CN103945843A - 褪黑素用于治疗和/或预防粘膜炎的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含2.5％至5％w/v比例之褪黑素或其衍生物的组合物在制备用于治疗和/或预防粘膜炎的药物组合物中的用途。所述粘膜炎优选地由放射治疗和/或化学治疗引起，并且优选地具体涉及口腔粘膜炎。

Description

褪黑素用于治疗和/或预防粘膜炎的用途
技术领域
本发明涉及包含2.5％至5％重量/体积(w/v)浓度之褪黑素(melatonina)(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)或其衍生物的组合物在制备用于治疗和/或预防粘膜炎(mucositis)的药物组合物中的用途。所述粘膜炎优选地由放射治疗和/或化学治疗引起。因此，本发明可以归入医药领域。
背景技术
用放射治疗或化学治疗或者二者的结合来治疗恶性肿瘤越来越有效，但是其与短期和长期的副作用相关。在这些副作用中存在口腔粘膜功能和完整性疾病。结果包括严重的溃疡(粘膜炎)和嘴的真菌超感染(念珠菌病、鹅口疮)。由所述疾病及其治疗诱发的这些并发症包括：吞咽疼痛、吞咽困难、营养不良、化学治疗施用的延迟、放射治疗方案的中断、肿瘤治疗效力的损失、住院延长、升高的成本和在一些患者中潜在的致命感染(败血症)。
粘膜炎是影响整个胃肠道(从嘴至肛门)的炎症反应，并且其为化学治疗和/或放射治疗以及骨髓移植的主要不良作用之一。粘膜炎还可由化学试剂引起，所述化学试剂例如皮质类固醇、免疫抑制药物(硫唑嘌呤、环孢菌素A)、口干燥症诱发药物、抗焦虑药、抗抑郁药、抗组胺药、拟交感神经兴奋剂、抗帕金森病药、抗精神病药、牙龈治疗、乙内酰脲或者广谱抗生素。
由电离辐射和由化学治疗剂诱发的口腔粘膜炎(或口粘膜炎(oromucositis))是目前癌症患者治疗的主要问题之一，其中由电离辐射诱发的口腔粘膜炎也称为辐射诱发的口腔粘膜炎。40％的接受化学治疗和/或放射治疗之患者以及多达76％的骨髓移植患者发生口腔问题，最普遍的口腔问题是：粘膜炎、局部感染、疼痛和出血。97％的头颈癌患者发生一定程度的粘膜炎，并且100％的受到长时间之分次放射治疗患者也发生粘膜炎(Trotti A等，Radiotherapy and Oncology2003，66：253-262)。由电离辐射引起的损伤是由于直接和间接机制。直接作用是由于辐射在脱氧核糖核酸(DNA)中的致突变作用，而间接机制(约这种机制的70％)是由于辐射对水分子的作用，导致形成自由基(Trotti A等，Radiotherapyand Oncology2003，66：253-262)。
根据世界卫生组织(WHO)，基于症状学将粘膜炎分为不同等级。等级0：正常；等级1：泛发性红斑，粉红、具有丰富唾液的非疼痛粘膜，正常嗓音；等级2：红斑，不非常广泛的溃疡，能够吞咽固体；等级3：红斑，水肿或广泛的溃疡，患者只可以吞咽液体，讲话时疼痛并有困难；等级4：非常广泛的溃疡，牙龈出血，感染，无唾液，非常剧烈的疼痛，肠或肠胃外支持。
粘膜炎作为一系列生物事件的结果发生，所述事件在粘膜下层开始并向上皮发展，并且对于具有不同病因的粘膜炎来说是普遍的。已经在放射治疗和化学治疗中描述了在第一阶段中活性氧族(ROS)增加和对DNA的损伤增加。转录因子被活化，所述转录因子例如核因子κ-B(NF-κB)。促炎细胞因子(包括白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子α(TNFα))的产生增加，引起凋亡和细胞损伤。该炎症反应在粘膜中产生损伤，导致溃疡发作。这些细胞将被细菌侵蚀，并且活化了产生更多负责所有组织损伤之细胞因子的巨噬细胞。在该整个过程中，使得炎性过程和细胞损伤增加的自由基大幅增加。在第二阶段中，放射治疗和/或化学治疗抑制了上皮细胞的复制，减少了细胞更新。在第三阶段中，细菌侵蚀(colonización)和溃疡的表面继续增加，促进全身性感染的发作(Volpato LE等，Mol CancerTher2007，6：3122-3130)。粘膜炎是不响应于已知抗炎治疗的炎性病理。粘膜炎是这样的过程，其中与其余炎性过程(例如炎性体途径)不同的生物化学机制可以干预(Escames G等，Hum Genet，July 2011，DOI10.1007/s00439-011-1057)。目前不存在完全逆转粘膜炎或者完全预防其发生的治疗。
直到现在已经使用了许多用于治疗和预防粘膜炎而并不示出粘膜炎完全逆转结果的治疗，例如，已经描述了使用以下的治疗：阿昔洛韦、苄达明、β-胡萝卜素、磷酸钙、用别嘌呤醇冲洗、芦荟、氯己定、甘菊(chamomile)、依托泊苷、亚叶酸、谷氨酰胺、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、制霉菌素、米索硝唑、聚维酮、匹鲁卡品、苏木精(hematoxifilina)、泼尼松或硫糖铝(Worthington HV等，CochraneDatabase Syst Rev.October2007，17；(4)DOI：10.1002/14651858.CD000978.pub3；Clarkson JE等，Cochrane DatabaseSyst Rev.August2010，4；(8))，DOI：10.1002/14651858.CD001973.pub4。
因此，存在对于允许完全逆转和预防粘膜炎(特别是在受到放射治疗和/或化学治疗的患者中)之工具的需要。
发明内容
本发明描述了包含2.5％至5％w/v浓度之褪黑素或其衍生物的组合物在制备用于治疗和/或预防粘膜炎的药物组合物中的用途。
示出针对由放射治疗或化学治疗引起之损伤保护口腔粘膜的体内结果。本发明的组合物可用于保护口腔粘膜以及胃肠粘膜。本发明证明比本发明的组合物中描述的浓度低的浓度不能完全逆转粘膜炎，而等于或者大于3％w/v的浓度能够治疗并完全逆转由电离辐射引起的粘膜炎。示出不同施用途径的结果，表面途径是提供针对口腔粘膜炎的最佳保护途径。
基于所描述的，本发明涉及包含2.5％至5％w/v浓度之褪黑素或其衍生物的组合物在制备用于治疗和/或预防粘膜炎的药物组合物中的用途。在下文中，其应作为“本发明的组合物”提及。
“2.5％至5％w/v的浓度”理解为组合物在100ml最终组合物中包含2.5至5克褪黑素或其衍生物。缩写“w/v”指重量/体积或者质量/体积(m/v)。
一个优选的实施方案涉及其中褪黑素或其衍生物的浓度为3％w/v的用途。因此，所述优选的组合物涉及在100ml组合物总体积中包含3g褪黑素或其衍生物的组合物。在下文中，其应作为“本发明的优选组合物”提及。
可用于制备用来治疗和/或预防粘膜炎之药物组合物的通式I中包括的任何化合物以及其可药用的盐、溶剂化物或前药理解为“褪黑素或其衍生物”。
