WO2013073998A2 - Новые производные гемина с антибактериальной и противовирусной активностью - Google Patents

Новые производные гемина с антибактериальной и противовирусной активностью Download PDF

Info

Publication number
WO2013073998A2
WO2013073998A2 PCT/RU2012/000939 RU2012000939W WO2013073998A2 WO 2013073998 A2 WO2013073998 A2 WO 2013073998A2 RU 2012000939 W RU2012000939 W RU 2012000939W WO 2013073998 A2 WO2013073998 A2 WO 2013073998A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
glu
general formula
hemin
staphylococcus aureus
Prior art date
Application number
PCT/RU2012/000939
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2013073998A3 (ru
Inventor
Владимир Евгеньевич НЕБОЛЬСИН
Галина Александровна ЖЕЛТУХИНА
Сергей Александрович ОКОРОЧЕНКОВ
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to EA201490963A priority Critical patent/EA023667B1/ru
Priority to CN201280062451.7A priority patent/CN104039824B/zh
Priority to SI201231693T priority patent/SI2781525T1/sl
Priority to PL12850312T priority patent/PL2781525T3/pl
Priority to ES12850312T priority patent/ES2755937T3/es
Priority to UAA201406790A priority patent/UA116877C2/uk
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез"
Priority to US14/358,998 priority patent/US9605013B2/en
Priority to EP12850312.5A priority patent/EP2781525B1/en
Priority to DK12850312T priority patent/DK2781525T3/da
Publication of WO2013073998A2 publication Critical patent/WO2013073998A2/ru
Publication of WO2013073998A3 publication Critical patent/WO2013073998A3/ru
Priority to CY20191101177T priority patent/CY1122496T1/el

