WO2013054447A1 - γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙまたはその塩の製造方法、および変異型グルタチオン合成酵素 - Google Patents

γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙまたはその塩の製造方法、および変異型グルタチオン合成酵素 Download PDF

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WO2013054447A1
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amino acid
acid sequence
glu
seq
gly
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PCT/JP2011/073715
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崇敬 伊藤
西内　博章
五十嵐　俊介
一雄 山岸
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味の素株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02003—Glutathione synthase (6.3.2.3)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a peptide represented by ⁇ -Glu-X-Gly (X represents an amino acid selected from the group consisting of Val, nVal, Leu, Abu, and Ile; the same shall apply hereinafter) or a salt thereof, And a mutant glutathione synthetase.
  • CaSR Calcium sensing receptor
  • Patent Document 1 Several ⁇ -glutamyl peptides such as ⁇ -Glu-Met, ⁇ -Glu-Thr, and ⁇ -Glu-Val-Gly have been reported to have a kokumi imparting effect (Patent Document 1). .
  • Patent Document 2 an S- or O-carboxyalkylated ⁇ -glutamyl or ⁇ -aspartyl peptide ester group has been reported as a body taste substance (Patent Document 2).
  • these peptides and esters impart a rich taste to foods like GSH, they do not have a reduced thiol group (—SH group) unlike GSH.
  • Patent Document 2 a substance having a reduced thiol group such as GSH is unstable, and its titer decreases with the formation of a disulfide bond. Therefore, these rich taste imparting peptides that do not have a reduced thiol group are considered useful in terms of stability and the like.
  • Non-patent Document 4 As a knowledge about foods containing ⁇ -glutamyldipeptide, there is a report that various ⁇ -glutamyldipeptides were detected from Gouda cheese aged for about 44 weeks (Non-patent Document 4). In this document, various ⁇ -glutamyldipeptides such as ⁇ -Glu-Ala, ⁇ -Glu-Glu, and ⁇ -Glu-Gln were detected, and the content of ⁇ -glutamyldipeptide was 3590 ⁇ mol / kg dry weight at the maximum. It has been reported.
  • Non-patent Document 5 an example of fermentation broth analysis of Micrococcus glutamicus.
  • fermentation broth was applied to various columns to separate peptides and ⁇ -Glu-Glu, ⁇ -Glu-Val, and ⁇ -Glu-Leu were isolated. It is unknown how much was contained in the broth.
  • GSH is produced in vivo by ⁇ -Glu-Cys being produced from Glu and Cys by ⁇ -glutamylcysteine synthase, and Gly being further bound by glutathione synthase.
  • ⁇ -glutamylcysteine synthetase is encoded by GSH1 gene or gshA gene
  • glutathione synthetase is encoded by GSH2 gene or gshB gene
  • Non-patent Document 3 a method for enzymatically producing theanine ( ⁇ -glutamylanilide) using the side reaction of ⁇ -glutamylcysteine synthetase of Escherichia coli has been reported (Patent Document 3, non-patent document). Reference 6).
  • Patent Document 7 an example in which the substrate specificity of ⁇ -glutamylcysteine synthetase of Proteus mirabilis to amino acids other than Cys has been reported has been reported (Non-patent Document 7).
  • ⁇ -glutamylcysteine synthetase is known to have a wide substrate specificity.
  • Non-Patent Document 8 Non-Patent Document 9
  • ⁇ -Glu-Abu ⁇ -glutamyl- ⁇ -aminobutyric acid
  • Gly for glutathione synthase derived from Escherichia coli Has reported a method for producing ⁇ -Glu-Abu-Gly (Patent Document 4), but for X other than Abu, it has been shown whether ⁇ -Glu-X can be a substrate for glutathione synthase. Absent.
  • ⁇ -Glu-Val and ⁇ -Glu-nVal were used for glutathione synthase derived from rat liver.
  • Gly have been studied (Non-patent Document 10), but ⁇ -Glu-Val is not a substrate, and ⁇ -Glu-nVal is a substrate, but the reactivity is very low. It was considered difficult to apply this enzyme to the production of ⁇ -glutamyl tripeptide using these ⁇ -glutamyl compounds as substrates.
  • Patent Document 5 discloses a yeast that produces ⁇ -Glu-Cys having a mutant of glutathione synthetase, and T47I, P54L, and G387D are disclosed as mutation points. The effect on the production of ⁇ -Glu-X-Gly is not known.
  • ⁇ -Glu-X-Gly is produced using glutathione synthetase derived from Saccharomyces cerevisiae or a mutant glutathione synthetase having a specific mutation.
  • Non-Patent Documents 11 and 12 As a method for producing ⁇ -Glu-X-Gly, an example in which ⁇ -Glu-Lys-Gly is generated using ⁇ -GTP has been reported (Non-Patent Documents 11 and 12). When using, there is also a problem of how to prepare Lys-Gly used as a substrate.
  • the present invention provides a method for producing a peptide represented by ⁇ -Glu-X-Gly (X represents an amino acid selected from the group consisting of Val, nVal, Leu, Abu, and Ile) or a salt thereof. This is the issue.
  • ⁇ -Glu-X-Gly is produced by the action of Saccharomyces cerevisiae-derived glutathione synthetase or mutant glutathione synthetase using ⁇ -Glu-X and Gly as raw materials.
  • the present inventors acted on ⁇ -Glu-X by using ⁇ -glutamylcysteine synthetase, and Saccharomyces cerevisiae-derived glutathione synthetase or mutant glutathione synthetase using Glu, X, and Gly as raw materials.
  • -Gly was found to form. Based on these findings, the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • ⁇ -Glu-X-Gly (1) (In the formula, X represents an amino acid selected from the group consisting of Val, nVal, Leu, Abu, and Ile.)
  • ⁇ -Glu-X-Gly (1) (In the formula, X represents an amino acid selected from the group consisting of Val, nVal, Leu, Abu, and Ile.)
  • ⁇ -Glu-X-Gly (1) (In the formula, X represents an amino acid selected from the group consisting of Val, nVal, Leu, Abu, and Ile.)
  • a method for producing a peptide represented by the formula: A step of producing ⁇ -Glu-X-Gly by allowing glutathione synthetase and ⁇ -glutamylcysteine synthetase to act on Glu, X, and Gly, The method wherein the glutathione synthetase is a protein selected from the following (A) to (D): (A) The following (a) to (c): (A) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, (B) an amino acid sequence comprising one or several amino acid substitutions, deletions, insertions or additions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (C) an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; In any one of the amino acid
  • the mutation is a mutation corresponding to one or more mutations selected from the following: S28T, M29V, F34Y, S44T, F100L, L104V, I126L, F127Y, L132 (I, M, V), T149V, V150 (A, C, F, G, H, I, M, N, S, T, Y ), S153 (A, T), F154C, S158T, S191T, L195V, L199V, I223V, V224I, Q225 (D, E, N), R226Q, N227D, E228D, N230Q, V236I, L237I, L252V, T253S, F254Y, Y284F, T286S, Y288F, T289S, T290S, T291S, D292E, A313S, L320V, S321T, S323T, E386 (D, N), G389A
  • the mutation is a mutation corresponding to a mutation selected from the following: S28T, F34Y, S44T, L132M, V150A, V150C, V150F, V150G, V150H, V150I, V150M, V150N, V150S, V150T, V150Y, S191T, L195V, Q225D, V236I, L237I, E386D, I445V, Y446F, (S28T + S ), (S28T + L132M), (S28T + L195V), (S28T + E386D), (S28T + Y446F), (S44T + L132M), (S44T + L195V), (S44T + E386D), (S44T + Y446F), (L132M + L195V), (S44T + E386D), (S44T + Y446F), (L132M + L195V), (L132M + E386D), (S44
  • the method wherein the glutathione synthetase and / or ⁇ -glutamylcysteine synthetase is a culture of microorganisms having the activity of the enzyme or a processed product of the culture. [7] The method, wherein the glutathione synthetase and / or ⁇ -glutamylcysteine synthetase is a purified enzyme. [8] The method, wherein the glutathione synthetase and / or ⁇ -glutamylcysteine synthetase is an immobilized enzyme.
  • microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia or Corynebacterium.
  • microorganism is Escherichia coli or Corynebacterium glutamicum.
  • the mutant glutathione synthetase wherein the mutation is a mutation corresponding to a mutation selected from the following: S28T, F34Y, S44T, L132M, V150A, V150C, V150F, V150G, V150H, V150I, V150M, V150N, V150S, V150T, V150Y, S191T, L195V, Q225D, V236I, L237I, E386D, I445V, Y446F, (S28T + S ), (S28T + L132M), (S28T + L195V), (S28T + E386D), (S28T + Y446F), (S44T + L132M), (S44T + L195V), (S44T + E386D), (S44T + Y446F), (L132M + L195V), (S44T + E386D), (S44T + Y446F), (L132M + L195V
  • ⁇ -Glu-X-Gly (X represents an amino acid or an amino acid derivative selected from the group consisting of Val, nVal, Leu, Abu, and Ile) can be produced.
  • the present invention also provides a mutant glutathione synthetase that can be used for the production of ⁇ -Glu-X-Gly.
  • ⁇ -Glu-X-Gly produced by the present invention
  • the peptide produced by the present invention has the following formula (1): ⁇ -Glu-X-Gly (1)
  • X represents an amino acid selected from the group consisting of Val, nVal, Leu, Abu, and Ile.
  • Glu in the formula (1) represents glutamic acid.
  • “-” Represents a peptide bond.
  • “ ⁇ ” in ⁇ -Glu means that X is bound to glutamic acid via a carboxyl group at the ⁇ -position of glutamic acid.
  • X represents an amino acid selected from the group consisting of valine (Val), norvaline (nVal), leucine (Leu), ⁇ -aminobutyric acid (Abu), and isoleucine (Ile). That is, X is selected from aliphatic neutral amino acids. X is preferably Val or nVal.
  • one type of ⁇ -Glu-X-Gly may be produced, or two or more types of ⁇ -Glu-X-Gly may be produced.
  • ⁇ -Glu-X-Gly and Glu, X, Gly, and ⁇ -Glu-X used as raw materials may all be free forms or salts thereof, or a mixture thereof.
  • the salt include sulfate, hydrochloride, carbonate, ammonium salt, sodium salt, and potassium salt.
  • the glutathione synthase used in the present invention recognizes ⁇ -Glu-X as a substrate and binds to Gly to form a peptide that is a glutathione derivative, that is, ⁇ -Glu-X-Gly. Has the activity of catalyzing the reaction to produce In the present invention, the activity that catalyzes the reaction is referred to as glutathione synthetase activity.
  • the glutathione synthetase used in the present invention does not need to exhibit glutathione synthetase activity for any X, and may exhibit glutathione synthetase activity for the amino acid or amino acid derivative selected as X.
  • glutathione synthase when two or more ⁇ -Glu-X-Gly are produced, a single glutathione synthase catalyzes a reaction that produces all of the two or more ⁇ -Glu-X-Gly. It is not necessary to have such activity, and two or more glutathione synthetases may be used depending on X.
  • glutathione synthase has an activity of catalyzing the reaction of generating GSH or ⁇ -Glu-Cys derivative-Gly from ⁇ -Glu-Cys or ⁇ -Glu-Cys derivative and Gly. You may or may not have.
  • Examples of the glutathione synthetase used in the present invention include a protein encoded by the GSH2 gene of Saccharomyces cerevisiae.
  • the base sequence of the GSH2 gene of Saccharomyces cerevisiae is disclosed in Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/).
  • the base sequence of the GSH2 gene of Saccharomyces cerevisiae S288C strain (ATCC No. 26108) and the amino acid sequence encoded by this gene are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the glutathione synthetase used in the present invention may be a glutathione synthetase, for example, a protein variant having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, as long as it has glutathione synthetase activity. Such a variant may be referred to as a “conservative variant”.
  • the conservative variant may be, for example, a homologue or artificially modified form of the glutathione synthetase.
  • the gene encoding glutathione synthetase is a protein having glutathione synthetase activity, that is, if it encodes the glutathione synthetase or a conservative variant thereof, It may be a variant.
  • the gene encoding the homolog of glutathione synthetase can be easily obtained from a public database by BLAST search or FASTA search using the GSH2 gene of Saccharomyces cerevisiae as a query sequence, and a chromosome such as yeast can be used as a template. Thus, it can be obtained by PCR using oligonucleotides prepared based on these known gene sequences as primers.
  • the glutathione synthetase gene can be substituted, deleted, inserted or added at one or several positions in the amino acid sequence as long as it encodes a protein having glutathione synthetase activity. It may be a gene encoding a protein having a sequence to be included.
  • the “one or several” differs depending on the position of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein and the type of amino acid residue, but specifically preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, More preferably, it means 1 to 5.
  • One or several amino acid substitutions, deletions, insertions or additions described above are conservative mutations in which the function of the protein is maintained normally. A typical conservative mutation is a conservative substitution.
  • Conservative substitution is, for example, when the substitution site is an aromatic amino acid, between Phe, Trp, and Tyr, and when the substitution site is a hydrophobic amino acid, between Leu, Ile, and Val, a polar amino acid Is an amino acid having a hydroxyl group between Lys, Arg and His when it is a basic amino acid, and between Asp and Glu when it is an acidic amino acid. In some cases, it is a mutation that substitutes between Ser and Thr.
  • substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln substitution, Cys to Ser or Ala substitution, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg substitution, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, substitution from Gly to Pro, substitution from His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr, substitution from Ile to Leu, Met, Val or Phe, substitution from Leu to Ile, Met, Val or Phe, Replacement of Lys with Asn, Glu, Gln, His, or Arg Met to Ile, Leu, Val or Phe substitution, Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu substitution, Ser to Thr or Ala substitution, Thr to Ser or Ala substitution, Trp to Phe or Substitution to
  • amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above include naturally occurring mutations (mutants or variants) such as cases based on individual differences or species differences of microorganisms from which genes are derived. Also included by mutations (mutants or variants) such as cases based on individual differences or species differences of microorganisms from which genes are derived. Also included by mutations (mutants or variants) such as cases based on individual differences or species differences of microorganisms from which genes are derived. Also included by
  • a gene having a conservative mutation as described above is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more with respect to the entire amino acid sequence. It may be a gene encoding a protein having a homology of at least% and having glutathione synthetase activity. In the present specification, “homology” may refer to “identity”.
  • the glutathione synthase gene encodes a protein having glutathione synthetase activity by hybridizing under stringent conditions with a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a complementary sequence to the whole or a part of the base sequence. It may also be DNA that does.
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, highly homologous DNAs, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more DNAs having homology.
  • the probe used for the hybridization may be a part of a complementary sequence of a gene.
  • a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared on the basis of a known gene sequence as a primer and a DNA fragment containing these base sequences as a template.
  • hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • the glutathione synthase gene can be used in its natural form, but it may be modified to have an optimal codon according to the codon usage frequency of the host to be used.
  • examples of the glutathione synthetase used in the present invention include glutathione synthetase having a specific mutation.
  • the “specific mutation” will be described later.
  • the glutathione synthetase having the “specific mutation” is also referred to as “mutant glutathione synthetase”.
  • the glutathione synthetase having no “specific mutation” is also referred to as “wild-type glutathione synthetase”.
  • wild type as used herein is not limited to those obtained in nature unless it has the “specific mutation”.
  • Examples of the wild-type glutathione synthase include proteins encoded by the above-mentioned Saccharomyces cerevisiae GSH2 gene and conservative variants thereof that do not have the “specific mutation”.
  • mutant glutathione synthetase may be a protein encoded by the above-mentioned Saccharomyces cerevisiae GSH2 gene or a conservative variant thereof, except that it has the “specific mutation”.
  • the mutant glutathione synthase may be a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 except having the “specific mutation”.
  • the mutant glutathione synthase has one or several amino acid substitutions, deletions, insertions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 except that it has the “specific mutation”.
  • it may be a protein having an amino acid sequence including an addition.
  • the mutant glutathione synthase has 80% or more, preferably 90% or more, more preferably, with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 except that it has the “specific mutation”.
  • the mutant glutathione synthetase has the “specific mutation” in the amino acid sequence of the protein encoded by the GSH2 gene of Saccharomyces cerevisiae as long as it has glutathione synthetase activity. It may be a variant containing a mutation at a place other than “mutation of”. For such variants, the above-mentioned descriptions concerning variants of glutathione synthetase can be applied mutatis mutandis.
  • the mutant glutathione synthase has the “specific mutation” in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and further, one or several other than the “specific mutation” It may be a protein having an amino acid sequence including amino acid substitution, deletion, insertion, or addition, and having glutathione synthetase activity.
  • the mutant glutathione synthetase has a mutation in an amino acid residue corresponding to one or more amino acid residues selected from the following.
  • This mutation is a “specific mutation” in the present invention.
  • numbers indicate positions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and letters on the left side of the numbers indicate amino acid residues before mutation. That is, for example, “S28” indicates the serine residue at position 28 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position X in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 refers to the alignment between the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the target amino acid sequence.
  • amino acid residue corresponding to S28 means an amino acid residue corresponding to the serine residue at position 28 in SEQ ID NO: 2, and one amino acid residue on the N-terminal side from position 28 is deleted.
  • the 27th amino acid residue counted from the N-terminus (the methionion residue encoded by the start codon is the first) is the “amino acid residue corresponding to S28”.
  • the 29th amino acid residue counted from the N-terminal is “an amino acid residue corresponding to S28”.
  • the mutant glutathione synthetase when the wild-type glutathione synthetase has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the mutant glutathione synthetase only needs to have a mutation in the amino acid residue in SEQ ID NO: 2.
  • the mutant glutathione synthetase when the wild-type glutathione synthetase is a variant of a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the mutant glutathione synthetase is an amino acid residue corresponding to the amino acid residue in SEQ ID NO: 2. It suffices to have a mutation.
  • the mutant glutathione synthetase is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence comprising one or several amino acid substitutions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a sequence number
  • the amino acid residue corresponding to the amino acid residue in SEQ ID NO: 2 may have a mutation.
  • Alignment can be performed using, for example, known gene analysis software.
  • Specific software includes DNA Solutions from Hitachi Solutions and GENETYX from Genetics (Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24 (1), 72-96, 1991; Barton GJ et) al., Journal of molecular biology, 198 (2), 327-37. 1987).
  • mutant glutathione synthetase preferably has a mutation in an amino acid residue corresponding to one or more amino acid residues selected from the following among the above amino acid residues.
  • the numbers and the meanings of the characters to the left of the numbers are the same as described above.
  • the amino acid residue after the mutation may be any amino acid residue other than the original amino acid residue as long as the mutant glutathione synthetase has glutathione synthetase activity.
  • the substrate specificity for “X” of ⁇ -Glu-X may be the same between wild-type glutathione synthetase and mutant glutathione synthetase. Well, it can be different. For example, when the wild-type glutathione synthetase can recognize ⁇ -Glu-Cys as a substrate, the mutant glutathione synthetase may or may not recognize ⁇ -Glu-Cys as a substrate.
  • Specific mutations at the positions include mutations corresponding to mutations selected from the following.
  • the numbers and the meanings of the characters to the left of the numbers are the same as described above.
  • the character on the right side of the number or the character in parentheses on the right side of the number indicates the amino acid residue after mutation. That is, for example, “S28T” indicates a mutation in which the Ser residue at position 28 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is replaced with a Thr residue.
  • “L132 (I, M, V)” is a substitution of the Lys residue at position 132 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 with any amino acid residue selected from Ile, Met, and Val. The mutation is shown.
  • mutantation corresponding to the mutation of the amino acid residue at position X in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 refers to the alignment between the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the target amino acid sequence.
  • mutation corresponding to S28T refers to a mutation in which an amino acid residue corresponding to the Ser residue at position 28 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with a Thr residue.
  • mutations in which the synthetic activity of ⁇ -Glu-Val-Gly or ⁇ -Glu-Nva-Gly is confirmed are preferable.
  • Specific examples of such a mutation include a mutation corresponding to a mutation selected from the following. In the following notation, the meanings of the numbers, the characters on the left side of the numbers, and the characters on the right side of the numbers or the characters in the parentheses on the right side of the numbers are the same as described above.
  • mutations corresponding to mutations selected from the following are more preferable.
  • the meanings of the numbers, the characters on the left side of the numbers, and the characters on the right side of the numbers are the same as described above.
  • mutations corresponding to the mutations shown below include mutations corresponding to the mutations shown below.
  • the meanings of the numbers, the characters on the left side of the numbers, and the characters on the right side of the numbers are the same as described above.
  • the combination of two or more mutations represented by “+” indicates double mutation or multiple mutations. That is, for example, “S28T + S44T” indicates a double mutation of S28T and S44T.
  • multiple mutations may be described as “(S28T + S44T)” with parentheses.
  • Mutant glutathione synthetase can be obtained by modifying the gene encoding wild-type glutathione synthetase so that the encoded glutathione synthetase has the “specific mutation” and expressing the resulting modified gene .
  • Introduction of such mutations is achieved by modifying the gene encoding wild-type glutathione synthase so that the amino acid residue at a specific position is replaced with another amino acid, for example, by site-directed mutagenesis. it can.
  • ⁇ -glutamylcysteine synthetase used in the present invention is selected from the amino acids represented by X, ie, valine, norvaline, leucine, ⁇ -aminobutyric acid, and isoleucine. It is not particularly limited as long as it has an activity of catalyzing a reaction of recognizing one or more amino acids as a substrate and binding to Glu to produce a peptide represented by ⁇ -Glu-X. In the present invention, the activity catalyzing the reaction is referred to as ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity.
  • the ⁇ -glutamylcysteine synthetase used in the present invention does not need to exhibit ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity for any X, and may exhibit ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity for the amino acid selected as X.
  • ⁇ -glutamylcysteine synthetases may be used.
  • ⁇ -glutamylcysteine synthetase may have an activity of catalyzing a reaction of generating ⁇ -Glu-Cys or ⁇ -Glu-Cys derivative from Glu and Cys or Cys derivative. It does not have to be good.
  • the origin of the ⁇ -glutamylcysteine synthetase used in the present invention is not particularly limited, and an enzyme derived from any organism such as a microorganism, a plant, or an animal can be used, but one derived from a microorganism is preferred.
  • the microorganism include eukaryotic microorganisms such as yeast, and bacteria such as enteric bacteria and coryneform bacteria.
  • Examples of the ⁇ -glutamylcysteine synthetase used in the present invention include a protein encoded by the GSH1 gene of Saccharomyces cerevisiae.
