WO2013071678A1 - 一种肝癌多肽标志物抗原竞争性酶联免疫检测试剂盒 - Google Patents

一种肝癌多肽标志物抗原竞争性酶联免疫检测试剂盒 Download PDF

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monoclonal antibody
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魏开华
肖汉族
周晓明
付海媛
原剑
侯利平
杨保安
孙云波
黄亚娟
郑俊杰
甄蓓
张拓
王东茂
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北京正旦国际科技有限责任公司
湖南金健药业有限责任公司
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin

Definitions

  • the invention belongs to the field of biotechnology, and particularly relates to a biologic polypeptide marker antigen competitive enzyme-linked immunoassay kit and a detection method thereof. Background technique
  • liver cancer surgery With the maturity and development of liver cancer surgery, the treatment methods and means of liver cancer are increasingly abundant, and are no longer limited to a single surgical treatment. Liver resection and liver transplantation are still the main methods for treatment of liver cancer patients, but minimally invasive treatment, percutaneous transcatheter arterial chemoembolization and other technical methods, as an important supplement to surgical treatment, have also been widely used, they are created for patients. Surgical treatment opportunities, reducing or reducing tumor recurrence and metastasis have played a role in extending the survival time of patients. Despite this, patients with liver cancer have insidious onset, no obvious symptoms, and most patients have lost the opportunity to undergo radical surgery. Therefore, "early detection, early diagnosis, early treatment” is an important measure to reduce cancer mortality. Screening and establishing highly sensitive, highly specific serological diagnostic techniques for early diagnosis of cancer, providing early warning screening for cancer, is of great significance and great market prospects.
  • AFP alpha-fetoprotein
  • HCC liver cancer
  • the peptide in serum is different from the protein in serum, and its molecular weight is lower than 1000OOD, and the structure is simple and varied. Whether it is possible to use the current routine clinical means for testing is still being explored.
  • a serum polypeptide is a degradation product of a serum albumin or a gene directly encoded product.
  • the metabolism of the protein changes, resulting in a corresponding change in the polypeptide, thereby establishing a correlation between the polypeptide and the disease. Therefore, the polypeptide can be diagnosed like a protein.
  • some diseases have been diagnosed using peptide markers.
  • the early detection kit for tumor based on serum polypeptide antigen is one of the most important early diagnosis techniques for tumors.
  • single markers in the clinical field always have the disadvantages of low specificity and low positive rate. Especially the detection rate of early tumors is not high. It is imperative to detect multiple markers. However, there is no good means. Achieve simultaneous detection.
  • Josep Villanueva et al. studied 32 cases of prostate cancer, 21 cases of breast cancer and 20 cases of bladder cancer serum peptides, and found that 14, 10 and 58 can be used as tumor marker polypeptides for prostate cancer, breast cancer and bladder cancer, respectively.
  • the prediction accuracy is 100%.
  • the abundant peptides present in serum provide abundant marker resources for tumor early warning and early diagnosis.
  • the object of the present invention is to provide a kit for detecting a liver cancer polypeptide marker antigen competitive enzyme-linked immunoassay and a method for detecting the same.
  • the invention provides a liver cancer polypeptide marker antigen competitive enzyme-linked immunosorbent assay kit, which comprises the monoclonal antibody secreted by the monoclonal antibody hybridoma cell line AP0105 of the anti-human primary liver cancer polypeptide marker with the accession number CGMCC No. 5269.