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic Table
    • C07F15/02—Iron compounds
    • C07F15/025—Iron compounds without a metal-carbon linkage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/02—Local antiseptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/22—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • C07K5/06069—Ser-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/06095—Arg-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to the field of bioorganic chemistry and is aimed at obtaining new derivatives of hemin and the development of antibacterial and antiviral agents and compositions based on them.
  • Bacteria cause epidemic diseases such as cholera, typhoid fever, paratyphoid, plague, diphtheria, tularemia, brucellosis, as well as tuberculosis, blood poisoning (sepsis), leprosy, syphilis, etc.
  • bacteria cause glanders, anthrax, tuberculosis and other.
  • the fight against bacteria is based on the use of antibacterial agents, including antibiotics.
  • many well-known agents have several disadvantages, such as toxicity, sensitivity to the action of proteolytic enzymes, hemolytic effect, insufficient breadth of antibacterial action.
  • MRSA methicillin-resistant staphylococcus
  • beta-lactams antibiotics
  • Methicillin-resistant staphylococcus causes difficult to cure diseases in people, such as blood diseases, pneumonia. He adapted to survival in the presence of methicillin, difloxacin and oxacillin. Most often, nosocomial infections are associated with it. About 18,000 Americans die every year from methicillin-resistant staphylococcal infections.
  • Herpes simplex viruses are the most famous representatives of herpes viruses (family Herpesviridae), as cause damage to almost every person.
  • Herpes simplex virus - HSV-1 family Herpesviridae
  • Herpes viruses can cause damage to the nervous system, eyes and internal organs.
  • herpes is the most common cause of acute viral encephalitis.
  • the causative agent of herpetic encephalitis is herpes simplex virus type 1.
  • Acyclovir is a widely known means of combating herpes viruses. However, since acyclovir-resistant herpes virus strains already exist, the search for new antiherpetic agents is highly relevant.
  • hemin has antimicrobial activity against Staphylococcus aureus [Y. Nitzan, N. Ladan, S. Gozansky, Z. Malik. Characterization of hemin antibacterial action on Staphylococcus aureus // FEMS Microbiol. Lett., 1987, V. 48 (3), p. 401-406].
  • the use of hemin as an antibacterial agent is difficult due to its insolubility in water, hemolytic activity, as well as the short duration of the antibacterial effect.
  • Ri and R 2 are —OH or an amino acid or peptide residue, wherein Ri and R 2 cannot simultaneously mean —OH.
  • e p + is Fe 2+ or Fe 3+ ; Na represents F " , SG, Br * or G
  • RU patent Jte 2250906 published 04/27/2005].
  • These derivatives have been identified various types of biological activity, including nuclease [Patent RU N ° 2404191, published 20.1 01.2010], [Patent RU jVs 2250906, published April 27, 2005], peroxidase, catalytic [RU Patent J4S 2404191, published January 20, 2010], and virucidal [RU Patent No. 2404191, published November 20, 2010].
  • the present invention relates to new derivatives of hemin of General formula (I)
  • Ri and R.2 are both ArgNH 2 , Arg (N0 2 ) OMe, GlyNH 2, SerNH 2 , SerOH, GlyOH, GIu (OH) OH, Glu (ArgNH 2 ) ArgNH 2 , Glu (SerOMe) SerOMe, Glu (NHCH 2 CH 2 OH) NHCH 2 CH 2 OH, Glu (SerNH 2 ) SerNH 2 , Glu (GlyNH 2 ) GlyNH 2) Glu (GlyOMe) GlyOMe, ArgSerOMe, ArgSerNH 2 , ArgSerOH, SerArgOMe, SerArgNH 2i SerArgOH, Me + represents Fe 2+ or Fe 3+ ; Hal * represents F " , SG, Br " or G,
  • the invention relates to a pharmaceutical composition based on these compounds, and to the use of these compounds for the manufacture of drugs having antibacterial and / or antiviral activity.
  • Figure 1 shows a comparison of CLogP claimed and previously known compounds of General formula 1.
  • the advantages of the new hemin derivatives of the formula (I) are their high water solubility, as well as high antibacterial efficacy, including against resistant strains.
  • R, 2 -Glu (NHCH2CH 2 OH) NHCH 2 CH20H;
  • Dipeptides comprising the ArgSer sequence are known compounds. So, ArgSerOMe CAS 147139-57-9, ArgSerNH 2 - 121 185-78-2, ArgSerOH - 70921-62-9.
  • the dipeptides SerArgNH 2 n SerArgOH are also known: CAS 1008793-14-3 and 13261-1 1-5, respectively.
  • the protected derivative of the dipeptide BocSer (Bzl) ArgOH CAS 88263-54-1 has also been previously described.
  • Benzyloxycarbonyl (Z) and benzyl (Bzl) protections were cleaved by hydrogenolysis over the palladium catalyst, and the mpe / rz-butyloxycarbonyl protonation (Boe) was removed with methanol saturated with hydrogen chloride.
  • the compounds of formula (I) can be used both in the form of salts with pharmaceutically acceptable acids, for example, lactic, tartaric, citric, hydrochloric, etc., and in the form of salts of carboxyl groups with alkali and alkaline earth metal ions, such as sodium, potassium , calcium, or, for example, with pharmaceutically acceptable bases, such as ammonia, ethanolamine.
  • pharmaceutically acceptable acids for example, lactic, tartaric, citric, hydrochloric, etc.
  • alkali and alkaline earth metal ions such as sodium, potassium , calcium
  • pharmaceutically acceptable bases such as ammonia, ethanolamine.
  • the compounds of formula (I) above are active against bacteria such as bacteria of the genus Staphylococcus (e.g., Staphylococcus aureus), Bacillus (e.g., Bacillus subtilis), Enterococcus (e.g., Enterococcus faecalis), Micrococcus (e.g. Micrococcus luteus), and Escherichia (e.g. Escherichia coli) including resistant ones, i.e. possessing resistance to the action of known antibacterial agents.
  • bacteria of the genus Staphylococcus e.g., Staphylococcus aureus
  • Bacillus e.g., Bacillus subtilis
  • Enterococcus e.g., Enterococcus faecalis
  • Micrococcus e.g. Micrococcus luteus
  • Escherichia e.g. Escherichia coli
  • these bacteria belong to the strains of Bacillus subtilis VKM B-501, Staphylococcus aureus 209P, Enterococcus faecalis VKM B-871 or Micrococcus luteus In KM Ac-2230. Even more preferably, these compounds exhibit antibacterial activity against resistant strains of Staphylococcus aureus Ns 25923 ATCC, Staphylococcus aureus N ° 100 KS, Staphylococcus aureus Na 5 MRSA, Staphylococcus aureus N ° 3797 MRSA, Staphylocococcus epidermidis Na 5 ° 5 fa faecium Na 569 or Escherichia coli 4300.
  • the compounds of the invention have antiviral activity, in particular against herpes viruses, such as herpes simplex viruses type 1 and / or 2.
  • herpes viruses such as herpes simplex viruses type 1 and / or 2.
  • the compounds of the invention have activity against herpes simplex type 1 viruses, an EU strain, and / or type 2, strain G (ATCC JN ° VR-734).
  • the above compounds of formula (I) and / or their salts can be used as active ingredients in pharmaceutical compositions (for example, in solid, semi-solid or liquid forms) in admixture with an organic or inorganic carrier or excipient.
  • the active ingredient may be included in the composition along with commonly used non-toxic, pharmaceutically acceptable carriers suitable for the manufacture of solutions, tablets, pills, capsules, suppositories, emulsions, suspensions, sprays, inhalers, drops, ointments and any other dosage forms.
  • carriers water, glucose, lactose, gum arabic, gelatin, starch, magnesium trixylite, talc, corn starch, urea, polyethylene glycol and other carriers suitable for the manufacture of solid, soft or liquid preparations can be used.
  • stabilizers, thickeners, colorants and perfumes can be used as additives.
  • the compound of formula I is introduced into the composition in an effective amount sufficient to obtain an antibacterial and / or antiviral effect.
  • the amount of active ingredient used in combination with a carrier may vary depending on the recipient undergoing treatment, on the particular method of drug administration. So, for example, when using the compounds of the present invention in the form of solutions for injection, the content of the active principle in them is 0.001-1 wt.%. As a diluent, 0.9% sodium chloride solution, distilled water, novocaine solution for injection, Ringer's solution, and glucose solution can be used. When using the compounds of general formula (I) in the form of tablets and suppositories, the amount of the substance is 1.0-100.0 mg per unit dosage form. For tablets and suppositories, any pharmaceutically acceptable base is used as a pharmaceutical excipient.
  • the compounds of general formula (I) are both water soluble and lipophilic, they can be used in the form of aqueous solutions, alcohol solutions, ointments, creams, etc.
  • the invention further relates to an antibacterial and antiviral drug based on the above compounds of formula (I), as well as to a method for treating diseases caused by the above bacteria and / or viruses, comprising administering to a patient in need thereof the above compound of formula (I) or pharmaceutical compositions based on it.
  • the treatment method is intended for mammalian patients, including humans.
  • Recommended doses of the compound of formula (I) are 0.01-10 mg / kg.
  • the compounds of formula (I) have antibacterial and antiviral activity, they can also be used as or as part of antiseptic and / or disinfectants.
  • Such agents can be made, for example, in the form of solutions using various solvents, such as water and lower alcohols (for example, 1-propanol or 2-propanol).
  • Another aspect of the invention relates to a method for producing the above new compounds of formula (I).
  • Peptides amino acids (in mainly ⁇ -amino acids) or their analogues, in particular ArgNH 2 , Arg (NC> 2) OMe, GlyNH 2 , SerNH 2> SerOH, GlyOH, Glu (OH) OH, NH 2 CH 2 CH 2 OH, GlyOMe, and SerOMe, as well as derivatives of the dipeptides ArgSerOMe, ArgSerNH 2> ArgSerOH, SerArgOMe, SerArgNH 2 and SerArgOH.
  • the reaction is carried out in a solvent, preferably in
  • the amino groups of the amino components are acylated with hemin bis-hydroxy succinimide ester.
  • the reactions are carried out in DMF for 0.5-2 hours, at a temperature of from -15 ° to + 30 ° C, using triethylamine.
  • Similar reactions with unprotected amino acids are carried out in DMF in the presence of triethylamine and up to 10% water.
  • hemin conjugates with branched peptides are obtained by direct attachment of a COOH protected group of amino acid derivatives and peptides to the hemin conjugate with glutamic acid in the presence of a TBTU condensing agent.
  • HSV-2 herpes simplex virus type 2
  • A is the optical density
  • Z is benzyloxycarbonyl.
  • High-resolution mass spectra were obtained on a GaPech time-of-flight mass spectrometer (Vshkeg, Germany) using the matrix laser method desorption ionization (TOF MALDI), 2,5-dihydroxybenzoic acid was used as a matrix.
  • TOF MALDI matrix laser method desorption ionization
  • IR spectra were recorded on a Fourier spectrometer: Magna 750 (Nicolet, USA).
  • UV VS 7800 (Japan).
  • the precipitate was separated and dried in a desiccator under reduced pressure over calcium chloride for a day, then it was dissolved in 1 ml of anhydrous methanol and insoluble NaCl was filtered off, after which it was purified by gel filtration on a 20x2 cm column filled with Sephadex LH20, eluting with methanol. The fractions containing the target product were combined, the solvent was removed in vacuo. The target product was dried in a desiccator under reduced pressure over calcium chloride for a day.
  • the solvent was removed in vacuo, the residue was dried in a desiccator under reduced pressure over calcium chloride, then dissolved in 1 ml of anhydrous methanol and the salts were filtered off. The solvent was removed in vacuo. If necessary, the target substance was purified by recrystallization or column chromatography on silica gel.
  • reaction mass was stirred for one day, after which it was concentrated in vacuo to a volume of 1 ml.
  • water-insoluble compounds XI and XIV
  • 10 ml of an aqueous 0.1 M hydrochloric acid solution was added to the concentrated reaction mass, the precipitate was separated and washed with water until neutral.
  • the precipitate was dried in a desiccator under reduced pressure over calcium chloride for a day.
  • water-soluble compounds (IX, X, and XIII) a 0.01 M hydrochloric acid solution in a saturated aqueous NaCl solution was added to the concentrated reaction mass.
  • the precipitate was separated and dried in a desiccator under reduced pressure over calcium chloride for a day, then it was dissolved in 1 ml of anhydrous methanol and insoluble NaCl was filtered off, after which it was purified by gel filtration on a 20x2 cm column filled with Sephadex LH20, eluting with methanol. The fractions containing the target product were combined, the solvent was removed in vacuo. The target product was dried in a desiccator under reduced pressure over calcium chloride for a day.
  • CLogP octanol / water partition coefficients
  • strains of gram-positive bacteria Staphylococcus aureus 209P, Enterococcus faecalis VKM B-871, Micrococcus luteus VKM Ac-2230, Bacillus subtilis VKM B-501 and gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa PAOl and Escherichia coli KGM coli were used.
  • Strains marked with VKM were obtained from the All-Russian collection of microorganisms of the Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of the Russian Academy of Sciences.
  • Staphylococcus aureus 209P strain was obtained from the collection of the Department of Microbiology, Faculty of Biology, Moscow State University M.V. Lomonosova, a Pseudomonas aeruginosa PAOl - from the collection of microorganisms of the Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • MMC minimum bactericidal concentration
  • MICs were evaluated by inhibition of culture growth in a liquid medium with serial dilutions of substances according to a modified method [Amsterdam, D. 1996. Susceptibility testing of antimicrobials in liquid media, pp. 52-11 1. In Loman, V., ed. Antibiotics in laboratory medicine, 4th ed. Williams and Wilkins, Baltimore].
  • Bacteria were cultured and tested in a liquid MH medium.
  • IR 1 [(AkGA k OIA 1 , -A u )] x100 / (A kG A k0 ) (1), where the index i denotes the number of the hole, k is the control well with bacteria into which the test compound is not introduced, 0 - the measurement is carried out immediately after introducing the analyte into the well, t-measurement 20 hours after adding the substance.
  • the following experimental protocol was used to determine the antibacterial activity of the test compounds.
  • a cryovial with the culture of the test strain in a medium with 7% DMSO stored in liquid nitrogen was quickly thawed, 100 ⁇ l of the cell suspension was added to 1.5 ml of fresh MH medium.
  • Cells were grown during the day at a temperature of 37 ° C and stirring on an orbital shaker at a speed of 150 rpm.
  • the morphological characteristics of the strain and the absence of contamination with foreign bacteria were checked (a) by plating on agar (15 g / l agar) MN medium according to the shape and color of the formed colonies, (b) under a microscope (Mikmed-2, LOMO, Russia) with a 40x objective characteristic morphological features of cells.
  • the bacteria were cultured in 1 ml of liquid MH medium at a temperature of 37 ° C with stirring. Cells were reseeded every day. Starting from the 3rd and ending with the 6th reseeding, the cell culture was used to set up the tests.
  • the suspension was diluted with MH medium to 5x10 4 -1x10 5 cells / ml and a sterile 96-well plate was transferred at 100 ⁇ l per well. Then, the studied compounds were introduced to the cells and serial double dilutions of these compounds were made in the wells of the plate.
  • the maximum concentration of substances in the series was 10 "4 M, the minimum - 1.6x10 '6 M.
  • the study of antibacterial activity was performed in 2 repetitions for each compound, and the result was averaged.
  • MBC MBC-containing MH medium (15 g / l agar) and triturated uniformly over the area of the plates with sterile spatulas. Cups were incubated for 2 days. MBC was determined as the lowest concentration of the test compound at which the colonies on the Petri dish do not grow.
  • compounds II, III, IV, V, IX, X, XIV according to the invention inhibit the growth of gram-positive bacteria S. aureus in the micromolar concentration range (table 2). These compounds also exhibit bactericidal activity in concentrations up to 25 ⁇ M.
  • M.luteus bacteria are highly sensitive even at submicromolar concentrations to the action of all compounds (in some cases, MI ⁇ 0.8 ⁇ M).
  • Enterococci of E.faecalis are on average more resistant to the action of these compounds than micrococci M.luteus and staphylococci S.aureus.
  • the most effective compounds against E.faecalis were II and V: MIC ⁇ 7 ⁇ M.
  • Staphylococcus aureus jV ° 25923 ATCC American Type Culture Collection
  • Staphylococcus aureus Na 100 KC Staphylococcus epidermidis N ° 533; Enterococcus faecalis N ° 559; Enterococcus faecium N ° 569, Staphylococcus aureus 5 (MRS A), Staphylococcus aureus N ° 3797 (MRS A).
  • a ready-made dry medium Trypticase Soy Agar (Trypticase Soy Agar, BBL), was used.
  • 10 ⁇ l were taken and 190 ⁇ l of bacterial culture was added (10 5 CFU).
  • 10 ⁇ l of solvent (DMSO) was added, then 20 ⁇ l of stock solution of the test compound in water with a concentration of 5x10 3 M was added to 1 well and its concentration was adjusted twice to a concentration of 0.039x10 3 M.
  • 2 ⁇ l were taken from each well and 198 ⁇ l of bacterial culture (10 5 CFU) was added.
  • the growth of cultures was assessed visually, comparing the growth of microorganisms in the presence of the studied test compounds with the growth of culture without them.
  • the MIC was taken as the last dilution of the tested drugs with inhibition of bacterial culture growth.
  • the new compounds showed activity against gram-positive bacteria Staphylococcus aureus 25923, Staphylococcus aureus 100 KS and Staphylococcus epidermis 533, with MICs not exceeding 13 ⁇ M.
  • the water solubility and antibacterial activity of hemin dipeptide derivatives in some cases turned out to be higher than that of other PGs. So, compound XIX showed an order of magnitude higher antibacterial activity against Staphylococcus epidermis 533 (MIC 1.3 ⁇ M).
  • Staphylococcus aureus 3797 (MIC, ⁇ M)
  • the new compounds showed high antibacterial activity against MRSA strains, with MPC lying in the range of 0.78-13 ⁇ M.
  • Herpes simplex virus type 1 (collection of the Research Institute of Virology, EU strain), herpes simplex virus type 2 strain G (ATCC # VR-734) and human cytomegalovirus strain AD169 (ATCC # VR-538) were used for research.
  • Herpes simplex viruses of types 1 and 2 were cultured in Vero cells. The cells were cultured at 37 ° C under 5% C0 2 incubator Gas Flow Sanyo MCO-15AS (Tokyo, Japan) in Eagle's MEM growth medium (MEM medium Biolot, St. Russia, Cat. # 1.3.3) supplemented with 10% fetal serum (BioloT, St. Moscow, cat. # 1.1.12).
  • the seeding dose of cells was about 2 ⁇ 10 5 cells / ml in the starting material, or 2x10 4 cells in the well.
  • Herpes simplex viruses were cultured under the same conditions in serum-free MEM (maintenance medium).
  • Original virus titers were 10 TCIDso / ml.
  • DMSO-soluble preparations From DMSO-soluble preparations, stock solutions of a concentration of 10 mM in DMSO were prepared. A mother liquor of the same concentration was prepared from water-soluble preparations on MEM (Minimal Essential Medium) medium for cell cultures. To control cytotoxicity (see below), the mother liquor was diluted in a medium to a concentration of 100 ⁇ M, after which a series of ten-fold dilutions of the preparations were prepared on MEM medium (in the case of DMSO- soluble substances on MEM medium with 3% DMSO).
  • MEM Minimum Essential Medium
  • the following drug concentrations were taken in the antiviral experiment: in the absence of toxicity of 100 ⁇ M preparations, the concentrations of the tested substances were 100, 10 and 1 ⁇ M, and in the presence of toxicity of 100 ⁇ M, 10, 1 and 0.1 ⁇ M.
  • Acyclovir (10 ⁇ g / ml) for both herpes simplex viruses was used as reference preparations to control the adequacy of the viral model.
  • the preparations were introduced into the wells of a tablet with a monolayer of cells in a volume of 0.1 ml per well.
  • concentrations of the compounds i.e. 200, 20 and 2 or 20, 2 and 0.2 ⁇ M for toxic and non-toxic at a concentration of 100 ⁇ M preparations, respectively, were incubated for 1 hour, after which they were infected with the studied viruses in a volume of 0.1 ml per well in doses of 1, 10 and 100 TSSh 50 (50% tissue infectious dose).
  • Infected cells were incubated for 48 hours at 37 ° C under 5% C0 2, after which visually under an inverted microscope Leica DMIL NA evaluated monolayer state, given the nature of the cytopathogenic effect varies substantially and for the virus of the drug at its toxic concentrations.
  • the virus-specific cytopathogenic effect was manifested in an increase in cell sizes, their rounding and separation from the substrate. These morphological features sharply distinguished them from cells exposed to the toxic effects of high concentrations of the studied drugs. The latter acquired a fusiform shape, lost contact with neighboring cells of the monolayer, their borders became sharper.
  • the severity of virus-specific changes in the cells was evaluated semi-quantitatively according to a 4-point system: 0 - there are no CPP in the cells, 1 - up to 25% of the monolayer is infected with the virus, 2 - from 25 to 50%, 3 - from 50 to 75%, 4 - from 75 up to 100%.
  • the antiviral activity of the compounds was evaluated by their ability to reduce the manifestations of the cytopathogenic effect in the wells of the tablet compared to control values. Differences with control values of 1 point or more were considered significant.
  • Antiviral activity of the claimed compounds of general formula (I) against herpes simplex virus types 1 and 2 manifestations of viral CPD (points) at various concentrations of hemin derivatives, ⁇ M
  • New compounds are practically non-toxic; leukocyte death of 1-5% is detected at concentrations of 12-50 ⁇ M.
  • the studied new compounds also do not cause a significant exit of hemoglobin from human blood erythrocytes, which is no more than 2-3% up to concentrations of 50 ⁇ M.
  • results obtained indicate the promise of the claimed substances for creating non-toxic, biocompatible antibacterial and antiviral agents based on them, including for the prevention and treatment of diseases caused by various microorganisms.
  • the claimed compounds have greater water solubility, exhibit antibacterial activity at lower concentrations, including against gram-positive and gram-negative resistant bacterial strains, and have an antiviral effect against viruses herpes of types 1 and 2, which increases their potential practical value as anti-infective agents.
  • compositions of the present invention can be used in the form of disinfectant, antiseptic and pharmaceutical preparations (for example, in solid, semi-solid or liquid forms) containing the compounds of the invention as active ingredients in admixture with an organic or inorganic carrier or excipient suitable for intramuscular administration, intravenous, intranasal, oral, sublingual, inhalation and intrarectal administration.
  • the active ingredient may be included in the composition along with commonly used non-toxic, pharmaceutically acceptable carriers suitable for the manufacture of solutions, tablets, pills, capsules, suppositories, emulsions, suspensions, sprays, inhalers, drops, ointments and any other dosage forms.
  • water glucose, lactose, gum arabic, gelatin, starch, magnesium trixylite, talc, corn starch, urea, polyethylene glycol and other carriers suitable for the manufacture of solid, soft or liquid preparations can be used.
  • stabilizers, thickeners, colorants and perfumes can be used as additives.
  • the compound of general formula (I) is introduced into the composition in an amount sufficient to obtain the desired antibacterial and / or antiviral effect.
  • the amount of active ingredient used in combination with a carrier may vary depending on the recipient undergoing treatment, on the particular method of drug administration.
  • the content of the active ingredient in them is 0.001-1%.
  • a diluent 0.9% sodium chloride solution, distilled water, novocaine solution for injection, Ringer's solution, and glucose solution can be used.
  • the compounds of general formula (I) in the form of tablets and suppositories the amount of the substance is 1.0-100.0 mg per unit dosage form.
  • any pharmaceutically acceptable base is used as a pharmaceutical excipient.
  • composition of the powder introduced into the capsule :
  • the tablet form is prepared using the following ingredients:
  • the components are mixed and pressed to form 200 mg tablets each.
  • composition of the aerosol mixture designed for 10 receptions:
  • the compound is mixed with fillers and placed in a special device for spraying.
  • Cocoa butter the amount required to obtain a suppository. If necessary, it is possible to produce rectal, vaginal and urethral suppositories with appropriate excipients.
  • hydrocarbon ointment bases - white and yellow petroleum jelly (Vaselinum album, Vaselinum flavum), liquid paraffin (Oleum Vaselini), white and liquid ointment (Unguentum album, Unguentum flavum), and as additives to give a denser consistency, hard paraffin and wax;
  • absorbent ointment bases hydrophilic petrolatum (Vaselinum hydrophylicum), lanolin (Lanolinum), cold cream (Unguentum leniens);
  • ointment bases washed off with water - hydrophilic ointment (Unguentum hydrophylum); water-soluble ointment bases - polyethylene glycol ointment (Unguentum Glycolis Polyaethyleni), bentonite bases and others.
  • composition of the ointment is an example of the composition of the ointment:
  • a solvent in the preparation of a solution for injection the following can be used: 0.9% sodium chloride solution, distilled water, novocaine solution. Release form - ampoules, bottles, syringe tubes,
  • composition of the solution for injection is a composition of the solution for injection:
  • compositions for disinfectants and antiseptics are examples of compositions for disinfectants and antiseptics.
  • Quaternary ammonium base (or a mixture thereof) 2-10%
  • PEG polyethylene glycol
  • novel hemin derivatives of the general formula (I) of the present invention have increased water solubility, antibacterial activity, including against resistant bacterial strains, antiviral activity, including against the herpes virus.
  • hemin derivatives that are active against resistant strains of gram-negative bacteria have been identified among the new compounds.
  • the effectiveness of individual representatives of the new compounds corresponding to the general formula I confirms their suitability for use as a disinfectant, antiseptic and therapeutic agent with antibacterial and / or antiviral effects.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к новым производным гемина общей формулы (I), их получению и применению в качестве антибактериальных и/или противовирусных, средств, в том числе в составе фармацевтических композиций. Преимуществами новых антибактериальных и противовирусных средств на основе производных гемина является их биосовместимость, биодеградируемость, высокая эффективность против резистентных бактерий и широко распространенных и опасных для человека вирусов, при отсутствии токсичности.

