CN112689624B - 萝卜硫素-褪黑激素类化合物 - Google Patents

Abstract

公开了一种组合物，其包含化合物并且该化合物包含6‑羟基褪黑激素和6‑甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯的偶联物或由其组成，以及该组合物用作药物的用途。此外，公开了该组合物在治疗和/或预防上皮组织疾病和/或病症的方法中的应用。

Description

萝卜硫素-褪黑激素类化合物

发明领域

本发明涉及药物领域，更具体地说，涉及用于治疗皮肤和/或粘膜病症的药物组合物领域。更具体地，本发明涉及在治疗和/或预防皮炎和/或粘膜炎的方法中使用的组合物，涉及相关的组合物，并且涉及用作药物的相关的组合物。

发明背景

皮炎和/或粘膜炎可能是由氧化应激引起的，例如由于暴露于电离辐射引起的氧化应激。例如，放射疗法或放疗(RT)是一种治疗方式，其中将电离辐射应用于控制和/或杀死恶性细胞，例如在癌症治疗中或作为癌症治疗策略的一部分。人也可能会暴露于大剂量的自然发生的电离辐射，例如可能会在太空旅行中遇到，或者可能会意外地暴露于大剂量的电离辐射，例如在核设施发生故障或无法屏蔽放射源的情况下，例如在医院，无损检测设备或放射性同位素热电发生器中。

在放射疗法中，电离辐射可用于杀死癌细胞和/或缩小几乎所有已知类型的实体瘤中的肿瘤，包括脑癌，乳腺癌，子宫颈癌，喉癌，肺癌，胰腺癌，前列腺癌，皮肤癌，脊柱癌，胃癌，子宫癌和软组织肉瘤。放射线还可用于治疗白血病和淋巴瘤。在没有治愈方法的情况下，放射疗法可以用作姑息治疗用于局部控制肿瘤或症状缓解，或者可以用作延长患者寿命的治疗方法。

但是，放射疗法的应用并不一定限于癌症治疗，例如可用于治疗三叉神经痛，动静脉畸形，甲状腺眼病，翼状胬肉，以及预防瘢痕疙瘩生长或异位骨化。也可以在骨髓移植之前进行全身照射。此外，热疗或深层组织加热常与放射线结合使用，以增加大肿瘤或晚期肿瘤对治疗的反应性。例如，可以通过热疗法和放射疗法的组合来治疗体内的晚期和/或大肿瘤。通过将深层组织暴露于43℃至50℃范围内的温度，可以破坏体内相当深的癌组织，这可能导致皮肤灼伤。

不幸的是，由于放射疗法对健康细胞，特别是毛囊、表皮和粘膜内的上皮细胞群(包括干细胞)具有诱导毒性，使用这种疗法会带来严重的副作用。放射疗法通过破坏靶组织中细胞的DNA，改变信号转导途径和诱导细胞凋亡来破坏靶组织中的细胞。放射疗法的细胞毒性作用与可引起DNA电离的电子能级的增加以及活性氧物质(ROS)的产生有关，所述活性氧物质包括超氧阴离子自由基，过氧化氢和羟基自由基，这些物质可能会破坏细胞，蛋白质和DNA。细胞对放射的反应尤其取决于放射的类型，能量和剂量以及组织的特异性灵敏度。然而，由于物理和几何约束，所递送剂量的很大一部分也将沉积在健康组织中。

放射治疗通常带来短期副作用，包括皮肤红斑，刺激和炎症，以及中长期和长期副作用，如水肿，疼痛，纤维化和浅表血管扩张(毛细血管扩张)。放射疗法用于治疗乳房切除术后的胸壁，头颈部肿瘤和皮肤肿瘤可能会引起急性反应并严重损害皮肤和粘膜。皮肤反应可能会有所不同，从急性红斑到脱皮和坏死。类似地，口腔、喉咙、食道、气管、肠、膀胱和直肠的粘膜也可能受损。电离辐射治疗后，口腔酸痛和溃疡是患者的常见症状。由于在产生唾液或粘液的副腺中感觉到放射的急性作用，因此副作用还包括口干燥症(口干)，眼干燥症(干眼)以及阴道和肛门粘膜干燥。

长期并发症通常可能发生在较高剂量的放射下(例如超过35Gy)。在几个月或几年的过程中可能出现的后期副作用包括组织疤痕(例如由于结缔组织的增加)，继发性癌症，例如乳腺癌，胃癌，肺癌和黑色素瘤(可能在靠近受辐照区域的身体区域发生)，以及甲状腺疾病。

放射诱发的皮炎或放射性皮炎是众所周知的且痛苦的副作用，已知在大多数放射治疗患者中都会发生。此外，热疗也可能诱发皮炎，放疗和热疗相结合可以大大提高皮炎的风险和严重性。

放射性皮炎的严重程度可能会有所不同，具体取决于治疗方法和患者固有因素。大多数急性放射性皮炎反应会在几周后消失，但有些反应会持续并可能导致并发症。迟发性放射性皮炎的特点是在萎缩和脆弱的皮肤上形成毛细血管扩张，这会导致裸露的组织发炎并严重影响表皮屏障功能。

粘膜炎是癌症治疗的另一重要且高代价的副作用。作为粘膜表面的炎症，粘膜炎是化学疗法和/或放射疗法的常见，潜在的严重并发症。它可以表现为红斑，脱皮，溃疡形成，出血和渗出液。从口腔到肠和直肠，整个胃肠道和泌尿生殖道都可能存在粘膜炎。

通常认为，放射性皮炎和粘膜炎均源于化学疗法或放射疗法对DNA复制以及表皮和粘膜干细胞增殖的直接抑制作用。这些事件的发生与引起DNA电离的电子能级的增加以及活性氧物质(ROS)的产生有关，所述活性氧物质包括超氧阴离子自由基，过氧化氢和羟基自由基，它们会破坏细胞、蛋白质和DNA，导致基底上皮的再生能力降低，表皮和粘膜萎缩，胶原蛋白分解和溃疡。次生效应是保护性表皮和粘膜屏障破裂后许多病原体的感染。

放射性皮炎和粘膜炎都可能对伴随和随后的治疗方案，尤其是对患者的生活质量产生重大不利影响，因为其可以导致营养异常，全身感染增加，使用麻醉剂减轻疼痛和推迟癌症治疗。因此，就质量调整生命年(QALY)而言，此类病症也可能对治疗后预后产生不利影响。

目前，针对这些病理的治疗选择非常有限。然而，尽管没有足够的证据来形成预防和/或减轻放射性皮炎和粘膜炎的权威性建议，但是已经取得了一些进展。例如，使用低水平激光疗法(LLLT)或血管激光来控制放射性皮炎的症状似乎是有益的。最近的一些临床前和临床研究表明，LLLT具有生物刺激特性，可使组织更快再生和愈合，减少炎症并预防纤维化。而且，在迟发性放射性皮炎中，脉冲染料激光治疗已表明在清除放射引起的毛细血管扩张方面是有益的。

当前用于粘膜炎的治疗包括应用卫生基本原则以及局部麻醉剂和/或全身镇痛剂以减轻疼痛，努力使症状最小化。但是，这些方法不能解决放射性皮炎和/或粘膜炎的根本原因。

无论是否需要有效治疗作为癌症治疗副作用的皮炎和/或粘膜炎，在放射疗法之后或期间和/或在存在化学治疗剂的情况下，成功实施能促进正常细胞常规生长和增殖的保护性疗法可以使更高剂量，更激进的癌症治疗成为可能。因此，这些保护性疗法不仅可以解决癌症及其治疗的副作用，甚至可以改善当前癌症疗法的治疗功效。

WO 2012/142511公开了抗炎和细胞外基质稳定的正分子组合物及其药物制剂。这些组合物包括多种植物化学活性的营养化合物，其中包括萝卜硫素和褪黑激素。公开了预防和治疗应用，例如用于治疗急性或长期炎症介导的病症并稳定哺乳动物细胞外基质。

WO 2012/122295描述了包含多种营养和非化学治疗药物组分的组合物，其中包括萝卜硫素和褪黑激素，以及用于治疗胰腺癌的相关方法。

WO 2009/051739描述了与Nrf2诱导剂(例如萝卜硫素)的局部使用有关的方法和组合物，用于保护皮肤和粘膜免受放射疗法的不良副作用。

US 2014/243384涉及以2.5％至5％w/v的比例包含褪黑激素或其衍生物的组合物在制备用于治疗和/或预防(例如口腔)粘膜炎(例如由放疗和/或化疗引起的)的药物组合物中的用途。

DUNAWAY SPENCER等人在“天然抗氧化剂：保护皮肤免受阳光辐射的多种机制(Natural antioxidants:multiple mechanisms to protect skin from solarradiation)”(《药理学前沿(FRONTIERS IN PHARMACOLOGY)》，2018年，卷9,392，第1-14页)中描述了天然植物产物(包括萝卜硫素和褪黑激素)进行光保护的多种机制。

TALALAY P等人在“萝卜硫素调动细胞防御能力，保护皮肤免受紫外辐射的伤害(Sulforaphane mobilizes cellular defenses that protect skin against damage byUV radiation)”(美国国家科学院院刊(PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OFSCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA,NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES,US)，卷104,44号，第17500-17505页)中公开了局部施用西兰花芽中富含萝卜硫素的提取物的紫外辐射防护作用。

WO 97/06779公开了用于皮肤防晒的化妆品局部用组合物。该组合物包含褪黑激素或其类似物。

发明内容

本发明的实施方式的一个目的是提供一种用于治疗上皮组织疾病的良好、有效率、有效和/或负担得起的药物，所述上皮组织疾病例如影响上皮细胞的疾病，例如那些衬在口腔，胃肠道和/或泌尿生殖道内的上皮细胞，和/或皮肤的上皮细胞，包括毛囊和表皮。

本发明的实施方式的优点在于，相对于本领域中已知的现有方法，在治疗这种上皮组织疾病中可以实现更高的有效性，并且易于施用。

本发明的实施方式的优点在于，可以去除，减轻和/或预防放射疗法和/或化学疗法的副作用。

本发明的实施方式的一个优点是该组合物可以有利地(和协同地)增强肿瘤细胞的放射敏感性以及保护健康的上皮细胞免受由放射引起的氧化应激(或帮助从中恢复)。

本发明的实施方式的一个优点是提供了用于预防和治疗影响上皮细胞的疾病的安全且有效的药物和方法，其可以减少癌症治疗的副作用，例如放射性皮炎和粘膜炎。

本发明实施方式的一个优点是可以将有效的且无毒的诱导NF-E2相关因子2(Nrf2)的化合物施用于高危非肿瘤组织，例如通过局部、口服或其他给药方法进行施用，因此可以减少，甚至中和有害的氧自由基形成，例如在放射治疗期间或之后。

