ES2755937T3 - Derivados de hemina con actividad antibacteriana y antiviral - Google Patents

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Abstract

Un compuesto de fórmula general (I)**Fórmula** en la que ambos R1 y R2 son iguales y representan sustituyentes seleccionados del siguiente grupo: ArgNH2, GlyNH2, SerNH2, Glu(ArgNH2)ArgNH2, Glu(SerNH2)SerNH2, Glu(GlyNH2)GlyNH2, ArgSerNH2, y SerArgNH2; Men+ es Fe2+ o Fe3+; Hal- es F-,Cl-,Br- o I-, o una sal del mismo aceptable para uso farmacéutico.

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados de hemina con actividad antibacteriana y antiviral
Campo técnico
La invención se refiere al campo de la química bioorgánica y está dirigida a la obtención de nuevos derivados de hemina y al desarrollo de agentes antibacterianos y antivirales y composiciones basadas en los mismos.
Antecedentes
Se sabe que muchas enfermedades peligrosas en seres humanos y animales son causadas por bacterias y virus. Las bacterias causan enfermedades epidémicas como el cólera, fiebre tifoidea, fiebre paratifoidea, peste, difteria, tularemia, brucelosis, así como tuberculosis, septicemia (envenenamiento de la sangre), lepra, sífilis y otras. En los animales, las bacterias causan equinia, ántrax, tuberculosis y otras enfermedades. La estrategia en la lucha contra los microorganismos implica la administración de agentes antibacterianos, incluidos los antibióticos; sin embargo, muchos agentes conocidos tienen desventajas tales como toxicidad, sensibilidad a las enzimas proteolíticas, un efecto hemolítico y un rango insuficiente de actividad antibacteriana. El desarrollo constante de cepas resistentes, es decir, cepas resistentes a agentes antibacterianos conocidos, es un problema grave. Por lo tanto, en este momento, por ejemplo, staphylococcus resistente a la meticilina (MRSA) que es resistente a un gran grupo de antibióticos betalactámicos es actualmente el más peligroso. El staphylococcus resistente a la meticilina causa enfermedades difíciles de tratar en humanos, tal como enfermedades de la sangre y neumonía. Se ha adaptado a meticilina, difloxacina y oxacilina. Este patógeno a menudo se asocia con infecciones nosocomiales. Cada año, más de 18.000 pacientes estadounidenses mueren a causa de infecciones por staphylococcus resistentes a la meticilina.
En este contexto, la búsqueda de nuevos agentes antibacterianos, incluidos los que son activos contra cepas resistentes, sigue siendo de gran interés.
Los virus también causan diferentes enfermedades, tales como gripe, infección viral respiratoria aguda (ARVI) y hepatitis viral. Los virus del herpes simple son los representantes más conocidos de los virus del herpes (la familia Herpesviridae) ya que infectan a casi todas las personas. Hay dos tipos de virus del herpes simple (HSV): HSV-1 (herpes oral) y HSV-2 (herpes genital). Los virus del herpes pueden afectar el sistema nervioso, los ojos y los órganos internos. El virus del herpes es la causa más común de encefalitis viral aguda en los EE.UU. El virus del herpes simple tipo 1 es un agente causal en más del 95% de los casos de encefalitis herpética. El aciclovir es un agente bien conocido contra los virus del herpes. Sin embargo, dado que ya existen cepas del virus del herpes resistentes al aciclovir, la búsqueda de nuevos agentes antiherpéticos sigue siendo de interés actual.
Se sabe que hemina tiene una actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus [Y. Nitzan, H. Ladan, S. Gozansky y Z. Malik, "Characterization of Hemin Antibacterial Action on Staphylococcus aureus," Microbiol FEMS. Lett., 1987, Vol. 48 (3), págs. 401-406]. Sin embargo, el uso de la hemina como agente antibacteriano se ve obstaculizado por su insolubilidad en agua, actividad hemolítica y efecto antibacteriano a corto plazo.
Se realizaron esfuerzos para modificar la hemina mediante la conjugación de la misma con aminoácidos, péptidos y derivados de los mismos para producir derivados biológicamente activos. La modificación de los grupos carboxi hemina para preparar las amidas correspondientes dio como resultado compuestos, que se estudiaron, de fórmula general (I)
Figure imgf000002_0001
en la que ambos R1 y R2 son iguales o diferentes, representando -OH o un aminoácido o resto peptídico, y en la que ambos R1 y R2 no pueden ser simultáneamente -OH. Men es Fe2+ o Fe3+; Hal- es F-, Cl-, Br- o I-, [patente RU No.
2250906, publicada el 27 de abril de 2005]. Se ha encontrado que estos derivados manifiestan diversas actividades biológicas, incluida la nucleasa [Patente RU No. 2404191, publicada el 20 de noviembre de 2010], [Patente RU No.
2250906, publicada el 27 de abril de 2005], peroxidasa, catalítica [Patente RU No. 2404191, publicada el 20 de noviembre de 2010], y actividades virulicidas [patente RU No., 2404191, publicada el 20 de noviembre de 2010].
Entre los derivados de hemina que se han sintetizado anteriormente por los presentes inventores, hay una serie de compuestos específicos que exhiben una actividad antimicrobiana (incluida la antibacteriana) [patente RU No. 2415868 C1, publicada el 10 de abril de 2011; también publicada como WO 2011/031187]. Estos compuestos representan principalmente conjugados de hemina con ésteres de aminoácidos y péptidos antimicrobianos, donde se ha encontrado que los derivados de hemina, en particular, R-i=R2=-GlyOMe, R-i=R2=-n Hc H2CH2OH, SerOMe o -Glu(ArgOMe)-ArgOMe, poseen actividad antibacteriana. Sin embargo, se descubrió que solo unos pocos derivados de hemina son efectivos contra cepas bacterianas resistentes, cuyos derivados también son poco solubles en agua y tienen una actividad menor. Por el momento, se han encontrado nuevos derivados de hemina, que demuestran actividades antibacterianas y antivirales y tienen propiedades mejoradas, en particular, poseen actividad contra las cepas de MRSA.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a novedosos derivados de hemina de la fórmula general (I)
Figure imgf000003_0001
en la que ambos R1 y R2 son iguales y representan sustituyentes seleccionados del siguiente grupo: ArgNH2, GlyNH2, SerNH2, Glu(ArgNH2)ArgNH2, Glu(SerNH2)SerNH2, Glu(GlyNH2)GlyNH2, ArgSerNH2, y SerArgNH2; Men+ es Fe2+ o Fe3+; Hal- es F-, Cl-, Br-o I-, o una sal de los mismos aceptable para uso farmacéutico.
Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica basada en los compuestos mencionados anteriormente y al uso de estos compuestos en la fabricación de medicamentos con actividad antibacteriana y/o antiviral.
También se divulga lo siguiente:
1. Un compuesto de la fórmula general (I)
Figure imgf000003_0002
en la que ambos R1 y R2 son iguales y representan ArgNH2, Arg(NO2)OMe, GlyNH2, SerNH2, SerOH, GlyOH, Glu(OH)OH, Glu(ArgNH2)ArgNH2, Glu(SerOMe)SerOMe, Glu(NHCH2CH2OH)NCH2CH2OH, Glu(SerNH2)SerNH2, Glu(GlyNH2)GlyNH2, Glu(GlyOMe)GlyOMe, ArgSerOMe, ArgSerNH2, ArgSerOH, SerArgOH, SerArgNH2 y SerArgOMe; Men+ es Fe2+ o Fe3+; Hal- es F-, Cl-, Br- o I-,
o una sal del mismo aceptable para uso farmacéutico.
2. El compuesto o una sal del mismo de acuerdo con el punto 1, en la que ambos R1 y R2 son ArgNH2, GlyNH2, SerNH2, Glu(ArgNH2)ArgNH2, Glu(SerNH2)SerNH2 o Glu(GlyNH2)GlyNH2, ArgSerNH2, SerArgNH2.
3. El compuesto o una sal del mismo de acuerdo con el punto 1, en la que ambos R1 y R2 son SerOH, GlyOH o Glu(OH)OH, ArgSerOH, SerArgOH.
4. El compuesto o una sal del mismo de acuerdo con el punto 1, en la que ambos R1 y R2 son Glu(NHCH2CH2OH)NHCH2CH2OH, Glu(GlyOMe)GlyOMe, ArgSerOMe, SerArgOMe.
5. Una composición farmacéutica que tiene una actividad antibacteriana y/o antiviral, que comprende como agente activo un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo aceptable para uso farmacéutico de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 4 formulada con un vehículo o excipiente orgánico o inorgánico.