Description

НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ГЕМИНА С АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ И ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Область техники
Изобретение относится к области биоорганической химии и направлено на получение новых производных гемина и на разработку антибактериальных и противовирусных средств и композиций на их основе.
Уровень техники
Как известно, многие опасные заболевания человека и животных вызываются бактериями и вирусами. Бактерии вызывают такие заболевания эпидемического характера, как холера, брюшной тиф, паратифы, чума, дифтерия, туляремия, бруцеллез, а также туберкулез, заражение крови (сепсис), проказа, сифилис и др. У животных бактерии вызывают сап, сибирскую язву, туберкулез и др. Борьба с бактериями основывается на применении антибактериальных средств, в том числе антибиотиков. Однако многие известные средства обладают рядом недостатков, такими как токсичность, чувствительность к действию протеолитических ферментов, гемолитический эффект, недостаточная широта антибактериального действия. Очень серьезную проблему представляет постоянное появление резистентных штаммов, т.е. штаммов, устойчивых к действию известных антибактериальных средств. Так, например, на сегодняшний день большую опасность представляет метициллинрезистентный стафилококк (MRSA), который устойчив к большой группе антибиотиков— бета-лактамов. Метициллинрезистентный стафилококк вызывает трудно вылечиваемые заболевания у людей, такие как заболевания крови, пневмонии. Он адаптировался к выживанию в присутствии метициллина, дифлоксацина и оксациллина. Наиболее часто именно с ним связаны внутрибольничные (нозокомиальные) инфекции. От метициллинрезистентной стафилококковой инфекции умирает около 18000 американцев ежегодно.
Поэтому проблема поиска новых антибактериальных средств, в том числе, активных в отношении резистентных штаммов, не теряет своей актуальности.
Вирусы также являются причиной различных заболеваний, таких как грипп, ОРВИ, вирусные гепатиты и др. Вирусы простого герпеса - наиболее известные представители герпесвирусов (семейство Herpesviridae), так как вызывают поражения практически у каждого человека. Имеются две разновидности вируса простого герпеса - ВПГ-1 (лабиальный герпес) и ВПГ-2 (генитальный герпес). Вирусы герпеса могут вызывать поражение нервной системы, глаз и внутренних органов. В США герпес - самая частая из причин острого вирусного энцефалита. Более чем в 95% случаев возбудителем герпетического энцефалита служит вирус простого герпеса типа 1. Широко известным средством борьбы с вирусами герпеса является ацикловир. Однако, поскольку в настоящее время уже существуют резистентные к ацикловиру штаммы вируса герпеса, то поиск новых противогерпетических агентов является весьма актуальным.
Известно, что гемин обладает антимикробной активностью в отношении золотистого стафилококка [Y. Nitzan, Н. Ladan, S. Gozansky, Z. Malik.Characterization of hemin antibacterial action on Staphylococcus aureus// FEMS Microbiol. Lett., 1987, V. 48 (3), p. 401-406]. Однако использование гемина в качестве антибактериального средства затруднено вследствие его нерастворимости в воде, гемолитической активности, а также кратковременности антибактериального эффекта.
Ранее предпринимались попытки модификации гемина путем его конъюгации с аминокислотами, пептидами и их производными с целью создания биологически активных производных. В результате модификации карбоксильных групп гемина путем получения соответствующих амидов были получены и исследованы соединения общей формулы (I),
Figure imgf000004_0001
где Ri и R2, одинаковые или различные, представляют собой -ОН или остаток аминокислоты или пептида, причем Ri и R2 не могут одновременно обозначать -ОН. еп+ представляет собой Ре2+или Fe3+; На представляет собой F" , СГ, Вг* или Г [патент RU Jte 2250906, опубликованный 27.04.2005]. У этих производных были выявлены разные виды биологической активности, включая нуклеазную [Патент RU N° 2404191, опубликованный 20.1 1.2010], [Патент RU jVs 2250906, опубликованный 27.04.2005], пероксидазную, каталитическую [Патент RU J4S 2404191, опубликованный 20.1 1.2010], и вирулицидную [Патент RU Ns 2404191, опубликованный 20.11.2010].
Среди синтезированных ранее авторами изобретения производных гемина формулы (1) был выявлен ряд конкретных соединений, обладающих антимикробной (в том числе антибактериальной) активностью. [Патент RU 2415868 С1, опубликованный 10.04.2011]. Эти соединения представляют собой, в основном, конъюгаты гемина с эфирами аминокислот и антимикробными пептидами, где, в частности, для производных гемина с Ri=R2=-GlyOMe, Ri=R2=- NHCH2CH2OH, SerOMe или -Glu(ArgOMe)-ArgOMe была обнаружена антибактериальная активность. Однако лишь небольшое число производных гемина проявило активность в отношении резистентных штаммов бактерий, к тому же эти соединения были плохо растворимы в воде, а их активность была не слишком высока.
В настоящее время обнаружены новые производные гемина, обладающие антибактериальным и противовирусным действием, которые обладают улучшенными свойствами, в частности, проявляют активность в отношении штаммов MRSA.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к новым производным гемина общей формулы (I)
Figure imgf000006_0001
где Ri и R.2 оба представляют собой ArgNH2, Arg(N02)OMe, GlyNH2, SerNH2, SerOH, GlyOH, GIu(OH)OH, Glu(ArgNH2)ArgNH2, Glu(SerOMe)SerOMe, Glu(NHCH2CH2OH)NHCH2CH2OH, Glu(SerNH2)SerNH2, Glu(GlyNH2)GlyNH2) Glu(GlyOMe)GlyOMe, ArgSerOMe, ArgSerNH2, ArgSerOH, SerArgOMe, SerArgNH2i SerArgOH, Men+ представляет собой Fe2+ или Fe3+; Hal* представляет собой F", СГ, Br" или Г,
или их фармацевтически приемлемым солям.
Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции на основе указанных соединений, и к применению указанных соединений для получения лекарственных средств, обладающих антибактериальной и/или противовирусной активностью.
Краткое описание фигур чертежей
На Фиг.1 приведено сравнение CLogP заявляемых и известных ранее соединений общей формулы 1.
Подробное описание изобретения
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что новые соединения приведенной выше формулы (1),являются более эффективными по сравнению с ранее описанными аналогами.
Преимуществами новых производных гемина формулы (I) являются их большая водорастворимость, а также высокая антибактериальная эффективность, в том числе против резистентных штаммов.
Отличие новых заявляемых соединений от ранее известных - активность против опасных резистентных штаммов грамположительных бактерий St. aureus N° 5 и MRSA St.aureus N° 3797 MRSA и грамотрицательных E.coli 4300. Неожиданно оказалось, что производные гемина общей формулы I, имеющие в составе заместителей незащищенный карбоксил или соответствующий амид, проявляют более высокую активность против бактерий. Так, соединения И, IV, X проявили при прочих равных условиях более высокую антибактериальную активность, чем соответствующие сложные эфиры, описанные в патенте RU 2415868 С1, опубликованном 10.04.2011.
При этом токсичность новых соединений осталась невысокой. Следует отметить, что вещества, содержащие амидированный карбоксил, лучше растворимы в воде, нежели их аналоги, содержащие карбоксильную или сложноэфирную группировку. По-видимому, это связано с большей гидрофильностью заместителей этих соединений, характеризуемой коэффициентами распределения октанол-вода.
В настоящей работе были получены и исследованы следующие новые соединения формулы (I):
Соединение (II): R!=R2=-ArgNH2;
Соединение (III): Ri=R2=-Arg(N02)OMe;
Соединение (IV): Ri=R2=-GlyNH2;
Соединение (V): Ri=R2=-SerNH2 ;
Соединение (VI): Ri=R2=-SerOH;
Соединение (VII):
Figure imgf000007_0001
Соединение (VIII): R,=R2=-Glu(OH)OH;
Соединение (IX): Ri=R2=-Glu(ArgNH2)ArgNH2;
Соединение (X): Ri=R2=-Glu(SerOMe)SerOMe;
Соединение (XI): R, 2=-Glu(NHCH2CH2OH)NHCH2CH20H;
Соединение (XII): Ri=R2=-Glu(SerNH2)SerNH2;
Соединение (XIII): Ri=R2=-Glu(GlyNH2)GlyNH2;
Соединение (XIV): R,=R2=-Glu(GlyOMe)GlyOMe;
Соединение (XIX): Rt=R2=- ArgSerOMe;
Соединение (XX): R[=R2=- ArgSerNH2;
Соединение (XXI): R)=R2=- SerArgOMe: Соединение (XXII): Ri=R2=- ArgSerOH;
Соединение (XXIII): Ri=R2=- SerArgNH2;
Соединение (XXIV): Rt=R2=- SerArgOH .
Все аминокислоты, входящие в состав производных гемина, представляют собой L-аминокислоты, если не указано иное.
Дипептиды, включающие последовательность ArgSer, являются известными соединениями. Так, у ArgSerOMe CAS 147139-57-9, у ArgSerNH2 - 121 185-78-2, у ArgSerOH - 70921-62-9. Дипептиды SerArgNH2 n SerArgOH также известны: CAS 1008793-14-3 и 13261-1 1-5 соответственно. Ранее было описано также защищенное производное дипептида BocSer(Bzl)ArgOH CAS 88263-54-1. Другие использованные нами в синтезе производных гемина промежуточные защищенные дипептиды Z3ArgSerOMe, Z3ArgSerNH2, Z3ArgSerOH, BocSer(Bzl)ArgOMe, BocSer(Bzl)ArgNH2, а также дипептид SerArgOMe являются новыми. Синтез данных пептидов осуществлён нами с применением методов пептидной химии, конкретнее методом активированных Ν-оксисукцинимидных эфиров. Бензилоксикарбонильную (Z) и бензильную (Bzl) защиты отщепляли гидрогенолизом над палладиевым катализатором, а mpe/rz-бутилоксикарбонильная защита (Вое) удаляли метанолом, насыщенным хлористым водородом.
Соединения формулы (I) могут быть использованы как в виде солей с фармацевтически приемлемыми кислотами, например, молочной, винной, лимонной, хлористоводородной и др., так и в виде солей по карбоксильным группам с ионами щелочных и щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, кальций, или, например, с фармацевтически приемлемыми основаниями, такими как аммиак, этаноламин.
Представленные выше соединения формулы (I) проявляют активность против бактерий, таких как бактерии рода Staphylococcus (например, Staphylococcus aureus), Bacillus (например, Bacillus subtilis), Enterococcus (например, Enterococcus faecalis), Micrococcus (например, Micrococcus luteus), и Escherichia (например, Escherichia coli) в том числе резистентных, т.е. обладающих устойчивостью к действию известных антибактериальных средств. Предпочтительно, указанные бактерии относятся к штаммам Bacillus subtilis ВКМ В-501, Staphylococcus aureus 209Р, Enterococcus faecalis ВКМ B-871 или Micrococcus luteus В KM Ac-2230. Еще более предпочтительно, указанные соединения проявляют антибактериальную активность против резистентных штаммов Staphylococcus aureus Ns 25923 АТСС, Staphylococcus aureus N° 100 КС, Staphylococcus aureus Na 5 MRSA, Staphylococcus aureus N° 3797 MRSA, Staphylococcus epidermidis Na 533, Enterococcus faecalis N° 559, Enterococcus faecium Na 569 или Escherichia coli 4300.
Кроме того, соединения по изобретению обладают противовирусной активностью, в частности в отношении вирусов герпеса, таких как вирусы герпеса простого 1 и/или 2 типа. Предпочтительно, соединения по изобретению обладают активностью в отношении вирусов герпеса простого 1 типа, штамм ЕС, и/или 2 типа, штамм G (АТСС JN° VR-734).
Указанные выше соединения формулы (I) и/или их соли могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях (например, в твердой, полутвердой или жидкой формах) в смеси с органическим или неорганическим носителем или наполнителем.
Активный ингредиент может быть включен в композицию вместе с обычно используемыми нетоксичными, фармацевтически приемлемыми носителями, пригодными для изготовления растворов, таблеток, пилюль, капсул, суппозиториев, эмульсий, суспензий, спреев, ингаляторов, капель, мазей и любых других лекарственных форм. В качестве носителей могут быть использованы вода, глюкоза, лактоза, аравийская камедь, желатин, крахмал, триксилит магния, тальк, кукурузный крахмал, мочевина, полиэтиленгликоль и другие носители, пригодные для изготовления твердых, мягких или жидких препаратов. При этом в качестве добавок могут быть использованы стабилизаторы, загустители, красители и отдушки.