实施方式的一个优点是，组合物可以被认为是局部作用制剂，例如当局部施用时。

实施方式的一个优点是提供了具有明显的抗氧化活性的组合物。

实施方式的一个优点是提供了一种组合物，其可以使受辐照的组织中的氧化还原过程正常化，阻碍细胞膜中脂质的过氧型氧化过程发生以及它们的分解，防止表皮和亚细胞结构的细胞发生结构变化，降低毛细血管的通透性，表现出解毒作用，促进组织代谢的正常化和/或刺激再生过程。

实施方式的一个优点是提供了低毒性和/或不具有诱变，胚胎毒性和/或致癌特性的组合物。

实施方式的一个优点是，提供了一种对肿瘤组织不提供放射防护作用的组合物(例如，当与放射疗法和/或化学疗法组合，例如用于治疗其副作用时，可能是特别有利的)。

实施方式的一个优点是提供了一种组合物，该组合物被快速代谢为氧化态并从生物体中清除。

上述目的是通过使用的组合物和根据本发明的组合物来实现的。

在第一方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包含萝卜硫素或萝卜硫素类似物和褪黑激素或褪黑激素类似物的化合物，该组合物用于治疗和/或预防上皮组织疾病和/或病症的方法，例如用于治疗和/或预防皮炎和/或粘膜炎的方法。换句话说，该化合物可以是萝卜硫素(或萝卜硫素类似物)和褪黑激素(或褪黑激素类似物)的偶联物(conjugate)，即通过至少将萝卜硫素(或萝卜硫素类似物)和褪黑激素(或褪黑激素类似物)连接在一起所形成的化合物。该化合物包含6-羟基褪黑激素和6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯的偶联物，或由其组成，例如可以包含通过将至少6-羟基褪黑激素和6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯连接在一起所形成的化合物或由其组成。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，所述用途可以是在治疗放射诱发的皮炎和/或放射诱发的粘膜炎的方法中的用途。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，所述用途可以是在治疗放射疗法和/或化学疗法的副作用的方法中的用途。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，所述用途可以包括所述组合物的局部施用。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，这种局部施用可包括在皮肤和/或粘膜上施用该组合物。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，所述用途可以包括组合物的口服，粘膜，皮下，肌内和/或肠胃外施用。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，该组合物还可以包含增溶剂，皮肤渗透促进剂，防腐剂，保湿剂，胶凝剂，缓冲剂，表面活性剂，乳化剂，润肤剂，增稠剂，稳定剂，湿润剂，分散剂和/或其任何组合。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，所述组合物可以还包含载体和/或赋形剂，以促进该组合物在体内或在体表上的摄取。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，载体和/或赋形剂可以包含无毒的填充材料，即对人类有机体基本上无毒的填充材料。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，载体和/或赋形剂可包含稀释剂。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，载体和/或赋形剂可包含用于至少暂时包封化合物的包封材料。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，载体和/或赋形剂可包含脂质体。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，所述组合物可以还包含抗生素，抗细菌剂和/或抗真菌剂。

在第二方面，本发明涉及包含化合物的组合物，其中该化合物包含6-羟基褪黑激素和6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯的偶联物或由其组成。

在第三方面，本发明涉及根据本发明第二方面的实施方式的组合物作为药物的用途。

在所附的独立和从属权利要求中陈述了本发明的特定和优选方面。来自从属权利要求的特征可以适当地与独立权利要求的特征以及其他从属权利要求的特征相结合，而不仅是权利要求中明确提出的。

本发明的这些和其它方面将参考下文所述的实施方式披露并阐明。

附图简要说明

图1示出了在举例说明本发明的实施方式的实例中，在小型猪的背部皮肤上施加聚焦γ放射的放射损伤。

图2示出了图1的实例的示意图，用于说明本发明的实施方式。

图3示出了图1和图2的实例的结果，示出了用载剂和用根据本发明实施方式的组合物处理的猪在辐照之前，辐照后7、21和35天的皮肤外观的图片。

图4示出了在说明本发明实施方式的图1和图2的实例中，辐照后猪的临床评分随时间的变化。

图5示出了在用载剂和用根据本发明实施方式的组合物处理的猪在辐照后35天的组织学皮肤变化。用苏木精和曙红染色并以400x的放大倍数获取图像。

图6示出了用载剂和用根据本发明实施方式的组合物处理的小型猪的皮肤中基底细胞密度随时间的变化。(*p<0.05和**p<0.01与经载剂处理的被辐照的动物相比)

图7示出了辐照后，用载剂和用根据本发明实施方式的组合物处理的小型猪的皮肤的表皮厚度随时间的变化。(*p<0.05和**p<0.01与经载剂处理的被辐照的动物相比)

图8至图14示出了在用根据本发明实施方式的组合物处理的猪在辐照后，皮肤中环氧合酶(COX)-2的表达降低。用苏木精复染并以400x的放大倍数获取图像。

图8示出了放射暴露之前皮肤中的COX-2表达。

图9，图10和图11分别显示了在辐照后7、21和35天，载剂处理的小型猪的皮肤中的COX-2表达。

图12，图13和图14分别显示了在辐照后7、21和35天，用根据本发明实施方式的组合物处理的小型猪的皮肤中的COX-2表达。

图15至图21示出了在用根据本发明实施方式的组合物处理的猪在辐照后，皮肤中核因子(NF)-κB的表达降低。用苏木精复染并以400x的放大倍数获取图像。

图15示出了放射暴露之前皮肤中的NF-κB表达。

图16，图17和图18分别显示了在辐照后7、21和35天，载剂处理的小型猪的皮肤中的NF-κB表达。

图19，图20和图21分别显示了在辐照后7、21和35天，用根据本发明实施方式的组合物处理的小型猪的皮肤中的NF-κB表达。

图22至图27分别针对用载剂处理的情况和用根据本发明实施方式的组合物处理的情况，显示了上述实例的小型猪在聚焦放射之前，辐照后3、7、21和35天的外周血计数。图22示出了血细胞的数量，图23显出了中性粒细胞的计数，图24示出了嗜酸性粒细胞的计数，图25示出了淋巴细胞的计数，图26示出了红细胞的计数，图27示出了血小板的计数。显示平均值的平均值±标准误差。

图28示出了在上述实例中，在辐照后三天，由根据本发明实施方式的组合物刺激的活检病变的伤口愈合。从左至右，分别显示了活检后32天未辐照的活检病变的外观，与载剂处理相结合的辐照后35天的活检病变的外观，以及与使用根据本发明实施方式的组合物处理相结合的辐照后35天的活检病变的外观。

图29示出了用载剂处理的猪和用根据本发明实施方式的组合物处理的猪在辐照后，皮肤中活检伤口随时间的变化(以临床量表评分)。6OHM-6-HITC施用会影响皮肤中活检伤口的形成。显示平均值的平均值±标准误差。

图30示出了在用于说明本发明实施方式的第二实例中，X射线辐照后小鼠的体重随时间的变化。

图31示出了在用于说明本发明实施方式的第二实例中，X射线辐照后的生存时间过程。

图32示出了在用于说明本发明实施方式的第二实例中，口腔粘膜炎的平均值±SEM临床评分(n＝10)。在第0天用20Gy辐照小鼠的舌头。*p<0.05，与对照值明显不同(Steel–Dwass测试)。

图33示出了在用于说明本发明实施方式的第二实例中，各组在第0天至第12天之间口腔粘膜炎总评分的平均值±SEM值。*p<0.05，与对照值明显不同(Steel–Dwass测试)。

图34示出了在用于说明本发明实施方式的第二实例中，X射线辐照后舌标本的组织学照片。舌标本用10％福尔马林缓冲液固定并包埋在石蜡中。将切片(3mm)用苏木精和曙红染色(×200)。a：完整，b：对照(口腔粘膜炎)，c：6OHM-6-HITC 30mg/kg，d：6OHM-6-HITC300mg/kg。

图35示出了在用于说明本发明实施方式的第二实例中，X射线辐照后舌标本的组织学照片。舌标本用10％福尔马林缓冲液固定并包埋在石蜡中。通过TUNEL染色评估凋亡细胞(×400)。a：完整，b：对照(口腔粘膜炎)，c：6OHM-6-HITC 30mg/kg，d：6OHM-6-HITC300mg/kg。

图36示出了在用于说明本发明实施方式的第二实例中，TUNEL染色后观察到的凋亡百分比。*p<0.05，与对照值明显不同(Steel–Dwass测试)。

图37示出了在用于说明本发明实施方式的第二实例中，根据本发明实施方式的组合物对患有口腔粘膜炎的小鼠舌中的髓过氧化物酶(MPO)活性(单位)的影响。*p<0.05，与对照值明显不同(Steel–Dwass测试)。

图38示出了在用于说明本发明实施方式的第二实例中，根据本发明实施方式的组合物对确定患有口腔粘膜炎的小鼠舌中的2-硫代巴比妥酸反应性物质(TBARS)活性(单位)的影响。*p<0.05，与对照值明显不同(Steel–Dwass测试)。

所述附图仅为示意性而不具限制性。在附图中，一些元件的尺寸可能被夸大且未按比例绘制以用于说明目的。

权利要求书中的任何附图标记不应理解为限制本发明的范围。

具体实施方式

将就具体实施方式并参照某些附图对本发明进行描述，但本发明并不受此限制，仅由权利要求书限定。描述的附图仅是示意性的且是非限制性的。在附图中，一些元件的尺寸可能被夸大且未按比例绘制以用于说明目的。所述尺寸和相对尺寸不与本发明实践的实际减小相对应。应注意，权利要求中使用的术语“包含”不应解释为被限制为其后列出的部分，其不排除其它元件或步骤。因此，其应被理解为指出所述特征、整体、步骤或组分的存在，但这并不排除一种或多种其它特征、整体、步骤或组分或其组合的存在或添加。说明书中提及的“一个实施方式”或“一种实施方式”表示连同实施方式描述的具体特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，在说明书中各处出现的短语“在一个实施方式中”或“在一种实施方式中”不一定全部指同一个实施方式，但可能全部都指同一个实施方式。此外，具体特征、结构或特性可以任何合适方式在一个或多个实施方式中组合，这对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。类似地，应理解，在本发明的示例性实施方式的描述中，本发明的不同特征有时在单一实施方式、附图或其说明中集合在一起，这是为了简化公开内容并帮助理解本发明的一个或多个不同方面。然而，本公开内容中的方法不应被理解为反映以下意图：请求保护的本发明需要比各权利要求中明确引用的具有更多的特征。并且，如同所附权利要求所反映的那样，发明方面包括的特征可能会少于前述公开的一个单一实施方式的全部特征。因此，所附权利要求书将被明确地纳入该具体说明，并且各权利要求本身表示本发明的一个独立实施方式。此外，当本文所述的一些实施方式包括一些但不包括其它实施方式中所包括的其它特征时，不同实施方式的特征的组合应意在包括在本发明范围内，并且形成不同的实施方式，这应被本领域技术人员所理解。例如，在所附的权利要求中，所请求保护的任何实施方式可以任何组合形式使用。本文的描述中阐述了众多的具体细节。然而应理解，本发明的实施方式可不用这些具体细节进行实施。在其它情况中，为了不混淆对该说明书的理解，没有详细描述众所周知的方法、结构和技术。

