RU2250906C2

RU2250906C2 - Способы получения геминпептидов и их применение в качестве нуклеолитических агентов

Info

Publication number: RU2250906C2
Application number: RU2003120714/04A
Authority: RU
Inventors: В.Е. Небольсин (RU); В.Е. Небольсин; Г.А. Желтухина (RU); Г.А. Желтухина; Т.Н. Лобанова (RU); Т.Н. Лобанова
Original assignee: Небольсин Владимир Евгеньевич
Priority date: 2003-07-10
Filing date: 2003-07-10
Publication date: 2005-04-27
Also published as: RU2003120714A

Abstract

Изобретение относится к способам получения порфиринопептидов формулы I

где R₁ и R₂ - заместители, которые могут представлять собой аминокислоты или пептиды, состоящие из 2-15 аминокислотных остатков, при этом α -карбоксильные группы аминокислот или пептидов могут быть модифицированы С₁-С₈алкиловым эфиром, а боковые функции аминокислот или пептидов могут быть защищены, причем возможно, что R₁=R₂ или R₁≠ R₂, в частности R₁=-ArgOMe, R₂=-ОН (III); R₁=-LeuHisOMe, R₂=-OH (IV); R₁=-LeuLeuValPheOMe, R₂=-OH (V); карбоксильная группа порфирина может быть модифицирована метиловым или другим C₁-C₈ эфиром или физиологически приемлемой солью; Y^- представляет собой Cl^-; Me представляет собой Zn, Cu, Fe, Mn; путем активации карбоксильной группы порфирина действием N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидом при молярном соотношении исходных реагентов 1:1 и процесс ведут в присутствии N,N^' – дициклогексилкарбодиимида, или действием дифенилфосфорилазида (DPPA) при эквимолярном соотношении порфирин:DPPA в присутствии основания, затем активированный по карбоксильной группе порфирин вводят в реакцию с аминокомпонентом - аминокислотой или пептидом, находящимся в виде соли с минеральной кислотой, которую нейтрализуют основанием; и к применению I в качестве нуклеолитических агентов. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

Description

Изобретение относится к химии и медицине, а именно к новому способу синтеза конъюгатов порфиринов, в частности гемина с олигопептидами и аминокислотами, и их применению в качестве нуклеолитических агентов, общей формулы I:

где R₁ и R₂ - заместители, которые могут представлять собой аминокислоты или пептиды, состоящие из 2-15 аминокислотных остатков, при этом α -карбоксильные группы аминокислот или пептидов могут быть модифицированы C₁-C₈ алкиловым эфиром, а боковые функции аминокислот или пептидов могут быть защищены, причем возможно, что R₁=R₂ или R₁≠ R₂, в частности R₁=-ArgOMe, R₂=-OH(III); R₁=-LeuHisOMe, R₂=-OH(IV); R₁=-LeuLeuValPheOMe, R₂=-OH(V); карбоксильная группа порфирина может быть модифицирована метиловым или другим C₁-C₈ эфиром или физиологически приемлемой солью;

Y^-представляет собой Сl^-;

Me представляет собой Zn, Cu, Fe, Mn.

Известно, что одним из механизмов действия противовирусных препаратов является их способность разрушать ДНК. В связи с этим в настоящее время ведется поиск реагентов, способных эффективно и селективно деструктурировать ДНК и РНК. Соединения с такой активностью обнаружены, например, среди пептидов [Pierre J., Laval J. // J.Biol. Chem. 1981. V.256. Р.10217-10220] и их конъюгатов с олигонуклеотидами. Гемин обладает некоторой противовирусной активностью [Levere R.D., Gong Y.-F., Bucher D.J., Wormser C.P., Abraham N.G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88. P.1756-1759] и в особых условиях может стать причиной разрушения участков ДНК [Aft R.L., Mueller G.C. The hemin - mediated DNA strend scission. // J.Biol. 1983. V.258. P.19069-19079].

Учитывая вышеуказанное, геминпептиды могут представлять собой более совершенные реагенты для расщепления ДНК (РНК).

