WO2021100846A1 - 有用物質の製造方法 - Google Patents

有用物質の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021100846A1
WO2021100846A1 PCT/JP2020/043356 JP2020043356W WO2021100846A1 WO 2021100846 A1 WO2021100846 A1 WO 2021100846A1 JP 2020043356 W JP2020043356 W JP 2020043356W WO 2021100846 A1 WO2021100846 A1 WO 2021100846A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
promoter
gene
glutathione
strain
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/043356
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
美里 松井
新吾 小林
直明 田岡
Original Assignee
株式会社カネカ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社カネカ filed Critical 株式会社カネカ
Priority to JP2021558466A priority Critical patent/JPWO2021100846A1/ja
Priority to CN202080080653.9A priority patent/CN114761541A/zh
Publication of WO2021100846A1 publication Critical patent/WO2021100846A1/ja
Priority to US17/749,857 priority patent/US20220290203A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/11—Aminopeptidases (3.4.11)
    • C12Y304/11004—Tripeptide aminopeptidase (3.4.11.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y108/00—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8)
    • C12Y108/01—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.8.1)
    • C12Y108/01007—Glutathione-disulfide reductase (1.8.1.7), i.e. glutathione reductase (NADPH)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02002—Gamma-glutamyltransferase (2.3.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02002—Glutamate-cysteine ligase (6.3.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02003—Glutathione synthase (6.3.2.3)

Definitions

  • One or more embodiments of the first disclosure relate to methods for producing ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione and / or oxidized glutathione.
  • Another embodiment of the first disclosure is a prokaryotic microorganism capable of overproducing ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione and / or oxidized glutathione. Regarding stocks.
  • the second disclosure relates to a microorganism that produces glutathione lacking the glutathione reductase gene, and a method for producing glutathione using the microorganism.
  • Glutathione is known to have reduced and oxidized forms, and reduced glutathione is a peptide consisting of three amino acids: L-cysteine, L-glutamic acid, and glycine.
  • Oxidized glutathione is a compound in which two molecules of reduced glutathione have a disulfide bond. It exists not only in the human body but also in many living organisms such as other animals, plants, and microorganisms, and is an important compound for living organisms such as active oxygen scavenging action, detoxification action, and amino acid metabolism. Therefore, it is attracting attention in the pharmaceutical, food and cosmetics industries. Further, in recent years, it has been found that oxidized glutathione has an effect of promoting plant growth, and it is expected to be used in various fields including agriculture.
  • glutathione is an oxidation of reduced glutathione (hereinafter sometimes referred to as "GSH"), which is a form of SH in which the thiol group of the L-cysteine residue is reduced, and the thiol group of the L-cysteine residue. It exists in any form of oxidized glutathione (hereinafter sometimes referred to as "GSSG”), which is a form in which a disulfide bond is formed between two glutathione molecules.
  • GSH reduced glutathione
  • GSSG oxidized glutathione
  • a method for producing glutathione a method for producing glutathione by fermentation using yeast or Escherichia coli (Patent Document 1), or ⁇ -glutamylcysteine synthase or glutathione synthase is produced using microorganisms, and L-glutamic acid and L-cysteine are produced.
  • Patent Documents 3 and 4 A method for producing by enzymatically linking glycine (Patent Documents 3 and 4) and the like are known.
  • Patent Document 1 is characterized in that glutathione is produced from the obtained culture medium by culturing yeast having increased thiol oxidase activity as compared with the parent strain in a medium, and then glutathione is recovered from the obtained culture solution. , A method for producing glutathione is described.
  • Patent Document 2 a microorganism having a higher activity of a protein having glutathione transport activity and a protein activity involved in the biosynthesis of glutathione or ⁇ -glutamylcysteine than the parent strain is cultured in a medium, and glutathione or ⁇ - A method for producing glutathione or ⁇ -glutamylcysteine, which produces and accumulates glutamilcysteine and collects glutathione or ⁇ -glutamylcysteine from the culture, is described.
  • Example 4 of Patent Document 2 an Escherichia coli strain overexpressing the gamma-glutamyl-cysteine ligase gene derived from Escherichia coli, gshA gene, and the glutathione synthase gene, gshB, was cultured in a medium supplemented with amino acids. It is stated that the glutathione concentration in the medium was 160 mg / L.
  • Non-Patent Document 1 Escherichia coli transformed with an expression vector containing the difunctional glutathione synthase gshF gene placed under the control of a constitutive promoter is subjected to glutathione constituent amino acids L-cysteine, L-glutamic acid and A method for producing glutathione by culturing in a medium supplemented with glycine is described.
  • a prokaryotic microbial strain capable of producing ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione and / or oxidized glutathione, and a method for producing the peptide using the same.
  • a new aspect of is required.
  • the first disclosure of the present specification includes the embodiments shown in (1) to (14) below.
  • Cysteine and cystine are the prokaryotic microbial strains in which the expression levels of one or more genes selected from the glutamate-cysteine ligase gene, the glutathione synthase gene, and the bifunctional glutathione synthase gene are increased as compared with the wild strain.
  • a method comprising culturing in a medium having a total concentration of 0.5 g / L or less.
  • the prokaryotic microbial strain overproduces ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione and / or oxidized glutathione by inducible expression of one or more genes.
  • the method according to (1) wherein (3) A method for producing ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione and / or oxidized glutathione.
  • a prokaryotic microbial strain in which the expression level of one or more genes selected from the glutamate-cysteine ligase gene, the glutathione synthase gene, and the bifunctional glutathione synthase gene is increased as compared with the wild strain is cultured in a medium. Including doing A method that does not involve the addition of cysteine or cystine to the medium.
  • the prokaryotic microbial strain overproduces ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione and / or oxidized glutathione by inducible expression of one or more genes. The method according to (3).
  • a protozoan microbial strain carrying one or more genes selected from a glutamate-cysteine ligase gene, a glutathione synthase gene, and a bifunctional glutathione synthase gene expressively linked to a promoter.
  • the promoter is a promoter that makes the transcription amount of the gamma-glutamyl-cysteine ligase gene by the prokaryotic microbial strain 20 times or more that of the wild-type strain when the one or more genes are the gamma-glutamyl-cysteine ligase gene.
  • a protozoan microbial strain capable of overproducing ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione and / or oxidized glutathione.
  • the inducible promoter is an IPTG-inducible promoter, a photo-inducible promoter, an araBAD promoter, a rhaBAD promoter, a tet promoter, a penP promoter, a cspA promoter, or a promoter containing a tetO or lacO operator as an operator sequence.
  • the inducible promoter includes a T5 promoter, a T7 promoter, a lacT5 promoter, a lacT7 promoter, a tac promoter, an araBAD promoter, a rhaBAD promoter, a tet promoter, a penP promoter, a cspA promoter, or a tetO or lacO operator as an operator sequence.
  • the prokaryotic microbial strain according to (7) which is a promoter.
  • the second disclosure of the present specification includes the embodiments shown in (15) to (22) below.
  • Microorganisms lacking the following genes [1] and [2] and having enhanced expression of the genes [3] or [4]: [1] A gene encoding ⁇ -glutamyl transferase (EC: 2.3.2.2); [2] Gene encoding glutathione reductase (EC: 1.8.1.7); [3] A gene encoding glutamic acid-cysteine ligase (EC: 6.3.2.2) and a gene encoding glutathione synthetase (EC: 6.3.3.2); [4] A gene encoding a bifunctional glutathione synthase.
  • ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione are inexpensive because the step of adding cysteine or cystine is not required. And / or oxidized glutathione can be produced.
  • the nuclear microbial strain according to the first disclosure of the present specification can efficiently produce ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione and / or oxidized glutathione. ..
  • the microorganism according to the second disclosure of the present specification has high glutathione productivity by fermentation.
  • glutathione According to the method for producing glutathione according to the second disclosure of the present specification, glutathione can be efficiently produced.
  • ⁇ -Glutamyl transferase> ⁇ -Glutamyl transferase (EC: 2.3.2.2) is an enzyme that hydrolyzes ⁇ -glutamyl peptides such as glutathione.
  • Gamma-glutamyl transferase is also referred to as “ ⁇ -glutamyl transpeptidase” or “Ggt”.
  • ⁇ -glutamyl transferase is also referred to as " ⁇ -glutamyl transpeptidase" or "Ggt”.
  • ⁇ -glutamyl transferase is interchangeable.
  • ⁇ -glutamyl transferase examples include (1A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22; (1B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted, or substituted (particularly preferably, the N-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 and the N-terminal A polypeptide consisting of a total of one or more amino acids substituted, deleted and / or added, preferably deleted and / or added amino acids at one or both of the C-terminals) with ⁇ -glutamyltransferase activity.
  • Polypeptide with (1C) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22.
  • the fragment can be a polypeptide having preferably 200 or more amino acids, more preferably 300 or more, more preferably 400 or more, more preferably 500 or more, and more preferably 550 or more.
  • polypeptides may be chemically modified as appropriate.
  • the “plurality” means, for example, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3. .
  • Conservative amino acid substitution is desirable for amino acid substitution.
  • “Conservative amino acid substitution” refers to a substitution between amino acids having similar properties such as charge, side chain, polarity, and aromaticity.
  • Amino acids with similar properties include, for example, basic amino acids (arginine, lysine, histidine), acidic amino acids (aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, cysteine, tyrosine), non-polar amino acids.
  • sex amino acids leucine, isoleucine, alanine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine
  • branched amino acids leucine, valine, isoleucine
  • aromatic amino acids phenylalanine, tyrosine, tryptophan, histidine
  • sequence identity means a sequence when two amino acid sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of amino acid matching between the two amino acids is the highest. The ratio (%) of the same amino acid residue to the total number of amino acid residues of the protein shown in No. 22. Sequence identity can be calculated using a protein search system using BLAST or FASTA (Karlin, S. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877; Altschul, S.F.et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410; Pearson, WR et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 ).
  • sequence identity of an amino acid sequence is used with the same meaning.
  • the "gene encoding ⁇ -glutamyl transferase refers to a nucleic acid (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the amino acid sequence of ⁇ -glutamyl transferase, and ⁇ -glutamyl. It is contained in the genomic DNA on the chromosome of wild-type microorganisms before deficient in transferase.
  • SEQ ID NO: 21 shows an example of DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 of ⁇ -glutamyl transferase derived from Escherichia coli.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 21 does not always exist as it is, the base sequence of SEQ ID NO: 21 is an exon sequence, and one or more intron sequences may intervene in the middle. ..
  • a polypeptide having a total of one or more bases substituted, deleted and / or added, preferably a deleted and / or added base sequence in one or both, and having ⁇ -glutamyltransferase activity is encoded.
  • Base sequence to be (1G) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identity with respect to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21.
  • sequence identity means a sequence when two base sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of amino acid matching between the two is the highest. The ratio (%) of the same base to the total number of bases of No. 21. Sequence identity can be calculated using a nucleotide sequence search system using BLAST or FASTA (Karlin, S. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877; Altschul. , FAet al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410; Pearson, WR et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444- 2448).
  • sequence identity of a base sequence is used with the same meaning.
  • Glutathione reductase EC: 1.8.1.7
  • Glutathione reductase is an enzyme that catalyzes the reaction of reducing oxidized glutathione (glutathione disulfide) in the presence of NADPH to produce reduced glutathione.
  • (2A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26;
  • (2B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26, a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted, or substituted (particularly preferably, the N-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 and the N-terminal A polypeptide consisting of a total of one or more amino acids substituted, deleted and / or added, preferably deleted and / or added amino acids at one or both of the C-terminals) and has glutathione reductase activity.
  • Polypeptide; (2C) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26. It can be a polypeptide consisting of an amino acid sequence having glutathione reductase activity; or a fragment of any of the polypeptides (2D) (2A) to (2C) having glutathione reductase activity.
  • the fragment can be a polypeptide having preferably 200 or more amino acids, more preferably 300 or more, and more preferably 400 or more.
  • the “plurality” means, for example, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3. ..
  • Conservative amino acid substitution is desirable for amino acid substitution. “Conservative amino acid substitution” is described in ⁇ 1.1. As described with respect to (1B) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>.
  • sequence identity in (2C) above is ⁇ 1.1. As described with respect to (1C) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>. That is, in the above (2C), “sequence identity” means that two amino acid sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of amino acid matching between the two amino acids is the highest. The ratio (%) of the same amino acid residue to the total number of amino acid residues of the protein shown in SEQ ID NO: 26.
  • the "gene encoding glutathione reductase (EC: 1.8.1.7)” refers to a nucleic acid (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the amino acid sequence of glutathione reductase, before deletion of glutathione reductase. It is contained in the genomic DNA on the chromosomes of wild-type microorganisms.
  • SEQ ID NO: 25 shows an example of DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 of glutathione reductase derived from Escherichia coli.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 25 does not always exist as it is, the base sequence of SEQ ID NO: 25 is an exon sequence, and one or more intron sequences may intervene in the middle. ..
  • (2H) A partial base sequence encoding the amino acid sequence of a polypeptide having glutathione reductase activity in the base sequence of any of (2E) to (2G);
  • (2I) In any of the base sequences (2E) to (2H), a base sequence into which a silent mutation (base substitution that does not change the encoding amino acid residue) is introduced
  • (2J) A base sequence encoding the amino acid sequence of any of the polypeptides (2A) to (2D); or Examples thereof include a base sequence in which any of (2K), (2E) to (2J) is used as an exon sequence, and one or more intron sequences are interposed in the base sequence.
  • sequence identity in the above (2G) is ⁇ 1.1. As described with respect to (1G) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>. That is, in the above (2G), “sequence identity” means that two base sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of base matching between the two base sequences is the highest. The ratio (%) of the same base to the total number of bases of SEQ ID NO: 25.
  • Tripeptide Peptidase EC: 3.4.11.4
  • Tripeptide peptidase is an enzyme that catalyzes the reaction that releases N-terminal amino acid residues from tripeptides.
  • the "tripeptide peptidase” is also referred to as “peptidase T” or "PepT”. In the present specification, "tripeptide peptidase”, “peptidase T” and “PepT" are interchangeable.
  • tripeptide peptidases include (5A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24; (5B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24, a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted, or substituted (particularly preferably, the N-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 and the N-terminal and A polypeptide consisting of a total of one or more amino acids substituted, deleted and / or added, preferably deleted and / or added amino acids at one or both of the C-terminals), which has tripeptipeptidase activity.
  • the fragment can be a polypeptide having preferably 200 or more amino acids, more preferably 300 or more, and more preferably 350 or more.
  • polypeptides may be chemically modified as appropriate.
  • the “plurality” means, for example, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3. ..
  • Conservative amino acid substitution is desirable for amino acid substitution. “Conservative amino acid substitution” is described in ⁇ 1.1. As explained with respect to (1B) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>.
  • sequence identity in (5C) above is ⁇ 1.1. As described with respect to (1C) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>. That is, in the above (5C), “sequence identity” means that two amino acid sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of amino acid matching between the two amino acids is the highest. The ratio (%) of the same amino acid residue to the total number of amino acid residues of the protein shown in SEQ ID NO: 24.
  • the "gene encoding tripeptide peptidase refers to a nucleic acid (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the amino acid sequence of tripeptide peptidase, which is deficient in tripeptide peptidase. It is contained in the genomic DNA on the chromosomes of wild-type microorganisms before being fed.
  • SEQ ID NO: 23 shows an example of DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 of tripeptide peptidase derived from Escherichia coli.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 23 does not always exist as it is, the base sequence of SEQ ID NO: 23 is an exon sequence, and one or more intron sequences may intervene in the middle. ..
  • nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23 Nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23;
  • 5F Nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23;
  • a base sequence in which one or more bases are added, deleted, or substituted particularly preferably, the 5'end and the 3'end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23.
  • a total of one or more bases in one or both are substituted, deleted and / or added, preferably a deleted and / or added base sequence), encoding a polypeptide having tripeptipeptidase activity.
  • Base sequence 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identity with respect to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23.
  • a base sequence having a base sequence encoding a polypeptide having tripeptide peptidase activity A partial base sequence encoding the amino acid sequence of a polypeptide having tripeptide peptidase activity in the base sequence of any of (5E) to (5G);
  • 5I In any of the base sequences (5E) to (5H), a base sequence into which a silent mutation (base substitution that does not change the encoding amino acid residue) is introduced;
  • sequence identity in the above (5G) is ⁇ 1.1. As described with respect to (1G) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>. That is, in the above (5G), “sequence identity” means that two base sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of base matching between the two base sequences is the highest. The ratio (%) of the same base to the total number of bases of SEQ ID NO: 23.
  • Glutamic acid-Cysteine ligase EC: 6.3.2.2
  • Glutamic acid-cysteine ligase recognizes L-cysteine as a substrate in the presence of ATP and catalyzes the reaction to produce ⁇ -glutamylcysteine by binding to L-glutamyl acid.
  • the activity is referred to as glutamic acid-cysteine ligase activity. 1U of the activity means an activity of producing 1 ⁇ mol of ⁇ -glutamylcysteine at 30 ° C. for 1 minute, and was measured under the following measurement conditions.
  • Glutamic acid-cysteine ligase is also referred to as “glutamyl cysteine ligase” or “GshA”.
  • GshA glutamate-maleic anhydride
  • the reaction was carried out by adding an enzyme solution to a 50 mM Tris hydrochloride buffer (pH 8.0) containing 10 mM ATP, 15 mM L-glutamic acid, 15 mM L-cysteine, and 10 mM magnesium sulfate and keeping the temperature at 30 ° C., and 6N hydrochloric acid.
  • the reaction is stopped by adding. Quantify ⁇ -glutamylcysteine in the reaction solution using high performance liquid chromatography.
  • the conditions of the above high performance liquid chromatography are as follows. Under these conditions, reduced glutathione (GSH), ⁇ -glutamylcysteine ( ⁇ -GC), bis- ⁇ -glutamylcystine (oxidized ⁇ -GC), and oxidized glutathione (GSSG) are eluted in this order.
  • GSH reduced glutathione
  • ⁇ -GC ⁇ -glutamylcysteine
  • oxidized ⁇ -GC bis- ⁇ -glutamylcystine
  • GSSG oxidized glutathione
  • glutamic acid-cysteine ligase it is preferable to use one having a glutamic acid-cysteine ligase activity (specific activity) of 0.5 U or more, preferably 1 U or more, more preferably 5 U or more, and most preferably 10 U or more per 1 mg of protein.
  • the origin of glutamic acid-cysteine ligase is not particularly limited, and those derived from microorganisms, animals, plants, etc. can be used.
  • Microorganism-derived gamma-glutamyl-cysteine ligase is preferable, and gamma-glutamyl-cysteine ligase derived from enterobacteria such as Escherichia coli, bacteria such as corine-type bacteria, and eukaryotic microorganisms such as yeast is particularly preferable.