6. Un agente antiséptico y/o desinfectante, que comprende un compuesto de fórmula (I) según lo definido en el punto 1.
7. La composición farmacéutica de acuerdo con el punto 5, que comprende como agente activo un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo aceptable para uso farmacéutico de acuerdo con el punto 2.
8. La composición farmacéutica de acuerdo con el punto 5, que comprende como agente activo un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo aceptable para uso farmacéutico de acuerdo con el punto 3.
9. La composición farmacéutica de acuerdo con el punto 5, que comprende como agente activo un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo aceptable para uso farmacéutico de acuerdo con el punto 4.
10. La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5 y 7 a 9, que es activa contra los géneros gram positivos Staphylococcus, Enterococcus, Micrococcus y/o Escherichia.
11. La composición farmacéutica de acuerdo con el punto 10, que es activa contra las especies gram positivas Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium, o contra Escherichia coli gram negativa.
12. La composición farmacéutica de acuerdo con el punto 11, en la que las bacterias gram positivas son Staphylococcus aureus 209P, Enterococcus faecalis BKM B-871, Micrococcus luteus BKM Ac-2230, Staphylococcus aureus No. 25923 ATCC, Staphylococcus aureus No. 100 KC, Staphylococcus aureus No. 5 MRSA, Staphylococcus aureus No. 3797 MRSA, Staphylococcus epidermidis No. 533, Enterococcus faecalis No. 559, Enterococcus faecium No. 569 o la cepa Escherichia coli 4300 gram negativa.
13. La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5 y 7 a 9, que es activa contra el virus del herpes.
14. La composición farmacéutica de acuerdo con el punto 13, que es activa contra el virus del herpes simple tipo 1 y/o tipo 2.
15. La composición farmacéutica de acuerdo con el punto 13, que es activa contra la cepa tipo 1 EC y la cepa tipo 2 G del virus del herpes simple (ATCC No. VR-734).
16. Un medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales, siendo el medicamento un derivado de hemina de fórmula general (I) o una sal del mismo aceptable para uso farmacéutico de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 4.
17. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con el punto 16, en donde el medicamento es un compuesto o una sal del mismo aceptable para uso farmacéutico de acuerdo con el punto 2.
18. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con el punto 16, en donde el medicamento es un compuesto o una sal del mismo aceptable para uso farmacéutico de acuerdo con el punto 3.
19. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con el punto 16, en donde el medicamento es un compuesto o una sal del mismo aceptable para uso farmacéutico de acuerdo con el punto 4.
20. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 16 a 19, que es activo contra los géneros gram positivos Staphylococcus, Enterococcus, Micrococcus y/o Escherichia.
21. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con el punto 20, que es activo contra especies gram positivas Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium o contra Escherichia coli gram negativa.
22. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con el punto 21, en donde las bacterias gram positivas son Staphylococcus aureus 209P, Enterococcus faecalis BKM B-871, Micrococcus luteus BKM Ac-2230, Staphylococcus aureus No. 25923 ATCC, Staphylococcus aureus No. 100 KC, Staphylococcus aureus No. 5 MRSA, Staphylococcus aureus No. 3797 MRSA, Staphylococcus epidermidis No. 533, Enterococcus faecalis No. 559, Enterococcus faecium No. 569 o la cepa gram negativa Escherichia coli 4300.
23. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 16 a 19, que es activo contra el virus del herpes.
24. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con el punto 23, que es activo contra el virus del herpes simple tipo 1 y/o tipo 2.
25. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con el punto 23, que es activo contra la cepa tipo 1 EC y la cepa tipo 2 G del virus del herpes simple (ATCC No. VR-734).
26. Un procedimiento de preparación de un compuesto de la fórmula general (I) de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 4, que comprende hacer reaccionar un derivado de hemina activado en un grupo carboxi con un componente amino.
27. El procedimiento de acuerdo con el punto 26, en donde el derivado de hemina activado es éster de 6,7-bis-N-oxisuccinimida de hemina y un disolvente es N,N-dimetilformamida.
28. El procedimiento de acuerdo con el punto 26, en el que el derivado de hemina activado es éster de 6,7-bis-N-oxisuccinimida de hemina, el componente amino es un aminoácido no protegido o un péptido, y como disolvente se utilizan N,N-dimetilformamida que comprende hasta 10% de agua y trietilamina.
29. Un procedimiento de preparación de un compuesto de la fórmula general (I) de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 4, que comprende una adición directa de derivados de aminoácidos y péptidos, ambos con un grupo COOH protegido, a un conjugado de hemina con ácido glutámico en presencia de un agente de acoplamiento TBTU.
30. Un dipéptido seleccionado de HSerArgOMe, BocSer(Bzl)ArgOMe, BocSer(Bzl)ArgNH2, ZaArgSerOMe, Z3ArgSerNH2, y ZaArgSerOH, en el que Z es benciloxicarbonilo.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una comparación de CLogP de los compuestos reivindicados y conocidos de fórmula general (1). Descripción detallada de la invención
Los presentes inventores han encontrado que los nuevos compuestos de la fórmula general (I) anterior son más efectivos que los análogos conocidos anteriores.
Las ventajas de los nuevos derivados de hemina de fórmula general (I) son su alta solubilidad en agua y su alta eficacia antibacteriana, también contra cepas resistentes.
Los compuestos novedosos reivindicados difieren de los conocidos anteriormente por su actividad contra cepas resistentes peligrosas de bacterias gram positivas St.aureus No. 5 y MRSA St.aureus No. 3797 MRSA y gram negativa E.coli 4300. Se ha encontrado inesperadamente que los derivados de hemina de fórmula general (I) con un grupo carboxilo sin protección o la amida correspondiente como sustituyentes exhiben una mayor actividad antibacteriana. Por lo tanto, en las mismas condiciones, los compuestos II, IV y X exhiben una mayor actividad antibacteriana que sus ésteres correspondientes descritos en la patente RU No. 2415868C1, publicada el 10.04.2011.
Al mismo tiempo, la toxicidad de los nuevos compuestos sigue siendo baja. Debe observarse que los compuestos que comprenden un grupo carboxilo amidado tienen una mayor solubilidad en agua que sus análogos que comprenden un grupo carboxilo o éster. Esto parece deberse a una mayor hidrofilicidad de los sustituyentes de estos compuestos, que se caracteriza por el coeficiente de división octanol-agua.
Los siguientes nuevos compuestos de fórmula (I) se han obtenido y probado en este documento:
Compuesto (II) : R-f R2= -ArgNH2;
Compuesto (III) : R-f R2= -Arg(NO2)OMe;
Compuesto (IV) : R-f R2= -GlyNH2;
Compuesto (V) : R-f R2= -SerNH2 ;
Compuesto (VI) : R-f R2= -SerOH;
Compuesto (VII) : R-f R2= -GlyOH;
Compuesto (VIII) : R-f R2= -Glu(OH)OH;
Compuesto (IX) : R-f R2= -Glu(ArgNH2)ArgNH2;
Compuesto (X) : R-f R2= -Glu(SerOMe)SerOMe;
Compuesto (XI) : R-f R2= -Glu(NHCH2CH2OH)NHCH2CH2OH
Compuesto (XII) : R-f R2= -Glu(SerNH2)SerNH2;
Compuesto (XIII) : R-f R2= -Glu(GlyNH2)GlyNH2;
Compuesto (XIV) : R-f R2= -Glu(GlyOMe)GlyOMe;
Compuesto (XIX) : R-f R2= -ArgSerOMe;
Compuesto (XX) : R-f R2= -ArgSerNH2;
Compuesto (XXI) : R-f R2= -SerArgOMe:
Compuesto (XXII) : R-f R2= -ArgSerOH;
Compuesto (XXIII) : R-f R2= -SerArgNH2;
Compuesto (XXIV) : R-f R2= -SerArgOH.
Todos los aminoácidos en los derivados de hemina son L-aminoácidos, a menos que se indique lo contrario.