Порфиринопептиды, конкретнее геминпептиды, соответствующие формуле (I), а именно (IV), (V), ранее получали как методами классического синтеза в растворе, так и на твердой фазе. В обоих случаях в качестве активированного производного гемина использовался N-оксисукцинимидный эфир [Радюхин В.А., Филиппович Е.И., Евстигнеева Р.П. // Журн. Общ. химии. 1980. Т.50. С.673-678.; Евстигнеева Р.П., Лубсандоржиева Л.К., Желтухина Г.А. // Биоорган. химия. 1993. Т.19. №6. С.664-669.; Евстигнеева Р.П., Желтухина Г.А., Зарубина Т.В., Небольсин В.Е., Носик Д.Н., Носик И.И.// Авторская заявка на патент № 2002111028, дата подачи 25.04.2002].

Твердофазный метод синтеза геминпептидов позволяет целенаправленно с высоким выходом получать монопептидные производные гемина и имеет преимущества перед классическим синтезом в растворе при получении геминпептидов, содержащих достаточно длинные пептиды со сложной аминокислотной последовательностью. Однако синтез твердофазным методом геминпептидов, содержащих остатки аминокислот или коротких пептидов, неоправдано сложен и трудоемок по сравнению с синтезом в растворе.

Известные аминоацильные и пептидные производные гемина, соответствующие формуле I, а именно (III-V), ранее были получены путем взаимодействия аминосвободного эфира аминокислоты или пептида с N-оксисукцинимидным эфиром гемина [Евстигнеева Р.П., Рожкова Е.А., Немыкин В.Н., Воронов С.А., Желтухина Г.А. // ДАН. 1997. Т.356. С.642-644.; Евстигнеева Р.П., Желтухина Г.А., Зарубина Т.В., Небольсин В.Е., Носик Д.Н., Носик Н.Н.// Авторская заявка на патент № 2002111028, дата подачи 25.04.2002].

Последний представляет собой смесь моно- и бис-эфиров с гемином при соотношении приблизительно 2:1:1, который вводится в реакцию с аминокомпонентом без выделения. Вследствие этого для выделения моно-аминоацильных и моно-пептидных производных гемина оказалось необходимым применение трудоемкой двухстадийной очистки, предусматривающей использование колоночной и препаративной тонкослойной хроматографии. В результате выходы геминпептидов (III-V) составили соответственно 17, 47 и 41%.

Вышеуказанные недостатки делают известные способы малопригодными для препаративного синтеза низкомолекулярных геминпептидов, соответствующих общей формуле I.

Задачей заявленного изобретения является упрощение процесса, повышение выхода и качества целевого продукта.

Поставленная задача решается заявленным способом, согласно которому синтез порфиринопептидов, в частности геминпептидов формулы I, в растворе осуществляют путем ацилирования аминогруппы аминокислоты или пептида N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидным эфиром гемина или гемином, карбоксильная группа которого активирована действием DPPA [Гершкович А.В., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. // Киев: Наукова думка. 1992. 359 С.].

Активацию карбоксильной группы гемина осуществляют путем превращения в N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидный эфир DCC-методом (схема 1) с применением эффекта концентрационного разбавления. Последний заключается в медленном прибавлении в течение 5-6 часов раствора 1 экв. DCC в диметилформамиде к раствору протогемина IX и N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимида (1:1) при 0° С и при интенсивном перемешивании. В результате соотношение гемин:моно-активированный эфир:бис-активированный эфир в реакционной смеси составляет приблизительно 2:4:1 соответственно. Таким образом, количество моно-активированного эфира в реакционной смеси увеличивается в два раза, а количество бис-активированного эфира соответственно уменьшается по сравнению с подобной реакцией с N-оксисукцинимидом.

Схема 1

Синтез 6(7)-моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира протогемина IX

Полученный моно-ONb-эфир гемина (II) без выделения вводят в реакцию с аминокомпонентами H-ArgOMe или H-Leu-HisOMe или H-Leu-Leu-Val-PheOMe. Реакции протекают с более высокой скоростью по сравнению с аналогичными реакциями с участием N-оксисукцинимидного эфира гемина. При этом наблюдается полная конверсия моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира и аминокомпонентов с преимущественным образованием моно-аминоацильного или монопептидного производных гемина; соотношение образующихся моно- и бис-аминоацильных или пептидных производных гемина в реакционной смеси составляет приблизительно 4:1.