在第一方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包含萝卜硫素(sulforaphane)或萝卜硫素类似物(例如合成萝卜硫素类似物)和(例如融合(fused)或结合的)褪黑激素或褪黑激素类似物(例如合成褪黑激素类似物)的化合物，该组合物用于治疗和/或预防上皮组织疾病和/或病症的方法，例如用于治疗和/或预防皮炎和/或粘膜炎的方法。换句话说，该化合物可以是萝卜硫素(或萝卜硫素类似物)和褪黑激素(或褪黑激素类似物)的偶联物，即通过至少将萝卜硫素(或萝卜硫素类似物)和褪黑激素(或褪黑激素类似物)连接在一起所形成的化合物。该化合物包含6-羟基褪黑激素和6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯的偶联物，或由其组成，例如可以包含通过将至少6-羟基褪黑激素和6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯连接在一起所形成的化合物或由其组成。

萝卜硫素是硫代葡萄糖苷萝卜硫苷(也称为萝卜硫素硫代葡萄糖苷(SGS))的糖苷配基分解产物。萝卜硫素的分子式为C₆H₁₁NOS₂，其分子量为177.29道尔顿。萝卜硫素也称为4-甲基亚磺酰基丁基异硫氰酸酯和(-)-1-异硫氰酸根基-4(R)-(甲基亚磺酰基)丁烷。萝卜硫素的结构式为：

提及萝卜硫素类似物通常可以指异硫氰酸酯，例如6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯。萝卜硫素类似物可指异硫氰酸酯家族的任何代谢产物，或其合成衍生物。萝卜硫素类似物可以从至少一种含异硫氰酸酯的植物或蔬菜的提取物中获得，或者可以是合成的。

褪黑激素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)是一种经过修饰的色氨酸，可以通过5-羟色胺的乙酰化和甲基化来合成。褪黑激素的结构式为：

在特定实例中，提及褪黑激素类似物可指6-羟基褪黑激素。褪黑激素类似物可以指褪黑激素的任何代谢产物或其合成类似物。

根据实施方式使用的组合物可以通过激活NF-E2相关因子2(Nrf2)II期酶来减少活性氧物质(ROS)和炎症。特别地，该化合物可以通过激活Nrf2/Keap1/ARE途径而特异性地靶向自由基的中和。该化合物可以具有多效作用，例如，可以靶向多种基因和/或相关途径，从而通过褪黑激素(类)和萝卜硫素(类)特性的协同作用达到令人惊讶的有效作用。

在用于治疗皮炎和/或粘膜炎的方法中的用途可以指对动物的治疗，例如对哺乳动物，例如人的治疗。该治疗不一定是诊断出皮炎和/或粘膜炎之后的治疗，而是还可以指在考虑到皮炎和/或粘膜炎的未来发展的预判的情况下的预防性治疗。例如，该组合物可用于治疗患有既往病症的患者或用于易患皮肤或粘膜疾病或病症的对象。例如，该组合物可用于减轻患者的放射治疗症状，或作为此类患者的预防措施。

所述组合物有利地对由放射相关因素引起的皮炎和粘膜炎具有治愈作用(但不必限于此)，具有有利的长作用持续时间，并且可以认为是安全的，例如，无毒副作用。此外，治疗可以有利地短并且可以迅速生效，并且可以广泛地用于皮肤损伤和炎症以及放射疗法引起的皮炎和粘膜炎的临床治疗。包含药物化合物的组合物可以有利地保护经历电离辐射治疗的对象的皮肤和粘膜。

皮炎和/或粘膜炎可以指对皮肤或粘膜的损害或皮肤或粘膜的疾病，这对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以包括其中涉及氧化应激作为原因或实质性致病因素的皮肤和粘膜的任何异常。放射可能与此类损害或疾病的病因有关。该组合物可用于治疗的损害或疾病的实例包括但不限于急性红斑，皮肤刺激，炎症，水肿，脱皮，皮肤坏死，口腔酸痛和溃疡，疼痛，纤维化，毛细血管扩张，口干，干眼病，阴道粘膜干燥，乳腺癌，胃癌，肺癌，黑色素瘤和甲状腺疾病。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，所述用途可以是在治疗放射诱发的皮炎和/或放射诱发的粘膜炎的方法中的用途。在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，所述用途可以是在治疗放射疗法和/或化学疗法的副作用的方法中的用途。根据本发明实施方式的用途的组合物可以是用于预防和/或治疗放射疗法引起的皮炎和/或粘膜炎的药物组合物。

该药物组合物可用于预防和/或治疗皮肤放射性灼烧病变，例如由电离和/或非电离辐射引起的皮肤放射性灼烧病变。例如，该组合物可用于局部保护患者的皮肤和粘膜免受放射疗法的毒性副作用，和/或用于预防。当局部应用(但不一定限于局部应用)于患者暴露于电离辐射的身体区域和/或周围区域时，该组合物可以通过诱导Nrf2 II期酶来保护接受电离辐射治疗的患者的皮肤和粘膜。

例如，根据本发明实施方式的用途的待治疗的对象可能遭受电离辐射治疗的短期或长期影响。该对象可能受到以下病症的影响：急性红斑，皮肤刺激，炎症，水肿，脱皮，皮肤坏死，口腔酸痛和溃疡，疼痛，纤维化，毛细血管扩张，口干，干眼症，阴道或直肠粘膜干燥和刺激，黑色素瘤，乳腺癌，胃癌，肺癌或甲状腺疾病。

因此，本发明的实施方式可以具体涉及根据本发明实施方式的组合物用于治疗上文提及的任何状况和/或疾病和/或用于治疗其任何组合。

然而，待治疗的对象也可能几乎没有或没有症状，例如，可以使用根据本发明实施方式的用途的组合物进行治疗，以防止皮肤放射性灼伤病变。该组合物可以有利地具有低毒性，并且可以有利地在保护皮肤免受电离和非电离辐射中提供高功效。由于增加了对较高剂量的耐受性，这还可以使得能够在放射治疗中使用较高的放射剂量，和/或可以使得能够采用更激进的分级方案，例如，其中相同或相似的剂量以较少的级数递送和/或连续剂量级数递送之间的延迟较短。

然而，本发明的实施方式不必限于与放射疗法的副作用有关的用途，例如可以同等地用于治疗非放射引起的氧化应激导致的皮炎和/或粘膜炎。尽管放射疗法可引起高水平的急性氧化应激，但已知可能引起皮炎和/或粘膜炎的多种其他氧化应激来源。例如，氧化应激可能在许多皮肤疾病以及皮肤老化中起作用。例如，特应性湿疹或特应性皮炎(AD)是一种慢性复发性炎症性皮肤病，其中可能涉及氧化应激，并伴有诸如免疫失调和超敏反应的遗传易感性等因素。在另一个例子中，皮炎或粘膜炎可以由热疗引起(或被热疗促进)。

氧化应激是指在细胞中，即在本公开上下文的皮肤或粘膜中，(急性或慢性地)相对于这些细胞的抗氧化防御能力而言过量地形成氧化剂。在正常的代谢活动中会产生自由基，活性氧物质(ROS)和氮氧物质(NOS)之类的氧化剂，用于应对这些氧化剂的细胞防御机制可能会变得超负荷，所述细胞防御机制例如是酶基系统(例如过氧化物还原蛋白)和非酶基系统(例如，可能依赖特定的维生素，谷胱甘肽，辅酶Q10和其他抗氧化剂)。如果控制不当，氧化剂会与细胞中的许多大分子发生反应，甚至可能引发连锁反应，从而导致严重的细胞损伤和/或细胞凋亡。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，所述化合物可以包含6-羟基褪黑激素和6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯的偶联物，或由其组成，例如可以包含通过将至少6-羟基褪黑激素和6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯连接在一起所形成的化合物或由其组成。此类化合物可以通过将6-羟基褪黑激素(6OHM)(褪黑激素类似物)和6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯(6-HITC)(萝卜硫素类似物)偶联来制备。6-羟基褪黑激素(6OHM)的结构式为：

6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯(6-HITC)的结构式为：

因此，两种分子的杂交6-HITC-60HM可以由以下结构式表示：

因此，在一个优选的实施方式中，可以被认为是Nrf2 II期酶诱导剂的化合物可以是由6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯组成的合成萝卜硫素类似物与由6-羟基褪黑激素(6OHM)组成的合成褪黑激素类似物融合得到的化合物。因此在本公开中，该化合物可以被称为6-HITC-6OHM，即，根据本发明的实施方式的用途的组合物可以包含6-HITC-6OHM偶联物。

6OHM可以被认为是褪黑激素的主要活性代谢产物，即褪黑激素在体内通过细胞色素P450同工酶被氧化转化为6-羟基褪黑激素。褪黑激素是3-烷基吲哚有机化合物，即具有在-3位上带有烷基链的吲哚部分，而6-羟基褪黑激素有利地是羟基吲哚有机化合物，即具有带有羟基的吲哚部分。此外，6OHM有利地是稳定的，生物可利用的并且具有良好的清除自由基的活性，例如，与褪黑激素相比，具有更高的稳定性，更好的生物利用度和更好的自由基清除活性。

可以从山葵获得6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯，但本发明的实施方式不限于此。萝卜硫素可以通过4-甲基硫代己基异硫氰酸酯的氧化来合成，其中，异硫氰酸酯基团中的氧基团被硫取代。另一方面，6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯可以通过6-甲基硫代己基异硫氰酸酯的氧化来合成，其中，异硫氰酸酯基团中的氧基团也被硫取代。尽管两种异硫氰酸酯具有相应的结构，-N＝C＝S，但它们的烷基链长度不同。如体外显示，6-甲基硫代己基异硫氰酸酯在诱导Nrf2途径方面有利地强效(例如比萝卜硫素更有效)。

褪黑激素通过细胞色素P450同工酶在体内转化时，这些同工酶也会激活遗传毒性剂，例如，对于预防和/或治疗癌症患者的放射性皮炎或粘膜炎，这是不希望的。但是，萝卜硫素可能会抑制细胞色素P450同工酶，从而褪黑激素不会代谢(或较小程度地代谢)。因此，6-HITC-6OHM化合物可能特别适合刺激Nrf2途径，因为提供了褪黑激素的主要代谢产物而无需依赖细胞色素P450同工酶的作用，细胞色素P450同工酶甚至可以被抑制以避免或降低基因毒性。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，所述用途可以包括所述组合物的局部施用。在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，这种局部施用可包括在皮肤和/或粘膜上施用该组合物。局部施用可以涉及对象身体已经、正在或将要要暴露于电离辐射的区域，或涉及包括周围区域的该区域。因此，可将组合物直接施用于对象身体的相关部分的皮肤上，以防止或最小化由放射疗法或另一种状况如热疗引起的短期和/或长期副作用。