通式I的化合物指：
其中：
“n”为1至4的整数；
R1和R3为相同的或不同的、直链或支链(C1-C4)烷基基团；以及
R2为氢、直链或支链C1-C4烷基、-C(＝O)O-Ra基团或-C(＝O)-N(H)-Ra基团，其中Ra为直链或支链C1-C4烷基基团。
在本发明中，术语“烷基”指具有1至4个碳原子的直链或支链脂肪链，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基等。所述烷基基团优选地具有1至2个碳原子。更优选地，其为甲基基团。
在本发明的一个优选实施方案中，R1和R3为甲基基团。更优选地n为1，并且甚至更优选地R2为氢。
术语“褪黑素”指N-乙酰基-5-甲氧基色胺，在文献中也被称作褪黑素、褪黑激素(melatonine)、麦乐通宁(melatol)、松果腺素(melovine)、circadin、regulin、乙酰胺(acetaminde)、N-乙酰基-甲氧基-色胺、5-甲氧基-N-乙酰基色胺、N-[2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)乙基]乙酰胺或N-[2-(5-甲氧基吲哚-3-基)乙基]乙酰胺，或者当R1和R3在通式(I)的化合物中为甲基时，n为1且R2为氢。褪黑素的CAS登记号为73-31-4。
褪黑素是内源的神经激素，其在动物(包括人)内生理上通过松果体以及通过其他器官(例如，胃肠道、视网膜、淋巴细胞和骨髓细胞)产生。
褪黑素在动物(包括人)中从血清素(5-羟色胺，5-HT)产生，所述血清素进而来源于氨基酸色氨酸。因此，本发明还可涉及包含任何褪黑素前体(5-HT、色氨酸或中间代谢物，如N-乙酰基血清素或NAS)之组合物在制备用于治疗和/或预防粘膜炎的药物组合物中的用途，所述褪黑素前体的浓度足以使其在人体内转化为本发明描述的褪黑素的浓度。
因此，本发明还涉及褪黑素或其衍生物的可药用盐，其可通过本领域技术人员已知的化学方法产生，例如，通过在水中或在有机溶剂中或这二者的混合物中与酸反应。可以使用乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈作为有机溶剂。酸加成盐的实例包括矿物酸加成盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐)以及有机酸加成盐(例如乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐)。
如本文使用的，术语“前药”指已经经历化学衍生(例如取代或另外化学基团的加成)的化学化合物，以修饰其任何物理化学性质(例如溶解性或生物利用度)，但是其不修饰原始分子的技术特性。前药可以例如为酯、醚或酰胺衍生物。生物利用率指其在具体生物区室中的利用率。
根据本发明，术语“溶剂化物”必须理解为具有另一个分子的褪黑素衍生物，所述另一个分子例如通过非共价键结合的极性溶剂。这种溶剂化物的实例包括水合物和醇化物(例如甲醇化物)。
可以通过本领域中已知的方法制备盐、溶剂化物和前药。非可药用的盐、溶剂化物或前药也在本发明的范围内，因为它们可用于制备可药用的盐、溶剂化物或前药。
本发明的组合物或本发明的优选组合物也可指包含褪黑素之功能性生物等价物的组合物，所述功能性生物等价物的浓度等价于本发明的组合物中描述的浓度。
如本文使用的，术语“功能性生物等价物”或“生物等价变体”指具有与描述的分子相同功能的分子，其可以显示对于所述描述的分子轻微的变化，而所述变化并不给所述分子带来任何另外的技术效果。因此，本发明涉及具有相同功能并显示轻微变化而所述变化不给褪黑素带来任何另外技术效果的褪黑素变体。
“等价的浓度”理解为褪黑素的功能性生物等价物产生与本发明中描述的通过本发明组合物之作用相同的必要浓度。
褪黑素也可以在植物中产生。例如，已在藻类、可食用植物、谷物、水果、种子、根、茎、叶和药用草药中描述了褪黑素的存在(Paredes SD等，J Exp Bot20089，60(1)：57-69)。已在例如可可、葡萄、番茄、茶、绿茶、藻类、谷物和橄榄中描述了褪黑素的存在。本发明组合物的褪黑素来源可以是植物来源。为此目的，来自植物来源的褪黑素(也称为植物褪黑素)可以通过本领域技术人员已知的任何方法获得。
本发明组合物中使用的褪黑素来源还可以是合成的。为此目的，褪黑素可以通过本领域技术人员已知的技术来化学合成。
术语“药物组合物”或“药用产品”指用于预防、诊断、缓解、治疗或治愈人或动物疾病的任何物质。在本发明的上下文中，其指能够治疗和/或预防粘膜炎的组合物。
在本发明中，“治疗和/或预防”指治疗性和预防性治疗或预防措施。可以治疗的那些情况包括已经与转变(alteraciones)相关的那些以及在其中预防转变的那些。“转变”是从如本文所描述的本发明组合物的治疗中获益的任何病症。
如本文使用的，术语“粘膜炎”主要指胃肠道粘膜(即口腔、咽、食道、胃和肠粘膜)发生炎症的疾病，并且其特征为对粘膜完整性和功能具有可导致其中溃疡和感染的影响。粘膜炎可由多种病因引起，其中有放射治疗处理、化学治疗处理、骨髓移植或用药物处理。
一个优选的实施方案涉及其中由放射治疗和/或化学治疗引起之粘膜炎的用途。
放射治疗理解为基于使用能够电离物质的电离辐射(例如X射线或放射性，例如，其包括γ射线和α粒子二者)的治疗。本发明涉及用在癌症治疗中使用的电离辐射的治疗，并包括本领域技术人员已知的产生粘膜炎的任何治疗。
化学治疗理解为基于施用引起肿瘤生长抑制的药剂，并且包括本领域技术人员已知的产生粘膜炎的任何治疗。例如，化学试剂可以指甲氨蝶呤、甲基苄肼、硫鸟嘌呤、巯嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟尿苷、长春花碱、长春新碱、更生霉素、柔红霉素、阿霉素、光辉霉素、博来霉素、天冬酰胺酶或伊立替康。
另一个优选的实施方案涉及其中粘膜炎为口腔、咽、食道、胃或肠粘膜炎的用途。另一个优选的实施方案涉及其中粘膜炎为口腔粘膜炎的用途。
另一个优选的实施方案涉及其中粘膜炎在人中的用途。
另一个优选的实施方案涉及其中组合物还包含至少一种可药用赋形剂或辅剂的用途。
术语“赋形剂”指帮助本发明的药物组合物或者药用产物吸收、稳定所述药物组合物或者在赋予其稠度或提供使其更可口之风味的意义上帮助其制备的物质。所以，赋形剂可以具有将成分保持在一起的功能，例如淀粉、糖或纤维素；变甜的功能；充当染料的功能；保护药用产品的功能，例如将其与空气和/或水分分离；作为对丸剂、胶囊剂或任何其他呈现形式之填充剂的功能，例如磷酸氢钙；起到促进溶解组分及其在肠中吸收之功能的崩解剂，而不排除未在本段提到的其他类型的赋形剂。为了使本发明的组合物具有令人愉快的味道，可以添加香精(例如肉桂、柠檬、橙、柑橘或香草香精)。