Соединение формулы I вводят в композицию в эффективном количестве, достаточном для получения антибактериального и/или противовирусного эффекта.
При изготовлении разовой лекарственной формы количество активного ингредиента, используемого в комбинации с носителем, может варьировать в зависимости от реципиента, подвергающегося лечению, от конкретного способа введения лекарственного средства. Так, например, при использовании соединений настоящего изобретения в виде растворов для инъекций содержание действующего начала в них составляет 0,001-1 масс.%. В качестве разбавителя вещества могут быть использованы 0,9% раствор натрия хлорида, дистиллированная вода, раствор новокаина для инъекций, раствор Рингера, раствор глюкозы. При использовании соединения общей формулы (I) в виде таблеток и суппозиториев количество вещества составляет 1,0-100,0 мг на единичную дозированную форму. Для таблеток и суппозиториев в качестве фармацевтического наполнителя используют любую фармацевтически пригодную основу.
Поскольку соединения общей формулы (I) являются как водорастворимыми, так и липофильными, то они могут применяться в виде водных растворов, спиртовых растворов, мазей, кремов и т.д.
Далее, изобретение относится к антибактериальному и противовирусному лекарственному средству на основе указанных выше соединений формулы (I), а также к способу лечения заболеваний, вызываемых указанными выше бактериями и/или вирусами, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту указанного выше соединения формулы (I) или фармацевтической композиции на его основе.
Способ лечения предназначен для пациентов-млекопитающих, в том числе людей. Рекомендуемые дозы соединения формулы (I) составляют 0,01 - 10 мг/кг.
Поскольку соединения формулы (I) обладают антибактериальной и противовирусной активностью, они могут также использоваться в качестве или в составе антисептических и/или дезинфицирующих средств. Такие средства могут быть изготовлены, например, в виде растворов с использованием различных растворителей, таких как вода и низшие спирты (например, 1-пропанол или 2- пропанол).
Еще один аспект изобретения относится к способу получения описанных выше новых соединений формулы (I).
Соединения формулы (I) получают путем взаимодействия активированного по карбоксильным группам производного гемина с аминокомпонентом с применением стандартных методов пептидного синтеза.
В качестве аминокомпонентов используют пептиды, аминокислоты (в основном, α-аминокислоты) или их аналоги, в частности, ArgNH2, Arg(NC>2)OMe, GlyNH2, SerNH2> SerOH, GlyOH, Glu(OH)OH, NH2CH2CH2OH, GlyOMe, и SerOMe, а также производные дипептидов ArgSerOMe, ArgSerNH2> ArgSerOH, SerArgOMe, SerArgNH2 и SerArgOH. Реакцию проводят в растворителе, предпочтительно в
DMF.
Предпочтительно, аминогруппы аминокомпонентов (например, а- аминогруппы карбоксилзащищенных аминокислот) ацилируют бис-Ν- оксисукцинимидным эфиром гемина. Реакции проводят в DMF в течение 0,5-2 часов, при температуре от -15° до +30°С, с применением триэтиламина. Подобные реакции с незащищенными аминокислотами проводят в DMF в присутствии триэтиламина и до 10% воды. Кроме того, конъюгаты гемина с разветвленными пептидами получают с помощью прямого присоединения защищенных по СООН группе производных аминокислот и пептидов к конъюгату гемина с глутаминовой кислотой в присутствии конденсирующего агента TBTU.
Таким образом, предлагаются новые эффективные антибактериальные и противовирусные средства на основе производных гемина. Их преимуществами являются биосовместимость, биодеградируемость, повышенная активность в отношении резистентных штаммов бактерий, низкая токсичность и отсутствие побочных эффектов, что делает их перспективными для применения в качестве лекарственных средств.
Изобретение далее иллюстрируется с помощью примеров, которые не предназначены для ограничения его объема.
Список сокращений
ВПГ-1 - вирус простого герпеса 1 типа
ВПГ-2 - вирус простого герпеса 2 типа
ИК - инфракрасная спектроскопия
ИР - ингибирование роста
МБК - минимальная бактерицидная концентрация
МИК - минимальная ингибирующая концентрация
ПАВ - поверхностно-активные вещества
ТСХ- тонкослойная хроматография
ХЛФ - хлороформ ЦПД - цитопатогенное действие
А - оптическая плотность
Вое - /ирш-бутилоксикарбонил
Bzl - бензил
DMF - диметилформамид
DMSO - диметилсульфоксид
Et3N - триэтиламин
МеОН - метиловый спирт
МН - среда Mueller-Hilton
MRSA - метициллин-резистентный Staphylococcus aureus
ОМе- метиловый эфир
PEG - полиэтиленгликоль
TBTU - 2-/1 Н-бензотриазол- 1 -ил/- 1 , 1 ,3,3-тетраметилуронийтетрафторборат TCIDJO- тканевая цитопатогенная доза, вызывающая гибель 50% клеток онослоя
Z - бензилоксикарбонил.
Следующие примеры иллюстрируют предлагаемое изобретение.
В работе использовались аминокислоты и их производные L-ряда, за исключением глицина, фирмы «Васпет» (Германия), «Reanal» (Венгрия), Et3N (Fluka, Германия). Промежуточные соединения - защищенные дипептиды Z3ArgSerOMe, Z3ArgSerNH2 и Z3ArgSerOH, BocSer(Bzl)ArgOMe, BocSer(Bzl)ArgNH2 и BocSer(Bzl)ArgOH- получали методами пептидной химии; их физико-химические характеристики приведены в таблице 1. Все растворители безводные, за исключением тех, которые использовались для экстракции из водных растворов. Индивидуальность полученных соединений проверяли методом ТСХ на пластинах Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) в системах: хлороформ: метанол: уксусная кислота: вода 5:4:0,5:0,5 (1), хлороформ: метанол: уксусная кислота: вода 5 :4:0,2:0,2 (2), хлороформ - метанол 9: 1 (3). Хроматограммы проявляли хлор-толидиновым реактивом, по свечению в УФ- свете.
Масс-спектры высокого разрешения получали на время-пролетном масс- спектрометре « гаПех» («Вшкег», Германия) методом матриксной лазерно- десорбционной ионизации (TOF MALDI), в качестве матрицы использовалась 2,5- дигидроксибензойная кислота.
ИК-спектры регистрировали на Фурье-спектрометре: «Magna 750» («Nicolet», США).
Электронные спектры снимали на спектрофотометре «Jasco» модель
UV VS 7800 (Япония).
Общая методика получения соединений II- V, XIX-XXIV
К суспензии 0,26 ммоль аминокомпонента в 1,5 мл DMF прибавляли 0,033 мл (0,266 ммоль) Et3N и перемешивали при комнатной температуре 3 мин. К полученному раствору прибавляли раствор 0,100 г (0,1 18 ммоль) 6,7-6HC-N- оксисукцинимидного эфира протогемина IX в 5 мл DMF, и перемешивали 30 мин при комнатной температуре. Контроль за протеканием реакции осуществляли методом ТСХ в системе (3). Реакционную массу концентрировали в вакууме до объема 1 мл. Для нерастворимых в воде соединений III, IV и V к сконцентрированной реакционной массе добавляли 10 мл водного 0,01 М раствора соляной кислоты, осадок отделяли и промывали водой до нейтральной реакции. Осадок сушили в эксикаторе при пониженном давлении над хлоридом кальция в течение суток. Для водорастворимого соединения II, XIX-XXIV к сконцентрированной реакционной массе добавляли 2,55 М раствор соляной кислоты в метаноле до достижения нейтральной реакции, затем добавляли 0,01 М раствор соляной кислоты в насыщенном водном растворе NaCl. Осадок отделяли и сушили в эксикаторе при пониженном давлении над хлоридом кальция в течение суток, затем растворяли в 1 мл безводного метанола и отфильтровывали нерастворившийся NaCl, после чего очищали с помощью гель-фильтрации на колонке 20x2 см, заполненной Sephadex LH20, элюируя метанолом. Содержащие целевой продукт фракции объединяли, растворитель удаляли в вакууме. Целевой продукт сушили в эксикаторе при пониженном давлении над хлоридом кальция в течение суток.
Пример 1
6,7-бис-(Амид N0- аргинил)-протогемин (IX) (II)
Выход 0,1020г (70%). ИК-Фурье спектр, v, см*1, таблетка Вг: 1656 (амид I), 1534 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: 926 [М-СГ]+. Электронный спектр, DMSO, ? , им, (ε·10-3): 403,8 (92,60), 499,2 (6,3643), 623,6 (1,553).
Пример 2
6,7-бис-(Метиловый эфир -Να- (1 с-нитро)аргинил)-протогемин (IX)
(III)
Выход 0,083 г (65%), Rf 0,26 (1), 0,71 (2). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 1737 (СО сл.эф.), 1648 (амид I), 1539 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]+ 1001 [M-NO2-CI"] 956 [М-2 2-СГ]. Электронный спектр, DMSO, ? , нм, (ε·10"3): 404 (1,163), 500,2 (0,986), 623,4 (0,540).
Пример 3
6,7-бис-(Амид 1Ч -глицил)-протогемин (IX) (IV)
Выход 0.092 г (68%). ИК-Фурье спектр, ν, см'1, таблетка КВг: 1654 (амид I), 1536 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: 728 [М-С1"]+. Электронный спектр, DMSO, λ , нм, (ε-ΙΟ'3): 402,0 (101 ,2), 504,2 (7,417), 628,6 (4,201).
Пример 4
6,7-бис-(Амид 1Ча-серил)-протогемин (IX) (V)
Выход 0,105г (72%). ИК-Фурье спектр, ν, см"1, таблетка КВг: 1651 (амид I), 1530 (амид И). Масс-спектр (MALDI), m/z: 788 [М-СГ]+. Электронный спектр, DMSO, нм, (ε· 10"3): 404,8 (207,12), 499,2 (6,547), 623,4 (3,603).
Пример 5
6,7-бис-[(метиловый эфир ^-Ь-серил)-Ь-аргинил]-протогемин IX (XIX)
Выход 30 мг (65%), Rf 0,43 (5), ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 3338 (NH), 1740(С=О сл. эф.), 1653 (амид I), 1545 (амид II). Масс-спектр (MALDI): [М- С1']+ 1131,5. Электронный спектр, DMSO, " , нм, (ε·10"3): 401,8 (63), 585 (3,18).
Пример 6
6,7-бис-[(амид ^-Ь-серил)-Ь-аргинил]-протогемин IX (XX)
Выход 27 мг (58%), Rf 0,25 (6), ИК-Фурье спектр, v, см*1, таблетка КВг: 3388(NH), 1652 (амид I), 1544 (амид И). Масс-спектр (MALDI): [М-С1-]+ 1 100. Электронный спектр, DMSO, * , нм, (ε·10"3): 400,8 (47), 581,6 (3,34).
Пример 7
6,7-бис-[(метиловый эфир ^-Ь-аргинил)-Ь-серил]-протогемин IX (XXI)
Выход 22 мг (55%), Rf 0.6 (9), ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВг: 3326 ( H), 1738 (С=0 сл. эф.), 1627 (амид I), 1577 (амид II). Масс-спектр (MALDI): [М- Cl"]+ 1132. Электронный спектр, DMSO, нм, (ε ΐθ'3): 404,8 (61), 495,6 (3,44), 619,6 (1,9).
Пример 8
6,7-бис-[(1Ча-Ь-серил)-Ь- аргинил]-протогемин IX (XXII)
Выход 30 мг (65%), Rf 0,18 (5), ИК-Фурье спектр, v, см'1, таблетка КВг: 3396 (NH), 1645 (амид I), 1550 (амид II) . Масс-спектр (MALDI): [M-C1-J+ 1 102,5 Электронный спектр, DMSO, нм, (ε·10'3): 404 (76), 495 (5,11), 610 (3,1).
Пример 9
6,7-бис-[(амид Na-L- аргинил)-Ь -серил]-протогемин IX (XXIII)
Выход 27 мг (58%), Rf 0,3 (9), ИК-Фурье спектр, v, см*1, таблетка КВг: 3365 (NH), 1655 (амид I), 1542 (амид II). Масс-спектр (MALDI): [М-С1-]+ 1 100. Электронный спектр, DMSO, * , нм, (ε·10'3): 402,2 (65,3), 496,4 (4,0), 618,2 (2,1).
Пример 10
6,7-бис-[( Na-L -аргинил)^- серил]-протогемин IX (XXIV)
Выход 22 мг (55%), Rf 0,2 (9), ИК-Фурье спектр, v, см'1, таблетка КВг: 3340 (NH), 1659 (амид I), 1550 (амид II) . Масс-спектр (MALDI): [М-С1-]+ 1102. Электронный спектр, DMSO, нм, (ε·10'3): 403,8 (146), 498,4 (8.1), 620,4 (4,9).
Таблица 1
Физико-химические характеристики защищенных промежуточных дипептидов
Figure imgf000015_0001
Общая методика получения защищенных пептидов (таблица 1)
К раствору (0,64 ммоль) BocSer(Bzl)ONSu или Z3ArgONSu в 3 мл ДМФ добавляли раствор (0,7 ммоль) соответствующего аминокомпонента и (0,83 ммоль) триэтиламина в смеси 2 мл ДМФ и 0,3 мл воды. Реакционную смесь перемешивали 1 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляли в вакууме, остаток растворяли в 10 мл н-бутанола и экстрагировали 3x10 мл насыщенного водного раствора NaCl. Органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия и отфильтровывали. Растворитель удаляли в вакууме, остаток сушили в эксикаторе при пониженном давлении над хлоридом кальция, затем растворяли в 1 мл безводного метанола и отфильтровывали соли. Растворитель удаляли в вакууме. При необходимости целевое вещество очищали перекристаллизацией или колоночной хроматографией на силикагеле.
Общая методика получения соединений VI- VIII