Вышеуказанные факторы и значительное различие в Rf моно- и бис-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидными эфирами гемина, а также между N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидными эфирами и аминоацильными и пептидными производными гемина позволяют упростить процесс выделения и повысить выходы целевых моно-пептидных производных гемина (III, IV, V). Для очистки этих геминпептидов оказалось достаточной однократная колоночная хроматография на силикагеле, в то время как при использовании N-оксисукцинимидного эфира гемина для выделения соответствующих геминпептидов (III, IV, V) требовалась достаточно сложная очистка: колоночная хроматография в сочетании с препаративной ТСХ или двухкратная препаративная [Евстигнеева Р.П., Рожкова Е.А., Немыкин В.Н., Воронов С.А., Желтухина Г.А. // ДАН. 1997. Т.356. С.642-644], что усложняет весь процесс в целом и снижает выход продуктов.

Выходы геминпептидов (III, IV, V), полученных с использованием N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидных эфиров гемина, были несколько выше, чем в случае N-оксисукцинимидных эфиров гемина, и составляют соответственно 36, 60 и 51%.

Кроме того, поставленная задача заявленного изобретения, заключающаяся в повышении выхода и качества моно-производных протогемина IX и упрощения процесса их выделения, решается и другим, альтернативным методом с применением дифенилфосфорилазида (DPPA) для активации СООН-группы гемина.

Активацию СООН-группы гемина действием DPPA проводят в целом в соответствии с методикой, применяемой в пептидном синтезе для активации аминокислот [Гершкович А.В., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. // Киев: Наукова думка. 1992. 359 С.], путем последовательного добавления к раствору гемина при охлаждении основания, DPPA и аминокомпонента. Преимуществом предлагаемого способа, как и в случае ONb-эфиров гемина, являются практически полная конверсия аминокомпонента, преимущественное образование моно-пептидного производного (соотношение образующихся моно- и бис-пептидных производных гемина составляет приблизительно 4:1).

Вышеуказанные факторы и отсутствие устойчивых активированных производных гемина после завершения реакции позволяют упростить процесс выделения и повысить выходы целевых моно-производных гемина. Для их очистки оказалось достаточно однократной колоночной хроматографии на силикагеле и выходы аминоацильного производного гемина и геминпептидов составили соответственно 63, 66 и 62%.

Ранее при получении геминпептидов (IV, V) использовались аминокомпоненты, полученные путем нейтрализации соответствующих трифторацетатов триэтиламином. Известно, что трифторуксусная кислота в присутствии основания и активированного карбоксильного компонента в безводной среде в ходе реакции образования различными методами пептидной связи между активированным карбоксильным и аминокомпонентами может служить источником побочных реакций [Гросс Э., Майенходер Н. Пептиды. Основные методы образования пептидной связи. // Москва. Мир. 1983].

Кроме того, трифторацетат может выступать в качестве противоиона по иону металла вместо Сl^-в составе порфиринового остатка.

Вышеуказанное может изменять и ухудшать качество и выход геминпептидов, в том числе их устойчивость при хранении.

Так, геминпептиды (IV, V), полученные с использование трифторуксусной кислоты, неустойчивы в растворах DMSO, что подтверждается методами ТСХ, электронной и масс-спектрометрии, что может быть причиной плохой воспроизводимости результатов биологических и биохимических испытаний, проводимых в растворах, содержащих DMSO.

Поставленная в заявке на изобретение задача повышения качества и выходов геминпептидов решается путем замены трифторуксусной кислоты на минеральную, например соляную, при отщеплении N-защиты, например Воc, от N-защищенных пептидов - аминокомпонентов при синтезе геминпептидов формулы I. Полученные таким способом геминпептиды устойчивы в растворах, содержащих DMSO.

Заключение

Таким образом, способ активации СООН-групп гемина с применением моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира и DCC или DPPA в присутствии основания и использование аминокомпонентов - пептидов в виде солей с минеральной кислотой, например хлоргидратов, с последующей нейтрализацией основанием обеспечивают упрощение процесса, повышение выходов и качества геминпептидов.

Список сокращений

Воc - трет-бутилоксикарбонил

DCC - N,N’-дициклогексилкарбодиимид

DCU - N,N’-дициклогексилмочевина

DMF - N,N’-диметилформамид

DMSO - диметилсульфоксид

DPPA - дифенилфосфорилазид

МеОН - метиловый спирт

ОМе - метиловый эфир

ONb - норборнендикарбоксиимидоокси

Трис-НСl - (гидроксиметил)аминометан-гидрохлорид

ТСХ - хроматография в тонком слое

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

Экспериментальная часть

Синтез порфиринопептидов отражен в примерах 2-7.