  • hybridoma cell line is a polypeptide marker antigen (sequence is Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-
  • polypeptide 5 The polypeptide of Gln, designated as polypeptide 5), is conjugated to the carrier protein keyhole limpet hemocyanin (KLH) immunogen, immunized to BALB/C mice, and then screened for hybridoma cell lines.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • the monoclonal antibody hybridoma cell line AP0105 for anti-human primary liver cancer polypeptide marker provided by the present invention has been on the ordinary microbiology center of China Microbial Culture Collection Management Committee on September 27, 2011 (Address: Beichen West, Chaoyang District, Beijing) No. 3, No. 1 Road, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Zip Code 100101) Deposit, deposited as CGMCC No. 5269.
  • the monoclonal antibody is an enzyme-labeled monoclonal antibody, and preferably, the labeled enzyme may be horseradish peroxidase.
  • the liver cancer polypeptide marker antigen competitive enzyme-linked immunosorbent assay kit of the present invention may further comprise a coating solution, 5% skim milk powder, TMB color developing solution, 2M sulfuric acid, and 96-well enzyme-linked plate.
  • the invention provides a method for detecting a liver cancer polypeptide marker antigen, comprising the steps of:
  • the method specifically includes the following steps:
  • the sample to be tested is combined with 0.3 g/mL of HRP-labeled polypeptide antibody at a volume ratio of 1: 1 at 37 °C for 0.5-1 hour; at the same time, PBS is used instead of the sample to be tested as a negative pair.
  • the invention also provides the use of the above enzyme-linked immunoassay kit for detecting liver cancer polypeptide marker antigen.
  • the monoclonal antibody provided by the invention has strong specificity against the polypeptide marker antigen;
  • the method for detecting the peptide marker antigen is simple and rapid, and is convenient for clinical detection; and can be detected by a high-throughput, low-cost enzyme-linked detector.
  • the invention combines polypeptide antibody with ELSIA technology, can simultaneously detect multiple biomarker groups, and can be used for large-scale sample detection, and is an ideal tool for verifying serum markers and for clinical detection.
  • Fig. 1 is a graph showing the ROC curve of liver cancer and normal serum in the present invention. detailed description
  • Example 1 Method for preparing polypeptide marker antigen monoclonal antibody
  • the recombinant polypeptide 5 conjugated to the carrier protein KLH was used as an immunogen to immunize BALB/C mice; its full-length sequence is: Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-Hi-Glu-Arg-Asp -Gln-Gly-His-Gly-His-Gln.
  • polypeptide standard solution ⁇ g/ml coating solution of synthetic peptide 5;
  • TMB color developing solution purchased from Beijing Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd.;
  • Samples 60 clinically diagnosed liver cancer serum and normal serum.
  • the monoclonal antibody provided by the invention has strong specificity against the polypeptide marker antigen; the method for detecting the polypeptide marker antigen is simple and rapid, and is convenient for clinical detection; and can be detected by a high-throughput and low-cost enzyme-linked detector. Multiple biomarker groups can be detected at the same time, and it can be used for large-scale sample detection, which reduces costs. It is an ideal tool for verifying serum markers and for clinical detection, and has important economic value and application prospects.

