WO2013057354A1 - Uso de melatonina para el tratamiento y/o prevención de la mucositis - Google Patents

Uso de melatonina para el tratamiento y/o prevención de la mucositis Download PDF

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Germaine Escames Rosa
Darío ACUÑA CASTROVIEJO
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Definitions

  • the present invention relates to the use of a composition comprising melatonin (N-Acetyl-5-methoxytryptamine) or its derivatives in a concentration of 2.5% to 5% weight / volume (w / v) for the preparation of a Pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of mucositis.
  • melatonin N-Acetyl-5-methoxytryptamine
  • w / v weight / volume
  • mucositis is caused by radiotherapy and / or chemotherapy. Therefore, the invention could be framed in the medical field.
  • Mucositis is an inflammatory reaction that affects the entire gastrointestinal tract, from the mouth to the anus, and is one of the main adverse effects of chemotherapy and / or radiotherapy and bone marrow transplants. Mucositis can also be caused by chemical agents such as corticosteroids, immunosuppressive drugs (azathioprine, cyclosporine A), xerostomizing drugs, anxiolytics, antidepressants, antihistamines, sympathomirnetic stimulants, antiparkinsonians, antipsychotics, gingival or hydantoin antibiotics.
  • corticosteroids such as corticosteroids, immunosuppressive drugs (azathioprine, cyclosporine A), xerostomizing drugs, anxiolytics, antidepressants, antihistamines, sympathomirnetic stimulants, antiparkinsonians, antipsychotics, gingival or hydantoin antibiotics.
  • immunosuppressive drugs azathi
  • Oral mucositis (or oromucositis) induced by ionizing radiation (or also called radioinduced) and chemotherapeutic agents is currently one of the main problems in the therapy of cancer patients.
  • 97% develop some degree of mucositis, and 100% of those undergoing prolonged fractional radiotherapy also develop it (Trotti A et al. Radiotherapy and Oncology 2003, 66: 253 -262).
  • the damage caused by ionizing radiation is due to direct and indirect mechanisms.
  • Mucositis is classified, according to the World Health Organization (WHO), in different grades according to the symptomatology.
  • Grade 0 normality
  • grade 1 generalized erythema, pink mucosa not painful and with abundant saliva, normal voice
  • grade 2 erythema, little extensive ulcers, solid swallowing is maintained
  • grade 3 erythema, edema or extensive ulcers, the patient can only swallow fluids, entails pain and difficulty speaking
  • grade 4 very extensive ulcers, bleeding gums, infections, no saliva, very intense pain, enteral or parenteral support.
  • Mucositis appears as a result of a series of biological events that begin in the submucosa and progress to the epithelium and are common for mucositis of different etiologies.
  • ROS reactive oxygen species
  • Transcription factors are activated such as the nuclear factor kappa-B (NF-kB).
  • NF-kB nuclear factor kappa-B
  • proinflammatory cytokines including interleukin 1 (IL-1) and tumor necrosis factor alpha (TNFa), which cause apoptosis and cell damage. This inflammatory reaction causes damage to the mucosa with the consequent appearance of ulcers.
  • Mucositis is a process in which some biochemical mechanism different from the rest of the inflammatory processes could intervene, such as the inflammatory pathway (Escames G, et al. Hum Genet, Julio, 201 1, DOI 10.1007 / s00439-01 1 -1057). At present it has no treatment that causes a total reversal of the same or that totally prevents its appearance.
  • the present invention describes the use of a composition comprising melatonin or a derivative thereof at a concentration of 2.5 to 5% w / v for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of mucositis .
  • composition of the invention is useful for protecting the oral mucosa as well as the gastrointestinal mucosa.
  • concentrations lower than those collected in the composition of the invention are not capable of completely reversing mucositis, while concentrations equal to or greater than 3% w / v are capable of treating and reversing 100% Mucositis caused by ionizing radiation.
  • Results of different routes of administration are shown, the topical route being the one that offers the best protection to oral mucositis.
  • the present invention relates to the use of a composition comprising melatonin or a derivative thereof at a concentration of 2.5% to 5% w / v for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of mucositis.
  • a composition of the invention comprising melatonin or a derivative thereof at a concentration of 2.5% to 5% w / v for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of mucositis.
  • Constant of 2.5-5% w / v means that the composition comprises between 2.5-5 grams of melatonin or a derivative thereof in 100 ml of final composition.
  • the abbreviation "p / v” refers to weight / volume or mass / volume (m / v).
  • a preferred embodiment refers to the use where the concentration of melatonin or a derivative thereof is 3% w / v. Therefore, said preferred composition refers to a composition comprising 3 grams of melatonin or a derivative thereof in 100 ml of total volume of the composition.
  • preferred composition of the invention refers to a composition comprising 3 grams of melatonin or a derivative thereof in 100 ml of total volume of the composition.
  • Melatonin or a derivative thereof means any compound comprised within the general formula I, as well as its pharmaceutically acceptable salts, solvates or prodrugs, which are useful for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or mucositis prevention
  • the compounds of general formula I refer to:
  • n is an integer between 1 and 4;
  • alkyl refers in the present invention to aliphatic, linear or branched chains, having 1 to 4 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, tert- butyl, sec-butyl, n-pentyl, etc.
  • the alkyl group has between 1 and 2 carbon atoms. And more preferably they are a methyl group.
  • R 3 is a methyl group. More preferably n is 1 and even more preferably R 2 is hydrogen.
  • melatonin refers to N-acetyl-5-methoxy-triptamine, also referred to in the literature as melatonin, melatonine, melatol, melovine, circadin, ceremoniesn, acetaminde, N-acetyl-methoxy-tryptamine, 5-methoxy- N- acetyltryptamine, N- [2- (5-methoxy-1 H-indole-3-yl) ethyl] acetamide or N- [2- (5- methoxyindole-3-yl) ethyl] acetamide or when in the compound of general formula (I) Ri and R3 are methyl, n is 1 and R 2 is hydrogen.
  • the CAS number of melatonin is 73-31 -4.
  • Melatonin is an endogenous neurohormone produced by the pineal gland (cerebri epiphysis), as well as by other organs, such as the gastrointestinal tract, the retina, lymphocytes and bone marrow cells, physiologically in animals, including humans .
  • Melatonin is produced in animals, including humans, from serotonin (5-hydroxtriptamine, 5-HT), which in turn derives from the amino acid tryptophan. Therefore, the present invention could also refer to the use of a composition comprising any of the precursors of melatonin (5- HT, tryptophan or intermediate metabolites such as N-acetylserotonin, or ⁇ AS), in a concentration sufficient to allow the human body were transformed to melatonin at the concentrations described in the present invention, for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of mucositis.
  • a composition comprising any of the precursors of melatonin (5- HT, tryptophan or intermediate metabolites such as N-acetylserotonin, or ⁇ AS), in a concentration sufficient to allow the human body were transformed to melatonin at the concentrations described in the present invention, for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of mucos
  • the present invention also relates to the pharmaceutically acceptable salts of melatonin or its derivatives that can be generated by chemical methods known to the person skilled in the art, for example, by a reaction with an acid in water or in a solvent. organic or in a mixture of both.
  • organic solvent ether, ethyl acetate, ethanol, isopropanol or acetonitrile can be used.
  • the acid addition salts include mineral acid addition salts such as, for example, hydrochloride, hydrobromide, iohydrate, sulfate, nitrate, phosphate, and organic acid addition salts such as, for example, acetate, maleate. , fumarate, citrate, oxalate, succinate, tartrate, malate, mandelate, methanesulfonate and ptoluenesulfonate.
  • prodrug refers to a chemical compound that has undergone a chemical derivation, for example a substitution or an addition of an additional chemical group, to modify any of its physicochemical properties, such as solubility. or bioavailability, but that does not modify the technical characteristics of the original molecule.
  • a prodrug could be for example an ester, ether or amide derivative.
  • Bioavailability refers to its availability in a specific biological compartment.
  • solvate is to be understood as that derivative of melatonin having another molecule, for example a polar solvent, joined by means of a non-covalent bond.
  • solvates include hydrates and alcoholates, for example methanolates.
  • compositions of the invention or the preferred composition of the invention may also refer to a composition comprising a functional biological equivalent of melatonin in a concentration that is equivalent to that described in the compositions of the invention.
  • the term "functional biological equivalent” or “bioequivalent variable” as used in the present description refers to a molecule with the same function as the molecule described, which may have slight variations with respect to the molecule described without said Variations provide no technical effect added to said molecule. In the present invention, it therefore refers to melatonin variants that have the same function and that show slight variations without such variations providing any technical effect added to melatonin.
  • concentration that is equivalent is meant that concentration necessary for the functional biological equivalent of melatonin that produces the same effect as described in the present invention by the composition of the invention.
  • Melatonin is also produced in vegetables. For example, the presence of melatonin in algae, edible plants, cereals, fruits, seeds, roots, stems, leaves and medicinal herbs has been described. (SD Walls al. J Exp Bot 20089, 60 (1): 57-69). For example, the presence of melatonin in cocoa, grapes, tomatoes, tea, green tea, seaweed, cereals and olives has been described. Therefore, the origin of the melatonin of the composition of the invention can be vegetable. Obtaining melatonin of plant origin (also called phytomelatonin) can be carried out by any method known to the person skilled in the art for this purpose. The origin of the melatonin used in the composition of the invention can also be synthetic.
  • composition refers to any substance used for the prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in man or animals. In the context of the present invention, it refers to a composition capable of treating and / or preventing mucositis.
  • treatment and / or prevention refers to both therapeutic and prophylactic treatment or preventive measures. Those situations susceptible to treatment include those already associated with alterations as well as in those in which the alteration is prevented. An “alteration” is any condition that would benefit from treatment with the composition of the invention, as described herein.
  • mucositis refers mainly to the disease that occurs with inflammation of the mucous membranes of the gastrointestinal tract, that is, oral, pharyngeal, esophageal, stomach and intestinal mucosa, and which is characterized by affectation to the integrity and function of the mucosa and that can lead to ulceration and infection in it. Mucositis can be caused by various etiologies, including radiation therapy, chemotherapy, bone marrow transplants or drug treatments.
  • a preferred embodiment refers to the use where mucositis is caused by radiotherapy and / or chemotherapy.
  • Radiation therapy is the treatment based on the use of ionizing radiation capable of ionizing matter, such as X-rays or radioactivity, which includes both gamma rays and alpha particles.
  • ionizing radiation capable of ionizing matter, such as X-rays or radioactivity, which includes both gamma rays and alpha particles.
  • it refers to the treatment with ionizing radiation that is used in cancer treatments and that includes any treatment known to the person skilled in the art that generates mucositis.
  • Chemotherapy is understood to be that treatment based on the administration of an agent that produces inhibition in tumor growth and that includes any treatment known by the person skilled in the art that generates mucositis, for example the chemical agent can refer to methotrexate, frocarbacin, thioguanine , mercaptopurine, cytarabine, fluoruracil, floxuridine, vinblastine, vincristine, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, mitramycin, bleomycin, asparaginase or irinotecan.
  • the chemical agent can refer to methotrexate, frocarbacin, thioguanine , mercaptopurine, cytarabine, fluoruracil, floxuridine, vinblastine, vincristine, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, mitramycin, bleomycin, asparaginase or ir
  • Another preferred embodiment relates to the use where the mucositis is oral, pharyngeal, esophageal, stomach or intestinal. Another preferred embodiment relates to the use where mucositis is oral.
  • Another preferred embodiment relates to the use where mucositis is in humans.
  • composition further comprises at least one pharmaceutically acceptable excipient or adjuvant.
  • excipient refers to a substance that aids in the absorption of the pharmaceutical composition or medicament of the invention, stabilizes said pharmaceutical composition or aids in its preparation in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it more pleasant.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, dye function, drug protection function such as to isolate it from air and / or moisture, function filling a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • an essence such as cinnamon, lemon, orange, tangerine or vanilla essence can be added.
  • adjuvant refers to any substance that potentiates the response of an active substance. In the present invention it refers to any substance that potentiates the effects of the composition of the invention, may refer to any adjuvant known to the person skilled in the art.
  • composition further comprises a gelling agent.