  • the gamma-glutamyl-cysteine ligase is not limited to the gamma-glutamyl-cysteine ligase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, but other polypeptides having glutamate-cysteine ligase activity such as its active mutant and other species orthologs can also be used. ..
  • the other polypeptide having a gamma-glutamyl-cysteine ligase activity is preferably 10% or more, preferably 40% or more when the gamma-glutamyl-cysteine ligase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 is used under the above activity measurement conditions. , More preferably 60% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more activity.
  • glutamic acid-cysteine ligase examples include (3-1A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13; (3-1B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted, or substituted (particularly preferably, N of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13). A polypeptide consisting of a total of one or more amino acids substituted, deleted and / or added, preferably deleted and / or added amino acids at one or both of the ends and the C-terminal), glutamate-cysteine.
  • Polypeptide with ligase activity (3-1C) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more of the same sequence with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • Gamma-glutamyl-a polypeptide consisting of an amino acid sequence having sex and having gamma-glutamyl-cysteine ligase activity; or a polypeptide of any one of (3-1D) (3-1A) to (3-1C). It can be a fragment with cysteine ligase activity.
  • the fragment can be a polypeptide having preferably 200 or more amino acids, more preferably 300 or more, more preferably 400 or more, more preferably 450 or more, and more preferably 500 or more. ..
  • polypeptides may be chemically modified as appropriate.
  • plality means, for example, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3 pieces. To say. Conservative amino acid substitution is desirable for amino acid substitution. “Conservative amino acid substitution” is described in ⁇ 1.1. As explained with respect to (1B) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>.
  • sequence identity in (3-1C) above is ⁇ 1.1. As described with respect to (1C) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>. That is, in the above (3-1C), "sequence identity" means when two amino acid sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of amino acid matching between the two amino acids is the highest. Refers to the ratio (%) of the same amino acid residues to the total number of amino acid residues of the protein shown in SEQ ID NO: 13.
  • the "gene encoding gamma-glutamyl-cysteine ligase (EC: 6.3.2.2) refers to a nucleic acid (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the amino acid sequence of gamma-glutamyl-cysteine ligase.
  • SEQ ID NO: 12 shows an example of DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 of gamma-glutamyl-cysteine ligase derived from Escherichia coli.
  • the base sequence of the nucleic acid encoding the amino acid sequence of gamma-glutamyl-cysteine ligase may be codon-optimized for the host.
  • 'A polypeptide having a total of one or more bases substituted, deleted and / or added, preferably a deleted and / or added base sequence at one or both ends) and having glutamate-cysteine ligase activity.
  • Nucleotide sequence having sex and encoding a polypeptide having gamma-glutamyl-cysteine ligase activity (-3-1H) A partial base sequence encoding the amino acid sequence of a polypeptide having gamma-glutamyl-cysteine ligase activity in any of the base sequences (3-1E) to (3-1G); (3-1I) In any of the base sequences (3-1E) to (3-1H), a base sequence into which a silent mutation (base substitution that does not change the encoding amino acid residue) is introduced; (3-1J) A base sequence encoding the amino acid sequence of any of the polypeptides (3-1A) to (3-1D); or Examples thereof include a base sequence in which any of (3-1K), (3-1E) to (3-1J) is used as an exon sequence, and one or more intron sequences are interposed in the base sequence.
  • sequence identity in (3-1G) above is ⁇ 1.1. As described with respect to (1G) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>. That is, in the above (3-1G), "sequence identity" means when two base sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of base matching between the two bases is the highest. Refers to the ratio (%) of the same base to the total number of bases of SEQ ID NO: 12.
  • Glutathione Synthetic Enzyme EC: 6.3.2.3
  • Glutathione synthase is an enzyme that catalyzes the reaction that produces GSH by recognizing ⁇ -glutamylcysteine as a substrate in the presence of ATP and binding it to glycine. As long as it has activity, its origin, structure, etc. are not particularly limited. In the present specification, the activity is referred to as glutathione synthase activity. 1U of the activity means an activity of producing 1 ⁇ mol of glutathione in 1 minute at 30 ° C., and is measured under the following measurement conditions.
  • Glutathione synthase is also called “GshB”.
  • GshB glutathione synthase
  • the reaction was carried out by adding an enzyme solution to a 50 mM Tris hydrochloride buffer (pH 8.0) containing 10 mM ATP, 15 mM ⁇ -glutamylcysteine, 15 mM glycine, and 10 mM magnesium sulfate and keeping the temperature at 30 ° C., and 6N hydrochloric acid was added.
  • the reaction is stopped by adding. Glutathione in the reaction solution is quantified using high performance liquid chromatography.
  • glutathione synthase it is preferable to use one having a glutathione synthase activity (specific activity) of 0.5 U or more, preferably 1 U or more, more preferably 5 U or more, and most preferably 10 U or more per 1 mg of protein.
  • the glutathione synthase is not particularly limited, and those derived from microorganisms, animals, plants, etc. can be used. Glutathione synthetase derived from microorganisms is preferable, especially for intestinal bacteria such as Escherichia coli, bacteria such as coryneform bacteria, eukaryotic microorganisms such as yeast, and microorganisms belonging to the family Hydrogenophilaceae. The derived glutathione synthase is preferred.
  • the glutathione synthase derived from a microorganism belonging to the family Hydrogenophilales is preferably a glutathione synthase derived from a microorganism belonging to the genus Thiobacillus, more preferably Thiobacillus. It is a glutathione synthase derived from a microorganism belonging to denitrificans). In particular, glutathione synthase derived from the thiobacillus denitrificans ATCC25259 strain is preferred.
  • glutathione synthase derived from Escherichia coli or a mutant thereof Specific examples of the base sequence of glutathione synthetase derived from Escherichia coli and the amino acid sequence encoded by the base sequence are shown in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, respectively.
  • the glutathione synthase is not limited to the glutathione synthase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, but other polypeptides having glutathione synthase activity such as its active variant and other species orthologs can also be used.
  • the other polypeptide having glutathione synthase activity is preferably 10% or more, preferably 40% or more, more than the case where the glutathione synthase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 is used under the above activity measurement conditions. It is preferably a polypeptide having an activity of 60% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more.
  • glutathione synthase derived from Escherichia coli or a mutant thereof include (3-2A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15; (3-2B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted, or substituted (particularly preferably, N of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15). A polypeptide consisting of a total of one or more amino acids substituted, deleted and / or added, preferably deleted and / or added amino acids at one or both of the ends and the C-terminal), which is a glutathione synthase.
  • Active polypeptide (3-2C) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15.
  • the fragment can be a polypeptide having preferably 200 or more amino acids, more preferably 250 or more, and more preferably 300 or more.
  • polypeptides may be chemically modified as appropriate.
  • plural means, for example, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3.
  • Conservative amino acid substitution is desirable for amino acid substitution. “Conservative amino acid substitution” is described in ⁇ 1.1. As explained with respect to (1B) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>.
  • sequence identity in (3-2C) above is ⁇ 1.1. As described with respect to (1C) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>. That is, in the above (3-2C), “sequence identity” means when two amino acid sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of amino acid matching between the two amino acids is the highest. Refers to the ratio (%) of the same amino acid residues to the total number of amino acid residues of the protein shown in SEQ ID NO: 15.
  • the "gene encoding glutathione synthase (EC: 6.3.2.3) refers to a nucleic acid (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the amino acid sequence of glutathione synthase.
  • SEQ ID NO: 14 shows an example of DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 of glutathione synthetase derived from Escherichia coli.
  • the base sequence of the nucleic acid encoding the amino acid sequence of glutathione synthase may be codon-optimized according to the host.
  • Encoding base sequence (3-2G) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identical to the base sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • a base sequence having sex and encoding a polypeptide having glutathione synthase activity (3-2H) A partial base sequence encoding the amino acid sequence of a polypeptide having glutathione synthetase activity in any of the base sequences (3-2E) to (3-2G); (3-2I) In any of the base sequences (3-2E) to (3-2H), a base sequence into which a silent mutation (base substitution that does not change the encoding amino acid residue) is introduced; (3-2J) A base sequence encoding the amino acid sequence of any of the polypeptides (3-2A) to (3-2D); or The base sequence of any one of (3-2K), (3-2E) to (3-2J) is used as an exon sequence, and a base sequence in which one
  • sequence identity in (3-2G) above is ⁇ 1.1. As described with respect to (1G) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>. That is, in the above (3-2G), “sequence identity” means when two base sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of base matching between the two bases is the highest. Refers to the ratio (%) of the same base to the total number of bases of SEQ ID NO: 14.
  • glutathione synthase derived from thiobacillus denitrificans or a mutant thereof
  • glutathione synthase is the wild-type glutathione synthase or an active variant thereof derived from the Thiobacillus denitrificans ATCC25259 strain.
  • the nucleotide sequence of the wild-type glutathione synthetase of the thiobacillus denitrificans ATCC25259 strain and specific examples of the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence are shown in SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, respectively.
  • the active variant of the wild-type glutathione synthase is preferably 10% or more, preferably 40% or more, when the wild-type glutathione synthase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 is used under the above activity measurement conditions. , More preferably 60% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more activity.
  • glutathione synthase of the thiobacillus denitrificans ATCC25259 strain or a mutant thereof include (3-3A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17; (3-3B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted, or substituted (particularly preferably, N of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17). A polypeptide consisting of a total of one or more amino acids substituted, deleted and / or added, preferably deleted and / or added amino acids at one or both of the ends and the C-terminal), which is a glutathione synthase.
  • Active polypeptide; (3-3C) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  • the fragment can be a polypeptide having preferably 200 or more amino acids, more preferably 250 or more, and more preferably 300 or more.
  • polypeptides may be chemically modified as appropriate.
  • plality means, for example, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3. To say. Conservative amino acid substitution is desirable for amino acid substitution. “Conservative amino acid substitution” is described in ⁇ 1.1. As explained with respect to (1B) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>.
  • sequence identity in (3-3C) above is ⁇ 1.1. As described with respect to (1C) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>. That is, in the above (3-3C), "sequence identity" means when two amino acid sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of amino acid matching between the two amino acids is the highest. Refers to the ratio (%) of the same amino acid residues to the total number of amino acid residues of the protein shown in SEQ ID NO: 17.
  • SEQ ID NO: 16 shows an example of DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 of the glutathione synthetase of the thiobacillus denitrificans ATCC25259 strain.
  • the base sequence of the nucleic acid encoding the amino acid sequence of glutathione synthase may be codon-optimized according to the host.
  • Encoding base sequence (-3-3G) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more or 99% or more sequence identical to the base sequence shown in SEQ ID NO: 16.
  • a base sequence having sex and encoding a polypeptide having glutathione synthase activity (3-3H) A partial base sequence encoding the amino acid sequence of a polypeptide having glutathione synthetase activity in any of the base sequences (3-3E) to (3-3G); (3-3I) In any of the base sequences (3-3E) to (3-3H), a base sequence into which a silent mutation (base substitution that does not change the encoding amino acid residue) is introduced; (3-3J) A base sequence encoding the amino acid sequence of any of the polypeptides (3-3A) to (3-3D); or An exon sequence is used as any of the base sequences of (3-3K), (3-3E) to (3-3J), and a base sequence in which one or
  • sequence identity in (3-3G) above is ⁇ 1.1. As described with respect to (1G) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>. That is, in the above (3-3G), "sequence identity" means when two base sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of base matching between the two bases is the highest. Refers to the ratio (%) of the same base to the total number of bases of SEQ ID NO: 16.
  • glutathione synthase is an active variant of the wild glutathione synthase of the thiobacillus denitrificans ATCC25259 strain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17, which is described in WO2018 / 084165. Polypeptides are particularly preferred.
  • the active mutant is (3-4A) Among the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 17, the following group: 13, 17, 20, 23, 39, 70, 78, 101, 113, 125, 126, 136, 138, 149, 152, 154, 155, 197, 200, 215, 226, 227, 230, 239, 241, A polypeptide consisting of amino acid sequence 3-4A in which one or more amino acids selected from positions 246, 249, 254, 260, 262, 263, 270, 278, 299, 305, 307 and 310 are substituted; (3-4B) In the amino acid sequence 3-4A, a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids among amino acids other than the amino acid site are added, deleted, or substituted (particularly preferably, the amino acid).
  • the amino acid moiety coincides with the amino acid sequence 3-4A, and 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, in the portion other than the amino acid moiety.
  • a polypeptide having preferably 150 or more amino acids, more preferably 200 or more, and more preferably 300 or more can be used.
  • polypeptides may be chemically modified as appropriate.
  • plality means, for example, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4 or 2 to 3. To say. Conservative amino acid substitution is desirable for amino acid substitution. “Conservative amino acid substitution” is described in ⁇ 1.1. As explained with respect to (1B) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>.
  • sequence identity in (3-4C) above is ⁇ 1.1. As described with respect to (1C) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>. That is, in the above (3-4C), "sequence identity" means when two amino acid sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of amino acid matching between the two amino acids is the highest. Refers to the ratio (%) of the same amino acid residue to the total number of amino acid residues other than the amino acid site of the amino acid sequence 3-4A.
  • the amino acid sequence 3-4A is more preferably in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, in the following group: 13th is serine, 17th is glutamic acid, 20th is threonine, 23rd is threonine, 39th is threonine, 70th is serine, 78th is leucine, 101st is aspartic acid, glutamine, serine, threonine, 113th is histidine , 125th valine, 126th aspartic acid, 136th threonine, 138th alanine, 149th glutamic acid, 152nd aspartic acid, 154th aspartic acid, 155th leucine, 197th glutamic acid, 200th serine , 215th aspartic acid, 226th arginine, 227th serine, 230th proline, 239th serine, 241st histidine, 246th arginine, 249th glutamic acid, 254th aspart
  • the amino acid sequence 3-4A is particularly preferably the following (1) to (35): among the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 17.
  • the 13th is Serin, (2) The 17th is glutamic acid, the 113th is histidine, the 230th is proline, (3) The 20th is threonine, the 215th is aspartic acid, (4) The 20th is threonine, the 241st is histidine, (5) The 23rd is leucine, the 126th is asparagine, (6) The 39th is threonine, the 260th is alanine, (7) The 70th is serine, the 260th is alanine, (8) The 78th is leucine, the 278th is alanine, (9) The 101st is asparagine, (10) The 101st is glutamine, (11) The 101st is Serin, (12) The 101st is serine, the 260th is alanine, (13) The 101st is
  • the base sequence encoding the amino acid sequence of any of the polypeptides (3-4A) to (3-4D) is used as a "gene encoding glutathione synthetase (EC: 6.3.2.3)". can do.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 of the glutathione synthetase of the thiobacillus denitrificans ATCC25259 strain an example of the base sequence encoding the amino acid sequence of the active mutant in which valine at position 260 is replaced with alanine is the sequence number. 18 is shown.
  • the base sequence of the nucleic acid encoding the amino acid sequence of the active mutant of the glutathione synthetase of the thiobacillus denitrificans ATCC25259 strain may be codon-optimized for the host.
  • Bifunctional glutathione synthase recognizes L-cysteine as a substrate in the presence of ATP and catalyzes the reaction of producing ⁇ -glutamylcysteine by binding to L-glutamic acid, and ⁇ -glutamylcysteine in the presence of ATP.
  • an enzyme that also has an activity of catalyzing a reaction for producing GSH by recognizing as a substrate and binding to glycine, and its origin, structure, etc. are not particularly limited as long as it has the activity.
  • the activity is referred to as bifunctional glutathione synthase activity.
  • 1U of the activity means an activity of producing 1 ⁇ mol of GSH in 1 minute at 30 ° C., and is measured under the following measurement conditions.
  • Difunctional glutathione synthase is also called “GshF”.
  • bifunctional glutathione synthase and “GshF” are interchangeable.
  • the reaction was carried out by adding an enzyme solution to a 50 mM Tris hydrochloride buffer (pH 8.0) containing 10 mM ATP, 15 mM L-glutamic acid, 15 mM L-cysteine, 15 mM glycine, and 10 mM magnesium sulfate and keeping the temperature at 30 ° C. , 6N Hydrochloric acid is added to stop the reaction. Glutathione in the reaction solution is quantified using high performance liquid chromatography.
  • bifunctional glutathione synthase one having a bifunctional glutathione synthase activity (specific activity) of 0.5 U or more, preferably 1 U or more, more preferably 5 U or more, and most preferably 10 U or more per 1 mg of protein is used. Is preferable.
  • the origin of the bifunctional glutathione synthase is not particularly limited, and those derived from microorganisms, animals, plants, etc. can be used. Microbial-derived bifunctional glutathione synthase is preferred. Bacterial bifunctional glutathione synthases are particularly preferred, and more specifically, Streptococcus agaractiae, Streptococcus mutans, Streptococcus sarcostococcus Bacteria of the genus Streptococcus; Bacteria of the genus Lactobacillus such as Lactobacillus plantarum; Bacteria of the genus Desulfotarea cyclophila (Desulfotalea cyclophila) Bacteria belonging to the genus Clostridium; Bacteria belonging to the genus Listeria such as Listeria innocua and Listeria monocytogenes; Bacteria belonging to the genus Listeria; ) Etc.
  • Bacteria belonging to the genus Enterococcus Bacteria belonging to the genus Pasteurella such as Pasteurella multicida; Bacteria belonging to the genus Mannheimia succinici
  • a bifunctional glutathione synthase derived from at least one selected from the group consisting of bacteria of the genus Haemofilus such as Somnus (Haemofilus somnus) is preferable.
  • the base sequence of the bifunctional glutathione synthase derived from Streptococcus agaractier and the amino acid sequence encoded by the base sequence are shown in SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20, respectively.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19 is a nucleotide sequence encoding a bifunctional glutathione synthase derived from Streptococcus agaractier, which consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, and is a nucleotide sequence adapted to the frequency of codon use in Escherichia coli. Is.
  • the bifunctional glutathione synthase is not limited to the bifunctional glutathione synthase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, and has bifunctional glutathione synthase activity such as its active variant and other species orthologs. Polypeptides can also be used.
  • the other polypeptide having bifunctional glutathione synthase activity is preferably 10% or more, preferably 10% or more of the case where the bifunctional glutathione synthase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 is used under the above activity measurement conditions. Is a polypeptide showing an activity of 40% or more, more preferably 60% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more.
  • (4A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20; (4B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are added, deleted, or substituted (particularly preferably, the N-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 and the N-terminal and A polypeptide consisting of a total of one or more amino acids substituted, deleted and / or added, preferably deleted and / or added amino acids at one or both of the C-terminals), and bifunctional glutathione synthesis.
  • Polypeptide with enzymatic activity (4C) Sequence identity of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20.
  • a polypeptide having preferably 400 or more amino acids more preferably 500 or more, more preferably 600 or more, more preferably 700 or more, and more preferably 730 or more can be used.
  • polypeptides may be chemically modified as appropriate.