Предлагаемые порфиринопептиды получают с высокими выходами и высокой степенью чистоты и характеризуют УФ-, ИК-спектроскопией, масс-спектрометрией, ТСХ.

Индивидуальность полученных соединений проверяют методом ТСХ на пластинах Kieselgel 60 F₂₅₄ (фирмы "Merck", Германия) в системах: хлороформ - метанол 9:1 (1), хлороформ - метанол - уксусная кислота 5:3:1 (2), хлороформ - метанол 4:1 (3), на пластинах Alufol (нейтр., фирмы "Merck", Германия) - в метаноле (4), в системе хлороформ - метанол 9:1 (5).

Хроматограммы проявляют нингидрином, хлор-толидиновым реактивом и по свечению в УФ-свете, имидазолсодержащие производные - реактивом Паули.

Масс-спектры высокого разрешения получают на времяпролетном масс-спектрометре REFLEX™ III (BRUKER, Германия) методом матриксной лазернодесорбционной ионизации, в качестве матрицы использовалась 2,5-дигидрооксибензойная кислота.

ИК-спектры регистрируют на приборах: Perkin ELMER FT-IR Spectrometer 1725X (Швейцария) и Magna 750 (Nicolet, США).

Электронные спектры снимают на приборе Jasco model UV/VS 7800 Spectrophotometer (Япония).

Пример 1. Синтез 6(7)-моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира протогемина IX (II)

К раствору 0.7 г (1.08 ммоль) протогемина IX в 7 мл DMF и 0.20 г (1.08 ммоль) N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимида при охлаждении до -10° С и перемешивании добавляют по каплям 0.22 г (1.08 ммоль) DCC в 3 мл DMF в течение 6 ч. Раствор оставляют на 48 ч при 0° С. DCU отделяют. Дополнительную очистку от DCU проводят переосаждением из DMF эфиром. В осадке получают смесь соединений с Rf_ocн. _(II) 0.27(1), Rf_{минорн.}0.5(1), Rf_гемина0.15 (1).

Пример 2. Nα -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Arg-OMe (III)

К раствору 0.16 мл (1.2 ммоль) Еt₃N в 2 мл DMF прибавляют 0.16 г (0.6 ммоль) гидрохлорида метилового эфира аргинина, оставляют на 15 мин при 0° С. К раствору полученного аминокомпонента добавляют раствор 20.8 мл (0.6 ммоль) 6(7)-моно-N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира протогемина (IX) в DMF, полученного по вышеуказанной методике. Реакционную смесь перемешивают 5 ч до полного исчезновения моно-активированного эфира гемина с Rf 0.27(1). Раствор концентрируют в вакууме до 2 мл и прибавляют 6 мл эфира. Осадок отделяют от раствора декантированием и сушат над безводным CaCl₂. Вещество очищают на колонке (24× 1.2 см) с Kieselgel 60, целевой продукт элюируют смесью хлороформ-метанол (7:3). Фракции, содержащие вещество с Rf 0.78(2), объединяют. Растворитель удаляют в вакууме. Вещество растворяют в 8 мл бутанола и промывают водой (3× 3 мл). Растворитель из органического слоя удаляют в вакууме. Для введения противоиона Сl^- геминпептид (III) в 10 мл смеси хлороформ-метанол (9:1) встряхивают с 6 мл 0.5 н соляной кислоты, 6 мл 2% водного раствора гидрокарбоната натрия и водой до нейтральной реакции. Органический слой сушат над безводным Na₂SO₄, растворитель удаляют в вакууме, остаток сушат над безводным CaCl₂ в вакууме. Выход 0.14 г (36%). Rf 0.78 (2). Электронный спектр, λ _max, нм, СНСl₃-МеОН (1:1), (ε · 10^-3): 397.4 (101.5), 500.80 (4.49), 540.40 (2.63). 626.0 (1.14). ИК-спектр, ν , см^-1, вазелиновое масло: 1745 (СО cл.эф.), 1650 (амид I), 1514 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 786.41.