可以将治疗有效量的化合物(可以视为Nrf2 II期酶诱导剂)施用于对象。用于局部施用的组合物可以以(但不一定限于)伤口敷料、喷雾剂、软膏剂、乳霜、乳剂、洗剂、凝胶或防晒霜的形式提供。这种赋形剂是本领域众所周知的。局部施用可以例如包括施用于皮肤或粘膜，包括肺、胃、阴道、口和/或眼的表面。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，所述用途可以包括组合物的口服，粘膜，皮下，肌内和/或肠胃外施用。因此，组合物可包含多种合适的载体和/或赋形剂。

在根据实施方式的组合物中，例如，在用于局部施用的这些组合物中，可以包括本领域技术人员已知的各种添加剂。例如，在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，该组合物还可以包含增溶剂，皮肤渗透促进剂，防腐剂(例如抗氧化剂)，保湿剂，胶凝剂，缓冲剂，表面活性剂，乳化剂，润肤剂，增稠剂，稳定剂，湿润剂，分散剂，药物载体和/或其任何组合。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，所述组合物可以还包含载体和/或赋形剂，以促进该组合物在体内或在体表上的摄取。在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，所述组合物可以还包含抗生素，抗细菌剂和/或抗真菌剂。此类试剂的实例包括但不限于对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚山梨酸等。实施方式的优点是可以实现感染的预防和/或治疗。这与治疗皮炎和/或粘膜炎的优点是协同作用的，因为皮炎和/或粘膜炎可明显增加感染的风险，例如，由于皮肤屏障损坏导致感染风险增加。

合适的皮肤渗透促进剂是本领域众所周知的，并且可以包括：低级烷醇，例如甲醇，乙醇和2-丙醇；烷基甲基亚砜，例如二甲基亚砜(DMSO)，癸基甲基亚砜(C10 MSO)和十四烷基甲基亚砜；吡咯烷酮；脲；N,N-二乙基间甲苯胺；C2-C6烷二醇；二甲基甲酰胺(DMF)；N,N-二甲基乙酰胺(DMA)和/或四氢糠醇。

增溶剂的实例包括但不限于亲水性醚，例如二甘醇单乙醚(乙氧基二甘醇，可作为

商购获得)和二甘醇单乙醚油酸酯(可作为

商购获得)；聚氧35蓖麻油，聚氧40氢化蓖麻油，聚乙二醇(PEG)，特别是低分子量PEG(例如PEG 300和PEG 400)，和聚乙二醇衍生物，例如PEG-8辛酸/癸酸甘油酯(可作为

商购获得)；烷基甲基亚砜，例如DMSO；吡咯烷酮，DMA及其混合物。

在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，载体和/或赋形剂可以包含无毒的填充材料，即对人类有机体基本上无毒的填充材料。这些填充剂材料可以是固体，半固体或液体。在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，载体和/或赋形剂可包含稀释剂。

合适的药物载体可以包括本领域已知的任何此类材料，例如，任何液体，凝胶，溶剂，液体稀释剂，增溶剂，聚合物等，其(对人类有机体)是无毒的，并且不会以有害的方式与组合物的其他成分或皮肤发生明显的相互作用。在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，载体和/或赋形剂可包含用于至少暂时包封化合物的包封材料。在根据本发明第一方面的实施方式的用途的组合物中，载体和/或赋形剂可包含脂质体。

预防和/或治疗感染可通过在本发明的组合物中包含抗生素以及各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等来实现。

根据实施方式的用途的用于胃肠外注射的组合物可以是以下形式(例如，可以由其组成)：无菌的水溶液或非水溶液，分散液，悬浮液和/或乳液，和/或无菌粉末，无菌粉末在使用前重建成无菌的可注射溶液或分散液。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或载剂的实例包括水，乙醇，多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，羧甲基纤维素及其合适的混合物，植物油(例如橄榄油)，和诸如油酸乙酯等可注射有机酯。可以例如通过使用涂覆材料如卵磷脂，如果是分散体则通过保持所需粒度，以及通过使用表面活性剂，来维持合适的流动性。

根据本发明实施方式的用途的组合物还可包含佐剂，例如但不限于防腐剂，湿润剂，乳化剂和分散剂。根据本发明实施方式的用途的组合物可以包括等渗剂，例如糖，氯化钠等。可以通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的组合物的延长吸收。

在通过皮下或肌内注射时减慢组合物的吸收来期望组合物的效果延长的情况下，该组合物可以包含水溶性差的结晶或无定形物质的液体悬浮液。然后，药物的吸收速率可以取决于其溶解速率，而溶解速率又可以取决于晶体尺寸和晶体形式。或者，可以通过将药物溶解或悬浮在油载剂中来实现胃肠外给药药物形式的延迟吸收。

可通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微胶囊基质来制备可注射的储库形式。根据药物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制药物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还可以通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备储库型可注射制剂。可注射制剂可被灭菌，例如，通过细菌截留过滤器过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，其可在将使用之前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。

根据本发明实施方式的用途的组合物可以以固体剂型提供，用于口服给药，例如但不限于胶囊剂，片剂，丸剂，粉末剂和颗粒剂。在这种固体剂型中，活性化合物与以下物质中的至少一种混合：赋形剂或载体，例如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或a)填充剂或增量剂，例如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸，b)粘合剂，例如羧甲基纤维素，海藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂，例如甘油，d)崩解剂，例如琼脂，碳酸钙，马铃薯或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶解延迟剂，例如石蜡，f)吸收促进剂，例如季铵化合物，g)润湿剂，例如乙酰醇和甘油单硬脂酸酯，h)吸收剂，例如高岭土和膨润土，和i)润滑剂，例如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，十二烷基硫酸钠，以及它们的混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况中，剂型中还可含有缓冲剂。相似类型的固体组合物也可以用作软和硬填充明胶胶囊中的填充剂，其使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。

片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂等固体剂型可用包衣和衣壳来制备，例如肠衣或其它包衣，诸如药物配制领域众所周知的延长释放、缓释、延迟释放和即释包衣。它们可以任选地包含遮光剂，并且也可以是仅在或优先在肠道的某部分(任选地)以延迟方式释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。活性化合物也可以是微囊化形式，如果合适，可含有一种或多种上述赋形剂。

口服给药的液体剂型可包括但不限于药学上可接受的乳剂，溶液剂，混悬剂，糖浆剂和酏剂。除活性化合物外，液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和失水山梨糖醇脂肪酸酯和它们的混合物。除惰性稀释剂外，这些口服组合物还可包含诸如湿润剂、乳化及悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂等佐剂。除活性化合物外，混悬剂可含有诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶及它们的混合物等悬浮剂。

本领域普通技术人员将理解，可以容易地凭经验确定本发明方法中使用的组合物中试剂的有效量。应当理解，当施用于人类患者时，主治医师可以在合理的医学判断范围内确定根据本发明的组合物的每日总用量。针对特定患者的治疗有效剂量水平可能取决于多种因素，例如要实现的反应的类型和程度，所采用的特定组合物的活性，患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食，治疗持续时间，与本发明实施方式的用途组合或同时使用的药物，和/或医学领域已知的其他因素。药学或治疗有效量是指有效引起临床上显著的细胞反应的量。例如，在根据本发明的实施方式的用途中，组合物中化合物的量(例如用于局部施用于对象)可以在约0.005重量％至约1重量％的范围内。

可以通过将化合物作为活性药物成分(API)溶解在用于局部施用的软膏或类似产品中来提供组合物，使得API浓度达到0.005％至1％(按重量计)。这样的组合物可以具有辐射防护和治疗特性。该组合物可以有利地部分穿透皮肤以在其中沉积API。当在放射之前施用到皮肤上时，该组合物可以改善皮肤的放射抗性，并且可以防止或最小化可能导致放射性皮炎的红斑，湿和干脱皮。在发生放射性皮炎的情况下，该组合物可以减少或消除皮肤的水肿，充血，瘙痒，疼痛和灼热刺激，加速其愈合并促进组织和细胞结构的快速正常化。

在第二方面，本发明涉及包含化合物的组合物，其中该化合物包含6-羟基褪黑激素和6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯的偶联物或由其组成。对于根据本发明第二方面的实施方式的组合物的细节，参考与本发明第一方面的实施方式有关的上述描述，其不必限于关于本发明第一方面的实施方式所述的医学用途。

在第三方面，本发明涉及根据本发明第二方面的实施方式的组合物作为药物的用途。

在第四方面，本发明涉及根据本发明第二方面的实施方式的组合物的合成方法。该方法包括提供化合物，并且可以包括向该化合物添加另外的产品以形成组合物，例如，如关于本发明第一方面的实施方式所描述的另外的产品。该方法可以包括将N,N′-硫代羰基二咪唑(例如0.26毫摩尔，46.8mg)的THF(例如2mL)溶液添加到2-(6-羟基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)-乙酰胺(例如0.26毫摩尔，50mg)的干四氢呋喃(例如3mL)溶液中。例如，混合溶液可以在0℃保持10分钟。可以使所得物升温至室温，并可以搅拌，例如持续3小时，直到完成。此后，可在减压下除去溶剂，并通过硅胶快速色谱法纯化(例如，使用己烷:CH₂Cl₂ 0–60％)，得到浅黄色油状产物(例如54.4mg，产率为90％)。

为了帮助技术人员理解本发明的各个方面并简化本发明的实践，以下提供了理论上的考虑。然而，本发明和本说明书的实施方式不应解释为受这种理论框架的准确性和/或完整性的限制。

暴露于电离辐射后，自由基可在暴露的细胞中形成，从而引发对DNA和细胞器的后续破坏。这样的损害会引起免疫系统的多种反应。暴露后几分钟即可引发对放疗引起的氧化应激的免疫反应(但不一定限于放疗引起的氧化应激，甚至不限于电离辐射引起的氧化应激)，并且该免疫反应甚至可能在辐照后持续数年。这些效应可能取决于辐射剂量和被辐射的器官。此外，不同的免疫细胞对电离辐射的反应可能不同。免疫系统的细胞和分子分为两个部分，先天免疫系统和后天免疫系统。大多数免疫反应是由可溶性分子介导的，包括细胞因子和趋化因子。先天和后天免疫系统对电离辐射引起的DNA损伤和细胞死亡具有不同的反应。几种类型的细胞死亡可以在暴露于辐射后发生，并可以刺激免疫系统中的不同途径。辐射后发生的细胞死亡机制包括有丝分裂障碍，坏死，凋亡，自噬和衰老。免疫细胞对这些细胞死亡途径的反应导致产生刺激正常组织中各种信号传导途径的细胞因子。免疫原性细胞死亡途径包括坏死和坏死性死亡(necroptotic)。相反，由细胞氧化应激和氧化性DNA损伤诱导的凋亡性死亡具有抗免疫原性。这些途径之间的平衡决定了免疫细胞分泌的细胞因子谱，以及辐射的免疫原性或耐受原性。凋亡细胞与巨噬细胞协同刺激巨噬细胞合成并释放耐受原性细胞因子，例如TGF-β，IL-10，血小板活化因子和PGE2，从而抑制炎症反应。细胞死亡后，与损伤相关的分子模式(DAMP)的分泌，例如高迁移率族蛋白1(HMGB1)和氧化的DNA，导致产生炎性细胞因子，例如IL-1，IL-2，IL-6，TNF-α和IFN-γ。免疫系统细胞对电离辐射的免疫原性和耐受原性反应都涉及与放射治疗相关的若干早期和晚期效应。