  • the base sequence of the GSH1 gene of Saccharomyces cerevisiae is disclosed in Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/).
  • the nucleotide sequence of the GSH1 gene of Saccharomyces cerevisiae S288C strain (ATCC No. 26108) and the amino acid sequence encoded by this gene are shown in SEQ ID NOs: 239 and 240, respectively.
  • examples of the ⁇ -glutamylcysteine synthetase used in the present invention include a protein encoded by the CSH1 gene of Candida utilis.
  • the base sequence of Candida utilis GSH1 gene is disclosed in US Pat. No. 7,553,638.
  • the ⁇ -glutamylcysteine synthetase used in the present invention includes a protein encoded by the gshA gene of Escherichia coli.
  • the gshA gene of Escherichia coli K12 MG1655 strain corresponds to the complementary sequence of the 2812905 to 2814461 positions in the genome sequence registered as GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI: 49175990) in the NCBI database.
  • the ⁇ -glutamylcysteine synthetase used in the present invention may be a variant of a protein having the amino acid sequence as long as it has ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity.
  • the above-mentioned descriptions concerning the glutathione synthase variants can be applied mutatis mutandis.
  • the present invention provides a yeast (also referred to as “the yeast of the present invention”) having a DNA encoding a mutant glutathione synthase.
  • the yeast of the present invention can be obtained by introducing DNA encoding a mutant glutathione synthetase into an appropriate strain of yeast, for example, a strain described later.
  • Introduction of a DNA encoding a mutant glutathione synthetase can be achieved, for example, by introducing a vector containing a DNA encoding a mutant glutathione synthetase into yeast and retaining the vector.
  • Introducing DNA encoding a mutant glutathione synthetase can be achieved, for example, by inserting a DNA encoding a mutant glutathione synthetase into a yeast chromosome by homologous recombination.
  • a technique for introducing such a gene into a host for example, a known technique can be used. Specifically, for example, the technique described in “(4) Preparation of enzyme used in the present invention” can be used.
  • the yeast of the present invention may be a budding yeast or a fission yeast.
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • Candida utilis Candida utilis
  • genus Pichia pastel Piichia ⁇ ⁇ pastoris
  • Pichia genus Hansenula polymorpha (Hansenula morph)
  • yeast belonging to the genus Hansenula examples include yeast belonging to the genus Hansenula.
  • the fission yeast include yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces pombe, such as Schizosaccharomyces pombe.
  • yeast belonging to the genus Saccharomyces is preferable, and Saccharomyces cerevisiae is more preferable.
  • the yeast of the present invention may be haploid or may have diploidity or higher ploidy.
  • Saccharomyces cerevisiae AJ14956 can be used as the Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae AJ14956 was deposited and commissioned on August 18, 2010 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (address: postal number 305-8666, 1-chome, 1-chome, 1-chome, Tsukuba, Ibaraki) The number FERM BP-11299 is assigned.
  • Saccharomyces cerevisiae specifically, BY4743 strain (ATCC201390) and S288C strain (ATCC26108) can be used.
  • Candida utilis specifically, Candida utilis ATCC22023 strain can be used. These stocks can be sold, for example, from the American Type Culture Collection (address 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America). That is, a registration number corresponding to each strain is given, and it is possible to receive a sale using this registration number (see http://www.atcc.org/). The registration number corresponding to each strain is described in the catalog of American Type Culture Collection.
  • the method for obtaining the enzyme used in the present invention is not particularly limited.
  • the enzyme used in the present invention can be prepared from an organism having the enzyme activity, for example, a wild strain or a mutant strain of a microorganism having the enzyme activity.
  • the organism having the activity of the enzyme is preferably an organism having an enhanced activity of the enzyme. Examples of such an organism include a transformant in which expression of a gene encoding the enzyme used in the present invention is enhanced by genetic engineering techniques.
  • the phrase “enzyme activity is enhanced” is not limited to increasing the enzyme activity in a microorganism that inherently has the enzyme activity, and is a microorganism that does not inherently have the enzyme activity. And imparting the activity of the enzyme.
  • transformed hosts include bacterial cells, actinomycetes cells, yeast cells, fungal cells, plant cells, insect cells, and animals. Cells or the like can be used. As the host to be transformed, microbial cells are preferably used.
  • the microorganisms for which host-vector systems have been developed include Escherichia bacteria, Pseudomonas bacteria, Corynebacterium bacteria, Arthrobacter bacteria, Bacillus. ) Genus bacteria, Aspergillus fungi and the like. Among these, Escherichia coli (E. coli) or Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) is preferably used.
  • Enhancement of gene expression can be achieved, for example, by replacing the promoter of the gene on the chromosome with a stronger one.
  • a promoter examples include T7 promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, and PL promoter.
  • substitution to a strong promoter can be used in combination with the improvement of the translation efficiency of the gene and the increase in the copy number of the gene, which will be described later.
  • enhancement of gene expression can be achieved, for example, by improving gene translation efficiency. It is known that the substitution of several nucleotides in the spacer region between the ribosome binding site (RBS) and the start codon, particularly in the sequence immediately upstream of the start codon, greatly affects the translation efficiency of mRNA. The translation efficiency can be improved by modifying.
  • RBS ribosome binding site
  • enhancement of gene expression can be achieved, for example, by increasing the copy number of the gene.
  • Increase in gene copy number can be achieved by introducing the target gene onto the chromosome.
  • Introduction of a gene onto a chromosome can be performed using, for example, homologous recombination.
  • multiple copies of a gene can be introduced into a chromosome by performing homologous recombination with a sequence having multiple copies in the chromosome as a target.
  • sequences having multiple copies in the chromosome include, but are not limited to, repetitive DNA or an inverted repeat sequence at the end of a transposable element.
  • examples of sequences having many copies in the chromosome include autonomously replicating sequences (ARS) consisting of unique short repetitive sequences and rDNA sequences having about 150 copies.
  • ARS autonomously replicating sequences
  • the increase in the copy number of a gene can also be achieved by introducing a vector containing the target gene into a host organism.
  • a vector to be used a multicopy vector is preferable.
  • the vector preferably has a marker such as an ampicillin resistance gene.
  • examples of multi-copy vectors that can be used for Escherichia coli include pUC-based plasmids, pBR322-based plasmids, and plasmids having a ColE1 origin of replication such as derivatives thereof.
  • the “derivative” means a plasmid modified by base substitution, deletion, insertion, addition or inversion.
  • the modification here includes mutagenesis using mutagen and UV irradiation, and modifications caused by natural mutation and random mutation.
  • Suitable vectors that can be used for Escherichia coli include pTrc99A (Pharmacia), pUC (Takara Bio), pPROK (Clontech), pKK233-2, which are commercially available expression vectors having a strong promoter. (Clontech), pET (Novagen), pQE (Qiagen) and the like.
  • vectors examples include shuttle vectors for Escherichia coli-Bacillus subtilis such as pHY300PLK, pGK12, pLF14, and pLF22, and phage vectors such as 11059, 1BF101, M13mp9, and Mu phage (Japanese Patent Laid-Open No. 2-109855).
  • transposons such as Mu, Tn10, and Tn5 (Berg, DE and Berg, CM, Bio / Technol., 1, 417 (1983)) can be used.
  • a transposon when a transposon is used as a vector, as described above, the gene copy number increases when the target gene is transferred and introduced onto the chromosome.
  • vectors that can be used in yeast include plasmids having a CEN4 replication origin and multicopy plasmids having a 2 ⁇ m DNA replication origin.
  • a transformant with enhanced gene expression can be obtained by transforming a host with an expression plasmid in which a DNA fragment obtained by sequentially linking a promoter and a gene to a vector as described above is inserted.
  • Some vectors contain a promoter suitable for gene expression. When such a vector is used and a gene is linked downstream to a promoter contained in the vector, a separate promoter is used in the vector. There is no need to insert.
  • a terminator which is a transcription termination sequence, may be linked downstream of the gene. Examples of the terminator include T7 terminator, fd phage terminator, T4 terminator, tetracycline resistance gene terminator, Escherichia coli trpA gene terminator, and the like.
  • the method of transformation is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • a conventionally known method can be used.
  • D. M.M. Morrison's method Methods in Enzymology 68, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 3261979 (1979)
  • a method in which recipient cells are treated with calcium chloride to increase DNA permeability Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)
  • a method used for transformation of ordinary Escherichia bacteria can be carried out by a method used for transformation of ordinary Escherichia bacteria.
  • yeast transformation methods include protoplast method, KU method (H. Ito et al., J. Bateriol., 153-163 (1983)), KUR method (fermentation and industrial vol.43, p.630- 637 (1985)), electroporation method (Luis et al., FEMS micro microbiology Letters 165 (1998) 335-340), method using carrier DNA (Gietz RD and Schiestl RH, Methods Methods Mol. Cell. Biol. 5: 255-269 (1995)) and the like, a method usually used for yeast transformation can be employed.
  • the culture conditions of the transformant in which the expression of the gene encoding the enzyme used in the present invention obtained as described above is enhanced, and the conditions for inducing production of the enzyme are the type of marker, the type of promoter, and the type used. What is necessary is just to select suitably according to the kind etc. of a host.
  • the medium used for culturing Escherichia coli transformants is preferably a medium used for culturing normal Escherichia coli such as 2 ⁇ YT medium, M9-casamino acid medium, LB medium, etc. it can.
  • the medium used for culturing the yeast transformant is not particularly limited as long as the yeast can grow, and a medium usually used industrially can be used.
  • an SD medium or a YPD medium can be suitably used.
  • the bacterial cells are collected and crushed or dissolved to obtain an enzyme-containing solution.
  • crushing the cells for example, ultrasonic crushing, French press crushing or glass bead crushing can be suitably used.
  • cells are lysed, for example, egg white lysozyme, peptidase treatment, or an appropriate combination thereof can be used.
  • a residue can be removed by centrifugation etc. as needed.
  • the target enzyme is present in the culture supernatant
  • the culture supernatant can be used as an enzyme-containing solution.
  • the recovery of the enzyme from the enzyme-containing solution can be performed by a known method used for enzyme purification. Such methods include ammonium sulfate precipitation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxyapatite chromatography and the like.
  • the target enzyme When the target enzyme is produced as a fusion protein with another protein or peptide, the target enzyme can be purified by affinity chromatography using the affinity for the fused protein or peptide.
  • the preparation of the enzyme using the transformant with enhanced expression of the gene encoding the enzyme used in the present invention has been described. However, in other cases, it can be appropriately modified and applied as necessary. . For example, even when a wild strain or a mutant strain of a microorganism having the activity of the enzyme used in the present invention is used as an enzyme acquisition source, the cell is grown to produce the target enzyme, and the enzyme is prepared. Can do.
  • an enzyme purified as described above may be used, or an unpurified enzyme may be used.
  • the unpurified enzyme include a culture supernatant obtained by culturing a microorganism that produces the enzyme, and an enzyme-containing solution such as a crushed product of the microorganism.
  • the enzyme can be used in the state of an immobilized enzyme immobilized on an arbitrary carrier.
  • a culture containing microbial cells producing an enzyme or a treated product of the culture may be used as the enzyme.
  • the treated product of the culture include cells separated and collected from the culture, and treated cells obtained by immobilizing, treating with acetone, freeze drying, and the like.
  • Method for producing ⁇ -Glu-X-Gly is characterized by utilizing the activity of glutathione synthetase. To do.
  • the first aspect of the method of the present invention includes a step of generating ⁇ -Glu-X-Gly by causing glutathione synthetase to act on ⁇ -Glu-X and Gly. , ⁇ -Glu-X-Gly. That is, in the first embodiment, Gly is added to ⁇ -Glu-X in the reaction raw material by the action of glutathione synthetase to produce ⁇ -Glu-X-Gly.
  • ⁇ -Glu-X used as a substrate may be produced by any method.
  • ⁇ -Glu-X can be produced by an enzymatic reaction using ⁇ -glutamylcysteine synthetase using a raw material containing Glu and X.
  • ⁇ -Glu-X can be obtained by recovering from the cells or culture supernatant of a microorganism having the ability to produce ⁇ -Glu-X.
  • the microorganism having the ability to produce ⁇ -Glu-X may be a wild strain or a mutant strain of a microorganism, or a transformant produced using a genetic engineering technique.
  • a transformant having the ability to produce ⁇ -Glu-X can be obtained, for example, by introducing a gene encoding ⁇ -glutamylcysteine synthetase into an appropriate strain by a known technique.
  • the first aspect of the method of the present invention may further include a step of generating ⁇ -Glu-X by the method as described above. That is, for example, in one aspect of the first aspect (hereinafter also referred to as the second aspect), a step of producing ⁇ -Glu-X by causing ⁇ -glutamylcysteine synthetase to act on Glu and X (hereinafter referred to as “the second aspect”). Step (A)), and a step of producing ⁇ -Glu-X-Gly by allowing glutathione synthase to act on ⁇ -Glu-X and Gly produced in step (A) (hereinafter referred to as step (B)) And ⁇ -Glu-X-Gly.
  • ⁇ -Glu-X is produced from Glu and X in the reaction raw material by the action of ⁇ -glutamylcysteine synthetase, and Gly is further added by the action of glutathione synthase to give ⁇ -Glu- X-Gly is generated.
  • step (A) and step (B) may proceed separately.
  • ⁇ -Glu-X produced in step (A) may be recovered, and step (B) may be advanced using the recovered ⁇ -Glu-X.
  • step (B) may be advanced by adding glutathione synthase, Gly, or both to the reaction system. .
  • the step (A) and the step (B) may proceed simultaneously. Both steps may proceed simultaneously during the entire reaction process, or may proceed simultaneously during only a part of the reaction process. When both steps are performed simultaneously, both enzymes and Glu, X, and Gly may be present in the reaction system. For example, by allowing all of them to coexist at the start of the reaction, both steps can be started simultaneously.
  • the step (B) may be advanced by adding glutathione synthase, Gly, or both to the reaction system at an arbitrary point in the reaction process.
  • a further aspect of the method of the present invention (hereinafter also referred to as the third aspect) is to produce ⁇ -Glu-X-Gly by allowing ⁇ -glutamylcysteine synthetase and glutathione synthetase to act on Glu, X, and Gly.
  • a process for producing ⁇ -Glu-X-Gly That is, in the third embodiment, ⁇ -Glu-X is produced from Glu and X in the reaction raw material by the action of ⁇ -glutamylcysteine synthase, and Gly is further added by the action of glutathione synthase. X-Gly is considered to be generated.
  • ⁇ -Glu-X-Gly can be produced by allowing ⁇ -glutamylcysteine synthetase and glutathione synthetase, and Glu, X, and Gly to coexist in the reaction system. Further, for example, ⁇ -glutamylcysteine synthetase may be acted first, and then glutathione synthetase may be additionally added to the reaction system at any time point. In addition, when glutathione synthetase is made to act additionally in the third aspect, Glu, X, or both may not remain in the reaction system at the time when glutathione synthetase acts.
  • ⁇ -Glu-X and Gly in the first aspect Glu, X, ⁇ -Glu-X, and Gly in the second aspect, and Glu, X, and Gly in the third aspect are collectively referred to. Also called “substrate”.
  • glutathione synthetase in the first embodiment, and the ⁇ -glutamylcysteine synthetase and the glutathione synthetase in the second and third embodiments are also collectively referred to as “enzymes”.
  • the enzyme reaction is preferably performed in an aqueous solvent such as water or a buffer solution.
  • the enzyme reaction may be performed, for example, by containing each substrate and each enzyme in the reaction solution, or may be performed by supplying a reaction solution containing each substrate to the immobilized enzyme. That is, for example, the enzyme reaction may be performed in a batch system or a column system. In the case of the batch type, necessary substrates and enzymes may be mixed in the reaction solution in the reaction vessel. The enzyme reaction may be performed by standing or may be performed with stirring. In the case of a column type, a reaction solution containing a necessary substrate may be passed through a column packed with an immobilized enzyme.
  • the pH of the reaction solution is not particularly limited as long as the enzyme used functions, and can be set as appropriate according to the properties of the enzyme used.
  • the pH of the reaction solution is, for example, preferably 6 to 11, more preferably 8 to 10, and particularly preferably 8.5 to 9.5.
  • the concentration of each substrate in the reaction solution is not particularly limited. For example, it is preferably 1 ⁇ M or more, more preferably 100 ⁇ M or more, and particularly preferably 1 mM or more. Moreover, although the upper limit of a density
  • the concentration ratio of each substrate is not particularly limited, but it may be preferable to adjust the concentration of each substrate in the reaction solution from the viewpoint of the yield of ⁇ -Glu-X-Gly and purification. That is, for example, in the first embodiment, it may be preferable that the ratio of the concentrations of ⁇ -Glu-X and Gly is close to 1: 1.
  • the concentration of each enzyme in the reaction solution or the concentration of each immobilized enzyme is not particularly limited, and various conditions such as enzyme properties, X type, Gly type, raw material concentration, reaction temperature, and reaction time. What is necessary is just to set suitably according to.
  • the concentration of each enzyme in the reaction solution is, for example, preferably 1 ⁇ g / ml to 100 mg / ml, and more preferably 10 ⁇ g / ml to 10 mg / ml.
  • the concentration of each immobilized enzyme is, for example, preferably 2 to 200 mg / g carrier, and more preferably 10 to 100 mg / g carrier.
  • an essential factor for the enzyme reaction is present.
  • Factors essential for the enzymatic reaction include ATP in both the reaction with glutathione synthetase and the reaction with ⁇ -glutamylcysteine synthetase.
  • ATP is used as an energy source for peptide bond formation.
  • ATP may be supplied to the reaction system so that the enzyme used in the present invention can use ATP for peptide bond formation.
  • ATP can be supplied as a powder or as an aqueous solution to a reaction solution for generating and accumulating ⁇ -Glu-X-Gly.
  • an ATP regeneration system may be used instead of adding expensive ATP directly.
  • a catalyst such as a purified enzyme, crude enzyme, fungus body, or treated cell product having ATP regeneration ability and a substrate used for ATP regeneration to the reaction system
  • a method for using the ATP regeneration system specifically, a method of adding a cultured cell of Corynebacterium ammoniagenes (C. amoniagenes) and a carbon source (Biosci. Biotechnol. Biochem., Bio 65, 644). -650 (2001)), a method of adding polyphosphate kinase and polyphosphate (J. Biosci. Bioeng., 91, 557-563 (2001)), a method of adding creatine phosphorylase and creatine phosphate, etc. .
  • reaction solution composition in which the cation is not chelated, but there is no limitation as long as the action of the cation is maintained.
  • a buffer solution with a low possibility that a cation is chelated a HEPES buffer, a MES buffer, a GTA wide area buffer, etc. are mentioned.
  • other optional components may be present in the reaction solution as long as the production of ⁇ -Glu-X-Gly can be achieved.
  • organic solvents such as alcohols, esters, ketones, and amides can be contained.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as the enzyme used functions, and can be appropriately set according to the properties of the enzyme.
  • the reaction temperature is usually 10 ° C. to 80 ° C., preferably 15 ° C. to 60 ° C., more preferably 20 ° C. to 50 ° C., and further preferably 30 ° C. to 45 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, and may be set as appropriate according to various conditions such as enzyme properties and reaction temperature.
  • the reaction time is usually preferably from 5 minutes to 200 hours, for example. Further, for example, when the reaction is performed in a column type, the liquid passing speed may be set so as to achieve the preferable reaction time.
  • each substrate, each enzyme, and other components may be added to the reaction system alone or in any combination. These components may be added once or a plurality of times, or may be added continuously. Further, uniform conditions from the start of the reaction to the end of the reaction may be used, and the conditions may be changed in the course of the reaction. Note that changing the conditions in the course of the reaction is not limited to changing the conditions in terms of time. For example, in the case of performing a column reaction using an immobilized enzyme, the reaction temperature, enzyme concentration, etc. Including spatially changing the condition. For example, in the case where the immobilized enzyme is used in the second or third aspect, ⁇ -glutamylcysteine synthetase and glutathione synthetase may be mixed and arranged separately. Good.
  • the preferable conditions on which glutathione synthetase and ⁇ -glutamylcysteine synthetase act are different from each other, it is suitable for ⁇ -glutamylcysteine synthetase in the course of the reaction. It may be effective to change the conditions to conditions suitable for glutathione synthase.
  • the production of ⁇ -Glu-X-Gly can be confirmed by any method used for detection or identification of a compound.
  • Such techniques include HPLC, LC / MS, GC / MS, and NMR.
  • ⁇ -Glu-X-Gly produced according to the present invention can be isolated using a commonly used peptide purification method.
  • ⁇ -Glu-X-Gly can be isolated from a reaction supernatant obtained by removing solids by centrifugation, if necessary, by combining operations such as ion exchange resin, membrane treatment, and crystallization. it can.
  • ⁇ -Glu-X-Gly may be isolated after disrupting the cells and the like.
  • Example 1 Construction of Saccharomyces cerevisiae-derived wild-type glutathione synthase gene (GSH2) expression plasmid pET-GSH2 Expression plasmid pET-GSH2 encoding the wild-type glutathione synthetase of Saccharomyces cerevisiae S288C strain (ATCC26108) It was constructed according to the following procedure and introduced into Escherichia coli. An outline of the construction procedure is shown in FIG.
  • Primer A (SEQ ID NO: 3) and primer B (SEQ ID NO: 4) prepared based on the base sequence (SEQ ID NO: 1) of GSH2 gene of Saccharomyces cerevisiae S288C strain, and chromosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae S288C strain as a template
  • the sequence containing the GSH2 gene was amplified by PCR.
  • Primer A is obtained by adding a KpnI recognition sequence and a partial sequence of yeast expression plasmid pAUR123 to the 5 'end of the region containing the start codon of the GSH2 gene of the chromosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae S288C.
  • Primer B includes a base sequence complementary to the C-terminal base sequence of the GSH2 gene, a base sequence complementary to a sequence encoding a His tag, a base sequence complementary to a stop codon (TAA), an XbaI recognition sequence, and yeast A partial sequence of the expression plasmid pAUR123 is added.
  • PCR was performed according to the manual using PrimeSTAR Max DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.). The amplified fragment was introduced into the KpnI-XbaI site of the yeast expression plasmid pAUR123 (Takara Bio) using In-Fusion Advantage PCR Kit (Takara Bio) to obtain the yeast expression plasmid pAUR-GSH2. .
  • Primer C (SEQ ID NO: 5) and Primer D (SEQ ID NO: 6) prepared from the base sequence (SEQ ID NO: 1) of the GSH2 gene of Saccharomyces cerevisiae S288C strain were purchased from Nippon Bioservice.