  • the gelling agent is selected from the list comprising copolymer of polyethylene and polypropylene, cellulose and guar gum. It preferably refers to polyethylene and polypropylene copolymer.
  • another embodiment refers to the use where the composition is a gel (or also called "hydrogel").
  • gelling agent refers to a substance that forms a gel, that is, a three-dimensional network formed by the gelling agent and generally containing a liquid phase.
  • the gelling agents that can be used may be those known to those skilled in the art for the preparation of a pharmaceutical composition.
  • the copolymers of polyethylene and polypropylene copolymers of poloxamer (or poloxamer) could be used, for example the agents called Pluronic®, among them, Pluronic® F127 (CAS number 9003-1 1-6) or Pluronic® F127NF.
  • Pluronic® F127 CAS number 9003-1 1-6
  • Pluronic® F127NF Pluronic® F127NF.
  • Another preferred embodiment relates to the use where the composition further comprises at least one preservative.
  • Preservative means that substance that maintains the properties of the drug by inhibiting germ contamination, can be ionic or non-ionic preservative.
  • the preservative used will not be toxic, will be chemically stable, and compatible with meatonin.
  • preservatives those known in the state of the art can be used, for example, the preservative may refer to benzoic acid, sodium benzoate, ascorbic acid, potassium sorbate, methylparaben, ethylparaben or butylparaben.
  • "Germs" means any cell that can grow and multiply in the composition of the invention, for example bacteria, fungi and yeasts.
  • composition further comprises an antioxidant.
  • antioxidant refers to that substance that is capable of retarding or preventing oxidation.
  • antioxidant agents those known in the state of the art can be used, for example tocopherol, ascorbic acid, sodium ascorbate, tartaric acid, butylhydroxyanisole, citric acid, vitamin A or vitamin E.
  • composition further comprises at least one other active ingredient.
  • active substance refers to any component that potentially provides a pharmacological activity or other different diagnostic effect , cure, mitigation, treatment or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of the human being or other animals.
  • active ingredient refers to any component that potentially provides a pharmacological activity or other different diagnostic effect , cure, mitigation, treatment or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of the human being or other animals.
  • allopurinol could be used.
  • Another preferred embodiment relates to the use where the composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a “pharmaceutically acceptable vehicle”, or pharmacologically acceptable refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and includes, but are not limited to, solids, liquids, solvents or surfactants
  • the carrier can be an inert substance or action analogous to any of the compounds of the present invention.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of the expression product of the invention as well as other compounds, to allow a better dosage and administration or to give consistency and form to the pharmaceutical composition.
  • the presentation form is liquid, the vehicle is the diluent.
  • the pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the invention may be those known to those skilled in the art, for example, lysosomes, millicapsules, microcapsules, nanocapsules, sponges, microspheres, microspheres, nanospheres, miliparticles, microparticles and nanoparticles.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be formulated for administration in a variety of ways known in the state of the art.
  • Such formulations may be administered to an animal and, preferably, to a mammal, and more preferably to a human, by a variety of routes, including, but not limited to topical, oral, parenteral, intraperitoneal, intravenous, intradermal, intralesional, intraarterial, intramuscular, intranasal, or subcutaneous.
  • compositions are presented in a form adapted to topical, oral, intraperitoneal, intradermal or subcutaneous administration.
  • An even more preferred embodiment refers to the use where the composition is presented in a form adapted to topical administration.
  • topical administration in the present invention refers to the composition being administered on the surface of the mucosa. Administration can be performed in the mucosa of any part of the digestive tract, preferably in the oral mucosa. The administration of the composition of the invention can be performed using an oral rinse for a few minutes, so that the oral mucosa is impregnated, and then it can be ingested to bathe, be in contact, with the entire gastrointestinal mucosa.
  • the formulations that can be used in the composition of the invention can be the following: oil-in-water emulsions, water-in-oil emulsions, milks, lotions, gels, ointments, balms, foams, body oils , soaps, bars, pencils, vaporizers, creams, liniments, ointments, serums and mousses.
  • the composition may also be incorporated into solid supports selected from the group consisting of hydrogels, wipes, patches and facial masks.
  • the dosage to obtain a therapeutically effective amount depends on a variety of factors, such as, for example, age, weight, sex or tolerance of the animal, preferably mammalian and more preferably human.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of the pharmaceutically effective composition that produces the desired effect and, in general, will be determined among other causes, by the characteristics of said pharmaceutical composition and of the therapeutic effect to be achieved.
  • a preferred embodiment of the invention relates to the use where the daily dose administered is between 37.5 mg and 75 mg.
  • An even more preferred embodiment refers to the use where the daily dose administered is between 45 mg.
  • another Even more preferred embodiment refers to the use where the dose is administered in a 15 mg regimen 3 times a day.
  • FIG. 1 Oxidative stress levels in rat tongue homogenate.
  • the results of the lipid peroxidation index (LPO) in control rats, irradiated and irradiated and treated with 1%, 3% or 5% w / v melatonin gel topically in the oral cavity are shown.
  • MDA malonildialdehyde
  • 4-HDA hydroxyalkenal
  • FIG. 2 Levels of oxidative stress in rat tongue mitochondria.
  • the results of the lipid peroxidation index (LPO) in control rats, irradiated and irradiated and treated with 1%, 3% or 5% w / v melatonin gel topically in the oral cavity are shown.
  • MDA malonildialdehyde
  • 4-HDA hydroxyalkenal; ** p ⁇ 0.01 and *** p ⁇ 0.001 versus C; ### p ⁇ 0.001 versus IR.
  • FIG. 4 Activity of glutathione peroxidase and glutathione reductase in mitochondria of the tongue in rats.
  • FIG. 5 Macroscopic appearance of the rat tongue after treatment with the composition of the invention.
  • the macroscopic results of the tongue of control rats, irradiated and irradiated and treated with 1%, 3% or 5% w / v melatonin gel are shown topically in the oral cavity.
  • Control, irradiated rats (IR), and rats irradiated and treated with 1%, 3% and 5% melatonin gel IR + MT 1%; IR + MT 3%, and IR + MT 5%, respectively).
  • FIG. 6 Comparison between topical administration and intraperitoneal administration with respect to glutathione levels in rat tongue.
  • the results of glutathione levels in control, irradiated and irradiated rats and treated with 3% w / v melatonin topically or 3% w / v intraperitoneally (ip) are shown.
  • A Reduced Glutathione Levels (GSH); B, oxidized glutathione levels (GSSG); C, total glutathione levels (GT); D, and GSSG / GSH index in rat tongue mitochondria.
  • FIG. 7 Activity and expression of GPx in the tongue of rats irradiated and treated with melatonin gel topically in the oral cavity and with melatonin intraperitoneally.
  • A GPx activity
  • B Densitometry analysis of the "immunoblot"("westernblot") of the GPx
  • C Image of the western blot of the GPx performed in tongue rats mitochondria of controls (C), irradiated (IR), treated with gel of 3% w / v melatonin topically in the oral cavity (IR + 3%), and treated with 3% w / v melatonin via ip (IR + IP).
  • FIG. 8 Activity and expression of the GRd in rat tongue irradiated and treated with melatonin gel topically in the oral cavity and with melatonin intraperitoneally.
  • A GRd activity
  • B Densitometry analysis of the "immunoblot"("westernblot") of the GRd
  • C Image of the western blot of the GRd performed in mitochondria of the tongue of control rats (C), irradiated (IR), treated with 3% w / v melatonin gel topically in the oral cavity (IR + 3%), and treated with 3% w / v melatonin via ip (IR + IP).
  • FIG. 9 Activity of the Cl, Cll, Clll and CIV complexes of the mitochondrial respiratory chain in tongue mitochondria in irradiated rats and treated with melatonin gel topically in the oral cavity and with intraperitoneal melatonin.
  • A Complex I
  • B complex II
  • C complex III
  • D complex IV.
  • FIG. 10 Expression of the Cl, Clll, CIV and CV complexes of the mitochondrial respiratory chain by western blotting in the tongue in rats irradiated and treated with 3% melatonin gel and with intraperitoneal melatonin.
  • A Densitometry of the "immunoblot" bands corresponding to Complex I; B, to complex III; C, to complex IV; D, to the VE complex Image of the "immunoblot" corresponding to complexes I, III, IV and V.
  • FIG. 11 Melatonin levels in mitochondria of the tongue of rats irradiated and treated with melatonin gel topically in the oral cavity and with melatonin intraperitoneally.
  • IR irradiated
  • IR + IP irradiated rats treated with 3% melatonin p / v administered via ip
  • FIG. 12 Macroscopic appearance of the rat tongue after treatment with the composition of the invention intraperitoneally. The macroscopic result of the irradiated rat tongue is shown, and treated with 3% w / v melatonin and intraperitoneally.
  • FIG. 13 Expression of PGC-1a, NRF1 and TFAM by western blotting in tongue homogenate of rats irradiated and treated with melatonin gel topically in the oral cavity and with melatonin intraperitoneally.
  • A Densitometry of the "immunoblot" bands corresponding to PGC-1 a; B, to NRF1; C, to TFAM; D, image of the "immunoblot" corresponding to PGC-1 a, NRF1 and TFAM.
  • FIG. 14 Expression of NFkB by western blotting in the tongue of rats irradiated and treated with melatonin gel topically in the oral cavity and with melatonin intraperitoneally.
  • A Densitometry of the "immunoblot" bands corresponding to NFkB in cytosol; B, to NFkB in core; C, image of the "immunoblot” corresponding to NFkB in cytosol and to NFkB in nucleus.
  • FIG. 15 Expression of NLRP3, ASC and caspase 1 by western blotting in tongue homogenate of rats irradiated and treated with melatonin gel topically in the oral cavity and with melatonin intraperitoneally.
  • FIG. 16 Expression of IL-1 and TNF- ⁇ by western blotting in tongue homogenate of rats irradiated and treated with melatonin gel topically in the oral cavity and with melatonin intraperitoneally.
  • FIG. 17 Expression of P53, Bax and Bcl2 by western blotting in tongue homogenate of rats irradiated and treated with melatonin gel topically in the oral cavity and with melatonin intraperitoneally.
  • composition of the invention was administered to experimental animals by different routes of administration and experiments were also performed with human patients.
  • the composition employed was a hydrogel (gel) comprising 1%, 3% or 5% melatonin (1, 3 or 5 grams of melatonin in 100 ml of the final volume of the composition respectively ) and in which 20% polyethylene and polypropylene copolymers were used as the gelling substance.
  • Pluronic® F127, (poloxamer) was used as polyethylene and polypropylene copolymers.
  • Sodium benzoate was used as a 0.3% preservative. 0.5% sweet orange essence was used.
  • mice As experimental animals, rats weighing 280 g were used, which underwent, under controlled conditions, ionizing radiation in the Experimental Radiology Unit of the Biomedical Research Center of the University of Granada. The animals were subjected to a total exposure of 50 grays (Gy). The irradiation dose used each day was 10 Gy that are administered at 100.75 cGy / min, 210 kilovolts (kV) and 12 milliamps (mA), and placing the animal at a distance of 40 cm from the source of radiation.
  • kV kilovolts
  • mA milliamps
  • the application of the different formulations in the animals was carried out as follows. A topical application in the oral cavity before irradiation, another after, and other successive every 8 hours for 21 days. The animals were sacrificed 21 days after the start of irradiation, which is when the maximum degree of mucositis was observed in irradiated animals without treatment with melatonin.
  • the formulations used in the experimental animals were the following: pluronic gel F-127 with 1%, 3% or 5% melatonin (1, 3 or 5 grams of melatonin / 100 ml respectively), applied three times day topically in the oral cavity at a volume of 500 ⁇ / each time, which makes a total of 1.5 ml / day.
  • Topical application in the oral cavity means that the animals ingest the gel that is applied in the oral cavity. They also performed the experiments, administering to the animals the same concentration of melatonin as that used with the 3% w / v hydrogel, but intraperitoneally, to check if plasma melatonin could reduce mucositis or if the application of said molecule is necessary topically
  • an isotonic solution was used comprising 70% v / v (volume / volume) of isotonic saline solution, and 30% v / v propylene glycol, measured in relation to the total volume of the solution.