К раствору или суспензии аминокислоты (0,945 ммоль) в 0,5 мл воды добавляли 0,130 мл (для серина и глицина) или 0,260 мл (для глутаминовой кислоты и дигидрохлоридов аргинина и гистидина) триэтиламина. Полученный раствор добавляли к 6,7-бис->Т-оксисукцинимидного эфира гемина (100 мг, 0,118 ммоль) в 6 мл диметилформамида и перемешивали 30 мин. Реакционную массу концентрировали в вакууме до объема 1 мл. Для нерастворимых в воде соединений VI-VIII к сконцентрированной реакционной массе добавляли 10 мл водного 0,01 М раствора соляной кислоты, осадок отделяли и промывали водой до нейтральной реакции. Осадок сушили в эксикаторе при пониженном давлении над хлоридом кальция в течение суток.
Пример 11
6,7-бис-(1Ч°-серил)-протогемин (IX) (VI)
Выход 84,7 мг (87%). ИК- спектр (KBr, V^/CM-1): 1727 (СООН), 1656 (С=0 амид I), 1530 (С=0 амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: 790 [М-С1']+. Электронный спектр, DMSO, λ™*, нм, (ε·10"3): 403(188), 497 (8,51), 622 (4,49).
Пример 12
6,7-бис-(1Ч°-глицил)-протогемин (IX) (VII)
Выход 77,7 мг (86%). ИК-спектр (KBr, vmax/cM_1): 3294 (NH), 1724 (СООН), 1656 (С=0 амид I), 1543 (С=0 амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: 730,1 [М-С1"]+. Электронный спектр, DMSO, , нм, (ε·10'3): 404 (126), 498 (8,02), 622 (4,48).
Пример 13
6,7-бис-(1Ч"-глутамил)-протогемин (IX) (VIII)
Выход 88 мг (82%). ИК- спектр (KBr, CM"1): 3286 (NH), 172 (СООН), 1644 (С=0 амид I), 1544 (СЮ амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: 874 [М-С1"]+. Электронный спектр, DMSO, λ^, нм, (ε· 10'3): 404 (76,7), 496 (8,79), 615 (6,02). Общая методика получения соединений IX-XIV
К 0,070 г (0,077 ммоль) 6,7-бис-На-глутамил-протогемина (IX) в 5 мл ДМФА добавляли 0,148 г (0,462 ммоль) TBTU и 0,086 мл (0,462 ммоль) Et3N. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин. К суспензии 0,462 ммоль гидрохлорида аминокомпонента в 1,5 мл DMF прибавляли 0,086 мл (0,462 ммоль) Et3N и перемешивали при комнатной температуре 3 мин, после чего полученный раствор добавляли к раствору преактивированного 6,7-бис-Ма-глутамил- протогемина (IX). Реакционную массу перемешивали в течение суток, после чего концентрировали в вакууме до объема 1 мл. Для нерастворимых в воде соединений (XI и XIV) к сконцентрированной реакционной массе добавляли 10 мл водного 0,1 М раствора соляной кислоты, осадок отделяли и промывали водой до нейтральной реакции. Осадок сушили в эксикаторе при пониженном давлении над хлоридом кальция в течение суток. Для водорастворимых соединений (IX, X и XIII) к сконцентрированной реакционной массе добавляли 0,01 М раствора соляной кислоты в насыщенном водном растворе NaCl. Осадок отделяли и сушили в эксикаторе при пониженном давлении над хлоридом кальция в течение суток, затем растворяли в 1 мл безводного метанола и отфильтровывали нерастворившийся NaCl, после чего очищали с помощью гель-фильтрации на колонке 20x2 см, заполненной Sephadex LH20, элюируя метанолом. Содержащие целевой продукт фракции объединяли, растворитель удаляли в вакууме. Целевой продукт сушили в эксикаторе при пониженном давлении над хлоридом кальция в течение суток.
Пример 14
6,7-бис-[(Ди-амид 1Ча-Ь-аргинил)-1.-глутамил]-протогемин IX (IX)
Выход 0,082 г (71%). ИК-Фурье спектр, v, см"1, таблетка КВп 1658 (амид I), 1541 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: 1495 [М-СГ]+ Электронный спектр, DMSO, тах, нм, (ε·10'3): 396,8 (137,83), 505,6 (13,404), 623,2 (6,419).
Пример 15
6,7-бис-[(Ди-метиловый эфир Ка-Ь-серил)-Ь-глутамил]-протогемин IX
(X)
Выход 0,068 г (67%). ИК-Фурье спектр, ν, см'1, таблетка КВп 1747 (СО сл.эф.), 1646 (амид I), 1542 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: 1313 [М-СГ]+ Электронный спектр, DMSO, нм, (ε·10'3): 404,6 (124,25), 500 (7,434), 622,2 (4,032)
Пример 16
6,7-бис-[(Ди-2-гидроксиэтиламид)-Ь-глутамил]-протогемин IX (XI)
Выход 0,054 г (64%). ИК-Фурье спектр, ν, см"1, таблетка КВг: 1654 (амид I), 1547 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: 1046 [М-СГ]+ Электронный спектр, DMSO, ^ах, нм, (ε·10'3): 403,2 (107,83), 502,3 (9,041), 635,2 (6,591).
Пример 17
6,7-бис-|(Диамид 1Ч"-Ь-серил)-Ь-глутамил]-протогемин IX (XII)
Выход 0,074 г (76%). ИК-Фурье спектр, ν, см"1, таблетка КВг: 1651 (амид I), 1537 (амид И). Масс-спектр (MALDI), m/z: 1218 [М-СГ]+ Электронный спектр, DMSO, max, нм, (ε·10"3): 398,6 (89,41), 497,4 (4,162), 619,4 (2,124).
Пример 18
6,7-бис-[(Ди-амид 1Ч -Ь-глицил)-Ь-глутамил]-протогемин IX (XIII)
Выход 0,077 г (87%). ИК-Фурье спектр, ν, см'1, таблетка КВг: 1652 (амид I), 1539 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: 1098 [М-СГ]+ Электронный спектр, DMSO, ? нм, (ε·10-3): 404,4 (88,0), 497,8 (5,184), 621,8 (2,728).
Пример 19
6,7-бис-[(Ди-метиловый эфир ]Ча-Ь-глицил)-Ь-глутамил]-протогемин
IX (XIV)
Выход 0,072 г (78%).ИК-Фурье спектр, ν, см'1, таблетка КВг: 1738 (СО сл.эф.), 1652 (амид I), 1535 (амид II). Масс-спектр (MALDI), m/z: 1158 [М-СГ]+ Электронный спектр, DMSO, ? нм, (ε·10'3): 404,4 (88,0), 497,8 (5,184), 621,8 (2,728).
Пример 20
Гидрофильность соединений общей формулы (I)
С помощью программы ACDLabs 8.0 были вычислены коэффициенты распределения октанол/вода (CLogP) заявляемых соединений общей формулы I: II, IV, V, IX, X, XII, XIII, XIV, а также ранее известных соединений общей формулы I, где Ri и R2 представляют собой ArgOMe (XV), Glu(ArgOMe)ArgOMe (XVI), GlyOMe (XVII), SerOMe (XVIII) [Патент RU 2415868 CI, опубликованный 10.04.2011].
Из фиг. 1 видно, что замещение группы -ОМе на NH2-rpynny приводит к увеличению гидрофильности производных гемина. Таким образом, новые заявляемые соединения общей формулы I обладают большей гидрофильностью, чем ранее известные.
Пример 21
Антибактериальная активность соединений общей формулы I, в том числе в отношении резистентных штаммов бактерий
Пример 21.1
Для определения антибактериальной активности веществ были использованы штаммы грамположительных бактерий Staphylococcus aureus 209Р, Enterococcus faecalis ВКМ B-871 , Micrococcus luteus ВКМ Ac-2230, Bacillus subtilis ВКМ B-501 и грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa PAOl и Escherichia coli KM МГУ C-600. Штаммы с маркировкой ВКМ были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН. Штамм Staphylococcus aureus 209Р был получен из коллекции кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова, a Pseudomonas aeruginosa PAOl - из коллекции микроорганизмов Института биоорганической химии РАН.
Основные параметры, которые характеризуют антибактериальную активность - это минимальная ингибирующая концентрация (МИК) и минимальная бактерицидная концентрация (МБК). МИК - это наименьшая концентрация исследуемого соединения, полностью ингибирующая размножение бактерий в жидкой среде. МБК - это наименьшая концентрация, вызывающая гибель всех клеток.
МИК оценивали методом ингибирования роста культуры в жидкой среде с серийными разведениями веществ по модифицированной методике [Amsterdam, D. 1996. Susceptibility testing of antimicrobials in liquid media, pp.52-11 1. In Loman, V., ed. Antibiotics in laboratory medicine, 4th ed. Williams and Wilkins, Baltimore].
Бактерии культивировали и тестирование проводили в жидкой среде МН
(среда Mueller-Hinton: сухой экстракт говяжьего бульона 4 г/л, крахмал 1,5 г/л, гидролизат казеина 17,5 г/л; Sigma-Fluka каталожный номер 70192) при 37°С, 100% влажности и перемешивании. Для тестирования использовали культуру (с 4 по 7 пересев от разморозки) в экспоненциальной фазе роста.
Все исследуемые соединения поглощают свет на длине волны 595 нм, используемой для оценки роста бактериальной культуры. Поэтому при оценке оптической плотности суспензии бактерий учитывали поправку на поглощение каждого соединения с учетом его концентрации в лунке. Ингибирование роста (ИР) бактерий рассчитывали в процентах через 20 часов инкубации клеток с веществами по оптической плотности (А) измеряемой в каждой лунке на длине волны 595 нм, используя формулу:
ИР1=[(АкгАкоИА1,-Аю)]х100/(АкГАк0) (1), где индекс i обозначает номер лунки, к - контрольная лунка с бактериями, в которую исследуемое соединение не вносится, 0 - измерение проводится сразу же после внесения исследуемого вещества в лунку, t- измерение через 20 часов после внесения вещества.
Для определения антибактериальной активности исследуемых соединений использовали следующий экспериментальный протокол. Криопробирку с культурой тестируемого штамма в среде с 7% DMSO, хранившуюся в жидком азоте, быстро размораживали, 100 мкл суспензии клеток добавляли к 1,5 мл свежей среды МН. Клетки растили в течение суток при температуре 37°С и перемешивании на орбитальном шейкере со скоростью 150 об/мин. Морфологические признаки штамма и отсутствие контаминации посторонними бактериями проверяли (а) путем посева на агаризованную (15 г/л агара) среду МН по форме и цвету образующихся колоний, (б) под микроскопом (Микмед-2, ЛОМО, Россия) с 40х объективом по характерным морфологическим признакам клеток. Далее бактерии культивировали в 1 мл жидкой среды МН при температуре 37°С и перемешивании. Клетки пересевали каждые сутки. Начиная с 3-его и заканчивая 6-м пересевом, культуру клеток использовали для постановки тестов.
Для постановки теста 5 мкл бактериальной суспензии в стационарной фазе роста переносили в 1 мл стерильной среды МН и инкубировали до достижения экспоненциальной фазы роста (3-5 ч, 37°С при перемешивании со скоростью 150 об/мин). Чтобы оценить концентрацию микроорганизмов, измеряли оптическую плотность (А) полученной бактериальной культуры на длине волны 595 нм. Считали, что А=0,2, измеренная от 200 мкл суспензии клеток в 96-луночном планшете с учетом поглощения среды, соответствует 4 108 клеток/мл для обоих используемых штаммов. С учетом измерения концентрации клеток суспензию разбавляли средой МН до 5х104-1х105 клеток/мл и переносили стерильный 96- луночный планшет по 100 мкл на лунку. Затем к клеткам вносили исследуемые соединения и делали серийные двукратные разведения этих соединений в лунках планшета. Максимальная концентрация веществ в серии составляла 10"4 М, минимальная - 1,6x10'6 М. Исследование антибактериальной активности выполняли в 2 повторах для каждого соединения, а результат усредняли.
В качестве контролей использовали: 100 мкл бактериальной культуры без добавления каких-либо веществ (4 лунки); бактериальная культура в которую добавлен 1% ДМСО или вода в объеме, как в лунках с максимальной концентрацией тестируемых соединений (4 лунки); 100 мкл стерильной среды МН без бактерий и без исследуемых веществ для контроля случайной контаминации в планшете (4 лунки).
Сразу после внесения соединений с помощью планшетного фотометра "Униплан" (Пикон, Россия) в каждой лунке измеряли А,о, а в контрольных лунках - Ак0 необходимые для расчета по формуле (1). Планшет инкубировали в течение 20 ч при температуре 37°С и перемешивании со скоростью 150 об/мин. Затем в каждой лунке измеряли Ajt> а в контрольных лунках - Ай и рассчитывали ингибирование роста бактерий по формуле (1). МИК определяли, как минимальную концентрацию исследуемого соединения, при которой ингибирование роста составляет 100%.
Для определения МБК среду из лунок, где концентрация исследуемого соединения равнялась МИК, МИКх2 и МИКх4, переносили на чашки Петри с агаризованной средой МН (15 г/л агара) и равномерно растирали по площади чашек стерильными шпателями. Чашки инкубировали 2 суток. МБК определяли, как наименьшую концентрацию исследуемого соединения, при которой колонии на чашке Петри не вырастают. Таблица 2
Характеристики антибактериальной активности соединений общей формулы I в отношении грамположительных бактерий Bacillus subtilis BKM B-501, Staphylococcus aureus 209P, Enierococcus faecalis BKM B-871, Micrococcus luteus BKM Ac-2230
Figure imgf000022_0001
**- МИК не достигнута Приведена максимальная использованная концентрация вещества,
н/и - не исследовано