  • Primer C is obtained by adding a base sequence containing an NdeI recognition sequence to the 5 'end of the region containing the start codon of the GSH2 gene in the chromosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae S288C strain.
  • Primer D is obtained by adding a base sequence containing an XhoI recognition sequence to the 5 'end of a base sequence complementary to the base sequence outside the stop codon of the GSH2 gene of pAUR-GSH2.
  • the sequence containing the GSH2 gene was amplified by PCR using Primer C and Primer D and the above-mentioned pAUR-GSH2 as a template. PCR was performed using plasmid DNA, 0.2 ⁇ mol / L of each primer, 1.25 unit PrimeSTAR HS DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), 10 ⁇ L of 5 ⁇ PrimeSTAR buffer (manufactured by Takara Bio Inc.), 2.5 mmol / L dNTP each. 50 ⁇ l of a reaction solution containing (dATP, dGTP, dCTP, and dTTP) is prepared, heated at 98 ° C. for 10 seconds, and then subjected to 30 steps of 98 ° C. for 10 seconds, 56 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 2 minutes. Repeatedly, it was further heated at 72 ° C. for 1 minute.
  • the approximately 1.5 kb DNA fragment containing the GSH2 gene obtained above and the approximately 5.4 kb DNA fragment of the expression plasmid pET-21a (+) obtained above were added to TaKaRa Ligation Kit Ver. 2.1 (manufactured by Takara Bio Inc.) was reacted at 16 ° C. for 30 minutes for ligation.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were transformed by the heat shock method using the reaction solution, and the transformant was LB [10 g / L bactotryptone containing 50 ⁇ g / ml ampicillin. (Difco), 5 g / L yeast extract (Difco), 5 g / L sodium chloride (Wako)]]
  • the cells were cultured overnight at 37 ° C.
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant by a known method, and its nucleotide sequence was determined by a known method.
  • the resulting plasmid was a plasmid in which the GSH2 gene derived from Saccharomyces cerevisiae S288C strain added with a sequence encoding a His tag at the 3 ′ end was ligated downstream of the T7 promoter, and the plasmid was named pET-GSH2. .
  • the base sequence of the GSH2 gene derived from Saccharomyces cerevisiae S288C strain and the amino acid sequence encoded thereby are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) strain competent cell manufactured by Novagen
  • the transformant was LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin.
  • the cells were cultured overnight at 37 ° C.
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, and the structure was analyzed using a restriction enzyme to confirm that pET-GSH2 was retained.
  • the Escherichia coli BL21 (DE3) strain carrying this pET-GSH2 was named Escherichia coli BL21 (DE3) / pET-GSH2.
  • Example 2 Purification of wild-type Gsh2 Escherichia coli BL21 (DE3) / pET-GSH2 obtained in Example 1 was inoculated into a tube containing 3 mL of LB medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C. Cultured with shaking for 16 hours. Of the obtained culture solution, 2 ml was inoculated into a Sakaguchi flask containing 100 ml of LB medium. After shaking culture at 37 ° C. for 2 hours, isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 0.5 mmol / L, and further cultured at 30 ° C. for 4 hours. The culture broth was centrifuged to obtain wet cells.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • Example 3 Production of ⁇ -glutamyl tripeptide using wild type Gsh2 Using purified Gsh2 (wild type) derived from Saccharomyces cerevisiae S288C obtained in Example 2, ⁇ -glutamylvaline ( ⁇ -Glu-Val) Alternatively, the production of ⁇ -glutamyl tripeptide using ⁇ -glutamylnorvaline ( ⁇ -Glu-nVal) as a substrate was examined. 200 ⁇ l of a reaction solution (pH 8.0) having the following composition was prepared and reacted at 37 ° C. for 16 hours.
  • a reaction solution pH 8.0
  • the peaks of the respective reaction products are the peaks of the samples of ⁇ -glutamylvalylglycine ( ⁇ -Glu-Val-Gly) and ⁇ -glutamylnorvalylglycine ( ⁇ -Glu-nVal-Gly). Retention times were in agreement and determined to be ⁇ -Glu-Val-Gly and ⁇ -Glu-nVal-Gly.
  • the ⁇ -Glu-Val-Gly concentration was 0.13 mmol / L
  • the ⁇ -Glu-nVal-Gly concentration was 6.0 mmol / L.
  • fractionated peptide was fluorescently derivatized with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) and detected by LC-MS / MS.
  • AQC 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate
  • AQC reagent solution prepared by dissolving the above AccQ-Flor reagent kit reagent powder in 1 ml of acetonitrile
  • the obtained mixture was heated at 55 ° C. for 10 minutes, and 100 ⁇ l of a 0.1% formic acid aqueous solution was added to prepare an analytical sample.
  • Example 4 Construction of mutant GSH2 gene
  • Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (FINNZYMES) was used, and various mutant GSH2 genes were supported.
  • PCR was performed using primers (SEQ ID NOs: 7 to 238) and pET-GSH2 constructed in Example 1 as a template.
  • PCR was performed using plasmid DNA, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 0.5 unit of Phusion High-Fidelity DNA polymerase, 5 ⁇ L of 5 ⁇ Phusion HF buffer (manufactured by FINNZYMES), 2.5 mmol / L of dNTP (dATP, dGTP). , DCTP, and dTTP) are prepared, heated at 98 ° C. for 30 seconds, and then the process of 98 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 2 minutes and 30 seconds is repeated 30 times. Was done. Tables 2 to 6 show the relationship between each mutation and the primer.
  • Escherichia coli JM109 strain competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.) was transformed by the heat shock method using the reaction solution.
  • the body was applied to an LB agar medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin, and then cultured at 37 ° C. overnight.
  • Plasmids were extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, the nucleotide sequence of the DNA was confirmed by a known method, and various plasmids having a GSH2 gene mutated at the target position were obtained.
  • the expression plasmid of the GSH2 gene into which multiple mutations were introduced was prepared by sequentially introducing mutations in the same manner as described above using the expression plasmids of each mutant type GSH2 gene prepared by the above method as a template.
  • the plasmid into which each mutation was introduced was named by adding the form of each mutation to pET-GSH2.
  • a plasmid having a mutant GSH2 gene encoding a mutant Gsh2 having an E386D mutation has a mutant GSH2 gene encoding pET-GSH2 (E386D) and a mutant Gsh2 having two mutations E386D and Y446F.
  • the plasmid is designated pET-GSH2 (E386D + Y446F).
  • the expression plasmids of the mutant GSH2 gene may be collectively referred to as pET-GSH2 (XXX).
  • Escherichia coli BL21 (DE3) strain competent cell manufactured by Invitrogen
  • pET-GSH2 XXX
  • the transformant contained 100 ⁇ g / mL ampicillin.
  • the cells were cultured overnight at 37 ° C., and the obtained transformant was used for further studies.
  • Example 5 Purification of mutant Gsh2 100 ⁇ g of Escherichia coli BL21 (DE3) [Escherichia coli BL21 (DE3) / pET-GSH2 (XXX)] carrying pET-GSH2 (XXX) obtained in Example 4
  • a test tube containing 3 mL of LB medium containing / ml ampicillin was inoculated and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours. 400 ⁇ l of the obtained culture solution was inoculated into a test tube containing 20 ml of LB medium. After shaking culture at 37 ° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the wet cells are suspended in 1 mL of BugBuster Master Mix (manufactured by Novagen), protein is extracted, and then centrifuged from the supernatant obtained from Ni Sepharose 6 Fast Flow (His-tagged protein purification kit, GE Healthcare). His-tagged recombinant Gsh2 was purified according to the manual, and purified Gsh2 (mutant) containing 500 mmol / L imidazole was obtained.
  • Example 6 Evaluation of ability to synthesize ⁇ -glutamyl tripeptide by mutant Gsh2 Using each purified Gsh2 (mutant) obtained in Example 5, ⁇ -glutamylcysteine ( ⁇ -Glu-Cys), ⁇ -glutamylvaline ( ⁇ -Glu-Val) or ⁇ -glutamylnorvaline ( ⁇ -Glu-nVal) as a substrate was examined for the production of ⁇ -glutamyltripeptide. 200 ⁇ l of a reaction solution (pH 8.0) having the following composition was prepared, and the reaction using ⁇ -Glu-Cys substrate was performed at 37 ° C. for 2 minutes, the reaction using ⁇ -Glu-Val substrate was performed for 30 minutes, and ⁇ -Glu.
  • a reaction solution pH 8.0
  • Example 7 Kinetic analysis of Gsh2 (7-1) Large-scale purification of wild-type Gsh2 and mutant Gsh2 In order to analyze the kinetics of wild-type Gsh2 and mutant Gsh2, purified enzyme was purified by the following procedure. Prepared.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • Example 8 Construction of ⁇ -glutamylcysteine synthetase gene (GSH1) expression plasmid pET-GSH1 derived from Saccharomyces cerevisiae Expression plasmid pET-GSH1 encoding the ⁇ -glutamylcysteine synthetase of S288C strain of Saccharomyces cerevisiae It was constructed according to the following procedure and introduced into Escherichia coli. An outline of the construction procedure is shown in FIG.
  • Primer E (SEQ ID NO: 241) and primer F (SEQ ID NO: 242) prepared based on the base sequence (SEQ ID NO: 239) of GSH1 gene of Saccharomyces cerevisiae S288C strain, and chromosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae S288C strain as template
  • the sequence containing the GSH1 gene was amplified by PCR.
  • Primer E is obtained by adding a KpnI recognition sequence and a partial sequence of the yeast expression plasmid pAUR123 to the 5 'end of the region containing the start codon of the GSH1 gene of the chromosomal DNA of the Saccharomyces cerevisiae strain.
  • Primer F includes a base sequence complementary to the sequence encoding the His tag in a base sequence complementary to the C-terminal base sequence of the GSH1 gene, a base sequence complementary to a stop codon (TAA), an XbaI recognition sequence, and yeast expression A partial sequence of plasmid pAUR123 is added. PCR was performed according to the manual using PrimeSTAR Max DNA polymerase.
  • the amplified fragment was introduced into the KpnI-XbaI site of the yeast expression plasmid pAUR123 using the In-Fusion Advantage PCR Kit based on the manual to prepare the yeast expression plasmid pAUR-GSH1.
  • Primer G (SEQ ID NO: 243) and Primer H (SEQ ID NO: 244) prepared from the base sequence (SEQ ID NO: 239) of the GSH1 gene of Saccharomyces cerevisiae S288C strain were purchased from Nippon Bioservice.
  • the primer is obtained by adding a base sequence containing a SpeI recognition sequence to the 5 'end of a region containing the next of the start codon of the GSH1 gene of chromosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae S288C strain.
  • the primer is obtained by adding a base sequence containing a SalI recognition sequence to the 5 'end of a base sequence complementary to the base sequence outside the stop codon of the GSH1 gene of pAUR-GSH1.
  • PCR is a reaction containing plasmid DNA, 0.2 ⁇ mol / L of each primer, 1.25 unit of PrimeSTAR HS DNA polymerase, 10 ⁇ L of 5 ⁇ PrimeSTAR buffer, and 2.5 mmol / L of dNTP (dATP, dGTP, dCTP and dTTP).
  • dNTP dATP, dGTP, dCTP and dTTP.
  • the DNA fragment was purified using MinElute Reaction Cleanup Kit and dissolved in 15 ⁇ l of Buffer EB. Next, using the total amount of the obtained DNA solution, the DNA fragment was dephosphorylated with Alkaline Phosphatase, Calf intestine (CIAP), purified using MinElute Reaction Cleanup Kit, and dissolved in 10 ⁇ l of Buffer EB.
  • the approximately 2.0 kb DNA fragment containing the GSH1 gene obtained above and the approximately 5.4 kb DNA fragment of the expression vector pET-21a (+) obtained above were added to TaKaRa Ligation Kit Ver. Using 2.1, the reaction was carried out at 16 ° C. for 30 minutes for ligation. Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.) was transformed by the heat shock method using the reaction solution, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin. Cultured overnight at 37 ° C.
  • a plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, and its base sequence was determined by a known method.
  • the obtained plasmid was a plasmid in which a GSH1 gene derived from Saccharomyces cerevisiae S288C strain added with a sequence encoding a His tag sequence at the 3 'end was ligated downstream of the T7 promoter and was named pET-GSH1.
  • the base sequence of the GSH1 gene derived from Saccharomyces cerevisiae S288C strain and the amino acid sequence encoded thereby are shown in SEQ ID NO: 239 and SEQ ID NO: 240, respectively.
  • Escherichia coli Rosetta2 (DE3) pLysS strain competent cells were transformed with the heat shock method using pET-GSH1, and the transformants were transformed with 100 ⁇ g / ml ampicillin and 30 ⁇ g / ml chloramphenicol. After being applied to an LB agar medium containing the solution, the cells were cultured overnight at 37 ° C. A plasmid was extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, and the structure was analyzed using a restriction enzyme to confirm that pET-GSH1 was retained.
  • the Escherichia coli Rosetta2 (DE3) pLysS strain carrying pET-GSH1 was named Escherichia coli Rosetta2 (DE3) pLysS / pET-GSH1.
  • Example 9 Purification of Gsh1 Escherichia coli Rosetta2 (DE3) pLysS / pET-GSH1 obtained in Example 8 was added to 3 mL of LB medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin and 30 ⁇ g / ml chloramphenicol. The test tube was inoculated and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours. Of the obtained culture solution, 2 ml was inoculated into a Sakaguchi flask containing 100 ml of LB medium. After shaking culture at 37 ° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the wet cells are suspended in 5 mL of BugBuster Master Mix (manufactured by Novagen), extracted from the protein, and centrifuged from the supernatant obtained by using Ni Sepharose 6 Fast Flow according to the instructions.
  • the modified Gsh1 was purified. Subsequently, the purified enzyme was desalted using a PD-10 column (GE Healthcare) according to the instructions. This purified and desalted Gsh1 was used as purified Gsh1 in subsequent experiments.
  • Example 10 Production of ⁇ -glutamyl dipeptide using Gsh1 Using the purified Gsh1 obtained in Example 9, production of ⁇ -glutamyl dipeptide using valine, norvaline, or ⁇ -aminobutyric acid (Abu) as a substrate was examined. . 200 ⁇ l of a reaction solution (pH 8.5) having the following composition was prepared and reacted at 30 ° C. for 24 hours.
  • the reaction product was analyzed by HPLC under the conditions described in Example 6.
  • the peaks of the respective reaction products were ⁇ -Glu-Val, ⁇ -Glu-nVal, and ⁇ -Glu-Abu.
  • the peak of the sample coincided with the retention time, and judged to be ⁇ -Glu-Val, ⁇ -Glu-nVal, and ⁇ -Glu-Abu.
  • the ⁇ -Glu-Val concentration was 0.5 mmol / L
  • the ⁇ -Glu-nVal concentration was 4.7 mmol / L
  • the ⁇ -Glu-Abu concentration was 8.2 mmol / L.
  • Example 11 Generation of ⁇ -glutamyl tripeptide from amino acid using mutant Gsh2 Using purified Gsh1 obtained in Example 9 and purified wild-type GSH2 or purified mutant Gsh2 (S44T + L132M + L195V) obtained in Example 7 The production of ⁇ -glutamyl tripeptide from amino acids was investigated. 200 ⁇ l of a reaction solution (pH 9.0) having the following composition was prepared and reacted at 30 ° C. for 8 hours.
  • a reaction solution pH 9.0
  • the reaction product was analyzed by HPLC under the conditions described in Example 6.
  • 0.08 mmol / L of ⁇ -Glu-Val-Gly was produced, whereas mutant type Gsh2 (S44T / L132M / L195V) was produced.
  • 0.11 mmol / L of ⁇ -Glu-Val-Gly was produced, and an increase in the amount of ⁇ -Glu-Val-Gly produced due to the Gsh2 mutation was observed.
  • Example 12 Construction of YCp-type plasmid for GSH2 expression
  • YCp-type plasmid which is a one-copy type plasmid
  • Y446F an expression plasmid pCAU-PGK1p-GSH2
  • WT wild type GSH2 expression plasmid
  • Y446F mutant type GSH2
  • URA3 was cloned into the EcoRI-AatII site of pUC19
  • H4ARS was cloned into the KpnI-EcoRI site
  • CEN4 was cloned into the KpnI site
  • the PGK1 promoter was cloned into the SmaI-BamHI site
  • PGK1p was produced.
  • the wild-type GSH2 fragment was amplified using the S288C strain genome as a template, using SEQ ID NOs: 253 and 254, The obtained DNA fragment was cloned into the BamHI-SphI site of pCAU-PGK1p.
  • WT YCp-type plasmid pCAU-PGK1p-GSH2
  • mutant GSH2 (Y446F)
  • SEQ ID NOs: 253 and 254 mutation was performed using plasmid pET-GSH2 (Y446F) having mutant GSH2 (Y446F) constructed in Example 4 as a template.
  • the type GSH2 (Y446F) fragment was amplified and the resulting DNA fragment was cloned into the BamHI-SphI site of pCAU-PGK1p.
  • a YCp-type plasmid pCAU-PGK1p-GSH2 (Y446F) that expresses mutant GSH2 (Y446F) was constructed.
  • Example 13 Acquisition of uracil-requiring strain (ura3 mutant)
  • uracil-requiring strain ura3 mutant
  • URA3 the method of Sofyanovich et al.
  • the DNA near URA3 excluding the gene was introduced into a Saccharomyces cerevisiae wild-type haploid (Mat ⁇ type) strain and obtained by disrupting the URA3 gene.
  • a URA3 gene-deficient strain exhibits 5-fluoroorotic acid (5-FOA) resistance. The specific procedure is shown below.
  • 500 bp upstream of URA3 was amplified by PCR using the chromosomal DNA of the wild type strain as a template.
  • 500 bp downstream of URA3 was amplified using the primers shown in SEQ ID NOs: 257 and 258.
  • the PCR conditions were 25 ° for heat denaturation at 94 ° C. for 10 seconds, annealing at 55 ° C. for 10 seconds, and extension at 72 ° C. for 1 minute.
  • Example 14 Acquisition of uracil-requiring gsh2 ⁇ 0 strain
  • the GSH2 gene of AJ14956 was disrupted by the following procedure.
  • PCR was carried out using the GSH2 disruption strain (available from Homozygous Diploid collection, available from Open Bio Systems) in the Saccharomyces cerevisiae gene disruption strain collection as a template, and the primers shown in SEQ ID NOs: 261 and 262 were used to amplify the DNA fragment. did.
  • AJ14956 competent cells were prepared using the Frozen EZ Yeast Transformation II kit from Zymo Research, the amplified DNA fragment was introduced into the competent cells, and a YPD plate containing G418 at a concentration of 75 ⁇ g / ml Spread to. From the emerged resistant strains, a strain in which the GSH2 gene was disrupted was selected to obtain gsh2 ⁇ 0 strain, which is a uracil-requiring GSH2 disruption strain.
  • Example 15 Acquisition of wild-type GSH2 and mutant-type GSH2-expressing yeast Strains that express each GSH2 by transforming the gsh2 ⁇ 0 strain constructed in Example 14 with each GSH2 expression plasmid constructed in Example 12 was bred. Specifically, in the same manner as in Example 14, a competent cell of gsh2 ⁇ 0 strain was prepared using the Frozen EZ Yeast Transformation II kit of Zymo Research, and each GSH2 expression plasmid was introduced to thereby obtain wild type GSH2.
  • the WT strain (gsh2 ⁇ 0 / pCAU-PGK1p-GSH2 (WT)) and the Y446F strain (gsh2 ⁇ 0 / pCAU-PGK1p-GSH2 (Y446F)) expressing the mutant GSH2 (Y446F) were obtained.
  • Example 16 Verification of Effect of Y446F Mutation
  • the effect of the Y446F mutation of glutathione synthetase on the ⁇ -Glu-Val-Gly content in bacterial cells was verified.
  • the WT strain and the Y446F strain were each inoculated into SD medium (50 ml in a 500 ml Sakaguchi flask) for 1 ase and cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm for 24 hours.
  • SD medium composition Glucose 2% Nitrogen Base 1-fold concentration (10-fold concentration Nitrogen Base was prepared by dissolving 1.7 g of Bacto Yeast Nitrogen Base w / o Amino Acids and Ammonium Sulfate (Difco) and 5 g of ammonium sulfate in 100 ml of sterilized water. pH adjusted to about 5.2 and filter sterilized)
  • the absorbance of the obtained culture broth was measured so that the initial OD660 was 0.01 (absorbance was measured using DU640 SPECTROPHOTOMETER of BECKMAN COULTER).
  • the final concentration was 100 ppm ⁇ -Glu-.
  • Inoculated into SD medium containing Val 50 ml in a 500 ml Sakaguchi flask
  • the filter-sterilized Gly solution was added to the culture solution to a final concentration of 750 ppm, and the culture was continued.
  • 10 ODunits (bacteria contained in 1 ml of culture solution with OD660 of 1 is defined as 1 ODunit) from the culture medium cultured for 0 hour, 1 hour, and 4 hours after the addition of the Gly solution is collected by centrifugation. did. The supernatant was removed as much as possible, and the remaining cells were suspended in 15 ml of milliQ water. The cells were collected again by centrifugation and resuspended in 15 ml of milliQ water. By repeating this operation three times in total, the medium was completely removed from the cells. The obtained washed cells were suspended in about 0.5 ml of milliQ water and heated at 70 ° C. for 10 minutes. In this step, the extract contained in the cells was extracted. Next, the extract and the cell residue were separated by centrifugation.
  • the content of ⁇ -Glu-Val-Gly contained per dry cell was calculated from the amount of ⁇ -Glu-Val-Gly and the dry cell weight contained in a certain amount of the culture medium thus measured.
  • Table 13 shows changes with time in the ⁇ -Glu-Val-Gly content of the cells.
  • AQC reagent solution prepared by dissolving the above AccQ-Fluor reagent kit reagent powder in 1 mL of acetonitrile
  • the obtained mixture was heated at 55 ° C. for 10 minutes, and then 100 ⁇ L of a 0.1% formic acid aqueous solution was added to prepare an analysis sample.
  • a peptide represented by ⁇ -Glu-X-Gly or a salt thereof can be produced.