  • a daily dose of 45 mg of melatonin was injected for 21 days. The animals were sacrificed 21 days after the onset of irradiation, as were the animals treated with the melatonin gel applied topically to the oral cavity.
  • a very important mechanism by which oxygen free radicals are capable of producing cellular damage is through the lipid peroxidation of their membranes, both cellular and mitochondrial. Lipoperoxidation is produced due to the action of free radicals on polyunsaturated fatty acids. These changes in the structure of the cell membrane cause changes in its physicochemical properties, with an increase in its permeability and progressive loss of its functions, which can lead to the subsequent cell death. The measurement of the degree of lipoperoxidation of the membranes has always been considered a very important parameter as an indicator of oxidative stress.
  • the lipid peroxidation index is provided by the quantification of malonyldialdehyde and 4-hydroxyalkenal (MDA + 4-HDA) present in the sample, which are important decomposition products of peroxides derived from polyunsaturated fatty acids and their esters related.
  • MDA + 4-HDA malonyldialdehyde and 4-hydroxyalkenal
  • concentrations of malonyldialdehyde and 4-hydroxyalkenal, as well as the concentration of hydroperoxides provide a convenient index of lipid peroxidation.
  • GRd -Glutation reductase
  • the index obtained from the ratio between oxidized / reduced glutathione (GSSG / GSH) is also an important index of the redox status assessment.
  • Mitochondrial dysfunction associated with an increase in free radical production, is responsible for cell death. Therefore, measure the activity of respiratory transport chain complexes (I, II, III and IV) and the expression of the complexes is essential to know the degree of mitochondrial damage.
  • ROS reactive oxygen species
  • PTM mitochondrial transition pore
  • NLRP3 apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain
  • ASC apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain
  • NF-kB nuclear factor kappa B
  • TLR Toll-like-receptors
  • NLRs NOD-like cytosolic receptors
  • NLRs NF-kB and NLRP3 work together to activate pro-inflammatory cytokines such as I L-1 ⁇ .
  • this cytokine can induce mitochondrial damage and increase the production of ROS, which induce mitochondrial DNA damage (mtDNA) and PTM opening, causing apoptosis.
  • NF-kB activates the expression of a wide variety of genes involved in the inflammatory response such as cyclooxygenase 2 (COX-2), inducible nitric oxide synthase ( ⁇ NOS) and vascular adhesion molecules (VCAM-1). Therefore, irradiation causes an increase in pro-inflammatory molecules that contribute to apoptosis and, therefore, to the appearance of mucositis.
  • COX-2 cyclooxygenase 2
  • ⁇ NOS inducible nitric oxide synthase
  • VCAM-1 vascular adhesion molecules
  • Proteins that regulate apoptosis are grouped into antiapoptotic proteins such as Bcl2 (B-cell lymphoma 2), and proapoptotic proteins such as Bax. Therefore, the Bax / Bcl2 index is an extremely important index since it directly reflects the level of apoptosis.
  • the p53 protein activates DNA repair enzymes to correct the damage detected. Entry into apoptosis is the last protective mechanism, if the DNA damage is irreparable, to prevent the proliferation of cells that contain abnormal DNA. p53 activates the expression of pro-apoptosis genes, such as BAX.
  • Oxidative stress caused by radiation causes damage to cell membranes, which is reflected in an increase in membrane lipid oxidation greater than 50% compared to the control ( Figure 1, p ⁇ 0.001). This damage indicates that radiation damages these tissues causing mucositis.
  • 3% melatonin completely reverses the effects of radiation therapy, while 1% melatonin only partially reverses the levels of LPO.
  • a concentration of melatonin greater than 3%, such as 5% we observe that it has the same effects as 3% to counteract oxidative stress (Figure 1).
  • Irradiation also produces a very significant decrease in GSH levels (p ⁇ 0.001) ( Figure 3A), while the GSSG levels rise (p ⁇ 0.001) ( Figure 3B) in the mitochondria of the tongue, causing an increase in total glutathione (GSH + GSSG) ( Figure 3C).
  • GSH + GSSG total glutathione
  • Figure 3C The increase in the GSS / GSH ratio (p ⁇ 0.001) ( Figure 3D), which is the best index of intracellular oxidative stress and, in our case, intramitochondrial, supports this harmful effect of irradiation.
  • the minimum effective dose for the treatment of mucositis corresponds to a concentration of 3% melatonin in the gel applied three times a day (500 ⁇ in each application), resulting in a daily dose of 45 mg of melatonin .
  • melatonin gel was compared topically in the oral cavity and administration of melatonin intraperitoneally (ip) at the same dose (45 mg daily).
  • Mitochondrial glutathione reductase (Figure 8) follows a completely different course. It is an enzyme easily inhibited by oxidative stress, and therefore its activity (Figure 8A) and expression ( Figure 8B and 8C) decrease significantly with irradiation. Protein expression studies are carried out by means of "western blot" (8C), and in the densitometry analyzes of these western ones, a decrease in the amount of protein with irradiation is observed, indicating an inhibition of the expression of said enzyme. . We observed a significant effect of melatonin gel to recover the activity and expression of GRd, while the ip administration of melatonin fails to recover the enzyme. If GRd remains inhibited, the mitochondrion is unable to counteract oxidative damage and favors cell death.
  • melatonin gel neutralizes oxidative stress, increases the activity and expression of antioxidant enzymes, increases mitochondrial function, reduces the production of free radicals, decreasing the activity of NFkB (Fig 14A and 14B) and of the inflamasome (Fig 15).
  • 3% melatonin gel inhibits apoptosis significantly (Fig 17D), decreasing apoptosis inducing proteins such as P53 and Bax (Fig 17A and 17B), and increasing the expression of antiapoptotic proteins such as Bcl2 (Fig 17C).
  • melatonin gel increases mitochondrial biogenesis, increasing PGC1 a, which is inhibited by irradiation. All this translates into an increase in cell survival.
  • the levels of melatonin are recovered, which favors its local antioxidant action.
  • parenteral administration of melatonin their tongue levels are not recovered.
  • the histology also shows macroscopic lesions.
  • the staining used has been hematoxylin-eosin, to determine the presence of histological lesions in the tissues studied.
  • Masson Goldner trichrome staining (TCMG) allowed to differentiate muscle tissue, which is stained red, from the connective tissue that makes it green. In the control animal without treatment, the histological structure of the tongue does not present alterations. Keratinized polystratified epithelium of the mucosa is maintained with presence of filiform papillae in the dorsal area and without them in the ventral area. Under the mucosa, is the lamina limbalium and the submucosa formed by a small layer of connective tissue and some vessels.
  • melatonin can protect the gastrointestinal mucosa undergoing radiotherapy, prevent lesions caused by such radiation as mucositis and cure these lesions, being topical administration more effective than parenteral administration.
  • the importance of these actions of melatonin lies in a reduction of mitochondrial damage, which translates into a total prevention of mucositis, not observing any type of lesion in rats treated at the macroscopic level, or at the microscopic level.
  • the pharmaceutical composition comprising 1% melatonin does not reverse the mucositis caused by radiotherapy. However, the pharmaceutical composition comprising 3% melatonin completely reverses the mucositis produced by radiotherapy, the same as with the composition comprising 5% melatonin.
  • These results demonstrate the usefulness of a composition comprising melatonin between 3 and 5% in the treatment of the side effects of mucositis caused by radiotherapy.
  • the results shown here show that in the mucositis there is a mitochondrial damage and, therefore, the success of this treatment lies in the oral application of a melatonin gel that permeates the mucous membranes and reverses the mitochondrial damage.
  • any other type of melatonin application does not have a clear effect on mucositis, probably because melatonin is rapidly absorbed, has a very short half-life (30 min), and does not reach sufficient therapeutic levels in the mucous membranes, both of the oral cavity like those of the gastro-intestinal tract.
  • the composition of the invention comprising pluronic gel F-127 and melatonin at a concentration of 3% or higher, impregnates the mucous membranes reaching effective local concentrations, allowing melatonin to enter the mitochondria and exert its effects throughout the gastro-intestinal tract.
  • Mitochondria play an important role in the control of cell survival, and we have demonstrated for the first time that their dysfunction is largely involved in the pathophysiology of mucositis (see results). Mitochondrial dysfunction correlates with an aggravation of mucositis.
  • GPx glutathione peroxidase
  • GRd glutathione reductase
  • GSH reduced glutathione
  • melatonin at the concentration containing the composition of the invention totally reduces mitochondrial oxidative stress in mucositis by increasing the activity of mitochondrial antioxidant enzymes, mainly GRd.
  • mitochondrial antioxidant enzymes mainly GRd.
  • respiratory chain complexes which are inhibited in mucositis.
  • the composition of the invention has antioxidant and anti-inflammatory effects that compositions with a lower concentration do not have.
  • the topical and oral application of melatonin between 3 and 5% (3 and 5 grams of melatonin in 100 ml of the final composition) prevents the deterioration of the cellular function of the mucous membranes damaged by ionizing radiation.
  • topical application in the oral cavity by means of melatonin gel in mucositis is more effective than parenteral administration, which could be due to the fact that the application in the oral cavity in the appropriate formulation keeps the melatonin levels higher for longer time in the oral cavity (and by extension, gastrointestinal), which facilitates its local antioxidant and anti-inflammatory action and, fundamentally, its action within the mitochondrion preventing tissue damage and, therefore, the appearance of mucositis. Therefore, the topical application of melatonin between 3% and 5%, in the oral cavity, provides a powerful defense system in these pathologies.
  • the composition of the invention allows to protect the gastrointestinal mucosa undergoing radiotherapy, prevent injuries caused by said radiation such as mucositis and cure said lesions. The results obtained are extrapolated to chemotherapy.

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Abstract

La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende melatonina o un derivado de la misma en una proporción del 2?5% al 5% p/v para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de la mucositis. La mucositis preferiblemente está causada por radioterapia y/o quimioterapia y se refiere preferiblemente a mucositis oral.

Description

USO DE MELATONINA PARA EL TRATAMIENTO Y/O PREVENCIÓN DE LA MUCOSITIS
La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende melatonina (N-Acetil-5-metoxitriptamina) o de sus derivados en una concentración del 2'5% al 5% peso/volumen (p/v) para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de la mucositis. Preferentemente la mucositis está causada por radioterapia y/o quimioterapia. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la medicina.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El tratamiento de los tumores malignos con radioterapia o quimioterapia, o la asociación de ambas, es cada vez más efectivo, pero se asocia a efectos secundarios a corto y largo plazo. Entre los efectos secundarios se encuentran los trastornos en la función e integridad de la mucosa oral. Las consecuencias incluyen ulceración grave (mucositis) y sobreinfección fúngica de la boca (candidiasis, muguet). Estas complicaciones inducidas por la enfermedad y sus tratamientos, conllevan dolor en la deglución, disfagia, desnutrición, retrasos en la administración de quimioterapia, interrupciones del esquema de radioterapia, pérdida de la efectividad de los tratamientos oncológicos, estancias hospitalarias prolongadas, costes elevados y, en algunos pacientes, infecciones potencialmente letales (sepsis). La mucositis es una reacción inflamatoria que afecta a todo el tracto gastrointestinal, desde la boca al ano, y es uno de los principales efectos adversos de la quimioterapia y/o radioterapia y de los trasplantes de médula ósea. La mucositis además puede ser causada por agentes químicos tales como corticoides, fármacos inmunosupresores (azatioprina, ciclosporina A), fármacos xerostomizantes, ansiolíticos, antidepresivos, antihistamínicos, estimulantes símpaticomirnéticos, antiparkinsonianos, antipsicóticos, tratamienteos gingivales, hidantoínas o antibióticos de amplio espectro. La mucositis oral (u oromucositis) inducida por radiaciones ionizantes (o también denominada, radioinducida) y por agentes quimioterápicos constituye actualmente uno de los principales problemas de la terapia de los pacientes con cáncer. Un 40% de los pacientes que reciben quimioterapia y/o radioterapia, y hasta un 76% de los pacientes trasplantados de médula ósea, desarrollan problemas bucales, siendo los más frecuentes: mucositis, infección local, dolor y hemorragia. En los pacientes con cáncer de cabeza y cuello, el 97% desarrolla algún grado de mucositis, y el 100% de los sometidos a radioterapia fraccionada durante un tiempo prolongado también la desarrollan (Trotti A et al. Radiotherapy and Oncology 2003, 66:253-262). El daño producido por las radiaciones ionizantes es debido a mecanismos directos e indirectos. Los efectos directos se deben a la acción mutagénica de la radiación en el ácido desoxirribonucleico (ADN), mientras que los mecanismos indirectos (aproximadamente el 70% de los mismos) son debido al efecto de la radiación sobre las moléculas de agua dando lugar a la formación de radicales libres (Trotti A et al. Radiotherapy and Oncology 2003, 66:253-262).