В таблице 2 в качестве соединений сравнения приведены ранее известные соединения общей формулы (I), в которых Ri=R2=ArgOMe (XV), Glu(ArgOMe)ArgOMe (XVI), GlyOMe (XVII), SerOMe (XVIII) [Патент RU 2415868 CI, опубликованный 10.04.201 1]. Таким образом, соединения II, III, IV, V, IX, X, XIV по изобретению подавляют рост грамположительных бактерий S. aureus в микромолярном интервале концентраций (таблица 2). Эти соединения также проявляют бактерицидную активность в концентрациях до 25 мкМ.
Бактерии M.luteus высокочувствительны даже в субмикромолярных концентрациях к действию всех соединений (в отдельных случаях МИ <0,8 мкМ).
Энтерококки E.faecalis в среднем более устойчивы к действию данных соединений, чем микрококки M.luteus и стафилококки S.aureus. Наиболее эффективными соединениями в отношении E.faecalis оказались II и V: МИК<7 мкМ.
Практически все исследованные соединения проявляют активность в отношении грамположительных бактерий B.Subtilis,.
Пример 21.2
Для определения специфической активности веществ были также использованы штаммы Staphylococcus aureus jV° 25923 АТСС (American Type Culture Collection); Staphylococcus aureus Na 100 КС; Staphylococcus epidermidis N° 533; Enterococcus faecalis N° 559; Enterococcus faecium N° 569, Staphylococcus aureus 5 (MRS A), Staphylococcus aureus N° 3797 (MRS А). Для культивирования Staphylococcus aureus использовали готовую сухую среду - Триптиказо-соевый агар (Trypticase Soy Agar, BBL). Для культивирования Enterococcus faecalis использовали готовую сухую среду - Колумбийский агар (Columbia Agar Base, BBL). Среды стерилизовали автоклавированием при 121 °С в течение 15 минут. Бактериальный инокулюм был постоянный и составлял 5х105 КОЕ/мл (105 КОЕ/0,2мл). Для водорастворимых соединений с 2 по 8 лунки вносили растворитель (вода) по 15 мкл, затем в 1 лунку вносили 30 мкл стокового раствора исследуемого соединения в воде с концентрацией 1x103М и последовательным двукратным разведением доводили его концентрацию до 0,007x103М. Из каждой лунки отбирали по 10 мкл и добавляли по 190 мкл бактериальной культуры (105 КОЕ). Для растворимых в DMSO соединений с 2 по 8 лунки вносили растворитель (DMSO) по 10 мкл, затем в 1 лунку вносили 20 мкл стокового раствора исследуемого соединения в воде с концентрацией 5x103М и последовательным двукратным разведением доводили его концентрацию до 0,039х103М. Из каждой лунки отбирали по 2 мкл и добавляли по 198 мкл бактериальной культуры (105 КОЕ).
В качестве контроля включали лунки, не содержащие тестируемых препаратов (контроль роста культуры). Кроме того, ставился контроль чистоты питательных сред и растворителей. Планшеты инкубировали в термостате при 36°С в течение 24 часов.
Оценку роста культур проводили визуально, сравнивая рост микроорганизмов в присутствии изучаемых тест - соединений с ростом культуры без них. За МИК принимали последнее разведение испытуемых препаратов с подавлением роста бактериальной культуры.
Таблица 3
Характеристики антибактериальной активности соединений общей формулы I в отношении грамположительных бактерий
Staphylococcus aureus 25923, Staphylococcus aureus 100 КС, Staphylococcus epidermis 533, Enterococcus faecalis 559, ванкомицин-резистентного Enterococcus faecium 569 и грамотрицательных ванкомицин-резистентных бактерий Echerichia
со// 4300 (МИК, мкМ)
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
В таблице 3 в качестве соединений сравнения приведены ранее известные соединения общей формулы (I), в которых R i=R2=ArgOMe (XV) или GlyOMe (XVII) [Патент RU 2415868 С1, опубликованный 10.04.2011].
Новые соединения проявили активность в отношении грамположительных бактерий Staphylococcus aureus 25923, Staphylococcus aureus 100 КС и Staphylococcus epidermis 533, причем МИК не превышали 13 мкМ. Водорастворимость и антибактериальная активность дипептидных производных гемина в ряде случаев оказалась выше, чем у остальных ПГ. Так, соединение XIX показало на порядок более высокую антибактериальную активность в отношении Staphylococcus epidermis 533 (МИК 1.3 мкМ).
В отношении Enterococcus faecalis 559 заявляемые соединения проявили несколько меньшее антибактериальное действие.
Выраженную антибактериальную активность против резистентных к ванкомицину бактерий Enterococcus faecium 569 проявили соединения II (МИК=3,12 мкМ), IV (МИК=50 MKM),V (МИК=25 мкМ), IX (МИК=6,25 мкМ), XIX-XXI (МИК=6,25 мкМ).
По отношению к грамотрицательной бактерии E.coli 4300 оказались активными соединения II (МИК=41,6 мкМ) и IX (МИК=16,6 мкМ).
В отношении грамотрицательных бактерий E.coli оказались активными II (МИК=41,6 мкМ) и IX (МИК=16,6 мкМ).
Таблица 4
Характеристики антибактериальной активности соединений общей формулы I в отношении метициллин-резистентных грамположительных бактерий
Staphylococcus aureus JN° 5, Staphylococcus aureus 3797 (МИК, мкМ)
St.aur N° 5 MRS A St.aur Wo 3797 MRSA
II 41 50
III 25 25
IV 3,12 3,12
V 1,56 1 ,56
VI 0,78 0,78
VII 6,25 6,25
XI 12,5 12,5 XIII 83 50
XIV 3,12 2,6
XIX 1 ,56 1,3
XX 3,12 1,3
XXI 0,65 1 ,56
XXII 25 20,8
XXIII > 50,0 > 50,0
XXIV 25 25
Как видно из таблицы 4, новые соединения проявили высокую антибактериальную активность в отношении MRSA-штаммов, при этом МПК лежали в интервале 0,78-13 мкМ.
Пример 22
Противовирусная активность производных гемина в отношении вирусов семейства Herpesviridae
Для исследований использовали вирус простого герпеса 1 типа (коллекция НИИ вирусологии, штамм ЕС), вирус простого герпеса 2 типа штамм G (АТСС #VR-734) и цитомегаловирус человека штамм AD169 (АТСС #VR-538). Вирусы простого герпеса 1 и 2 типов культивировали в клетках Vero. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере 5% С02 в газопроточном инкубаторе Sanyo МСО-15АС (Токио, Япония) в ростовой среде MEM Игла (среда MEM, БиолоТ, Санкт-Петербург, кат.# 1.3.3) с добавлением 10% фетальной сыворотки (БиолоТ, Санкт-Петербург, кат.#1.1.12). Посевная доза клеток составляла порядка 2х 105 клеток/мл в исходном материале, или 2x104 клеток в лунке. Вирусы простого герпеса культивировали в тех же условиях в среде MEM без сыворотки (поддерживающая среда). Исходные титры вирусов составили 10 TCIDso/мл.
Из DMSO-растворимых препаратов готовили маточные растворы концентрации 10 мМ в DMSO. Из водорастворимых препаратов готовили маточный раствор той же концентрации на среде MEM (Minimal Essential Medium) для культур клеток. Для контроля цитотоксичности (см. ниже) маточный раствор разводили в среде до концентрации 100 мкМ, после чего готовили серию десятикратных разведений препаратов на среде MEM (в случае DMSO- растворимых веществ - на среде MEM с 3% DMSO). В опыт по противовирусному действию брали следующие концентрации препаратов: в случае отсутствия токсичности 100 мкМ препаратов использовали концентрации испытуемых веществ 100, 10 и 1 мкМ, при наличии токсичности 100 мкМ препаратов - 10, 1 и 0,1 мкМ. В качестве препаратов сравнения для контроля адекватности вирусной модели использовали ацикловир (10 мкг/мл) для вирусов простого герпеса обоих типов.
Для изучения противовирусной активности препараты вносили в лунки планшета с монослоем клеток в объеме 0,1 мл на лунку. Чтобы компенсировать снижение концентрации препарата при последующем добавлении вирусов, использовали двукратные концентрации соединений, т.е. 200, 20 и 2 или 20, 2 и 0,2 мкМ для токсичных и нетоксичных в концентрации 100 мкМ препаратов, соответственно, инкубировали в течение 1 часа, после чего заражали изучаемыми вирусами в объеме 0,1 мл на лунку в дозах 1, 10 и 100 ТСШ50 (50% тканевая инфекционная доза).
Инфицированные клетки инкубировали в течение 48 часов при 37°С в атмосфере 5% С02, после чего визуально под инвертированным микроскопом Leica DMIL НС оценивали состояние монослоя, учитывая характер цитопатогенного действия, существенно различающийся для вируса и действия препарата при токсических его концентрациях. Вирусоспецифическое цитопатогенное действие проявлялось в увеличении размеров клеток, их округлении и отрыве от субстрата. Эти морфологические особенности резко отличали их от клеток, подвергшихся токсическому воздействию высоких концентраций исследуемых препаратов. Последние приобретали веретеновидную форму, утрачивали связь с соседними клетками монослоя, границы их становились резче.
Степень выраженности вирусоспецифических изменений в клетках оценивали полуколичественно по 4-балльной системе: 0 - ЦПД в клетках нет, 1 - вирусом поражены до 25% монослоя, 2 - от 25 до 50%, 3 - от 50 до 75%, 4 - от 75 до 100%. Противовирусную активность соединений оценивали по их способности снижать проявления цитопатогенного действия в лунках планшета по сравнению с контрольными значениями. Значимыми считали различия с контрольными значениями 1 балл и более. Противовирусная активность заявляемых соединений общей формулы (I) в отношении вируса герпеса простого 1 и 2 типов: проявления вирусного ЦПД (баллы) при различных концентрациях производных гемина, мкМ
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
-отличия от контрольных лунок без препарата: снижение степени ЦПД на 1 балл и более.
Как видно из таблицы 5, в отношении вирусов герпеса простого 1 типа оказались активными большинство исследованных заявляемых соединений в суб- и микромолярных концентрациях.
Пример 23
Токсичность новых соединений
Новые соединения практически не токсичны; гибель лейкоцитов 1-5% обнаруживается при концентрациях 12-50 мкМ.
Исследованные новые соединения также не вызывают значительного выхода гемоглобина из эритроцитов крови человека, который составляет не более 2-3% вплоть до концентраций 50 мкМ.
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности заявляемых веществ для создания на их основе нетоксичных, биосовместимых антибактериальных и противовирусных агентов, в том числе для профилактики и лечения заболеваний, вызванных различными микроорганизмами.
Таким образом, по сравнению с ранее известными соединениями [Патент
RU 2415868 С1, опубликованный 10.04.2011, Патент RU 2404191 С2, опубликованный 20.11.2010] заявляемые соединения обладают большей водорастворимостью, проявляют антибактериальную активность в более низких концентрациях, в том числе против грамположительных и грамотрицательных резистентных штаммов бактерий, оказывают противовирусное действие в отношении вирусов герпеса 1 и 2 типов, что повышает их потенциальную практическую ценность как противоинфекционных агентов.
Пример 24
Композиции настоящего изобретения могут быть использованы в виде дезинфицирующих, антисептических и фармацевтических препаратов (например, в твердой, полутвердой или жидкой формах), содержащих предлагаемые в настоящем изобретении соединения в качестве активных ингредиентов в смеси с органическим или неорганическим носителем или наполнителем, приемлемым для внутримышечного, внутривенного, интраназального, перорального, сублингвального, ингаляционного и интраректального введения. Активный ингредиент может быть включен в композицию вместе с обычно используемыми нетоксичными, фармацевтически приемлемыми носителями, пригодными для изготовления растворов, таблеток, пилюль, капсул, суппозиториев, эмульсий, суспензий, спреев, ингаляторов, капель, мазей и любых других лекарственных форм. В качестве носителей могут быть использованы вода, глюкоза, лактоза, аравийская камедь, желатин, крахмал, триксилит магния, тальк, кукурузный крахмал, мочевина, полиэтиленгликоль и другие носители, пригодные для изготовления твердых, мягких или жидких препаратов. При этом в качестве добавок могут быть использованы стабилизаторы, загустители, красители и отдушки.
Соединение общей формулы (I) вводят в композицию в количестве, достаточном для получения нужного антибактериального и/или противовирусного эффекта.
При изготовлении разовой лекарственной формы количество активного ингредиента, используемого в комбинации с носителем, может варьировать в зависимости от реципиента, подвергающегося лечению, от конкретного способа введения лекарственного средства.