术语“辅剂”指增强药物物质响应的任何物质。在本发明中，所述术语指增强本发明组合物之作用的任何物质；其可以指本领域技术人员已知的任何辅剂。
术语“可药用”指允许并评价涉及的化合物以使其不损伤在其中施用的生物体。
另一个优选的实施方案涉及其中还包含胶凝剂之组合物的用途。所述胶凝剂优选地选自包含聚乙烯和聚丙烯共聚物、纤维素和瓜尔胶的列表。其优选地指聚乙烯和聚丙烯共聚物。基于本文所描述的，另一个优选的实施方案涉及其中组合物为凝胶(或也指“水凝胶”)的用途。
术语“胶凝剂”指形成凝胶的物质，即通过胶凝剂形成的三维网状物，并一般含有液相。可以使用的所述胶凝剂可以为本领域技术人员已知的用于制备药物组合物的那些。例如，除了聚乙烯和聚丙烯共聚物，还可使用泊洛沙姆共聚物(或泊洛沙姆)，例如称作的药剂，包括F127(CAS登记号9003-11-6)或F127NF。
另一个优选的实施方案涉及其中组合物还包含至少一种防腐剂的用途。
防腐剂理解为通过抑制微生物污染来维持药用产品性质的物质；其可以为离子或非离子防腐剂。使用的防腐剂将是无毒的、化学稳定的并与褪黑素相容。可以使用本领域已知的防腐剂作为防腐剂，例如，防腐剂可以指苯甲酸、苯甲酸钠、抗坏血酸、山梨酸钾、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯或尼泊金丁酯。“微生物”理解为可以在本发明的组合物中生长并繁殖的任何细胞，例如细菌、真菌和酵母。
另一个优选的实施方案涉及其中组合物还包含抗氧化剂的用途。
术语“抗氧化剂”指能够延迟或防止氧化的物质。可以使用本领域已知的抗氧化剂作为抗氧化剂，例如生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸钠、酒石酸、丁基羟基茴香醚、柠檬酸、维生素A或维生素E。
另一个优选的实施方案涉及其中组合物还包含至少另一种药物物质的用途。
如本文使用的，术语“药物物质”、“活性物质”、“药物活性物质”、“活性成分”或“药物活性成分”指可潜在地对疾病之诊断、治愈、减轻、治疗或预防提供药理活性或另一不同作用或者可影响人或其他动物身体结构或功能的任何组分。例如，可以使用别嘌呤醇。
另一个优选的实施方案涉及其中组合物还包含可药用载体的用途。
“可药用载体”或药理学可用载体指在制药行业已知的用于制备药物剂型并包括但不限于固体、液体、溶剂或表面活性剂的那些物质或者物质的组合。载体可以为惰性物质或具有与本发明的任何化合物相似的作用。载体的功能是促进本发明的表达产物以及另一些化合物的整合，允许更好的剂量和施用或者赋予药物组合物稠度和形式。当呈现形式是液体时，所述载体为稀释剂。本发明中可以使用的可药用载体可以为本领域技术人员已知的那些，例如，溶酶体、毫米胶囊、微胶囊、纳米胶囊、海绵、毫米球、微球、纳米球、毫米粒、微粒和纳米粒。
本发明的药物组合物可以以本领域已知的多种形式配制用于施用。这些制剂可以通过多种途径向动物、优选地向哺乳动物以及更优选地向人施用，所述途径包括但不限于表面、经口、肠胃外、腹膜内、静脉内、皮内、病灶内、动脉内、肌内、鼻内或皮下途径。
基于本文所描述的，另一个优选的实施方案涉及其中组合物在适于表面、经口、腹膜内、皮内或皮下施用的剂型中的用途。一个甚至更优选的实施方案涉及其中组合物在适合表面施用的剂型中的用途。
本发明中的术语“表面施用”指组合物施用于粘膜表面。施用可以在消化道任何部分的粘膜中，优选在口腔粘膜中。本发明组合物的施用可以使用口腔冲洗数分钟来进行，以使口腔粘膜被浸渍，然后其可被咽下以浸渍并与整个胃肠粘膜接触。
在表面施用的情况下，可用于本发明组合物的制剂可以如下：水包油乳剂、油包水乳剂、乳液剂(leches)、洗剂、凝胶剂、润发油、香膏(bálsamos)、泡沫剂(espumas)、身体油(aceites corporales)、肥皂、条状物(barras)、铅笔状物(lápices)、喷雾器、乳膏剂、擦剂、软膏剂、浆液(sueros)和摩丝(mousses)。所述组合物还可以包含于选自水凝胶、擦拭巾(toallitas)、贴剂和面膜(mascarillas faciales)的固体支持物。
用于获得治疗有效量的剂量依赖于多种因素，例如年龄、重量、性别或动物(优选哺乳动物，更优选人)的耐受。在本文使用的意义中，表述“治疗有效量”指产生期望作用的组合物的药物有效量，且其一般尤其通过所述药物组合物和寻求之治疗作用的典型特性确定。
本发明的一个优选实施方案涉及其中施用的日剂量为37.5mg至75mg的用途。一个甚至更优选的实施方案涉及其中施用的日剂量为45mg的用途。另一个甚至更优选的实施方案涉及其中剂量以15mg、一天3次的方案施用的用途。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”和其变体不试图排除其他技术特征、添加物、组分或步骤。对于本领域技术人员来说，本发明的另一些目标、优点和特征将在说明书部分和本发明的实践部分推论。以下实施例和附图通过举例说明的方式提供，并不试图限制本发明。
附图说明
图1.在大鼠舌匀浆中的氧化应激水平。其示出在对照大鼠、经辐射的大鼠和用1％、3％或5％w/v褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径处理之经辐射的大鼠中脂质过氧化作用(LPO)指数的结果。对照组(C)；经辐射的组(IR)；用1％、3％或5％褪黑素凝胶处理的经辐射的组(IR+褪黑素)。MDA，丙二醛；4-HDA，羟烯醛(hidroxialquenal)；对于C，＊＊p<0.01且＊＊＊p<0.001；对于IR，###p<0.001。
图2.在大鼠舌匀浆中的氧化应激水平。其示出在对照大鼠、经辐射的大鼠和用1％、3％或5％w/v褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径处理之经辐射的大鼠中脂质过氧化作用(LPO)指数的结果。对照组(C)；经辐射的组(IR)；用1％、3％或5％褪黑素凝胶处理的经辐射的组(IR+褪黑素)。MDA，丙二醛；4-HDA，羟烯醛；对于C，＊＊p<0.01且＊＊＊p<0.001；对于IR，###p<0.001。
图3.大鼠舌中的谷胱甘肽水平。其示出在对照大鼠、经辐射的大鼠和用1％、3％或5％w/v褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径处理之经辐射的大鼠中谷胱甘肽水平的结果。A，还原型谷胱甘肽水平(GSH)；B氧化型(GSSG)；C，总谷胱甘肽(GT)；D，来自对照大鼠(C)、经辐射的大鼠(IR)以及用1％、3％和5％褪黑素(IR+褪黑素)处理的大鼠之舌线粒体的(GSSG/GSH)比值。对于C，＊＊＊p<0.001；对于IR，###p<0.001。