La mucositis se clasifica, según la Organización Mundial de la Salud (OMS), en diferentes grados atendiendo a la sintomatología. Grado 0: normalidad; grado 1 : eritema generalizado, mucosa rosada no dolorosa y con abundante saliva, voz normal; grado 2: eritema, úlceras poco extensas, se mantiene la deglución de sólidos; grado 3: eritema, edema o úlceras extensas, el paciente sólo puede deglutir líquidos, conlleva dolor y dificultad para hablar; grado 4, úlceras muy extensas, encías sangrantes, infecciones, no hay saliva, dolor muy intenso, soporte enteral o parenteral.
La mucositis aparece como consecuencia de una serie de eventos biológicos que empiezan en la submucosa y progresan hacia el epitelio y son comunes para las mucositis de distintas etiologías. En radioterapia y quimioterapia se ha descrito que en una primera fase hay un aumento de especies reactivas de oxígeno (ROS) y de daño del ADN. Se activan factores de transcripción como el factor nuclear kappa-B (NF-kB). Hay un aumento de la producción de citoquinas proinflamatorias, incluidas la interleukina 1 (IL-1 ) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), que provocan apoptosis y daño celular. Esta reacción inflamatoria produce daño en la mucosa con la consecuente aparición de úlceras. Estas células van a ser colonizadas por bacterias y se activan macrófagos que producen más citoquinas responsables de todo el daño tisular. En todo este proceso hay un gran aumento de radicales libres que contribuyen a incrementar el proceso inflamatorio y el daño celular. En una segunda fase, la radioterapia y/o la quimioterapia inhiben la replicación de las células epiteliales disminuyendo la renovación celular. En una tercera fase la colonización bacteriana y la superficie ulcerada sigue incrementándose, facilitando la aparición de una infección sistémica (Volpato LE et al. Mol Cáncer Ther 2007, 6:3122-3130). La mucositis es una patología inflamatoria que no responde al tratamiento con los antiinflamatorios conocidos. La mucositis es un proceso en el cual podría intervenir algún mecanismo bioquímico diferente al resto de los procesos inflamatorios, como podría ser la vía del inflamasoma (Escames G, et al. Hum Genet, Julio, 201 1 , DOI 10.1007/s00439-01 1 -1057). En la actualidad no tiene tratamiento que provoque una reversión total de la misma o que prevenga totalmente su aparición.
Con el fin de tratar y prevenir la mucositis se han utilizado una gran variedad de terapias hasta el momento sin resultados de reversión total de la misma, por ejemplo, se ha descrito el tratamiento con aciclovir, bencidamina, betacaroteno, fosfato de calcio, enjuagues con alopurinol, aloe vera, clorhexidina, manzanilla, etopósido, ácido folínico, glutamina, factor estimulante de colonias y granulocitos-macrófagos (GM-CSF), nistatina, misonidazol, povidona, pilocarpina, hematoxifilina, prednisona o sucralfato (Worthington HV etvL. Cochrane Datábase Syst Rev. Octubre de 2007,17;(4) DOI: 10.1002/14651858. CD000978.pub3; Clarkson JE et al., Cochrane Datábase Syst Rev. Agosto de 2010, 4;(8)), DOI: 10.1002/14651858. CD001973.pub4. En consecuencia, existe la necesidad de una herramienta que permita la reversión y la prevención total de la mucositis, concretamente en pacientes sometidos a radioterapia y/o quimioterapia. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se describe el uso de una composición que comprende melatonina o un derivado de la misma a una concentración del 2'5 al 5% p/v para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de la mucositis.
Se muestran resultados in vivo de protección de la mucosa oral al daño producido por radioterapia o quimioterapia. La composición de la invención es útil para proteger la mucosa oral así como la mucosa gastrointestinal. En la presente invención se demuestra que concentraciones inferiores a las recogidas en la composición de la invención no son capaces de revertir por completo la mucositis, mientras que concentraciones iguales o superiores al 3% p/v son capaces de tratar y de revertir al 100% la mucositis causada por radiaciones ionizantes. Se muestran resultados de distintas vías de administración, siendo la vía tópica la que mejor protección ofrece a la mucositis oral.
Por lo aquí descrito, la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende melatonina o un derivado de la misma a una concentración del 2'5% al 5% p/v para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de la mucositis. En adelante nos referiremos a ella como a la "composición de la invención".
Se entiende por "concentración del 2'5 al 5% p/v" a que la composición comprende entre 2'5 a 5 gramos de melatonina o un derivado de la misma en 100 mi de composición final. La abreviatura "p/v" se refiere a peso/volumen o masa/volumen (m/v). Una realización preferida se refiere al uso donde la concentración de melatonina o de un derivado de la misma es del 3% p/v. Por lo tanto, dicha composición preferida se refiere a una composición que comprenda 3 gramos de melatonina o un derivado de la misma en 100 mi de volumen total de la composición. En adelante nos referiremos a ésta como a la "composición preferida de la invención".
Se entiende por "melatonina o un derivado del la misma" cualquier compuesto comprendido dentro de la fórmula general I, así como sus sales, solvatos o profármacos, farmacéuticamente aceptables y que son útiles para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de la mucositis. Los compuestos de fórmula general I se refieren a:
Figure imgf000006_0001
Fórmula :( donde:
"n" es un número entero entre 1 y 4;
y R3 son, iguales o diferente, un grupo alquilo ( CrC4) lineal o ramificado; y R2 es hidrógeno, alquilo CrC4, lineal o ramificado, un grupo -C(=0)0-Ra o un grupo -C(=0)-N(H)-Ra, en donde Ra es un grupo alquilo Ci-C4, lineal o ramificado, El término "alquilo" se refiere en la presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tert-butilo, sec-butilo, n-pentilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 2 átomos de carbono. Y más preferiblemente son un grupo metilo.
En una realización preferida de la presente invención y R3 son un grupo metilo. Más preferiblemente n es 1 y aún más preferiblemente R2 es hidrógeno.
El término "melatonina" se refiere a la N-acetil-5-metoxi-triptamina, también denominada en la literatura melatonin, melatonine, melatol, melovine, circadin, regulin, acetaminde, N-acetyl-methoxy-tryptamine, 5-methoxy-N- acetyltryptamine, N-[2-(5-methoxy-1 H-indol-3-yl)ethyl]acetamide o N-[2-(5- methoxyindol-3-yl)ethyl]acetamide o cuando en el compuesto de fórmula general (I) Ri y R3 son un grupo metilo, n es 1 y R2 es hidrógeno. El número CAS de la melatonina es el 73-31 -4.
La melatonina es una neurohormona endógena producida por la glándula pineal (epífisis cerebri), así como por otros órganos, como por ejemplo el tracto gastrointestinal, la retina, linfocitos y células de la médula ósea, de manera fisiológica en animales, entre ellos en humanos.
La melatonina se produce en animales, entre ellos humanos, a partir de serotonina (5-hydroxtriptamina, 5-HT), la cual deriva a su vez del aminoácido triptófano. Por lo tanto, la presente invención podría referirse también al uso de una composición que comprende alguno de los precursores de melatonina (5- HT, triptófano o metabolitos intermedios tales como la N-acetilserotonina, o ÑAS), en una concentración suficiente para que en el cuerpo humano fueran transformados a melatonina en las concentraciones descritas en la presente invención, para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de la mucositis. Por lo tanto la presente invención también se refiere a las sales farmacéuticamente aceptables de melatonina o de sus derivados que pueden ser generadas mediante métodos químicos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, mediante una reacción con un ácido en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Como disolvente orgánico puede utilizarse éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Los ejemplos de las sales de adición de ácido incluyen sales de adición de ácido mineral tales como, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato, y sales de adición de ácido orgánico tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y ptoluenosulfonato.
El término "profármaco" tal como se usa en esta solicitud se refiere a un compuesto químico que ha experimentado una derivación química, por ejemplo una sustitución o una adición de un grupo químico adicional, para modificar cualquiera de sus propiedades fisicoquímicas, tales como la solubilidad o biodisponibilidad, pero que no modifica las características técnicas de la molécula original. Un profármaco podría ser por ejemplo un derivado de éster, de éter o de amida. La biodisponibilidad se refiere a la disponibilidad del mismo en un compartimento biológico concreto.
El término "solvato" según esta invención ha de entenderse como aquel derivado de melatonina que tiene otra molécula, por ejemplo un disolvente polar, unido por medio de un enlace no covalente. Los ejemplos de tales solvatos incluyen hidratos y alcoholatos, por ejemplo metanolatos.
La preparación de sales, solvatos y profármacos puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en el estado de la técnica. Las sales, solvatos o profármacos no farmacéuticamente aceptables también se encuentran dentro del alcance de la invención puesto que pueden ser útiles en la preparación de sales, solvatos o profármacos farmacéuticamente aceptables. La composición de la invención o la composición preferida de la invención también se pueden referir a una composición que comprende un equivalente biológico funcional de la melatonina en una concentración que sea equivalente a la descrita en las composiciones de la invención.
El término "equivalente biológico funcional" o "variable bioequivalente" tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a una molécula con la misma función que la molécula descrita, que puede presentar ligeras variaciones con respecto a la molécula descrita sin que dichas variaciones aporten ningún efecto técnico añadido a dicha molécula. En la presente invención se refiere por lo tanto a variantes de melatonina que presenten la misma función y que presenten ligeras variaciones sin que dichas variaciones aporten ningún efecto técnico añadido a la melatonina.
Por "concentración que sea equivalente" se entiende aquella concentración necesaria para el equivalente biológico funcional de melatonina que produzca el mismo efecto que el descrito en la presente invención por la composición de la invención.
La melatonina también se produce en vegetales. Por ejemplo, se ha descrito la presencia de melatonina en algas, plantas comestibles, cereales, frutos, semillas, raíces, tallos, hojas y hierbas medicinales. (Paredes SD te al. J Exp Bot 20089, 60(1 ):57-69). Por ejemplo se ha descrito la presencia de melatonina en el cacao, las uvas, los tomates, el té, el té verde, algas, cereales y las aceitunas. Por lo que el origen de la melatonina de la composición de la invención puede ser vegetal. La obtención de la melatonina de origen vegetal (también denominada fitomelatonina) se puede realizar por cualquier método conocido por el experto en la materia para tal fin. El origen de la melatonina utilizada en la composición de la invención también puede ser sintético. La síntesis química de la melatonina se puede realizar mediante las técnicas conocidas por el experto en la materia para tal fin. El término "composición farmacéutica", o medicamento, se refiere a cualquier sustancia usada para la prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre o los animales. En el contexto de la presente invención se refiere, a una composición capaz de tratar y/o prevenir la mucositis.
En la presente invención "tratamiento y/o prevención" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas. Aquellas situaciones susceptibles de tratamiento incluyen las ya asociadas con alteraciones así como en aquellas en las que se previene la alteración. Una "alteración" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con la composición de la invención, tal y como se describe en el presente documento.
El término "mucositis" tal y como se usa aquí, se refiere principalmente a la enfermedad que cursa con inflamación de las mucosas del tracto gastrointestinal, es decir, mucosa oral, faríngea, esofágica, estomacal e intestinal, y que se caracteriza por afectación a la integridad y función de la mucosa y que puede conllevar ulceración e infección en la misma. La mucositis puede ser causada por diversas etiologías, entre ellas tratamientos de radioterapia, quimioterapia, transplantes de médula ósea o tratamientos con fármacos.