  • the term "plurality” means, for example, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3. .. Conservative amino acid substitution is desirable for amino acid substitution. “Conservative amino acid substitution” is described in ⁇ 1.1. As explained with respect to (1B) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>.
  • sequence identity in (4C) above is ⁇ 1.1. As described with respect to (1C) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>. That is, in the above (4C), “sequence identity” means that two amino acid sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of amino acid matching between the two amino acids is the highest. The ratio (%) of the same amino acid residue to the total number of amino acid residues of the protein shown in SEQ ID NO: 20.
  • the "gene encoding the bifunctional glutathione synthase” refers to a nucleic acid (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the amino acid sequence of the bifunctional glutathione synthase.
  • sequence identity in the above (4G) is ⁇ 1.1. As described with respect to (1G) in the column of ⁇ -glutamyl transferase>. That is, in the above (4G), “sequence identity” means that two base sequences are aligned and a gap is introduced as necessary so that the degree of base matching between the two base sequences is the highest. The ratio (%) of the same base to the total number of bases of SEQ ID NO: 19.
  • the prokaryotic microbial strain according to one or more embodiments of the first disclosure can be cultured in a medium to ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione and / or oxidized form. Since glutathione can be overproduced and accumulated in the medium, it can be used for the purpose of efficiently producing the peptide.
  • the prokaryotic microorganism according to one or more embodiments of the first disclosure is cultured in a medium having a total concentration of cysteine and cystine of 0.5 g / L or less, or in a medium prepared without adding cysteine or cystine. Even in this case, the peptide can be produced, so that the production cost of the peptide can be reduced.
  • the prokaryotic microbial strain according to one or more embodiments of the first disclosure is preferably ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione by induced expression of the one or more genes. And / or a prokaryotic strain capable of overproducing oxidized glutathione.
  • the prokaryotic microbial strain according to one or more embodiments of the first disclosure is cultured in a medium and induced and expressed by one or more of the above-mentioned genes to induce ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamyl. Since cystine, reduced glutathione and / or oxidized glutathione can be overproduced and accumulated in the medium, it can be used for the purpose of efficiently producing the peptide.
  • the enzyme whose gene expression level is increased in the prokaryotic microbial strain is selected from one or more selected from gamma-glutamyl-cysteine ligase, glutathione synthase, and bifunctional glutathione synthase. Any enzyme can be used. Specific examples of each enzyme are as described above.
  • the prokaryotic microbial strain is used for the purpose of producing ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine and / or ⁇ -glutamylcystine, glutamate-cysteine ligase and / or a bifunctional glutathione synthase.
  • the gene expression level is increased as compared with the wild-type strain.
  • the prokaryotic microbial strain is used for the purpose of producing reduced glutathione and / or oxidized glutathione
  • the gene expression levels of glutamate-cysteine ligase and glutathione synthase are increased as compared with the parent strain, or It is preferable that the gene expression level of the bifunctional glutathione synthase is increased as compared with the wild strain.
  • the host prokaryotic strain may be a bacterium, particularly Escherichia, Bacillus, Brevibacterium, or Corynebacterium (. Examples include cells of microorganisms belonging to the genus Corynebacterium, particularly preferably cells of microorganisms belonging to the genus Escherichia, and most preferably cells of Escherichia coli.
  • the host prokaryotic strain may also be an enterobacteria.
  • the prokaryotic microbial strain according to one or more embodiments of the first disclosure can be a transformant in which a prokaryotic microorganism carries a predetermined gene.
  • wild strain refers to a host strain before introduction of one or more genes selected from a gamma-glutamyl-cysteine ligase gene, a glutathione synthase gene, and a bifunctional glutathione synthase gene, and is referred to as a "parent strain”. You can also do it.
  • the expression level of one or more genes selected from the glutamic acid-cysteine ligase gene, the glutathion synthase gene, and the bifunctional glutathion synthase gene is increased as compared with the wild strain" in the wild.
  • the expression level of the one or more genes is increased as compared with the wild strain, and the wild strain originally does not express the one or more genes. In some cases, it includes both that the wild strain is endowed with the ability to express one or more of the genes.
  • An increase in the expression level of the one or more genes increases the number of copies of the one or more genes in the cells of the prokaryotic microbial strain, or increases the number of copies of the one or more genes on the genomic DNA of the cells of the prokaryotic microbial strain. It can be achieved by substituting a stronger expression promoter for the promoter that controls the expression of.
  • the increase in the copy number of one or more genes in the cell of a prokaryotic microorganism is (1) Achieving by introducing an expression vector containing the above 1 or more genes into the cells of a prokaryotic microorganism, or (2) introducing the above 1 or more genes into the genomic DNA of a cell of a prokaryotic microorganism. Can be done.
  • a plasmid vector containing one or more genes can be used.
  • the expression vector is preferably capable of autonomous replication in prokaryotic microbial cells.
  • the expression vector consists of a DNA encoding one or more enzymes selected from gamma-glutamyl-cysteine ligase, glutathione synthase, and bifunctional glutathione synthase, and a promoter functionally linked at a position where the DNA can be transcribed. Is preferably contained.
  • the expression vector is preferably a base sequence capable of autonomous replication in prokaryotic microbial cells and composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a base sequence encoding the amino acid sequence of one or more of the above enzymes, and a transcription termination sequence. It is a recombinant DNA containing.
  • Suitable plasmid vectors are available from pQEK1, pCA24N (DNA RESEARCH, 12, 191-299 (2005)), pACYC177, pACYC184 (available from Nippon Gene Co., Ltd.), pQE30, pQE60, pQE70, pQE80 and pQE9 (Qiagen).
  • pTipQC1 available from Qiagen or Hokkaido System Science
  • pTipRT2 available from Hokkaido System Science
  • pBS vector Phagescript vector, Bluescript vector, pNH8A, pNH16A, pNH18A and pNH46A (available from Stratage); p -3, pKK233-3, pDR540 and pRIT5 (available from Addgene); pRSF (available from MERCK); and pAC (available from Nippon Gene Co., Ltd.), pUCN18 (available from pUC18 (Takara Bio Inc.) ), PSTV28 (available from Takara Bio Inc.), pUCNT (International Publication No. 94/03613) and the like can be exemplified.
  • the expression vector preferably contains a promoter that controls transcription of the one or more genes.
  • the promoter is preferably an inducible promoter.
  • the inducible promoter examples include an isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) -inducible promoter, a photo-inducible promoter that induces gene expression under light irradiation, an araBAD promoter (arabinose-inducible), and a rhaBAD promoter (ramnorth-inducible). Sex), tet promoter (drug-inducible), penP promoter (drug-inducible), cspA promoter (temperature-inducible promoter that responds to low temperature), promoters including tetO or lacO operator as operator sequences, etc. can be exemplified and IPTG-inducible.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • a promoter, araBAD promoter, rhaBAD promoter, tet promoter, penP promoter, cspA promoter, or a promoter containing a tetO or lacO operator as an operator sequence is preferable.
  • IPTG-inducible promoter examples include T5 promoter, lacUV5 promoter, lac promoter, T7 promoter, lacT5 promoter, lacT7 promoter, tac promoter and the like.
  • an IPTG-inducible promoter is particularly preferable, and among the IPTG-inducible promoters, a T5 promoter, a T7 promoter, a lacT5 promoter, a lacT7 promoter or a tac promoter is particularly preferable.
  • the promoter it is also possible to use a promoter obtained by modifying a conventional promoter into a highly active form by using various reporter genes.
  • the activity of the promoter can be enhanced by bringing the -35 and -10 regions within the promoter region closer to the consensus sequence (International Publication WO00 / 18935).
  • highly active promoters include various tac-like promoters (Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574). Evaluation methods of promoter strength and examples of strong promoters are described in the paper by Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)).
  • the number of copies of the expression vector in the cells is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, more preferably 5 or more, and more preferably. Is preferably 10 or more, more preferably 15 or more, and more preferably 20 or more.
  • the two or more genes When increasing the expression level of two or more of the genes in the cells of a prokaryotic microorganism, the two or more genes may be contained in one expression vector, in which case, under the control of one expression promoter.
  • the two or more genes may be arranged therein.
  • two or more genes may be contained in different expression vectors.
  • homologous recombination when the one or more genes are introduced into the genomic DNA of a cell of a prokaryotic microorganism, homologous recombination can be used.
  • a promoter similar to the expression vector more preferably an inducible promoter can be used as the expression promoter.
  • preferred promoters are as described above.
  • the degree of increase in the expression level of the one or more genes is not particularly limited.
  • the expression level of the one or more genes is one or more selected from the mRNAs corresponding to the one or more genes extracted from the cells (that is, gamma-glutamyl-cysteine ligase, glutathione synthase, and bifunctional glutathione synthase). It can be expressed as the amount of mRNA) that encodes the amino acid sequence of the enzyme.
  • the expression level based on this mRNA is preferably expressed as a relative value to the amount of mRNA encoding an appropriate internal standard protein.
  • the expression level of the gamma-glutamyl-cysteine ligase gene is increased, the expression level of gamma-glutamyl-cysteine ligase in the prokaryotic microbial strain (preferably, the mRNA level of gamma-glutamyl-cysteine ligase in the prokaryotic microbial strain is set in the same strain.
  • the relative value obtained by dividing the amount of gamma-glutamyl-cysteine ligase in the wild strain is the amount of gamma-glutamyl-cysteine ligase in the wild strain.
  • Relative value divided by the amount of mRNA encoding the standard protein is preferably 5 times or more, more preferably 10 times or more, and more preferably 20 times or more.
  • the expression level of glutathione synthase in the prokaryotic microbial strain (preferably, the mRNA amount of glutathione synthase in the prokaryotic microbial strain is set as an internal standard in the same strain.
  • the relative value divided by the amount of mRNA encoding the protein is the expression level of glutathione synthetase in the wild strain (preferably the amount of glutathione synthetase mRNA in the wild strain, which encodes the internal standard protein in the same strain).
  • the relative value divided by the amount of mRNA is preferably 5 times or more, more preferably 10 times or more, and more preferably 20 times or more.
  • Examples of the internal standard protein include a protein encoded by hcaT (SEQ ID NO: 27) known as a housekeeping gene.
  • the prokaryotic microbial strain according to one or more embodiments of the first disclosure more preferably degrades cysteine, ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione or oxidized glutathione.
  • the expression level of the gene of the active enzyme or the glutathione uptake transporter gene is lower than that of the wild strain, or the expression of the gene is lost. When culturing such a prokaryotic microbial strain, the peptide tends to accumulate in the medium.
  • Examples of enzymes having an activity of degrading ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione or oxidized glutathione include ⁇ -glutamyltransferase and tripeptide peptidase.
  • the tryptophanase gene tnaA can be exemplified as a gene of an enzyme having an activity of degrading cysteine.
  • YliABCD can be exemplified as a glutathione uptake transporter gene.
  • ⁇ -glutamyl transferase is as described above.
  • tripeptide peptidase are as described above.
  • the expression level of the gene of the enzyme having the activity of degrading cysteine, ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione or oxidized glutathione, or the glutathione uptake transporter gene is higher than that of the wild strain.
  • a prokaryotic microbial strain in which the expression of the gene is also reduced or the expression of the gene is lost is produced by a method of introducing a deletion, substitution or addition of a base into the base sequence encoding the enzyme on the genomic DNA of the protozoal microbial strain. Can be done. Examples of such a method include a method using homologous recombination, and specifically, the method described in JP-A-2004-344029 can be used.
  • a more preferred embodiment of the prokaryotic microbial strain according to one or more embodiments of the first disclosure described above is: A protozoan microbial strain carrying one or more genes selected from the glutamate-cysteine ligase gene, glutathione synthetase gene, and bifunctional glutathione synthetase gene expressively linked to an inducible promoter.
  • the inducible promoter is an inducible promoter in which the transcription amount of the gamma-glutamyl-cysteine ligase gene by the prokaryotic microbial strain when the one or more genes are the gamma-glutamyl-cysteine ligase gene is 20 times or more that of the wild-type strain.
  • the one or more genes expressively linked to the inducible promoter may be retained in a state of being contained in a part of the genomic DNA of the prokaryotic microbial strain. However, it may be retained in a state of being contained in an expression vector present in a prokaryotic microbial strain. Specific examples of the expression vector are as described above.
  • the inducible promoter is not particularly limited as long as the transcription amount of the gamma-glutamyl-cysteine ligase gene by the prokaryotic microbial strain is 20 times or more that of the wild-type strain when the one or more genes are the gamma-glutamyl-cysteine ligase gene. ..
  • the transcription amount can be evaluated based on the mRNA amount.
  • the gamma-glutamyl-cysteine ligase gene for confirming that the inducible promoter has a predetermined expression ability is preferably the same species as the gamma-glutamyl-cysteine ligase gene possessed by the wild strain.
  • Such a highly expression-inducible promoter can be selected from the above examples of inducible promoters, but preferably IPTG-inducible promoter, photo-inducible promoter, araBAD promoter, rhaBAD promoter, tet promoter, penP.
  • An example is a promoter, a cspA promoter, or a promoter containing a tetO or lacO operator as an operator sequence.
  • an IPTG-inducible promoter is particularly preferable, and among the IPTG-inducible promoters, a T5 promoter, a T7 promoter, a lacT5 promoter, a lacT7 promoter or a tac promoter is particularly preferable.
  • an inducible promoter modified to a highly active form by using various reporter genes can also be used.
  • One or more further embodiments of the first disclosure A method for producing ⁇ -glutamylcysteine, bis- ⁇ -glutamylcystine, ⁇ -glutamylcystine, reduced glutathione and / or oxidized glutathione (hereinafter referred to as “target peptide”).
  • Cysteine and cystine are the prokaryotic microbial strains in which the expression levels of one or more genes selected from the glutamate-cysteine ligase gene, the glutathione synthase gene, and the bifunctional glutathione synthase gene are increased as compared with the wild strain.
  • the present invention relates to a method comprising culturing in a medium having a total concentration of 0.5 g / L or less.
  • the prokaryotic microbial strain used in this method is preferably a prokaryotic microbial strain capable of overproducing the target peptide by induced expression of the one or more genes.
  • a method for producing the target peptide is: A method for producing the target peptide.
  • a prokaryotic microbial strain in which the expression level of one or more genes selected from the glutamate-cysteine ligase gene, the glutathione synthase gene, and the bifunctional glutathione synthase gene is increased as compared with the wild strain is cultured in a medium.
  • the present invention relates to a method that does not include the addition of cysteine or cystine in the medium.
  • the prokaryotic microbial strain used in this method is preferably a prokaryotic microbial strain capable of overproducing the target peptide by induced expression of the one or more genes.
  • the nuclear microbial strain according to one or more embodiments of the first disclosure described above is added with a medium having a total concentration of cysteine and cystine of 0.5 g / L or less, or cysteine or cystine. It is based on the unexpected finding that the target peptide containing cysteine or cystine as a constituent amino acid can be accumulated in the medium even when cultured in the prepared medium without performing the step. According to this method, the target peptide can be produced at low cost.
  • the medium used in the above method is a synthetic medium or a natural medium as long as it contains nutrients necessary for the growth of microorganisms used in the first disclosure such as carbon source, nitrogen source, inorganic salt and vitamin, and the biosynthesis of the target peptide. It may be any of.
  • the carbon source may be any carbon source that can be assimilated by the microorganism to be used, and examples thereof include glucose, sugars such as fructose, alcohols such as ethanol and glycerol, and organic acids such as acetic acid. it can.
  • nitrogen source examples include ammonia, ammonium salts such as ammonium sulfate, nitrogen compounds such as amines, peptone, and natural nitrogen sources such as soybean hydrolyzate.
  • Examples of the inorganic salt include potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, potassium carbonate and the like.
  • vitamins examples include biotin and thiamine.
  • a substance required for growth by the microorganism of the first disclosure for example, a required amino acid in the case of an amino acid-requiring microorganism
  • a required amino acid in the case of an amino acid-requiring microorganism
  • the concentration of glycine added to the medium include 100 mM to 2000 mM, preferably 400 mM to 1200 mM.
  • concentration of the sulfur source added to the medium include 100 mM to 2000 mM, preferably 400 mM to 1200 mM.
  • sulfur source one or more kinds of inorganic sulfur compounds such as sulfuric acid, thiosulfuric acid, sulfurous acid, hyposulfurous acid or sulfide or salts thereof can be added.
  • Sulfuric acid, thiosulfuric acid, sulfurous acid, hyposulfurous acid or sulfide may be a free form, a salt, or any mixture thereof.
  • the salt is not particularly limited, and examples thereof include sodium salt, calcium salt, ammonium salt, potassium salt and the like.
  • Glycine may be free, salt, or any mixture thereof.
  • the salt is not particularly limited, and examples thereof include sulfates and hydrochlorides.
  • Sulfur source and / or glycine can be added to the medium at the start of or during the culture.
  • the sulfur source and / or glycine may be added to the medium all at once, or may be added to the medium continuously or intermittently.
  • the sulfur source and / or glycine may be contained in the medium for the entire period of the culture, or may be contained in the medium only for a part of the period of the culture.
  • the amount of sulfur source and glycine added need not be in the above range during the entire period of the stage of producing and accumulating the target peptide, and the amount of sulfur source and / or glycine is within the above range during culturing. May be contained in the medium, and the sulfur source and / or the glycine content may decrease with the lapse of the culture time.
  • a sulfur source and / or glycine may be additionally added continuously or intermittently. The concentration of the medium components other than the sulfur source and / or glycine may fluctuate during the culture period, or may be additionally added.
  • Culturing is preferably carried out under aerobic conditions such as shaking culture and aeration stirring culture.
  • the culture temperature is 20 to 50 ° C., preferably 20 to 42 ° C., more preferably 28 to 38 ° C.
  • the pH at the time of culturing is 5 to 9, preferably 6 to 7.5.
  • the culturing time is 3 hours to 5 days, preferably 5 hours to 3 days.
  • the target peptide accumulated in the culture can be collected by a usual purification method. For example, after the culture is completed, the cells and solids in the culture can be removed by centrifugation or the like, and then the cells can be collected by ion exchange, concentration, or crystal separation.
  • glutathione may be reduced glutathione, oxidized glutathione, or a mixture of reduced glutathione and oxidized glutathione.
  • glutathione and / or oxidized glutathione are interchangeable.
  • the host (parent strain) microorganism is preferably a bacterium.
  • the bacterium may be an intestinal bacterium.
  • the bacterium may be a gram-negative bacterium such as a bacterium belonging to the genus Escherichia or a bacterium belonging to the genus Pantoea, a bacterium belonging to the genus Bacillus, a bacterium belonging to the genus Brevibacterium, or a bacterium belonging to the genus Corynebacterium.
  • It may be a gram-positive bacterium such as a genus bacterium, but it is preferably a gram-negative bacterium, and particularly preferably Escherichia coli.