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Abstract

本发明公开了一种肝癌多肽标志物抗原竞争性酶联免疫检测试剂盒，其含有保藏编号为CGMCC No.5269的抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105分泌的单克隆抗体以及和待测样品中的多肽标志物竞争的多肽标准品，所述多肽的序列为Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln。

Description

一种肝癌多肽标志物抗原竞争性酶联免疫检测试剂盒 技术领域
本发明属于生物技术领域， 具体涉及肝癌多肽标志物抗原竟争 性酶联免疫检测试剂盒及其检测方法。 背景技术
随着肝癌外科的成熟和发展， 肝癌的治疗方法和手段日渐丰富， 而不再局限于单一的手术治疗。肝切除术和肝移植仍然是肝癌患者治 疗的主要方法， 但微创治疗、 经皮肝动脉化疗栓塞等技术方法， 作为 手术治疗的重要补充， 也得到了较广泛的应用， 它们在为患者创造手 术治疗机会、降低或减少肿瘤的复发和转移等方面都起到了一定的作 用， 延长了患者的生存时间。 虽然如此， 肝癌患者发病隐匿、 无明显 症状、 多数患者就诊时已失去手术根治的机会。 因此， "早期发现、 早期诊断、 早期治疗"是降低癌症死亡率的重要措施。 筛选和建立用 于癌症早期诊断的、 高敏感、 高特异的血清学诊断技术， 提供癌症早 期预警普查， 具有重大意义和巨大巿场前景。
目前国内外广泛釆用检测血清中甲胎蛋白 （AFP ) 来确诊肝癌 ( HCC ),尽管这种方法提高了 HCC的检测水平，但仍有显著数量患 者的甲胎蛋白并未升高， 尤其对肿瘤直径小于 3CM的小肝癌患者， 其敏感性及特异性更低。 近年来， 标志物联检在肿瘤诊断中的应用的 研究得到很大的重视。 如通过联检甲胎蛋白 (AFP)、 癌胚抗原 (CEA)、 血清铁蛋白 (SF)、 （x-L-岩藻糖苷酶 (AFU)可显著提高肝癌诊断的阳性 率。 AFP、 CEA、 SF、 CA等四标志物联检原发肝癌的实验也获得不 错的结果。但由于诊断特异性或成本效益方面的原因， 很难在肝癌普 查中广泛应用。
血清中丰富的多肽资源在目前重大疾病诊断中扮演重要的角色。 釆用目前常规的临床手段进行多肽检测逐渐引起学术界和医药界的 高度重视，基于多肽的肿瘤诊断技术正开始向临床应用高速发展， 肿 瘤的早期预警技术也在开发之中，一些多肽的联合应用有可能为胂瘤 等重大疾病的预警提供革新性的突破。 血清中多肽同血清中蛋白不 同， 其分子量低于 lOOOODa, 结构简单， 变化多样。 是否能够釆用目 前常规的临床手段进行检测仍在探索。
目前，检测血清中多肽进行临床诊断还没有先例。 血清多肽能否 用于诊断或早期诊断肝癌可以从三个方面来判断。 1、 血清多肽是血 清蛋白的降解产物或基因直接编码产物。当生理状态发生变化时尤其 向肿瘤转化时， 蛋白的代谢发生变化， 导致多肽相应变化， 从而建立 了多肽… -疾病的相关关系， 因此， 多肽可以像蛋白一样进行疾病诊 断。 2、实践上已经有一些疾病的诊断采用多肽标志物， 1985年以来, 利用合成多肽检测艾滋病病毒（P24 )、 风疹病毒、 人巨细胞病毒及类 风湿等已应用到临床。 3、 文献表明， 多肽可以用于临床诊断， 如， Clinical Chemistry 51 :10, 1933-1945(2005)和 Clinical Chemitry 53:61 , 067- 1074(2007)认为血清多肽标志物能更精确的区分蛋白标志物不能 区分的肿瘤。 Nat Methods .2008 Jan;5(l):57-9认为质谱诊断肿瘤甚至 比 MRI还好。 质谱技术给生命科学带来的促进作用举世公认， 近十 年来， 质谱在新生二筛查、 基因突变检测方面取得一系列重要进展， 并出现了单核苷酸多态性（SNP )分析专业质谱仪器， 显示了质谱在 临床诊断方面的价值。
基于血清多肽抗原的肿瘤早期诊断试剂盒是当前最受关注的肿 瘤早期诊断技术之一。 目前临床领域中单一标志物始终存在着特异性 不强、 阳性率较低等不足， 特别是对早期肿瘤的检测率不高， 多标志 联合检测事在必行， 但苦于没有一个很好的手段实现同时检测。 2006 年 Josep Villanueva等人对 32例前列腺癌、 21例乳腺癌和 20例膀胱 癌血清多肽研究， 发现 14个、 10个和 58个可分别作为前列腺癌、 乳腺癌和膀胱癌的肿瘤标志多肽， 预测准确率为 100%。 血清中存在 的丰富的多肽为肿瘤预警和早期诊断提供了丰富的标志物资源，这些 多肽的联合应用有可能为肿瘤等重大疾病的预警提供革新性突破。经 研 究 发 现 ， 序 列 为 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys- His-Glu-Arg-Asp-Glii-Gly-His-Gly-His-Gln 的多肽是癌症重要血清多 肽标志物之一。