Los dipéptidos que comprenden la secuencia ArgSer son compuestos conocidos. Por lo tanto, los números CAS de ArgSerOMe, ArgSerNH2 y ArgSerOH son 147139-57-9, 121185-78-2 y 70921-62-9, respectivamente. Los dipéptidos SerArgNH2 y SerArgOH también son conocidos: CAS 1008793-14-3 y 13261-11-5, respectivamente. El derivado de dipéptido protegido Boc-Ser(Bzl)ArgOH, CAS 88263-54-1 también se describió anteriormente. Los otros derivados dipeptídicos protegidos ZaArgSerOMe, Z3ArgSerNH2, ZaArgSerOH, BocSer(Bzl)ArgOMe, BocSer(Bzl)ArgNH2, y el dipéptido SerArgOMe utilizados aquí como productos intermedios para preparar derivados de hemina son nuevos. Estos péptidos se sintetizaron mediante los procedimientos de la química de péptidos, en particular, mediante el procedimiento de ésteres de N-oxisuccinimida activados. Los grupos protectores de benciloxicarbonilo (Z) y bencilo (Bzl) se escindieron por hidrólisis en presencia de un catalizador de paladio, y un grupo protector de terc-butoxicarbonilo (Boc) se eliminó con metanol saturado con cloruro de hidrógeno.
Los compuestos de fórmula (I) pueden usarse en forma de sales con ácidos aceptables para uso farmacéutico (por ejemplo, ácido láctico, tartárico, cítrico, clorhídrico u otro ácido), o en forma de sales de los grupos carboxilo de los mismos con álcali o iones de metales alcalinotérreos (tal como sodio, potasio y calcio) o con, por ejemplo, bases aceptables para uso farmacéutico, tal como amoníaco y etanolamina.
Los compuestos de fórmula (I) descritos anteriormente son activos contra bacterias, tal como los géneros bacterianos Staphylococcus (por ejemplo, Staphylococcus aureus), Bacillus (por ejemplo, Bacillus subtilis), Enterococcus (por ejemplo, Enterococcus faecalis), Micrococcus (por ejemplo., Micrococcus luteus) y Escherichia (por ejemplo, Escherichia coli), en particular, contra bacterias que son resistentes a los agentes antibacterianos conocidos. Preferentemente, las bacterias enumeradas anteriormente son Bacilus subtilis BKM B-501, Staphylococcus aureus 209P, Enterococcus faecalis BKM B-871 o Micrococcus luteus BKM Ac-2230. Aún más preferentemente, los compuestos mencionados anteriormente tienen actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus No. 25923 ATCC, Staphylococcus aureus No. 100 KC, Staphylococcus aureus No. 5 MRSA, Staphylococcus aureus No. 3797 MRSA, Staphylococcus epidermidis No. 533, Enterococcus faca No. 9, Enterococcus faca. Enterococcus faecium No. 569 o Escherichia coli 4300.
Además, los compuestos de acuerdo con la invención son activos contra virus, en particular, contra virus de herpes, tales como virus del herpes simple tipo 1 y/o tipo 2. Preferentemente, los compuestos de acuerdo con la invención exhiben actividad contra cepa tipo 1 eC y/o cepa tipo 2 G del virus del herpes Simple (No. VR-734 ATCC).
Los compuestos de fórmula (I) mencionados anteriormente y/o sus sales pueden usarse como agentes activos de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, en forma sólida, semisólida o líquida) formuladas con un vehículo o excipiente orgánico o inorgánico.
El agente activo en la composición puede formularse con vehículos convencionales no tóxicos y aceptables para uso farmacéutico que son adecuados para preparar soluciones, comprimidos, píldoras, cápsulas, supositorios, emulsiones, suspensiones, aerosoles, inhaladores, gotas, pomadas o cualquier otra forma farmacéutica. Como vehículos pueden usarse agua, glucosa, lactosa, goma arábiga, gelatina, almidón, trixilitol de magnesio, talco, almidón de maíz, urea, polietilenglicol y otros vehículos adecuados para la fabricación de preparaciones sólidas, blandas o líquidas. Aquí, los estabilizadores, espesantes, agentes colorantes y agentes aromatizantes pueden usarse como aditivos.
Un compuesto de fórmula (I) se incluye en la composición en una cantidad suficiente para proporcionar un efecto antibacteriano y/o antiviral.
En la fabricación de una forma farmacéutica unitaria, la cantidad del agente activo formulado con un vehículo puede variar dependiendo del receptor bajo terapia y de la vía particular de administración del agente terapéutico.
Por ejemplo, cuando los compuestos de la presente invención se usan como soluciones inyectables, el contenido del agente activo en la solución varía de 0,001 a 1% en peso. Los diluyentes para los compuestos pueden ser una solución de cloruro de sodio al 0,9%, agua destilada, solución inyectable de novocaína, solución de Ringer y solución de glucosa. Cuando los compuestos de fórmula general (I) se usan como comprimidos o supositorios, la cantidad del compuesto varía de 1,0 a 100,0 mg por forma farmacéutica unitaria. Para comprimidos y supositorios, el excipiente farmacéutico puede ser cualquier base adecuada para uso farmacéutico.
Como los compuestos de fórmula general (I) son tanto solubles en agua como lipófilos, pueden usarse, por ejemplo, como soluciones acuosas, soluciones alcohólicas, pomadas y cremas.
Además, la invención se refiere a un agente terapéutico antibacteriano y antiviral basado en los compuestos de fórmula (I) mencionados anteriormente y al uso del compuesto de fórmula (I) o una composición farmacéutica del mismo en un procedimiento para tratar enfermedades causadas por las bacterias y/o virus mencionados anteriormente, comprendiendo el uso administrar a un paciente que lo necesite dicho compuesto de fórmula (I) o una composición farmacéutica del mismo.
El compuesto de fórmula (I) o una composición farmacéutica del mismo está destinado a usarse en un procedimiento para tratar pacientes de mamíferos, en particular seres humanos. Las dosis recomendadas de un compuesto de fórmula (I) son de 0,01 a 10 mg/kg.
Como los compuestos de fórmula (I) tienen actividades antibacterianas y antivirales, también pueden usarse como (o en) agentes antisépticos y/o desinfectantes. Estos agentes pueden prepararse como, por ejemplo, soluciones con diversos disolventes, tales como agua y alcoholes inferiores (por ejemplo, 1-propanol o 2-propanol).
Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de preparación de los nuevos compuestos de fórmula (I) descritos anteriormente.
Los compuestos de fórmula (I) se preparan haciendo reaccionar un derivado de hemina activado en grupos carboxilo con un componente amino mediante procedimientos convencionales de síntesis de péptidos.
Los componentes amino pueden ser péptidos, aminoácidos (principalmente, a-aminoácidos) o análogos de los mismos, en particular, ArgNH2, Arg (NO2) OMe, GlyNH2, SerNH2, SerOH, GlyOH, Glu(OH)OH, NH2CH2CH2OH, GlyOMe, y SerOMe, así como derivados de dipéptidos, tales como ArgSerOMe, ArgSerNH2, ArgSerOH, SerArgOMe, SerArgNH2 y SerArgOH. La reacción se lleva a cabo preferentemente en DMF.
Preferentemente, los grupos amino de los componentes amino (por ejemplo, los grupos a-amino de aminoácidos protegidos con carboxilo) se acilan con éster de bis-N-oxisuccinimida hemina. Las reacciones se llevan a cabo en DMF durante 0,5 a 2 horas a una temperatura de -15 ° a 30 ° C utilizando trietilamina. Se llevan a cabo reacciones similares con aminoácidos no protegidos en DMF en presencia de trietilamina y hasta 10% de agua. Además, los conjugados de hemina con péptidos ramificados se preparan mediante la adición directa de derivados, aminoácidos y péptidos protegidos con el grupo COOH, a un conjugado de hemina con ácido glutámico en presencia del agente de acoplamiento TBTU.
Por lo tanto, se proporcionan nuevos agentes antibacterianos y antivirales eficaces basados en derivados de hemina. Sus ventajas consisten en biocompatibilidad, biodegradabilidad, una mayor actividad contra cepas bacterianas resistentes, baja toxicidad y la falta de efectos secundarios, lo que los hace prometedores para su uso como agentes terapéuticos.
Además, la invención se ilustrará con ejemplos.
Anotaciones
HSV-1 = Virus del herpes simple tipo 1
HSV-2 = Virus del herpes simple tipo 2
IR = espectroscopia infrarroja
GI = inhibición del crecimiento
MBC = concentración bactericida mínima
MIC = concentración inhibitoria mínima
SAA = agentes tensioactivos (tensioactivos)
TLC = cromatografía en capa fina
CLF = cloroformo
CPE = efecto citopatógeno
A = densidad óptica
Boc = terc-butoxicarbonilo
Bzl = bencilo
DMF = N,N'-dimetilformamida
DMSO = dimetilsulfóxido
Et3N = trietilamina
MeOH = metanol
MH = medio Mueller-Hilton
MRSA = Staphylococcus aureus resistente a meticilina
OMe = éter metílico
PEG = polietilenglicol
TBTU = tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
TCID50 = dosis citopatógena tisular que causa 50% de muerte celular en una monocapa
Z = benciloxicarbonilo
Los siguientes ejemplos ilustran la invención reivindicada.