Так, например, при использовании соединений настоящего изобретения в виде растворов для инъекций содержание активного ингредиента в них составляет 0,001-1%. В качестве разбавителя вещества могут быть использованы 0,9% раствор натрия хлорида, дистиллированная вода, раствор новокаина для инъекций, раствор Рингера, раствор глюкозы. При использовании соединения общей формулы (I) в виде таблеток и суппозиториев количество вещества составляет 1,0-100,0 мг на единичную дозированную форму. Для таблеток и суппозиториев в качестве фармацевтического наполнителя используют любую фармацевтически пригодную основу.
Примеры лекарственных форм
А. Желатиновые капсулы
Состав вводимого в капсулу порошка:
Соединение, соответствующее общей формуле (I) 1-50 мг,
Оксид магния 50 мг,
Крахмал 100-200 мг
Указанные выше ингредиенты смешивают, и смесь вводят в твердые желатиновые капсулы в количестве 151-285 мг. Б. Таблетированная форма
Таблетированную форму получают, используя приведенные ингредиенты:
Соединение, соответствующее общей формуле (I) 1-50 мг
Крахмал картофельный 100 мг
Поливинилпирролидон 10 мг
Магния стеарат 2 мг
Лактоза 48-82 мг
Аэросил 5 мг
Компоненты смешивают и прессуют для образования таблеток весом 200 мг каждая.
В. Аэрозольная форма
Состав аэрозольной смеси, рассчитанной на 10 приемов:
Соединение, соответствующее общей формуле (I) 10-100 мг
Магния сульфата 150 мг
Лактоза 1 10- 140 мг
Соединение смешивают с наполнителями и помещают в специальное устройство для распыления.
Г. Суппозитории
В качестве суппозиторной основы могут быть использованы:
основы, не растворимые в воде - масло какао;
основы, растворимые в воде или смешиваемые с водой - желатино- глицериновые или полиэтиленоксидные;
комбинированные основы - мыльно-глицериновые.
Пример состава суппозитория:
Соединение, соответствующее общей формуле (I) - 1-50 мг,
Масло какао - количество, необходимое для получения суппозитория При необходимости возможно изготовление ректальных, вагинальных и уретральных суппозиториев с соответствующими наполнителями.
Д. Мази
В качестве мазевой основы могут быть использованы:
углеводородные мазевые основы - вазелин белый и желтый (Vaselinum album, Vaselinum flavum), вазелиновое масло (Oleum Vaselini), мазь белая и жидкая (Unguentum album, Unguentum flavum), а в качестве добавок для придания более плотной консистенции твердый парафин и воск;
абсорбтивные мазевые основы - гидрофильный вазелин (Vaselinum hydrophylicum), ланолин (Lanolinum), кольдкрем (Unguentum leniens);
мазевые основы, смываемые водой - гидрофильная мазь (Unguentum hydrophylum); водорастворимые мазевые основы - полиэтиленгликолевая мазь (Unguentum Glycolis Polyaethyleni), бентонитовые основы и другие.
Пример состава мази:
Соединение соответствующее общей формуле (I) 0,01-0, 1 г
Вазелин Ю г
Мази изготавливают по соответствующей технологии.
Е. Раствор для инъекций
В качестве растворителя при приготовлении раствора для инъекций могут быть использованы: 0,9% раствор натрия хлорида, дистиллированную воду, раствор новокаина. Форма выпуска - ампулы, флаконы, шприц-тюбики,
Состав раствора для инъекций:
Соединение, соответствующее общей формуле (I) 1-50 мг
Вода дистиллированная 1-2 мл
Возможно изготовление различных лекарственных форм для инъекций - стерильных растворов, стерильных порошков и таблеток.
Примеры композиций для дезинфицирующих и антисептических средств
Ж. Соединение, соответствующее общей формуле I 0,001-1%
1-пропанол 30-40%
2-пропанол 10-70% вода дистиллированная 10-60%
3. Соединения, соответствующие общей формуле I 0,001-1%
Четвертичное аммониевое основание (или их смесь) 2-10%
Вода дистиллированная до 100%
И. Соединения, соответствующие общей формуле I 0,001-1%
Диметилсульфоксид (DMSO) 1-20%
или полиэтиленгликоль (PEG) М.М. 200-12000 1-20% вода дистиллированная до 100%
К. Соединения, соответствующие общей формуле 1 0,001-1%
Смесь спиртов, DMSO, PEG, ПАВ в различных
сочетаниях и соотношениях 1-80%
вода дистиллированная до 100%
Л. Соединения, соответствующие общей формуле 0,001-1% вода дистиллированная до 100%
Таким образом, предлагаемые в настоящем изобретении новые производные гемина общей формулы (I), обладают повышенными водорастворимостью, антибактериальной активностью, в том числе в отношении резистентных штаммов бактерий, противовирусной активностью, в том числе против вируса герпеса. Кроме того, среди новых соединений выявлены производные гемина, активные в отношении резистентных штаммов грамотрицательных бактерий. Эффективность отдельных представителей новых соединений, соответствующих общей формуле I, подтверждает их пригодность для применения в составе дезинфицирующих, антисептических и терапевтических средств с антибактериальным и/или противовирусным действием.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединение об ей формулы (I)
Figure imgf000037_0001
где Ri и R.2, оба, представляют собой ArgNH2, Arg(N02)OMe, GlyNH2, SerNH2, SerOH, GlyOH, Glu(OH)OH, Glu(ArgNH2)ArgNH2, Glu(SerOMe)SerOMe, Glu(NHCH2CH2OH)NHCH2CH2OH, Glu(SerNH2)SerNH2, Glu (GlyNH2)GlyNH2 или Glu(GlyOMe)GlyOMe, ArgSerOMe, ArgSerNH2> ArgSerOH, SerArgOH, SerArgNH2 и SerArgOMe; Men+ представляет собой Fe + или Fe3+; НаГ представляет собой F", СГ, Br" или Г,
или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Соединение или его соль по п. 1, в котором: R| и R2 оба представляют собой ArgNH2> GlyNH2, SerNH2, Glu(ArgNH2)ArgNH2, Glu(SerNH2)SerNH2 или Glu(GlyNH2)GlyNH2, ArgSerNH2, SerArgNH2.
3. Соединение или его соль по п. 1, в котором: Ri и R2 оба представляют собой SerOH, GlyOH или Glu(OH)OH, ArgSerOH, SerArgOH.
4. Соединение или его соль по п. 1, в котором: Ri и R2 оба представляют собой Glu(NHCH2CH2OH)NHCH2CH2OH, Glu(GlyOMe)GlyOMe, ArgSerOMe, SerArgOMe.
5. Фармацевтическая композиция, обладающая антибактериальной и/или противовирусной активностью, включающая в качестве активного ингредиента соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль по любому из п.п. 1-4.
6. Фармацевтическая композиция по п. 5, включающая в качестве активного ингредиента соединение общей формулы (I) или его соль по п. 2.
7. Фармацевтическая композиция по п. 5, включающая в качестве активного ингредиента соединение общей формулы (I) или его соль по п. 3.
8. Фармацевтическая композиция по п. 5, включающая в качестве активного ингредиента соединение общей формулы (I) или его соль по п. 4.
9. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 5-8, которая проявляет активность в отношении грамположительных бактерий рода Staphylococcus, Enterococcus, Micrococcus, и/или Escherichia.
10. Фармацевтическая композиция по п.9, которая проявляет активность в отношении грамположительных бактерий рода Staphylococcus aureus,
Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium или грамотрицательной бактерии Escherichia coli.
11. Фармацевтическая композиция по п.10, которая проявляет активность в отношении грамположительных бактерий, где бактерии относятся к штамму Staphylococcus aureus 209Р, Enterococcus faecalis BKM B-871, Micrococcus luteus BKM Ac-2230, Staphylococcus aureus N° 25923 ATCC, Staphylococcus aureus Na 100 КС, Staphylococcus aureus jNb 5 MRSA, Staphylococcus aureus jVa 3797 MRSA, Staphylococcus epidermidis N° 533, Enterococcus faecalis N° 559, Enterococcus faecium J a 569 или грамотрицательной бактерии Escherichia coli 4300.
12. Фармацевтическая композиция по любому из п.п. 5-8, которая проявляет активность в отношении вирусов герпеса.
13. Фармацевтическая композиция по п.12, которая проявляет активность в отношении вирусов герпеса простого 1 и/или 2 типа.
14. Фармацевтическая композиция по п.12, которая проявляет активность в отношении вирусов герпеса простого 1 типа, штамм ЕС, и 2 типа, штамм G
(ATCC KaVR-734).
15. Лекарственное средство, обладающее антибактериальной и/или противовирусной активностью, представляющее собой производное гемина общей формулы (I) или его фармацевтическую соль по любому из п.п. 1-4.
16. Лекарственное средство по п. 15, представляющее собой соединение общей формулы (I) или его соль по п. 2.
17. Лекарственное средство по п. 15, представляющее собой соединение общей формулы (I) или его соль по п. 3.
18. Лекарственное средство по п. 15, представляющее собой соединение общей формулы (I) или его соль по п. 4.
19. Лекарственное средство по любому из п.п. 15-18, которое проявляет активность в отношении грамположительных бактерий рода Staphylococcus,
Enterococcus, Micrococcus, и/или Escherichia.
20. Лекарственное средство по п.19, которое проявляет активность в отношении грамположительных бактерий рода Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium или грамотрицательной бактерии Escherichia coli.
21. Лекарственное средство по п. 20, которое проявляет активность в отношении грамположительных бактерий, где бактерии относятся к штамму Staphylococcus aureus 209Р, Enterococcus faecalis BKM B-871, Micrococcus luteus BKM Ac-2230, Staphylococcus aureus N° 25923 ATCC, Staphylococcus aureus Ν° 100 КС, Staphylococcus aureus N° 5 MRS A, Staphylococcus aureus N° 3797 MRS A, Staphylococcus epidermidis N° 533, Enterococcus faecalis N° 559, Enterococcus faecium N° 569 или грамотрицательной бактерии Escherichia coli 4300.
22. Лекарственное средство по любому из п.п. 15-18, которое проявляет активность в отношении вирусов герпеса.
23. Лекарственное средство по п. 22, которое проявляет активность в отношении вирусов герпеса простого 1 и/или 2 типа.
24. Лекарственное средство по п. 22, которое проявляет активность в отношении вирусов герпеса простого 1 типа, штамм ЕС, и 2 типа, штамм G (ATCC J42VR-734).
25. Способ получения соединения общей формулы (I) по любому из п.п.1- 4, включающий взаимодействие активированного по карбоксильной группе производного гемина с аминокомпонентом.
26. Способ по п. 25, где в качестве активированного производного гемина используют 6,7-бис->}-оксисукцинимидный эфир гемина, а в качестве растворителя используют Ν,Ν-диметилформамид.
27. Способ по п. 25, где в качестве активированного производного гемина используют 6,7-бис- -оксисукцинимидный эфир гемина, в качестве аминокомпонента - незащищенную аминокислоту или пептид, а в качестве растворителя используют Ν,Ν-диметилформамид, содержащий до 10% воды и триэтиламин.
28. Способ получения соединения общей формулы (I) по любому из п.п. 1- 4, включающий прямое присоединение защищенных по СООН группе производных аминокислот и пептидов к конъюгату гемина с глутаминовой кислотой в присутствии конденсирующего агента TBTU.
29. Дипептид, выбранный из группы HSerArgOMe, BocSer(Bzl)ArgOMe, BocSer(Bzl)ArgNH2, Z3ArgSerOMe, Z3ArgSerNH2, Z3ArgSerOH.
PCT/RU2012/000939 2011-11-17 2012-11-15 Новые производные гемина с антибактериальной и противовирусной активностью WO2013073998A2 (ru)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201280062451.7A CN104039824B (zh) 2011-11-17 2012-11-15 具有抗菌和抗病毒活性的氯高铁血红素之新衍生物
SI201231693T SI2781525T1 (sl) 2011-11-17 2012-11-15 Derivati hemina s protibakterijskim in protivirusnim delovanjem
PL12850312T PL2781525T3 (pl) 2011-11-17 2012-11-15 Pochodne heminy z aktywnością przeciwbakteryjną i przeciwwirusową
ES12850312T ES2755937T3 (es) 2011-11-17 2012-11-15 Derivados de hemina con actividad antibacteriana y antiviral
UAA201406790A UA116877C2 (uk) 2011-11-17 2012-11-15 Сполука з антибактеріальною і/абопротивірусною активністю
EA201490963A EA023667B1 (ru) 2011-11-17 2012-11-15 Новые производные гемина с антибактериальной и противовирусной активностью
US14/358,998 US9605013B2 (en) 2011-11-17 2012-11-15 Derivatives of hemin with antibacterial and antiviral activity
EP12850312.5A EP2781525B1 (en) 2011-11-17 2012-11-15 Derivatives of hemin with antibacterial and antiviral activity
DK12850312T DK2781525T3 (da) 2011-11-17 2012-11-15 Derivater af hæmin med antibakteriel og antiviral aktivitet
CY20191101177T CY1122496T1 (el) 2011-11-17 2019-11-11 Παραγωγα αιμινης με αντιβακτηριακη και αντιιικη δραστικοτητα