Una realización preferida se refiere al uso donde la mucositis está causada por radioterapia y/o quimioterapia. Se entiende por radioterapia aquel tratamiento basado en el empleo de radiaciones ionizantes capaces de ionizar la materia, como por ejemplo rayos X o radiactividad, la cual incluye tanto los rayos gamma como las partículas alfa. En la presente invención se refiere al tratamiento con radiaciones ionizantes que se utiliza en tratamientos de cáncer y que incluye cualquier tratamiento conocido por el experto en la materia que genere mucositis. Se entiende por quimioterapia aquel tratamiento basado en la administración de un agente que produce inhibición en el crecimiento tumoral y que incluye cualquier tratamiento conocido por el experto en la materia que genere mucositis, por ejemplo el agente químico se puede referir a metotrexato, frocarbacina, tioguanina, mercaptopurina, citarabina, fluoruracilo, floxuridina, vinblastina, vincristina, dactinomícina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitramicina, bleomicina, asparaginasa o irinotecán.
Otra realización preferida se refiere al uso donde la mucositis es oral, faríngea, esofágica, estomacal o intestinal. Otra realización preferida se refiere al uso donde la mucositis es oral.
Otra realización preferida se refiere al uso donde la mucositis es en humanos.
Otra realización preferida se refiere al uso donde la composición comprende además al menos un excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de la composición farmacéutica o medicamento de la invención, estabiliza dicha composición farmacéutica o ayuda a su preparación en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. Para que la composición de la invención tenga un sabor agradable se puede añadir una esencia como por ejemplo, esencia de canela, limón, naranja, mandarina o vainilla.
El término "adyuvante" se refiere a cualquier sustancia que potencie la respuesta de un principio activo. En la presente invención se refiere a cualquier sustancia que potencie los efectos de la composición de la invención, puede referirse a cualquier adyuvante conocido por el experto en la materia.
El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra. Otra realización preferida se refiere al uso donde la composición además comprende un agente gelificante. Preferiblemente el agente gelificante se selecciona de la lista que comprende copolímero de polietileno y polipropileno, celulosa y goma guar. Preferentemente se refiere a copolímero de polietileno y polipropileno. Por lo aquí descrito, otra realización referida se refiere al uso donde la composición es un gel (o también denominado "hidrogel").
El término "agente gelificante" se refiere a una sustancia que conforma un gel, es decir, una red tridimensional formada por el agente gelificante y que generalmente contiene una fase líquida. Los agente gelificante que pueden utilizarse pueden ser aquellos conocidos por el experto en la material para la elaboración de una composición farmacéutica. Por ejemplo, entre los copolímeros de polietileno y polipropileno se podría utilizar copolimeros de poloxamer (o poloxamer), por ejemplo los agentes denominados Pluronic®, entre ellos, Pluronic® F127 (número CAS 9003-1 1 -6) o Pluronic® F127NF. Otra realización preferida se refiere al uso donde la composición además comprende al menos un conservante.
Se entiende por conservante aquella sustancia que mantenga las propiedades del medicamento al inhibir la contaminación por gérmenes, pueden ser conservante iónico o no-iónico. El conservante empleado no será tóxico, será estable químicamente, y compatible con la meíatonina. Como agentes conservantes pueden utilizarse los conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, el conservante puede referirse a ácido benzoico, benzoato sódico, ácido ascórbico, sorbato potásico, metilparaben, etilparaben o butilparaben. Se entiende por "gérmenes" cualquier célula que pueda crecer y multiplicarse en la composición de la invención, por ejemplo bacterias, hongos y levaduras.
Otra realización preferida se refiere al uso donde la composición además comprende un antioxidante.
El término "antioxidante" se refiere a aquella sustancia que es capaz de retardar o prevenir la oxidación. Como agentes antioxidante pueden utilizarse los conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo tocoferol, ácido ascórbico, ascorbato sódico, ácido tartárico, butilhidroxianisol, ácido cítrico, vitamina A o vitamina E.
Otra realización preferida se refiere al uso donde la composición además comprende al menos otro principio activo.
Como se emplea aquí, los términos "principio activo", "sustancia activa", sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" o "ingrediente farmacéuticamente activo" se refiere a cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de una enfermedad, o que afecte a la estructura o función del cuerpo del ser humano u otros animales. Por ejemplo, se podría utilizar el alopurinol. Otra realización preferida se refiere al uso donde la composición además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable", o farmacológicamente aceptable, se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensoactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación del producto de expresión de la invención así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. Los vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en la invención pueden ser los conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, lisosomas, milicápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, esponjas, miliesferas, microesferas, nanoesferas, milipartículas, micropartículas y nanopartículas. La composición farmacéutica de la invención puede formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Tales formulaciones pueden administrarse a un animal y, preferiblemente, a un mamífero, y más preferiblemente a un humano, por una variedad de vías, incluyendo, pero sin limitarse a tópica, oral, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, intralesional, intraarterial, intramuscular, intranasal, o subcutánea.
Por lo aquí descrito, otra realización preferida se refiere al uso donde la composición se presenta en una forma adaptada a la administración tópica, oral, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea. Una realización aún más preferida se refiere al uso donde la composición se presenta en una forma adaptada a la administración tópica. EL término "administración tópica" en la presente invención se refiere a que la composición se administra en la superficie de la mucosa. La administración puede ser realizada en la mucosa de cualquier parte del tracto digestivo, preferentemente en la mucosa oral. La administración de la composición de la invención puede ser realizada utilizando un enjuague oral durante unos minutos, de tal forma que se impregne la mucosa oral, y a continuación se puede ingerir para que bañe, esté en contacto, con toda la mucosa gastrointestinal.
En el caso de la administración tópica, las formulaciones que pueden utilizarse en la composición de la invención pueden ser las siguientes: emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, leches, lociones, geles, pomadas, bálsamos, espumas, aceites corporales, jabones, barras, lápices, vaporizadores, cremas , linimentos, ungüentos, sueros y mousses. La composición puede también estar incorporada en soportes sólidos seleccionados del grupo formado por hidrogeles, toallitas, parches y mascarillas faciales. La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como, por ejemplo, edad, peso, sexo o tolerancia del animal, preferentemente mamífero y más preferentemente humano. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de la composición farmacéuticamente efectiva que produzca el efecto deseado y, en general, vendrá determinada entre otras causas, por las características propias de dicha composición farmacéutica y del efecto terapéutico a conseguir.
Una realización preferida de la invención se refiere al uso donde la dosis diaria administrada es de entre 37,5 mg y 75 mg. Una realización aún más preferida se refiere al uso donde la dosis diaria administrada es de entre 45 mg. Y otra realización aún más preferida se refiere al uso donde la dosis se administra en una pauta de 15 mg 3 veces al día.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Niveles de estrés oxidativo en homogenado de lengua de ratas. Se muestra los resultados del índice de peroxidación lipídica (LPO) en ratas control, irradiadas e irradiadas y tratadas con gel de melatonina al 1 %, 3% o 5% p/v por vía tópica en la cavidad oral. Grupo control (C); grupo irradiado (IR); grupos irradiados y tratados con gel de melatonina al 1 %, 3% o 5%. (IR + melatonina). MDA, malonildialdehido; 4-HDA, hidroxialquenal; **p<0.01 y ***p<0.001 frente a C; ###p<0.001 frente a IR.
FIG. 2. Niveles de estrés oxidativo en mitocondrias de lengua de ratas. Se muestra los resultados del índice de peroxidación lipídica (LPO) en ratas control, irradiadas e irradiadas y tratadas con gel de melatonina al 1 %, 3% o 5% p/v por vía tópica en la cavidad oral. Grupo control (C); grupo irradiado (IR); grupos irradiados y tratados con gel de melatonina al 1 %, 3% o 5% (IR+melatonina). MDA, malonildialdehido; 4-HDA, hidroxialquenal; **p<0.01 y ***p<0.001 frente a C; ###p<0.001 frente a IR. FIG. 3. Niveles de glutation en lengua de rata. Se muestra los resultados de los niveles de glutation en ratas control, irradiadas e irradiadas y tratadas con gel de melatonina al 1 %, 3% o 5% p/v por vía tópica en la cavidad oral. A, Niveles de glutation reducido (GSH); B, oxidado (GSSG); C, glutation total (GT); D, índice (GSSG/GSH) en mitocondrias de lengua de ratas controles (C), irradiadas (IR), y tratadas con melatonina al 1 %, 3% y 5% (IR+melatonina). ***p<0.001 frente a C; ###p<0.001 frente a IR.
FIG. 4. Actividad de la glutation peroxidasa y glutation reductasa en mitocondrias de la lengua en ratas. Se muestra los resultados de la actividad de: A, la glutation peroxidasa (GPx); y B, de la glutation reductasa (GRd), ambas en ratas control, irradiadas e irradiadas y tratadas con gel de melatonina al 1 %, 3% o 5%. Controles (C), ratas irradiadas (IR), y ratas irradiadas y tratadas con gel de melatonina al 1 %, 3% y 5% p/v por vía tópica en la cavidad oral (IR+melatonina). **p<0.01 y ***p<0.001 frente a C; ###p<0.001 frente a IR.
FIG. 5. Aspecto macroscópico de la lengua de la rata tras tratamiento con la composición de la invención. Se muestra los resultados macroscópicos de la lengua de ratas control, irradiadas e irradiadas y tratadas con gel de melatonina al 1 %, 3% o 5% p/v por vía tópica en la cavidad oral. Control, ratas irradiadas (IR), y ratas irradiadas y tratadas con gel de melatonina al 1 %, 3% y 5% (IR+MT 1 %; IR+MT 3%, e IR+MT 5%, respectivamente).
FIG. 6. Comparación entre la administración tópica y la administración intraperitoneal respecto a los niveles de glutation en lengua de rata. Se muestra los resultados de los niveles de glutation en ratas control, irradiadas e irradiadas y tratadas con melatonina al 3% p/v por vía tópica o al 3% p/v por vía intraperitoneal (i.p.). A, Niveles de glutation reducido (GSH); B, niveles de glutation oxidado (GSSG); C, niveles de glutation total (GT); D, e índice GSSG/GSH en mitocondrias de lengua de ratas. Controles (C), irradiadas (IR), tratadas con gel de melatonina al 3% (IR+3%), y tratadas con melatonina por vía i.p. (IR+IP). ***p<0.001 frente a C; ##p<0.01 y «p-cn.001 frente a IR.
FIG. 7. Actividad y expresión de la GPx en lengua de ratas irradiadas y tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad oral y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Actividad de la GPx; B, Análisis de la densitometría de los "inmunoblot" ("western blot") de la GPx C, Imagen de los western blot de la GPx realizados en mitocondrias de lengua de ratas controles (C), irradiadas (IR), tratadas con gel de melatonina al 3% p/v por vía tópica en la cavidad oral (IR+ 3%), y tratadas con melatonina al 3% p/v por vía i.p. (IR+IP). **p<0.01 y ***p<0.05 frente a C; ##p<0.01 y ###p<0.001 frente a IR.
FIG. 8. Actividad y expresión de la GRd en lengua de rata irradiadas y tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad oral y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Actividad de la GRd ; B, Análisis de la densitometría de los "inmunoblot" ("western blot") de la GRd y C, Imagen de los western blot de la GRd realizados en mitocondrias de la lengua de ratas controles (C), irradiadas (IR), tratadas con gel de melatonina al 3% p/v por vía tópica en la cavidad oral (IR+ 3%), y tratadas con melatonina al 3% p/v por vía i.p. (IR+IP). ***p<0.001 frente a C; #p<0.05 y ###p<0.001 frente a IR.
FIG. 9. Actividad de los complejos Cl, Cll, Clll y CIV de la cadena respiratoria mitocondrial en mitocondrias de la lengua en ratas irradiadas y tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad oral y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Complejo I; B, complejo II; C, complejo III; D, complejo IV. Controles (C), irradiadas (IR), tratadas con gel de melatonina al 3% p/v por vía tópica en la cavidad oral (IR+ 3%), y tratadas con melatonina al 3% p/v por vía i.p. (IR+IP). *p<0.05, **p<0.01 , y ***p<0.001 frente a C; #p<0.05, y ###p<0.001 frente a IR.