  • SEQ ID NO: 1 Base sequence of GSH2 gene derived from Saccharomyces cerevisiae
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of Gsh2 protein derived from Saccharomyces cerevisiae
  • SEQ ID NO: 3 Forward primer for amplifying GSH2 gene derived from Saccharomyces cerevisiae (Primer A)
  • SEQ ID NO: 4 Reverse primer (primer B) for amplifying the GSH2 gene derived from Saccharomyces cerevisiae
  • SEQ ID NO: 5 Forward primer (primer C) for amplifying the GSH2 gene derived from Saccharomyces cerevisiae
  • SEQ ID NO: 6 Reverse primer (primer D) for amplifying the GSH2 gene derived from Saccharomyces cerevisiae
  • SEQ ID NOs: 7 to 238 PCR primers for GSH2 mutation introduction
  • SEQ ID NO: 239 Base sequence of GSH1 gene derived from Saccharomyces cere

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Abstract

　γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ（ＸはＶａｌ、ｎＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｂｕ、およびＩｌｅからなる群より選択されるアミノ酸を示す）で表されるペプチド、またはその塩を製造する方法を提供する。γ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＧｌｙに、グルタチオン合成酵素、例えば、特定の変異を有する変異型グルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙで表されるペプチド、またはその塩を製造する。

Description

γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙまたはその塩の製造方法、および変異型グルタチオン合成酵素
　本発明は、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ（ＸはＶａｌ、ｎＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｂｕ、およびＩｌｅからなる群より選択されるアミノ酸を表す。以下同じ）で表されるペプチドまたはその塩の製造方法、および変異型グルタチオン合成酵素に関する。
　クラスＣに分類されるＧタンパク質であるカルシウムセンシングレセプター（ＣａＳＲ）は、γ‐グルタミル化合物の１つであるグルタチオン（γ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓ‐Ｇｌｙ）（ＧＳＨ）に応答することが報告されていた（非特許文献１）が、その生理的な意味は明らかとなっていなかった。また、このＣａＳＲは舌細胞にも存在しており何らかの呈味応答を示すと考えられていた（非特許文献２）が、最近、このＣａＳＲが人のコク味（ｋｏｋｕｍｉ）認識に関与していることが明らかとなった（非特許文献３）。同文献では、これまでコク味物質として認識されてきたＧＳＨだけでなく、いくつかのγ‐グルタミル化合物が同様にＣａＳＲに応答することが報告されている。
　いくつかのγ‐グルタミルペプチド、例えばγ‐Ｇｌｕ‐Ｍｅｔ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｔｈｒ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙは、コク味付与効果を有していることが報告されている（特許文献１）。また、Ｓ‐またはＯ‐カルボキシアルキル化γ‐グルタミルまたはβ‐アスパルチルペプチドのエステル群などもコク味物質として報告されている（特許文献２）。これらのペプチドやエステルはＧＳＨと同様に食品にコク味を付与するが、ＧＳＨと異なり還元型チオール基（‐ＳＨ基）を有していない。一般に、ＧＳＨのような還元型チオール基を有する物質は不安定であり、ジスルフィド結合の形成とともにその力価が低下することが知られている（特許文献２）。よって、還元型チオール基を有していないこれらのコク味付与ペプチドは、安定性等の点で有用であると考えられる。
　γ‐グルタミルジペプチドを含有する食品に関する知見としては、４４週間程も長期熟成したゴーダチーズから、各種γ‐グルタミルジペプチドが検出されたとの報告がある（非特許文献４）。同文献では、γ‐Ｇｌｕ‐Ａｌａ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｕ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｎなどの各種γ‐グルタミルジペプチドが検出され、更にγ‐グルタミルジペプチドの含有量は最大で３５９０μｍｏｌ／ｋｇ乾燥重量であったと報告されている。
　また、γ‐グルタミルジペプチドに関するその他の知見としては、ミクロコッカス・グルタミカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）の発酵ブロス解析の例を挙げることができる（非特許文献５）。同文献では発酵ブロスを各種カラムにかけペプチド等を分離し、γ‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｕ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｌｅｕを単離したと報告されているが、各種カラム分離の結果見出されたものであり、どの程度の量ブロス中に含まれていたかは不明である。
　このように、γ‐グルタミルジペプチドを含む食品や発酵ブロスについての報告例はいくつかあるものの、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを含むものについては報告例が見当たらない。
　γ‐グルタミル化合物の生合成に関する研究としては、ＧＳＨまたはその前駆体であるγ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓに関する研究が多くなされている。ＧＳＨは、生体内ではγ‐グルタミルシステイン合成酵素によりＧｌｕとＣｙｓからγ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓが生成し、更にグルタチオン合成酵素によりＧｌｙが結合し、生成することが知られている。γ‐グルタミルシステイン合成酵素はＧＳＨ１遺伝子またはｇｓｈＡ遺伝子に、グルタチオン合成酵素はＧＳＨ２遺伝子またはｇｓｈＢ遺伝子にコードされていることが知られており、その性質が調べられてきた。
　例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のγ‐グルタミルシステイン合成酵素の副反応を利用して、テアニン（γ‐グルタミルアニリド）を酵素的に生成する方法が報告されている（特許文献３、非特許文献６）。また、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）のγ‐グルタミルシステイン合成酵素についてＣｙｓ以外のアミノ酸への基質特異性を解析した例も報告されている（非特許文献７）。以上のように、γ‐グルタミルシステイン合成酵素は基質特異性が広いことが知られている。
　一方、グルタチオン合成酵素の基質特異性については、エシェリヒア・コリや３種の植物（大豆、小麦、トウモロコシ）由来のグルタチオン合成酵素について、γ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓと結合するアミノ酸としてＧｌｙ以外のアミノ酸を検討した例が報告されている（非特許文献８、非特許文献９）。また、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの生合成におけるグルタチオン合成酵素の基質特異性については、エシェリヒア・コリ由来のグルタチオン合成酵素について、γ‐Ｇｌｕ‐Ａｂｕ（γ‐グルタミル‐α‐アミノ酪酸）とＧｌｙから、γ‐Ｇｌｕ‐Ａｂｕ‐Ｇｌｙを製造する方法が報告されているが（特許文献４）、Ａｂｕ以外のＸについて、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘがグルタチオン合成酵素の基質になり得るかは示されていない。また、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの生合成におけるグルタチオン合成酵素の基質特異性については、ラットの肝臓由来のグルタチオン合成酵素について、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌやγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ（γ‐グルタミルノルバリン）とＧｌｙとの結合が検討されているが（非特許文献１０）、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌは基質にならず、またγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌは基質になったものの反応性は非常に低いため、本酵素をこれらγ‐グルタミル化合物を基質としたγ‐グルタミルトリペプチドの製造に応用するのは困難であると考えられていた。
　また、特許文献５には、グルタチオン合成酵素の変異体を有するγ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓを生産する酵母が開示されており、変異点としてＴ４７Ｉ、Ｐ５４Ｌ、Ｇ３８７Ｄが開示されているが、これらの変異がγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの製造に及ぼす影響は知られていない。
　これらいずれの知見においても、サッカロマイセス・セレビシエ由来グルタチオン合成酵素や、特定の変異を有する変異型グルタチオン合成酵素を利用して、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを製造することは知られていない。
　また、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの製法としては、γ‐ＧＴＰを利用し、γ‐Ｇｌｕ‐Ｌｙｓ‐Ｇｌｙを生成した例も報告されているが（非特許文献１１、１２）、この方法を利用する場合は基質として用いるＬｙｓ‐Ｇｌｙをどのようにして調製するかという問題もある。
ＷＯ２００７／０５５３９３ ＷＯ２００７／０４２２８８ ＷＯ２００６／１２１０５５ 特開昭６２‐１６３６９８号公報 ＥＰ１４４９９１３
J.Biol.Chem.,281,8864‐8870(2006) Biochem.Biophys.Res.Commun.,378,414‐418(2009) J.Biol.Chem.,285,1016‐1022(2010) J.Agric.Food.Chem.,57,3738‐3748(2009) J.Biol.Chem.,240,2508‐2511(1965) Biosci.Biotechnol.Biochem.,73、2677‐2683(2009) Agric.Biol.Chem.,45,2839‐2845(1981) Biochem.Biophys.Res.Commun.,352,351‐359(2007) Biochem.J.,391,567‐574(2005) J.Biol.Chem.,254,5184‐5190(1979) Recent Highlights in Flavor Chemistry & Biology,[Proceedings of the Wartburg Symposium on Flavor Chemistry and Biology],8th,Eisenach,Germany,Feb.27‐Mar.2,227‐232(2007) Annals of the New York Academy of Sciences,613,647‐651(1990)
　本発明は、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ（ＸはＶａｌ、ｎＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｂｕ、およびＩｌｅからなる群より選択されるアミノ酸を表す）で表されるペプチドまたはその塩を製造する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、γ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＧｌｙを原料として、サッカロマイセス・セレビシエ由来グルタチオン合成酵素あるいは変異型グルタチオン合成酵素を作用させることにより、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙが生成することを見出した。また、本発明者らは、Ｇｌｕ、Ｘ、およびＧｌｙを原料として、γ‐グルタミルシステイン合成酵素、およびサッカロマイセス・セレビシエ由来グルタチオン合成酵素あるいは変異型グルタチオン合成酵素を作用させることにより、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙが生成することを見出した。これらの知見に基づいて、本発明は完成されるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]
　下記式（１）：
　γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ　・・・（１）
　（式中、Ｘは、Ｖａｌ、ｎＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｂｕ、およびＩｌｅからなる群より選択されるアミノ酸を示す。）
　で表されるペプチド、またはその塩の製造方法であって、
　γ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＧｌｙに、グルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを生成する工程を含み、
　前記グルタチオン合成酵素が、下記（Ａ）～（Ｄ）から選択されるタンパク質である、方法：
（Ａ）下記（ａ）～（ｃ）：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有する変異型グルタチオン合成酵素：
　S28、M29、F34、S44、F100、L104、I126、F127、L132、T149、V150、S153、F154、S158、S191、L195、L199、I223、V224、Q225、R226、N227、E228、N230、V236、L237、L252、T253、F254、Y284、T286、Y288、T289、T290、T291、D292、A313、L320、S321、S323、E386、G389、E416、L417、I445、Y446、L465、L466、R467、K469、G476、G477、A479、G483、C484、L485、
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質。
[２]
　下記式（１）：
　γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ　・・・（１）
　（式中、Ｘは、Ｖａｌ、ｎＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｂｕ、およびＩｌｅからなる群より選択されるアミノ酸を示す。）
　で表されるペプチド、またはその塩の製造方法であって、
　ＧｌｕおよびＸに、γ‐グルタミルシステイン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘを生成する工程、並びに
　前記工程で得られたγ‐Ｇｌｕ‐ＸとＧｌｙに、グルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを生成する工程を含み、
　前記グルタチオン合成酵素が、下記（Ａ）～（Ｄ）から選択されるタンパク質である、方法：
（Ａ）下記（ａ）～（ｃ）：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有する変異型グルタチオン合成酵素：
　S28、M29、F34、S44、F100、L104、I126、F127、L132、T149、V150、S153、F154、S158、S191、L195、L199、I223、V224、Q225、R226、N227、E228、N230、V236、L237、L252、T253、F254、Y284、T286、Y288、T289、T290、T291、D292、A313、L320、S321、S323、E386、G389、E416、L417、I445、Y446、L465、L466、R467、K469、G476、G477、A479、G483、C484、L485、
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質。
[３]
　下記式（１）：
　γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ　・・・（１）
　（式中、Ｘは、Ｖａｌ、ｎＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｂｕ、およびＩｌｅからなる群より選択されるアミノ酸を示す。）
　で表されるペプチド、またはその塩の製造方法であって、
　Ｇｌｕ、Ｘ、およびＧｌｙに、グルタチオン合成酵素およびγ‐グルタミルシステイン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを生成する工程を含み、
　前記グルタチオン合成酵素が、下記（Ａ）～（Ｄ）から選択されるタンパク質である、方法：
（Ａ）下記（ａ）～（ｃ）：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有する変異型グルタチオン合成酵素：
　S28、M29、F34、S44、F100、L104、I126、F127、L132、T149、V150、S153、F154、S158、S191、L195、L199、I223、V224、Q225、R226、N227、E228、N230、V236、L237、L252、T253、F254、Y284、T286、Y288、T289、T290、T291、D292、A313、L320、S321、S323、E386、G389、E416、L417、I445、Y446、L465、L466、R467、K469、G476、G477、A479、G483、C484、L485、
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質。
[４]
　前記変異が、下記より選ばれる１またはそれ以上の変異に相当する変異である、前記方法：
　S28T、M29V、F34Y、S44T、F100L、L104V、I126L、F127Y、L132（I, M, V）、T149V、V150（A, C, F, G, H, I, M, N, S, T, Y）、S153（A, T）、F154C、S158T、S191T、L195V、L199V、I223V、V224I、Q225（D, E, N）、R226Q、N227D、E228D、N230Q、V236I、L237I、L252V、T253S、F254Y、Y284F、T286S、Y288F、T289S、T290S、T291S、D292E、A313S、L320V、S321T、S323T、E386（D, N）、G389A、E416（D, Q）、L417（I, V, Y）、I445V、Y446F、L465F、L466V、R467K、K469R、G476N、G477N、A479N、G483A、C484S、L485V。
[５]
　前記変異が、下記より選ばれる変異に相当する変異である、前記方法：
　S28T、F34Y、S44T、L132M、V150A、V150C、V150F、V150G、V150H、V150I、V150M、V150N、V150S、V150T、V150Y、S191T、L195V、Q225D、V236I、L237I、E386D、I445V、Y446F、（S28T + S44T）、（S28T + L132M）、（S28T + L195V）、（S28T + E386D）、（S28T + Y446F）、（S44T + L132M）、（S44T + L195V）、（S44T + E386D）、（S44T + Y446F）、（L132M + L195V）、（L132M + E386D）、（L132M + Y446F）、（V150T + Y446F）、（V150M + L195V）、（V150M + Y446F）、（L195V + E386D）、（L195V + Y446F）、（E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M）、（S28T + S44T + L195V）、（S28T + S44T + E386D）、（S28T + S44T + Y446F）、（S28T + L132M + L195V）、（S28T + L132M + E386D）、（S28T + L132M + Y446F）、（S28T + L195V + E386D）、（S28T + L195V + Y446F）、（S28T + E386D + Y446F）、（S44T + L132M + L195V）、（S44T + L132M + E386D）、（S44T + L132M + Y446F）、（S44T + L195V + E386D）、（S44T + L195V + Y446F）、（S44T + E386D + Y446F）、（L132M + L195V + E386D）、（L132M + L195V + Y446F）、（L132M + E386D + Y446F）、（L195V + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + L195V）、（S28T + S44T + L195V + E386D）、（S28T + L132M + L195V + E386D）、（S28T + L195V + E386D + Y446F）、（S44T + L132M + L195V + E386D）、（S44T + L132M + E386D + Y446F）、（S44T + L195V + E386D + Y446F）、（L132M + L195V + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + L195V + E386D）、（S28T + S44T + L132M + L195V + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L195V + E386D + Y446F）、（S28T + L132M + L195V + E386D + Y446F）、（S44T + L132M + L195V + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + L195V + E386D + Y446F）。
[６]
　前記グルタチオン合成酵素および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が、該酵素の活性を有する微生物の培養物または該培養物の処理物である、前記方法。
[７]
　前記グルタチオン合成酵素および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が精製された酵素である、前記方法。
[８]
　前記グルタチオン合成酵素および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が固定化酵素である、前記方法。
[９]
　前記微生物が、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、前記方法。
[１０]
　前記微生物が、エシェリヒア・コリまたはコリネバクテリウム・グルタミカムである、前記方法。
[１１]
　下記（ａ）～（ｃ）：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有する変異型グルタチオン合成酵素：
　S28、M29、F34、S44、F100、L104、F154、S158、S191、L195、L199、I223、V224、Q225、R226、N227、N230、V236、L252、T253、F254、Y284、T290、T291、D292、A313、L320、S321、S323、G389、I445、L466、R467、K469、A479、G483、C484、L485。
[１２]
　下記（ａ）～（ｃ）：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１またはそれ以上の変異に相当する変異を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有する変異型グルタチオン合成酵素：
　S28T、M29V、F34Y、S44T、F100L、L104V、I126L、F127Y、L132（I, M）、T149V、V150（A, C, F, G, H, I, M, N, S, T, Y）、S153（A, T）、F154C、S158T、S191T、L195V、L199V、I223V、V224I、Q225（D, E, N）、R226Q、N227D、E228D、N230Q、V236I、L237I、L252V、T253S、F254Y、Y284F、Y288F、T289S、T290S、T291S、D292E、A313S、L320V、S321T、S323T、E386（D, N）、G389A、E416（D, Q）、L417（I, V, Y）、I445V、Y446F、L466V、R467K、K469R、A479N、G483A、C484S、L485V。
[１３]
　前記変異が、下記より選ばれる変異に相当する変異である、前記変異型グルタチオン合成酵素：
　S28T、F34Y、S44T、L132M、V150A、V150C、V150F、V150G、V150H、V150I、V150M、V150N、V150S、V150T、V150Y、S191T、L195V、Q225D、V236I、L237I、E386D、I445V、Y446F、（S28T + S44T）、（S28T + L132M）、（S28T + L195V）、（S28T + E386D）、（S28T + Y446F）、（S44T + L132M）、（S44T + L195V）、（S44T + E386D）、（S44T + Y446F）、（L132M + L195V）、（L132M + E386D）、（L132M + Y446F）、（V150T + Y446F）、（V150M + L195V）、（V150M + Y446F）、（L195V + E386D）、（L195V + Y446F）、（E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M）、（S28T + S44T + L195V）、（S28T + S44T + E386D）、（S28T + S44T + Y446F）、（S28T + L132M + L195V）、（S28T + L132M + E386D）、（S28T + L132M + Y446F）、（S28T + L195V + E386D）、（S28T + L195V + Y446F）、（S28T + E386D + Y446F）、（S44T + L132M + L195V）、（S44T + L132M + E386D）、（S44T + L132M + Y446F）、（S44T + L195V + E386D）、（S44T + L195V + Y446F）、（S44T + E386D + Y446F）、（L132M + L195V + E386D）、（L132M + L195V + Y446F）、（L132M + E386D + Y446F）、（L195V + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + L195V）、（S28T + S44T + L195V + E386D）、（S28T + L132M + L195V + E386D）、（S28T + L195V + E386D + Y446F）、（S44T + L132M + L195V + E386D）、（S44T + L132M + E386D + Y446F）、（S44T + L195V + E386D + Y446F）、（L132M + L195V + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + L195V + E386D）、（S28T + S44T + L132M + L195V + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L195V + E386D + Y446F）、（S28T + L132M + L195V + E386D + Y446F）、（S44T + L132M + L195V + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + L195V + E386D + Y446F）。
[１４]
　前記変異型グルタチオン合成酵素をコードするＤＮＡを有する酵母。
[１５]
　サッカロマイセス属に属する、前記酵母。
[１６]
　サッカロマイセス・セレビシエである、前記酵母。
　本発明により、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ（ＸはＶａｌ、ｎＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｂｕ、およびＩｌｅからなる群より選択されるアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す）を製造することができる。また、本発明により、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの製造に利用できる変異型グルタチオン合成酵素が提供される。
プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ２の構築を示す図。 プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ１の構築を示す図。 Ｇｓｈ１と、野生型Ｇｓｈ２または変異型Ｇｓｈ２（Ｓ４４Ｔ＋Ｌ１３２Ｍ＋Ｌ１９５Ｖ）を用いた際の、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙの生成を示す図。 プラスミドｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐの構築を示す図。
（１）本発明により製造されるγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ
　本発明により製造されるペプチドは、下記式（１）：
　γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ　・・・（１）
　（式中、Ｘは、Ｖａｌ、ｎＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｂｕ、およびＩｌｅからなる群より選択されるアミノ酸を示す。）
で表される。式（１）中のＧｌｕは、グルタミン酸を示す。また、「‐」はペプチド結合を表す。γ‐Ｇｌｕの「γ」とは、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基を介してＸがグルタミン酸に結合していることを意味する。
　本発明において、「Ｘ」は、バリン（Ｖａｌ）、ノルバリン（ｎＶａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、α‐アミノ酪酸（Ａｂｕ）、およびイソロイシン（Ｉｌｅ）からなる群より選択されるアミノ酸を表す。すなわち、Ｘは、脂肪族の中性アミノ酸から選択される。Ｘは、ＶａｌまたはｎＶａｌであるのが好ましい。
　本発明においては、１種のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙが製造されてもよく、２種またはそれ以上のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙが製造されてもよい。
　なお、上記アミノ酸は、いずれもＬ‐体である。また、本発明において、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ、ならびに原料として用いられるＧｌｕ、Ｘ、Ｇｌｙ、およびγ‐Ｇｌｕ‐Ｘは、いずれもフリー体もしくはその塩、またはそれらの混合物であってもよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。
（２）本発明に用いられる酵素
　以下、本発明に用いられるグルタチオン合成酵素、および本発明に用いられるγ‐グルタミルシステイン合成酵素について説明する。なお、本発明に用いられるグルタチオン合成酵素、および本発明に用いられるγ‐グルタミルシステイン合成酵素を総称して、「本発明に用いられる酵素」ともいう。
（２－１）グルタチオン合成酵素
　本発明に用いられるグルタチオン合成酵素は、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘを基質として認識し、Ｇｌｙと結合させることでグルタチオン誘導体であるペプチド、すなわち、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを生成する反応を触媒する活性を有する。本発明において、当該反応を触媒する活性を、グルタチオン合成酵素活性という。なお、本発明に用いられるグルタチオン合成酵素は、あらゆるＸに関してグルタチオン合成酵素活性を示す必要はなく、Ｘとして選択されたアミノ酸またはアミノ酸誘導体に関してグルタチオン合成酵素活性を示せばよい。また、２種またはそれ以上のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙが製造される場合に、単一のグルタチオン合成酵素が当該２種またはそれ以上のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ全てを生成する反応を触媒する活性を有する必要はなく、Ｘに応じて２種またはそれ以上のグルタチオン合成酵素を利用してもよい。なお、本発明において、グルタチオン合成酵素は、γ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓまたはγ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓ誘導体と、Ｇｌｙとから、ＧＳＨまたはγ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓ誘導体‐Ｇｌｙを生成する反応を触媒する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