  • the microorganism according to one or more embodiments of the second disclosure can be a transformant in which a predetermined gene is deleted in the microorganism and the predetermined gene is retained in an expressible manner.
  • ⁇ 3.2. Microorganisms according to the second disclosure of the present specification> One or more embodiments of the second disclosure are microorganisms lacking the following genes [1] and [2] and having enhanced expression of the genes [3] or [4]: [1] A gene encoding ⁇ -glutamyl transferase (EC: 2.3.2.2); [2] Gene encoding glutathione reductase (EC: 1.8.1.7); [3] A gene encoding glutamic acid-cysteine ligase (EC: 6.3.2.2) and a gene encoding glutathione synthetase (EC: 6.3.3.2); [4] A gene encoding a bifunctional glutathione synthase, Regarding.
  • the microorganism has a high ability to produce glutathione by fermentation, and is therefore suitable for producing glutathione.
  • the microorganism can produce glutathione by culturing in a medium.
  • the microorganism is more preferably a microorganism lacking the following gene [5].
  • [5] A gene encoding a tripeptide peptidase (EC: 3.4.11.4).
  • microorganism lacking the tripeptide peptidase gene is preferable because it has a particularly high glutathione-producing ability.
  • microorganisms that are the hosts of the microorganisms according to one or more embodiments of the second disclosure are as described above.
  • a gene encoding ⁇ -glutamyltransferase and a gene encoding glutathione reductase, or a gene encoding a tripeptide peptidase (hereinafter referred to as a “defective gene”) in the microorganism according to one or more embodiments of the second disclosure.
  • the term "deficiency” (which may be the case) means that the activity of the enzyme encoded by the deletion target gene is reduced as compared with the parent strain, and includes the case where the activity is completely eliminated.
  • the microorganism according to one or more embodiments of the second disclosure is a microorganism in which the function of the deletion target gene is lost or the function is reduced, and specifically, the above-mentioned
  • the expression level of mRNA, which is a transcript of the gene to be deleted, or protein, which is a translation product, is low, or mRNA, which is a transcript of the gene to be deleted, or protein, which is a translation product, is normally expressed as mRNA or protein.
  • Examples include microorganisms that are in a non-functional state.
  • the deletion of the gene to be deleted can be achieved by, for example, artificially modifying the gene of the microbial parent strain. Such modification can be achieved by, for example, mutation treatment, gene recombination technology, gene expression suppression treatment using RNAi, gene editing, and the like.
  • mutation treatment irradiation with ultraviolet rays or normal mutation treatment such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethylmethane sulfonate (EMS), methylmethane sulfonate (MMS), etc. Treatment with the mutant agent used in the above can be mentioned.
  • MNNG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • EMS ethylmethane sulfonate
  • MMS methylmethane sulfonate
  • Examples of gene recombination technology include known technologies (FEMS Microbiology Letters 165 (1998) 335-340, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Dec. 1995, p7171-7177, Curr Genet 1986; 10 (8): 573-578, WO. 98/14600 etc.) can be used.
  • the gene encoding ⁇ -glutamyl transferase, glutathione reductase, or tripeptide peptidase distinguishes not only the coding region of the amino acid sequence of each protein but also its expression regulatory sequence (promoter sequence, etc.), exon sequence, intron sequence, etc. Show without doing.
  • the expression regulatory sequence is modified, the expression regulatory sequence is preferably modified at 1 base or more, more preferably 2 bases or more, and particularly preferably 3 bases or more.
  • the deletion of the deletion target gene in the second disclosure is more preferably a deletion of the deletion target gene in the genomic DNA of the microorganism.
  • the deletion of the gene to be deleted may be a deletion of a part or all of the expression regulatory sequence, or a deletion of a part or all of the coding region of the amino acid sequence of the enzyme.
  • the term "defective" means a deletion or damage, preferably a deletion.
  • the entire gene may be deleted including the sequences before and after the deletion target gene.
  • any region such as the N-terminal region, the internal region, or the C-terminal region can be used as long as a decrease in enzyme activity can be achieved. It may be deleted. Usually, the longer the region to be deleted, the more reliable the gene can be inactivated. Further, it is preferable that the reading frames of the sequences before and after the region to be deleted do not match.
  • the coding region and / or expression regulatory sequence of the amino acid sequence of the deletion target gene for example, the total number of bases of the coding region and / or the expression regulatory sequence is preferable.
  • a microorganism lacking 50% or more, more preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and more preferably a region consisting of 100% of bases.
  • it is a microorganism in which the region from the start codon to the stop codon of the gene to be deleted is deleted in the genomic DNA.
  • deletion of the deletion target gene such that the enzyme activity is reduced
  • introduction of an amino acid substitution (missense mutation) into the amino acid sequence coding region of the deletion target gene on the genomic DNA a stop codon (Nonsense mutation) or a frameshift mutation that adds or deletes 1 or 2 bases can be exemplified.
  • deletion of the deletion target gene such that the enzyme activity is reduced can also be achieved by inserting another sequence into the expression regulatory sequence or the amino acid sequence coding region of the deletion target gene on the genomic DNA, for example.
  • the insertion site may be any region of the gene, but the longer the sequence to be inserted, the more reliable the gene can be inactivated. Further, it is preferable that the reading frames do not match in the arrangement before and after the insertion site.
  • Other sequences are not particularly limited as long as they reduce or eliminate the function of the encoded protein, and examples thereof include genes useful for the production of ⁇ -glutamyl compounds such as marker genes and glutathione.
  • Deletion of the defective gene on the genomic DNA as described above is, for example, to prepare an inactive gene obtained by modifying the defective gene so as not to produce a normally functioning protein, and obtain the inactive gene.
  • This can be achieved by substituting the gene on the genomic DNA with the inactive gene by transforming the microorganism with the containing recombinant DNA to cause homologous recombination between the inactive gene and the gene on the genomic DNA.
  • the recombinant DNA contains a marker gene according to a trait such as auxotrophy of the host, it is easy to operate.
  • the recombinant DNA is linearized by cutting with a restriction enzyme or the like, a strain in which the recombinant DNA is incorporated into the genomic DNA can be efficiently obtained. Even if the protein encoded by the inactive gene is produced, it has a three-dimensional structure different from that of the wild-type protein, and its function is reduced or lost.
  • a replacement target site typically, a part or all of the deletion target gene
  • the microorganism is transformed with a linear DNA having the sequence of, or a linear DNA directly linked to the upstream and downstream sequences of the replacement target site on the genomic DNA, and upstream and downstream of the replacement target site of the genomic DNA of the microorganism.
  • the arbitrary sequence may include, for example, a marker gene sequence.
  • the marker gene may then be removed if necessary. When removing the marker gene, a sequence for homologous recombination may be added to both ends of the marker gene so that the marker gene can be removed efficiently.
  • Confirmation that the deficient target gene is deficient in the microorganism can be confirmed by a decrease in the activity of the enzyme encoded by the deficient target gene. Confirmation that the activity of the enzyme has decreased can be performed by measuring the activity of the enzyme. For example, the activity of glutathione reductase can be measured by a known method (Glutathione Reductase Assay Kit Part No. 7510-100-K manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.).
  • the amount of mRNA is preferably reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% as compared with the parent strain.
  • the amount of the enzyme encoded by the defective gene is, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less as compared with the parent strain. , Or preferably reduced to 0%.
  • the "enhanced expression" of a predetermined expression-enhanced gene is originally the parent strain (wild strain) of the microorganism.
  • the expression-enhancing gene is expressed, the expression level of the expression-enhancing gene is increased as compared with the parent strain, and when the parent strain does not originally express the expression-enhancing gene, the expression-enhancing gene is expressed. It includes both that the ability to do is granted to the parent strain.
  • An increase in the expression level of the expression-enhancing gene increases the number of copies of the expression-enhancing gene in the cells of the microorganism, and a promoter that controls the expression of the expression-enhancing gene on the genomic DNA of the cells of the microorganism. This can be achieved by substituting with a stronger expression promoter.
  • the increase in the copy number of the expression-enhancing gene in the cells of the microorganism is (A) An expression vector containing the expression-enhancing gene is introduced into the cells of a microorganism, or (B) This can be achieved by introducing the expression-enhancing gene into the genomic DNA of a microbial cell.
  • a plasmid vector containing the expression-enhancing gene or the like can be used as the expression vector used in the aspect (A).
  • the expression vector is preferably capable of autonomous replication in microbial cells.
  • the expression vector is a DNA encoding one or more enzymes selected from gamma-glutamyl-cysteine ligase, glutathione synthase, and bifunctional glutathione synthase, and a promoter functionally linked at a position where the DNA can be transcribed. Is preferably contained.
  • the expression vector preferably has a base sequence capable of autonomous replication in microbial cells and composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a base sequence encoding the amino acid sequence of one or more enzymes, and a transcription termination sequence.
  • the microorganism according to one or more embodiments of the second disclosure preferably carries an expression vector containing a base sequence encoding the expression-enhancing gene.
  • the microorganism can express the expression-enhancing gene from the expression vector.
  • Suitable plasmid vectors are available from pQEK1, pCA24N (DNA RESEARCH, 12, 191-299 (2005)), pACYC177, pACYC184 (available from Nippon Gene Co., Ltd.), pQE30, pQE60, pQE70, pQE80 and pQE9 (Qiagen).
  • pTipQC1 available from Qiagen or Hokkaido System Science
  • pTipRT2 available from Hokkaido System Science
  • pBS vector Phagescript vector, Bluescript vector, pNH8A, pNH16A, pNH18A and pNH46A (available from Stratage); p -3, pKK233-3, pDR540 and pRIT5 (available from Addgene); pRSF (available from MERCK); and pAC (available from Nippon Gene Co., Ltd.), pUCN18 (available from pUC18 (Takara Bio Inc.) ), PSTV28 (available from Takara Bio Inc.), pUCNT (International Publication No. 94/03613) and the like can be exemplified.
  • the expression vector preferably contains a promoter that controls transcription of the expression-enhancing gene.
  • the promoter is preferably an inducible promoter.
  • the inducible promoter examples include an isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) -inducible promoter, a photo-inducible promoter that induces gene expression under light irradiation, an araBAD promoter (arabinose-inducible), and a rhaBAD promoter (ramnorth-inducible). Sex), tet promoter (drug-inducible), penP promoter (drug-inducible), cspA promoter (temperature-inducible promoter that responds to low temperature), promoters including tetO or lacO operator as operator sequences, etc. can be exemplified and IPTG-inducible.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • a promoter, araBAD promoter, rhaBAD promoter, tet promoter, penP promoter, cspA promoter, or a promoter containing a tetO or lacO operator as an operator sequence is preferable.
  • IPTG-inducible promoter examples include T5 promoter, lacUV5 promoter, lac promoter, T7 promoter, lacT5 promoter, lacT7 promoter, tac promoter and the like.
  • an IPTG-inducible promoter is particularly preferable, and among the IPTG-inducible promoters, a T5 promoter, a T7 promoter, a lacT5 promoter, a lacT7 promoter or a tac promoter is particularly preferable.
  • the promoter it is also possible to use a promoter obtained by modifying a conventional promoter into a highly active form by using various reporter genes.
  • the activity of the promoter can be enhanced by bringing the -35 and -10 regions within the promoter region closer to the consensus sequence (International Publication WO00 / 18935).
  • highly active promoters include various tac-like promoters (Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574). Evaluation methods of promoter strength and examples of strong promoters are described in the paper by Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)).
  • the number of copies of the expression vector in the cell is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, more preferably 5 or more, and more preferably 10. As mentioned above, it is more preferably 15 or more, and more preferably 20 or more.
  • two or more genes may be contained in one expression vector, in which case, under the control of one expression promoter, Two or more genes may be arranged. In addition, two or more genes may be contained in different expression vectors.
  • a promoter similar to the expression vector more preferably an inducible promoter, can be used as the expression promoter.
  • specific examples of preferred promoters are as described above.
  • the degree of enhancement of expression (increase in expression level) of the expression-enhancing gene is not particularly limited.
  • the expression level of the expression-enhancing gene is the expression level of one or more enzymes selected from the mRNA corresponding to the expression-enhancing gene extracted from the cell (that is, gamma-glutamyl-cysteine ligase, glutathione synthase, and difunctional glutathione synthase). It can be expressed as the amount of mRNA that encodes the amino acid sequence.
  • the expression level based on this mRNA is preferably expressed as a relative value to the amount of mRNA encoding an appropriate internal standard protein.
  • the expression level of gamma-glutamyl-cysteine ligase in the microorganism preferably the mRNA level of gamma-glutamyl-cysteine ligase in the microorganism is set in the same strain.
  • the relative value obtained by dividing the amount of mRNA encoding the internal standard protein is the expression level of gamma-glutamyl-cysteine ligase in the parent strain (preferably, the amount of gamma-glutamyl-cysteine ligase mRNA in the wild strain is divided by the amount of mRNA of the internal standard protein in the same strain).
  • the relative value divided by the amount of mRNA encoding the above) is preferably 5 times or more, more preferably 10 times or more, and more preferably 20 times or more.
  • the expression level of the glutathione synthase in the microorganism (preferably the mRNA amount of the glutathione synthase in the microorganism is the internal standard protein in the same strain.
  • the relative value obtained by dividing by the amount of mRNA encoding the above is the expression level of glutathione synthetase in the wild strain (preferably the amount of the mRNA of glutathione synthetase in the wild strain divided by the amount of mRNA encoding the internal standard protein in the same strain).
  • the relative value divided by the amount) is preferably 5 times or more, more preferably 10 times or more, and more preferably 20 times or more.
  • the internal standard protein include a protein encoded by the hcaT gene known as a housekeeping gene.
  • the medium may be either a synthetic medium or a natural medium as long as it contains nutrients necessary for the growth of microorganisms used in the second disclosure such as carbon source, nitrogen source, inorganic salt and vitamin, and for the biosynthesis of glutathione.
  • M9 medium is used.
  • the carbon source may be any carbon source that can be assimilated by the microorganism to be used, and examples thereof include glucose, sugars such as fructose, alcohols such as ethanol and glycerol, and organic acids such as acetic acid. it can.
  • nitrogen source examples include ammonia, ammonium salts such as ammonium sulfate, nitrogen compounds such as amines, peptone, and natural nitrogen sources such as soybean hydrolyzate.
  • examples of the inorganic salt include potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, potassium carbonate and the like.
  • vitamins examples include biotin and thiamine.
  • a substance required for growth by the microorganism according to one or more embodiments of the second disclosure for example, a required amino acid in the case of an amino acid-requiring microorganism can be added.
  • the concentration of glycine added to the medium include 100 mM to 2000 mM, preferably 400 mM to 1200 mM.
  • concentration of the sulfur source added to the medium include 100 mM to 2000 mM, preferably 400 mM to 1200 mM.
  • sulfur source one or more kinds of inorganic sulfur compounds such as sulfuric acid, thiosulfuric acid, sulfurous acid, hyposulfurous acid or sulfide or salts thereof can be added.
  • Sulfuric acid, thiosulfuric acid, sulfurous acid, hyposulfurous acid or sulfide may be a free form, a salt, or any mixture thereof.
  • the salt is not particularly limited, and examples thereof include sodium salt, calcium salt, ammonium salt, potassium salt and the like.
  • Glycine may be free, salt, or any mixture thereof.
  • the salt is not particularly limited, and examples thereof include sulfates and hydrochlorides.
  • Sulfur source and / or glycine can be added to the medium at the start of or during the culture.
  • the sulfur source and / or glycine may be added to the medium all at once, or may be added to the medium continuously or intermittently.
  • the sulfur source and / or glycine may be contained in the medium for the entire period of the culture, or may be contained in the medium only for a part of the period of the culture.
  • the amount of sulfur source and glycine added need not be in the above range for the entire period of the stage of producing and accumulating glutathione, and the sulfur source and / or glycine is mediumd so that the content is in the above range during culturing.
  • the sulfur source and / or the glycine content may decrease with the lapse of the culture time.
  • a sulfur source and / or glycine may be additionally added continuously or intermittently.
  • the concentration of the medium components other than the sulfur source and / or glycine may fluctuate during the culture period, or may be additionally added.
  • Culturing is preferably carried out under aerobic conditions such as shaking culture and aeration stirring culture.
  • the culture temperature is 20 to 50 ° C., preferably 20 to 42 ° C., more preferably 28 to 38 ° C.
  • the pH at the time of culturing is 5 to 9, preferably 6 to 7.5.
  • the culturing time is 3 hours to 5 days, preferably 5 hours to 3 days.
  • Glutathione accumulated in the culture can be collected by a usual purification method. For example, after the culture is completed, the cells and solids in the culture can be removed by centrifugation or the like, and then the cells can be collected by ion exchange, concentration, or crystal separation.
  • the genetic manipulation described below can be carried out with reference to the description of Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
  • enzymes used for genetic manipulation, cloning hosts, etc. can be purchased from market suppliers and used according to the explanation.
  • the enzyme is not particularly limited as long as it can be used for genetic manipulation.
  • Example 1-1 Construction of glutathione synthesis gene expression vector (1)
  • the T5 promoter, Escherichia coli-derived gshA gene (SEQ ID NO: 12), and Escherichia coli-derived gshB gene (SEQ ID NO: 14) were inserted between the SmaI site and the HindIII site of the plasmid vector pQEK1-term shown in SEQ ID NO: 4.
  • Primers were designed based on the instructions of NEBillder HiFi DNA Assembly Master Mix (manufactured by New England Biolabs), and the vector was constructed according to the procedure described.
  • the constructed plasmid vector is referred to as pQEK1-PT5-ABEc-term.
  • pQEK1-PT5-ABEc-term may be expressed as pQEK1-PT5-gshA-gshB.
  • Example 1-2 Construction of glutathione synthesis gene expression vector (2) A mutant enzyme of the T5 promoter, the Escherichia coli-derived gshA gene (SEQ ID NO: 12), and the sulfur bacterium Thiobacillus denitrificans-derived glutathione synthase between the SmaI site and the HindIII site of the plasmid vector pQEK1-term shown in SEQ ID NO: 4 (WO2018 / The TDgshB (V260A) gene (SEQ ID NO: 18) encoding 084165) was inserted.
  • pQEK1-PT5-ABTd V260A
  • V260A pQEK1-PT5-ABTd
  • V260A pQEK1-PT5-ABTd
  • Example 1-3 Construction of glutathione synthesis gene expression vector (3)
  • the SAgshF gene (SEQ ID NO: 19) encoding the T5 promoter and the Streptococcus agalactiae-derived bifunctional glutathione synthase gene was inserted between the SmaI site and the HindIII site of the plasmid vector pQEK1-term shown in SEQ ID NO: 4.
  • Primers were designed based on the instructions of NEBillder HiFi DNA Assembly Master Mix (manufactured by New England Biolabs), and the vector was constructed according to the procedure described.