巨噬细胞和T淋巴细胞对于响应免疫挑战释放细胞因子和趋化因子很重要。淋巴细胞对电离辐射的反应可通过T辅助1(Th1)和T辅助2(Th2)亚组介导。具有这些亚组的分泌细胞因子对细胞具有不同的作用。核灾难幸存者(例如在切尔诺贝利和日本)和接受癌症放射治疗的患者的长期随访数据显示，Th1/Th2细胞因子谱之间的平衡发生了变化。暴露于电离辐射与Th1的减少和Th2的增加有关。这些结果表明，电离辐射抑制细胞介导的免疫并刺激体液免疫。Th1细胞因子参与炎症反应，包括巨噬细胞和T细胞的活化，而Th2细胞因子刺激免疫系统的体液和过敏反应。Th1和Th2细胞因子产生之间的这种不平衡与辐射暴露后的长期副作用有关。

巨噬细胞和T细胞对高剂量辐射的反应(例如在放射疗法中所见的反应)导致受辐照组织(包括血液以及未辐照组织)的细胞因子谱发生变化。涉及辐射诱导的免疫反应和非辐照组织损伤的关键分子包括转录因子(例如NF-κB)，蛋白激酶(例如MAPK)，细胞因子(例如IL-1β，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12，IL-18，IL-33和IFN-γ)，TNF-α和生长因子(例如TGF-β，bFGF，IGF-1和PDGF)。炎性细胞因子和生长因子(例如TGF-β和IGF-1)刺激巨噬细胞，T细胞，嗜中性粒细胞和非免疫细胞产生前列腺素，ROS和NO。这些免疫反应导致发炎，发红，疼痛，还导致DNA，脂质和蛋白质的氧化，以及致癌和非癌性疾病(如心脏病)的风险增加。另外，暴露于大剂量辐射后，炎性细胞因子和生长因子(例如TGF-β，bFGF和IGF-1)的长期上调会导致细胞外基质(ECM)重塑，从而导致严重的影响，例如可能影响组织正常功能的萎缩，血管损伤和纤维化。

放射疗法中免疫反应的调节是增加肿瘤反应的有效性和管理正常组织副作用的有趣目标。对于这些目标，似乎最重要的是对放射疗法的免疫反应进行管理。褪黑激素在肿瘤和正常组织中的有趣特性可以帮助实现正常组织的适当管理以及对放射疗法的癌症反应。

根据本发明实施方式的组合物，例如当局部施用于暴露于电离辐射的皮肤和粘膜区域和/或周围区域时，可以被认为是Nrf2 II期酶诱导剂。这可以显著提高皮肤和粘膜的机械弹性，并可以预防或减少哺乳动物的皮肤和粘膜损伤，尤其是暴露于热和/或电离辐射的人，例如在放射治疗，热疗，太空环境或核事故中。特别地，在暴露于辐射之前，期间或之后局部施用药学有效量的药物化合物可以提供针对皮肤和粘膜的短期和长期损害的有效免疫调节保护。

根据本发明实施方式的组合物的化合物可以有利地诱导转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)，以预防或治疗由氧化应激引起的对皮肤或粘膜的损害或者皮肤或粘膜的疾病，该氧化应激例如由于放射疗法或其他辐射暴露和/或由于热疗引起。根据萝卜硫素和褪黑激素的多效性概况，可以通过将这些化合物(或其类似物)组合在单个分子中来实现互补的细胞保护作用。根据实施方式的化合物可以与Keap1中存在的半胱氨酸反应以释放Nrf2，Nrf2然后充当与细胞内的GSH偶联的药物，以产生有效的褪黑激素类抗氧化剂化合物，即该偶联物的前药。这种药物-前药机制在治疗应用中可产生良好的药理学概况，例如作为放疗的佐剂。

转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)属于CNC(Cap-N-Collar)转录因子家族，并具有高度保守的基本区域-亮氨酸拉链(bZip)结构。Nrf2在抗氧化剂和解毒基因(通常称为II期基因)的组成型和诱导型表达中起关键作用，该基因编码防御酶，包括药物代谢酶，诸如谷胱甘肽S-转移酶，NADP(H)：醌氧化还原酶和UDP-葡萄糖醛酸糖基转移酶，以及抗氧化酶，例如血红素加氧酶-1(HO-1)和谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)，以响应氧化和外源性应激。这些酶通过称为抗氧化反应元件(ARE)或亲电子反应元件(EpRE)的启动子进行调控。II期基因负责细胞防御机制，其中包括清除活性氧或氮物质(ROS或RNS)，亲电体的解毒和维持细胞内还原。

Nrf2通常被称为Keap1的肌动蛋白结合调节蛋白隔离在细胞的细胞质中。当细胞暴露于氧化或亲电应激时，Keap1-Nrf2复合物发生构象变化，Nrf2从复合物中释放出来并释放到细胞核中。活性Nrf2与小的Maf蛋白二聚化，与ARE结合并激活II期基因转录。

Keap1-Nrf2系统除具有抗氧化功能和解毒功能外，还参与稳态调节。激活该系统的化合物被认为是各种疾病的治疗剂。

已知九类II期酶诱导剂：1)双酚，苯二胺和醌；2)迈克尔(Michael)受体；3)异硫氰酸酯；4)氢过氧化物和过氧化氢；5)1,2-二硫醇-3-硫酮(1,2-dithiole-3-thiones)；6)二硫醇类；7)三价砷；8)二价重金属；和9)类胡萝卜素，姜黄素和相关多烯。这些II期酶诱导剂被认为是非常有效的抗氧化剂，因为与直接抗氧化剂不同，它们在氧化还原反应过程中不会以化学计量消耗，具有较长的作用时间，支持直接抗氧化剂(如生育酚和辅酶Q)的功能，并增强了强抗氧化剂谷胱甘肽的合成。

利尿依他尼酸(EA)，亲电迈克受体，奥替普拉(oltipraz)和异硫氰酸酯萝卜硫素已显示抑制脂多糖(LPS)诱导的高迁移率族蛋白1(HMGB1)的分泌，HMGB1是一种来自免疫刺激的巨噬细胞的与炎症疾病的发病机理有关的促炎蛋白。奥替普拉通过增强致癌物的解毒作用来防止肝脏和膀胱癌变。角化细胞生长因子(KGF)对受伤和发炎的组织(包括受伤的皮肤)中的氧化应激的细胞保护作用与KGF在皮肤伤口修复过程中刺激Nrf2有关。

异硫氰酸酯主要来自十字花科蔬菜，是有效的抗氧化剂，并且在通过II期酶的活化，致癌物活化I期酶的抑制和细胞凋亡的诱导来化学预防肿瘤中是有效的试剂。在植物中，异硫氰酸酯是由硫代葡萄糖苷的水解形成的，该硫代葡萄糖苷是β-硫代葡萄糖苷-N-羟基硫酸盐，当蔬菜被捕食者浸软时，食物制备或咀嚼会破坏细胞，从而激活并释放黑芥子酶。所得糖苷配基经过非酶分子内重排，产生异硫氰酸酯，腈和表硫腈。

西兰花中已鉴定出萝卜硫素，其是分离的鼠肝癌细胞中有效的II期酶诱导剂。萝卜硫素阻止SD(Sprague-Dawley)大鼠乳腺肿瘤的形成，阻止促进小鼠皮肤肿瘤发生，并增加人肝癌HepG2细胞中的血红素加氧酶-1(HO-1)表达。萝卜硫素还可以抑制人角质形成细胞中紫外(UV)光诱导的活化剂蛋白-1(AP-1)(皮肤癌变的启动子)的活化。萝卜硫素提取物的局部应用可能会增加小鼠皮肤表皮中II期酶NAD(P)H：醌氧化还原酶1(NQO1)，谷胱甘肽S-转移酶A1和血红素加氧酶1的水平。

此外，萝卜硫素可以保护人表皮角质形成细胞免受硫芥，强效细胞毒剂以及强大的诱变剂和致癌物的影响，并抑制细胞生长，激活细胞凋亡，抑制组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)活性并降低雌激素受体-α，表皮生长因子受体和人表皮生长因子受体-2的表达，它们是人乳腺癌细胞中参与乳腺癌增殖的关键蛋白。此外，已证明萝卜硫素可从人胃异种移植物中根除幽门螺杆菌。

萝卜硫素除了通过对NHEJ和HRR途径的损伤而显示出对辐射诱导的DNA DSB的修复抑制作用外，萝卜硫素还显著增强了人肿瘤细胞在体外和体内的放射敏感性。这种修复抑制作用似乎至少部分是由于联合治疗诱导的细胞凋亡增强。

褪黑激素主要由松果体分泌，但也可以由例如骨髓、免疫细胞、大脑和肠道合成。褪黑激素具有两种重要的代谢产物，N1-乙酰基-N2-甲酰基-5-甲氧基犬尿胺(AFMK)和N1-乙酰基-5-甲氧基犬尿胺(AMK)。其中，AFMK是最丰富的。

褪黑激素及其代谢产物具有强大的抗氧化和辐射防护性能。它减少了由不同氧化因子(包括电离辐射)引起的ROS/NO产生。在氧化应激期间它也非常迅速地被消耗。这表明褪黑激素可以有效地作为防止ROS/NO产生增加的一线保护因子。

褪黑激素作为一种强大的ROS/NO清除剂，可以与自由基和氧化性DNA损伤相互作用。它可以保护细胞免受羟基自由基(辐射后最常见的自由类基型)，过氧化氢，一氧化氮(免疫细胞的产物)，过氧亚硝酸根阴离子和单线态氧的影响。而且，褪黑激素改善了不同水平的氧化应激，例如分子路径和细胞功能的调节，这将在下面详细解释。看来褪黑激素清除自由基的机制与大多数其他机制不同。维生素C和E之类的抗氧化剂可刺激氧化还原系统，还可以促进ROS的产生。一些研究已经提出褪黑激素与ROS和RNS相互作用而不刺激氧化还原系统。而且，褪黑激素将自由基转化为稳定的产物，例如N-乙酰基-5-甲氧基犬尿胺(kynuramine)，N(1)-乙酰基-N(2)-甲酰基-5-甲氧基犬尿胺和6-羟基褪黑激素，它们与其他分子基本不反应。但是，在某些情况下，褪黑激素可能会通过氧化磷酸化刺激线粒体ROS的产生。