　本発明に用いられるグルタチオン合成酵素としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＳＨ２遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられる。サッカロマイセス・セレビシエのＧＳＨ２遺伝子の塩基配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．２６１０８）のＧＳＨ２遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および２に示す。
　本発明に用いられるグルタチオン合成酵素は、グルタチオン合成酵素活性を有する限り、上記グルタチオン合成酵素、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のバリアントであってもよい。そのようなバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントは、例えば、上記グルタチオン合成酵素のホモログや人為的な改変体であってもよい。
　本発明において、グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子（グルタチオン合成酵素遺伝子）は、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、すなわち、上記グルタチオン合成酵素やその保存的バリアントをコードするものであれば、上記塩基配列のバリアントであってもよい。
　グルタチオン合成酵素のホモログをコードする遺伝子は、上記のサッカロマイセス・セレビシエのＧＳＨ２遺伝子を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができ、また、酵母等の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
　また、グルタチオン合成酵素遺伝子は、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、例えば、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ間で、極性アミノ酸である場合には、Ｇｌｎ、Ａｓｎ間で、塩基性アミノ酸である場合には、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間で、酸性アミノ酸である場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、ＡｌａからＳｅｒまたはＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、ＨｉｓまたはＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒまたはＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅまたはＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐへの置換、および、ＶａｌからＭｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。
　さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、上記アミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、「同一性」（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を指すことがある。
　また、グルタチオン合成酵素遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で、１回、より好ましくは２～３回洗浄する条件が挙げられる。
　上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片をプローブとして用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳが挙げられる。
　また、グルタチオン合成酵素遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。
　上述した遺伝子およびタンパク質のバリアントに関する記載は、後述する変異型グルタチオン合成酵素やγ‐グルタミルシステイン合成酵素等のタンパク質およびそれらをコードする遺伝子についても準用できる。
　また、本発明に用いられるグルタチオン合成酵素としては、特定の変異を有するグルタチオン合成酵素が挙げられる。「特定の変異」については後述する。
　本発明において、当該「特定の変異」を有するグルタチオン合成酵素を「変異型グルタチオン合成酵素」ともいう。また、本発明において、当該「特定の変異」を有しないグルタチオン合成酵素を「野生型グルタチオン合成酵素」ともいう。なお、ここでいう「野生型」とは、当該「特定の変異」を有しない限り、天然に得られるものには限定されない。
　野生型グルタチオン合成酵素としては、上述したサッカロマイセス・セレビシエのＧＳＨ２遺伝子にコードされるタンパク質やその保存的バリアントであって、当該「特定の変異」を有さないものが挙げられる。
　すなわち、変異型グルタチオン合成酵素は、当該「特定の変異」を有する以外は、上述したサッカロマイセス・セレビシエのＧＳＨ２遺伝子にコードされるタンパク質やその保存的バリアントであってよい。
　具体的には、例えば、変異型グルタチオン合成酵素は、当該「特定の変異」を有する以外は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
　また、具体的には、例えば、変異型グルタチオン合成酵素は、当該「特定の変異」を有する以外は、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
　また、具体的には、例えば、変異型グルタチオン合成酵素は、当該「特定の変異」を有する以外は、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
　また、言い換えると、変異型グルタチオン合成酵素は、グルタチオン合成酵素活性を有する限り、サッカロマイセス・セレビシエのＧＳＨ２遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該「特定の変異」を有し、さらに当該「特定の変異」以外の箇所に変異を含むバリアントであってよい。このようなバリアントについては、上述したグルタチオン合成酵素のバリアントに関する記載を準用できる。
　すなわち、具体的には、例えば、変異型グルタチオン合成酵素は、配列番号２に示すアミノ酸配列において、当該「特定の変異」を有し、さらに当該「特定の変異」以外の箇所に１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質であってよい。
　以下、「特定の変異」について説明する。
　本発明において、変異型グルタチオン合成酵素は、下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有する。当該変異が、本発明における「特定の変異」である。なお、下記表記において、数字は配列番号２に示すアミノ酸配列における位置を、数字の左側の文字は変異前のアミノ酸残基を、各々示す。すなわち、例えば、「S28」は、配列番号２に示すアミノ酸配列における28位のセリン残基を示す。
　S28、M29、F34、S44、F100、L104、I126、F127、L132、T149、V150、S153、F154、S158、S191、L195、L199、I223、V224、Q225、R226、N227、E228、N230、V236、L237、L252、T253、F254、Y284、T286、Y288、T289、T290、T291、D292、A313、L320、S321、S323、E386、G389、E416、L417、I445、Y446、L465、L466、R467、K469、G476、G477、A479、G483、C484、L485。
　任意のアミノ酸配列（対象アミノ酸配列）において、「配列番号２に示すアミノ酸配列におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」とは、配列番号２のアミノ酸配列と対象アミノ酸配列とのアライメントにおいて、配列番号２に示すアミノ酸配列におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基をいう。すなわち、上記各アミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその位置は前後することがある。例えば、「S28に相当するアミノ酸残基」とは、配列番号２における２８位のセリン残基に相当するアミノ酸残基を意味し、２８位よりもＮ末端側の１アミノ酸残基が欠失している場合は、Ｎ末端から数えて２７番目（開始コドンによってコードされるメチニオン残基を１番目とする）のアミノ酸残基が「S28に相当するアミノ酸残基」であるものとする。また、２８位よりもＮ末端側に１アミノ酸残基挿入されている場合は、Ｎ末端から数えて２９番目のアミノ酸残基が「S28に相当するアミノ酸残基」であるものとする。
　すなわち、本発明において、野生型グルタチオン合成酵素が配列番号２に示すアミノ酸配列を有する場合、変異型グルタチオン合成酵素は、配列番号２における上記のアミノ酸残基に変異を有すればよい。また、本発明において、野生型グルタチオン合成酵素が配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のバリアントである場合、変異型グルタチオン合成酵素は、配列番号２における上記のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有すればよい。
　すなわち、具体的には、例えば、変異型グルタチオン合成酵素は、配列番号２に示すアミノ酸配列、配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換等を含むアミノ酸配列、または、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において、配列番号２における上記のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有するものであってよい。
　アラインメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
　また、変異型グルタチオン合成酵素は、上記アミノ酸残基の内、下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有するのが好ましい。なお、下記表記において、数字および数字の左側の文字の意味は前記と同様である。
　S28、M29、F34、S44、F100、L104、F154、S158、S191、L195、L199、I223、V224、Q225、R226、N227、N230、V236、L252、T253、F254、Y284、T290、T291、D292、A313、L320、S321、S323、G389、I445、L466、R467、K469、A479、G483、C484、L485。
　前記位置の変異において、変異後のアミノ酸残基は、変異型グルタチオン合成酵素がグルタチオン合成酵素活性を有する限り、元のアミノ酸残基以外のいずれのアミノ酸残基であってもよい。なお、変異型グルタチオン合成酵素がグルタチオン合成酵素活性を有する限り、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘの「Ｘ」についての基質特異性は、野生型グルタチオン合成酵素と変異型グルタチオン合成酵素とで同一であってもよく、異なっていてもよい。例えば、野生型グルタチオン合成酵素がγ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓを基質として認識できる場合に、変異型グルタチオン合成酵素はγ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓを基質として認識できてもよく、認識できなくともよい。
　前記位置における具体的な変異としては、下記より選ばれる変異に相当する変異が挙げられる。なお、下記表記において、数字および数字の左側の文字の意味は前記と同様である。また、数字の右側の文字または数字の右側のカッコ内の文字は、変異後のアミノ酸残基を示す。すなわち、例えば、「S28T」は、配列番号２に示すアミノ酸配列における28位のSer残基がThr残基に置換される変異を示す。また、例えば、「L132（I, M, V）」は、配列番号２に示すアミノ酸配列における132位のLys残基が、Ile、Met、およびValから選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換される変異を示す。
　S28T、M29V、F34Y、S44T、F100L、L104V、I126L、F127Y、L132（I, M, V）、T149V、V150（A, C, F, G, H, I, M, N, S, T, Y）、S153（A, T）、F154C、S158T、S191T、L195V、L199V、I223V、V224I、Q225（D, E, N）、R226Q、N227D、E228D、N230Q、V236I、L237I、L252V、T253S、F254Y、Y284F、T286S、Y288F、T289S、T290S、T291S、D292E、A313S、L320V、S321T、S323T、E386（D, N）、G389A、E416（D, Q）、L417（I, V, Y）、I445V、Y446F、L465F、L466V、R467K、K469R、G476N、G477N、A479N、G483A、C484S、L485V。
　任意のアミノ酸配列（対象アミノ酸配列）において、「配列番号２に示すアミノ酸配列におけるＸ位のアミノ酸残基の変異に相当する変異」とは、配列番号２のアミノ酸配列と対象アミノ酸配列とのアライメントにおいて、配列番号２に示すアミノ酸配列におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基における変異をいう。例えば、「S28Tに相当する変異」とは、配列番号２に示すアミノ酸配列における28位のSer残基に相当するアミノ酸残基がThr残基に置換される変異を示す。
　上記変異の内、例えば、γ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ｇｌｙの内、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙまたはγ－Ｇｌｕ－Ｎｖａ－Ｇｌｙの合成活性が確認された変異が好ましい。そのような変異として、具体的には、下記より選ばれる変異に相当する変異が挙げられる。なお、下記表記において、数字、数字の左側の文字、および数字の右側の文字または数字の右側のカッコ内の文字の意味は前記と同様である。
　S28T、M29V、F34Y、S44T、F100L、L104V、I126L、F127Y、L132（I, M）、T149V、V150（A, C, F, G, H, I, M, N, S, T, Y）、S153（A, T）、F154C、S158T、S191T、L195V、L199V、I223V、V224I、Q225（D, E, N）、R226Q、N227D、E228D、N230Q、V236I、L237I、L252V、T253S、F254Y、Y284F、Y288F、T289S、T290S、T291S、D292E、A313S、L320V、S321T、S323T、E386（D, N）、G389A、E416（D, Q）、L417（I, V, Y）、I445V、Y446F、L466V、R467K、K469R、A479N、G483A、C484S、L485V。
　また、上記変異の内、下記より選ばれる変異に相当する変異がより好ましい。なお、下記表記において、数字、数字の左側の文字、および数字の右側の文字の意味は前記と同様である。
　S28T、F34Y、S44T、L132M、V150A、V150C、V150F、V150G、V150H、V150I、V150M、V150N、V150S、V150T、V150Y、S191T、L195V、Q225D、V236I、L237I、E386D、I445V、Y446F。
　これらの変異の具体的な組み合わせとしては、下記に示す変異に相当する変異が挙げられる。なお、下記表記において、数字、数字の左側の文字、および数字の右側の文字の意味は前記と同様である。また、下記表記において、「+」で表される２またはそれ以上の変異の併記は、二重変異又はそれ以上の多重変異を示す。すなわち、例えば、「S28T + S44T」は、S28TとS44Tの二重変異を示す。なお、多重変異を、カッコを付して「（S28T + S44T）」のように記載する場合がある。
　S28T + S44T
　S28T + L132M
　S28T + L195V
　S28T + E386D
　S28T + Y446F
　S44T + L132M
　S44T + L195V
　S44T + E386D
　S44T + Y446F
　L132M + L195V
　L132M + E386D
　L132M + Y446F
　V150T + Y446F
　V150M + L195V
　V150M + E386D
　V150M + Y446F
　L195V + E386D
　L195V + Y446F
　E386D + Y446F
　S28T + S44T + L132M
　S28T + S44T + L195V
　S28T + S44T + E386D
　S28T + S44T + Y446F
　S28T + L132M + L195V
　S28T + L132M + E386D
　S28T + L132M + Y446F
　S28T + L195V + E386D
　S28T + L195V + Y446F
　S28T + E386D + Y446F
　S44T + L132M + L195V
　S44T + L132M + E386D
　S44T + L132M + Y446F
　S44T + L195V + E386D
　S44T + L195V + Y446F
　S44T + E386D + Y446F
　L132M + L195V + E386D
　L132M + L195V + Y446F
　L132M + E386D + Y446F
　V150M + E386D + Y446F
　L195V + E386D + Y446F
　S28T + S44T + L132M + L195V
　S28T + S44T + L195V + E386D
　S28T + L132M + L195V + E386D
　S28T + L195V + E386D + Y446F
　S44T + L132M + L195V + E386D
　S44T + L132M + E386D + Y446F
　S44T + L195V + E386D + Y446F
　L132M + L195V + E386D + Y446F
　S28T + S44T + L132M + L195V + E386D
　S28T + S44T + L132M + L195V + Y446F
　S28T + S44T + L132M + E386D + Y446F
　S28T + S44T + L195V + E386D + Y446F
　S28T + L132M + L195V + E386D + Y446F
　S44T + L132M + L195V + E386D + Y446F
　S28T + S44T + L132M + L195V + E386D + Y446F
　上記変異の組み合わせの内、（V150M + E386D）および（V150M + E386D + Y446F）に相当する変異以外のものが好ましい。
　変異型グルタチオン合成酵素は、野生型グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を、コードされるグルタチオン合成酵素が当該「特定の変異」を有するよう改変し、得られた改変型遺伝子を発現させることにより取得できる。そのような変異の導入は、例えば、部位特異的変異法により、特定の位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸で置換されるように、野生型グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を改変することにより達成できる。
　DNAの目的部位に目的の変異を起こす部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）等が挙げられる。
（２－２）γ‐グルタミルシステイン合成酵素
　本発明に用いられるγ‐グルタミルシステイン合成酵素は、Ｘで表されるアミノ酸、すなわち、バリン、ノルバリン、ロイシン、α-アミノ酪酸、およびイソロイシンから選択される１またはそれ以上のアミノ酸を基質として認識し、Ｇｌｕと結合させることでγ‐Ｇｌｕ‐Ｘで表されるペプチドを生成する反応を触媒する活性を有する限り特に限定されない。本発明において、当該反応を触媒する活性を、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性という。なお、本発明に用いられるγ‐グルタミルシステイン合成酵素は、あらゆるＸに関してγ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を示す必要はなく、Ｘとして選択されたアミノ酸に関してγ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を示せばよい。また、基質として２種またはそれ以上のＸを用いる場合に、単一のγ‐グルタミルシステイン合成酵素が当該２種またはそれ以上のＸ全てに関してγ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を示す必要はなく、Ｘに応じて２種またはそれ以上のγ‐グルタミルシステイン合成酵素を利用してもよい。なお、本発明において、γ‐グルタミルシステイン合成酵素は、Ｇｌｕと、ＣｙｓまたはＣｙｓ誘導体とから、γ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓまたはγ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓ誘導体を生成する反応を触媒する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
　本発明に用いられるγ‐グルタミルシステイン合成酵素の由来は特に制限されず、微生物、植物または動物等の任意の生物に由来する酵素を用いることができるが、微生物に由来するものが好ましい。微生物としては、酵母等の真核微生物、あるいは腸内細菌やコリネ型細菌等の細菌が挙げられる。
　本発明に用いられるγ‐グルタミルシステイン合成酵素としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＳＨ１遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられる。サッカロマイセス・セレビシエのＧＳＨ１遺伝子の塩基配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．２６１０８）のＧＳＨ１遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２３９および２４０に示す。
　また、本発明に用いられるγ‐グルタミルシステイン合成酵素としては、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）のＧＳＨ１遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられる。カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）のＧＳＨ１遺伝子の塩基配列は、米国特許第７５５３６３８号に開示されている。
　また、本発明に用いられるγ‐グルタミルシステイン合成酵素としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のｇｓｈＡ遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられる。エシェリヒア・コリＫ１２　ＭＧ１６５５株のｇｓｈＡ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＮＣ＿０００９１３（ＶＥＲＳＩＯＮ　ＮＣ＿０００９１３．２　ＧＩ：４９１７５９９０）として登録されているゲノム配列中、２８１２９０５～２８１４４６１位の配列の相補配列に相当する。
　本発明に用いられるγ‐グルタミルシステイン合成酵素は、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有する限り、上記アミノ酸配列を有するタンパク質のバリアントであってよい。遺伝子およびタンパク質のバリアントについては、上述したグルタチオン合成酵素のバリアントに関する記載を準用できる。
（３）本発明の酵母
　本発明は、変異型グルタチオン合成酵素をコードするＤＮＡを有する酵母（「本発明の酵母」ともいう）を提供する。
　本発明の酵母は、酵母の適当な菌株、例えば後述する菌株に変異型グルタチオン合成酵素をコードするＤＮＡを導入することで取得することができる。変異型グルタチオン合成酵素をコードするＤＮＡを導入することは、例えば、変異型グルタチオン合成酵素をコードするＤＮＡを含むベクターを酵母に導入し、同ベクターを保持させることにより達成できる。また、変異型グルタチオン合成酵素をコードするＤＮＡを導入することは、例えば、相同組み換えにより変異型グルタチオン合成酵素をコードするＤＮＡを酵母の染色体上に挿入することにより達成できる。そのような遺伝子を宿主に導入する手法としては、例えば、公知の手法を用いることができる。具体的には、例えば、「（４）本発明に用いられる酵素の調製」において説明する手法を利用することができる。
　本発明の酵母は、出芽酵母であってもよく、分裂酵母であってもよい。出芽酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロミセス属、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）等のキャンディダ属、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等のピヒア属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等のハンゼヌラ属等に属する酵母を例示することができる。分裂酵母としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロミセス属等に属する酵母を例示することができる。中でも、サッカロミセス属に属する酵母が好ましく、サッカロミセス・セレビシエがより好ましい。本発明の酵母は、１倍体でもよいし、２倍性またはそれ以上の倍数性を有するものであってもよい。
　サッカロミセス・セレビシエとしては、具体的には、サッカロミセス・セレビシエＡＪ１４９５６を用いることができる。サッカロミセス・セレビシエＡＪ１４９５６は、平成２２年８月１８日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（住所　郵便番号３０５－８５６６　茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２９９が付与されている。
　また、サッカロミセス・セレビシエとしては、具体的には、ＢＹ４７４３株（ＡＴＣＣ２０１３９０）やＳ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣ２６１０８）を用いることができる。また、キャンディダ・ユティリスとしては、具体的には、キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ２２０２３株を用いることができる。これらの株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
（４）本発明に用いられる酵素の調製
　本発明に用いられる酵素を取得する方法は特に限定されない。本発明に用いられる酵素は、同酵素の活性を有する生物、例えば、同酵素の活性を有する微生物の野生株または変異株から調製することができる。同酵素の活性を有する生物は、同酵素の活性が増強された生物であるのが好ましい。そのような生物としては、遺伝子工学的手法により本発明に用いられる酵素をコードする遺伝子の発現が増強された形質転換体が挙げられる。なお、「酵素の活性が増強される」とは、本来的に該酵素の活性を有する微生物において該酵素の活性を増大させることに限られず、本来的には該酵素の活性を有さない微生物に該酵素の活性を付与することを含む。
　遺伝子工学的手法により形質転換体を構築しタンパク質の大量生産を行う場合、形質転換される宿主としては、例えば、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞等を用いることができる。形質転換される宿主としては、微生物細胞を用いるのが好ましい。なお、宿主‐ベクター系が開発されている微生物としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、アンスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属真菌等が挙げられる。中でも、エシェリヒア・コリ（Ｅ．　ｃｏｌｉ）またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が好適に用いられる。
　遺伝子の発現の増強は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なものに置換することにより達成できる。そのようなプロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、およびＰＬプロモーター等が挙げられる。また、強力なプロモーターへの置換は、後述する遺伝子の翻訳効率の向上や遺伝子のコピー数の増加と組み合わせて利用できる。
　また、遺伝子の発現の増強は、例えば、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することにより翻訳効率を向上させることができる。
　また、遺伝子の発現の増強は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
　遺伝子のコピー数の増加は、染色体上に目的の遺伝子を導入することにより達成できる。染色体上への遺伝子の導入は、例えば相同的組み換えを利用して行うことができる。例えば、染色体中に多数のコピーが存在する配列を標的として相同的組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体中に多数のコピーが存在する配列としては、反復ＤＮＡまたは転位因子の末端にある逆方向反復配列等が挙げられるが、これらに限定されない。また、酵母の場合、染色体中に多数のコピーが存在する配列としては、例えば、特有の短い繰り返し配列からなる自律複製配列（ＡＲＳ）や、約150コピー存在するrDNA配列が挙げられる。ＡＲＳを含むプラスミドを用いて酵母の形質転換を行った例が、国際公開９５／３２２８９号パンフレットに記載されている。また、米国特許第５，５９５，８８９号に開示されるように、トランスポゾンに遺伝子を組み込み、それを染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させることも可能である。
　また、遺伝子のコピー数の増加は、目的遺伝子を含むベクターを宿主となる生物に導入することによっても達成できる。用いるベクターとしてはマルチコピーベクターが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターはアンピシリン耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。例えば、エシェリヒア・コリに利用できるマルチコピーベクターとしては、ｐＵＣ系のプラスミド、ｐＢＲ３２２系のプラスミド、およびそれらの誘導体等のＣｏｌＥ１複製起点を有するプラスミドが挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位により改変を受けたプラスミドを意味する。ここでの改変には、変異原物質やＵＶ照射を用いる変異誘発処理や、自然突然変異、ランダム変異により生じる改変を含む。エシェリヒア・コリに利用できる好適なベクターとしては、強力なプロモーターを有する市販の発現ベクターであるｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社製）、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クロンテック社製）、ｐＫＫ２３３‐２（クロンテック社製）、ｐＥＴ系（ノバジェン社製）、ｐＱＥ系（キアゲン社製）等が挙げられる。また、その他のベクターとしては、例えばｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＧＫ１２、ｐＬＦ１４、およびｐＬＦ２２等のエシェリヒア・コリ‐バチラス・サブチリス用シャトルベクター、ｌ１０５９、ｌＢＦ１０１、Ｍ１３ｍｐ９、およびＭｕ　ｐｈａｇｅ（特開平２‐１０９９８５）等のファージベクター、ならびにＭｕ、Ｔｎ１０、Ｔｎ５等のトランスポゾン（Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)）が利用できる。なお、例えばトランスポゾンをベクターとして利用する場合には、上述したように、目的の遺伝子が染色体上に転移して導入されることで遺伝子のコピー数が増加する。また、酵母に利用できるベクターとしては、例えば、CEN4の複製開始点を持つプラスミドや2μm DNAの複製開始点を持つ多コピー型プラスミドが挙げられる。