Los reactivos utilizados fueron L-aminoácidos y sus derivados adquiridos de, excepto glicina, Bachem (Alemania) y Reanal (Hungría); y Et3N (Fluka, Alemania). Los productos intermedios, es decir, los dipéptidos protegidos Z3ArgSerOMe, Z3ArgSerNH2 M Z3ArgSerOH, BocSer(Bzl)ArgOMe, BocSer(Bzl)ArgNH2 y BocSer(Bzl)ArgOH se prepararon mediante procedimientos de química de péptidos; sus características fisicoquímicas se dan en la Tabla 1. Todos los disolventes eran anhidros, excepto los utilizados para la extracción de soluciones acuosas. La identidad de los compuestos preparados se verificó por TLC en placas Kieselgel 60 F254 (Merck, Alemania) en los siguientes sistemas: (1) cloroformo-metanol-ácido acético-agua (5: 4: 0,5: 0,5), (2) cloroformo-metanol-ácido acético-agua (5: 4: 0,2: 0,2) y (3) cloroformo-metanol (9: 1). Se desarrollaron gramos de cromato con el reactivo de cloro-tolidina por fluorescencia en UV.
Se obtuvieron espectros de masas de alta resolución en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo Ultraflex (Bruker, Alemania) usando desorción/ionización láser asistida por matriz (TOF MALDI); se usó la matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico.
Los espectros IR se registraron en un espectrómetro de transformada de Fourier Magna 750 (Nicolet, EE.UU.).
Los espectros electrónicos se registraron en un espectrofotómetro Jasco modelo UV/VS 7800 (Japón).
Procedimiento general de preparación de los compuestos II-V, XIX-XXIV
Se añadieron 0,033 ml (0,266 mmol) de Et3N a una suspensión de un componente amino (0,26 mmol) en 1,5 ml de DMF y se agitó a temperatura ambiente durante 3 minutos. A la solución resultante, se añadió una solución de éster de 6,7-bis-N-oxisuccinimida de protohemina IX (0,100 g, 0,118 mmol) en 5 ml de DMF y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se controló por TLC en el sistema (3). La masa de reacción se concentró hasta 1,0 ml al vacío. Para los compuestos insolubles en agua III, IV y V, 10 ml de ácido clorhídrico 0,01M se añadió a la masa de reacción concentrada, el residuo se separó y se lavó con agua hasta pH neutro. El residuo se secó en un desecador sobre cloruro de potasio bajo presión reducida durante un día. Para los compuestos solubles en agua II y XIX-XXIV, se añadió ácido clorhídrico 2,55 M en metanol para alcanzar un pH neutro, seguido de la adición de ácido clorhídrico 0,01 M en una solución saturada de NaCl en agua. El residuo se separó y se secó en un desecador sobre cloruro de potasio bajo presión reducida durante un día y se disolvió en 1 m de metanol anhidro y, después de filtrar NaCl no disuelto, se purificó en una columna (202 cm) empaquetada con Sephadex LH20 con metanol como eluyente. Las fracciones que contenían el producto diana se combinaron; el disolvente se eliminó al vacío. El producto diana se secó en un desecador sobre cloruro de potasio bajo presión reducida durante un día.
Ejemplo 1
6.7- bis-(amida Na-arginil)-protohemina (IX) (II)
Rendimiento 0,1020 g (70%) ; Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 1656 (amida I), 1534 (amida II). Espectro de masas (MALDI), m/z: 926 [M-Cl']+. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (£ ■ 10 -3) : 403,8 (92,60), 499,2 (6,3643), 623,6 (1,553).
Ejemplo 2
6.7- bis-(metil éster Na-(NG-nitro)arginil)-protohemina (IX) (III)
Rendimiento 0,083 g (65%), Rf 0,26 (1), 0,71 (2). Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 1737 (CO est.), 1648 (amida I), 1539 (amida II). Espectro de masas, m/z: [M]+ 1001 [M-NO2-Cl']+ 956 [M-2NO2-Cl']+. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (£ ■ 10-3): 404 (1,163), 500,2 (0,986), 623,4 (0,540).
Ejemplo 3
6.7- bis-(amida Na-glicil)-protohemina (IX) (IV)
Rendimiento 0,092 g (68%). Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 1654 (amida I), 1536 (amida II). Espectro de masas (MALDI), m/z: 728 [M-Cl']+. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (£ ■ 10 -3): 402,0 (101,2), 504,2 (7,417), 628,6 (4,201).
Ejemplo 4
6.7- bis-(amida Na-seril)-protohemina (IX) (V)
Rendimiento 0,105 g (72%). Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 1651 (amida I), 1530 (amida II). Espectro de masas (MALDI), m/z: 788 [M-Cl']+. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (£ ■ 10 -3): 404,8 (207,12), 499,2 (6,547), 623,4 (3,603).
Ejemplo 5
6.7- bis-[(metil éster Na-L-seril)-L-arginil]-protohemina (IX) (XIX)
Rendimiento 30 mg (65%), Rf 0,43 (5). Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 3338 (NH), 1740 (C=O est.), 1653 (amida I), 1545 (amida II). Espectro de masas (MALDI): [M-Cl-]+.1131,5. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (£ ■ 10’3): 401,8 (63), 585 (3,18).
Ejemplo 6
6.7- bis-[(amida Na-L-seril)-L-arginil]-protohemina (IX) (XX)
Rendimiento 27 mg (58%), Rf 0,25 (6). Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 3388 (NH), 1652 (amida I), 1544 (amida II). Espectro de masas (MAlDi) : [M-Cl']+1100. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (£ ■ 10’3): 400,8 (47), 581,6 (3,34).
Ejemplo 7
6.7- bis-[(metil éster Na-L-arginil)-L-seril]-protohemina (IX) (XXI)
Rendimiento 22 mg (55%), Rf 0,6 (9). Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 3326 (NH), 1738 (C=O est.), 1627 (amida I), 1577 (amida II). Espectro de masas (MALDI) : [M-Cl']+1132. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (£ ■ 10’3): 404,8 (61), 495,6 (3,44), 619,6 (1,9).
Ejemplo 8
6.7- bis-[(Na-L-seril)-L-arginil]-protohemina (IX) (XXII)
Rendimiento 30 mg (65%), Rf 0,18 (5). Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 3396 (NH), 1645 (amida I), 1550 (amida II). Espectro de masas (MAlDi): [M-Cl']+ 1102,5. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (£ ■ 10’3): 404 (76), 495 (5,11), 610 (3,1).
Ejemplo 9
6.7- bis-[(amida Na-L-arginil)-L-seril]-protohemina (IX) (XXIII)
Rendimiento 27 mg (58%), Rf 0,3 (9). Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 3365 (NH), 1655 (amida I), 1542 (amida II). Espectro de masas (MAlDi): [M-Cl']+ 1100. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (£ ■ 10’3): 402,2 (65,3), 496,4 (4,0), 618,2 (2,1).
Ejemplo 10
6.7- bis-[(Na-L-arginil)-L-seril]-protohemina (IX) (XXIV)
Rendimiento 22 mg (55%), Rf 0,2 (9). Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 3340 (NH), 1659 (amida I), 1550 (amida II). Espectro de masas (MALDI): [M-Cl']+ 1102. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (£ ■ 10 ’3): 403,8 (146), 498,4 (8,1 ), 620,4 (4,9).
Tabla 1
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Un procedimiento general de preparación de péptidos protegidos (Tabla 1)
Una solución de un componente amino correspondiente (0,7 mmol) y trietilamina (0,83 mmol) en una mezcla de 2 ml de DMF y 0,3 ml de agua se añadió a una solución de 0,64 mmol de BocSer(Bzl)ONSu o ZaArgONSu en 3 ml de DMF. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se eliminó a vacío; el residuo se disolvió en 10 ml de n-butanol y se extrajo con 3 x 10 ml de solución acuosa saturada de NaCl. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró. El disolvente se eliminó al vacío, el residuo se secó en un desecador sobre cloruro de potasio a presión reducida, y luego se disolvió en 1 ml de metanol anhidro, y las sales se filtraron. El disolvente se eliminó al vacío. El compuesto objetivo se purificó, si era necesario, mediante recristalización o cromatografía en columna sobre gel de sílice.