  • the constructed plasmid vector is referred to as pQEK1-PT5-FSa-term.
  • pQEK1-PT5-AFSa-term may be expressed as pQEK1-PT5-SAgshF.
  • Example 1-4 Construction of glutathione synthesis gene expression vector (4) A mutant enzyme of the lac promoter, the Escherichia coli-derived gshA gene (SEQ ID NO: 12), and the sulfur bacterium Thiobacillus denitrificans-derived glutathione synthase (WO2018 /) between the SmaI site and the HindIII site of the plasmid vector pQEK1-term shown in SEQ ID NO: 4.
  • the TDgshB (V260A) gene (SEQ ID NO: 18) encoding 084165) was inserted.
  • pQEK1-Plac-ABTd V260A
  • V260A pQEK1-Plac-ABTd
  • V260A pQEK1-Plac-ABTd
  • pQEK1-PlacUV5-ABTd V260A
  • V260A pQEK1-PlacUV5-ABTd
  • V260A pQEK1-PlacUV5-ABTd
  • Example 1-6 Preparation of host strain
  • the plasmid pTH18cs1 obtained from the Escherichia coli strain BW25113 obtained from the National Institute of Genetics was used.
  • Strains lacking the ⁇ -glutamyltransferase gene (SEQ ID NO: 21) and the tripeptide peptidase gene (SEQ ID NO: 23) were prepared in the same manner as shown.
  • Example 1-7 Preparation of glutathione synthetic gene-enriched strain Competent cells of the host strain prepared in Example 1-6 were prepared by a conventional method, and transformed with the plasmid vector prepared in Examples 1-1 to 5. And each transformant was obtained.
  • Example 1-8 Evaluation of glutathione fermentation production
  • a host strain (without plasmid) prepared in Example 1-6 or a glutathione synthetic gene-enriched strain prepared in Example 1-7 was prepared in 5 mL LB medium (20 ⁇ g / mL tetracycline). Inoculated into (including) and cultured with shaking at 300 rpm and 30 ° C. for 8 hours.
  • Example 1-9 Transcription analysis of gamma-glutamyl-cysteine ligase gene and glutathione synthetase gene Expression level analysis of overexpressed gene was performed using a plasmid by real-time PCR. In the culture described in Example 1-8, the culture broth after the second inoculation was cultured for 6 hours, 0.1 mM isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside was added, and an appropriate amount was sampled 1 hour later. Using NucleoSpin RNA purchased from Takara Bio Inc., RNA was extracted according to the attached instructions. Each RNA sample was adjusted to a concentration of 50 ng / ⁇ L by diluting with water.
  • hcaT SEQ ID NO: 27
  • hcaT, gshA, and gshB the genomic DNA of the host Escherichia coli was used and subjected to a real-time PCR reaction at the same time as the sample to prepare a calibration curve. Based on the calibration curve, the amount of each gene contained in each cDNA was quantified.
  • a calibration curve was prepared using the plasmid pTDGSH2m15 described in WO2018 / 084165 for TDgshB (V260A) and the plasmid pNGSHF described in WO2016 / 017631 for SAgshF.
  • the forward primer for amplifying hcaT is SEQ ID NO: 28
  • the reverse primer is SEQ ID NO: 29
  • the forward primer for amplifying gshA is SEQ ID NO: 30
  • the reverse primer is SEQ ID NO: 31
  • the forward primer for amplifying TDgshB (V260A) is forward.
  • the primer is SEQ ID NO: 32
  • the reverse primer is SEQ ID NO: 33
  • the forward primer for amplifying gshB is SEQ ID NO: 34
  • the reverse primer is SEQ ID NO: 35
  • the forward primer for amplifying SAgshF is SEQ ID NO: 36
  • the reverse primer is sequence. The one shown in No. 37 was used.
  • PQEK1-PT5-ABTd V260A -term, pQEK1-Plac-ABTd (V260A) -term, pQEK1-PlacUV5-ABTd (V260A) -term, or pQEK1-PT5-ABEc, which are plasmid vectors containing the gshA gene derived from Escherichia coli. -The expression level of Escherichia coli-derived gshA gene by the transformant into which term was introduced (quantitative value of gshA gene expression level of each transformant was divided by the quantitative value of hcaT expression level in the same transformant and standardized.
  • Example level the expression level of the Escherichia coli-derived gshA gene by the untransformed host strain prepared in Example 1-6 (quantitative value of the expression level of the gshA gene of the host strain) of hcaT in the same host strain. Calculated as a relative amount with 1 as the relative amount (standardized expression level divided by the quantitative value of the expression level), and the relative amount of 5 or more and less than 10 is "+", 10 or more and less than 20 is "++", and 20 or more is "++++". I evaluated it.
  • the expression level of the Escherichia coli-derived gshB gene by a transformant introduced with pQEK1-PT5-ABEc-term which is a plasmid vector containing the Escherichia coli-derived gshB gene (quantitative value of the expression level of the gshB gene of each transformant).
  • the expression level of the gshB gene derived from Escherichia coli by the untransformed host strain is divided by the quantitative value of the expression level of hcaT in the same transformant.
  • the expression level of the TDgshB (V260A) gene or SAgshF gene by the transformant into which ABTd (V260A) -term or pQEK1-PT5-FSa-term was introduced the quantitative value of the expression level of each gene was used as hcaT in the same sample. Standardized by dividing by the quantitative value of the gene. As a negative control, the gene expression level was similarly determined for the untransformed host strain (without plasmid). The results are shown in Table 3.
  • a plasmid vector for disrupting the ggt ( ⁇ -glutamyltransferase) gene (SEQ ID NO: 21) was prepared.
  • SEQ ID NO: 1 a DNA fragment having an upstream sequence and a downstream sequence of the ggt gene was obtained.
  • the obtained fragment was digested with XbaI and HindIII, and the temperature-sensitive plasmid pTH18cs1 (GenBank accession number AB019610) [Hashimoto-Gotoh, T. et al. , Gene, 241,185-191 (2000)] with XbaI and HindIII, and Ligation high Ver. 2 (Toyobo) was ligated to obtain a plasmid vector pTH18cs1-ggt-UD.
  • a BW251 13 ⁇ ggt strain was prepared using pTH18cs1-ggt-UD.
  • pTH18cs1-ggt-UD was introduced into Escherichia coli BW25113 strain by an electroporation method, applied to an LB agar plate containing 10 ⁇ g / mL of chloramphenicol, and cultured at 30 ° C. to obtain a transformant.
  • the obtained transformant was cultured with shaking at 30 ° C. overnight in an LB liquid medium containing 10 ⁇ g / mL of chloramphenicol, and the culture solution was applied to an LB agar plate containing 10 ⁇ g / mL of chloramphenicol.
  • the product was cultured at 42 ° C.
  • the obtained transformant was cultured overnight in an LB liquid medium at 42 ° C., and then applied to an LB agar plate to obtain colonies. The acquired colonies were replicated on an LB agar plate and an LB agar plate containing 10 ⁇ g / mL of chloramphenicol, respectively, and transformants exhibiting chloramphenicol sensitivity were selected. From the selected transformants, one strain lacking from the start codon to the stop codon of the ggt gene on the chromosome was isolated by PCR and analysis by a DNA sequencer. This gene-disrupted strain was named BW251 13 ⁇ ggt strain. The BW25113 ⁇ ggt strain is a strain in which the Escherichia coli BW25113 strain is used as a host and the start codon to the stop codon of the ggt gene on the chromosome is deleted.
  • a plasmid vector for disrupting the pepT (tripeptide peptidase) gene (SEQ ID NO: 23) was prepared.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 2) having an upstream sequence and a downstream sequence of the pepT gene was obtained.
  • the obtained fragment was digested with XbaI and HindIII, and pTH18cs1 was digested with XbaI and HindIII. It was ligated with 2 to obtain a plasmid vector pTH18cs1-pepT-UD.
  • BW251 13 ⁇ ggt strain prepared in Production Example 2-1 was used as the parent strain, and pTH18cs1-pepT-UD was used to delete the start codon to the stop codon of the pepT gene on the chromosome in the same manner as in Production Example 2-1.
  • One strain was isolated. This gene-disrupted strain was named BW25113 ⁇ ggt ⁇ pepT strain.
  • the BW25113 ⁇ ggt ⁇ pepT strain is a strain in which the Escherichia coli BW25113 strain is used as a host and the ggt gene and the pepT gene on the chromosome are deleted from the start codon to the stop codon.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 5) consisting of a T5 promoter, an Escherichia coli-derived gshA gene, and a Thiobacilus denitrificans-derived gshB gene (carrying a V260A mutation) was obtained.
  • the obtained fragment was ligated with the fragment obtained by digesting pQEK1-term with SpeI and HindIII using NEBiller HiFi DNA Assembury Master Mix (New England Biolabs), and pQ60PT5-PT25-PT25-PT25-PT60 ) -Term was obtained.
  • a plasmid vector for disrupting the go (glutathione reductase) gene was prepared.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 7) having an upstream sequence and a downstream sequence of the go gene was obtained.
  • the obtained fragment was digested with XbaI and HindIII, and pTH18cs1 was digested with XbaI and HindIII. It was ligated with 2 to obtain a plasmid vector pTH18cs1-gor-UD.
  • BW25113 ⁇ ggt ⁇ pepT strain prepared in Production Example 2-2 was used as the parent strain, and pTH18cs1-gor-UD was used to delete the start codon to the stop codon of the gor gene on the chromosome in the same manner as in Production Example 2-1.
  • One strain was isolated. This gene-disrupted strain was named BW25113 ⁇ ggt ⁇ pepT ⁇ gor strain.
  • Example 2-1 Fermentation production of glutathione by BW25113 ⁇ ggt ⁇ pepT ⁇ gor / pQEK1-PT5-ABTd (V260A) -term strain BW25113 ⁇ ggt ⁇ pepT ⁇ gor / pQEK1-PT5-ABTd (V260A) -term strain obtained in Production Example 2-6.
  • V260A Fermentation production of glutathione by BW25113 ⁇ ggt ⁇ pepT ⁇ gor / pQEK1-PT5-ABTd
  • V260A Fermentation production of glutathione by BW25113 ⁇ ggt ⁇ pepT ⁇ gor / pQEK1-PT5-ABTd (V260A) -term strain obtained in Production Example 2-6.
  • Example 2-1 Comparative Example 2-1 in Table 4, it can be seen that glutathione productivity (GSH + GSSG) is greatly increased by disruption of the go gene. From this, it can be seen that the disruption of the go gene is effective in the fermentation production of glutathione.
  • Example 2-2 Fermentation production of glutathione by BW25113 ⁇ ggt ⁇ pepT ⁇ gor / pQEK1-PT5-ABEc-term strain
  • BW25113 ⁇ ggt ⁇ pepT ⁇ gor / pQEK1-PT5-ABEc-term strain obtained in Production Example 2-9 was used under the same conditions as in Example 2-1.
  • Example 2-2 Comparative Example 2-2 in Table 5, it can be seen that glutathione productivity (GSH + GSSG) is greatly increased by disruption of the go gene. From this, it can be seen that the disruption of the go gene is effective in the fermentation production of glutathione.
  • Example 2-3 Fermentation production of glutathione by BW25113 ⁇ ggt ⁇ pepT ⁇ gor / pQEK1-PT5-FSa-term strain
  • the BW25113 ⁇ ggt ⁇ pepT ⁇ gor / pQEK1-PT5-FSa-term strain obtained in Production Example 2-12 was subjected to the same conditions as in Example 2-1. To produce GSH and GSSG. The results are shown in Table 6.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本明鎖書はグルタチオン等のペプチドの製造方法、及び、該方法に用いることができる微生物を開示する。　第一の開示の一以上の実施形態は、ｇｓｈＡ遺伝子、ｇｓｈＢ遺伝子、及び、ｇｓｈＦ遺伝子から選択される１以上の遺伝子の発現量が野生株と比較して増加している原核微生物株を、システイン及びシスチンの合計濃度が０．５ｇ／Ｌ以下の培地中で培養することを含む、グルタチオン等のペプチドの製造方法に関する。第二の開示は、γ－グルタミルトランスフェラーゼ遺伝子及びグルタチオンレダクターゼ遺伝子を欠損し、ｇｓｈＡ遺伝子及びｇｓｈＢ、或いは、ｇｓｈＦ遺伝子の発現が強化された微生物に関する。

Description

有用物質の製造方法
　第一の開示の一以上の実施形態は、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンの製造方法に関する。
　第一の開示の別の一以上の実施形態は、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを過剰生産することが可能な原核微生物株に関する。
　第二の開示は、グルタチオンレダクターゼ遺伝子を欠損したグルタチオンを製造する微生物、および該微生物を用いたグルタチオンの製造方法に関する。
　グルタチオンは還元型及び酸化型の存在が知られており、還元型グルタチオンは、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン酸、グリシンの３つのアミノ酸から成るペプチドである。また、酸化型グルタチオンは２分子の還元型グルタチオンのチオール基がジスルフィド結合した化合物である。人体だけでなく、他の動物や植物、微生物などの多くの生体内に存在し、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸の代謝など、生体にとって重要な化合物である。そのため医薬品、食品、化粧品産業で注目されている。また、近年、酸化型グルタチオンに植物の生長を促進する効果があることなどの知見も得られるなど、農業を含めたさまざまな分野での用途が期待されている。
　グルタチオンは生体内で、Ｌ－システイン残基のチオール基が還元されたＳＨの形態である還元型のグルタチオン（以下「ＧＳＨ」と称することがある）と、Ｌ－システイン残基のチオール基が酸化されグルタチオン２分子間でジスルフィド結合を形成した形態である酸化型グルタチオン（以下「ＧＳＳＧ」と称することがある）のいずれかの形態で存在する。
　グルタチオンの製造方法としては、酵母又は大腸菌を用いて発酵により製造する方法（特許文献１）や、微生物を用いてγ－グルタミルシステイン合成酵素やグルタチオン合成酵素を生産し、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－システイン、グリシンを酵素的に連結することにより製造する方法（特許文献３、４）などが知られている。
　例えば特許文献１には、親株と比較してチオールオキシダーゼの活性が増大した酵母を培地中で培養することにより、グルタチオンを産生せしめた後、得られる培養液からグルタチオンを回収することを特徴とする、グルタチオンの製造方法が記載されている。
　また特許文献２には、グルタチオン輸送活性を有する蛋白質の活性、およびグルタチオンまたはγ－グルタミルシステインの生合成に関わる蛋白質の活性が親株より高い微生物を培地に培養し、該培地中にグルタチオンまたはγ－グルタミルシステインを生成、蓄積させ、培養物中からグルタチオンまたはγ－グルタミルシステインを採取するグルタチオンまたはγ－グルタミルシステインの製造法が記載されている。特許文献２の実施例４では、大腸菌由来のグルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子であるｇｓｈＡ遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子であるｇｓｈＢとを過剰発現させた大腸菌株を、アミノ酸を添加した培地中で培養したところ培地中のグルタチオン濃度は１６０ｍｇ／Ｌであったことが記載されている。
　非特許文献１では、恒常型プロモーターの制御下に配置された二機能性グルタチオン合成酵素ｇｓｈＦ遺伝子を含む発現ベクターにより形質転換された大腸菌を、グルタチオンの構成アミノ酸であるＬ－システイン、Ｌ－グルタミン酸およびグリシンが添加された培地中で培養して、グルタチオンを製造する方法が記載されている。
国際公開ＷＯ２０１６／１４０３４９ 国際公開ＷＯ２００８／１２６７８４ 特開昭６０－２７３９６号公報 特開昭６０－２７３９７号公報
Journal of Biotechnology (2018), https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2018.11.001
　第一に、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを生産することが可能な原核微生物株及びそれを用いた前記ペプチドの製造方法の新たな態様が求められる。
　第二に、グルタチオンを生産することが可能な微生物及びそれを用いたグルタチオンの製造方法の新たな態様が求められる。
　本明細書の第一の開示は、以下の（１）～（１４）に示す実施形態を包含する。
（１）γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンの製造方法であって、
　グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子、グルタチオン合成酵素遺伝子、及び、二機能性グルタチオン合成酵素遺伝子から選択される１以上の遺伝子の発現量が野生株と比較して増加している原核微生物株を、システイン及びシスチンの合計濃度が０．５ｇ／Ｌ以下の培地中で培養することを含む方法。
（２）前記原核微生物株が、前記１以上の遺伝子の誘導発現により、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを過剰生産することが可能である、（１）に記載の方法。