　上記のようなベクターにプロモーターおよび遺伝子を順に連結したＤＮＡ断片が挿入された発現プラスミドで宿主を形質転換することにより、遺伝子の発現が増強された形質転換体が得られる。なお、ベクターには遺伝子を発現させるのに好適なプロモーターを含んでいるものがあり、そのようなベクターを用い、ベクターに含まれるプロモーターに下流に遺伝子を連結する場合には、別途プロモーターをベクターに挿入する必要はない。また、遺伝子の下流には、転写終結配列であるターミネーターを連結してもよい。ターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、エシェリヒア・コリｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。
　形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、ベクターをエシェリヒア・コリに導入するには、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等、通常のエシェリヒア属細菌の形質転換に用いられる方法により行うことができる。
　また、酵母の形質転換法としては、プロトプラスト法、ＫＵ法（H.Ito et al., J. Bateriol., 153-163 (1983)）、ＫＵＲ法（発酵と工業 vol.43, p.630-637 (1985)）、エレクトロポレーション法（Luis et al., FEMS Micro biology Letters 165 (1998) 335-340）、キャリアＤＮＡを用いる方法（Gietz R.D. and Schiestl R.H., Methods Mol.Cell. Biol. 5:255-269 (1995)）等、通常酵母の形質転換に用いられる方法を採用することができる。また、酵母の胞子形成、１倍体酵母の分離、等の操作については、「化学と生物 実験ライン３１ 酵母の実験技術」、初版、廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ１０ 酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社等に記載されている。
　上記のようにして得られる本発明に用いられる酵素をコードする遺伝子の発現が増強された形質転換体の培養条件、および酵素の生産誘導の条件は、マーカーの種類、プロモーターの種類、および、用いる宿主の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば、エシェリヒア・コリ形質転換体を培養するのに用いる培地としては、２×ＹＴ培地、Ｍ９‐カザミノ酸培地、ＬＢ培地等の通常エシェリヒア・コリを培養するのに用いる培地を好適に用いることができる。また、例えば、酵母形質転換体を培養するのに用いる培地としては、酵母が増殖し得るものであれば特に制限されず、通常工業的に用いられる培地を利用することができる。例えば、ＳＤ培地やＹＰＤ培地を好適に利用することができる。
　培養後、菌体を回収し、破砕または溶解することにより酵素含有溶液が得られる。菌体の破砕には、例えば、超音波破砕、フレンチプレス破砕またはガラスビーズ破砕を好適に用いることができる。また、細胞を溶解する場合には、例えば、卵白リゾチーム、ペプチダーゼ処理やそれらの適切な組み合わせを用いることができる。なお、破砕または溶解後に残渣が残る場合には、必要に応じて、遠心等により残渣を除去することができる。また、例えば、培養上清中に目的の酵素が存在する場合には、培養上清を酵素含有溶液として利用することができる。
　酵素含有溶液からの酵素の回収は、酵素の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等が挙げられる。また、目的の酵素を他のタンパク質あるいはペプチドとの融合タンパク質として生産する場合には、融合したタンパク質あるいはペプチドに対する親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより目的の酵素を精製することができる。
　なお、上記では、本発明に用いられる酵素をコードする遺伝子の発現が増強された形質転換体を用いた酵素の調製について記載したが、それ以外の場合にも、必要により適宜変更して適用できる。例えば、本発明に用いられる酵素の活性を有する微生物の野生株または変異株等を酵素の取得源として利用する場合にも、菌体を増殖させて目的の酵素を産生させ、酵素を調製することができる。
　本発明の方法においては、上記のように精製された酵素を使用してもよく、精製されていない酵素を使用してもよい。精製されていない酵素としては、例えば、酵素を産生する微生物を培養した培養上清や、該微生物の破砕物等の酵素含有溶液が挙げられる。また、本発明の方法においては、酵素は任意の担体に固定化した固定化酵素の状態で利用することができる。さらに、例えば、酵素を産生する微生物の菌体を含む培養物や、同培養物の処理物を酵素として使用してもよい。培養物の処理物としては、例えば、該培養物から分離・回収した菌体や、該菌体を固定化処理、アセトン処理、凍結乾燥処理等した菌体処理物が挙げられる。
（５）γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの製造方法
　本発明のγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの製造方法（以下、本発明の方法ともいう）は、グルタチオン合成酵素の活性を利用することを特徴とする。
　本発明の方法の第１の態様（以下、第１の態様ともいう）は、γ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＧｌｙにグルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを生成する工程を含む、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの製造方法である。すなわち、第１の態様においては、グルタチオン合成酵素の作用により反応原料中のγ‐Ｇｌｕ‐ＸにＧｌｙが付加されγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙが生成する。
　第１の態様において、基質として用いられるγ‐Ｇｌｕ‐Ｘは、任意の手法により製造すればよい。例えば、ＧｌｕおよびＸを含有する原料を用いて、γ‐グルタミルシステイン合成酵素を用いた酵素反応によりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘを生成することができる。また、例えば、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ生産能を有する微生物の菌体あるいは培養上清から回収することにより、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘを得ることができる。なお、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ生産能を有する微生物とは、微生物の野生株または変異株であってもよく、遺伝子工学的手法を用いて作製された形質転換体であってもよい。γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ生産能を有する形質転換体は、例えば、γ‐グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子を公知の手法により適当な株に導入することにより取得できる。
　本発明の方法の第１の態様は、さらに、上記のような手法によりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘを生成する工程を含んでいてもよい。すなわち、例えば、第１の態様の一態様（以下、第２の態様ともいう）は、ＧｌｕおよびＸにγ‐グルタミルシステイン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘを生成する工程（以下、工程（Ａ）ともいう）、および工程（Ａ）で生成したγ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＧｌｙにグルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを生成する工程（以下、工程（Ｂ）ともいう）を含む、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの製造方法である。すなわち、第２の態様においては、γ‐グルタミルシステイン合成酵素の作用により反応原料中のＧｌｕおよびＸからγ‐Ｇｌｕ‐Ｘが生成し、さらにグルタチオン合成酵素の作用によりＧｌｙが付加されγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙが生成する。
　第２の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は別個に進行してもよい。例えば、工程（Ａ）で生成したγ‐Ｇｌｕ‐Ｘを回収して、回収したγ‐Ｇｌｕ‐Ｘを用いて工程（Ｂ）を進行させてもよい。また、例えば、工程（Ａ）におけるγ‐Ｇｌｕ‐Ｘの生成が平衡に達した後に、グルタチオン合成酵素、Ｇｌｙ、またはその両方を反応系に添加することで工程（Ｂ）を進行させてもよい。
　また、第２の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は同時に進行してもよい。両工程は、反応過程の全期間において同時に進行してもよく、また、反応過程の一部の期間においてのみ同時に進行してもよい。両工程を同時に進行させる場合には、反応系に両酵素、ならびにＧｌｕ、Ｘ、およびＧｌｙを共存させればよい。例えば、それら全てを反応開始時に共存させることで、両工程を同時に開始させることができる。また、工程（Ａ）を開始した後、反応過程の任意の時点においてグルタチオン合成酵素、Ｇｌｙ、またはその両方を反応系に添加することで工程（Ｂ）を進行させてもよい。
　本発明の方法のさらなる態様（以下、第３の態様ともいう）は、Ｇｌｕ、Ｘ、およびＧｌｙにγ‐グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを生成する工程を含む、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの製造方法である。すなわち、第３の態様においては、γ‐グルタミルシステイン合成酵素の作用により反応原料中のＧｌｕおよびＸからγ‐Ｇｌｕ‐Ｘが生成し、さらにグルタチオン合成酵素の作用によりＧｌｙが付加されγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙが生成すると考えられる。
　第３の態様においては、γ‐グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素、ならびにＧｌｕ、Ｘ、およびＧｌｙを反応系に共存させることにより、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを生成することができる。また、例えば、先にγ‐グルタミルシステイン合成酵素を作用させ、続いて、任意の時点でグルタチオン合成酵素を追加的に反応系に添加して作用させてもよい。なお、第３の態様においてグルタチオン合成酵素を追加的に作用させる場合には、グルタチオン合成酵素が作用する時点でＧｌｕ、Ｘ、またはその両方が反応系に残存していなくともよい。
　なお、以下、第１の態様におけるγ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＧｌｙ、第２の態様におけるＧｌｕ、Ｘ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ、およびＧｌｙ、ならびに第３の態様におけるＧｌｕ、Ｘ、およびＧｌｙを総称して、「基質」ともいう。また、以下、第１の態様におけるグルタチオン合成酵素、ならびに第２および第３の態様におけるγ‐グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を総称して、「酵素」ともいう。
　いずれの態様においても、酵素反応は水あるいは緩衝液等の水性溶媒中で行われるのが好ましい。酵素反応は、例えば、反応液中に各基質および各酵素を含有させることで行われてもよく、また、各基質を含有する反応液を固定化酵素に供給することにより行われてもよい。すなわち、例えば、酵素反応は、バッチ式で行われてもよく、カラム式で行われてもよい。バッチ式の場合は、反応容器内の反応液中で、必要な基質および酵素を混合すればよい。酵素反応は、静置で行われてもよく、撹拌下で行われてもよい。カラム式の場合は、固定化酵素を充填したカラムに、必要な基質を含む反応液を通液すればよい。
　反応液のｐＨは用いる酵素が機能する限り特に限定されず、用いる酵素の性質に応じて適宜設定することができる。反応液のｐＨは、例えば、好ましくはｐＨ６～１１であり、より好ましくは８～１０であり、特に好ましくは８．５～９．５である。
　反応液中の各基質の濃度は特に限定されないが、例えば、１μＭ以上であるのが好ましく、１００μＭ以上であるのがより好ましく、１ｍＭ以上であるのが特に好ましい。また、濃度の上限は特に限定されないが、例えば、通常２Ｍ以下であり、１Ｍ以下であるのが好ましい。また、各基質の濃度の比率は特に限定されないが、例えばγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの収率や精製の観点から、反応液中の各基質の濃度をそろえる方が好ましい場合がある。すなわち、例えば、第１の態様においては、γ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＧｌｙの濃度の比が１：１に近い方が好ましい場合があり、第２または第３の態様においては、Ｇｌｕ、Ｘ、およびＧｌｙの濃度の比が１：１：１に近い方が好ましい場合がある。また、用いる酵素の性質等によっては、各基質の濃度に差があるのが好ましい場合もあり得る。
　反応液中の各酵素の濃度、または固定化された各酵素の濃度は特に限定されず、酵素の性質、Ｘの種類、Ｇｌｙの種類、原料の濃度、反応温度、および反応時間等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。反応液中の各酵素の濃度は、例えば、１μｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌであるのが好ましく、１０μｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌであるのがより好ましい。また、固定化された各酵素の濃度は、例えば、２～２００ｍｇ／ｇ担体が好ましく、１０～１００ｍｇ／ｇ担体であるのがより好ましい。
　反応液中には、酵素反応に必須な因子が存在することが好ましい。酵素反応に必須な因子としては、グルタチオン合成酵素による反応、およびγ‐グルタミルシステイン合成酵素による反応の双方において、ＡＴＰが挙げられる。ＡＴＰは、ペプチド結合形成のためのエネルギー源として利用される。本発明の方法において、ＡＴＰは、本発明に用いられる酵素がペプチド結合形成にＡＴＰを利用できるように反応系に供給されればよい。例えば、ＡＴＰはγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを生成および蓄積させる反応液に粉末のまま、あるいは水溶液として供給することができる。また、さらに実用的には、高価なＡＴＰを直接添加する代わりに、ＡＴＰ再生系を利用してもよい。すなわち、ＡＴＰ再生能を有する精製酵素、粗酵素、菌体、または菌体処理物等の触媒とＡＴＰ再生に用いられる基質とを反応系に添加することで、消費されたＡＴＰを再生しながらγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの生成を継続することが可能である。ＡＴＰ再生系を利用するための方法としては、具体的には、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃ．　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）の培養菌体と炭素源を添加する方法（Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 644‐650 (2001)）、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸を添加する方法（J. Biosci. Bioeng., 91, 557‐563 (2001)）、およびクレアチンホスホリラーゼとクレアチンリン酸を添加する方法等が挙げられる。
　また、用いられる酵素によっては、反応液中に種々のカチオン、例えばＭｇ２＋が存在するのが好ましい場合がある。そのような場合には、カチオンがキレートされない反応液組成を用いるのが好ましいが、カチオンの作用が保持されていれば何ら制限を受けない。例えば、カチオンがキレートされる可能性が少ない緩衝液としては、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファー、ＧＴＡ広域バッファー等が挙げられる。さらに、反応液中には、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの生成を達成できる限りにおいて、その他の任意の成分が存在しうる。例えば、アルコール類、エステル類、ケトン類、アミド類等の有機溶媒を含有させることもできる。
　反応温度は用いる酵素が機能する限り特に限定されず、酵素の性質に応じて適宜設定することができる。反応温度は例えば通常１０℃～８０℃であり、１５℃～６０℃であるのが好ましく、２０℃～５０℃であるのがより好ましく、３０℃～４５℃であるのがさらに好ましい。
　反応時間は特に限定されず、酵素の性質や反応温度等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。反応時間は例えば通常５分～２００時間であるのが好ましい。また、例えば、カラム式で反応を行う場合には、前記好ましい反応時間となるよう通液速度を設定してもよい。
　いずれの態様においても、反応の過程において、各基質、各酵素、およびその他の成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで追加的に反応系に添加してもよい。これらの成分は１回または複数回添加されてもよく、連続的に添加されてもよい。また、反応開始から反応終了まで均一の条件を用いてもよく、反応の過程において条件を変化させてもよい。なお、反応の過程において条件を変化させるとは、条件を時間的に変化させることに限られず、例えば固定化酵素を利用してカラム式で反応を行う場合等において、反応温度や酵素濃度等の条件を空間的に変化させることを含む。例えば、第２または第３の態様において固定化酵素を利用する場合には、γ‐グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を混在して配置してもよく、位置的に分離させて配置してもよい。
　また、例えば、第２または第３の態様において、グルタチオン合成酵素とγ‐グルタミルシステイン合成酵素の作用する好適な条件が互いに異なる場合には、反応の過程において、γ‐グルタミルシステイン合成酵素に好適な条件からグルタチオン合成酵素に好適な条件へと変化させることが有効であり得る。
　本発明の方法において、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙの生成は、化合物の検出または同定に用いられる任意の手法により確認することができる。そのような手法としては、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、およびＮＭＲ等が挙げられる。
　本発明により製造されたγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙは、通常用いられるペプチドの精製法を用いて単離することができる。例えば、必要により遠心分離等により固形物を除いた反応液上清から、イオン交換樹脂、膜処理法、晶析法などの操作を組み合わせて、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを単離することができる。
　また、例えば、酵素を産生する微生物の菌体を含む培養物や、同培養物の処理物を酵素として使用した場合で、菌体内等にγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙが蓄積する場合には、適宜、菌体等を破砕した後、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを単離してもよい。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１：サッカロマイセス・セレビシエ由来野生型グルタチオン合成酵素遺伝子（ＧＳＨ２）発現プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ２の構築
　サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株（ＡＴＣＣ２６１０８）の野生型グルタチオン合成酵素をコードするＧＳＨ２遺伝子の発現プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ２を以下の手順で構築し、エシェリヒア・コリに導入した。なお、構築手順の概要を図１に示す。
（１‐１）酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ‐ＧＳＨ２の構築
　まず、酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ‐ＧＳＨ２を、タカラバイオに委託し、以下の手順で構築した。
　サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株のＧＳＨ２遺伝子の塩基配列（配列番号１）を基に作製したプライマーＡ（配列番号３）およびプライマーＢ（配列番号４）、ならびに鋳型としてサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ＧＳＨ２遺伝子を含む配列の増幅を行った。プライマーＡは、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡのＧＳＨ２遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端にＫｐｎＩ認識配列および酵母発現プラスミドｐＡＵＲ１２３の部分配列を付加したものである。プライマーＢは、ＧＳＨ２遺伝子のＣ末端塩基配列と相補的な塩基配列に、Ｈｉｓタグをコードする配列と相補的な塩基配列、終止コドン（ＴＡＡ）と相補的な塩基配列、ＸｂａＩ認識配列、および酵母発現プラスミドｐＡＵＲ１２３の部分配列を付加したものである。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、マニュアルに従って行った。増幅された断片をＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社製）のＫｐｎＩ‐ＸｂａＩサイトに導入し、酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ‐ＧＳＨ２を取得した。
（１‐２）エシェリヒア・コリ用発現プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ２の構築
　続いて、エシェリヒア・コリ用発現プラスミドｐＥＴ‐ＧＳＨ２を以下の手順で構築した。
　日本バイオサービス社より、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株のＧＳＨ２遺伝子の塩基配列（配列番号１）を基に作製したプライマーＣ（配列番号５）およびプライマーＤ（配列番号６）を購入した。プライマーＣは、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡのＧＳＨ２遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端にＮｄｅＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＤは、上記のｐＡＵＲ‐ＧＳＨ２のＧＳＨ２遺伝子の終止コドンの外側の塩基配列と相補的な塩基配列の５’末端にＸｈｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
　プライマーＣおよびプライマーＤ、ならびに鋳型として上記のｐＡＵＲ‐ＧＳＨ２を用いたＰＣＲにより、ＧＳＨ２遺伝子を含む配列の増幅を行った。ＰＣＲは、プラスミドＤＮＡ、０．２μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、１．２５ｕｎｉｔのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、１０μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ緩衝液（タカラバイオ社製）、各２．５ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む反応液５０μｌを調製し、９８℃で１０秒加温した後、９８℃で１０秒間、５６℃で５秒間、７２℃で２分間の工程を３０回繰り返し、さらに７２℃で１分間加温することにより行った。
　ＰＣＲ後の反応液３μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、ＧＳＨ２遺伝子断片に相当する約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液からＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅ（ニッポンジーン社製）を用いて該ＤＮＡ断片を精製し、２５μｌのｄＨ２Ｏに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液全量を用い、該ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、１５μｌのＢｕｆｆｅｒ　ＥＢ（キアゲン社製）に溶解した。
　１μｇの発現プラスミドｐＥＴ‐２１ａ（＋）（ノバジェン社製）を制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｋｉｔを用いて精製し、１５μｌのＢｕｆｆｅｒ　ＥＢに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液全量を用い、ＤＮＡ断片をＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｃａｌｆ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）（ＣＩＡＰ）で脱リン酸化した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｋｉｔを用いて精製し、１０μｌのＢｕｆｆｅｒ　ＥＢに溶解した。
　上記で得られたＧＳＨ２遺伝子を含む約１．５ｋｂのＤＮＡ断片および上記で得られた発現プラスミドｐＥＴ‐２１ａ（＋）の約５．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社製）を用いて、１６℃で３０分間反応させ連結した。該反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（タカラバイオ社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ［１０ｇ／Ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／Ｌイーストエキス（ディフコ社製）、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム（Ｗａｋｏ社製）］寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。
　生育してきた形質転換体のコロニーより、公知の方法によりプラスミドを抽出し、その塩基配列を公知の方法により決定した。得られたプラスミドは、３’末端にＨｉｓタグをコードする配列が付加されたサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株由来ＧＳＨ２遺伝子が、Ｔ７プロモーター下流に連結されたプラスミドであり、該プラスミドをｐＥＴ‐ＧＳＨ２と命名した。なお、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株由来ＧＳＨ２遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２に示す。
　続いて、ｐＥＴ‐ＧＳＨ２を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株コンピテントセル（ノバジェン社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｐＥＴ‐ＧＳＨ２が保持されていることを確認した。このｐＥＴ‐ＧＳＨ２を保持するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株を、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ‐ＧＳＨ２と命名した。
実施例２：野生型Ｇｓｈ２の精製
　実施例１で得られたエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ‐ＧＳＨ２を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液のうち２ｍｌを１００ｍｌのＬＢ培地が入った坂口フラスコに接種した。３７℃で２時間振とう培養後、終濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、さらに３０℃で４時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
　該湿菌体を、３００ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ８．０の１００ｍｍｏｌ／Ｌトリス‐塩酸バッファー１０ｍｌに懸濁し超音波処理により破砕した後、遠心分離して得られる上清から、Ｈｉｓタグ付加タンパク質精製キットであるＮｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、マニュアルに従いＨｉｓタグ付加組換え型Ｇｓｈ２を精製し、続いて、ＰＤ‐１０カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、マニュアルに従い脱塩を行った。この精製および脱塩されたＧｓｈ２を、精製Ｇｓｈ２（野生型）として以降の実験に用いた。
実施例３：野生型Ｇｓｈ２を用いたγ‐グルタミルトリペプチドの生成
　実施例２で取得したサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株由来の精製Ｇｓｈ２（野生型）を用い、γ‐グルタミルバリン（γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ）またはγ‐グルタミルノルバリン（γ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ）を基質とするγ‐グルタミルトリペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液（ｐＨ８．０）２００μｌをそれぞれ調製し、３７℃で１６時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製Ｇｓｈ２（野生型）　　　　　　　　　　　１２．４μｇ／２００μｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）　　　　　　　　１００　　ｍｍｏｌ／Ｌ
γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌまたはγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ　　１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
グリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）　　　　　　　　　　１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　　　　１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）　　　　　　　　　　　０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
　反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣにより分析した。分析条件は、下記の通りである。
（１）ＨＰＬＣ：ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｌ‐２０００シリーズ
（２）分離カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　４μ　Ｈｙｄｒｏ‐ＲＰ　８０Ａ、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、粒子径４μｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
（３）カラム温度：４０℃
（４）移動相Ａ：５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ２．５）
（５）移動相Ｂ：アセトニトリル
（６）流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
（７）溶出条件：溶出は、移動相Ａおよび移動相Ｂの混合液を用いて行った。混合液に対する移動相Ｂの比率は以下の通りである。０分（０％）、０分～５分（０％～２．５％）、５分～１５分（２．５％）、１５分～３０分（２．５％～４０％）、３０分～３０．１分（４０％～０％）、３０．１分～５０分（０％）。
（８）検出：ＵＶ２１０ｎｍ