Пример 3. Nα -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Leu-His-OMe (IV)

Раствор 0.14 г (0.36 ммоль) Boc-Leu-His-OMe в 3.25 н НСl в смеси диоксана и метанола выдерживают 25 мин при 20° С. Кислоту и растворитель удаляют в вакууме, остаток растирают с эфиром. Осадок отделяют центрифугированием и сушат в вакууме над безводным NaOH. К раствору дихлоргидрата метилового эфира лейцилгистидина в 3.0 мл DMF при перемешивании и охлаждении до 0° С добавляют 0.1 мл (0.72 ммоль) Et₃N. Оставляют на 15 мин при 0° С. К раствору полученного аминокомпонента добавляют раствор 8 мл (0.36 ммоль) 6(7)-моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира протогемина IX (I), полученного ранее. Реакционную смесь перемешивают в течение 4 ч до исчезновения аминокомпонента. Раствор концентрируют в вакууме до 1.5 мл и добавляют 6 мл эфира. Осадок отделяют от растворителя декантированием и сушат над безводным CaCl₂. Вещество очищают на колонке (19× 3.5 см) с Kieselgel 60, целевой продукт элюируют смесью хлороформ-метанол (7:3). Фракцию, содержащую смесь моно- и бис-(метилового эфира Nα -лейцилгистидил)-протогемина IX с Rf 0.4 (3) и Rf 0.38 (3) соответственно, и фракцию, содержащую индивидуальный продукт с Rf 0.38 (3), 0 (4) собирают отдельно. Растворитель удаляют в вакууме. Фракцию с Rf 0.4 (3) дополнительно очищают колоночной хроматографией, элюируют смесью хлороформ-метанол (9:1), отбирают фракции отдельно с Rf соответственно 0.38 (3), 0 (4) (соединение IV), 0.4 (3), 0.8 (4) (бис-производное). Растворитель удаляют в вакууме. Целевое вещество (IV) переосаждают эфиром из хлороформа. Для введения противоиона Сl^-геминпептид (IV) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (III). Выход 0.19 г (60%). Rf 0.38 (3), Rf 0 (4), Электронный спектр, λ _мах, нм, СНСl₃-МеОН (8:2), (ε · 10^-3): 401.00 (102), 497.40 (10.6), 575.80 (3.87), 630.20 (2.27). ИК-спектр, KBr, ν , см^-1: 3274 (NH, ш.с.), 1744 (СО cл.эфир), 1663 (амид I), 1552 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]⁺ 880.8.

Пример 4. Nα -[6(7)-(Протогемин IХ)-ил]-Leu-Leu-Val-Phe-OMe (V).

Соединение (V) получают аналогично соединению (IV) из 0.105 г (0.18 ммоль) Boc-Leu-Leu-Val-Phe-OMe и 4.5 мл (0.18 ммоль) 6(7)-моно-N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимидного эфира протогемина IX (II), полученного ранее. Целевое вещество выделяют на колонке (35× 1.2 см) с Kieselgel 60, элюируя смесью растворителей хлороформ-метанол (9:1). Для введения противоиона Сl^-геминпептид (V) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (III). Выход 0.190 г (51%). Rf 0.5 (1), Rf 0 (5). Аминокислотный анализ: Leu 1.9 (2), Val 1.07 (1), Phe 1.02 (1). ИК-спектр, ν , см^-1, KBr: 3248 (NH-), 1730 (СО сл.эф.), 1640 (амид I), 1540 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M⁺] 1102.8.

Пример 5. Nα -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Arg-OMe (IIIa)

К раствору 0.05 г (0.20 ммоль) H-ArgOMex2HCl и 0.13 г (0.20 ммоль) протогемина IX в 2 мл DMF при охлаждении до -10° С и перемешивании прибавляют 0.044 мл (0.20 ммоль) DPPA и 0.084 мл (0.6 ммоль) Et₃N. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при -10° С и 15 ч при 20° С. Раствор концентрируют в вакууме до 1.5 мл и добавляют 6 мл эфира. Осадок отделяют от растворителя декантированием и сушат над безводным СаСl₂. Соединение очищают на колонке с Kieselgel 60 F₂₅₄ (12× 31.5 см) (Merck). Целевое вещество с Rf 0.78 (2) элюируют смесью хлороформ-метанол (7:3). Растворитель удаляют в вакууме. Для введения противоиона Сl^-геминпептид (IIIa) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (III). Выход 0.100 г (63%). Rf 0.78 (2). Электронный спектр, λ _max, нм, СНСl₃-МеОН (1:1), (ε · 10^-3): 398.4 (97.5). 495.80 (5.8), 542.40 (2.54), 630.0 (1.1). ИК-спектр, ν , см^-1, вазелиновое масло: 1745 (СО сл.эф.), 1635 (амид I), 1560 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 786.0.