（３）γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンの製造方法であって、
　グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子、グルタチオン合成酵素遺伝子、及び、二機能性グルタチオン合成酵素遺伝子から選択される１以上の遺伝子の発現量が野生株と比較して増加している原核微生物株を培地中で培養することを含み、
　前記培地中にシステイン又はシスチンを添加することを含まない方法。
（４）前記原核微生物株が、前記１以上の遺伝子の誘導発現により、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを過剰生産することが可能である、（３）に記載の方法。
（５）プロモーターに発現可能に連結されたグルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子、グルタチオン合成酵素遺伝子、及び、二機能性グルタチオン合成酵素遺伝子から選択される１以上の遺伝子を保持する原核微生物株であって、
　前記プロモーターが、前記１以上の遺伝子がグルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子である場合の前記原核微生物株によるグルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子の転写量を野生株の２０倍以上とするプロモーターである、
　γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを過剰生産することが可能な原核微生物株。
（６）前記プロモーターが誘導性プロモーターである、（５）に記載の原核微生物株。
（７）前記誘導性プロモーターが、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、光誘導性プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｒｈａＢＡＤプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター、或いは、オペレーター配列としてｔｅｔＯ又はｌａｃＯオペレーターを含むプロモーターである、（６）に記載の原核微生物株。
（８）前記誘導性プロモーターが、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｔａｃプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｒｈａＢＡＤプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター、或いは、オペレーター配列としてｔｅｔＯ又はｌａｃＯオペレーターを含むプロモーターである、（７）に記載の原核微生物株。
（９）前記誘導性プロモーターが、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター又はｔａｃプロモーターである、（８）に記載の原核微生物株。
（１０）前記誘導性プロモーターがＴ５プロモーターである、（９）に記載の原核微生物株。
（１１）腸内細菌の形質転換体である、（５）～（１０）のいずれかに記載の原核微生物株。
（１２）大腸菌の形質転換体である、（５）～（１０）のいずれかに記載の原核微生物株。
（１３）前記原核微生物株が、（５）～（１２）のいずれかに記載の原核微生物株である、（１）又は（２）に記載の方法。
（１４）前記原核微生物株が、（５）～（１２）のいずれかに記載の原核微生物株である、（３）又は（４）に記載の方法。
　本明細書の第二の開示は、以下の（１５）～（２２）に示す実施形態を包含する。
（１５）以下の［１］の遺伝子及び［２］の遺伝子を欠損し、且つ、［３］遺伝子又は［４］の遺伝子の発現が強化された微生物：
［１］γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．２．２）をコードする遺伝子；
［２］グルタチオンレダクターゼ（ＥＣ：１．８．１．７）をコードする遺伝子；
［３］グルタミン酸－システインリガーゼ（ＥＣ：６．３．２．２）をコードする遺伝子、及び、グルタチオン合成酵素（ＥＣ：６．３．２．３）をコードする遺伝子；
［４］二機能性グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子。
（１６）以下の［５］の遺伝子を欠損した、（１５）に記載の微生物：
［５］トリペプチドペプチダーゼ（ＥＣ：３．４．１１．４）をコードする遺伝子。
（１７）微生物が、細菌の形質転換体である、（１５）又は（１６）に記載の微生物。
（１８）微生物が、腸内細菌の形質転換体である、（１５）又は（１６）に記載の微生物。
（１９）微生物が、グラム陰性細菌の形質転換体である、（１５）又は（１６）に記載の微生物。
（２０）微生物が、大腸菌の形質転換体である、（１５）又は（１６）に記載の微生物。
（２１）（１５）～（２０）のいずれかに記載の微生物を培地中で培養することを含む、グルタチオンの製造方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１９－２１１４７７号及び日本国特許出願番号２０２０－００２３６３号の開示内容を包含する。
　本明細書の第一の開示に係る方法によれば、システイン又はシスチンを添加する工程を必要としないため低コストでγ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを製造することができる。
　本明細書の第一の開示に係る原核微生物株は、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを効率的に生産することができる。
　本明細書の第二の開示に係る微生物は、発酵によるグルタチオン生産性が高い。
　本明細書の第二の開示に係るグルタチオンの製造方法によれば、グルタチオンを効率良く製造することが可能である。
　本明細書の第一の開示及び第二の開示の好ましい実施形態について具体的に以下に説明するが、本明細書の第一の開示及び第二の開示の範囲はこれらの実施形態には限定されない。
＜１．酵素＞
＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞
　γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．２．２）は、グルタチオン等のγ－グルタミルペプチドを加水分解する酵素である。
　「γ－グルタミルトランスフェラーゼ」は、「γ－グルタミルトランスペプチダーゼ」又は「Ｇｇｔ」とも称される。本明細書において「γ－グルタミルトランスフェラーゼ」と「γ－グルタミルトランスペプチダーゼ」と「Ｇｇｔ」とは相互に置換可能である。
　γ－グルタミルトランスフェラーゼの具体例としては、
（１Ａ）配列番号２２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１Ｂ）配列番号２２に示すアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号２２に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）であって、γ－グルタミルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド；
（１Ｃ）配列番号２２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、γ－グルタミルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（１Ｄ）（１Ａ）～（１Ｃ）のいずれかのポリペプチドの、γ－グルタミルトランスフェラーゼ活性を有する断片
であることができる。
　前記（１Ｄ）において断片としては、アミノ酸数が好ましくは２００以上、より好ましくは３００以上、より好ましくは４００以上、より好ましくは５００以上、より好ましくは５５０以上のポリペプチドであることができる。
　前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。
　前記（１Ｂ）において「複数個」とは、例えば、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～７個、２～５個、２～４個又は２～３個をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似するアミノ酸間の置換をいう。性質の類似するアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）等に分類することができる。
　前記（１Ｃ）において「配列同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号２２に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。配列同一性は、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質の検索システムを用いて算出することができる（Karlin，S．et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877；Altschul，S．F．et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410；Pearson，W．R．et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448）。以下、本明細書ではアミノ酸配列の「配列同一性」は、同様の意味で用いる。
　「γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．２．２）をコードする遺伝子」とは、γ－グルタミルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を指し、γ－グルタミルトランスフェラーゼを欠損させる前の野生型の微生物の染色体上のゲノムＤＮＡに含まれる。
　大腸菌に由来する、γ－グルタミルトランスフェラーゼの配列番号２２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一例を配列番号２１に示す。ただし野生型の微生物のゲノムＤＮＡでは、配列番号２１の塩基配列がそのまま存在するとは限らず、配列番号２１の塩基配列がエキソン配列であり、途中に１以上のイントロン配列が介在していてもよい。
　すなわち、γ－グルタミルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列の具体例としては、
（１Ｅ）配列番号２１に示す塩基配列；
（１Ｆ）配列番号２１に示す塩基配列において、１～複数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列（特に好ましくは、配列番号２１に示す塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方において合計で１～複数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加した塩基配列）であって、γ－グルタミルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（１Ｇ）配列番号２１に示す塩基配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、γ－グルタミルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（１Ｈ）（１Ｅ）～（１Ｇ）のいずれかの塩基配列の、γ－グルタミルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする部分塩基配列；
（１Ｉ）（１Ｅ）～（１Ｈ）のいずれかの塩基配列において、サイレント変異（コードするアミノ酸残基を変化しない塩基置換）が導入された塩基配列；
（１Ｊ）（１Ａ）～（１Ｄ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は、
（１Ｋ）（１Ｅ）～（１Ｊ）のいずれかの塩基配列をエキソン配列とし、途中に１以上のイントロン配列が介在している塩基配列
が挙げられる。
　前記（１Ｇ）において「配列同一性」とは、二つの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号２１の全塩基数に対する同一塩基の割合（％）をいう。配列同一性は、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによる塩基配列の検索システムを用いて算出することができる（Karlin，S．et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877；Altschul，S．F．et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410；Pearson，W．R．et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448）。以下、本明細書では塩基配列の「配列同一性」は、同様の意味で用いる。
＜１．２．グルタチオンレダクターゼ＞
　グルタチオンレダクターゼ（ＥＣ：１．８．１．７）は、ＮＡＤＰＨの存在下で酸化型グルタチオン（グルタチオンジスルフィド）を還元して還元型グルタチオンを生成する反応を触媒する酵素である。
　グルタチオンレダクターゼの具体例としては、
（２Ａ）配列番号２６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２Ｂ）配列番号２６に示すアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号２６に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）であって、グルタチオンレダクターゼ活性を有するポリペプチド；
（２Ｃ）配列番号２６に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、グルタチオンレダクターゼ活性を有するポリペプチド；又は
（２Ｄ）（２Ａ）～（２Ｃ）のいずれかのポリペプチドの、グルタチオンレダクターゼ活性を有する断片
であることができる。
　前記（２Ｄ）において断片としては、アミノ酸数が好ましくは２００以上、より好ましくは３００以上、より好ましくは４００以上のポリペプチドであることができる。
　前記（２Ｂ）において「複数個」とは、例えば、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～７個、２～５個、２～４個又は２～３個をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｂ）に関して説明した通りである。
　前記（２Ｃ）での「配列同一性」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｃ）に関して説明した通りである。すなわち前記（２Ｃ）において「配列同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号２６に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。
　「グルタチオンレダクターゼ（ＥＣ：１．８．１．７）をコードする遺伝子」とは、グルタチオンレダクターゼのアミノ酸配列をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を指し、グルタチオンレダクターゼを欠損させる前の野生型の微生物の染色体上のゲノムＤＮＡに含まれる。
　大腸菌に由来する、グルタチオンレダクターゼの配列番号２６に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一例を配列番号２５に示す。ただし野生型の微生物のゲノムＤＮＡでは、配列番号２５の塩基配列がそのまま存在するとは限らず、配列番号２５の塩基配列がエキソン配列であり、途中に１以上のイントロン配列が介在していてもよい。
　すなわち、グルタチオンレダクターゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列の具体例としては、
（２Ｅ）配列番号２５に示す塩基配列；
（２Ｆ）配列番号２５に示す塩基配列において、１～複数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列（特に好ましくは、配列番号２５に示す塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方において合計で１～複数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加した塩基配列）であって、グルタチオンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（２Ｇ）配列番号２５に示す塩基配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、グルタチオンレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（２Ｈ）（２Ｅ）～（２Ｇ）のいずれかの塩基配列の、グルタチオンレダクターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする部分塩基配列；
（２Ｉ）（２Ｅ）～（２Ｈ）のいずれかの塩基配列において、サイレント変異（コードするアミノ酸残基を変化しない塩基置換）が導入された塩基配列；
（２Ｊ）（２Ａ）～（２Ｄ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は、
（２Ｋ）（２Ｅ）～（２Ｊ）のいずれかの塩基配列をエキソン配列とし、途中に１以上のイントロン配列が介在している塩基配列
が挙げられる。
　前記（２Ｇ）での「配列同一性」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｇ）に関して説明した通りである。すなわち前記（２Ｇ）において「配列同一性」とは、二つの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号２５の全塩基数に対する同一塩基の割合（％）をいう。
＜１．３．トリペプチドペプチダーゼ＞
　トリペプチドペプチダーゼ（ＥＣ：３．４．１１．４）は、トリペプチドからＮ末端アミノ酸残基を遊離させる反応を触媒する酵素である。
　「トリペプチドペプチダーゼ」は、「ペプチダーゼＴ」又は「ＰｅｐＴ」とも称される。本明細書において「トリペプチドペプチダーゼ」と「ペプチダーゼＴ」と「ＰｅｐＴ」とは相互に置換可能である。
　トリペプチドペプチダーゼの具体例としては、
（５Ａ）配列番号２４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（５Ｂ）配列番号２４に示すアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号２４に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）であって、トリペプチドペプチダーゼ活性を有するポリペプチド；
（５Ｃ）配列番号２４に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、トリペプチドペプチダーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（５Ｄ）（５Ａ）～（５Ｃ）のいずれかのポリペプチドの、トリペプチドペプチダーゼ活性を有する断片
であることができる。
　前記（５Ｄ）において断片としては、アミノ酸数が好ましくは２００以上、より好ましくは３００以上、より好ましくは３５０以上のポリペプチドであることができる。
　前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。
　前記（５Ｂ）において「複数個」とは、例えば、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～７個、２～５個、２～４個又は２～３個をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｂ）に関して説明した通りである
　前記（５Ｃ）での「配列同一性」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｃ）に関して説明した通りである。すなわち前記（５Ｃ）において「配列同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号２４に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。
　「トリペプチドペプチダーゼ（ＥＣ：３．４．１１．４）をコードする遺伝子」とは、トリペプチドペプチダーゼのアミノ酸配列をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を指し、トリペプチドペプチダーゼを欠損させる前の野生型の微生物の染色体上のゲノムＤＮＡに含まれる。
　大腸菌に由来する、トリペプチドペプチダーゼの配列番号２４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一例を配列番号２３に示す。ただし野生型の微生物のゲノムＤＮＡでは、配列番号２３の塩基配列がそのまま存在するとは限らず、配列番号２３の塩基配列がエキソン配列であり、途中に１以上のイントロン配列が介在していてもよい。
　すなわち、トリペプチドペプチダーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列の具体例としては、
（５Ｅ）配列番号２３に示す塩基配列；
（５Ｆ）配列番号２３に示す塩基配列において、１～複数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列（特に好ましくは、配列番号２３に示す塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方において合計で１～複数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加した塩基配列）であって、トリペプチドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（５Ｇ）配列番号２３に示す塩基配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、トリペプチドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（５Ｈ）（５Ｅ）～（５Ｇ）のいずれかの塩基配列の、トリペプチドペプチダーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする部分塩基配列；
（５Ｉ）（５Ｅ）～（５Ｈ）のいずれかの塩基配列において、サイレント変異（コードするアミノ酸残基を変化しない塩基置換）が導入された塩基配列；
（５Ｊ）（５Ａ）～（５Ｄ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は、
（５Ｋ）（５Ｅ）～（５Ｊ）のいずれかの塩基配列をエキソン配列とし、途中に１以上のイントロン配列が介在している塩基配列
が挙げられる。
　前記（５Ｇ）での「配列同一性」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｇ）に関して説明した通りである。すなわち前記（５Ｇ）において「配列同一性」とは、二つの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号２３の全塩基数に対する同一塩基の割合（％）をいう。
＜１．４．グルタミン酸－システインリガーゼ＞
　グルタミン酸－システインリガーゼ（ＥＣ：６．３．２．２）は、ＡＴＰの存在下でＬ－システインを基質として認識し、Ｌ－グルタミン酸と結合させることでγ－グルタミルシステインを生成する反応を触媒する酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本明細書において、当該活性を、グルタミン酸－システインリガーゼ活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのγ－グルタミルシステインを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。
　「グルタミン酸－システインリガーゼ」は、「グルタミン酸システインリガーゼ」又は「ＧｓｈＡ」とも称される。本明細書において「グルタミン酸－システインリガーゼ」と「グルタミン酸システインリガーゼ」と「ＧｓｈＡ」とは相互に置換可能である。
（測定条件）
１０ｍＭ　ＡＴＰ、１５ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸、１５ｍＭ　Ｌ－システイン、１０ｍＭ　硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ　塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のγ－グルタミルシステインを定量する。
　上記高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。この条件では、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、γ－グルタミルシステイン（γ－ＧＣ）、ビス－γ－グルタミルシスチン（酸化型γ－ＧＣ）、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の順で溶出する。
［ＨＰＬＣ条件］
カラム：ＯＤＳ－ＨＧ－３（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、野村化学社製）；
溶離液：リン酸２水素カリウム１２．２ｇ及びヘプタンスルホン酸ナトリウム３．６ｇを蒸留水１．８Ｌで溶解した後、該溶液をリン酸でｐＨ２．８に調整し、メタノール１８６ｍｌを追加して溶解した液；
流速：１．０ｍｌ／分；
カラム温度：４０℃；
測定波長：２１０ｎｍ
　グルタミン酸－システインリガーゼとしてはタンパク質１ｍｇあたりのグルタミン酸－システインリガーゼ活性（比活性）が０．５Ｕ以上、好ましくは１Ｕ以上、さらに好ましくは５Ｕ以上、最も好ましくは１０Ｕ以上のものを使用することが好ましい。
　グルタミン酸－システインリガーゼの起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のグルタミン酸－システインリガーゼが好ましく、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の腸内細菌や、コリネ型細菌等の細菌、酵母等の真核微生物等に由来するグルタミン酸－システインリガーゼが好ましい。
　大腸菌由来のグルタミン酸－システインリガーゼの塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１２及び配列番号１３に示す。
　グルタミン酸－システインリガーゼとしてはまた、配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるグルタミン酸－システインリガーゼに限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、グルタミン酸－システインリガーゼ活性を有する他のポリペプチドも使用できる。グルタミン酸－システインリガーゼ活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるグルタミン酸－システインリガーゼを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。
　グルタミン酸－システインリガーゼの具体例としては、
（３－１Ａ）配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（３－１Ｂ）配列番号１３に示すアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１３に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）であって、グルタミン酸－システインリガーゼ活性を有するポリペプチド；
（３－１Ｃ）配列番号１３に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、グルタミン酸－システインリガーゼ活性を有するポリペプチド；又は
（３－１Ｄ）（３－１Ａ）～（３－１Ｃ）のいずれかのポリペプチドの、グルタミン酸－システインリガーゼ活性を有する断片
であることができる。
　前記（３－１Ｄ）において断片としては、アミノ酸数が好ましくは２００以上、より好ましくは３００以上、より好ましくは４００以上、より好ましくは４５０以上、より好ましくは５００以上のポリペプチドであることができる。
　前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。
　前記（３－１Ｂ）において「複数個」とは、例えば、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～７個、２～５個、２～４個又は２～３個をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｂ）に関して説明した通りである
　前記（３－１Ｃ）での「配列同一性」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｃ）に関して説明した通りである。すなわち前記（３－１Ｃ）において「配列同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１３に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。
　「グルタミン酸－システインリガーゼ（ＥＣ：６．３．２．２）をコードする遺伝子」とは、グルタミン酸－システインリガーゼのアミノ酸配列をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を指す。