　上記測定の結果、それぞれの反応生成物のピークは、γ‐グルタミルバリルグリシン（γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙ）およびγ‐グルタミルノルバリルグリシン（γ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙ）の標品のピークと保持時間が一致し、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙおよびγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙであると判断した。定量の結果、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙ濃度は０．１３ｍｍｏｌ／Ｌ、γ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙ濃度は６．０ｍｍｏｌ／Ｌであった。
　さらに、標品のγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙのピークと保持時間が一致した画分をＨＰＬＣで分取し、質量分析装置を用いてγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙであることを確認した。具体的には、分取したペプチドを６‐アミノキノリル‐Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）を用いて蛍光誘導体化し、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳにより検出することより行った。手順は以下の通りである。
　適当な濃度に希釈した分取画分溶液２．５μｌ、または１μＭのγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙを含む標準液２．５μｌに、ＭｉｌｌｉＱ水２．５μｌ、５μＭ内部標準物質溶液（安定同位体で標識されたＬ‐ａｌａｎｉｎｅ‐３，３，３‐ｄ３（Ａｌａ‐Ｄ３；シグマ社製））５μｌ、および硼酸緩衝液（日本ウォーターズ社製ＡｃｃＱ‐Ｆｌｏｕｒ（登録商標）試薬キット付属品）３０μｌを添加した。この混合物に、ＡＱＣ試薬溶液（上記ＡｃｃＱ‐Ｆｌｏｕｒ試薬キットの試薬粉末をアセトニトリル１ｍｌ中に溶解することにより調製）１０μｌを添加した。得られた混合物を１０分間、５５℃で加熱後、０．１％のギ酸水溶液１００μｌを加え、分析サンプルとした。
　次に、分析サンプルを、逆相液体クロマトグラフィーにより分離させた。分離条件は下記の通りである。
（１）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ
（２）分離カラム：Ｕｎｉｓｏｎ　ＵＫ‐Ｐｈｅｎｙｌ、内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径３μｍ（Ｉｍｔａｋｔ社製）
（３）カラム温度：４０℃
（４）移動相Ａ：２５ｍＭギ酸水溶液をアンモニア水でｐＨ６．０に調整した水溶液
（５）移動相Ｂ：メタノール
（６）流速：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ
（７）溶出条件：溶出は、移動相Ａおよび移動相Ｂの混合液を用いて行った。混合液に対する移動相Ｂの比率は以下の通りである。０分（５％）、０分～１７分（５％～４０％）、１７分～１７．１分（４０％～８０％）、１７．１分～１９分（８０％）、１９分～１９．１分（８０％～５％）、１９．１分～２７分（５％）。
　その後、上記分離条件によって溶出されたγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙの誘導体化物を質量分析計に導入してマスクロマトグラムを取得した。分析条件は下記の通りである。
（１）質量分析装置：ＡＢ　Ｓｃｉｅｘ　ＡＰＩ３２００　ＱＴＲＡＰ
（２）検出モード：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｏｎ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ポジティブイオンモード）
（３）選択イオン：表１
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られた結果を解析ソフトＡｎａｌｙｓｔ　ｖｅｒ１．４．２（ＡＢ　Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて解析し、標品のγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙのピークと保持時間が一致したピークが、γ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ‐Ｇｌｙのピークであることを確認した。
実施例４：変異型ＧＳＨ２遺伝子の構築
　変異型グルタチオン合成酵素をコードする変異型ＧＳＨ２遺伝子を構築するため、Ｐｈｕｓｉｏｎ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製）を使用し、各種変異型ＧＳＨ２遺伝子に対応するプライマー（配列番号７～２３８）を用いて、実施例１で構築したｐＥＴ－ＧＳＨ２を鋳型として、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、プラスミドＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、０．５ｕｎｉｔのＰｈｕｓｉｏｎ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡポリメラーゼ、５μＬの５ｘＰｈｕｓｉｏｎ　ＨＦ緩衝液（ＦＩＮＮＺＹＭＥＳ社製）、各２．５ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）を含む反応液２５μｌを調製し、９８℃で３０秒加温した後、９８℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分３０秒間の工程を３０回繰り返すことにより行った。また、各変異とプライマーの関係を表２～６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）で消化した後、該反応液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９株コンピテントセル（タカラバイオ社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。
　生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、該ＤＮＡの塩基配列を公知の方法で確認を行い、目的の位置に変異の入ったＧＳＨ２遺伝子を有する各種プラスミドを得た。また、多重変異の導入されたＧＳＨ２遺伝子の発現プラスミドは、上記の方法で作製した各変異型ＧＳＨ２遺伝子の発現プラスミドを鋳型として、上記と同様の方法で順次変異を導入して作製した。各変異が導入されたプラスミドは、ｐＥＴ－ＧＳＨ２に各々の変異の態様を付加して命名した。例えば、Ｅ３８６Ｄ変異を有する変異型Ｇｓｈ２をコードする変異型ＧＳＨ２遺伝子を持つプラスミドは、ｐＥＴ－ＧＳＨ２（Ｅ３８６Ｄ）と、Ｅ３８６ＤとＹ４４６Ｆの二つの変異を有する変異型Ｇｓｈ２をコードする変異型ＧＳＨ２遺伝子を持つプラスミドは、ｐＥＴ－ＧＳＨ２（Ｅ３８６Ｄ＋Ｙ４４６Ｆ）と表記する。なお、以下、変異型ＧＳＨ２遺伝子の発現プラスミドを総称して、ｐＥＴ－ＧＳＨ２（ＸＸＸ）と記載する場合がある。
　続いて、ｐＥＴ－ＧＳＨ２（ＸＸＸ）を用いてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株コンピテントセル（インビトロジェン社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養し、得られた目的の形質転換株を以後の検討に用いた。
実施例５：変異型Ｇｓｈ２の精製
　実施例４で得られたｐＥＴ－ＧＳＨ２（ＸＸＸ）を保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）［エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＧＳＨ２（ＸＸＸ）］を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液のうち４００μｌを２０ｍｌのＬＢ培地が入った試験管に接種した。３７℃で２時間振とう培養後、終濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル－β―Ｄ―チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、さらに３０℃で４時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
　該湿菌体を、１ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に懸濁しタンパク質を抽出した後、遠心分離して得られる上清から、Ｎｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（Ｈｉｓタグ付加タンパク質精製キット、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、マニュアルに従いＨｉｓタグ付加組換え型Ｇｓｈ２を精製し、５００ｍｍｏｌ／Ｌのイミダゾールを含む精製Ｇｓｈ２（変異型）を得た。
実施例６：変異型Ｇｓｈ２によるγ‐グルタミルトリペプチド合成能評価
　実施例５で取得した各精製Ｇｓｈ２（変異型）を用い、γ‐グルタミルシステイン（γ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓ）、γ‐グルタミルバリン（γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ）、またはγ‐グルタミルノルバリン（γ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ）を基質とするγ‐グルタミルトリペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液（ｐＨ８．０）２００μｌをそれぞれ調製し、３７℃でγ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓ基質を用いた反応は２分間、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ基質を用いた反応は３０分間、γ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ基質を用いた反応は５分間行った。なお、精製Ｇｓｈ２量は、γ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓ基質を用いた反応では０．６　μｇ／２００μｌ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ基質またはγ‐Ｇｌｕ‐ｎＶａｌ基質を用いた反応では５４．５　μｇ／２００μｌとした。
〔反応液組成〕
精製Ｇｓｈ２（変異型）　　　　０．６または５４．５　μｇ／２００μｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）　　　　　　　　５０　　　ｍｍｏｌ／Ｌ
グリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ
γ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓ、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ、またはγ－Ｇｌｕ－ｎＶａｌ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　　　ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）　　　　　　　　　１２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　　　１２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）　　　　　　　　　　２　　　ｍｍｏｌ／Ｌ
　反応終了後、反応生成物をＨＰＬＣにより分析した。分析条件は、下記の通りである。
（１）ＨＰＬＣ：ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｌ‐２０００シリーズ
（２）分離カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　４μ　Ｈｙｄｒｏ‐ＲＰ　８０Ａ、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、粒子径４μｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
（３）カラム温度：４０℃
（４）移動相：５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝９５／５
（５）流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
（６）検出：ＵＶ２１０ｎｍ
　上記測定の結果に基づき、それぞれの基質において、野生型のＧｓｈ２のγ‐グルタミルトリペプチド合成活性を１００としたときの、各変異型Ｇｓｈ２の相対活性を算出し、表７～１１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
実施例７：Ｇｓｈ２の反応速度論解析
（７－１）野生型Ｇｓｈ２および変異型Ｇｓｈ２の大量精製
　野生型Ｇｓｈ２および変異型Ｇｓｈ２の反応速度論的な解析を行うため、以下の手順で精製酵素を調製した。
　実施例１で得られたｐＥＴ－ＧＳＨ２を保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）［エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＧＳＨ２］および実施例４で得られたｐＥＴ－ＧＳＨ２（ＸＸＸ）を保有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）［エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＧＳＨ２（ＸＸＸ）］をそれぞれ１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液のうち２ｍｌを１００ｍｌのＬＢ培地が入った坂口フラスコ４本にそれぞれ接種した。３７℃で２時間振とう培養後、終濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル－β―Ｄ―チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、さらに３０℃で４時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
　坂口フラスコ４本分の湿菌体を合わせ、２０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘに懸濁しタンパク質を抽出した後、遠心分離して得られる上清から、Ｎｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗを用い、マニュアルに従いＨｉｓタグ付加組換え型Ｇｓｈ２を精製し、続いて、ＰＤ‐１０カラムを用いて、マニュアルに従い脱塩を行った。この精製および脱塩されたＧｓｈ２を、精製Ｇｓｈ２として以降の実験に用いた。
（７－２）野生型Ｇｓｈ２および変異型Ｇｓｈ２の反応速度論解析
　（７－１）で取得した精製Ｇｓｈ２を用いて、野生型Ｇｓｈ２と変異型Ｇｓｈ２について、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌを基質とした際の酵素反応速度論的な解析を行った。下記組成の反応液（ｐＨ８．０）２００μｌをそれぞれ調製し、３７℃で２～５分間反応を行い、酵素反応の初期速度を測定した。ＨＵＬＩＮＫＳ社製のＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈを用いて、酵素反応の速度定数（Kcat値及びKm値）を求めた。その結果を表１２に示す。 
〔反応液組成〕
精製Ｇｓｈ２（野生型または変異型）　８５～１７０　　μｇ／２００μｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）　　　 　　　　 ５０　　　ｍｍｏｌ／Ｌ
グリシン　　　　　　　　　　　　　　 　　　　 １２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ
γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ　　　　　　　　　  ０．０５～０．５　ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）　　　  　　　　　１２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム　　　　　　　　　  　　　　　１２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）　　　  　　　　　　２　　　ｍｍｏｌ／Ｌ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
実施例８：サッカロマイセス・セレビシエ由来γ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子（ＧＳＨ１）発現プラスミドｐＥＴ－ＧＳＨ１の構築
　サッカロマイセス・セレビシエのＳ２８８Ｃ株のγ‐グルタミルシステイン合成酵素をコードするＧＳＨ１遺伝子の発現プラスミドｐＥＴ－ＧＳＨ１を以下の手順で構築し、エシェリヒア・コリに導入した。なお、構築手順の概要を図２に示す。
（８－１）酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ－ＧＳＨ１の構築
　まず、酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ－ＧＳＨ１を、タカラバイオに委託し、以下の手順で構築した。
　サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株のＧＳＨ１遺伝子の塩基配列（配列番号２３９）を基に作製したプライマーＥ（配列番号２４１）およびプライマーＦ（配列番号２４２）、ならびに鋳型としてサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲによりＧＳＨ１遺伝子を含む配列の増幅を行った。プライマーＥは、サッカロマイセス・セレビシエ株の染色体ＤＮＡのＧＳＨ１遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端にＫｐｎＩ認識配列および酵母発現プラスミドｐＡＵＲ１２３の部分配列を付加したものである。プライマーＦは、ＧＳＨ１遺伝子のＣ末端塩基配列と相補的な塩基配列にＨｉｓタグをコードする配列と相補的な塩基配列、終止コドン（ＴＡＡ）に相補的な塩基配列、ＸｂａＩ認識配列、および酵母発現プラスミドｐＡＵＲ１２３の部分配列を付加したものである。ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　ポリメラーゼを用い、マニュアルに従って行った。
　増幅された断片をＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｋｉｔを用いてマニュアルに基づき酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ１２３のＫｐｎＩ‐ＸｂａＩサイトに導入し、酵母用発現プラスミドｐＡＵＲ‐ＧＳＨ１を作成した。
（８－２）エシェリヒア・コリ用発現プラスミドｐＥＴ－ＧＳＨ１の構築
　続いて、エシェリヒア・コリ用発現プラスミドｐＥＴ－ＧＳＨ１を以下の手順で構築した。
　日本バイオサービス社より、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株のＧＳＨ１遺伝子の塩基配列（配列番号２３９）を基に作製したプライマーＧ（配列番号２４３）およびプライマーＨ（配列番号２４４）を購入した。プライマーは、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株の染色体ＤＮＡのＧＳＨ１遺伝子の開始コドンの次からを含む領域の５’末端にＳｐｅＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーは、上記のｐＡＵＲ‐ＧＳＨ１のＧＳＨ１遺伝子の終止コドンの外側の塩基配列と相補的な塩基配列の５’末端にＳａｌＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
　プライマーＧおよびプライマーＨ、ならびに鋳型として上記のｐＡＵＲ－ＧＳＨ１を用いたＰＣＲにより、ＧＳＨ１遺伝子を含む配列の増幅を行った。ＰＣＲは、プラスミドＤＮＡ、０．２μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、１．２５ｕｎｉｔのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡポリメラーゼ、１０μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ緩衝液、各２．５ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む反応液５０μｌを調製し、９８℃で１０秒間加温した後、９８℃で１０秒間、５６℃で５秒間、７２℃で２分間の工程を３０回繰り返し、さらに７２℃で１分間加温することにより行った。
　ＰＣＲ後の反応液の３μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、ＧＳＨ１遺伝子断片に相当する約２．０ｋｂのＤＮＡ断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液からＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅを用いて該ＤＮＡ断片を精製し、２５μｌのｄＨ２Ｏに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液全量を用い、該ＤＮＡを制限酵素ＳｐｅＩおよびＳａｌＩで切断した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｋｉｔを用いて該ＤＮＡ断片を精製し、１５μｌのＢｕｆｆｅｒ　ＥＢに溶解した。
　１μｇの発現プラスミドｐＥＴ－２１ａ（＋）を制限酵素ＮｈｅＩおよびＳａｌＩで切断後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｋｉｔを用いて該ＤＮＡ断片を精製し、１５μｌのＢｕｆｆｅｒ　ＥＢに溶解した。次に、得られたＤＮＡ溶液全量を用い、該ＤＮＡ断片をＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，Ｃａｌｆ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（ＣＩＡＰ）で脱リン酸化した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｋｉｔを用いて精製し、１０μｌのＢｕｆｆｅｒ　ＥＢに溶解した。
　上記で得られたＧＳＨ１遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片および上記で取得した発現ベクターｐＥＴ－２１ａ（＋）の約５．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２．１を用いて、１６℃で３０分間反応させ連結した。該反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（タカラバイオ社製）を、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。
　生育してきた形質転換体のコロニーより、公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、その塩基配列を公知の方法により決定した。得られたプラスミドは、３’末端にＨｉｓタグ配列をコードする配列が付加されたサッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株由来ＧＳＨ１遺伝子が、Ｔ７プロモーター下流に連結されたプラスミドであり、ｐＥＴ－ＧＳＨ１と命名した。なお、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株由来ＧＳＨ１遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２３９および配列番号２４０に示す。
　続いて、ｐＥＴ－ＧＳＨ１を用いてエシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株コンピテントセルを、ヒートショック法により形質転換し、該形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布した後、３７℃で一晩培養した。生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｐＥＴ－ＧＳＨ１が保持されていることを確認した。このｐＥＴ－ＧＳＨ１を保持するエシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を、エシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴ－ＧＳＨ１と命名した。
実施例９：Ｇｓｈ１の精製
　実施例８で得られたエシェリヒア・コリＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＥＴ－ＧＳＨ１を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む３ｍＬのＬＢ培地の入った試験管に接種し３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液のうち２ｍｌを１００ｍｌのＬＢ培地が入った坂口フラスコに接種した。３７℃で２時間振とう培養後、終濃度が０．５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにイソプロピル－β―Ｄ―チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、さらに３０℃で４時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
　該湿菌体を、５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に懸濁しタンパク質を抽出した後、遠心分離して得られる上清から、Ｎｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗを用い、説明書に従いＨｉｓタグ付加組換え型Ｇｓｈ１を精製した。続いて、該精製酵素についてＰＤ－１０カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、説明書に従い脱塩を行った。この精製および脱塩されたＧｓｈ１を、精製Ｇｓｈ１として以降の実験に用いた。
実施例１０：Ｇｓｈ１を用いたγ‐グルタミルジペプチドの生成
　実施例９で取得した精製Ｇｓｈ１を用い、バリン、ノルバリン、またはα‐アミノ酪酸（Ａｂｕ）を基質とするγ‐グルタミルジペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液（ｐＨ８．５）２００μｌをそれぞれ調製し、３０℃で２４時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製Ｇｓｈ１　　　　　　　　　　　　　　　　４０．５μｇ／２００μｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．５）　　　　　　　　　５０　　ｍｍｏｌ／Ｌ
バリン、ノルバリン、またはα‐アミノ酪酸　　　　１０　　ｍｍｏｌ／Ｌ
グルタミン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）　　　　　　　　　　１０　　ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）　　　　　　　　　　　２　　ｍｍｏｌ／Ｌ
グリセロール　　　　　　　　　　　　２０　　％（Ｖｏｌ．／Ｖｏｌ．）
　反応終了後、実施例６に記載の条件にて反応生成物をＨＰＬＣにより分析したところ、それぞれの反応生成物のピークはγ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ、γ‐Ｇｌｕ－ｎＶａｌ、およびγ‐Ｇｌｕ－Ａｂｕの標品のピークと保持時間が一致し、γ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ、γ‐Ｇｌｕ－ｎＶａｌ、およびγ‐Ｇｌｕ－Ａｂｕであると判断した。定量の結果、γ‐Ｇｌｕ－Ｖａｌ濃度は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、γ‐Ｇｌｕ－ｎＶａｌ濃度は４．７ｍｍｏｌ／Ｌ、γ‐Ｇｌｕ－Ａｂｕ濃度は８．２ｍｍｏｌ／Ｌであった。
実施例１１：変異型Ｇｓｈ２を用いたアミノ酸からのγ‐グルタミルトリペプチドの生成
　実施例９で取得した精製Ｇｓｈ１と、実施例７で取得した精製野生型ＧＳＨ２または精製変異型Ｇｓｈ２（Ｓ４４Ｔ＋Ｌ１３２Ｍ＋Ｌ１９５Ｖ）を用い、アミノ酸からのγ‐グルタミルトリペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液（ｐＨ９．０）２００μｌを調製し、３０℃で８時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製Ｇｓｈ１　　　　　　　　　　　　　　　１２７　　μｇ／２００μｌ
精製Ｇｓｈ２（野生型または変異型）　　　　　　７　　μｇ／２００μｌ
Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ９．０）　　　　　　　　　５０　　ｍｍｏｌ／Ｌ
バリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　ｍｍｏｌ／Ｌ
グルタミン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　ｍｍｏｌ／Ｌ
グリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　ｍｍｏｌ／Ｌ
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）　　　　　　　　　　１０　　ｍｍｏｌ／Ｌ
硫酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　ｍｍｏｌ／Ｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）　　　　　　　　　　　２　　ｍｍｏｌ／Ｌ
グリセロール　　　　　　　　　　　　２０　　％（Ｖｏｌ．／Ｖｏｌ．）
　反応終了後、実施例６に記載の条件にて反応生成物をＨＰＬＣにより分析した。その結果、図３に示すように、野生型Ｇｓｈ２を用いた反応では、０．０８ｍｍｏｌ／Ｌのγ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙが生成したのに対し、変異型Ｇｓｈ２（Ｓ４４Ｔ／Ｌ１３２Ｍ／Ｌ１９５Ｖ）を用いた反応では、０．１１ｍｍｏｌ／Ｌのγ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙが生成し、Ｇｓｈ２の変異によるγ‐Ｇｌｕ‐Ｖａｌ‐Ｇｌｙ生成量の増加が認められた。
実施例１２：ＧＳＨ２発現用のＹＣｐ型プラスミドの構築
　変異型ＧＳＨ２の酵母細胞内での効果を野生型ＧＳＨ２と比較する為に、１コピー型プラスミドである酵母セントロメア型プラスミド（ＹＣｐ型プラスミド）を基に、野生型ＧＳＨ２の発現プラスミドｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐ－ＧＳＨ２（ＷＴ）と変異型ＧＳＨ２（Ｙ４４６Ｆ）の発現プラスミドｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐ－ＧＳＨ２（Ｙ４４６Ｆ）を構築した。
（１２－１）ＵＲＡ３マーカー遺伝子をもつＹＣｐ型プラスミドｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐの構築
　まず、ｐＵＣ１９（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入可能）を基に、ＵＲＡ３マーカー遺伝子をもつＹＣｐ型プラスミドｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐを以下の手順で構築した。なお、構築手順の概要を図４に示す。
　サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８Ｃ株のゲノムを鋳型に、配列番号２４５および２４６のプライマーを用いて、Ｓ２８８Ｃ株を鋳型にＵＲＡ３遺伝子を、配列番号２４７および２４８のプライマーを用いてＨ４ＡＲＳを、配列番号２４９および２５０のプライマーを用いてＣＥＮ４を、配列番号２５１および２５２を用いてＰＧＫ１プロモーターを増幅した。つづいてＵＲＡ３をｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ－ＡａｔＩＩサイトへ、Ｈ４ＡＲＳをＫｐｎＩ－ＥｃｏＲＩサイトへ、ＣＥＮ４をＫｐｎＩサイトへ、ＰＧＫ１プロモーターをＳｍａＩ－ＢａｍＨＩサイトへ順にクローン化し、ＵＲＡ３マーカーとＰＧＫ１プロモーターをもつＹＣｐ型プラスミドｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐを作製した。
（１２－２）ＧＳＨ２発現プラスミドｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐ－ＧＳＨ２の構築
　続いて、ＧＳＨ２発現プラスミドｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐ－ＧＳＨ２を以下の手順で構築した。