FIG. 10. Expresión de los complejos Cl, Clll, CIV y CV de la cadena respiratoria mitocondrial mediante western blot en la lengua en ratas irradiadas y tratadas con gel de melatonina al 3% y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Densitometría de las bandas del "inmunoblot" correspondiente al Complejo I; B, al complejo III; C, al complejo IV; D, al complejo V. E. Imagen del "inmunoblot" correspondiente a los complejos I, III, IV y V. Controles (C), irradiadas (IR), tratadas con gel de melatonina al 3% p/v por vía tópica en la cavidad oral (IR+3%), y tratadas con melatonina al 3% p/v por vía i.p. (IR+IP). *p<0.05, **p<0.01 , y ***p<0.001 frente a C; #p<0.05 y ###p<0.001 frente a IR. FIG. 11. Niveles de melatonina en mitocondrias de la lengua de ratas irradiadas y tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad oral y con melatonina por vía intraperitoneal. Controles (C), ratas irradiadas (IR), ratas irradiadas tratadas con gel de melatonina al 3% p/v por vía tópica en la cavidad oral (IR+aMT 3%), y ratas irradiadas tratadas con melatonina al 3% p/v administrada por vía i.p. (IR+IP). ***p<0.001 frente a C; ###p<0.001 frente a IR.
FIG. 12. Aspecto macroscópico de la lengua de la rata tras tratamiento con la composición de la invención por vía intraperitoneal. Se muestra el resultado macroscópico de la lengua de rata irradiada, y tratada con melatonina al 3% p/v y por vía intraperitoneal.
FIG. 13. Expresión de PGC-1a, NRF1 y TFAM mediante western blot en homogenado de lengua de ratas irradiadas y tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad oral y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Densitometría de las bandas del "inmunoblot" correspondiente a PGC-1 a; B, a NRF1 ; C, a TFAM; D, imagen del "inmunoblot" correspondiente a PGC-1 a, NRF1 y TFAM. Controles (C), irradiadas (IR), tratadas con gel de melatonina al 3% (+aMT 3%), y tratadas con melatonina por vía i.p. (+IP aMT). *p<0.05, **p<0.01 y ***p<0.001 frente a C; ###p<0.001 frente a IR.
FIG. 14. Expresión de NFkB mediante western blot en lengua de ratas irradiadas y tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad oral y con melatonina por vía intraperitoneal. A, Densitometría de las bandas del "inmunoblot" correspondiente a NFkB en citosol; B, a NFkB en núcleo; C, imagen del "inmunoblot" correspondiente a NFkB en citosol y a NFkB en núcleo. Controles (C), irradiadas (IR), tratadas con gel de melatonina al 3% (+aMT 3%), y tratadas con melatonina por vía i.p. (+IP aMT). ***p<0.001 y **p<0.01 frente a C; ##p<0.01 frente IR. FIG. 15. Expresión de NLRP3, ASC y caspasa 1 mediante western blot en homogenado de lengua de ratas irradiadas y tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad oral y con melatonina por vía intraperitoneal. A,
Densitometría de las bandas del "inmunoblot" correspondiente a NLRP3; B, a ASC; C, a caspasa 1 (casp. 1 ); D, imagen del "inmunoblot" correspondiente a NLRP3, ASC y caspasa 1 . Controles (C), irradiadas (IR), tratadas con gel de melatonina al 3% (+aMT 3%), y tratadas con melatonina por vía i.p. (+IP aMT). ***p<0.001 frente a C; #p<0.05 frente a IR.
FIG. 16. Expresión de IL-1 y de TNF-α mediante western blot en homogenado de lengua de ratas irradiadas y tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad oral y con melatonina por vía intraperitoneal. A,
Densitometría de las bandas del "inmunoblot" correspondiente a IL-1 ; B, a TNF- a; C, imagen del "inmunoblot" correspondiente a IL-1 y TNF-α. Controles (C), irradiadas (IR), tratadas con gel de melatonina al 3% (+aMT 3%), y tratadas con melatonina por vía i.p. (+IP aMT). **p<0.01 y *p<0.05 frente a C; ##p<0.01 y #p<0.05 frente a IR.
FIG. 17. Expresión de P53, Bax y Bcl2 mediante western blot en homogenado de lengua de ratas irradiadas y tratadas con gel de melatonina por vía tópica en la cavidad oral y con melatonina por vía intraperitoneal. A,
Densitometría de las bandas del "inmunoblot" correspondiente a P53; B, a Bax; C, a Bcl2; D, índice Bax/Bcl2; E, imagen del "inmunoblot" correspondiente a P53, Bax y Bcl2. Controles (C), irradiadas (IR), tratadas con gel de melatonina al 3% (+aMT 3%), y tratadas con melatonina por vía i.p. (+IP aMT). ***p<0.001 , **p<0.01 y *p<0.05 frente a C; ###p<0.001 y ##p<0.01 frente a IR. EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la utilidad del gel de melatonina en la mucositis y se muestran resultados a distintas concentraciones.
A. Material y métodos:
Se administró la composición de la invención a animales de experimentación por diferentes vías de administración y también se realizaron experimentos con pacientes humanos.
Para la administración tópica en la cavidad oral, la composición empleada fue un hidrogel (gel) que comprendía melatonina al 1 %, 3% o al 5% (1 , 3 o 5 gramos de melatonina en 100 mi del volumen final de la composición respectivamente) y en la que se emplearon copolímeros de polietileno y polipropileno al 20% como sustancia gelificante. Como copolímeros de polietileno y polipropileno se utilizó Pluronic® F127, (poloxamer). Se empleó benzoato sódico como conservante al 0,3%. Se utilizó esencia de naranja dulce, al 0,5 %. Todos los componentes utilizados se obtuvieron de FAGRON IBERICA, S.A.U., números de referencia: melatonina, 33457-27; Pluronic® F127, 33353-SP; benzoato de solio, 31360-12; esencia de naranja, 30620-08. La estructura química de la melatonina se muestra a continuación:
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Como animales de experimentación se utilizaron ratas, de 280 g de peso, que se sometieron, bajo condiciones controladas, a radiaciones ionizantes en la Unidad de Radiología Experimental del Centro de Investigación Biomédica de la Universidad de Granada. Los animales se sometieron a una exposición total de 50 grays (Gy). La dosis de irradiación utilizada cada día fue de 10 Gy que se administran a 100,75 cGy/min, 210 kilovoltios (kV) y 12 miliamperios (mA), y colocando el animal a una distancia de 40 cm con respecto a la fuente de radiación.
La aplicación de las diferentes formulaciones en los animales se realizó de la siguiente manera. Una aplicación tópica en la cavidad oral antes de la irradiación, otra después, y otras sucesivas cada 8 horas durante 21 días. Los animales se sacrificaron a los 21 días del inicio de la irradiación que es cuando se observó en los animales irradiados sin tratamiento con melatonina el grado máximo de mucositis. Las formulaciones utilizadas en los animales de experimentación fueron las siguientes: gel de pluronic F-127 con melatonina al 1 %, 3% o al 5% (1 , 3 o 5 gramos de melatonina/100 mi gel respectivamente), aplicados tres veces al día de forma tópica en la cavidad oral en un volumen de 500 μΙ/cada vez, lo que hace un total de 1 '5 ml/día. La aplicación tópica en la cavidad oral conlleva que los animales ingieran el gel que se aplica en la cavidad bucal. También realizaron los experimentos, administrando a los animales la misma concentración de melatonina que la utilizada con el hidrogel al 3% p/v, pero por vía intraperitoneal, para comprobar si la melatonina plasmática podría reducir la mucositis o es necesaria la aplicación de dicha molécula por vía tópica. Para la vía parenteral se utilizó una solución isotónica que comprendía un 70% v/v (volúmen/volúmen) de solución salina isotónica, y 30% v/v de propilenglicol, medidos en relación al volumen total de la disolución. Se inyectó una dosis diaria de 45 mg de melatonina durante 21 días. Los animales se sacrificaron a los 21 días del inicio de la irradiación, al igual que los animales tratados con el gel de melatonina aplicado por vía tópica en la cavidad oral.
También evaluó el papel protector de la composición de melatonina al 3% p/v en pacientes con cáncer de cabeza y cuello sometidos a radioterapia. El estudio se realizó a doble ciego (5 pacientes tratados con un gel de melatonina al 3% p/v y 5 pacientes con gel sin melatonina). Los pacientes se sometieron a enjuagues orales con el gel descrito anteriormente, con 500 microlitros durante tres veces al día, es decir, los pacientes recibieron un total de 45 mg/día de melatonina repartidos en una pauta de 15 mg 3 veces al día.. Los pacientes mantuvieron el gel con melatonina en la cavidad bucal durante 2 minutos, y a continuación lo ingirieron para que el gel bañara toda la mucosa gastrointestinal. Se realizaron dos evaluaciones semanales en consulta programada del grado objetivo de oromucositis (Escala objetiva de toxicidad RTOG (Radiation Therapy Oncology Group) según la OMS): Grado 0-4. B. Parámetros evaluados
B.1. Marcadores del daño oxidativo
-Evaluación de la oxidación de las membranas celulares y subcelulares (LPO)
Un mecanismo muy importante por el que los radicales libres de oxígeno son capaces de producir lesión celular, es mediante la peroxidación lipídica de sus membranas, tanto celulares como mitocondriales. La lipoperoxidación se produce debido a la acción de los radicales libres sobre los ácidos grasos poliinsaturados. Estas modificaciones en la estructura de la membrana celular provocan cambios en sus propiedades fisicoquímicas, con un aumento de su permeabilidad y pérdida progresiva de sus funciones, que pueden llevar a la consiguiente muerte celular. La medida del grado de lipoperoxidación de las membranas se ha considerado siempre un parámetro muy importante como indicador del estrés oxidativo. El índice de peroxidación lipídica (LPO) es proporcionado por la cuantificación del malonildialdehido y 4-hidroxialquenal (MDA + 4-HDA) presentes en la muestra, los cuales son importantes productos de descomposición de los peróxidos derivados de los ácidos grasos poliinsaturados y sus esteres relacionados. Las concentraciones de malonildialdehido y 4-hidroxialquenal, así como la concentración de hidroperóxidos proveen un índice conveniente de la peroxidación lipídica. B.2. Evaluación de las defensas antioxidantes
Dentro del sistema antioxidante celular, hay un grupo de enzimas que se encargan de detoxificar la célula de los radicales libres en condiciones fisiológicas, estos enzimas son fundamentalmente: -Glutation peroxidasa (GPx). este enzima utiliza como cofactor el glutation reducido y elimina el peróxido de hidrógeno (H2O2).
-Glutation reductasa (GRd). este enzima reconvierte el glutation oxidado, producido por la actividad de la glutation peroxidasa, en glutation reducido.
También es un índice importante de la evaluación del estado redox el índice obtenido del cociente entre el glutation oxidado/reducido (GSSG/GSH).
B. 3. Evaluación de marcadores de la actividad mitocondrial
La disfunción mitocondrial, asociada a un incremento de la producción de radicales libres, es responsable de la muerte celular. Por tanto, medir la actividad de los complejos de la cadena de transporte respiratorio (I, II, III y IV) y la expresión de los complejos es fundamental para conocer el grado de daño mitocondrial.
B.4. Mitocondria y estrés oxidativo: activación del inflamasoma:
En las mitocondrias dañadas por la irradiación aumenta la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) provocando alteraciones oxidativas de los componentes mitocondriales y apertura del poro de transición mitocondrial (PTM). La permeabilización de la membrana mitocondrial representa un punto irreversible de la activación de las vías de muerte celular programada que culminan en apoptosis o necrosis (Schroder K, et al. Cell. 2010; 140:821 -832; Latz E , Curr. Opin. Inmunol, 2010; 22: 28-33. Epub 2010).
Estudios recientes demuestran que la mitocondria también regula la respuesta inmune innata (Kastner DL, et al.JEur J Immunol. 2010; 40:61 1 -615). Se ha observado que los radicales libres originados en la mitocondria son los responsables de la activación de la maquinaria inflamatoria celular; concretamente, del llamado inflamasoma como el NLRP3 (NOD-//7 e receptor family, pyrin domain containing 3) (Zhou_R, et al. Nature 201 1 ; 469:221 -226). El NLRP3 es un complejo de proteínas que media la producción del mensajero inmune IL-1 beta y la inflamación.