图4.在大鼠舌线粒体中谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶的活性。其示出以下的活性结果：A，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)；以及B，谷胱甘肽还原酶(GRd)二者在对照大鼠、经辐射的大鼠和用1％、3％或5％褪黑素凝胶处理的经辐射的大鼠中。对照大鼠(C)、经辐射的大鼠(IR)以及用1％、3％和5％w/v褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径处理之经辐射的大鼠(IR+褪黑素)。对于C，＊＊p<0.01且＊＊＊p<0.001；对于IR，###p<0.001。
图5.在用本发明组合物处理后之大鼠舌的宏观外形。其示出对照大鼠、经辐射的大鼠以及用1％、3％或5％w/v褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径处理之经辐射大鼠的舌的宏观结果。对照大鼠、经辐射的大鼠(IR)以及用1％、3％和5％褪黑素凝胶处理之经辐射的大鼠(分别为IR+1％MT；IR+3％MT；和IR+5％MT)。
图6.表面施用和腹膜内施用的在大鼠舌中谷胱甘肽水平之间的比较。其示出在对照大鼠、经辐射的大鼠以及用3％w/v褪黑素通过表面途径或3％w/v褪黑素通过腹膜内(i.p.)途径处理之经辐射的大鼠中谷胱甘肽水平的结果。A，还原型谷胱甘肽水平(GSH)；B，氧化型谷胱甘肽水平(GSSG)；C，总谷胱甘肽水平(GT)；D，以及在大鼠舌线粒体中的GSSG/GSH比值。对照大鼠(C)、经辐射的大鼠(IR)、用3％褪黑素凝胶处理的大鼠(IR+3％)以及用褪黑素通过i.p.途径处理的大鼠(IR+IP)。对于C，＊＊＊p<0.001；对于IR，##p<0.01且＃＃#p<0.001。
图7.在用褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径和用褪黑素通过腹膜内途径处理之经辐射大鼠的大鼠舌中GPx的活性和表达。A，GPx活性；B，GPx的“免疫印迹”(“western印迹”)密度测定法分析。C，来自对照大鼠(C)、经辐射的大鼠(IR)、用3％w/v褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径(IR+3％)和用3％w/v褪黑素通过i.p.途径(IR+IP)处理之大鼠的舌线粒体中GPx的Western印迹图像。对于C，＊＊p<0.01且＊＊＊p<0.05；对于IR，##p<0.01且###p<0.001。
图8.在用褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径和用褪黑素通过腹膜内途径处理之经辐射大鼠的大鼠舌中GRd的活性和表达。A，GRd活性；B，GRd的“免疫印迹”(“western印迹”)密度测定法分析以及C，来自对照大鼠(C)、经辐射的大鼠(IR)、用3％w/v褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径(IR+3％)和用3％w/v褪黑素通过i.p.途径(IR+IP)处理之大鼠的舌线粒体中GRd的Western印迹图像。对于C，＊＊＊p<0.001；对于IR，#p<0.05且###p<0.001。
图9.在用褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径和用褪黑素通过腹膜内途径处理之经辐射大鼠的舌线粒体中线粒体呼吸链复合物CI、CII、CIII和CIV的活性。A，复合物I；B，复合物II；C，复合物III；D，复合物IV。对照大鼠(C)、经辐射的大鼠(IR)、用3％w/v褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径(IR+3％)和用3％w/v褪黑素通过i.p.途径(IR+IP)处理的大鼠。对于C，＊p<0.05，＊＊p<0.01且＊＊＊p<0.001；对于IR，#p<0.05且###p<0.001。
图10.通过在用3％褪黑素凝胶和用褪黑素经腹膜内途径处理之经辐射大鼠中Western印迹的舌中线粒体呼吸链复合物CI、CIII、CIV和CV表达。A，对应于复合物I的Western印迹带密度测定法；B，对应于复合物III；C，对应于复合物IV；D，对应于复合物V。E.对应于复合物I、III、IV和V的Western印迹图像。对照大鼠(C)、经辐射的大鼠(IR)、用3％w/v褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径(IR+3％)和用3％w/v褪黑素通过i.p.途径(IR+IP)处理的大鼠。对于C，＊p<0.05，＊＊p<0.01且＊＊＊p<0.001；对于IR，#p<0.05且###p<0.001。
图11.在用褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径和用褪黑素通过腹膜内途径处理之经辐射大鼠的大鼠舌线粒体中褪黑素的水平。对照大鼠(C)、经辐射的大鼠(IR)、用3％w/v褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径(IR+3％aMT)和用3％w/v褪黑素通过i.p.途径施用(IR+IP)处理的经辐射大鼠。对于C，＊＊＊p<0.001；对于IR，###p<0.001。
图12.在用本发明的组合物通过腹膜内途径处理后大鼠舌的宏观外形。示出在用3％w/v褪黑素并通过腹膜内途径处理之经辐射大鼠中大鼠舌的宏观结果。
图13.通过在来自用褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径和用褪黑素通过腹膜内途径处理之经辐射大鼠的大鼠舌匀浆中Western印迹的PGC-1α、NRF1和TFAM表达。A，对应于PGC-1α的Western印迹带密度测定法；B，对应于NRF1；C，对应于TFAM；D，对应于PGC-1α、NRF1和TFAM的Western印迹图像。对照大鼠(C)、经辐射的大鼠(IR)、用3％褪黑素凝胶(+3％aMT)和用褪黑素通过i.p.途径(+IP aMT)处理的大鼠。对于C，＊p<0.05，＊＊p<0.01且＊＊＊p<0.001；对于IR，###p<0.001。
