 내로 주입된다.

<69> 수지 주입 이 완료되면 주입된 수지를 냉각하여 세포 배양용 용기를 완성 한 다.

<70> 수지 는 계 1 금형 (402)과 제 2 금형 (404) 사이의 간극 (S)에 주입되므로 간극

(S)의 모양대로 세포 배양용 용기가 형성된다. 그리고 캐비티 (40) 내에도 주입되 어 캐비티 내에 위 치하는 금속 몰드의 형 태대로 세포 배양용 용기의 바닥면에 나노 구조물이 형성된다. 따라서 나노 구조물올 포함하는 세포 배양면은 세포 배양용 용기와 일체로 형성된다.

<71> 또한， 세포 배양면은 사출 성 형， 핫엠보싱， UV-몰딩， 주조 중 어느 하나로도 형성할 수 있다.

<72> 본 발명의 한 실시 예에서와 같이 세포 배양용 용기를 제작하면 나노 구조물 이 형성된 세포 배양면과 용기를 일체로 형성할 수 있어 , 세포 배양용 용기를 제작 하는 공정 이 단순해진다. 따라서 시간 및 비용을 절감할 수 있게 된다. 본 실시 예 에 따른 제조 방법에서 사용하는 수지는 폴리메틸메타크릴레이트， 폴리스티 렌， 폴 리카보네이트 등의 열가소성 수지를 사용하는 것 이 바람직하다.

<73> 이하에서는 도 11 내지 도 17을 참고하며 본 발명의 한 실시예에 따른 세포 배양용 용기에서 지방유래 줄기세포를 부착， 증식 및 분화하였올 때의 영 향올 비교 예와 비교하여 설명 한다.

<74> 본 발명의 실시 예 1은 세포 배양용 용기의 세포 배양면올 폴리스티 렌으로 형 성하고， 세포 배양면은 나노 구조물 (22)로 직경 200nm, 높이 500ηηι의 나노 기등을 포함한다.

<75> 그리고 실시 예 2는 세포 배양용 용기의 세포 배양면을 폴리스티 렌으로 형성 하고， 세포 배양면은 나노 구조물 (22)로 직경 200nm, 깊이 500rai의 나노 기공을 포 함한다. 각 나노 구조물 (22)은 400nm 내지 500 nm 간격올 두고 배치되도록 형성하 였다.

<76> 비교예는 어떠 한 구조물도 형성하지 않은， 편평 한 세포 배양면을 갖는 세포 배양용 용기에서 동일한 실험을 수행한 경우이다.

<77> 먼저 , 도 11은 본 실시 예와 비교예에서 각각 지방유래 줄기세포를 배양하여 광학 현미경올 통해 6일째에 관찰한 사진이다. <78> 도 11을 참조하면， 비교예에서는 세포가 표면에 비교적 넓게 관족 (podia)을 형성하였다. 그리고 본 실시예 1 및 2에서는 지방유래 줄기세포가 나노 구조의 돌 출부에 부착하고 관족올 좁게 형성하고 있는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 실 시예 1 및 2에서도 지방유래 줄기 세포가성공적으로 증식되는 것올 알수 있다.

<79> 도 12는 비교예， 본 발명의 실시예들에서 지방유래 줄기세포의 부착를과 증 식률을 나타낸 그래프이다.

<80> 도 12를 참조하면, 본 발명의 실시예 1 및 2에서 배향한 지방 유래 줄기 세 포가 비교예보다 세포 부착률이 각각 10¾>, 30% 정도 증가함을 알 수 있다. 또한, 본 실시예 모두 증식률이 시간이 지남에 따라꾸준하게 증가되는 것이 관찰되었다.

<8i> 도 13은 본 발명의 실시예와 비교예에서 각각 지방유래 줄기 세포의 국부 점 착 (local adhesion) 형태를 비교한사진이다.

<82> 도 13을 참조하면, 비교예， 실시예 1 및 2에 모두 지방유래 줄기 세포가 서 는 지방유래 줄기 세포가 나노 기공 구조에서 국부 점착 지점올 적게 형성하고 있 으며， 세포 골격도 적게 형성하고 있다. 반면 나노 기등 구조에서 지방 유래 줄기 세포가 국부 점착 지점이 작지만 많이 형성하고 있으며 세포 골격 형성도가 증가됨 을 확인할수 있다.

<83> 도 14 및 도 15는 본 발명의 실시예와 비교예에서 각각 지방유래 줄기세포를 지방세포로 분화 유도하여 이를 비교한사진과 그래프이다.

<84> 도 14 및 도 15를 참조하면, 나노 기공을 가지는 실시예 2에서 나노 기등을 가지는 실시예 1 및 비교예에서 배양한 지방유래 줄기세포보다 지방세포로의 분화효 율이 상대적으로 높게 나타남을 확인할 수 있다.

<85> 도 16 및 도 17은 비교예, 실시예 1 및 2에서 각각 지방유래 줄기세포를 골세 포로 분화 유도하여 이를 비교한사진과 그래프이다.

<86> 도 16 및 도 17올 참조하면, 나노 기둥을 가지는 실시여 U에서 나노 기공을 가지는 실시예 2 및 비교예에서 배양한 지방유래 줄기 세포보다 골세포로의 분화효 율이 상대적으로 높게 나타남을 확인할수 있다.

<87> 도 11 내지 도 17을 통해서 볼 때, 직경 200ntn, 깊이 500 nm인 나노 기공 형 상과 직경 200 nm, 높이 500ntn인 나노 기등 형상이 규칙적으로 형성된 세포 배양면 에서 성체 줄기세포를 배양한 경우를 평평한 배양면과 비교할 때， 부착율， 증식율 및 분화 효율이 상대적으로 향상되는 효과를 확인할수 있다.