近几年兴起的血清多肽组学已成功应用于几种癌的诊断研究，如 乳腺癌， 卵巢癌， 前列腺癌等， 主要采用的是表面增强激光解吸离子 化（SELDI )技术和免疫磁珠技术， 但该体系存在价格昂贵， 不利推 广的缺点。 发明内容
本发明的目的在于提供肝癌多肽标志物抗原竟争性酶联免疫检 测试剂盒及其检测方法。
本发明提供的肝癌多肽标志物抗原竟争性酶联免疫检测试剂 盒， 其含有保藏编号为 CGMCC No. 5269的抗人原发性肝癌多肽标 志物单克隆抗体杂交瘤细胞株 AP0105分泌的单克隆抗体以及和待测 样品中的多肽标志物竟争的多肽标准品， 所述多肽的序列为 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His- Gln。
其中， 所述杂交瘤细胞株是以多肽标志物抗原 （序列为 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-
Gln 的多肽， 命名为多肽 5 ) 与载体蛋白匙孔血蓝蛋白 (KLH)的偶联 物免疫原， 免疫 BALB/C小鼠， 然后筛选出的杂交瘤细胞株。 本发明 提供的抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株 AP0105, 已于 2011年 9月 27号在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（地址： 北京巿朝阳区北辰西路 1号院 3号， 中国科 学院微生物研究所， 邮编 100101 )保藏，保藏号为 CGMCC No.5269。
其中， 所述的单克隆抗体为酶标单克隆抗体， 优选的， 所述标记 的酶可为辣根过氧化物酶。 本发明的肝癌多肽标志物抗原竟争性酶联免疫检测试剂盒还可 进一步含有包被液、 5%脱脂奶粉、 TMB显色液、 2M硫酸和 96孔酶 联板。
本发明提供的检测肝癌多肽标志物抗原检测方法， 包括步骤：
( 1 ) 釆集样品；
(2) 用所述的试剂盒进行检测；
(3) 分析检测结果
优选地， 所述方法具体包括如下步骤：
1 )取 l-1.5 g/mL多肽标准品溶液 ΙΟΟμ (包被液溶解） , 置于 96孔板中， 4°C放置过夜或 37°C放置 2小时；
2)弃包被液， 用 0.01M、 pH7.4PBST缓冲液 200-300ML清洗 5-7 次， 拍干；
3)加入 200-300μΙ^5%的脱脂奶粉， 37°C静置封闭 1-2小时；
4)弃封闭液， 用 0.01M、 pH7.4PBST缓冲液 200-30(^L清洗 5-7 次， 拍干；
5)待测样品与 0.3 g/mL 的 HRP标记多肽抗体以体积比 1: 1 在板外 37 °C结合 0.5-1小时； 同时以 PBS代替待测样品作为阴性对 昭、.？
6)加入 80-120μΙ 5) 中结合溶液， 37°C静置 0.5-1小时；
7) 弃 6) 中溶液， 用謹 M、 pH7.4 PBST缓冲液 200-300 L清 洗 5-7次， 拍干；
8)加入 80-120μυΓΜΒ显色液， 37'C避光孵育 15min显色；
9)加入 30-70μί2Μ硫酸， 终止反应；
10)用酶联检测仪测定波长 450 nm的光吸收值（ OD值）。
本发明还提供了上述酶联免疫检测试剂盒在检测肝癌多肽标志 物抗原中的应用。
本发明所提供的单克隆抗体针对多肽标志物抗原的特异性强；多 肽标志物抗原的检测方法的操作步骤简便快捷， 利于临床检测； 可 进行高通量、 低成本的酶联检测仪检测。
本发明将多肽抗体与 ELSIA技术联合， 可以同时检测多个生物 标志群， 并可用于大规模的样本检测，是验证血清标志物和应用于临 床检测的理想工具。 附图说明
图 1为本发明的检测肝癌与正常血清的 ROC曲线图。 具体实施方式
以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 实施例 1 多肽标志物抗原单克隆抗体的制备方法
1 )采用偶联载体蛋白 KLH 的合成的多肽 5 作为免疫原免疫 BALB/C 小 鼠； 其全长序列为： Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys- His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln。
2 ) 2周后检测尾血滴度， 达到 1: 1000以上后， 取 BALB/C小 鼠脾细胞与 SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在 PEG作用下进行融合；
3 )通过 ELISA方法进行筛选， 用有限稀释法对分泌抗体阳性的 杂交瘤细胞进行克隆纯化；