Una gran variedad de factores pueden activar la respuesta inmune innata, desde agentes patógenos o moléculas que producen daño celular como consecuencia de un aumento de estrés. Cuando NLRP3 se activa, forma un complejo multiprotéico constituido por el NLRP3, la molécula adaptadora ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain), así como la pro-caspasa-1 . En situaciones de estrés celular, NLRP3 recluta a la proteína ASC y a la procaspasa 1 , que se activa a caspasa-1 provocando una serie de reacciones intracelulares que incluyen la activación de las citoquinas proinflamatorias.
B.5. Respuesta inflamatoria y NF-kB En la respuesta inflamatoria también participa la vía del factor nuclear kappa B (NF-kB). La diferencia con el inflamasoma, es que la vía de NF-kB se activa a través de los receptores de membrana Toll-like-receptors (TLR), mientras que el inflamasoma se activa a través de receptores citosólicos NOD-like receptors (NLRs) (Las siglas en inglés de NOD significan: Nucleotide Oligomerization Domain receptors),
NLRs. NF-kB y NLRP3 trabajan conjuntamente para activar las citoquinas pro- inflamatorias como I L-1 β. Paralelamente, esta citoquina puede inducir daño mitocondrial e incrementar la producción de ROS, que inducen daño del DNA mitocondrial (mtDNA) y apertura del PTM, provocando apoptosis.
Además, NF-kB activa la expresión de una gran variedad de genes implicados en la respuesta inflamatoria como la ciclooxigenasa 2 (COX-2), la óxido nítrico sintasa inducible (¡NOS) y moléculas de adhesión vascular (VCAM-1 ). Por tanto, la irradiación provoca un aumento de moléculas pro-inflamatorias que contribuyen a la apoptosis y, por tanto, a la aparición de la mucositis.
B.6. Mecanismos de apoptosis:
Las proteínas que regulan la apoptosis se agrupan en proteínas antiapoptóticas como Bcl2 (B-cell lymphoma 2), y proteínas proapoptóticas como Bax. Por tanto, el índice Bax/Bcl2 es un índice sumamente importante ya que refleja directamente el nivel de apoptosis. La proteína p53 activa las enzimas de reparación del ADN para corregir los daños detectados. La entrada en apoptosis es el último mecanismo protector, si el daño en el ADN es irreparable, para evitar la proliferación de las células que contienen ADN anormal. p53 activa la expresión de genes pro-apoptosis, como BAX.
Por tanto, las consecuencias de una producción incrementada de ROS mitocondriales, de daño del mtDNA y de la apertura del PTM, implican el mantenimiento del proceso inflamatorio, por lo que el tratamiento dirigido hacia el inflamasoma puede ser una vía para el uso de nuevas terapias en las enfermedades inflamatorias que no responden a los anti-inflamatorios como sucede con la mucositis inducida por la radioterapia.
C. EJEMPLO 1 : Resultados obtenidos en la lengua de rata
C.1 -Utilización de melatonina en un gel al 1%, 3%, y 5% p/v por vía tópica en la cavidad oral
El estrés oxidativo causado por las radiaciones produce daño en las membranas celulares, que se refleja en un aumento de la oxidación de los lípidos de membrana superior al 50% con respecto al control (Figura 1 , p<0.001 ). Este daño indica que las radiaciones lesionan estos tejidos causando mucositis. La melatonina al 3% revierte totalmente los efectos de la radioterapia, mientras que la melatonina al 1 %, tan sólo, revierte parcialmente los niveles de LPO. Cuando utilizamos una concentración de melatonina superior al 3%, como puede ser el 5%, observamos que tiene los mismos efectos que al 3% para contrarrestar el estrés oxidativo (Figura 1 ).
La irradiación también produce un intenso daño mitocondrial que se refleja por un aumento de LPO de las membranas mitocondriales (Figura 2). Este daño mitocondrial produce muerte celular (Acuña-Castroviejo et al. Curr Top Med Chem 2010, 1 1 (2):221 -240). Cuando tratamos las ratas irradiadas con melatonina, observamos un potente efecto antioxidante de la melatonina cuando se aplica al 3%, revirtiendo totalmente los efectos de la radioterapia (p<0.001 ) en la mitocondria. No se conoce ninguna molécula existente en la actualidad es capaz de ejercer estos efectos. Sin embargo, cuando se aplica la melatonina al 1 %, prácticamente no tiene ningún efecto para contrarrestar el daño oxidativo producido por la irradiación en la mitocondria. Cuando utilizamos una concentración de melatonina al 5%, encontramos que tiene los mismos efectos que al 3 % para contrarrestar el estrés oxidativo mitocondrial.
La irradiación también produce una disminución muy significativa de los niveles de GSH (p<0.001 ) (Figura 3A), al mismo tiempo que se elevan los del GSSG (p<0.001 ) (Figura 3B) en las mitocondrias de la lengua, provocando un aumento de glutatión total (GSH+GSSG) (Figura 3C). Estos cambios reflejan un considerable aumento del estrés oxidativo mitocondrial, que es reflejo de los efectos adversos provocados por la irradiación. El aumento del cociente GSS/GSH (p<0.001 ) (Figura 3D), que es el mejor índice del estrés oxidativo intracelular y, en nuestro caso, intramitocondrial, avala ese efecto nocivo de la irradiación. Por su parte, la administración de melatonina al 1 % es incapaz de aumentar los niveles de GSH (Figura 3A) y reducir los de GSSG (Figura 3B), de normalizar el índice GSSG/GSH (Figura 3D) y, por tanto, neutralizar el estrés oxidativo. Cuando utilizamos una concentración de melatonina al 5%, observamos que tiene los mismos efectos que al 3% para contrarrestar el estrés oxidativo mitocondrial, revirtiendo en ambos casos totalmente el efecto de la irradiación. Cuando medimos la actividad de la glutatión peroxidasa (GPx) (Figura 4A), observamos un aumento de la actividad por la irradiación como respuesta a un aumento de los peróxidos producidos. La administración del gel de melatonina al 3% contrarresta parcialmente los efectos de la irradiación. La melatonina al 5% tiene los mismos efectos que al 3%, mientras que al 1 % no tiene ningún efecto.
Cuando medimos la actividad de la glutatión reductasa (GRd) (Figura 4B), observamos que, igualmente, la melatonina al 5% tiene el mismo efecto que al 3%, mientras que al 1 % no tiene ningún efecto. La GRd mitocondrial es un enzima fácilmente inhibido por el estrés oxidativo y, por eso, su actividad disminuye significativamente con la irradiación (Figura 4B, p<0.001 ), efecto que es contrarrestado por la administración de melatonina (p<0.001 ), tanto al 3 como al 5%. La importancia de estas acciones de la melatonina radica en que, además de los cambios bioquímicos antes indicados, la reducción del estrés oxidativo mitocondrial se traduce en una prevención total de la mucositis, no observándose ningún tipo de lesión en las ratas tratadas (Figura 5). No se incluyen imágenes de los animales tratados con el gel de melatonina al 1 %, ya que no tuvo ningún efecto. Por tanto, la dosis mínima efectiva para el tratamiento de la mucositis corresponde a una concentración de melatonina al 3% en el gel aplicado tres veces al día (500 μΙ en cada aplicación), lo que resulta en una dosis diaria de 45 mg de melatonina. C.2-Comparación entre la aplicación del gel de melatonina al 3% p/v y la administración de la misma concentración de melatonina por vía parenteral.
Para determinar cuál es la vía de administración más adecuada para la reversión de la mucositis, se comparó la administración del gel de melatonina al 3% por vía tópica en la cavidad oral y la administración de melatonina por vía intraperitoneal (i.p.) a la misma dosis (45 mg al día).
Observamos que los efectos de la melatonina administrada con el gel y la administración de la melatonina por vía parenteral difieren en algunos aspectos importantes, como son una menor eficacia de la administración i.p. para recuperar el GSH y para disminuir el GSSG, lo que mantiene un cociente GSSG/GSH más alto, indicando un estrés oxidativo intramitocondrial mayor que tras la aplicación del gel. (Figura 6). En la figura 6 se compara los niveles de glutatión en lengua de rata tratadas con el gel al 3% y tratadas con la melatonina por vía intraperitoneal.
Con respecto a la glutatión peroxidasa mitocondrial (GPx) (Figura 7) los resultados indican un aumento de su actividad (Figura 7A) y de la expresión del enzima (Figura 7B y 7C) por la irradiación, como respuesta al aumento de los peróxidos producidos. Los estudios de expresión de proteínas se hacen mediante "western-blot" (7C), y en los análisis de densitometría de estos western se observa (Figura 7B) un aumento de la cantidad de proteína indicando un aumento de la expresión de dicho enzima con la irradiación. Tanto la administración de melatonina tópica como i.p. contrarrestan parcialmente el efecto de la irradiación.
La glutation reductasa mitocondrial (GRd) (Figura 8) sigue un curso completamente distinto. Es un enzima fácilmente inhibido por el estrés oxidativo, y por eso su actividad (Figura 8A) y expresión (Figura 8B y 8C) disminuyen significativamente con la irradiación. Los estudios de expresión de proteína se hacen mediante "western blot" (8C), y en los análisis de densitometría de estos western se observa (Figura 8B) una disminución de la cantidad proteína con la irradiación indicando una inhibición de la expresión de dicho enzima. Observamos un efecto significativo del gel de melatonina para recuperar la actividad y expresión de la GRd, mientras que la administración ip de melatonina no consigue recuperar el enzima. Si la GRd permanece inhibida, la mitocondria es incapaz de contrarrestar el daño oxidativo y favorece la muerte celular.
La irradiación produce una inhibición de los complejos de la cadena de transporte electrónico mitocondrial, fundamentalmente el complejo I, II y IV (Figura 9A, B y D). No se observan cambios significativos en el complejo III (Figura 9C) Cuando se dañan los complejos de la cadena respiratoria, se generan más radicales libres, disminuye la eficiencia de la cadena respiratoria, se produce menos ATP, se activan los factores apoptóticos y aumenta la apoptosis. La melatonina en gel es más eficiente para recuperar la actividad de los complejos que la administración parenteral, incluso aumentando la actividad por encima de los valores controles (Figura 9).
Al igual que ocurre con su actividad, la irradiación también inhibe la expresión de los complejos de la cadena respiratoria, siendo muy significativa la inhibición de la expresión de los complejos I, III, IV y V (Figura 10A, B, C, D y E). Mediante los estudios de "western blot", observamos una disminución de la cantidad de proteínas de los complejos I, III, IV y V, indicando una disminución de la síntesis de estos complejos con la irradiación. El gel de melatonina es mucho más eficaz para recuperar la expresión de los complejos que la administración parenteral. Además, podemos observar, que la aplicación parenteral es totalmente incapaz de recuperar la expresión del complejo V o ATP sintasa, el enzima encargado de la síntesis de ATP (Figura 10D). Este dato es muy relevante, ya que si el complejo V está inhibido, no hay síntesis de ATP y, por tanto, la célula muere por apoptosis o necrosis (Escames G, et al. Hum Genet, Julio, 201 1 , DOI 10.1007/s00439-01 1 -1057). La composición del gel al 3% es significativamente mejor que la la vía parenteral para reactivar la expresión de los complejos de la cadena respiratoria según los resultados mostrados.
Comprobamos que la irradiación suprime los niveles endógenos de melatonina en la lengua. Con la administración de la composición de la invención por vía tópica en la cavidad oral se recuperan dichos niveles, lo que favorece su acción antioxidante local. Sin embargo, con la administración parenteral de melatonina no se recuperan sus niveles en la lengua (Figura 1 1 ). Estos resultados explican que la administración tópica sea mucho más eficaz que la administración parenteral de la melatonina. Estas diferencias de eficiencia en cuanto a la acción de la melatonina según la vía de administración, se observan claramente al analizar las lesiones macroscópicas (Figuras 5 y 12). En efecto, la administración parenteral de melatonina no consigue recuperar las lesiones de la lengua tras la irradiación, mientras que la aplicación tópica en la cavidad oral normaliza totalmente el aspecto morfológico de la lengua.
C.3-Datos de la activación del inflamasoma, la respuesta inflamatoria y los mecanismos de apoptosis.