Пример 6. Nα -[6(7)-(Протогемин IX)-ил]-Leu-His-OMe (IVa)

Раствор 0.10 г (0.26 ммоль) Boc-Leu-His-OMe в 3.25 н НСl в смеси диоксана и метанола выдерживают 25 мин при 20° С. Кислоту и растворитель удаляют в вакууме, остаток растирают с эфиром. Осадок отделяют центрифугированием и сушат в вакууме над безводным NaOH. К раствору полученного аминокомпонента и 0,17 г (0.26 ммоль) протогемина IX в 3 мл DMF, при охлаждении до -10° С и перемешивании прибавляют 0.056 мл (0.26 ммоль) DPPA и 0.11 мл (0.8 ммоль) Et₃N. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при -10 С и 15 ч при 20° С. Раствор концентрируют в вакууме до 1.5 мл и добавляют 6 мл эфира. Осадок отделяют от растворителя декантированием и сушат над безводным CaCl₂. Соединение (IVa) очищают на колонке с Kieselgel 60 F₂₅₄ (35× 1.2 см) (Merck). Растворитель удаляют в вакууме. Для введения противоиона Сl^- геминпептид (IVa) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (III). Выход 0.156 г (65.6%). Rf 0.38 (3), Rf 0 (4). Аминокислотный анализ: Leu 1.12 (1), His 1.07 (1). ИК-спектр, ν , см^-1, KBr: 3400 (NH-), 1741 (СО сл.эф.), 1660 (амид I), 1534 (амид II). Масс-спектр, m/z: [M]⁺ 880.2

Пример 7. Nα -[6(7)-(Протогемин IХ)-ил]-Leu-Leu-Val-Phe-OMe (Va)

Деблокирование аминокомпонента и синтез геминпептида (Va) осуществляют в соответствии с условиями, описанными для соединения (IVa), исходя из 0.075 г (0.12 ммоль) Boc-Leu-Leu-Val-Phe-OMe, 0.078 г (0.12 ммоль) протогемина IX в 3 мл DMF, 0.03 мл (0.12 ммоль) DPPA и 0.033 мл (0.24 ммоль) Еt₃N. Целевое вещество выделяют на колонке (40× 1.2 см) с Kieselgel 60, элюируя смесью растворителей хлороформ-метанол (9:0.5). Для введения противоиона Сl^-геминпептид (Va) обрабатывают в соответствии с методикой, описанной для соединения (III). Выход 0.084 г (62%). Rf 0.5 (1), Rf 0 (5). Аминокислотный анализ: Leu 2.01 (2), Val 1.06 (1), Phe 0.9 (1). ИК-спектр, ν , см^-1, KBr: 3250 (NH-), 1726 (СО сл.эф.), 1642 (амид I), 1542 (амид II). Масс-спектр, m/z: [М]⁺ 1103.0

Исследование нуклеолитической активности геминпептидов

Другим объектом изобретения является применение геминпептидов общей формулы I в качестве нуклеолитических агентов.

Исследование нуклеолитической активности геминпептидов (III, IV, V) проводят по типичной методике [Maniatis Т., Fritish E., Sambrook J. Molecular Cloning (A Laboratory Manual) Cold Spring Harbor; N.-Y.: Cold Spring Harbor Cloning (A Laboratory Manual) Cold Spring Harbor; N.-Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982] с применением ДНК плазмиды pGem, а также ДНК плазмиды pUKB244, несущей полноразмерный вирусный ген Gag-P24 (ВИЧ), выделенных из E.coli. Геминпептиды в концентрации 10^-4-10^-8 М инкубируют с 0.5 мкг плазмидной ДНК в течение 1 ч при 37° С в 10 мкл реакционной смеси. Продукты расщепления анализируют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле в ТАЕ-буфере (0.04 М Трис-ацетат (рН 8.0), 0.02 М ЭДТА) при напряжении 10 В/см. Продукты реакции визуализируют путем окрашивания их флуоресцирующим красителем бромистым этидием. Полосы ДНК детектируют с помощью источника УФ-света длинноволновой области с λ 300 нм и фотографируют с помощью цифровой камеры фирмы “Canon”.