Un procedimiento general de preparación de los compuestos VI-VIII
Se añadieron 0,130 ml (para serina y glicina) o 0,260 ml (para ácido glutámico y dihidrocloruros de arginina y gistidina) trietilamina a una solución o suspensión de un aminoácido (0,945 mmol) en 0,5 ml de agua. La solución resultante se añadió a éster de 6,7-bis-N-oxisuccinimida de hemina (100 mg, 0,118 mmol) en 6 ml de DMF y se agitó durante 30 minutos. La masa de reacción se concentró al vacío hasta 1 ml. Para los compuestos insolubles en agua VI-VIII, se añadieron 10 ml de ácido clorhídrico acuoso (0,01 M) a la masa de reacción concentrada; El residuo se separó y se lavó con agua hasta pH neutro. El residuo se secó en un desecador sobre cloruro de potasio a presión reducida durante un día.
Ejemplo 11
6.7- bis-(Na-seril]-protohemina (IX) (VI)
Rendimiento 84,7 mg (87%). Espectro FT-IR (KBr, vmax/cm-1): 1727 (COOH), 1656 (C=O amida I), 1530 (C=O amida II). Espectro de masas (MALDI), m/z: 790 [M-Cl-]+. Espectro electrónico, DMs O, Amax, nm, (£ ■ 10-3): 403 (188), 497 (8,51), 622 (4,49).
Ejemplo 12
6.7- bis-(Na-glicil]-protohemina (IX) (VII)
Rendimiento 77,7 mg (86%). Espectro FT-IR (KBr, Vmax/cm-1): 3294 (NH), 1724 (COOH), 1656 (C=O amida I), 1543 (C=O amida II). Espectro de masas (MALDI), m/z: 730,1 [M-Cl-]+. Espectro electrónico, d Ms O, Amax, nm, (£ ■ 10-3): 404 (126), 498 (8,02), 622 (4,48).
Ejemplo 13
6.7- bis-(Na-glutamil]-protohemina (IX) (VIII)
Rendimiento 88 mg (82%). Espectro FT-IR (KBr, Vmax/cm-1): 3286 (NH), 172 (COOH), 1644 (C=O amida I), 1544 (C=O amida II). Espectro de masas (MALDI), m/z: 874 [M-Cl-]+. Espectro electrónico, Dm So , Amax, nm, (£ ■ 10-3):404 (76,7), 496 (8,79), 615 (6,02).
Un procedimiento general de preparación de los compuestos IX-XIV
Se añadieron 0,148 g (0,462 mmol) de TBTU y 0,086 ml (0,462 mmol) de Et3N a 0,070 g (0,077 mmol) de 6,7-bis-Naglutamil-protohemina (IX) en 5 ml de DMF. La solución resultante se agitó durante 30 minutos. A una suspensión de 0,462 mmol de hidrocloruro de componente amino en 1,5 ml de DMF, se añadieron 0,086 ml (0,462 mmol) de Et3N y se agitó a temperatura ambiente durante 3 minutos, luego la solución resultante se añadió a una solución de 6,7-bis-Naglutamil-protohemina preactivada (IX). La masa de reacción se agitó durante un día y se concentró hasta 1,0 ml al vacío. Para los compuestos insolubles en agua (XI y XIV), 10 ml de solución de ácido clorhídrico acuoso 0,01M se añadió a la masa de reacción concentrada, el residuo se separó y se lavó con agua hasta pH neutro. El residuo se secó en un desecador sobre cloruro de potasio bajo presión reducida durante un día. Para los compuestos solubles en agua (IX, X y XIII), ácido clorhídrico 0,01 M en una solución saturada de NaCl en agua se añadió a la masa de reacción concentrada. El residuo se separó y se secó en un desecador sobre cloruro de potasio bajo presión reducida durante un día y se disolvió en 1 ml de metanol anhidro y, después de filtrar NaCl no disuelto, se purificó en una columna (202 cm) empaquetada con Sephadex LH20 con metanol como eluyente. Las fracciones que contenían el producto diana se combinaron; el disolvente se eliminó al vacío. El producto diana se secó en un desecador sobre cloruro de potasio bajo presión reducida durante un día.
Ejemplo 14
6.7- bis-[(diamida Na-L-arginil)-L-glutamil]-protohemina (IX) (IX)
Rendimiento 0,082 g (71%). Espectro FT-IR, v, cm'1, Pélet KBr: 1658 (amida I), 1541 (amida II). Espectro de masas (MALDI), m/z: 1495 [M-Cl']+. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (£ ■ 10-3): 396,8 (137,83), 505,6 (13,404), 623,2 (6,419).
Ejemplo 15
6.7- bis-[(dimetil éster Na-L-seril)-L-glutamil]-protohemina (IX) (X)
Rendimiento 0,068 g (67%). Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 1747 (CO est.), 1646 (amida I), 1542 (amida II). Espectro de masas (MALDI), m/z: 1313 [M-Cl-]+. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (£ ■ 10-3): 404,6 (124,25), 500 (7,434), 622,2 (4,032).
Ejemplo 16
6.7- bis-[(di-2-hidroxietilamida)-L-glutamil]-protohemina (IX) (XI)
Rendimiento 0,054 g (64%). Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 1654 (amida I), 1547 (amida II). Espectro de masas (MALDI), m/z: 1046 [M-Cl‘]+. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (e ■ 10-3): 403,2 (107,83), 502,3 (9,041), 635,2 (6,591).
Ejemplo 17
6.7- bis-[(diamida Na-L-seril)-L-glutamil]-protohemina (IX) (XII)
Rendimiento 0,074 g (76%). Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 1651 (amida I), 1537 (amida II). Espectro de masas (MALDI), m/z: 1218 [M-Cl‘]+. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (e ■ 10 -3): 398,6 (89,41), 497,4 (4,162), 619,4 (2,124).
Ejemplo 18
6.7- bis-[(diamida Na-L-glicil)-L-glutamil]-protohemina (IX) (XIII)
Rendimiento 0,077 g (87%). Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 1652 (amida I), 1539 (amida II). Espectro de masas (MALDI), m/z: 1098 [M-Cl-]+. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (e ■ 10 -3): 404,4 (88,0), 497,8 (5,184), 621,8 (2,728).
Ejemplo 19
6.7- bis-[(dimetil éster Na-L-glicil)-L-glutamil]-protohemina (IX) (XIV)
Rendimiento 0,072 g (78%). Espectro FT-IR, v, cm-1, Pélet KBr: 1738 (CO est.), 1652 (amida I), 1535 (amida II). Espectro de masas (MALDI), m/z: 1158 [M-Cl']+. Espectro electrónico, DMSO, Amax, nm, (e ■ 10 ’3): 404,4 (88,0), 497,8 (5,184), 621,8 (2,728).
Ejemplo 20
Hidrofilicidad de los compuestos de formula general (I)
Los coeficientes de partición de octanol-agua (CLogP) de los compuestos reivindicados de fórmula (I), en particular los compuestos II, IV, V, IX, X, XII, XIII, XIV y compuestos conocidos de fórmula general I, en donde R1 y R2 son ArgOMe (XV), Glu(ArgOMe)ArgOMe (XVI), GlyOMe (XVII), SerOMe (XVIII) [Patente RU 2415868 C1, publicada el 10,04,2011], se calcularon utilizando el software ACDLabs 8.0.
Como se deduce de la Fig. 1, la sustitución del grupo -OMe con un grupo NH2 conduce a una hidrofilicidad mejorada de los derivados de hemina. Así, los nuevos compuestos reivindicados de fórmula general I tienen una hidrofilicidad mejorada en comparación con los compuestos conocidos.
Ejemplo 21
Actividad antibacteriana de compuestos de fórmula general I, incluidas cepas bacterianas resistentes Ejemplo 21.1
La actividad antibacteriana de los compuestos se determinó contra cepas de bacterias gram positivas tales como Staphylococcus aureus 209P, Enterococcus faecalis BKM B-871, Micrococcus luteus BKM Ac-2230, Bacilus subtilis BKM B-501 y bacterias gram negativas tales como Pseudomonas aeruginosa PAO1 y Escherichia coli KM MGU C-600. Las cepas BKM se adquirieron de la Colección de Microorganismos de Toda Rusia en el Instituto de Bioquímica y Fisiología de Microorganismos, Academia de Ciencias de Rusia. La cepa Staphylococcus aureus 209P se adquirió de la Colección de Microorganismos del Departamento de Microbiología de la Facultad de Biología de la Universidad Estatal de Moscú Lomonosov, y Pseudomonas aeruginosa PAO1 se adquirió de la Colección de Microorganismos del Instituto de Química Bioorgánica de la Academia de Ciencias de Rusia.
Los principales parámetros que caracterizan la actividad antibacteriana son la concentración inhibitoria mínima (MIC) y la concentración bactericida mínima (MBC). MIC es la menor concentración de un compuesto probado que inhibe completamente la reproducción de bacterias en un medio líquido. MBC es la menor concentración que causa la muerte de todas las células.