Cuando medimos la biogénesis mitocondrial, midiendo PGC1 a (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha), NRF1 (Nuclear respiratory factor 1) y TFAM (Transcription factor A, mitocondrial), observamos que la irradiación inhibía PGC1 a, sin embargo había un aumento de NRF1 y TFAM para compensar el daño mitocondrial (Fig 13).
Encontramos que la irradiación aumenta la activación de NFkB, incrementando los niveles tanto en núcleo como en citosol (Fig. 14A y Fig 14B) y se activa la vía del inflamasoma: aumenta NLRP3, ASC y la caspasa-1 (Fig 15). Como consecuencia de la activación de la vía de NFkB y del inflamasoma hay un aumento de citoquinas proinflamatorias IL-1 y TNF-α (Fig 16A y 16B) El daño mitocondrial implica también un aumento de apoptosis, con un aumento de las proteínas proapoptóticas P53 (Fig 17A) y Bax (Fig 17B), así como una disminución de las proteínas antiapoptóticas como Bcl2 (Fig 17C). Por tanto, encontramos un aumento del índice Bax/Bcl2 y de P53 (Fig 17D), indicando un aumento significativo de apoptosis.
Es la primera vez que se demuestra la relación directa entre daño mitocondrial, activación del inflamasoma y mucositis radioinducida.
Por su parte, la administración del gel de melatonina al 3% neutraliza el estrés oxidativo, aumenta la actividad y expresión de enzimas antioxidantes, aumenta la función mitocondrial, reduce la producción de radicales libres disminuyendo la actividad de NFkB (Fig 14A y 14B) y del inflamasoma (Fig 15).
Por tanto, el gel de melatonina al 3% inhibe la apoptosis de forma significativa (Fig 17D), disminuyendo las proteínas inductoras de apoptosis como P53 Y Bax (Fig 17A y 17B), y aumentando la expresión de las proteínas antiapoptóticas como Bcl2 (Fig. 17C).
Además, el gel de melatonina al 3% aumenta la biogénesis mitocondrial, aumentando PGC1 a, que se inhibe con la irradiación. Todo ello se traduce en un aumento de la supervivencia celular. Además, con la administración del gel por vía tópica en la cavidad oral se recuperan los niveles de melatonina, lo que favorece su acción antioxidante local. Sin embargo, con la administración parenteral de melatonina no se recuperan sus niveles en la lengua. Estos resultados explican que la administración tópica sea mucho más eficaz que la administración parenteral de la melatonina.
La histología también muestra lesiones macroscópicas La tinción utilizada ha sido la hematoxilina-eosina, para determinar la presencia de lesiones histológicas en los tejidos estudiados. La tinción de tricrómico de Masson Goldner (TCMG) permitió diferenciar el tejido muscular, que se tiñe de rojo, del tejido conjuntivo que lo hace de verde. En el animal control sin tratamiento, la estructura histológica de la lengua no presenta alteraciones. Se mantiene el epitelio poliestratificado queratinizado de la mucosa con presencia de papilas filiformes en la zona dorsal y sin ellas en la zona ventral. Bajo la mucosa, se encuentra la lámina propia y la submucosa formadas por una pequeña capa de tejido conjuntivo y algunos vasos. Luego las capas musculares que se orientan en distintas direcciones y con una pequeña cantidad de tejido conjuntivo entre los haces. Esta escasez de tejido conjuntivo se pone de manifiesto con la tinción de TCMG, donde la presencia de tinción verde es pequeña entre los músculos de la lengua. En el animal irradiado, aparece un aumento del tejido conjuntivo (fibrosis) entre las fibras musculares, separándolas. También aparecen congestión vascular y un marcado aumento del número de vasos (angiogénesis). A diferencia de lo que se observa en el animal control, en este caso la fibrosis teñida de color verde es mucho más abundante. Esta se observa sobre todo en la capa muscular donde las fibras se han cortado transversalmente. En los animales tratados con melatonina se observa una disminución de la fibrosis y de la angiogénesis entre las fibras musculares de la lengua, en comparación con la observada en la lengua del animal irradiado. Esta disminución del tejido conjuntivo fibroso se pone en evidencia mejor mediante la técnica de TCMG ya que se tiñe de verde, diferenciándose perfectamente de las fibras musculares que lo hacen de rojo. En cuanto a la diferencia entre ambos tratamientos, el gel al 3% de melatonina ha funcionado mejor que la administración parenteral, ya que la fibrosis es mucho menor. Todos estos efectos de la irradiación conllevan a un daño mitocondrial que se puede observar mediante microscopía electrónica. En los animales irradiados, podemos observar vacuolización mitocondrial, así como mitocondrias rotas con pérdida de su contenido, provocando un aumento de radicales libres y de la respuesta inflamatoria.
En los animales tratados con el gel, no se observan mitocondrias rotas y desaparecen las vacuolas. Sin embargo, en las ratas tratadas con melatonina por vía parenteral se observan mitocondrias rotas, al igual que en los animales sin tratar.
Por tanto, hemos demostrado, por primera vez que la melatonina permite proteger la mucosa gastrointestinal sometida a radioterapia, prevenir las lesiones provocadas por dichas radiaciones como la mucositis y curar dichas lesiones, siendo la administración por vía tópica más eficaz que la administración parenteral. La importancia de estas acciones de la melatonina radica en una reducción del daño mitocondrial, que se traduce en una prevención total de la mucositis, no observándose ningún tipo de lesión en las ratas tratadas a nivel macroscópico, o a nivel microscópico. D- EJEMPLO 2: Resultados obtenidos en humanos:
Los pacientes tratados con el gel de melatonina al 3% resisten mucho mejor la radioterapia, no necesitando tratamiento con opioides. Ninguno de estos pacientes necesitó sonda nasogástrica, ninguno fue ingresado ni tuvo que interrumpir el tratamiento. Los no tratados con melatonina necesitaron todos opioides mayores y todos desarrollaron el grado máximo de radiodermitis. Algunos necesitaron ser ingresado con interrupción del tratamiento.
E- Conclusión de los ejemplos de la invención:
La composición farmacéutica que comprende melatonina al 1 % no revierte la mucositis causada por radioterapia. Sin embargo, la composición farmacéutica que comprende melatonina al 3% revierte totalmente la mucositis producida por la radioterapia, lo mismo que sucede con la composición que comprende melatonina al 5%. Estos resultados demuestran la utilidad de una composición que comprenda melatonina entre el 3 y el 5% en el tratamiento de los efectos secundarios de la mucositis causada por radioterapia. Los resultados aquí mostrados demuestran que en la mucositis hay un daño mitocondrial y, por tanto, el éxito de este tratamiento radica en la aplicación oral de un gel de melatonina que impregna las mucosas y revierte el daño mitocondrial. Cualquier otro tipo aplicación de la melatonina no tiene un claro efecto en la mucositis, probablemente debido a que la melatonina se absorbe rápidamente, tiene una vida media muy corta (30 min), y no alcanza unos niveles terapéuticos suficientes en las mucosas, tanto de la cavidad oral como las del tracto gastro-intestinal. Sin embargo, la composición de la invención que comprendía el gel de pluronic F-127 y melatonina a la concentración del 3% o superior, impregna las mucosas alcanzando concentraciones efectivas locales, permitiendo a la melatonina entrar en la mitocondria y ejercer sus efectos en todo el tracto gastro-intestinal.
Por tanto, estas formulaciones farmacéuticas de aplicación tópica en la cavidad bucal que contienen melatonina en dosis apropiadas para proteger la piel y mucosas frente al terrible daño producido por las radiaciones durante ¡os periodos de radioterapia, tienen un gran interés clínico. Hemos comprobado que la administración parenteral de melatonina no aporta ningún beneficio respecto a la administración tópica en la cavidad oral para el tratamiento y/o prevención de la mucositis, con el valor añadido de que una administración parenteral de forma crónica resulta traumática para estos pacientes, siendo mucho más cómoda la administración tópica del gel.
Las mitocondrias juegan un papel importante en el control de la supervivencia celular, y nosotros hemos demostrado por primera vez, que su disfunción participa en gran medida en la fisiopatología de la mucositis (ver resultados). La disfunción mitocondrial se correlaciona con un agravamiento de la mucositis. Hemos visto, por primera vez, que en las mitocondrias de lengua de las ratas con mucositis, además del fracaso bioenergético, hay un aumento de la glutation peroxidasa (GPx), una reducción de la glutation reductasa (GRd), y un aumento del cociente glutation oxidado (GSSG)/glutatión reducido (GSH) (GSSG/GSH). Este último es un fiel marcador del estrés oxidativo intracelular e intramitocondrial.
En la presente invención se demuestra que la melatonina a la concentración que contiene la composición de la invención reduce totalmente el estrés oxidativo mitocondrial en la mucositis aumentando la actividad de los enzimas antioxidantes mitocondriales, principalmente GRd. Paralelamente, hay un aumento de la actividad y expresión de los complejos de la cadena respiratoria, que están inhibidos en la mucositis. La composición de la invención tiene efectos antioxidantes y antiinflamatorios que composiciones con menor concentración no tienen. La aplicación tópica y oral de melatonina entre el 3 y el 5% (3 y 5 gramos de melatonina en 100 mi de la composición final) impide el deterioro de la función celular de las mucosas dañada por radiaciones ionizantes.
Además, la aplicación tópica en la cavidad bucal mediante el gel de melatonina en las mucositis es más eficaz que la administración parenteral, lo cual podría deberse a que la aplicación en la cavidad oral en la formulación adecuada mantiene los niveles de melatonina más altos durante más tiempo en la cavidad oral (y por extensión, gastrointestinal), lo que facilita su acción local antioxidante y antiinflamatoria y, fundamentalmente, su acción dentro de la mitocondria impidiendo el daño tisular y, por tanto, la aparición de mucositis. Por ello, la aplicación tópica de melatonina entre el 3% y el 5%, en cavidad oral, proporciona un potente sistema de defensa en estas patologías. Hemos demostrado que la composición de la invención permite proteger la mucosa gastrointestinal sometida a radioterapia, prevenir las lesiones provocadas por dichas radiaciones como la mucositis y curar dichas lesiones. Los resultados obtenidos son extrapolables a quimioterapia.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Uso de una composición que comprende: un compuesto de fórmula general (I):
Figure imgf000038_0001
(i)
donde:
"n" es un número entero entre 1 y 4;
y R3 son, iguales o diferente, un grupo alquilo (C1-C4) lineal o ramificado; y
R2 es hidrógeno, un grupo alquilo (Ci-C4), lineal o ramificado, un grupo -C(=0)0-Ra o un grupo -C(=0)-N(H)-Ra; donde Ra es un grupo alquilo (Ci-C ), lineal o ramificado,
o sus sales, profarmaco y solvato del mismo, donde dicho compuesto está en una concentración del 2'5 a 5% p/v para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de la mucositis.
2. Uso según la reivindicación 1 , donde Ri y R3 son, iguales o diferente, un grupo alquilo (Ci-C2).
3. Uso según la reivindicación 2, donde R1 y R3 son un grupo metilo.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde n es 1 .
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde R2 es hidrógeno.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el compuesto es la melatonina.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la concentración del compuesto es del 3% p/v.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde la mucositis está causada por radioterapia y/o quimioterapia.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde la mucositis es mucositis oral, faríngea, esofágica, estomacal o intestinal.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la mucositis es mucositis oral.
1 1 . Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la mucositis es en humanos.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , donde la composición comprende además al menos un excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde la composición además comprende un agente gelificante.
14. Uso según la reivindicación 13, donde el agente gelificante se selecciona de la lista que comprende copolímero de polietileno y polipropileno, celulosa y goma guar.
15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 donde la composición además comprende al menos un conservante.
16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 donde la composición además comprende un antioxidante.
17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 donde la composición además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. Uso cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 donde la composición se presenta en una forma adaptada a la administración tópica, oral, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea.
19. Uso según la reivindicación 18 donde la composición se presenta en una forma adaptada a la administración tópica
20. Uso según la reivindicación 19 donde la dosis diaria administrada es de entre 37'5 mg y 75 mg.
21 . Uso según la reivindicación 20 donde la dosis diaria administrada
45 mg.
22. Uso según la reivindicación 21 donde la dosis se administra
pauta de 15 mg 3 veces al día.
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