　大腸菌に由来する、グルタミン酸－システインリガーゼの配列番号１３に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一例を配列番号１２に示す。グルタミン酸－システインリガーゼのアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列は、宿主に合わせてコドン最適化したものであってもよい。
　すなわち、グルタミン酸－システインリガーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列の具体例としては、
（３－１Ｅ）配列番号１２に示す塩基配列；
（３－１Ｆ）配列番号１２に示す塩基配列において、１～複数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列（特に好ましくは、配列番号１２に示す塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方において合計で１～複数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加した塩基配列）であって、グルタミン酸－システインリガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（３－１Ｇ）配列番号１２に示す塩基配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、グルタミン酸－システインリガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（３－１Ｈ）（３－１Ｅ）～（３－１Ｇ）のいずれかの塩基配列の、グルタミン酸－システインリガーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする部分塩基配列；
（３－１Ｉ）（３－１Ｅ）～（３－１Ｈ）のいずれかの塩基配列において、サイレント変異（コードするアミノ酸残基を変化しない塩基置換）が導入された塩基配列；
（３－１Ｊ）（３－１Ａ）～（３－１Ｄ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は、
（３－１Ｋ）（３－１Ｅ）～（３－１Ｊ）のいずれかの塩基配列をエキソン配列とし、途中に１以上のイントロン配列が介在している塩基配列
が挙げられる。
　前記（３－１Ｇ）での「配列同一性」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｇ）に関して説明した通りである。すなわち前記（３－１Ｇ）において「配列同一性」とは、二つの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１２の全塩基数に対する同一塩基の割合（％）をいう。
＜１．５．グルタチオン合成酵素＞
　グルタチオン合成酵素（ＥＣ：６．３．２．３）は、ＡＴＰの存在下でγ－グルタミルシステインを基質として認識し、グリシンと結合させることでＧＳＨを生成する反応を触媒する酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本明細書において、当該活性をグルタチオン合成酵素活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのグルタチオンを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。
　「グルタチオン合成酵素」は、「ＧｓｈＢ」とも称される。本明細書において「グルタチオン合成酵素」と「ＧｓｈＢ」とは相互に置換可能である。
（測定条件）
　１０ｍＭ　ＡＴＰ、１５ｍＭ　γ－グルタミルシステイン、１５ｍＭ　グリシン、１０ｍＭ　硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ　塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のグルタチオンを定量する。
　高速液体クロマトグラフィーの条件は、グルタミン酸－システインリガーゼの活性測定法に関して上述したのと同じ条件を用いる。
　グルタチオン合成酵素としてはタンパク質１ｍｇあたりのグルタチオン合成酵素活性（比活性）が０．５Ｕ以上、好ましくは１Ｕ以上、さらに好ましくは５Ｕ以上、最も好ましくは１０Ｕ以上のものを使用することが好ましい。
　グルタチオン合成酵素は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来のグルタチオン合成酵素が好ましく、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の腸内細菌や、コリネ型細菌等の細菌、酵母等の真核微生物、ヒドロゲノフィルス科（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌａｌｅｓ）に属する微生物等に由来するグルタチオン合成酵素が好ましい。
　ヒドロゲノフィルス科（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌａｌｅｓ）に属する微生物に由来するグルタチオン合成酵素は、好ましくは、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物に由来するグルタチオン合成酵素であり、より好ましくはチオバチルス・デニトリフィキャンス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）に属する微生物に由来するグルタチオン合成酵素である。特に、チオバチルス・デニトリフィキャンスＡＴＣＣ２５２５９株に由来するグルタチオン合成酵素が好ましい。
（大腸菌由来のグルタチオン合成酵素又はその変異体の好ましい実施形態）
　大腸菌由来のグルタチオン合成酵素の塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１４及び配列番号１５に示す。
　グルタチオン合成酵素としてはまた、配列番号１５に示すアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素に限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、グルタチオン合成酵素活性を有する他のポリペプチドも使用できる。グルタチオン合成酵素活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１５に示すアミノ酸配列からなるグルタチオン合成酵素を用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。
　大腸菌由来のグルタチオン合成酵素又はその変異体の具体例としては、
（３－２Ａ）配列番号１５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（３－２Ｂ）配列番号１５に示すアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１５に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）であって、グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチド；
（３－２Ｃ）配列番号１５に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチド；又は
（３－２Ｄ）（３－２Ａ）～（３－２Ｃ）のいずれかのポリペプチドの、グルタチオン合成酵素活性を有する断片
であることができる。
　前記（３－２Ｄ）において断片としては、アミノ酸数が好ましくは２００以上、より好ましくは２５０以上、より好ましくは３００以上のポリペプチドであることができる。
　前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。
　前記（３－２Ｂ）において「複数個」とは、例えば、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～７個、２～５個、２～４個又は２～３個をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｂ）に関して説明した通りである
　前記（３－２Ｃ）での「配列同一性」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｃ）に関して説明した通りである。すなわち前記（３－２Ｃ）において「配列同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１５に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。
　「グルタチオン合成酵素（ＥＣ：６．３．２．３）をコードする遺伝子」とは、グルタチオン合成酵素のアミノ酸配列をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を指す。
　大腸菌に由来する、グルタチオン合成酵素の配列番号１５に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一例を配列番号１４に示す。グルタチオン合成酵素のアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列は、宿主に合わせてコドン最適化したものであってもよい。
　すなわち、大腸菌由来のグルタチオン合成酵素又はその変異体のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列の具体例としては、
（３－２Ｅ）配列番号１４に示す塩基配列；
（３－２Ｆ）配列番号１４に示す塩基配列において、１～複数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列（特に好ましくは、配列番号１４に示す塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方において合計で１～複数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加した塩基配列）であって、グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（３－２Ｇ）配列番号１４に示す塩基配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（３－２Ｈ）（３－２Ｅ）～（３－２Ｇ）のいずれかの塩基配列の、グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする部分塩基配列；
（３－２Ｉ）（３－２Ｅ）～（３－２Ｈ）のいずれかの塩基配列において、サイレント変異（コードするアミノ酸残基を変化しない塩基置換）が導入された塩基配列；
（３－２Ｊ）（３－２Ａ）～（３－２Ｄ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は、
（３－２Ｋ）（３－２Ｅ）～（３－２Ｊ）のいずれかの塩基配列をエキソン配列とし、途中に１以上のイントロン配列が介在している塩基配列
が挙げられる。
　前記（３－２Ｇ）での「配列同一性」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｇ）に関して説明した通りである。すなわち前記（３－２Ｇ）において「配列同一性」とは、二つの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１４の全塩基数に対する同一塩基の割合（％）をいう。
（チオバチルス・デニトリフィキャンス由来のグルタチオン合成酵素又はその変異体の好ましい実施形態）
　グルタチオン合成酵素の別の好適な具体例は、チオバチルス・デニトリフィキャンス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ２５２５９株に由来する野生型グルタチオン合成酵素又はその活性変異体である。チオバチルス・デニトリフィキャンスＡＴＣＣ２５２５９株の野生型グルタチオン合成酵素の塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１６及び配列番号１７に示す。前記野生型グルタチオン合成酵素の活性変異体は、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号１７に示すアミノ酸配列からなる野生型グルタチオン合成酵素を用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。
　チオバチルス・デニトリフィキャンスＡＴＣＣ２５２５９株のグルタチオン合成酵素又はその変異体の具体例としては、
（３－３Ａ）配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（３－３Ｂ）配列番号１７に示すアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号１７に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）であって、グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチド；
（３－３Ｃ）配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチド；又は
（３－３Ｄ）（３－３Ａ）～（３－３Ｃ）のいずれかのポリペプチドの、グルタチオン合成酵素活性を有する断片
であることができる。
　前記（３－３Ｄ）において断片としては、アミノ酸数が好ましくは２００以上、より好ましくは２５０以上、より好ましくは３００以上のポリペプチドであることができる。
　前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。
　前記（３－３Ｂ）において「複数個」とは、例えば、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～７個、２～５個、２～４個又は２～３個をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｂ）に関して説明した通りである
　前記（３－３Ｃ）での「配列同一性」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｃ）に関して説明した通りである。すなわち前記（３－３Ｃ）において「配列同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１７に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。
　チオバチルス・デニトリフィキャンスＡＴＣＣ２５２５９株のグルタチオン合成酵素の配列番号１７に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一例を配列番号１６に示す。グルタチオン合成酵素のアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列は、宿主に合わせてコドン最適化したものであってもよい。
　すなわち、チオバチルス・デニトリフィキャンスＡＴＣＣ２５２５９株のグルタチオン合成酵素又はその変異体のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列の具体例としては、
（３－３Ｅ）配列番号１６に示す塩基配列；
（３－３Ｆ）配列番号１６に示す塩基配列において、１～複数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列（特に好ましくは、配列番号１６に示す塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方において合計で１～複数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加した塩基配列）であって、グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（３－３Ｇ）配列番号１６に示す塩基配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（３－３Ｈ）（３－３Ｅ）～（３－３Ｇ）のいずれかの塩基配列の、グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする部分塩基配列；
（３－３Ｉ）（３－３Ｅ）～（３－３Ｈ）のいずれかの塩基配列において、サイレント変異（コードするアミノ酸残基を変化しない塩基置換）が導入された塩基配列；
（３－３Ｊ）（３－３Ａ）～（３－３Ｄ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は、
（３－３Ｋ）（３－３Ｅ）～（３－３Ｊ）のいずれかの塩基配列をエキソン配列とし、途中に１以上のイントロン配列が介在している塩基配列
が挙げられる。
　前記（３－３Ｇ）での「配列同一性」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｇ）に関して説明した通りである。すなわち前記（３－３Ｇ）において「配列同一性」とは、二つの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１６の全塩基数に対する同一塩基の割合（％）をいう。
（チオバチルス・デニトリフィキャンス由来のグルタチオン合成酵素の活性変異体の好ましい実施形態）
　グルタチオン合成酵素の別の好ましい例は、配列番号１７に示すアミノ酸配列を含むチオバチルス・デニトリフィキャンスＡＴＣＣ２５２５９株の野生型グルタチオン合成酵素の活性変異体であり、国際公開ＷＯ２０１８／０８４１６５に記載されているポリペプチドが特に好ましい。
　前記活性変異体は、具体的には、
（３－４Ａ）配列番号１７に示すアミノ酸配列のうち次の群：
１３、１７、２０、２３、３９、７０、７８、１０１、１１３、１２５、１２６、１３６、１３８、１４９、１５２、１５４、１５５、１９７、２００、２１５、２２６、２２７、２３０、２３９、２４１、２４６、２４９、２５４、２６０、２６２、２６３、２７０、２７８、２９９、３０５、３０７及び３１０番目から選択される１つもしくは複数のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列３－４Ａからなるポリペプチド；
（３－４Ｂ）前記アミノ酸配列３－４Ａにおいて、前記アミノ酸部位以外のアミノ酸のうち１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、前記アミノ酸配列３－４ＡのＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）であって、グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチド；
（３－４Ｃ）前記アミノ酸配列３－４Ａに対して、前記アミノ酸部位が一致し、前記アミノ酸部位以外の部分において８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチド；又は
（３－４Ｄ）（３－４Ａ）～（３－４Ｃ）のいずれかのポリペプチドの、グルタチオン合成酵素活性を有する断片
であることができる。
　前記（３－４Ｄ）において断片としては、アミノ酸数が好ましくは１５０以上、より好ましくは２００以上、より好ましくは３００以上のポリペプチドを用いることができる。
　前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。
　前記（３－４Ｂ）において「複数個」とは、例えば、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～７個、２～５個、２～４個又は２～３個をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｂ）に関して説明した通りである
　前記（３－４Ｃ）での「配列同一性」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｃ）に関して説明した通りである。すなわち前記（３－４Ｃ）において「配列同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、前記アミノ酸配列３－４Ａの前記アミノ酸部位以外の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。
　前記アミノ酸配列３－４Ａは、より好ましくは、配列番号１７に示すアミノ酸配列において、次の群：
１３番目がセリン、１７番目がグルタミン酸、２０番目がスレオニン、２３番目がロイシン、３９番目がスレオニン、７０番目がセリン、７８番目がロイシン、１０１番目がアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、１１３番目がヒスチジン、１２５番目がバリン、１２６番目がアスパラギン、１３６番目がスレオニン、１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、１５２番目がグルタミン、１５４番目がアスパラギン、１５５番目がロイシン、１９７番目がグルタミン、２００番目がセリン、２１５番目がアスパラギン酸、２２６番目がアルギニン、２２７番目がセリン、２３０番目がプロリン、２３９番目がセリン、２４１番目がヒスチジン、２４６番目がアルギニン、２４９番目がグルタミン酸、２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、システイン、グリシン、グルタミン、スレオニン、２６２番目がシステイン、２６３番目がアルギニン、２７０番目がイソロイシン、２７８番目がグリシン、アラニン、２９９番目がアラニン、３０５番目がグリシン、３０７番目がバリンおよび３１０番目がスレオニンに置換、
から選択される１つもしくは複数のアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列である。
　前記アミノ酸配列３－４Ａは、特に好ましくは、配列番号１７に示すアミノ酸配列のうち下記の（１）～（３５）：
（１）１３番目がセリン、
（２）１７番目がグルタミン酸、１１３番目がヒスチジン、２３０番目がプロリン、
（３）２０番目がスレオニン、２１５番目がアスパラギン酸、
（４）２０番目がスレオニン、２４１番目がヒスチジン、
（５）２３番目がロイシン、１２６番目がアスパラギン、
（６）３９番目がスレオニン、２６０番目がアラニン、
（７）７０番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（８）７８番目がロイシン、２７８番目がアラニン、
（９）１０１番目がアスパラギン、
（１０）１０１番目がグルタミン、
（１１）１０１番目がセリン、
（１２）１０１番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（１３）１０１番目がスレオニン、
（１４）１２５番目がバリン、２４９番目がグルタミン酸、
（１５）１２５番目がバリン、１５２番目がグルタミン、
（１６）１３６番目がスレオニン、
（１７）１３８番目がアラニン、１４９番目がグルタミン、２４１番目がヒスチジン、２６３番目がグルタミン、
（１８）１５４番目がアスパラギン、２４６番目がアルギニン、
（１９）１５５番目がロイシン、２３９番目がセリン、
（２０）１９７番目がグルタミン、
（２１）２００番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２２）２２６番目がアルギニン、２６０番目がアラニン、
（２３）２２７番目がセリン、２６０番目がアラニン、
（２４）２５４番目がアスパラギン酸、２６０番目がアラニン、
（２５）２６０番目がアラニン、
（２６）２６０番目がアラニン、２７８番目がグリシン、３０７番目がバリン、
（２７）２６０番目がアラニン、２９９番目がアラニン、
（２８）２６０番目がアラニン、３０５番目がグリシン、
（２９）２６０番目がアラニン、３１０番目がスレオニン、
（３０）２６０番目がシステイン、
（３１）２６０番目がグリシン、
（３２）２６０番目がグルタミン、
（３３）２６０番目がスレオニン、
（３４）２６２番目がシステイン、
（３５）２７０番目がイソロイシン、
のいずれかで示されるアミノ酸置換が導入されたアミノ酸配列である。
　前記（３－４Ａ）～（３－４Ｄ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を、「グルタチオン合成酵素（ＥＣ：６．３．２．３）をコードする遺伝子」として利用することができる。
　チオバチルス・デニトリフィキャンスＡＴＣＣ２５２５９株のグルタチオン合成酵素の配列番号１７に示すアミノ酸配列において、第２６０位のバリンがアラニンに置換された活性変異体のアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を配列番号１８に示す。チオバチルス・デニトリフィキャンスＡＴＣＣ２５２５９株のグルタチオン合成酵素の活性変異体のアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列は、宿主に合わせてコドン最適化したものであってもよい。
＜１．６．二機能性グルタチオン合成酵素＞
　二機能性グルタチオン合成酵素は、ＡＴＰ存在下でＬ－システインを基質として認識し、Ｌ－グルタミン酸と結合させることでγ－グルタミルシステインを生成する反応を触媒する活性及びＡＴＰ存在下でγ－グルタミルシステインを基質として認識し、グリシンと結合させることでＧＳＨを生成する反応を触媒する活性を併せ持つ酵素であり、当該活性を有する限りその起源、構造等は特に限定されない。本明細書において、当該活性を、二機能性グルタチオン合成酵素活性という。当該活性の１Ｕは、３０℃で１分間に１μｍｏｌのＧＳＨを生成する活性を意味し、以下の測定条件で測定したものである。
　「二機能性グルタチオン合成酵素」は「ＧｓｈＦ」とも称される。本明細書において「二機能性グルタチオン合成酵素」と「ＧｓｈＦ」とは相互に置換可能である。
（測定条件）
　１０ｍＭ　ＡＴＰ、１５ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸、１５ｍＭ　Ｌ－システイン、１５ｍＭ　グリシン、１０ｍＭ　硫酸マグネシウムを含有する５０ｍＭ　トリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に酵素液を添加して３０℃で保温することで反応を行い、６Ｎ　塩酸を添加することで反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィーを用いて反応液中のグルタチオンを定量する。
　高速液体クロマトグラフィーの条件は、グルタミン酸－システインリガーゼの活性測定法に関して上述したのと同じ条件を用いる。
　二機能性グルタチオン合成酵素としてはタンパク質１ｍｇあたりの二機能性グルタチオン合成酵素活性（比活性）が０．５Ｕ以上、好ましくは１Ｕ以上、さらに好ましくは５Ｕ以上、最も好ましくは１０Ｕ以上のものを使用することが好ましい。
　二機能性グルタチオン合成酵素の起源は特に限定されず微生物、動物、植物等に由来するものを用いることができる。微生物由来の二機能性グルタチオン合成酵素が好ましい。特に細菌由来二機能性グルタチオン合成酵素が好ましく、具体的には、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｕｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌；ラクトバシルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）等のラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌；デスルフォタレア・サイクロフィラ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ　ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）等のデスルフォタレア（Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ）属細菌；クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）等のクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌；リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）等のリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌；エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）等のエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌；パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）等のパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属細菌；マンハイミア・スクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ　ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｅｃｅｎｓ）等のマンハイミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）属細菌；及び、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｏｍｎｕｓ）等のヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属細菌からなる群から選択される少なくとも１種に由来する二機能性グルタチオン合成酵素が好ましい。
　ストレプトコッカス・アガラクチエ由来の二機能性グルタチオン合成酵素の塩基配列、及び該塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の具体例を、それぞれ配列番号１９及び配列番号２０に示す。なお配列番号１９の塩基配列は、配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるストレプトコッカス・アガラクチエ由来の二機能性グルタチオン合成酵素をコードする塩基配列であって、大腸菌でのコドン使用頻度に適合させた塩基配列である。