褪黑激素的抗氧化作用的另一个重要机制是刺激基因和酶，例如Nrf2，超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，谷胱甘肽S-转移酶(GST)和谷胱甘肽还原酶(GR)，所有这些都有助于解毒。由于抗氧化酶的抑制作用是在被辐射器官和场外器官中电离辐射的重要作用，因此褪黑激素的这种特性可能会增强对辐射产生的自由基的清除。

免疫细胞(例如巨噬细胞，T细胞和嗜中性粒细胞)以及亚细胞器(例如线粒体，内质网，细胞膜和溶酶体)在细胞和组织对辐射的早期和晚期反应中起重要作用。线粒体和细胞膜产生ROS和RNS以及溶酶体的裂解酶的释放在辐射损伤中起重要作用。此外，包括巨噬细胞，T细胞和嗜中性粒细胞在内的免疫细胞会响应应激情况而产生ROS和NO。与其他抗氧化剂和放射防护剂相比，褪黑激素的显著特征是其能够进入大多数器官及其亚细胞器。褪黑激素可以影响不同的免疫细胞和细胞器，并减轻由于这些细胞和细胞器中的电离辐射引起的功能变化。这些特征表明褪黑激素是在不同组织的放射毒性期间保护正常组织的良好候选者。线粒体膜的保护，线粒体呼吸频率的恢复以及针对ROS/NO的膜电位是褪黑激素的独特特性，而其他抗氧化剂尚无此特性。

线粒体是细胞中ROS产生的主要来源，它们在辐照后的氧化损伤中具有关键作用。线粒体完整性的保持对于褪黑激素减轻氧化应激(例如暴露于电离辐射)期间的氧化损伤和ROS产生可能很重要。而且，有一些证据表明细胞膜和溶酶体的氧化损伤和功能受损减少。

褪黑激素可以通过免疫细胞上的受体调节增殖和细胞因子分泌。褪黑激素的施用可以改善存活率并增加骨髓中前体B和NK细胞的数量。电离辐射对免疫细胞(例如T和B淋巴细胞)具有有效作用。在免疫细胞中，这些细胞对辐射最敏感。骨髓中由辐射引起的淋巴细胞减少是放射疗法的重要副作用，其可能会限制肿瘤接受的放射剂量。褪黑激素治疗可以显著改善DNA损伤，并减少放射后的外周和骨髓淋巴细胞数量。减少DNA损伤和细胞死亡(尤其是在放射敏感性细胞中)，使褪黑激素成为管理辐射免疫反应的合适放射防护剂和免疫调节剂。

细胞因子是正常组织对电离辐射反应的关键介质。暴露于电离辐射会上调多种细胞因子，包括炎性和抗炎性细胞因子。研究表明，褪黑激素具有丝分裂原和抗炎作用，具体取决于现有情况。褪黑激素可以上调IL-2，IL-12和IFN-γ的产生。此外，褪黑激素诱导单核细胞对粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，IL-3，IL-4和IL-6的反应增加。这些作用导致褪黑激素治疗后，NK细胞活性增加，粒细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和红细胞的产生增加。另一方面，有证据表明，用褪黑激素治疗可增加IL-10的产生，并激活抗炎Th2免疫反应。

响应炎症，褪黑激素可作为有效的抗炎化合物，并减少与炎症有关的Th1细胞因子(如TNF-α，IL-1β和IFN-γ)的过表达，并能促进Th2反应。褪黑激素抑制中性粒细胞分泌的两种炎性细胞因子TNF-α和IL-8的释放。这些细胞因子在慢性炎症中尤其重要。因此，褪黑激素可以通过这些途径减少放射治疗后炎症引起的急性和慢性后果。最近的一项研究表明，在肺部辐照之前施用褪黑激素可改善TNF-α，TGF-β和IL-6的上调。而且，与仅辐照相比，其显示出SOD和过氧化氢酶活性以及GSH水平增加，并且肺组织中的氧化损伤减少。TGF-β对SOD和过氧化氢酶基因表达具有抑制作用。因此，在暴露于电离辐射后，TGF-β水平的降低可以帮助减轻氧化损伤。

某些转录因子(例如NF-κB，AP-1，c-jun，c-fos和STAT家族)以及蛋白激酶(例如MAPK)在控制细胞对电离辐射的反应中起关键作用。NF-κB刺激DNA的转录，细胞周期进程，对DNA损伤的反应，细胞因子产生(特别是炎性细胞因子)，细胞生长和分化以及细胞存活。NF-κB存在于几种类型的细胞中。异常的上调与许多恶性肿瘤有关，例如卵巢癌，结肠癌，白血病和淋巴瘤。辐射后，NF-κB刺激炎性细胞因子，例如IL-1α，IL-1β，TNF-α和IL-6mRNA表达。

似乎在NF-κB，AP-1和MAPK信号传导途径之间存在串扰。因此，用选择性抑制剂抑制这些转录因子之一不足以管理暴露于辐射后这些细胞因子的上调。褪黑激素在辐射之类的应激情况下对NF-κB基因表达具有抑制作用。功能性类视黄醇相关的孤儿受体-α(ROR-α)转录因子的调节参与此效果。抑制该信号传导途径可以减少ROS的产生及其后果，例如辐射后的粘膜炎。此外，褪黑激素可以下调MAPK的增加，包括氧化应激诱导的p38和JNK。一份报告显示，褪黑激素对c-jun，c-fos和STAT上调的抑制作用可改善炎性反应。因此，褪黑激素对转录因子的调节作用可能构成褪黑激素对放射肿瘤学的免疫调节特性的良好证据。

公认的是，环氧合酶2(COX-2)是辐射诱发炎症中涉及的最重要因素之一。褪黑激素能够抑制COX-2的产生。先前已经研究了褪黑激素及其代谢产物AFMK和AMK通过阻止COX-2和iNOS活化并减少其产物(包括PGE2和一氧化氮)而产生的抗炎作用。研究发现褪黑激素对COX-1没有影响，仅选择性抑制COX-2。这表明褪黑激素及其代谢产物起到抗炎剂的作用，而没有由于COX-1抑制而引起的某些副作用，例如胃肠道疾病。褪黑激素的这种抗炎作用不是由于其抗氧化作用，而是涉及其他途径。

巨噬细胞产生NO是免疫系统的杀菌特性，涉及电离辐射引起的炎症和氧化损伤。褪黑激素可抑制巨噬细胞中iNOS的表达并减少NO的产生及其后果。这种作用可能是通过抑制STAT-1信号传导和通过抑制NF-κB p50亚基的核易位和DNA结合活性来抑制NF-κB信号传导来介导的。PGE 2和NO的过量产生在炎症的发生和持续中起关键作用，并且还引起其症状，包括血管舒张，疼痛，发烧和浮肿。NO产生的异常增加会导致硝基氧化应激，从而导致DNA损伤，脂质过氧化和蛋白质氧化。这种损害会诱导导致慢性炎症的几种转录因子，例如NF-κB和MAPK。

COX-2，iNOS和其他酶(例如NADPH氧化酶)在氧化还原途径中很重要。这些酶还具有其他与炎症和氧化还原系统有关的作用，例如暴露于辐射后的线粒体，它们会放大由其引起的氧化损伤。褪黑激素的抗氧化和抗炎作用均会抑制COX-2，iNOS和NADPH氧化酶。褪黑激素清除了ROS和NO，并减弱了过氧化物和过氧亚硝酸盐的形成，并减少了与慢性炎症有关的转录因子的表达。

表观遗传调节通过抑制组蛋白乙酰转移酶活性来抑制褪黑激素对COX-2和iNOS转录激活的影响。此外，褪黑激素下调了被氧化应激激活的NF-κB和MAPK，如JNK，ERK和p38的激活。褪黑激素的这些作用可抑制炎性介质，如TNF-α和IL-1β，以及COX-2，PGE2和iNOS。这些对氧化还原系统的抑制作用提高了辐射后的活性，是褪黑激素对电离辐射所致毒性发挥保护作用的方式之一。

对电离辐射的免疫反应的慢性变化是放射治疗延迟效应的重要例子。诸如炎性细胞因子、趋化因子、生长因子、粘附分子和免疫细胞浸润的慢性上调之类的反应会导致受辐照组织的病理变化。电离辐射引起的病理损伤表现为组织结构中不可逆的变化，导致其正常功能受损。暴露后数月至数年可能会出现这种损坏。

NF-κB、炎性细胞因子和趋化因子、粘附分子(如VCAM和ICAM-1)、免疫细胞浸润等的长期上调与不同的病理损害有关。皮肤、肺、心脏、脑、肝、肠、肾、脾和结肠是受不可逆病理变化影响的最重要组织。电离辐射引起的最重要的病理变化包括肺炎，纤维化，坏死，血管扩张和阻塞以及水肿。这种损害之后是早期反应，例如细胞死亡和急性炎症。这些组织变化导致疾病，例如皮肤的屏障功能改变，呼吸功能改变，心脏病，胃肠道疾病等。因此，免疫系统对放射的反应的管理可以降低放射治疗后病理变化及其后果的风险。

褪黑激素可改善电离辐射引起的病理变化。褪黑激素的局部和/或口服施用可以预防或缓解慢性炎症和氧化损伤，纤维化，坏死，血栓，血管损伤以及各种组织(例如心脏，肺，腮腺和下颌下腺，肾脏，脊髓，晶状体，泌尿生殖系统等)中免疫细胞数量的增加。在暴露之前和之后的不同时间使用褪黑激素来预防由电离辐射引起的病理损害是有希望的结果。

除了保护正常组织免于电离辐射外，已有几项研究报道褪黑激素对肿瘤的生长具有抑制作用。施用褪黑激素和放射疗法或化学疗法可能产生的协同作用可以改善癌症患者的生存率，并改善其早期和晚期副作用。

褪黑激素的抗癌作用是通过抑制肿瘤细胞的增殖和生长而产生的。该性质可能与肿瘤细胞周期的抑制有关。刺激细胞死亡和抑制肿瘤细胞增殖降低了复发的可能性并增强了治疗。褪黑激素的抗增殖作用可能与NF-κB的负调控有关。该因子通过直接作用于细胞周期蛋白D1而具有增殖作用。而且，褪黑激素通过激活半胱天冬酶依赖性凋亡途径，增强肿瘤坏死因子，下调Bcl-2和存活率(通过抑制NF-κB p65的核易位)来诱导细胞凋亡。例如，Ramos细胞(人伯基特淋巴瘤B细胞)对褪黑激素非常敏感，其是由剂量依赖性G1期细胞周期停滞和凋亡引起的。另一方面，MCF-7细胞中的褪黑激素诱导细胞周期进程的延迟，这在很大程度上是由TGF-β途径的参与介导的。除细胞凋亡外，褪黑激素还可以诱导癌细胞中其他细胞死亡途径，包括自噬和衰老。