图14.通过在用褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径和用褪黑素通过腹膜内途径处理之经辐射大鼠的大鼠舌中Western印迹的NFκB表达。A，对应于在胞质溶胶中NFκB的Western印迹带密度测定法；B，细胞核中的NFκB；C，对应于在胞质溶胶和细胞核中NFκB的Western印迹图像。对照大鼠(C)、经辐射的大鼠(IR)、用3％褪黑素凝胶(+3％aMT)和用褪黑素通过i.p.途径(+IP aMT)处理的大鼠。对于C，＊＊＊p<0.001且＊＊p<0.01；对于IR，##p<0.01。
图15.通过在来自用褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径和用褪黑素通过腹膜内途径处理之经辐射大鼠的大鼠舌匀浆中Western印迹的NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1表达。A，对应于NLRP3的Western印迹带密度测定法；B，对应于ASC；C，对应于胱天蛋白酶1(casp.1)；D，对应于NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1的Western印迹图像。对照大鼠(C)、经辐射的大鼠(IR)、用3％褪黑素凝胶(+3％aMT)和用褪黑素通过i.p.途径(+IP aMT)处理的大鼠。对于C，＊＊＊p<0.001；对于IR，#p<0.05。
图16.通过在来自用褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径和用褪黑素通过腹膜内途径处理之经辐射大鼠的大鼠舌匀浆中Western印迹的IL-1和TNF-α表达。A，对应于IL-1的Western印迹带密度测定法；B，对应于TNF-α；C，对应于IL-1和TNF-α的Western印迹图像。对照大鼠(C)、经辐射的大鼠(IR)、用3％褪黑素凝胶(+3％aMT)和用褪黑素通过i.p.途径(+IP aMT)处理的大鼠。对于C，＊＊p<0.01且＊p<0.05；对于IR，＃＃p<0.01且#p<0.05。
图17.通过在来自用褪黑素凝胶在口腔中通过表面途径和用褪黑素通过腹膜内途径处理之经辐射大鼠的大鼠舌匀浆中Western印迹的p53、Bax和Bcl2表达。A，对应于p53的Western印迹带密度测定法；B，对应于Bax；C，对应于Bcl2；D，Bax/Bcl2比值；E，对应于p53、Bax和Bcl2的Western印迹图像。对照大鼠(C)、经辐射的大鼠(IR)、用3％褪黑素凝胶(+3％aMT)和用褪黑素通过i.p.途径(+IP aMT)处理的大鼠。对于C，＊＊＊p<0.001、＊＊p<0.01且＊p<0.05；对于IR，###p<0.001且##p<0.01。
具体实施方式
在本专利文件中提供的下列具体实施例用来举例说明本发明的性质。这些包括的实施例仅为了举例说明目的，且不能解释为对本文要求保护之本发明的限制。因此，下面描述的实施例举例说明本发明而不限制其应用领域。
将在下面通过本发明者进行的试验举例说明本发明，清楚地示出褪黑素凝胶在粘膜炎中的有效性，并示出在不同浓度下的结果。
A.材料和方法：
将本发明的组合物以不同施用途径施用于实验中使用的动物，并且还进行了人患者的实验。
对于在口腔中的表面施用，使用的组合物为包含1％、3％或5％褪黑素(在100ml最终体积的组合物中分别为1、3或5克褪黑素)的水凝胶(凝胶)，且其中使用20％聚乙烯和聚丙烯共聚物作为胶凝物质。使用F127(泊洛沙姆)作为聚乙烯和聚丙烯共聚物。使用0.3％苯甲酸钠作为防腐剂。使用0.5％甜橙香精。使用的所用组分从FAGRONIBERICA，S.A.U.取得，参考号：褪黑素，33457-27；F127，33353-SP；苯甲酸钠，31360-12；橙香精，30620-08。褪黑素的化学结构在下面示出：
实验中使用的动物为重280g的大鼠，并且在格兰纳达大学的生物医学研究中心的实验放射单位中在受控条件下对其进行电离辐射。对所述动物进行50戈瑞(Gy)的完全暴露。每天使用的辐射剂量为在100.75cGy/分钟，210千伏(kV)和12毫安(mA)下施用10Gy，并将动物放在距离辐射源40cm处。
如下向动物施加不同制剂。在辐射前于口腔中施加表面应用，在辐射后施加另一个表面应用，并且每8小时施加持续应用，维持21天。在开始辐射后21天处死所述动物，此时在经辐射而没有用褪黑素处理的动物中观察到最高等级的粘膜炎。在实验中使用的动物中使用的制剂如下：具有1％、3％或5％褪黑素的Pluronic F-127凝胶(每100ml凝胶中分别为1、3或5克褪黑素)，其在口腔中以每次500μl的体积每天表面施加3次，总计1.5ml/天。在口腔中的表面应用意指所述动物咽下施加于口腔中的凝胶。
而实验还通过将与3％w/v水凝胶使用的褪黑素浓度相同的褪黑素浓度通过腹膜内途径施用于动物，以了解血浆褪黑素是否可以减少粘膜炎或是否必须通过表面途径施加所述分子。对于肠胃外途径，使用包含70％v/v(体积/体积)等渗盐溶液和30％v/v丙二醇(相对于溶液总体积测量)的等渗溶液。注射45mg日剂量的褪黑素21天。像在口腔中通过表面途径施加褪黑素凝胶处理的动物那样，在开始辐射后21天处死所述动物。
还评价3％w/v褪黑素组合物对受到放射治疗之头颈癌患者的保护作用。所述研究为双盲研究(用3％w/v褪黑素凝胶处理的5位患者，和用无褪黑素的凝胶处理的5位患者)。使用上述凝胶500μl对所述患者进行每天3次的经口冲洗，即，所述患者接受总共45mg/天的褪黑素，其分散为15mg、一天3次的方案。所述患者将具有褪黑素的凝胶保持在其口腔中2分钟，然后将其咽下以使所述凝胶可以浸渍整个胃肠粘膜。在预定的访问中进行每周两次评价以确定口粘膜炎的目标等级(根据WHO的RTOG(Radiation Therapy Oncology Group，肿瘤放射治疗组)目标毒性标度)：等级0-4。
B.评价的参数
B.1.氧化损伤的标志物
-细胞膜和亚细胞膜氧化的评价(LPO)
氧自由基能够产生细胞损伤的非常重要的机制是通过细胞和线粒体膜二者的脂质过氧化作用。脂质过氧化作用的发生是由于自由基对多不饱和脂肪酸的作用。在细胞膜结构中的这些修饰引起其物理化学性质的变化，伴随渗透性的增加和功能的进行性丧失，这可导致接下来的细胞死亡。一直认为膜的脂质过氧化作用的量度是氧化应激指标的一个非常重要的参数。通过量化存在于样品中的丙二醛和4-羟烯醛(MDA+4-HDA)提供脂质过氧化作用(LPO)指数，这些为来自过氧化物分解的重要产物，所述过氧化物源自多不饱和脂肪酸和相关的酯。丙二醛和4-羟烯醛的浓度以及氢过氧化物的浓度提供脂质过氧化作用的合适指数。
B.2.抗氧化防御的评价
在细胞抗氧化系统中，一组酶负责在生理状况中净化细胞的自由基，这些酶基本上为：
-谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)：该酶使用还原型谷胱甘肽作为协同因子并除去过氧化氢(H2O2)。
-谷胱甘肽还原酶(GRd)：该酶将通过谷胱甘肽过氧化物酶活性产生之氧化型谷胱甘肽复原为还原型谷胱甘肽。
作为通过氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽(GSSG/GSH)相除的商获得的比值也是氧化还原态评价中的重要比值。
B.3.线粒体活性之标志物的评价
与自由基产生增加相关的线粒体功能障碍造成细胞死亡。因此，测量呼吸链传递复合物(I、II、III和IV)的活性以及所述复合物的表达是了解线粒体损伤的程度的基础。
B.4.线粒体和氧化应激：炎性体活化：
活性氧族(ROS)的产生在被辐射损伤的线粒体中增加，引起线粒体组分的氧化转变和线粒体转换孔(PTM)的开放。线粒体膜渗透代表在程序性细胞死亡途径活化中不可逆的点，以凋亡或坏死结束(Schroder K等，Cell.2010；140：821-832；Latz E，Curr.Opin.Immunol，2010；22：28-33.Epub2010)。
最近的研究显示线粒体也调节天然免疫应答(Kastner DL等，Eur JImmunol.2010；40：611-615)。已观察到在线粒体中产生的自由基负责活化细胞炎性机制，特别地，所谓的炎性体，例如NLRP3(NOD样受体家族，含有3的热蛋白结构域)(Zhou R等，Nature2011；469：221-226)。NLRP3是在免疫信使IL-1β的产生中以及炎症中介导的蛋白质复合物。
多种因子可以活化天然免疫应答，包括病原体或引起作为应激增加之结果的细胞损伤的分子。当NLRP3被活化时，其形成了由NLRP3、适配分子ASC(凋亡相关的含有胱天蛋白酶募集结构域的斑点样蛋白)以及前胱天蛋白酶1组成的多蛋白复合物。在细胞应激情况下，NLRP3募集ASC蛋白和前胱天蛋白酶1(其活化胱天蛋白酶-1)，引起一系列的细胞内反应(包括促炎细胞因子的活化)。
B.5.炎症反应和NF-κB
核因子κB(NF-κB)途径也参与炎症反应。与炎性体的不同之处为NF-κB途径通过在膜上的Toll样受体(Toll-like-receptor，TLR)活化，而炎性体通过胞质溶胶NOD样受体(NLR)(核苷寡聚化结构域样受体)活化，
NLR、NF-κB和NLRP3一起工作以活化促炎细胞因子(如IL-1β)。同时，所述细胞因子可诱发线粒体损伤并增加ROS产生，且ROS诱发线粒体DNA(mtDNA)的损伤和MTP开放，引起凋亡。
此外，NF-κB活化多种涉及炎症反应之基因的表达，例如环加氧酶2(COX-2)、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)和血管粘附分子(VCAM-1)。因此，辐射引起对凋亡有贡献的促炎分子的增加，并因此引起粘膜炎的发作。
B.6.凋亡的机制：
将调节凋亡的蛋白质分成抗凋亡蛋白(例如Bcl2(B-细胞淋巴瘤2))和促凋亡蛋白(例如Bax)。因此，Bax/Bcl2比值是非常重要的比值，因为其直接反映凋亡的水平。蛋白p53激活DNA修复酶以校正检测到的损伤。如果在DNA中的损伤是不可修复的，则为了防止含有异常DNA的细胞增殖，进入凋亡是保护的最终机制。p53活化促凋亡基因(例如BAX)的表达。
因此，线粒体ROS产生增加、在mtDNA的损伤和MTP开放的结果包括维持炎性过程，所以治疗靶向炎性体可以为用于在炎性疾病中使用新治疗的途径，所述炎性疾病不响应于抗炎药，如放射治疗诱发的粘膜炎发生的。
C.实施例1：在大鼠舌中获得的结果
C.1-在1％、3％和5％w/v凝胶中的褪黑素通过表面途径在口腔中使 用
由辐射引起的氧化应激造成细胞膜的损伤，其通过在膜脂质氧化的增加(相对于对照大于50％)反映出来(图1，p<0.001)。所述损伤表明辐射损伤这些组织引起粘膜炎。3％褪黑素完全逆转了放射治疗的作用，而1％褪黑素仅部分逆转了LPO水平。当使用大于3％的褪黑素浓度(例如5％)时，其在抵消氧化应激中与3％浓度具有相同的作用(图1)。
辐射还引起通过线粒体膜中LPO增加反映出的强线粒体损伤(图2)。所述线粒体损伤引起细胞死亡(等，Curr Top MedChem2010，11(2)：221-240)。当辐射的大鼠用褪黑素处理时，观察到在施加3％褪黑素时强效的抗氧化作用，完全逆转了放射治疗在线粒体中的作用(p<0.001)。目前无已知存在的分子能够发挥这些作用。然而，当施加1％褪黑素时，对抵消由辐射在线粒体中引起的氧化损伤无实质作用。当使用5％褪黑素浓度时，其在抵消线粒体氧化应激中具有与3％浓度相同的作用。
辐射还引起GSH水平非常显著的降低(p<0.001)(图3A)，而同时GSSG水平在舌线粒体中升高(p<0.001)(图3B)，引起总谷胱甘肽(GSH+GSSG)的增加(图3C)。所述变化反映线粒体氧化应激的显著增加，其是由辐射引起之不良作用的反映。GSS/GSH比值的增加(p<0.001)(图3D)(其是细胞内以及在这种情况下线粒体内氧化应激的最佳指数)支持辐射的这种有害作用。相应地，1％褪黑素的施用不能提高GSH的水平(图3A)以及降低GSSG的水平(图3B)，也不能使GSSG/GSH比值正常化(图3D)并因此中和氧化应激。当使用5％褪黑素浓度时，观察到其在抵消线粒体氧化应激中具有与3％浓度相同的作用，在两个情况下都完全逆转了辐射的作用。
当测量谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性时(图4A)，观察到因为响应产生过氧化物的增加而由辐射引起的活性的增加。3％褪黑素凝胶的施用部分抵消了辐射的作用。5％褪黑素具有与3％浓度相同的作用，而1％浓度不具有作用。
当测量谷胱甘肽还原酶(GRd)活性时(图4B)，同样观察到5％褪黑素具有与3％浓度相同的作用，而1％浓度不具有作用。线粒体GRd是易于被氧化应激抑制的酶，结果辐射下其活性显著降低(图4B，P<0.001)，作用通过施用3％和5％褪黑素二者而抵消(p<0.001)。
褪黑素这些作用的重要性除了基于上面提到的生物化学变化以外，还基于以下事实：线粒体氧化应激的减少转化为完全预防粘膜炎，在处理过的大鼠中未观察到其他病变类型(图5)。未包括用1％褪黑素凝胶处理动物的图像，因为所述浓度不具有作用。
因此，用于治疗粘膜炎的最小有效剂量对应于一天施加3次在凝胶中3％褪黑素浓度(每次施加500μl)，导致日剂量为45mg褪黑素。
C.2-施加3％w/v褪黑素凝胶与通过肠胃外途径施用相同褪黑素浓度 的比较
为确定对于逆转粘膜炎最合适的施用途径，比较相同剂量下(45mg一天)通过在口腔中表面途径施用3％褪黑素凝胶和通过腹膜内途径(i.p.)施用褪黑素。