　上記（１２－１）で作製したＹＣｐ型プラスミドｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐから野生型ＧＳＨ２を発現させるために、配列番号２５３および２５４を用いて、Ｓ２８８Ｃ株のゲノムを鋳型にして野生型ＧＳＨ２断片を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐのＢａｍＨＩ－ＳｐｈＩサイトへクローン化した。このようにしてコントロールとして野生型ＧＳＨ２を発現するＹＣｐ型プラスミドｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐ－ＧＳＨ２（ＷＴ）を構築した。同様に、変異型ＧＳＨ２（Ｙ４４６Ｆ）を発現させるために、配列番号２５３および２５４を用いて、実施例４で構築した変異型ＧＳＨ２（Ｙ４４６Ｆ）を持つプラスミドｐＥＴ－ＧＳＨ２（Ｙ４４６Ｆ）を鋳型にして変異型ＧＳＨ２（Ｙ４４６Ｆ）断片を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐのＢａｍＨＩ－ＳｐｈＩサイトへクローン化した。このようにして、変異型ＧＳＨ２（Ｙ４４６Ｆ）を発現するＹＣｐ型プラスミドｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐ－ＧＳＨ２（Ｙ４４６Ｆ）を構築した。
実施例１３：ウラシル要求株（ｕｒａ３変異株）の取得
　実施例１２で構築したＧＳＨ２発現プラスミドの導入にウラシル要求性を利用するため、サッカロマイセス・セレビシエのウラシル要求株（ｕｒａ３変異株）を構築した。ウラシル要求株は、Ｓｏｆｙａｎｏｖｉｃｈらの方法（Olga A. Sofyanovich et al: A New Method for Repeated “Self-Cloning” Promoter Replacement in Saccharomyces cerevisiae, Mol. Biotechnol.,48,218-227 (2011)）に準じて、ＵＲＡ３遺伝子を除いたＵＲＡ３近傍ＤＮＡをサッカロマイセス・セレビシエ野生型株１倍体(Ｍａｔα型)株に導入し、ＵＲＡ３遺伝子を破壊することによって取得した。なお、ＵＲＡ３遺伝子の欠損株は５－フルオロオロト酸（５－ＦＯＡ）耐性を示す。具体的な手順を以下に示す。
　まず、配列番号２５５及び２５６に示すプライマーを用い、上記野生型株の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、ＵＲＡ３の上流５００ｂｐを増幅した。また、配列番号２５７及び２５８に示すプライマーを用い、ＵＲＡ３の下流５００ｂｐを増幅した。ＰＣＲの条件は、熱変性 ９４℃で１０秒間、アニーリング ５５℃で１０秒間、伸張 ７２℃で１分間、２５ｃｙｃｌｅとした。次に、エタノール沈殿によって精製したこれら２つのＤＮＡ断片を鋳型に、配列番号２５９及び２６０に示すプライマーを用いてオーバーラップＰＣＲを行い、ＵＲＡ３遺伝子の上流５００ｂｐ及び下流５００ｂｐを結合した１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片で上記野生型株を形質転換した後、ウラシルを添加したＳＤ培地で一晩培養し、５－ＦＯＡ平板培地に菌体を塗布した。得られた形質転換体からＵＲＡ３遺伝子を欠損したｕｒａ３△０株を取得した。なお、このｕｒａ３△０株はプライベート番号ＡＪ１４９５６が付与され、２０１０年８月１８日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（住所　郵便番号３０５－８５６６　茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２２０００として寄託され、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２９９が付与されている。
実施例１４：ウラシル要求性のｇｓｈ２△０株の取得
　次に染色体上にコードされている野生型ＧＳＨ２の影響を取り除く為、ＡＪ１４９５６のＧＳＨ２遺伝子を以下の手順で破壊した。
　まず、サッカロマイセス・セレビシエ遺伝子破壊株コレクション中のＧＳＨ２破壊株（Homozygous Diploid collection, Open Bio Systems社より購入可能）を鋳型に、配列番号２６１および２６２に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を増幅した。次に、Ｚｙｍｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のＦｒｏｚｅｎ　ＥＺ　Ｙｅａｓｔ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ＩＩキットを用いてＡＪ１４９５６のコンピテントセルを作製し、増幅したＤＮＡ断片を同コンピテントセルに導入し、７５μｇ/ｍｌの濃度でＧ４１８を含有するＹＰＤプレートにスプレッドした。出現した耐性株の中から、ＧＳＨ２遺伝子が破壊されている菌株を選抜し、ウラシル要求性のGSH2破壊株であるｇｓｈ２△０株を取得した。
実施例１５：野生型ＧＳＨ２および変異型ＧＳＨ２発現酵母の取得
　実施例１２で構築した各ＧＳＨ２発現プラスミドで、実施例１４で構築したｇｓｈ２△０株を形質転換することにより、各ＧＳＨ２を発現する菌株を育種した。具体的には、実施例１４と同様にＺｙｍｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のＦｒｏｚｅｎ　ＥＺ　Ｙｅａｓｔ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ＩＩキットを用いてｇｓｈ２△０株のコンピテントセルを作製し、各ＧＳＨ２発現プラスミドを導入することにより、野生型ＧＳＨ２を発現するＷＴ株（ｇｓｈ２△０/ｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐ－ＧＳＨ２（ＷＴ））及び変異型ＧＳＨ２（Ｙ４４６Ｆ）を発現するＹ４４６Ｆ株（ｇｓｈ２△０/ｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐ－ＧＳＨ２（Ｙ４４６Ｆ））を取得した。
実施例１６：Ｙ４４６Ｆ変異の効果検証
　本実施例では、グルタチオン合成酵素のＹ４４６Ｆ変異が、菌体内γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ含量に与える効果を検証した。
　まず、ＷＴ株及びＹ４４６Ｆ株を各々ＳＤ培地（５００ｍｌ容坂口フラスコ中５０ｍｌ）に１エーゼ分植菌し、３０℃で１２０ｒｐｍの速度で２４時間振とう培養した。
〔ＳＤ培地組成〕
　グルコース     ２％
　Nitrogen Base  １倍濃度
　（１０倍濃度Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅは、１．７ｇのＢａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　Ａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社）と５ｇの硫酸アンモニウムを混合したものを１００ｍｌの滅菌水に溶解し、ｐＨを５．２程度に調整し、フィルター濾過滅菌したもの）
　得られた培養液の吸光度を測定し、初発ＯＤ６６０が０．０１になるように（なお、吸光度は、ＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ社のＤＵ６４０　ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲを用いて測定した。）、最終濃度で１００ｐｐｍのγ－Ｇｌｕ－Ｖａｌを含むＳＤ培地（５００ｍｌ容坂口フラスコ中５０ｍｌ）に植菌し、３０℃で１２０ｒｐｍの速度にて１９時間振とう培養した。その後、フィルター滅菌したＧｌｙ溶液を最終濃度で７５０ｐｐｍになるように培養液に添加し、培養を継続した。Ｇｌｙ溶液添加後に０時間、１時間、および４時間培養した培養液から、１０ＯＤｕｎｉｔｓ（ＯＤ６６０が１である培養液１ｍｌに含まれる菌体を１ＯＤｕｎｉｔと定義する。）分の菌体を遠心分離により採取した。上清は可能な限り取り除き、残った菌体を１５ｍｌのｍｉｌｌｉＱ水に懸濁した。再度遠心分離により菌体を集菌し、１５ｍｌのｍｉｌｌｉＱ水に再懸濁した。この操作を累計3回繰り返すことにより、菌体から培地分を完全に除去した。得られた洗浄菌体は、約０．５ｍｌのｍｉｌｌｉＱ水に懸濁し、７０℃で１０分間加熱した。この工程にて菌体内に含まれるエキス分を抽出した。次に、遠心操作によりエキスと菌体残渣を分離した。
　エキスから１０ｋＤａの遠心濾過膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社：Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍｌ　１０Ｋ（カタログ番号ＵＦＣ５０１０９６））を用いて細胞デブリを除去し、得られた画分をＡＱＣ（６－アミノキノリル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート）試薬にて蛍光誘導体化し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりγ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ量を測定した。また、乾燥菌体重量は、洗浄菌体を４時間１０４℃で乾燥させることにより測定した。このようにして測定した一定量の培養液に含まれるγ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ量及び乾燥菌体重量から、乾燥菌体あたりに含まれるγ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙの含量を算出した。菌体内γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ含量の経時的変化を表１３に示す。その結果、野生型ＧＳＨ２を発現するＷＴ株と比較して、変異型ＧＳＨ２（Ｙ４４６Ｆ）を発現するＹ４４６Ｆ株では菌体内でのγ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ生成能が高く、実施例６のｉｎ　ｖｉｔｒｏの検討で得られた結果がｉｎ　ｖｉｖｏでも再現された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　なお、エキス中のγ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙの測定は具体的には以下の方法で実施した。
　まず、適当な濃度に希釈した各サンプル溶液２．５μＬ、又は１μＭのγ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙを含む標準液２．５μＬに、ｍｉｌｌｉＱ水２．５μＬ、５μＭ内部標準物質溶液（安定同位体で標識されたＬ－ａｌａｎｉｎｅ－３，３，３－ｄ３（Ａｌａ－Ｄ３；シグマ社製））５μＬ、硼酸緩衝液（日本ウォーターズ社製ＡｃｃＱ－Ｆｌｕｏｒ（登録商標）試薬キット付属品）３０μＬを添加した。この混合物に、ＡＱＣ試薬溶液（上記ＡｃｃＱ－Ｆｌｕｏｒ試薬キットの試薬粉末をアセトニトリル１ｍＬ中に溶解することにより調製）１０μＬを添加した。得られた混合物を１０分間、５５℃で加熱後、０．１％のギ酸水溶液１００μＬを加え、分析サンプルとした。
　次に、前述のように調製した分析サンプルを、逆相の液体クロマトグラフィーで分離した。分離条件は下記の通りである。
（１）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００シリーズ
（２）分離カラム：Ｕｎｉｓｏｎ　ＵＫ－Ｐｈｅｎｙｌ　内径２．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、粒子径３μｍ（Ｉｍｔａｋｔ社製）
（３）カラム温度：４０℃
（４）移動相Ａ：２５ｍＭギ酸水溶液をアンモニア水でｐＨ６．０に調整した水溶液
（５）移動相Ｂ：メタノール
（６）流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ
（７）溶出条件：溶出は、移動相Ａ及び移動相Ｂの混合液を用いて行った。混合液に対する移動相Ｂの比率は以下の通り。０分（５%）、０分～１７分（５%～４０%）、１７分～１７．１分（４０％～８０％）、１７．１分～１９分（８０%）、１９分～１９．１分（８０％～５％）、１９．１分～２７分（５％）。
　その後、前述の分離条件によって溶出されたγ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙの誘導体化物を質量分析計に導入してマスクロマトグラムにより定量を行った。分析条件は下記の通りである。
（１）質量分析装置：ＡＢ　Ｓｃｉｅｘ　ＡＰＯ３２００　ＱＴＲＡＰ
（２）検出モード：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｏｎ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ポジティブイオンモード）
（３）選択イオン：表１４
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙの誘導体化物の定量は、解析ソフトＡｎａｌｙｓｔ　ｖｅｒ　１．４．２（ＡＢ　Ｓｃｉｅｘ）を用いて行った。定量を行うための内部標準物質として、γ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｙの誘導体化物の場合はＡｌａ－ｄ３の誘導体化物を用いた。
　本発明により、γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙで表されるペプチド、またはその塩を製造することができる。
配列表の説明
配列番号１：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ２遺伝子の塩基配列
配列番号２：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧｓｈ２タンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ２遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー（プライマーＡ）
配列番号４：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ２遺伝子を増幅するためのリバースプライマー（プライマーＢ）
配列番号５：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ２遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー（プライマーＣ）
配列番号６：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ２遺伝子を増幅するためのリバースプライマー（プライマーＤ）
配列番号７～２３８：ＧＳＨ２変異導入用ＰＣＲプライマー
配列番号２３９：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ１遺伝子の塩基配列
配列番号２４０：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧｓｈ１タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２４１：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ１遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー（プライマーＥ）
配列番号２４２：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ１遺伝子を増幅するためのリバースプライマー（プライマーＦ）
配列番号２４３：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ１遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー（プライマーＧ）
配列番号２４４：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＳＨ１遺伝子を増幅するためのリバースプライマー（プライマーＨ）
配列番号２４５～２５２：ｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐ作製のためのプライマー
配列番号２５３～２５４：ｐＣＡＵ－ＰＧＫ１ｐ－ＧＳＨ２作製のためのプライマー
配列番号２５５～２６０：ウラシル要求株取得のためのプライマー
配列番号２６１～２６２：ウラシル要求性のｇｓｈ２△０株の取得のためのプライマー

Claims (16)

  1. 　下記式（１）：
    　γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ　・・・（１）
    　（式中、Ｘは、Ｖａｌ、ｎＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｂｕ、およびＩｌｅからなる群より選択されるアミノ酸を示す。）
    　で表されるペプチド、またはその塩の製造方法であって、
    　γ‐Ｇｌｕ‐ＸおよびＧｌｙに、グルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを生成する工程を含み、
    　前記グルタチオン合成酵素が、下記（Ａ）～（Ｄ）から選択されるタンパク質である、方法：
    （Ａ）下記（ａ）～（ｃ）：
    （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、
    （ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有する変異型グルタチオン合成酵素：
    　S28、M29、F34、S44、F100、L104、I126、F127、L132、T149、V150、S153、F154、S158、S191、L195、L199、I223、V224、Q225、R226、N227、E228、N230、V236、L237、L252、T253、F254、Y284、T286、Y288、T289、T290、T291、D292、A313、L320、S321、S323、E386、G389、E416、L417、I445、Y446、L465、L466、R467、K469、G476、G477、A479、G483、C484、L485、
    （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
    （Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
    （Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質。
  2. 　下記式（１）：
    　γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ　・・・（１）
    　（式中、Ｘは、Ｖａｌ、ｎＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｂｕ、およびＩｌｅからなる群より選択されるアミノ酸を示す。）
    　で表されるペプチド、またはその塩の製造方法であって、
    　ＧｌｕおよびＸに、γ‐グルタミルシステイン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘを生成する工程、並びに
    　前記工程で得られたγ‐Ｇｌｕ‐ＸとＧｌｙに、グルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを生成する工程を含み、
    　前記グルタチオン合成酵素が、下記（Ａ）～（Ｄ）から選択されるタンパク質である、方法：
    （Ａ）下記（ａ）～（ｃ）：
    （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、
    （ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有する変異型グルタチオン合成酵素：
    　S28、M29、F34、S44、F100、L104、I126、F127、L132、T149、V150、S153、F154、S158、S191、L195、L199、I223、V224、Q225、R226、N227、E228、N230、V236、L237、L252、T253、F254、Y284、T286、Y288、T289、T290、T291、D292、A313、L320、S321、S323、E386、G389、E416、L417、I445、Y446、L465、L466、R467、K469、G476、G477、A479、G483、C484、L485、
    （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
    （Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
    （Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質。
  3. 　下記式（１）：
    　γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙ　・・・（１）
    　（式中、Ｘは、Ｖａｌ、ｎＶａｌ、Ｌｅｕ、Ａｂｕ、およびＩｌｅからなる群より選択されるアミノ酸を示す。）
    　で表されるペプチド、またはその塩の製造方法であって、
    　Ｇｌｕ、Ｘ、およびＧｌｙに、グルタチオン合成酵素およびγ‐グルタミルシステイン合成酵素を作用させることによりγ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙを生成する工程を含み、
    　前記グルタチオン合成酵素が、下記（Ａ）～（Ｄ）から選択されるタンパク質である、方法：
    （Ａ）下記（ａ）～（ｃ）：
    （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、
    （ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有する変異型グルタチオン合成酵素：
    　S28、M29、F34、S44、F100、L104、I126、F127、L132、T149、V150、S153、F154、S158、S191、L195、L199、I223、V224、Q225、R226、N227、E228、N230、V236、L237、L252、T253、F254、Y284、T286、Y288、T289、T290、T291、D292、A313、L320、S321、S323、E386、G389、E416、L417、I445、Y446、L465、L466、R467、K469、G476、G477、A479、G483、C484、L485、
    （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
    （Ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質、
    （Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有するタンパク質。
  4. 　前記変異が、下記より選ばれる１またはそれ以上の変異に相当する変異である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法：
    　S28T、M29V、F34Y、S44T、F100L、L104V、I126L、F127Y、L132（I, M, V）、T149V、V150（A, C, F, G, H, I, M, N, S, T, Y）、S153（A, T）、F154C、S158T、S191T、L195V、L199V、I223V、V224I、Q225（D, E, N）、R226Q、N227D、E228D、N230Q、V236I、L237I、L252V、T253S、F254Y、Y284F、T286S、Y288F、T289S、T290S、T291S、D292E、A313S、L320V、S321T、S323T、E386（D, N）、G389A、E416（D, Q）、L417（I, V, Y）、I445V、Y446F、L465F、L466V、R467K、K469R、G476N、G477N、A479N、G483A、C484S、L485V。
  5. 　前記変異が、下記より選ばれる変異に相当する変異である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法：
    　S28T、F34Y、S44T、L132M、V150A、V150C、V150F、V150G、V150H、V150I、V150M、V150N、V150S、V150T、V150Y、S191T、L195V、Q225D、V236I、L237I、E386D、I445V、Y446F、（S28T + S44T）、（S28T + L132M）、（S28T + L195V）、（S28T + E386D）、（S28T + Y446F）、（S44T + L132M）、（S44T + L195V）、（S44T + E386D）、（S44T + Y446F）、（L132M + L195V）、（L132M + E386D）、（L132M + Y446F）、（V150T + Y446F）、（V150M + L195V）、（V150M + Y446F）、（L195V + E386D）、（L195V + Y446F）、（E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M）、（S28T + S44T + L195V）、（S28T + S44T + E386D）、（S28T + S44T + Y446F）、（S28T + L132M + L195V）、（S28T + L132M + E386D）、（S28T + L132M + Y446F）、（S28T + L195V + E386D）、（S28T + L195V + Y446F）、（S28T + E386D + Y446F）、（S44T + L132M + L195V）、（S44T + L132M + E386D）、（S44T + L132M + Y446F）、（S44T + L195V + E386D）、（S44T + L195V + Y446F）、（S44T + E386D + Y446F）、（L132M + L195V + E386D）、（L132M + L195V + Y446F）、（L132M + E386D + Y446F）、（L195V + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + L195V）、（S28T + S44T + L195V + E386D）、（S28T + L132M + L195V + E386D）、（S28T + L195V + E386D + Y446F）、（S44T + L132M + L195V + E386D）、（S44T + L132M + E386D + Y446F）、（S44T + L195V + E386D + Y446F）、（L132M + L195V + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + L195V + E386D）、（S28T + S44T + L132M + L195V + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L195V + E386D + Y446F）、（S28T + L132M + L195V + E386D + Y446F）、（S44T + L132M + L195V + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + L195V + E386D + Y446F）。
  6. 　前記グルタチオン合成酵素および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が、該酵素の活性を有する微生物の培養物または該培養物の処理物である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記グルタチオン合成酵素および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が精製された酵素である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記グルタチオン合成酵素および／またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が固定化酵素である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記微生物が、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、請求項６に記載の方法。
  10. 　前記微生物が、エシェリヒア・コリまたはコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項９に記載の方法。
  11. 　下記（ａ）～（ｃ）：
    （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、
    （ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有する変異型グルタチオン合成酵素：
    　S28、M29、F34、S44、F100、L104、F154、S158、S191、L195、L199、I223、V224、Q225、R226、N227、N230、V236、L252、T253、F254、Y284、T290、T291、D292、A313、L320、S321、S323、G389、I445、L466、R467、K469、A479、G483、C484、L485。
  12. 　下記（ａ）～（ｃ）：
    （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列、
    （ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    のいずれかのアミノ酸配列において、下記より選ばれる１またはそれ以上の変異に相当する変異を有し、かつ、グルタチオン合成酵素活性を有する変異型グルタチオン合成酵素：
    　S28T、M29V、F34Y、S44T、F100L、L104V、I126L、F127Y、L132（I, M）、T149V、V150（A, C, F, G, H, I, M, N, S, T, Y）、S153（A, T）、F154C、S158T、S191T、L195V、L199V、I223V、V224I、Q225（D, E, N）、R226Q、N227D、E228D、N230Q、V236I、L237I、L252V、T253S、F254Y、Y284F、Y288F、T289S、T290S、T291S、D292E、A313S、L320V、S321T、S323T、E386（D, N）、G389A、E416（D, Q）、L417（I, V, Y）、I445V、Y446F、L466V、R467K、K469R、A479N、G483A、C484S、L485V。
  13. 　前記変異が、下記より選ばれる変異に相当する変異である、請求項１１または１２に記載の変異型グルタチオン合成酵素：
    　S28T、F34Y、S44T、L132M、V150A、V150C、V150F、V150G、V150H、V150I、V150M、V150N、V150S、V150T、V150Y、S191T、L195V、Q225D、V236I、L237I、E386D、I445V、Y446F、（S28T + S44T）、（S28T + L132M）、（S28T + L195V）、（S28T + E386D）、（S28T + Y446F）、（S44T + L132M）、（S44T + L195V）、（S44T + E386D）、（S44T + Y446F）、（L132M + L195V）、（L132M + E386D）、（L132M + Y446F）、（V150T + Y446F）、（V150M + L195V）、（V150M + Y446F）、（L195V + E386D）、（L195V + Y446F）、（E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M）、（S28T + S44T + L195V）、（S28T + S44T + E386D）、（S28T + S44T + Y446F）、（S28T + L132M + L195V）、（S28T + L132M + E386D）、（S28T + L132M + Y446F）、（S28T + L195V + E386D）、（S28T + L195V + Y446F）、（S28T + E386D + Y446F）、（S44T + L132M + L195V）、（S44T + L132M + E386D）、（S44T + L132M + Y446F）、（S44T + L195V + E386D）、（S44T + L195V + Y446F）、（S44T + E386D + Y446F）、（L132M + L195V + E386D）、（L132M + L195V + Y446F）、（L132M + E386D + Y446F）、（L195V + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + L195V）、（S28T + S44T + L195V + E386D）、（S28T + L132M + L195V + E386D）、（S28T + L195V + E386D + Y446F）、（S44T + L132M + L195V + E386D）、（S44T + L132M + E386D + Y446F）、（S44T + L195V + E386D + Y446F）、（L132M + L195V + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + L195V + E386D）、（S28T + S44T + L132M + L195V + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L195V + E386D + Y446F）、（S28T + L132M + L195V + E386D + Y446F）、（S44T + L132M + L195V + E386D + Y446F）、（S28T + S44T + L132M + L195V + E386D + Y446F）。
  14. 　請求項１１～１３のいずれか１項に記載の変異型グルタチオン合成酵素をコードするＤＮＡを有する酵母。
  15. 　サッカロマイセス属に属する、請求項１４に記載の酵母。
  16. 　サッカロマイセス・セレビシエである、請求項１５に記載の酵母。
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