MIC se cuantificó inhibiendo el crecimiento del cultivo en un medio líquido con diluciones en serie de compuestos utilizando un procedimiento modificado [Ámsterdam, D., 1966. "Susceptibility testing of antimicrobials in liquid media," págs. 52-111. En Loman, V., ed. Antibiotics in laboratory medicine, 4° edición Williams and Wilkins, Baltimore]
Las bacterias fueron cultivadas y probadas en un medio líquido MH (medio Mueller-Hinton: un extracto seco de caldo de res, 4 g/l; almidón, 1,5 g/l; hidrolizado de caseína, 17,5 g/l; Sigma -Fluka Catálogo No. 70192) a 37 ° C, 100% de humedad y bajo agitación. Los cultivos (dentro de 4 a 7 pases después de la descongelación) en la fase de crecimiento exponencial se utilizaron para las pruebas.
Todos los compuestos probados absorben luz a 595 nm, una longitud de onda utilizada para evaluar el crecimiento del cultivo bacteriano. Por lo tanto, se aplicó una corrección para la absorción al estimar la densidad óptica de las suspensiones bacterianas para cada compuesto teniendo en cuenta su concentración en el pocillo. La inhibición del crecimiento bacteriano (IG) como porcentaje después de 20 horas de incubación de células con compuestos se obtuvo a partir de la densidad óptica (A) medida en cada pocillo a una longitud de onda de 595 nm utilizando la ecuación:
Figure imgf000013_0001
en donde los subíndices tienen los siguientes significados: i denota el número de pocillo, c indica un pocillo de control con bacterias en el que no se inserta el compuesto probado, 0 se refiere a la medición tomada inmediatamente una vez que el compuesto probado se inserta en el pocillo, y t se refiere a la medición se tomó 20 horas después de que se insertara el compuesto.
El protocolo para la determinación de la actividad antibacteriana experimental de los compuestos probados fue el siguiente. Un criovial con el cultivo de la cepa de prueba en un medio con 7% de DMSO almacenado en nitrógeno líquido, se descongeló rápidamente, y se inocularon 1,5 ml del medio MH fresco con 100 pl de la suspensión celular. Las células se cultivaron durante un día a 37 ° C y se agitaron en un agitador orbital a 150 rpm. Las características morfológicas de la cepa y la ausencia de contaminación con bacterias extrañas se verificaron mediante: (a) inoculación en un medio MH agarizado (agar 15 g/l) y observación de la forma y el color de las colonias crecidas y (b) examen de características morfológicas características bajo un microscopio (Mikmed-2, LOMO, Rusia) equipado con una lente objetivo 40 X. Además, las bacterias se cultivaron en 1 ml del medio MH líquido a 37 ° C bajo agitación. Las células fueron resembradas todos los días. Los cultivos celulares se usaron en pruebas que comenzaron con la 3° resiembra y terminaron con la 6° resiembra.
Para la prueba, se transfirieron 5 pl de una suspensión bacteriana en la fase de crecimiento estacionaria a 1 ml de un medio MH estéril y se incubaron hasta que se alcanzó la fase de crecimiento exponencial (3 a 5 h, 37 ° C, agitando a 150 rpm). ) Para estimar la concentración de microorganismos, se midió la densidad óptica (A) del cultivo bacteriano resultante a una longitud de onda de 595 nm. El valor de A = 0,2 medido a partir de una porción de 200 pl de la suspensión celular en una placa de 96 pocillos, con una corrección para la absorción del medio aplicado, se ajustó a 4x108 células/ml para ambas cepas utilizadas. Teniendo en cuenta las mediciones de concentración celular, la suspensión se diluyó con el medio MH hasta una concentración de 5x104 a 1x105 células/ml y se transfirió a una placa estéril de 96 pocillos en una cantidad de 100 pl por pocillo. Luego, las células se agregaron con compuestos probados y se hicieron diluciones en serie dobles de estos compuestos en los pocillos de la placa. La concentración máxima de un compuesto en la serie fue 10'4 M; el mínimo fue 1,6x10'6 M. Los estudios de actividad antibacteriana se realizaron en dos réplicas para cada compuesto, y se promediaron los resultados.
Los controles utilizados fueron: 100 pl de un cultivo bacteriano sin aditivos (cuatro pocillos); un cultivo bacteriano agregado con DMSO al 1% o agua en el mismo volumen que en los pocillos con la concentración máxima de los compuestos probados (cuatro pocillos); y 100 pl del medio m H estéril sin bacterias y sin compuestos probados para el control de la contaminación ocasional en la placa (cuatro pocillos).
Inmediatamente una vez que se insertaron los compuestos, se midió Ai0 en cada pocillo y Ac0 en pocillos de control utilizando un fotómetro de placa Uniplan (Picon, Rusia) (ambos valores fueron necesarios para los cálculos por la ecuación (1)). La placa se incubó durante 20 ha 37 ° C y se agitó a 150 rpm. Luego, se midió Ait en cada pocillo y Act en los pocillos de control, y se calculó la inhibición del crecimiento bacteriano a partir de la ecuación (1). La MIC se determinó como la concentración mínima del compuesto probado a la que la inhibición del crecimiento fue del 100%. En las determinaciones de MBC, el medio de los pocillos en el que la concentración del compuesto probado era igual a MIC, MICx2 y MICx4 se transfirió a placas de Petri con un medio MH agarizado (agar 15 g/l) y se extendió uniformemente sobre el área de la placa usando espátulas estériles Las placas se incubaron durante dos días. MBC se determinó como la menor concentración del compuesto probado en el que no se cultivaron colonias en placas de Petri.
Tabla 2
Figure imgf000014_0001
Los compuestos comparativos en la Tabla 2 son compuestos ya conocidos de fórmula general (I), en donde R1=R2=ArgOMe (XV), Glu(ArgOMe)ArgOMe (XVI), GlyOMe (XVII), SerOMe (XVIII) [Patente RU 2415868 C1, 10.04.2011]. Por lo tanto, los compuestos II, III, IV, V, IX, X y XIV suprimen el crecimiento de bacterias gram positivas S. aureus dentro de un rango de concentración micromolar (Tabla 2). Estos compuestos también exhiben actividad bactericida en concentraciones de hasta 25 pM.
Las bacterias M. luteus son altamente sensibles a todos los compuestos en concentraciones submicromolares (en varios casos MIC <0,8 pM).
Los enterococos de E. faecalis son (en promedio) más resistentes a los compuestos probados que los micrococos de M. luteus o los estafilococos de S. aureus. Los compuestos II y V tienen la mayor eficacia contra E. faecalis: MIC <7 pM. En realidad, todos los compuestos probados son activos contra bacterias gram positivas B. subtilis.
Ejemplo 21.2
La actividad específica de los compuestos también se determinó frente a cepas de bacterias tales como Staphylococcus aureus No. 25923 ATCC (Recolección de Cultivos Tipos Americanos); Staphylococcus aureus No. 100 KC; Staphylococcus epidermidis No. 533; Enterococcus faecalis No. 559; Enterococcus faecium No. 569, Staphylococcus aureus No. 5 (MRSA), Staphylococcus aureus No. 3797 (MRSA). Staphylococcus aureus se cultivó en el medio seco Agar Tripticasa de Soja (BBL) disponible comercialmente. Enterococcus faecalis se cultivó en el medio seco Agar Columbia (BBL) disponible comercialmente. Estos medios se esterilizaron en autoclave a 121 ° C durante 15 min. El inóculo bacteriano fue constante y fue de 5 x 105 UFC/ml (105 UFC/0,2 ml). Para los compuestos solubles en agua, se agregaron pocillos del 2° al 8° con el solvente (agua) en una cantidad de 15 pl por pocillo, luego se agregó el primer pocillo con 30 pl de la solución madre del compuesto probado en agua con una concentración de 1 x 103 M, y la concentración se ajustó a 0,007 X 103 M mediante diluciones dobles en serie. Se tomó una porción de 10 pl de cada pocillo y se agregaron 190 pl del cultivo bacteriano (105 UFC) por pocillo. Para los compuestos solubles en DMSO, se agregaron pocillos del 2 ° al 8 ° con el disolvente (DMSO) en una cantidad de 10 pl por pocillo, luego se agregó el 1° pocillo con 20 pl de la solución madre del compuesto probado en agua con una concentración de 5 x 103 M, y la concentración se ajustó a 0,039 x 103 M mediante diluciones dobles en serie. Se tomó una porción de 2 pl de cada pocillo, y se agregaron 198 pl del cultivo bacteriano (105 UFC) por pocillo.