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011146831 2011-11-17
RU2011146831/04A RU2475498C1 (ru) 2011-11-17 2011-11-17 Новые производные гемина с антибактериальной и противовирусной активностью

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2013073998A2 true WO2013073998A2 (ru) 2013-05-23
WO2013073998A3 WO2013073998A3 (ru) 2013-08-08

Family

ID=48430327

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2012/000939 WO2013073998A2 (ru) 2011-11-17 2012-11-15 Новые производные гемина с антибактериальной и противовирусной активностью

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9605013B2 (ru)
EP (1) EP2781525B1 (ru)
CN (1) CN104039824B (ru)
CY (1) CY1122496T1 (ru)
DK (1) DK2781525T3 (ru)
EA (1) EA023667B1 (ru)
ES (1) ES2755937T3 (ru)
HU (1) HUE046503T2 (ru)
PL (1) PL2781525T3 (ru)
PT (1) PT2781525T (ru)
RU (1) RU2475498C1 (ru)
SI (1) SI2781525T1 (ru)
UA (1) UA116877C2 (ru)
WO (1) WO2013073998A2 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2656595C1 (ru) * 2018-03-16 2018-06-06 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Циклическое производное гемина с антимикробными свойствами и способ его синтеза
US11910795B2 (en) 2013-03-15 2024-02-27 Suncor Energy Inc. Natural indole auxin and aminopolycarboxylic acid herbicidal compositions

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111848656B (zh) * 2020-06-24 2023-03-14 天津大学 离子修饰的原卟啉镓化合物及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2250906C2 (ru) 2003-07-10 2005-04-27 Небольсин Владимир Евгеньевич Способы получения геминпептидов и их применение в качестве нуклеолитических агентов
RU2404191C2 (ru) 2007-07-09 2010-11-20 ООО "Фарминтерпрайсез" Производные гемина или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, композиция и применение
RU2415868C1 (ru) 2009-09-10 2011-04-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Производные гемина, обладающие антимикробной активностью, или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, фармкомпозиция и применение

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2088593A1 (en) 1990-07-31 1992-02-01 Attallah Kappas Use of metalloporphyrins to potentiate aids therapy
RU2238950C2 (ru) * 2002-04-25 2004-10-27 Небольсин Владимир Евгеньевич Производные гемина и их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, применение и фармацевтическая композиция
RU2280649C1 (ru) * 2004-11-26 2006-07-27 ООО "Фарминтерпрайсез" Геминпептиды, их фармацевтически приемлемые соли, фармкомпозиция и применение в качестве противоопухолевых агентов
RU2296131C2 (ru) * 2004-11-26 2007-03-27 ООО "Фарминтерпрайсез" Геминпептид, его фармацевтически приемлемые соли и применение в качестве противовирусного и вирулецидного агента

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2250906C2 (ru) 2003-07-10 2005-04-27 Небольсин Владимир Евгеньевич Способы получения геминпептидов и их применение в качестве нуклеолитических агентов
RU2404191C2 (ru) 2007-07-09 2010-11-20 ООО "Фарминтерпрайсез" Производные гемина или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, композиция и применение
RU2415868C1 (ru) 2009-09-10 2011-04-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Производные гемина, обладающие антимикробной активностью, или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, фармкомпозиция и применение

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMSTERDAM, D.: "Antibiotics in laboratory medicine", 1966, WILLIAMS AND WILKINS, article "Susceptibility testing of antimicrobials in liquid media", pages: 52 - 111
See also references of EP2781525A4
Y. NITZAN; H. LADAN; S. GOZANSKY; Z. MALIK: "Characterization of Hemin Antibacterial Action on Staphylococcus aureus", FEMS MICROBIOL. LETT., vol. 48, no. 3, 1987, pages 401 - 406, XP023921320, DOI: doi:10.1111/j.1574-6968.1987.tb02632.x

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11910795B2 (en) 2013-03-15 2024-02-27 Suncor Energy Inc. Natural indole auxin and aminopolycarboxylic acid herbicidal compositions
RU2656595C1 (ru) * 2018-03-16 2018-06-06 Общество С Ограниченной Ответственностью "Фарминтерпрайсез" Циклическое производное гемина с антимикробными свойствами и способ его синтеза

Also Published As

Publication number Publication date
SI2781525T1 (sl) 2020-02-28
PL2781525T3 (pl) 2020-05-18
WO2013073998A3 (ru) 2013-08-08
EA201490963A1 (ru) 2014-12-30
CN104039824B (zh) 2017-06-06
EP2781525A4 (en) 2015-05-27
DK2781525T3 (da) 2019-11-18
RU2475498C1 (ru) 2013-02-20
HUE046503T2 (hu) 2020-03-30
EP2781525B1 (en) 2019-10-16
US9605013B2 (en) 2017-03-28
UA116877C2 (uk) 2018-05-25
PT2781525T (pt) 2019-12-05
CN104039824A (zh) 2014-09-10
EA023667B1 (ru) 2016-06-30
CY1122496T1 (el) 2021-01-27
EP2781525A2 (en) 2014-09-24
ES2755937T3 (es) 2020-04-24
US20150031854A1 (en) 2015-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5524858B2 (ja) 抗菌性化合物
ES2576685T3 (es) Compuestos antimicrobianos
CA2761489C (en) High penetration prodrug compositions of peptides and peptide-related compounds
AU2013276480A1 (en) N-substituted second generation derivatives of antifungal antibiotic Amphotericin B and methds of their preparation and application
US11046730B2 (en) Antimicrobial compositions
CN104114547A (zh) 呫吨酮化合物的衍生物
JP2005509594A (ja) Ｎａｄシンテターゼ阻害剤およびその使用
WO2013073998A2 (ru) Новые производные гемина с антибактериальной и противовирусной активностью
RU2415868C1 (ru) Производные гемина, обладающие антимикробной активностью, или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения, фармкомпозиция и применение
US11014891B2 (en) Reduction-triggered antibacterial sideromycins
US6767718B2 (en) Lipodepsipeptide antibiotics and methods of preparation
EP3328877B1 (en) Peptoid
AU2002312656B2 (en) Peptoid compounds
Andruszkiewicz et al. Antimicrobial properties of N3-(iodoacetyl)-L-2, 3-diaminopropanoic acid-peptide conjugates
WO2010113042A1 (en) Antimicrobial cyclic peptides
US8541365B2 (en) Dendrimeric compounds comprising amino acids, hyperbranched core compound, process for preparation of dendrimeric compounds comprising amino acids and hyperbranched core compound, and use thereof
Borse et al. Dipeptide Conjugates: An Important Class of Therapeutic Agents
RU2656595C1 (ru) Циклическое производное гемина с антимикробными свойствами и способ его синтеза
CN113698460B (zh) 一种大肠杆菌lipid A结合基元PCK及其制备方法与应用
EP4139328A1 (en) Guanidine-modified c-terminus vancomycin compounds, compositions and methods
EP4132945A2 (en) Antibacterial lipopeptides, pharmaceutical composition and cosmetic composition comprising them, and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201490963

Country of ref document: EA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: A201406790

Country of ref document: UA

Ref document number: 2012850312

Country of ref document: EP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12850312

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14358998

Country of ref document: US