Активность соединений исследуют при кислых и нейтральных значениях рН в следующих буферных растворах:

буфер I:100 мМ AcONH₄ (рН 4.5), 10 мМ MnCl₂;

буфер II: 100 мМ AcONH₄ (pH 4.5), 20 мМ ZnOAC₂;

буфер III: 100 мМ AcONH₄ (pH 4.5), 10 MM MgCl₂;

буфер IV: 20 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 20 мМ МnСl₂;

буфер V: 20 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 20 мМ ZnOAC₂;

буфер VI: 100 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 10 мМ MgCl₂;

буфер VII: 20 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 2 мМ FeSO₄;

буфер VIII: 10 мМ Трис-HCl (рН 8.5), 10 мМ MgCl₂, 100 мМ КСl, 0.1 mg/ml BSA, 200 мМ ЭДТА;

буфер IX: 10 мМ Трис-HCl (рН 7.5), 10 мМ MgCl₂, 0.1 mg/ml BSA, 200 мМ ЭДТА.

Геминпептиды прибавляют к реакционной смеси в виде раствора в DMSO, причем концентрация DMSO в конечной пробе составляет 10%.

Исчезновение полос, соответствующих различным формам ДНК, свидетельствуют о расщеплении ДНК по окислительному типу.

Результаты

Введение в реакционную среду геминпептидов вызывает исчезновение полос (расщепление) ДНК в различных условиях (рН, ионы металлов и др.) (см. таблицу).

Таблица 1 Нуклеолитическая активность геминпептидов
№ соединения	Формула	Буфер (), расщепление ДНК	Буфер (), отсутствие расщепления ДНК
III	HeminArgOMe	(I-III, VIII, IX) +	(IV-VII) -
IV	HeminLeuHisOMe	(I, II) +	(III-IХ) -
V	HeminLeuLeuValPheOMe		(I, IV) -
+ расщепление ДНК - отсутствие расщепления ДНК

Заключение

Порфиринопептиды, полученные заявленным способом, можно применять в качестве нуклеолитических агентов, например для биомедицинских исследований, или в качестве потенциальных лекарственных средств для химиотерапии вирусных и онкологических заболеваний.

Claims

1. Способы получения порфиринопептидов общей формулы I или их фармацевтически приемлемых солей

(I)

где R₁ и R₂ - заместители, которые могут представлять собой аминокислоты или пептиды, состоящие из 2÷ 15 аминокислотных остатков, при этом α -карбоксильные группы аминокислот или пептидов могут быть модифицированы С₁-С₈алкиловым эфиром, а боковые функции аминокислот или пептидов могут быть защищены, причем возможно, что R₁=R₂ или R₁≠ R₂, в частности R₁=-ArgOMe, R₂=-OH (III); R₁=-LeuHisOMe, R₂=-OH (IV); R₁=-LeuLeuValPheOMe, R₂=-OH (V); карбоксильная группа порфирина может быть модифицирована метиловым или другим С₁-С₈ эфиром или физиологически приемлемой солью;

Y^- представляет собой Cl^-;

Me представляет собой Zn, Cu, Fe, Mn;

включающие активацию карбоксильной группы порфирина и последующее взаимодействие активированного производного порфирина с аминокислотой или пептидом, отличающиеся тем, что карбоксильную группу порфирина активируют действием N-окси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимида при молярном соотношении исходных реагентов 1:1 и процесс ведут в присутствии DCC, или действием DPPA при эквимолекулярном соотношении порфирин: DPPA в присутствии основания, затем активированный по карбоксильной группе порфирин вводят в реакцию с аминокомпонентом - аминокислотой или пептидом, находящимся в виде соли с минеральной кислотой, которую нейтрализуют основанием.

2. Способы получения порфиринопептидов по п.1, отличающиеся тем, что в соединениях общей формулы I остаток порфирина представляет собой гемин; остатки аминокислоты или пептида представляют собой -Arg-OMe, -Leu-HisOMe, -Leu-Leu-Val-PheOMe, а основание для активации СООН группы гемина действием DPPA и нейтрализации аминокомпонента, находящегося в виде хлористоводородной соли, представляет собой триэтиламин.

3. Применение порфиринопептидов общей формулы I в качестве нуклеолитических агентов.

4. Применение порфиринопептидов по п.3, отличающееся тем, что соединения общей формулы I проявляют нуклеолитическую активность по отношению к вирусной ДНК.