El control comprendía pocillos libres de compuestos ensayados (control de crecimiento del cultivo). Además, se utilizó el control de pureza de medios nutricionales y disolventes. Las placas se incubaron en un termostato a 36 °C durante 24 horas.
El crecimiento del cultivo se evaluó visualmente mediante la comparación de cómo crecieron los microorganismos en presencia de compuestos ensayados y en ausencia de ellos. MIC se ajustó a la última dilución de un agente ensayado que suprimió el crecimiento del cultivo bacteriano.
Tabla 3
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
Los compuestos comparativos en la Tabla 3 ya son compuestos conocidos de fórmula general (I), en donde Ri=R2=ArgOMe (XV) o GlyOMe (XVII) [Patente RU 2415868 C1, publicada el 10.04.2011].
Los compuestos novedosos fueron efectivos contra las bacterias gram positivas Staphylococcus aureus 25923, Staphylococcus aureus 100 KC y Staphylococcus epidermis 533, en donde los valores de MlC no fueron más de 13 pM. La solubilidad en agua y la actividad antibacteriana de algunos derivados de dipéptidos de hemina fueron más altas que las de los otros derivados de hemina. Así, la actividad antibacteriana del compuesto XIX contra Staphylococcus epidermis 533 fue mayor en un orden de magnitud (MIC = 1,3 pM).
La actividad antibacteriana demostrada por los compuestos reivindicados contra Enterococcus faecalis 559 fue ligeramente menor.
Se observó una actividad antibacteriana pronunciada contra Enterococcus faecium 569 resistente a la vancomicina para los compuestos II (MIC = 3,12 pM), IV (MIC = 50 pM), V (MIC = 25 pM), IX (MIC = 6,25 pM) y XIX-XXI (MIC = 6,25 pM). Los compuestos II (MIC = 41,6 pM) y IX (MIC = 16,6 pM) fueron activos contra E. coli 4300 gram negativa.
Los compuestos II (MIC = 41,6 pM) y IX (MIC = 16,6 pM) fueron activos contra E. coli gram negativa.
Tabla 4
Figure imgf000016_0002
Como se deduce de la Tabla 4, los nuevos compuestos tienen una alta actividad antibacteriana contra las cepas de MSRA, en donde MBC varía de 0,78 a 13/M.
Ejemplo 22
Actividad antiviral de derivados de hemina contra virus de la familia Herpesviridae
Las bacterias utilizadas en el estudio fueron Virus del Herpes Simple tipo 1 (Colección de Microorganismos en el Instituto de Investigación Científica de Virología, cepa EC), Virus del Herpes Simple tipo 2 cepa G (No. VR-734 ATCC), y cepa de citomegalovirus humano AD169 (No. VR-538 ATCC). Los Virus del Herpes Simple tipo 1 y tipo 2 se cultivaron en células Vero. Las células se incubaron en medio de crecimiento MEM Eagle (MEM, BioloT, St-Petersburg, 1,3,3) suplementado con suero bovino fetal al 10% (BioloT, St-Petersburg, 1,3,12) en termostato de flujo de gas Sanyo MCO-15AC (37 °C, 5% CO2) (Tokio, Japón). Una dosis simiente fue de 2 x 105 células/ml en el inóculo inicial o 2 x 104 células/pocillo. Los virus del herpes simple se cultivaron en las mismas condiciones en el medio MEM sin suero (medio de mantenimiento). Los títulos virales iniciales fueron 107 TCID50//ml.
Para preparaciones solubles en DMSO, se prepararon soluciones madre en una concentración de 10 mM en DMSO. Para preparaciones solubles en agua, una solución madre preparada tenía la misma concentración en el medio MEM (Medio esencial mínimo) para cultivos celulares. Para controlar la citotoxicidad (ver más abajo), la solución madre se diluyó en el medio hasta una concentración de 100|j M y se realizaron diluciones en serie de diez veces de las preparaciones en el medio MEM (para compuestos solubles en DMSO - en el MEM medio que comprendía 3% de DMSO). Las siguientes concentraciones de las preparaciones se usaron en el estudio de la acción antibacteriana: si no se encontraba toxicidad, las concentraciones de las preparaciones de 100 j M fueron 100, 10 y 1 j M; si se detectó toxicidad, las concentraciones de 100 j M preparaciones fueron 10, 1 y 0,1 j M. Se usó aciclovir (10jg/ml) para los virus del Herpes Simple de ambos tipos como preparación de referencia para controlar la validez del modelo viral.
Para estudiar la actividad antiviral, se añadieron pocillos de placa con una monocapa celular con las preparaciones en una cantidad de 0,1 ml/pocillo. Para compensar una reducción en la concentración de las preparaciones, que tiene lugar en la siguiente adición de virus, se usaron concentraciones dobles de compuestos (es decir, 200, 20 y 2 o 20, 2 y 0,2 j M para concentraciones tóxicas y no tóxicas de preparaciones 100 j M, respectivamente), se incubaron durante una hora y luego se infectaron con 0,1 ml/pocillo de virus examinado en las dosis 1 , 10 y 100 TCID50 (dosis infecciosa tisular al 50%).
Las células infectadas se incubaron (37 ° C, 5% de CO2) durante 48 horas y la condición de monocapa se evaluó bajo un microscopio Leica DMIL HC teniendo en cuenta la naturaleza de la acción citopatógena, que difiere significativamente para un virus, y la acción del preparado en su concentración tóxica. La acción citogénica específica del virus se manifestó en un aumento en el tamaño de las células, su redondeo y desprendimiento de un sustrato. Estas características morfológicas sirvieron como su marcada diferencia de las células sometidas a una acción tóxica de altas concentraciones de las preparaciones examinadas. Estas últimas adquirieron forma de huso, perdieron contactos con las células vecinas de la monocapa y sus límites se hicieron más distintos.
La intensidad de los cambios específicos de virus en las células se semicuantificaron usando un sistema de 4 puntuaciones: 0 - - No se detecta CPA (acción citopatógena); 1 - hasta un 25% de monocapa infectada con virus; 2 - del 25% al 50%; 3 - del 50% al 75%; y 4 - del 75% al 100%. La actividad antiviral de un compuesto se evaluó de acuerdo con su capacidad para reducir la manifestación de la acción citopatógena en los pocillos de la placa en comparación con los valores de control. Las diferencias con los valores de control en 1 puntuación y más se consideraron significativas.
Tabla 5
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Como se puede ver en la Tabla 5, la mayoría de los compuestos reivindicados ensayados eran activos contra el virus del herpes simple tipo 1 en concentraciones sub y micromolares.
Ejemplo 23
Toxicidad de los nuevos compuestos.
Los nuevos compuestos son sustancialmente no tóxicos; se observó 1-5% de muerte de leucocitos para concentraciones de 12 a 50 pM.
Los nuevos compuestos examinados tampoco causaron una liberación significativa de hemoglobina de los eritrocitos de sangre humana (la liberación observada no fue más del 2-3% para concentraciones de hasta 50 pM).
Los resultados obtenidos atestiguan el potencial de los compuestos reivindicados para ser utilizados para la fabricación de agentes antibacterianos y antivirales biocompatibles no tóxicos basados en ellos, así como para la prevención y el tratamiento de enfermedades causadas por diversos microorganismos.
Por lo tanto, en comparación con los compuestos conocidos [Patente RU No. 2415868 C1, publicada el 10.04.2011; Patente RU 2404191 C2, publicada el 20.11.2010], los compuestos reivindicados se caracterizan por una alta solubilidad en agua, actividad antibacteriana exhibida en concentraciones más bajas, contra cepas bacterianas resistentes tanto gram positivas como gram negativas, y actividad antiviral contra el Virus del herpes simple tipo 1 y tipo 2 , lo que aumenta su potencial y valores de práctica como agentes antiinfecciosos.
Ejemplo 24
Las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden usarse como preparaciones desinfectantes, antisépticas y farmacéuticas (por ejemplo, en formas sólidas, semisólidas o líquidas) que comprenden los compuestos reivindicados propuestos como un agente activo, en combinación con vehículos o excipientes orgánicos o no orgánicos adecuados para administraciones intramusculares, intravenosas, intranasales, orales, sublinguales, inhaladas e intrarrectales. El agente activo se puede introducir en la composición junto con vehículos aceptables para uso farmacéutico no tóxicos utilizados tradicionalmente, adecuados para la fabricación de soluciones, comprimidos, píldoras, cápsulas, supositorios, emulsiones, suspensiones, aerosoles, inhaladores, gotas, pomadas u otras formas de dosificación de medicamentos. Los vehículos pueden ser agua, glucosa, lactosa, goma arábiga, gelatina, almidón, trixilitol de magnesio, talco, almidón de maíz, urea, polietilenglicol y otros vehículos adecuados para la fabricación de preparaciones sólidas, blandas o líquidas. Aquí, los estabilizadores, espesantes, agentes colorantes y agentes aromatizantes pueden usarse como aditivos.