观察到用凝胶施用褪黑素与通过肠胃外途径施用褪黑素的作用在许多关键方面不同，例如i.p.施用在恢复GSH和在还原GSSG中较低的功效(其维持了较高的GSSG/GSH比值)，表明比在施加凝胶后更大的线粒体内氧化应激(图6)。图6比较了在用3％凝胶和用褪黑素通过腹膜内途径处理之大鼠的大鼠舌中的谷胱甘肽水平。
关于线粒体谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)(图7)，结果表明由于辐射酶活性(图7A)和表达(图7B和7C)的增加，其为对产生之过氧化物的增加的响应。通过Western印迹进行蛋白质表达研究(7C)，且在所述Western印迹的密度测定法分析中观察到蛋白质之量的增加(图7B)，表明辐射下所述酶表达的增加。褪黑素的表面施用和腹膜内施用都部分地抵消了辐射的作用。
线粒体谷胱甘肽还原酶(GRd)(图8)沿着完全不同的途径。其是容易被氧化应激抑制的酶，结果在辐射下其活性(图8A)和表达(图8B和8C)显著降低。通过Western印迹进行蛋白质表达研究(8C)，且在所述Western印迹的密度测定法分析中观察到蛋白质之量在辐射下的减少(图8B)，表明所述酶表达的抑制。观察到褪黑素凝胶对恢复GRd的活性和表达的显著作用，而褪黑素的腹膜内施用不能恢复所述酶。如果GRd保持抑制，则线粒体不能抵消氧化损伤并促成细胞死亡。
辐射引起线粒体电子传递链复合物(基本为复合物I、II和IV)的抑制(图9A、9B和9D)。在复合物III中未观察到显著的变化(图9C)。当呼吸链复合物受损时，产生更多的自由基，呼吸链效率降低，产生较少的ATP，活化凋亡因子且凋亡增加。褪黑素凝胶在恢复复合物活性上比肠胃外施用更有效，甚至使活性增加超过对照值(图9)。
如对活性所发生的，辐射还抑制呼吸链复合物的表达，复合物I、III、IV和V表达的抑制(图10A、10B、10C、10D和10E)是非常显著的。Western印迹研究显示复合物I、III、IV和V蛋白质之量的减少，表明辐射下所述复合物合成的减少。褪黑素凝胶在恢复复合物表达上比肠胃外施用更有效。还可以观察到肠胃外施加完全不能恢复复合物V或ATP合酶(负责ATP合成的酶)的表达(图10D)。所述数据非常相关，因为如果抑制了复合物V，就没有ATP合成，因此细胞由于凋亡或坏死而死亡(Escames G等，Hum Genet，July,2011，DOI10.1007/s00439-011-1057)。根据示出的结果，3％凝胶组合物在再活化呼吸链复合物的表达上显著优于肠胃外途径。
发现辐射抑制舌中内源褪黑素水平。所述水平通过在口腔中以表面途径施用本发明组合物来恢复，有利于局部抗氧化作用。然而，以肠胃外施用褪黑素并不恢复舌中的这种水平(图11)。所述结果解释了为什么表面施用比褪黑素的肠胃外施用有效得多。
在分析宏观损害时清晰地观察到根据施用途径关于褪黑素作用功效的这些不同(图5和12)。事实上，在肠胃外施用褪黑素不能恢复辐射后的舌病变，而在口腔中的表面施加完全使舌的形态外观正常化。
C.3-关于炎性体活化、炎症反应和凋亡机制的数据
当通过测量PGC1α(过氧化物酶体增殖物活化受体γ共活化因子1-α)、NRF1(核呼吸因子1)和TFAM(转录因子A，线粒体)测量线粒体生物发生时，观察到辐射抑制PGC1α，然而NFR1和TFAM增加以补偿线粒体损伤(图13)。
发现辐射提高了NFκB的活性(提高在细胞核和胞质溶胶二者中的水平)(图14A和图14B)，并活化炎性体途径，使NLRP3、ASC和胱天蛋白酶-1增加(图15)。作为NFκB途径和炎性体途径活化的结果，促炎细胞因子IL-1和TNF-α增加(图16A和16B)。
线粒体损伤还包括凋亡的增加，伴随促凋亡蛋白p53(图17A)和Bax(图17B)的增加以及抗凋亡蛋白(如Bcl2)的减少(图17C)。因此，Bax/Bcl2比值和p53增加(图17D)，表明凋亡的显著增加。
这是首次证明线粒体损伤、炎性体活化和辐射诱发的粘膜炎的直接关系。
相应地，3％褪黑素凝胶的施用中和了氧化应激，增加了抗氧化酶的活性和表达，提高了线粒体功能，减少了降低NFκB(图14A和14B)和炎性体(图15)活性之自由基的产生。
因此，3％褪黑素凝胶显著抑制凋亡(图17D)，减少凋亡诱导蛋白(例如p53和Bax)(图17A和17B)并增加抗凋亡蛋白(例如Bcl2)的表达(图17C)。
此外，3％褪黑素凝胶增加线粒体生物发生，增加被辐射抑制的PGC1α。
所有这些转化成细胞存活的提高。此外，在口腔中通过表面途径施用凝胶恢复了褪黑素水平，有利于局部抗氧化作用。
然而，在用褪黑素肠胃外施用的舌中不恢复这些水平。所述结果解释了为什么表面施用比褪黑素的肠胃外施用有效得多。
组织学也显示了宏观损害。使用苏木精-伊红染色确定在所研究组织中组织病变的存在。Masson Goldner的三色染色(TRI)允许区分肌肉组织(其被染为红色)和结缔组织(其被染为绿色)。
在未处理的对照动物中，舌的组织结构没有变化。在丝状乳头在背区中存在以及其在腹区不存在的情况下，维持粘膜的多复层角化上皮。由结缔组织的小层和一些血管形成的固有层和粘膜下层处于粘膜之下。然后发现肌肉的层，其朝向不同方向并在束间具有少量结缔组织。用TRI染色清晰地示出结缔组织的这种缺乏，其中绿色染色的存在少量位于舌肌肉之间。
在经辐射的动物中，肌纤维之间存在结缔组织的增加(纤维化)，将它们分开。还存在血管充血和血管数的显著增加(血管发生)。与在对照动物中所观察到的不同，在此情况下，绿色染色的纤维化丰富得多。这在其中纤维已经被横向切割的肌肉层中尤其被观察到。
与在经辐射动物的舌中观察到的相比，在用褪黑素处理的动物中，观察到舌肌纤维之间纤维化和血管发生的减少。所述纤维结缔组织的减少通过TRI技术极好地显示，因为其被染成绿色，与染成红色的肌纤维完美地区分。关于两种处理之间的差异，3％褪黑素凝胶比肠胃外施用更好地起作用，因为纤维化少得多。
辐射的所有这些作用导致可通过电子显微术观察到的线粒体损伤。在经辐射的动物中，可以观察到线粒体空泡化以及其内含物丧失的破碎线粒体，引起自由基和炎症反应的增加。
在用凝胶处理的动物中，未观察到破碎的线粒体并且空泡消失。然而，在用褪黑素通过肠胃外途径处理的大鼠中观察到破碎的线粒体，如在未处理的动物中观察到的。
因此，已经首次证明褪黑素允许保护受到放射治疗的胃肠粘膜，预防由所述辐射引起的病变(例如粘膜炎)，并治愈所述病变，通过表面途径施用比肠胃外施用更有效。褪黑素这些作用的重要性基于线粒体损伤的减少，其转化为粘膜炎的完全预防，在处理的大鼠中于宏观水平或微观水平下未观察到任何病变。
D-实施例2：在人中获得的结果：
用3％褪黑素凝胶治疗的患者更好地经受放射治疗，不需要用阿片样物质治疗。这些患者都不需要鼻胃管，没有人住院且没有人不得不中断治疗。没有用褪黑素治疗的患者都需要大量阿片样物质并且他们都形成最大等级的放射性皮炎。一些不得不住院，中断治疗。