血管生成在肿瘤生长和转移中起关键作用。抑制血管生成是改善癌症对放射疗法的反应的有前途的方法。响应放射疗法的肿瘤细胞中的炎症刺激了引起血管生成和肿瘤生长的不同基因的上调。褪黑激素可通过清除ROS生成并抑制HIF-1α，鞘氨醇激酶1，COX-2和血管内皮生长因子(VEGF)来减少血管生成。此外，褪黑激素通过抑制胰岛素样生长因子1(IGF-1)，表皮生长因子受体(EGFR)和内皮素1(ET-1)来降低生长因子对肿瘤细胞的作用，这些生长因子是癌细胞中血管生成的强大刺激剂，表明褪黑激素抑制了胃癌细胞和荷瘤裸鼠模型中的血管生成。结果表明，胃癌细胞中抗血管生成的主要机制是降低HIF-1α，VEGF和核受体RZR/RORγ的表达。使用细胞和小鼠模型，褪黑激素对乳腺癌中血管生成和肿瘤大小的影响是有希望的。用SPECT成像确定肿瘤大小表明，褪黑激素治疗可减少小鼠模型中植入性人乳腺癌的血管生长和大小。而且，在体外研究中，使用褪黑激素会降低乳腺癌细胞的活力。在一项包括20名转移性患者的临床研究中，褪黑激素的施用导致VEGF血药浓度显著降低，而进展中的患者则未见效果。

自然杀伤(NK)细胞在抑制肿瘤生长和转移中具有重要作用。NK细胞可杀死多种肿瘤细胞，尤其是那些源自淋巴瘤和白血病的肿瘤细胞。研究已证实褪黑激素对NK细胞活性具有积极作用。已经评估了褪黑激素对小鼠免疫细胞群的影响，表明在脾脏和骨髓中，NK细胞群持续升高了两周。这些结果表明褪黑激素增强了NK细胞的抗肿瘤功能。

尽管还没有完全确定褪黑激素对NK细胞的刺激作用的确切机制，但是已经提出了通过刺激T细胞褪黑激素受体来增加IL-2的产生。

在下文中，提供实施例和实验结果以帮助技术人员理解本发明并将其简化为实践。但是，这些实施例和实验结果仅是示例性的，并不意在限制本发明。

在这些实施例中，如上文关于本发明第四方面的实施方式所述合成化合物6-HITC-60HM。Rf 0.87(二氯甲烷，100％)；1H NMR和13C NMR数据与先前报道的发现一致；Rf0.87(DCM,100％)；1H NMR(300MHz,CDCl3)δH 7.91(1H,bs,NH),7.20(1H,d,J＝8.6Hz,H7),7.01(1H,d,J＝2.4Hz,H4),6.91(1H,d,J＝2.4Hz,H2),6.81(1H,dd,J＝2.4Hz,J＝8.6Hz,H6),3.81(1H,s,OCH3),3.69(2H,t,J＝6.8Hz,OCH2CH2NCS),3.06(2H,t,J＝6.8Hz,OCH2CH2NCS)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δC 154.2,131.4,127.3,123.8,112.5,112.2,110.9,56.1,45.7,26.5；HRMS(ES+)质量计算。对于C12H12N2SO 232.0670；实测值[(M+H)+]233.0740，实测值[(M+Na)+]255.0567；分析计算。对于C12H12N2SO:C,62.04；H,5.21；N,12.06,S,13.80。实测值:C,62.26；H,5.38；N,11.88；S,13.56。

根据本发明的实施方式的制剂由比利时的亚迪里安研发中心(AsterionResearch&Development,Belgium)在动物模型中进行了体内实验研究。这些测试的结果在下面描述。

实施例1：皮炎的治疗和预防

在这些实验中使用从德国哥廷根大学动物育种与遗传研究所获得的雄性哥廷根小型猪(平均体重19kg；范围18-20kg；年龄6-7个月)。对小型猪提供自来水和来自德国普瑞纳(Purina)的商业实验室仔猪饲料(普瑞纳实验室猪饲料5085)，其中含有粗蛋白、脂肪、纤维和灰分，以及钙、磷和水分(分别为14.5，4，5，8，0.55，1和14％)。另外，没有使用抗生素补充剂。所有动物实验均按照德国动物福利法进行。

通过将200mg卡波姆(卡波姆934P；美国路博润(Lubrizol))添加到2.5mL蒸馏水中并将200mg 6OHM-6-HITC溶解在2mL乙醇中来获得根据本发明实施方式的适合局部施用的制剂。将适量的乙醇分散液转移至卡波姆的水分散液中。将甲醇(1.25mL)与1mL乙醇混合，并添加到6OHM-6-HITC和卡波姆的混合物中，将其缓慢搅拌，并使卡波姆浸泡2小时。加入三乙醇胺(100mg；美国西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,USA))以中和卡波姆溶液并促进凝胶的形成，然后将pH调节至6.8。使用与乳膏相同的成分和相同的方法制备载剂乳膏，但是混合物中省略了6OHM-6-HITC。这种局部用凝胶制剂可产生最高的6OHM-6-HITC渗透性，而不会引起皮肤刺激或抗炎作用。对于局部治疗，将6OHM-6-HITC或载剂乳膏(浓度为200mg/cm²)每天两次涂在猪的受辐照皮肤上，持续35天，并在辐照后立即进行首次施用。

为了观察伽马辐射对小型猪(每组3只动物)的皮肤的影响，对背部皮肤进行了辐照。对于所有程序，将动物用替来他明/唑拉西泮(Zoletil 50；德国维巴克(Virbac,Germany))和美托咪定(Domitol；德国辉瑞动物健康公司(Pfizer Animal HealthGermany))麻醉。辐照前三到四天，将动物的毛从要暴露的区域剪下来，并用印度墨水标记和纹身暴露区域的位置。使用⁶⁰Coγ射线(Theratron 780；加拿大AECL)以50Gy的剂量并以130.1cGy/分钟的剂量率对所述区域进行伽玛辐照(区域大小，5×2cm，矩形；辐射源到皮肤的距离，80厘米；深度，1厘米，且填充物(bolus)1厘米)。如图1所示，根据可用的侧面皮肤面积，对每头猪进行50Gy辐照。图2显示了序贯活检21的辐照和穿刺部位。穿刺部位由图1上的三角形标记指示。

在辐照后的五周内每周对猪进行评估，并使用临床状态评分系统对它们的皮肤反应进行评分。检查皮肤反应的存在和外观以及手术疤痕的特征。根据以前的皮肤损伤模型，使用以下评分系统评估反应：1.0级，正常皮肤；1.5级，极少红斑和皮肤轻微干燥；2.0级，中度红斑和皮肤干燥；2.5级，明显红斑和干燥脱皮；3.0级，干燥脱皮和极少的干燥结壳；3.5级，干燥脱皮，干燥结壳和极少的表面结痂；4.0级，斑片状湿性脱皮和中度结痂；4.5级，融合性湿性脱皮、溃疡和大而深的痂；5.0级，开放性伤口和全层皮肤脱落；5.5级，坏死。

在麻醉下进行5mm穿刺活检，以从未辐照的健康皮肤和辐照后3、7、21和35天的辐照皮肤区域获得皮肤样品。收集后，将皮肤活检样品固定在软木塞上，保持5mm大小。在辐照之前从每只猪获得未辐照皮肤的活检样品。所有活检样品均经过处理，并在10％的福尔马林缓冲液中固定，然后包埋在石蜡中，然后切成4μm厚的冠状切片并脱蜡。接下来，将切片用苏木精和曙红染色并通过光学显微镜检查。选择每个载玻片上最长的网脊(rete ridge)，并从基底层的底部到角质层的底部进行测量，避开内含物似乎倾斜的区域。然后基于每个载玻片上每个部分的测量值计算平均值。通过对至少5mm深度的基底膜中的细胞进行计数来确定基底层的细胞密度。结果表示为每毫米基底膜的细胞数。从这些计算中排除了退化的细胞(即表现出萎缩和收缩坏死的细胞)。

在正常马血清中孵育60分钟以防止非特异性结合后，将皮肤切片与小鼠抗核因子(NF)-κB(sc-109，1:200；美国加利福尼亚州圣克鲁兹的圣克鲁兹生物技术公司(SantaCruz Biotechnology))和小鼠抗COX-2(18-7379，1:200；美国Zymed公司)在磷酸盐缓冲盐水-吐温(PBS-T)中于4℃孵育过夜。随后将切片与生物素化马抗小鼠IgG(VECTASTAINElite ABC Kit；美国Vector实验室)孵育。使用亲和素-生物素过氧化物酶复合物(VECTASTAIN Elite ABC Kit；Vector实验室)评估免疫反应性。使用二氨基联苯胺底物试剂盒(DAB底物试剂盒SK-4100；Vector实验室)开发过氧化物酶反应。作为对照，每个实验中一些测试切片的免疫组织化学分析均省略了一抗。然后在安装前用苏木精对切片进行复染。

在不同的时间点(辐照前，辐照后3、7、21和35天)通过耳静脉将血样收集到含有乙二胺四乙酸的样品管中。使用Hemavet系统(英国Drew科学公司)自动计数外周嗜酸性粒细胞。

数据表示为平均值±平均(SEM)值的标准误差。组之间的差异通过单向方差分析(ANOVA)，然后通过Student-Newman-Keuls事后检验进行多次比较来进行评估。在所有情况下，p<0.05被认为是显著的。

在接受放射暴露后35天，在接受载剂处理和6OHM-6-HITC处理的小型猪中均观察到随时间变化的受辐照皮肤的总变化。辐照后一周，皮肤暴露区域出现脱皮，并伴有鲜红色的红斑。该反应在辐照后的最初5周内严重程度逐渐增加，持续的湿性脱皮和组织破裂发展至真皮。在接受载剂处理和6OHM-6-HITC处理的小型猪中，当辐照后1周评估时，临床变化是相似的。然而，6OHM-6-HITC处理对皮炎的有益作用出现在辐照后2周。如图3和图4所示，与用载剂处理的辐照组相比，用6OHM-6-HITC处理的组表现出降低的皮肤反应严重性。

检查苏木精和曙红染色的切片，以评估使用或不使用6OHM-6-HITC处理的猪皮肤中的基底细胞密度和上皮深度。在辐照之前从每只猪收集的皮肤切片表现出正常的形态。基底细胞密度和上皮层厚度的变化与观察到的临床改变的进展平行，如图5，图6和图7所示。

皮肤的放射暴露逐渐降低了表皮中基底细胞的密度，直到放射后5周。然而，辐照后21天和35天，基底细胞计数的减少得到了明显改善(分别相对于载剂处理的辐照组，p＜0.01和p＜0.05；见图6)。

辐照后五周，表皮厚度逐渐明显下降。但是，6OHM-6-HITC处理可能会保留基底细胞数量，从而在辐照后35天阻止了这种减少(相对于载剂处理的辐照组，p<0.01)。这些结果表明6OHM-6-HITC显著减轻了被辐照的猪皮肤的皮肤损伤(见图7)。