Un compuesto de la fórmula general (I) está contenido en la composición en una cantidad suficiente para proporcionar un efecto antibacteriano y/o antiviral esperado.
En la fabricación de una forma farmacéutica unitaria, la cantidad del agente activo formulado con un vehículo puede variarse dependiendo del receptor en terapia y de la vía particular de administración del agente terapéutico.
[0106] Por ejemplo, cuando los compuestos de la presente invención se usan como soluciones inyectables, el contenido del agente activo en la solución varía de 0,001 a 1% en peso. Los diluyentes para los compuestos pueden ser una solución de cloruro de sodio al 0,9%, agua destilada, solución inyectable de novocaína, solución de Ringer y solución de glucosa. Cuando los compuestos de fórmula general (I) se usan como comprimidos o supositorios, la cantidad del compuesto varía de 1,0 a 100,0 mg por forma farmacéutica unitaria. Para comprimidos y supositorios, el excipiente farmacéutico puede ser cualquier base adecuada para uso farmacéutico.
Dosificación de ejemplo
A. Cápsulas de gelatina
El polvo a introducir en las cápsulas se formula de la siguiente manera:
Figure imgf000019_0001
Los ingredientes enumerados anteriormente se mezclan, y la mezcla se introduce en cápsulas de gelatina dura en una cantidad de 151 a 285 mg.
B. Forma farmacéutica de comprimido
Una forma farmacéutica de comprimido se fabrica usando los ingredientes enumerados a continuación:
Figure imgf000019_0002
Los componentes se mezclan y compactan para producir comprimidos con un peso de 200 mg cada uno.
C. Forma farmacéutica de aerosol
Una mezcla de aerosol destinada a una administración de 10 veces se formula de la siguiente manera:
Un compuesto correspondiente a la fórmula general (I)10 a 100 mg
Figure imgf000020_0001
El compuesto se mezcla con excipientes, y la mezcla se transfiere a un dispositivo de pulverización especial.
D. Supositorios
Se pueden usar las siguientes bases de supositorios:
bases insolubles en agua (manteca de cacao);
bases solubles en agua o miscibles en agua (gelatina-glicerol u óxido de polietileno); y
bases combinadas (jabón-glicerol).
Un ejemplo de formulación de supositorio:
Un compuesto correspondiente a la fórmula general (I) en una cantidad de 1 a 50 mg, y manteca de cacao en una cantidad necesaria para obtener un supositorio.
Cuando sea necesario, se pueden fabricar supositorios rectales, vaginales o uretrales con excipientes apropiados. E. Pomadas
Se pueden usar las siguientes bases de pomada:
bases de pomadas de hidrocarburos, tal como vaselina blanca y vaselina amarilla (Vaselinum album y Vaselinum flavum, respectivamente), aceite de vaselina (Oleum Vaselini), y pomada blanca y pomada líquida (Unguentum album y Unguentum flavum, respectivamente), con aditivos espesantes tal como parafina sólida y cera; bases de pomada absorbente, tales como vaselina hidrofílica (Vaselinum hydrophylicum), lanolina (Lanolinum) y crema fría (Unguentum leniens);
bases de pomadas removibles con agua, tales como pomadas hidrofílicas (Unguentum hydrophylum); bases de pomadas solubles en agua, tales como pomada de polietilenglicol (Unguentum Glycolis Polyaethyleni); bases de bentonita; y otros.
Un ejemplo de formulación de pomada
Figure imgf000020_0002
las pomadas se preparan con las tecnologías adecuadas.
E. Solución para inyecciones.
Los disolventes útiles para preparar soluciones inyectables incluyen solución de cloruro de sodio al 0,9%, agua destilada y solución de novocaína. Las formas farmacéuticas unitarias pueden fabricarse como ampollas, viales y ampins.
La formulación de la solución inyectable es la siguiente
Figure imgf000020_0003
Las formas farmacéuticas inyectables pueden fabricarse como soluciones estériles, polvos estériles y comprimidos estériles.
Formulaciones de ejemplo para agentes desinfectantes y antisépticos.
F. Ejemplo de formulación
Figure imgf000021_0005
G. Ejemplo de formulación
Figure imgf000021_0002
H. Ejemplo de formulación
Figure imgf000021_0003
I. Ejemplo de formulación
Figure imgf000021_0001
J. Ejemplo de formulación
Figure imgf000021_0004
Por lo tanto, los derivados de hemina de fórmula general (I) como se reivindica en la presente invención tienen una mayor solubilidad en agua, actividades antibacteriana (incluso contra cepas bacterianas resistentes) y antivirales (incluyendo virus del herpes). Además, entre los nuevos derivados de hemina se han revelado los derivados de hemina activos contra cepas bacterianas gram positivas. La eficacia de los miembros separados de los nuevos compuestos de fórmula general (I) demuestra su idoneidad para el uso en formulaciones de agentes desinfectantes, antisépticos y terapéuticos que tienen una acción antibacteriana y/o antiviral.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula general (I)
Figure imgf000022_0001
en la que ambos R1 y R2 son iguales y representan sustituyentes seleccionados del siguiente grupo: ArgNH2, GlyNH2, SerNH2, Glu(ArgNH2)ArgNH2, Glu(SerNH2)SerNH2, Glu(GlyNH2)GlyNH2, ArgSerNH2, y SerArgNH2; Men+ es Fe2+ o Fe3+; Hal- es F',Cl',Br o I-, o una sal del mismo aceptable para uso farmacéutico.
2. Una composición farmacéutica, que comprende como agente activo un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo aceptable para uso farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 1 formulada con un vehículo o excipiente orgánico o inorgánico.
3. Un agente antiséptico y/o desinfectante, que comprende o que consiste en un compuesto de fórmula (I) según lo definido en la reivindicación 1.
4. Un medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales, siendo el medicamento un derivado de hemina de fórmula general (I) o una sal del mismo aceptable para uso farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 1.
5. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con la reivindicación 4, que es activo contra los géneros gram positivos de Staphylococcus, Enterococcus, Micrococcus y/o Escherichia.
6. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con la reivindicación 5, que es activo contra las especies gram-positivas Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium o contra Escherichia coli gram-negativa.
7. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con la reivindicación 6, en el que las bacterias gram positivas son Staphylococcus aureus 209P, Enterococcus faecalis BKM B-871, Micrococcus luteus BKM Ac-2230, Staphylococcus aureus No. 25923 ATCC, Staphylococcus aureus No. 100 KC, Staphylococcus aureus No. 5 MRSA, Staphylococcus aureus No. 3797 MRSA, Staphylococcus epidermidis No. 533, Enterococcus faecalis No. 559, Enterococcus faecium No. 569 o cepa gram-negativa Escherichia coli 4300.
8. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con la reivindicación 4, que es activo contra el virus del Herpes.
9. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con la reivindicación 8, que es activo contra el virus del herpes simple tipo 1 y/o tipo 2.
10. El medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades bacterianas y/o virales de acuerdo con la reivindicación 9, que es activo contra la cepa tipo 1 EC y la cepa tipo 2 G del virus del herpes simple (ATCC No. VR-734).
11. Un procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula general (I) de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende hacer reaccionar un derivado de hemina activado en un grupo carboxi con un componente amino.
12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el derivado de hemina activado es éster de 6,7-bis-N-oxisuccinimida de hemina, el componente amino es un aminoácido no protegido o un péptido, y como disolvente se usa N,N-dimetilformamida que comprende hasta 10% de agua y trietilamina.
13. Una formulación antiséptica y/o desinfectante, que comprende un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 1 o agente de acuerdo con la reivindicación 3, formulada con un vehículo o excipiente orgánico o inorgánico.
14. Un procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula general (I) de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una adición directa de derivados de aminoácidos y péptidos, ambos con un grupo COOH protegido, a un conjugado de hemina con ácido glutámico en presencia de un agente de acoplamiento TBTU.
15. Un dipéptido seleccionado de HSerArgOMe, BocSer(Bzl)ArgOMe, BocSer(Bzl)ArgNH2, ZaArgSerOMe, Z3ArgSerNH2, y ZaArgSerOH, en las que Z es benciloxicarbonilo.
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