<88> 따라서 적정한 크기의 나노 기공， 나노 기등 구조의 나노 구조물을 포함하는 세포 배양면올 이용하여 세포를 배양하는 경우， 안정적으로 세포 점착， 증식 및 분 화를 유도할 수 있다. 그리고 보다 넓은 면적으로 안정적으로 세포가 세포 배양면 표면에 점착되는 효과를 얻올 수 있다. 따라서 이 러한 구조물을 포함하는 세포 배 양용 용기에서 성체 줄기세포를 배양하는 경우, 세포 분화 효율을 증가시 키 고， 많 은 수의 세포를 얻을 수 있을 것이다.

<89> 이상에서 본 발명의 바람직 한 실시 예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발 명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정 의 하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여 러 변형 및 개량 형 태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것 이다.

Claims

【청구의 범위】

【청구항 11

성체 줄기세포를 점착하여 상기 줄기 세포를 증식 및 분화시 키기 위 한 세포 배양면을 포함하는 세포 배양용 용기에 있어서，

상기 세포 배양면은 상기 세포 배양면 상에서 일정 한 간격을 두고 배치되는 나노 구조물을 포함하고，

상기 나노 구조물은 상기 세포 배양면으로부터 돌출한 나노 기둥올 포함하 고 ,

상기 나노 기등의 폭은 40 nm 내지 500 nm 사이의 범위 이고 ,

상기 나노 기등의 높이는 lOnm 내지 1 사이의 범위 인 나노 구조를 갖는 세포 배양용 용기 .

【청구항 2】

저 u항에서 ,

상기 나노 기둥은 반원 형상의 기단과， 상기 기단으로부터 일정한 폭으로 돌 출하며 상부가 반원 형상올 이루는 기등으로 이루어지는 나노 구조를 갖는 세포 배 양용 용기 .

【청구항 3】

성체 줄기세포를 점착하여 증식 및 분화시 기기 위 한 세포 배양면올 포함하는 세포 배양용 용기에 있어서，

상기 나노 구조물은 상기 세포 배양면으로부터 오목한 나노 기공올 포함하 고 ,

상기 나노 기공의 폭은 40 nm 내지 500 nm 사이 의 범위 이고，

상기 나노 기공의 깊이는 lOnm 내지 1 사이의 범위 인 나노 구조를 갖는 세 포 배양용 용기 .

【청구항 4】

제 1항 또는 제 3항에서，

상기 세포 배양면은 열가소성 수지， 열경화성 수지 및 탄성중합체 중 적어도 하나로 이루어지는 나노 구조를 갖는 세포 배양용 용기 .

【청구항 5]

제 4항에서， 상기 세포 배양용 용기는 표면에 플라즈마 처리 , 오존 처리 또는 세포 점착 증진 물질의 코팅 중 어느 하나가 처리되어 있는 나노 구조를 갖는 세포 배양용 용 기 .

【청구항 6]

2단계 양극산화알루미늄 공정을 이용하여 예비 기공올 포함하는 알루미늄 템 플릿을 형성하는 단계，

상기 알루미늄 템플릿 위에 고분자 물질층을 형성하고， 상기 고분자 물질층 상부를 상기 알루미늄 템플릿으로 가압하여 고분자 템플릿을 형성하는 단계，

상기 고분자 템플릿 및 상기 알루미늄 템플릿의 표면에 씨앗층을 형성하는 단계，

상기 씨앗층 위에 금속을 도금한 후 상기 고분자 템플릿과 상기 알루미늄 템 플릿을 제거하여 금속 몰드를 형성하는 단계， 그리고

상기 금속 몰드 위에 세포 배양용 고분자 물질층을 형성 한 후 상기 금속 몰 드를 제거하여 나노 구조물이 형성된 고분자 물질로 이루어지는 세포 배양면을 형 성하는 단계

를 포함하는 나노 구조를 갖는 세포 배양용 용기의 제조 방법 .

【청구항 7】

제 6항에서 ,

상기 금속 몰드는 니켈， 철， 구리， 은， 금 및 아연 주석 -납 합금 중 적어도 하나를 포함하여 이루어지는 나노 구조를 갖는 세포 배양 용기 의 제조 방법 .

【 구항 8]

계 6항에서，

상기 세포 배양면올 형성하는 단계는

캐비티를 포함하는 계 1 금형，

상기 캐비티 내에 상기 금속 몰드를 장착하는 단계，

상기 제 1 금형과 일정 한 간격을 두고 제 2 금형을 정 렬하는 단계，

상기 제 1 금형과 상기 제 2 금형 사이에 상기 세포 배양용 고분자 물질충을 형성하기 위한 수지를 주입하는 단계，

상기 수지를 경화시킨 후 상기 제 1 금형과 상기 제 2 금형을 제거하여 상기 세포 배양면이 바닥에 형성된 세포 배양용 용기를 완성하는 단계

를 더 포함하는 나노 구조를 갖는 세포 배양용 용기의 제조 방법 .

【청구항 9】 제 8항에 있어서 , ^'

상기 수지는 열가소성 수지， 열경화성 수지 또는 탄성 중합체 중 적어도 하나 로 이루어지는 나노 구조를 갖는 세포 배양용 용기의 제조 방법 .

【청구항 10]

제 6항에서，

상기 세포 배양용 용기는 표면에 플라즈마 처리， 오존 처 리 및 세포 점착 증 진 물질의 코팅 중 어느 하나의 처리를 실시하는 단계

【청구항 11】

제 6항에서 ,

상기 배양면올 형성하는 단계는

사출 성 형， 핫엠보싱， UV—몰딩， 주조 중 어느 하나로 형성하는 나노 구조를 갖는 세포 배양용 용기의 제조 방법 .