在正常的猪皮中，即在未经辐照和未处理的情况下，环氧合酶2(COX-2)的染色几乎看不到，在皮脂腺和皮下组织中有些染色，但没有可见的表皮染色，如图8所示。COX-2表达在经辐照的皮肤的表皮中可检测到，并且在暴露后1至3周之间的评估显示颗粒层和角质层中的COX-2表达，分别如图9和图10所示。辐照后五周，如图11所示，在所有皮肤层中均观察到斑块状的染色区域。但是，经6OHM-6-HITC处理的皮肤中，经辐照的皮肤中COX-2表达低于经载剂处理的皮肤中的情况，如图12，图13和图14所示。

在正常猪皮中，几乎看不到NF-κB染色，在皮脂腺、毛囊和表皮中可看到一些染色。另外，如图15所示，NF-κB在表皮的基底水平的细胞质区域中表达，而未检测到核染色。分别如图16和图17所示，在辐照后1-2周之间，被辐照的皮肤中的NF-κB表达增加。如图18所示，在辐照后三周，在所有表皮层中观察到弥漫性细胞质染色，而在五周后，检测到核染色。分别在图19，图20和图21中可以看出，在用6OHM-6-HITC处理的经辐照皮肤中，NF-κB表达低于用载剂处理的经辐照皮肤中的表达，并且核表达迅速降低。暴露后7天，聚焦放射暴露会暂时减少外周血的白细胞计数，包括中性粒细胞和淋巴细胞。6OHM-6-HITC治疗组的外周血样品的分析最初未显示6OHM-6-HITC的放射防护作用。但是，辐照后21和35天，聚焦辐射引起的皮肤炎症增加了外周血的中性粒细胞的数量。相反，6OHM-6-HITC治疗组的血液中的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞减少，但是减少并不明显，表明6OHM-6-HITC减轻了辐射诱导的皮肤炎症，如图22至图27所示。活检伤口的愈合随着时间推进，在辐照之前观察到皮肤伤口的稳定愈合。正常皮肤中的活检伤口在6至12天内愈合，但辐照后3天，活检病变似乎并未愈合。如在辐照后的各个时间点所观察到的，皮肤暴露于辐照会显著延迟伤口愈合。然而，如图28和图29所示，6OHM-6-HITC处理减弱了辐照后3天由辐射诱导的活检伤口的延迟愈合。

实施例2：粘膜炎的治疗和预防

在说明本发明实施方式的第二个实施例中，使用从德国哥廷根大学动物育种与遗传研究所获得的六周龄ICR小鼠(30-40g)。将动物圈养在保持在22±2℃的房间中，处于12小时光照/黑暗周期中，在上午7:00开灯。给小鼠喂食标准的啮齿动物饮食，可以自由饮水。另外，没有使用抗生素补充剂。所有动物实验均按照德国动物福利法进行。麻醉小鼠(每组n＝20)(戊巴比妥钠，50mg/kg体重，腹膜内注射)，然后进行辐照。小鼠仅需在舌尖进行辐照，因此身体的其余部分被铅装置(厚度为0.5mm)屏蔽。用胶带将舌头固定在铅装置的外表面上，并用20Gy的单次辐射剂量进行辐照。使用150kV电位(20mA)X射线源在350mm的焦距处产生辐射，并通过1.0mm的铝过滤系统(MBR-1520R-3；日本东京的日立公司(Hitachi))对光束进行硬化。剂量率为5.1Gy/分钟。将6OHM-6-HITC化合物溶解在少量的1M NaOH溶液中。用1MHCl将pH调节至7。在0.9％(生理)盐水溶液中将浓度调整为3mg/mL或15mg/mL。记录体重，并在辐照后每天观察舌头。在辐照前30分钟通过腹膜内途径注射6OHM-6-HITC。对照组接受辐照，但不施用6OHM-6-HITC化合物。

口腔粘膜炎评分是基于Sonis等人方法的改进。为了评估口腔粘膜炎的严重程度，每天用异氟烷麻醉小鼠。口腔粘膜炎评分为：0＝正常；1＝部分充血，红斑和肿胀；2＝整体充血，红斑和肿胀；3＝表皮松解，充血和红斑；4＝广泛的表皮松解和出血；5＝出血和脓肿。髓过氧化物酶(MPO)活性是发炎组织中中性粒细胞的标志物。使用Chen等人方法的改进在小鼠舌头中测量MPO活性。辐照后12天通过颈脱位法杀死小鼠后，取出舌头样品(每组n＝10)，并保存在-70℃直到需要进行分析。称重样品，并在含有0.5％十六烷基三甲基溴化铵(德国西格玛-奥德里奇公司)的10体积的50mM磷酸钾缓冲液(pH 6)中匀浆1分钟。将匀浆冷冻并解冻三次后，将其在10,000×g下于4℃离心15分钟。收集上清液，并使其与在50mM磷酸盐缓冲液(pH 6)中的0.167mg/mL邻联茴香胺二盐酸盐(Wako生化公司)和0.0005％H2O2(Wako生化公司)反应。使用酶标仪(Microplate Reader)(NJ-2300；日本东京Biotec公司)在450nm下测量MPO活性。通过测量使用MPO标准品(Wako生化公司)校准的吸光度的斜率来计算MPO活性，并表示为MPO/g舌头。TBARS自然存在于生物样本中。它们包括脂质氢过氧化物和醛，它们随着对氧化应激的反应而浓度增加。辐照后12天通过颈脱位法杀死小鼠后，取出舌头样品(每组n＝10)，并保存在-70℃直至需要进行分析。称重样品，并且每100mg舌头在0.5–1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中匀浆。将样品在4℃下以1500×g离心10分钟。收集上清液，并在试验缓冲液中稀释。使用酶标仪(Biotec)在540nm下测量TBARS水平。通过测量使用TBARS标准品校准的吸光度斜率来计算TBARS水平，并表示为TBARS/g舌头。此外，在辐照后12天杀死小鼠后，取出舌头用于组织病理学分析。将样本固定在10％中性缓冲福尔马林中，脱水并包埋在石蜡(Wako生化公司)中。获得组织切片并用苏木精和曙红(H&E)染色，并在光学显微镜下(放大200倍)检查。辐照后12天杀死小鼠后，取出舌头进行免疫组织化学(IHC)分析。将石蜡包埋的组织切片用于TUNEL染色(放大400倍)。进行脱蜡，水合和蛋白质消化。随后，在37℃下用100μL(或50μL)TdT反应溶液标记DNA的3末端10分钟。用PBS洗涤切片，并用POD偶联的抗体标记。在室温下用100μL 3,3'-二氨基联苯胺溶液显色5分钟，然后用双蒸馏水洗涤并进行复染。这些操作之后，在光学显微镜下进行脱水，清洁，安装和检查。对舌尖上TUNEL阳性细胞的数目进行计数，并以百分比表示。结果以平均值的平均值和标准误差或以平均值报告。用单向方差分析(ANOVA)然后进行Steel-Dwass测试来分析数据。P<0.05被认为是显著的。每天测量辐照后的体重。

对小鼠的舌头辐照20Gy导致体重下降，这在第12天达到最大。在第12天后，体重增加，如图30所示。食物和水的摄入也减少，并伴有体重减轻。图31显示了6OHM-6-HITC的剂量依赖性(30和300mg/kg)。在第12天后存活的小鼠数量减少。未发现存活率的明显差异。即使在300mg/kg6OHM-6-HITC的情况下，在小鼠中也未观察到行为障碍。通过宏观和组织学方法评估了小鼠舌头的病理生理变化。图32显示了口腔粘膜炎的评分。7天未观察到口腔粘膜炎，但在第8天出现。严重程度评分在第12天达到最大值。此后，分数随时间降低。6OHM-6-HITC以300mg/kg施用的组的口腔粘膜炎评分在第10天和第12天明显低于对照组。30和300mg/kg的6OHM-6-HITC在第0天到第12天之间的总评分分别明显低于对照组(图33)。舌头样品的组织病理学切片示于图34。在对照组中，观察到舌头的表皮松懈。但是，在6OHM-6-HITC组中，表皮松懈的程度保持，炎性细胞的浸润减少。进行TUNEL染色以确认由于辐射引起的细胞损伤。图35显示了用于评估细胞凋亡的TUNEL染色的照片。对照组具有相当大的细胞凋亡(23.7％的TUNEL阳性细胞)。相反，在分别用30和300mg/kg 6OHM-6-HITC处理后，TUNEL阳性细胞的百分比分别降低到9.9％和8.6％(也参见图36)。辐照后12天测量MPO活性和TBARS水平。与对照组相比，以30和300mg/kg施用6OHM-6-HITC的组的MPO活性显著降低(参见图37)。分别以30和300mg/kg施用6OHM-6-HITC的组的TBARS水平低于对照组，并且6OHM-6-HITC(300mg/kg)引起与对照组相比明显的下降(见图38)。

Claims (14)

1.一种组合物，其包含化合物，所述化合物包含6-羟基褪黑激素和6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯的偶联物或由其组成。

2.如权利要求1所述的组合物在制备药物中的应用。

3.一种包含化合物且该化合物包含6-羟基褪黑激素和6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯的偶联物或由其组成的组合物在制备用于治疗和/或预防上皮组织疾病和/或病症的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其中，所述应用是制备用于治疗皮炎和/或粘膜炎的药物。

5.如权利要求4所述的应用，其中，所述应用是制备用于治疗放射诱发的皮炎和/或放射诱发的粘膜炎的药物。

6.如权利要求3-5中任一项所述的应用，其中，所述应用是制备用于治疗放疗和/或化疗副作用的药物。

7.如权利要求3-5中任一项所述的应用，其中，所述应用包括制备药物，所述药物用于局部施用。

8.如权利要求7所述的应用，其中，所述局部施用包括在皮肤和/或粘膜上施用组合物。

9.如权利要求3-5中任一项所述的应用，其中，所述应用包括所述组合物的口服，粘膜，皮下，肌内和/或肠胃外施用。

10.如权利要求3-5中任一项所述的应用，其中，所述组合物还包含增溶剂，皮肤渗透促进剂，防腐剂，保湿剂，胶凝剂，缓冲剂，表面活性剂，乳化剂，润肤剂，增稠剂，稳定剂，湿润剂，分散剂和/或它们的任何组合。

11.如权利要求3-5中任一项所述的应用，其中，所述组合物包含载体、稀释剂和/或赋形剂，以促进所述组合物在体内或在体表上的摄取。

12.如权利要求11所述的应用，其中，所述载体和/或所述赋形剂包括用于至少暂时包封所述化合物的包封材料。

13.如权利要求11所述的应用，其中，所述载体和/或所述赋形剂包括脂质体。

14.如权利要求3-5中任一项所述的应用，其中，所述组合物还包含抗生素，抗细菌剂和/或抗真菌剂。

Images