E-本发明实施例的结论：
包含1％褪黑素的药物组合物不能逆转由放射治疗引起的粘膜炎。然而，包含3％褪黑素的药物组合物完全逆转由放射治疗引起的粘膜炎，如用包含5％褪黑素的组合物所发生的。所述结果证明了包含3％至5％褪黑素的组合物在由放射治疗引起的粘膜炎之副作用的治疗中的有效性。
本文显示的结果证明在粘膜炎中存在线粒体损伤，因此本治疗的成功基于褪黑素凝胶的经口施加，其浸渍粘膜并逆转线粒体损伤。任何其他类型的褪黑素施加对于粘膜炎不具有清楚的作用，这可能由于以下事实：褪黑素被快速吸收，具有非常短的半衰期(30分钟)且在口腔和胃肠道二者的粘膜中未达到充足的治疗水平。然而，包含Pluronic F-127和3％或更高浓度下褪黑素凝胶的本发明组合物浸渍粘膜，达到有效的局部浓度，允许褪黑素进入线粒体并在整个胃肠道上发挥其作用。
因此，这些用于在口腔中表面施加含有适于针对在放射治疗期间由辐射引起的严重损伤保护皮肤和粘膜之剂量的药物制剂具有巨大的临床利益。已发现肠胃外施用褪黑素相对于在口腔中表面施用对于治疗和/或预防粘膜炎未提供任何好处，具有附加价值的是长期肠胃外施用对这些患者是创伤性的，表面施用凝胶舒适得多。
线粒体在控制细胞存活中起重要作用，并且本文已经首次证明线粒体功能障碍很大程度上参与粘膜炎的病理生理(参见结果)。线粒体功能障碍与粘膜炎的恶化相关联。已经首次发现在来自患有粘膜炎之大鼠的舌线粒体中，除了生物能不足之外，还存在谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的增加，谷胱甘肽还原酶(GRd)的减少和氧化型谷胱甘肽(GSSG)/还原型谷胱甘肽(GSH)(GSSG/GSH)比值的提高。后者为细胞内和线粒体内氧化应激的准确标志物。
本发明证明在本发明组合物包含的浓度下的褪黑素完全减少了粘膜炎中的线粒体氧化应激，提高线粒体抗氧化酶(主要是GRd)的活性。同时，呼吸链复合物的活性和表达增加，其在粘膜炎中被抑制。本发明的组合物具有抗氧化和抗炎作用，所述作用是较低浓度的组合物不具有的。3％至5％褪黑素(在100ml最终组合物中3至5克褪黑素)的表面和经口施加预防了由电离辐射损伤之粘膜的细胞功能的损害。
另外，在口腔中通过表面施加褪黑素凝胶比肠胃外施用对于粘膜炎更有效，其可能是由于以下事实：在口腔内以合适制剂施加在口腔中(并且引申为在胃肠道中)使较高褪黑素水平维持较长的时间段，其促进局部抗氧化和抗炎作用，并基本上在线粒体内作用，预防组织损伤，并因此预防粘膜炎发作。因此，在口腔中表面施加3％至5％褪黑素提供了对这些病理的强效防御体系。已经证明本发明的组合物允许保护受到放射治疗的胃肠粘膜，预防所述辐射引起的病变(例如粘膜炎)，并治愈所述病变。获得的结果可以外推到化学治疗。

Claims (22)

1.组合物在制备用于治疗和/或预防粘膜炎的药物组合物中的用途，所述组合物包含：通式(I)的化合物
或其盐、前药和溶剂化物，
其中：
“n”为1至4的整数；
R1和R3为相同的或不同的、直链或支链(C1-C4)烷基基团；并且
R2为氢、直链或支链(C1-C4)烷基基团、-C(＝O)O-Ra基团或-C(＝O)-N(H)-Ra基团；其中Ra为直链或支链(C1-C4)烷基基团，
其中所述化合物的浓度为2.5％至5％w/v。
2.根据权利要求1所述的用途，其中R1和R3为相同的或不同的(C1-C2)烷基基团。
3.根据权利要求2所述的用途，其中R1和R3为甲基基团。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中n为1。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中R2为氢。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述化合物为褪黑素。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述化合物的浓度为3％w/v。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途，其中所述粘膜炎由放射治疗和/或化学治疗引起。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途，其中所述粘膜炎为口腔粘膜炎、咽粘膜炎、食道粘膜炎、胃粘膜炎或肠粘膜炎。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用途，其中所述粘膜炎为口腔粘膜炎。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的用途，其中所述粘膜炎在人中。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的用途，其中所述组合物还包含至少一种可药用赋形剂或辅剂。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的用途，其中所述组合物还包含胶凝剂。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述胶凝剂选自包含聚乙烯和聚丙烯共聚物、纤维素以及瓜尔胶的列表。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的用途，其中所述组合物还包含至少一种防腐剂。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的用途，其中所述组合物还包含抗氧化剂。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的用途，其中所述组合物还包含可药用载体。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的用途，其中所述组合物处于适合于表面、经口、腹膜内、皮内或皮下施用的剂型中。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述组合物处于适合于表面施用的剂型中。
20.根据权利要求19所述的用途，其中施用的日剂量为37.5mg至75mg。
21.根据权利要求20所述的用途，其中施用的日剂量为45mg。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述剂量以15mg、一天3次的方案施用。
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