4 )筛选出 10株针对合成肽 5的杂交瘤细胞， 意外地发现其中一 株敏感性较高（lng/well ), 扩增细胞系， 制备并纯化单抗腹水， 检测 单抗的效价 ( 1:200000 )、 滴度（ 0.0005 g/ml )及亚型鉴定 ( IgG2b ) 等， 得到抗多肽 5的特异性单克隆抗体。将该杂交瘤细胞株命名为抗 人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株， 并于 2011年 9 月 27 号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保 藏， 保藏号为 CGMCC No.5269。 实施例 2 多肽标志物抗原的竟争性酶联免疫检测试剂盒的组装
1 ) 1.25μβ/ιη1辣根过氧化物酶标记的实施例 1的抗多肽 5的特异 性单克隆抗体；
2) 多肽标准品溶液： ^g/ml合成肽 5的包被溶液；
3)包被液： 0.1MpH9.6的碳酸盐缓冲液；
4) 5%脱脂奶粉： 5g/100ml脱脂奶粉；
5) TMB显色液： 购自北京康为世纪生物科技公司；
6) 2M硫酸；
7) 96孔酶联板。 实施例 3 多肽标志物抗原的竟争性酶联免疫检测方法
样本： 临床确诊的肝癌血清、 正常血清各 60份。
检测过程：
1)取 l g/mL多肽标准品溶液 ΙΟΟμί (包被液溶解）， 置于 96 孔板中， 4°C放置过夜；
2) 弃包被液， 用 0·01Μ、 pH7.4PBST缓冲液 20(^L清洗 6次， 拍干；
3)加入 200μ 5%的脱脂奶粉， 37°C静置封闭 1.5小时；
4) 弃封闭液， 用 0.01M、 pH7.4PBST缓冲液 200μΙ^清洗 6次， 拍干；
5)待测样品与 0.3 g/mL 的 HRP标记多肽抗体以体积比 1: 1 在板外 37 °C结合 1小时； 同时以 PBS代替待测样品作为阴性对照；
6)加入 100μί5) 中结合溶液， 37°C静置 1小时；
7) 弃 6) 中溶液， 用 0.01M、 pH7.4 PBST缓冲液 200μ 清洗 6 次， 拍干；
8)加入 ΙΟΟμΕΓΜΒ显色液， 37°C避光孵育 15min显色；
9)加入 50μΙ^2Μ硫酸， 终止反应；
10)用酶联检测仪测定波长 450 nm的光吸收值（ OD值）。
结果经统计， 如图 1的 ROC曲线显示， 肝癌血清与正常血清两 组诊断阳性标准为 OD值<=0.967, 敏感度达到 94.3%, 特异度达到 95.1%,说明用本发明提供的试剂盒进行酶联免疫检测，特异性很强、 重复性好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领 域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下， 还可以 做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 工业实用性
本发明提供的单克隆抗体针对多肽标志物抗原的特异性强；多肽 标志物抗原的检测方法的操作步骤简便快捷， 利于临床检测； 可进 行高通量、 低成本的酶联检测仪检测。 可以同时检测多个生物标志 群， 并可用于大规模的样本检测， 降低了成本， 是验证血清标志物和 应用于临床检测的理想工具， 具有重要的经济价值和应用前景。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种肝癌多肽标志物抗原竟争性酶联免疫检测试剂盒， 其特 征在于，含有保藏编号为 CGMCC No. 5269的抗人原发性肝癌多肽标 志物单克隆抗体杂交瘤细胞株 AP0105分泌的单克隆抗体以及和待测 样品中的多肽标志物竟争的多肽标准品， 所述多肽的序列为
Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-
Gln。
2、 根据权利要求 1所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述的单 克隆抗体为酶标单克隆抗体。
3、 根据权利要求 2所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述酶为 辣根过氧化物酶。
4、 根据权利要求 1〜3任一项所述的检测试剂盒， 其还含有包被 液、 5%脱脂奶粉、 TMB显色液、 2M硫酸和 96孔酶联板。
5、 权利要求 1-4任一所述的试剂盒在检测肝癌多肽标志物抗原 中的应用。
PCT/CN2012/000221 2011-11-14 2012-02-21 一种肝癌多肽标志物抗原竞争性酶联免疫检测试剂盒 WO2013071678A1 (zh)

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