　二機能性グルタチオン合成酵素としてはまた、配列番号２０に示すアミノ酸配列からなる二機能性グルタチオン合成酵素に限らず、その活性変異体や他種オルソログ等の、二機能性グルタチオン合成酵素活性を有する他のポリペプチドも使用できる。二機能性グルタチオン合成酵素活性を有する他のポリペプチドは、好ましくは、上記の活性測定条件において、配列番号２０に示すアミノ酸配列からなる二機能性グルタチオン合成酵素を用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の活性を示すポリペプチドである。
　二機能性グルタチオン合成酵素の具体例としては、
（４Ａ）配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（４Ｂ）配列番号２０に示すアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（特に好ましくは、配列番号２０に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方において合計で１～複数個のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド）であって、二機能性グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチド；
（４Ｃ）配列番号２０に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、二機能性グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチド；又は
（４Ｄ）（４Ａ）～（４Ｃ）のいずれかのポリペプチドの、二機能性グルタチオン合成酵素活性を有する断片
であることができる。
　前記（４Ｄ）において断片としては、アミノ酸数が好ましくは４００以上、より好ましくは５００以上、より好ましくは６００以上、より好ましくは７００以上、より好ましくは７３０以上のポリペプチドを用いることができる。
　前記各ポリペプチドは適宜化学修飾されていてもよい。
　前記（４Ｂ）において「複数個」とは、例えば、２～２０個、２～１５個、２～１０個、２～７個、２～５個、２～４個又は２～３個をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｂ）に関して説明した通りである
　前記（４Ｃ）での「配列同一性」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｃ）に関して説明した通りである。すなわち前記（４Ｃ）において「配列同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号２０に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。
　「二機能性グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子」とは、二機能性グルタチオン合成酵素のアミノ酸配列をコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を指す。
　二機能性グルタチオン合成酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列の具体例としては、
（４Ｅ）配列番号１９に示す塩基配列；
（４Ｆ）配列番号１９に示す塩基配列において、１～複数個の塩基が付加、欠失、又は置換された塩基配列（特に好ましくは、配列番号１９に示す塩基配列の５’末端及び３’末端の一方又は両方において合計で１～複数個の塩基が置換、欠失及び／又は付加、好ましくは欠失及び／又は付加した塩基配列）であって、二機能性グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（４Ｇ）配列番号１９に示す塩基配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって、二機能性グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；
（４Ｈ）（４Ｅ）～（４Ｇ）のいずれかの塩基配列の、二機能性グルタチオン合成酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする部分塩基配列；
（４Ｉ）（４Ｅ）～（４Ｈ）のいずれかの塩基配列において、サイレント変異（コードするアミノ酸残基を変化しない塩基置換）が導入された塩基配列；
（４Ｊ）（４Ａ）～（４Ｄ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列；又は、
（４Ｋ）（４Ｅ）～（４Ｊ）のいずれかの塩基配列をエキソン配列とし、途中に１以上のイントロン配列が介在している塩基配列
　前記（４Ｇ）での「配列同一性」は、＜１．１．γ－グルタミルトランスフェラーゼ＞の欄で（１Ｇ）に関して説明した通りである。すなわち前記（４Ｇ）において「配列同一性」とは、二つの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号１９の全塩基数に対する同一塩基の割合（％）をいう。
＜２．第一の開示＞
　本明細書の第一の開示に係るγ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンの製造方法、並びに、原核微生物株について説明する。
＜２．１．本明細書の第一の開示に係る原核微生物株＞
　第一の開示の一以上の実施形態は、グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子、グルタチオン合成酵素遺伝子、及び、二機能性グルタチオン合成酵素遺伝子から選択される１以上の遺伝子の発現量が野生株と比較して増加しており、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを過剰生産することが可能な原核微生物株に関する。
　第一の開示の一以上の実施形態に係る原核微生物株は、培地中で培養することにより、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを過剰生産し、前記培地中に蓄積させることができるため、前記ペプチドを効率的に生産する目的で利用することができる。第一の開示の一以上の実施形態に係る原核微生物は、システイン及びシスチンの合計濃度が０．５ｇ／Ｌ以下の培地中、或いは、システイン又はシスチンを添加することなく調製された培地中で培養した場合であっても、前記ペプチドを生産することが可能であるため、前記ペプチドの生産コストを低減することができる。
　第一の開示の一以上の実施形態に係る原核微生物株は、好ましくは、前記１以上の遺伝子の誘導発現により、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを過剰生産することが可能な原核微生物株である。第一の開示の一以上の実施形態に係る原核微生物株は、培地中で培養し、前記１以上の遺伝子を誘導発現することにより、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを過剰生産し、前記培地中に蓄積させることができるため、前記ペプチドを効率的に生産する目的で利用することができる。
　第一の開示の一以上の実施形態に係る原核微生物株において遺伝子発現量が増加している酵素は、グルタミン酸－システインリガーゼ、グルタチオン合成酵素、及び、二機能性グルタチオン合成酵素から選択される１以上の酵素であればよい。各酵素の具体例は既述の通りである。前記原核微生物株を、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン及び／又はγ－グルタミルシスチンの製造に用いる目的で利用する場合、グルタミン酸－システインリガーゼ、及び／又は、二機能性グルタチオン合成酵素の遺伝子発現量が野生株と比較して増加していることが好ましい。前記原核微生物株を、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンの製造に用いる目的で利用する場合、グルタミン酸－システインリガーゼ及びグルタチオン合成酵素の遺伝子発現量が親株と比較して増加しているか、或いは、二機能性グルタチオン合成酵素の遺伝子発現量が野生株と比較して増加していることが好ましい。
　第一の開示の一以上の実施形態において、宿主となる原核微生物株としては、細菌、特に、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、又はコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物の細胞が挙げられ、特に好ましくはエシェリヒア属に属する微生物の細胞であり、最も好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の細胞である。宿主となる原核微生物株はまた、腸内細菌であってもよい。第一の開示の一以上の実施形態に係る原核微生物株は、原核微生物に所定の遺伝子を保持させた形質転換体であることができる。
　「野生株」とは、グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子、グルタチオン合成酵素遺伝子、及び、二機能性グルタチオン合成酵素遺伝子から選択される１以上の遺伝子を導入する前の宿主株を指し、「親株」と称することもできる。
　ここで「グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子、グルタチオン合成酵素遺伝子、及び、二機能性グルタチオン合成酵素遺伝子から選択される１以上の遺伝子の発現量が野生株と比較して増加して」いるとは、野生株が元来前記１以上の遺伝子を発現する場合に、前記１以上の遺伝子の発現量が野生株と比較して増加していることと、野生株が元来前記１以上の遺伝子を発現しない場合に、前記１以上の遺伝子を発現する能力が野生株に付与されていることの両方を包含する。
　前記１以上の遺伝子の発現量の増加は、原核微生物株の細胞内での、前記１以上の遺伝子のコピー数を増加させることや、原核微生物株の細胞のゲノムＤＮＡ上において前記１以上の遺伝子の発現を制御するプロモーターをより強力な発現プロモーターに置換することにより達成することができる。
　原核微生物の細胞内での、前記１以上の遺伝子のコピー数の増加は、
（１）前記１以上の遺伝子を含む発現ベクターを、原核微生物の細胞内に導入すること、あるいは
（２）前記１以上の遺伝子を、原核微生物の細胞のゲノムＤＮＡに導入すること
により達成することができる。
　前記（１）の態様で用いる発現ベクターとしては、前記１以上の遺伝子を含むプラスミドベクター等が使用できる。発現ベクターは、原核微生物細胞内において自律複製可能であることが好ましい。発現ベクターは、グルタミン酸―システインリガーゼ、グルタチオン合成酵素、及び、二機能性グルタチオン合成酵素から選択される１以上の酵素をコードするＤＮＡと、該ＤＮＡを転写できる位置に機能的に連結されたプロモーターとを含有することが好ましい。発現ベクターは、好ましくは、原核微生物細胞中で自律複製可能であり、且つ、プロモーター、リボソーム結合配列、前記１以上の酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び転写終結配列により構成された塩基配列を含む組換えＤＮＡである。
　好適なプラスミドベクターとしてはｐＱＥＫ１、ｐＣＡ２４Ｎ（ＤＮＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ，１２，１９１－２９９（２００５））、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４（（株）ニッポンジーンから入手可能）、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０及びｐＱＥ９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＴｉｐＱＣ１（Ｑｉａｇｅｎまたは北海道システムサイエンスから入手可能）、ｐＴｉｐＲＴ２（北海道システムサイエンスから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ及びｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０及びｐＲＩＴ５（Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能）；ｐＲＳＦ（ＭＥＲＣＫから入手可能）；並びに、ｐＡＣ（（株）ニッポンジーンから入手可能）、ｐＵＣＮ１８（ｐＵＣ１８（（株）タカラバイオから入手可能）を改変して作製可能）、ｐＳＴＶ２８（（株）タカラバイオから入手可能）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第９４／０３６１３号公報）等が例示できる。
　前記発現ベクターは、好ましくは、前記１以上の遺伝子の転写を制御するプロモーターを含む。
　第一の開示の一以上の実施形態においてプロモーターは誘導性プロモーターであることが好ましい。
　誘導性プロモーターとしては、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーター、光の照射下で遺伝子発現を誘導する光誘導性プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター（アラビノース誘導性）、ｒｈａＢＡＤプロモーター（ラムノース誘導性）、ｔｅｔプロモーター（薬剤誘導性）、ｐｅｎＰプロモーター（薬剤誘導性）、ｃｓｐＡプロモーター（低温に応答する温度誘導性プロモーター）、オペレーター配列としてｔｅｔＯ又はｌａｃＯオペレーターを含むプロモーター等が例示でき、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｒｈａＢＡＤプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター、或いは、オペレーター配列としてｔｅｔＯ又はｌａｃＯオペレーターを含むプロモーターが好ましい。
　ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの具体例としては、Ｔ５プロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｔａｃプロモーター等が例示できる。誘導性プロモーターとしてはＩＰＴＧ誘導性プロモーターが特に好ましく、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターのなかでも特に、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター又はｔａｃプロモーターが好ましい。
　プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターを高活性型に改変したプロモーターを用いることもできる。例えば、プロモーター領域内の－３５、－１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開WO00/18935号）。高活性型プロモーターの例としては、各種ｔａｃ様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文 (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)) 等に記載されている
　前記１以上の遺伝子を含む発現ベクターを原核微生物の細胞内に導入する場合、細胞内の前記発現ベクターのコピー数が、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、より好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、より好ましくは１５以上、より好ましくは２０以上であることが好ましい。
　原核微生物の細胞において前記遺伝子のうち２以上の遺伝子の発現量を増加させる場合、１つの発現ベクター内に、前記２以上の遺伝子が含まれてもよく、この場合、１つの発現プロモーターの制御下に、前記２以上の遺伝子が配置されていてもよい。また、２以上の遺伝子が、それぞれ別の発現ベクター内に含まれてもよい。
　前記（２）の態様により、前記１以上の遺伝子を、原核微生物の細胞のゲノムＤＮＡに導入する場合、相同組み換えを利用することができる。
　原核微生物の細胞のゲノムＤＮＡ上において前記１以上の遺伝子のプロモーターをより強力な発現プロモーターに置換する場合、発現プロモーターとしては、発現ベクターと同様のプロモーター、より好ましくは誘導性プロモーターを利用できる。好ましいプロモーターの具体例は上記の通りである。
　第一の開示の一以上の実施形態に係る原核微生物株において、前記１以上の遺伝子の発現量の増加の程度は特に限定されない。前記１以上の遺伝子の発現量は、細胞から抽出した前記１以上の遺伝子に対応するｍＲＮＡ（すなわち、グルタミン酸－システインリガーゼ、グルタチオン合成酵素、及び、二機能性グルタチオン合成酵素から選択される１以上の酵素のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡ）の量として表すことができる。このｍＲＮＡに基づく発現量は、適当な内部標準タンパク質をコードするｍＲＮＡの量に対する相対値として表すことが好ましい。グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子の発現量が増加している実施形態では、原核微生物株中のグルタミン酸－システインリガーゼの発現量（好ましくは、原核微生物株中のグルタミン酸－システインリガーゼのｍＲＮＡ量を、同一株中の内部標準タンパク質をコードするｍＲＮＡ量で割った相対値）が、野生株中のグルタミン酸－システインリガーゼの発現量（好ましくは、野生株中のグルタミン酸－システインリガーゼのｍＲＮＡ量を、同一株中の内部標準タンパク質をコードするｍＲＮＡ量で割った相対値）の、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、より好ましくは２０倍以上である。グルタチオン合成酵素遺伝子の発現量が増加している実施形態では、原核微生物株中のグルタチオン合成酵素の発現量（好ましくは、原核微生物株中のグルタチオン合成酵素のｍＲＮＡ量を、同一株中の内部標準タンパク質をコードするｍＲＮＡ量で割った相対値）は、野生株中のグルタチオン合成酵素の発現量（好ましくは、野生株中のグルタチオン合成酵素のｍＲＮＡ量を、同一株中の内部標準タンパク質をコードするｍＲＮＡ量で割った相対値）の好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、より好ましくは２０倍以上である。内部標準タンパク質としては、ハウスキーピング遺伝子として知られるｈｃａＴ（配列番号２７）がコードするタンパク質が例示できる。
　第一の開示の一以上の実施形態に係る原核微生物株では、より好ましくは、システイン、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン又は酸化型グルタチオンを分解する活性を有する酵素の遺伝子、又は、グルタチオン取り込みトランスポーター遺伝子の発現量が野生株よりも低下している、又は、前記遺伝子の発現が喪失している。このような原核微生物株を培養する場合、前記ペプチドが培地中に蓄積しやすい。
　γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン又は酸化型グルタチオンを分解する活性を有する酵素としては、γ－グルタミルトランスフェラーゼ及びトリペプチドペプチダーゼが例示できる。システインを分解する活性を有する酵素の遺伝子としてはトリプトファナーゼ遺伝子ｔｎａＡが例示できる。グルタチオン取り込みトランスポーター遺伝子としてはｙｌｉＡＢＣＤが例示できる。
　γ－グルタミルトランスフェラーゼの具体例は既述の通りである。
　トリペプチドペプチダーゼの具体例は既述の通りである。
　システイン、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン又は酸化型グルタチオンを分解する活性を有する酵素の遺伝子、又は、グルタチオン取り込みトランスポーター遺伝子の発現量が野生株よりも低下した、又は、前記遺伝子の発現が喪失した原核微生物株は、原核微生物株のゲノムＤＮＡ上の前記酵素をコードする塩基配列に塩基の欠失、置換又は付加を導入する方法により製造することができる。そのような方法としては相同組み換えを利用した方法を挙げることができ、具体的には、特開２００４－３４４０２９に記載された方法が使用できる。
　上述した第一の開示の一以上の実施形態に係る原核微生物株の、より好ましい実施形態は、
　誘導性プロモーターに発現可能に連結されたグルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子、グルタチオン合成酵素遺伝子、及び、二機能性グルタチオン合成酵素遺伝子から選択される１以上の遺伝子を保持する原核微生物株であって、
　前記誘導性プロモーターが、前記１以上の遺伝子がグルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子である場合の前記原核微生物株によるグルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子の転写量を野生株の２０倍以上とする誘導性プロモーターであり、
　前記１以上の遺伝子の誘導発現により、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを過剰生産することが可能な原核微生物株である。
　このより好ましい実施形態に係る原核微生物株において、誘導性プロモーターに発現可能に連結された前記１以上の遺伝子は、原核微生物株のゲノムＤＮＡの一部に含まれた状態で保持されていても良いし、原核微生物株に存在する発現ベクターに含まれた状態で保持されていてもよい。発現ベクターの具体例は既述の通りである。
　誘導性プロモーターとしては、前記１以上の遺伝子がグルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子である場合の前記原核微生物株によるグルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子の転写量を野生株の２０倍以上とするものであれば特に限定されない。ここで転写量はｍＲＮＡ量に基づき評価することができる。ここで、誘導性プロモーターが所定の発現能を有することを確認するためのグルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子は、野生株が有するグルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子と同種であることが好ましい。
　このような高発現誘導性プロモーターは、上記の誘導性プロモーターの例のなかから選択することができるが、好ましくは、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、光誘導性プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｒｈａＢＡＤプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター、或いは、オペレーター配列としてｔｅｔＯ又はｌａｃＯオペレーターを含むプロモーターが例示できる。高発現誘導性プロモーターとしてはＩＰＴＧ誘導性プロモーターが特に好ましく、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターのなかでも特にＴ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター又はｔａｃプロモーターが好ましい。
　高発現誘導性プロモーターとしては、上記のように、各種レポーター遺伝子を用いることにより高活性型に改変した誘導性プロモーターを用いることもできる。
＜２．２．本明細書の第一の開示に係る、細胞培養による有用物質の製造方法＞
　第一の開示の更なる一以上の実施形態は、
　γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオン（以下「目的ペプチド」と称する）の製造方法であって、
　グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子、グルタチオン合成酵素遺伝子、及び、二機能性グルタチオン合成酵素遺伝子から選択される１以上の遺伝子の発現量が野生株と比較して増加している原核微生物株を、システイン及びシスチンの合計濃度が０．５ｇ／Ｌ以下の培地中で培養することを含む方法に関する。
　この方法で用いる前記原核微生物株は、好ましくは、前記１以上の遺伝子の誘導発現により、前記目的ペプチドを過剰生産することが可能な原核微生物株である。
　第一の開示の別の更なる一以上の実施形態は、
　前記目的ペプチドの製造方法であって、
　グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子、グルタチオン合成酵素遺伝子、及び、二機能性グルタチオン合成酵素遺伝子から選択される１以上の遺伝子の発現量が野生株と比較して増加している原核微生物株を培地中で培養することを含み、
　前記培地中にシステイン又はシスチンを添加することを含まない方法に関する。
　この方法で用いる前記原核微生物株は、好ましくは、前記１以上の遺伝子の誘導発現により、前記目的ペプチドを過剰生産することが可能な原核微生物株である。
　この方法は、上述した第一の開示の一以上の実施形態に係る原核微生物株は、システイン及びシスチンの合計濃度が０．５ｇ／Ｌ以下という低濃度の培地、或いは、システイン又はシスチンを添加する工程を行うことなく調製された培地中で培養した場合でも、システイン又はシスチンを構成アミノ酸として含む前記目的ペプチドを培地中に蓄積することができる、という予想外の知見に基づく。この方法によれば、低コストで前記目的ペプチドを製造することが可能である。
　前記方法で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど第一の開示に用いられる微生物の増殖、及び前記目的ペプチドの生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
　炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよく、グルコース、フラクトースのような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを挙げることができる。
　窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などを挙げることができる。
　無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウムなどを挙げることができる。
　ビタミンとしては、ビオチンやチアミンなどを挙げることができる。さらに必要に応じて第一の開示の微生物が生育に要求する物質（例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸）を添加することができる。
　前記培地には硫黄源及びグリシンの少なくとも一方、好ましくは両方、を添加することが好ましい。グリシンの培地への添加濃度としては、例えば１００ｍＭ～２０００ｍＭ、好ましくは４００ｍＭ～１２００ｍＭが挙げられる。硫黄源の培地への添加濃度としては、例えば１００ｍＭ～２０００ｍＭ、好ましくは４００ｍＭ～１２００ｍＭが挙げられる。
　硫黄源としては、硫酸、チオ硫酸、亜硫酸、次亜硫酸又は硫化物或いはその塩等の無機硫黄化合物の１種又は複数種を添加することができる。硫酸、チオ硫酸、亜硫酸、次亜硫酸又は硫化物は、フリー体であってもよく、塩であってもよく、それらの任意の混合物であってもよい。塩としては、特に制限されず、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、カリウム塩等が挙げられる。 
　グリシンはフリー体であってもよく、塩であってもよく、それらの任意の混合物であってもよい。塩としては、特に制限されず、硫酸塩、塩酸塩等が挙げられる。
　硫黄源及び／又はグリシンは培養開始時又は培養の途中に培地に添加することができる。硫黄源及び／又はグリシンは一度に培地に添加してもよいし、連続的或いは間欠的に培地に添加してもよい。
　硫黄源及び／又はグリシンは、培養の全期間において培地に含有されていてもよく、培養の一部の期間においてのみ培地に含有されていてもよい。例えば、硫黄源およびグリシンの添加量は、前記目的ペプチドを生産蓄積させる段階の全期間において前記の範囲である必要はなく、培養途中に含有量が前記の範囲となるよう硫黄源及び／又はグリシンを培地に含有させ、培養時間の経過に伴い硫黄源及び／又はグリシン含有量が減少してもよい。また、硫黄源及び／又はグリシンを連続的或いは間欠的に追加添加してもよい。なお、硫黄源及び／又はグリシン以外の培地成分についても、培養期間中に濃度が変動してもよく、追加添加されてもよい。
　培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は２０～５０℃、好ましくは２０～４２℃、より好ましくは２８～３８℃である。培養時のｐＨは５～９、好ましくは６～７．５である。培養時間は、３時間～５日間、好ましくは５時間～３日間である。
　培養物中に蓄積した前記目的ペプチドは、通常の精製方法によって採取することができる。例えば、培養終了後、遠心分離などで培養物中の菌体や固形物を除いたあと、イオン交換、濃縮、結晶分別によって採取することができる。
＜３．第二の開示＞
　本明細書の第二の開示に係る微生物及びグルタチオンの製造方法について説明する。
　本明細書において「グルタチオン」とは、還元型グルタチオンであってもよいし、酸化型グルタチオンであってもよいし、還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンとの混合物であってもよい。本明細書において「グルタチオン」と「還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオン」とは相互に置換可能である。
＜３．１．宿主微生物＞
　第二の開示の１以上の実施形態に係る、下記の［１］の遺伝子及び［２］の遺伝子を欠損し、且つ、［３］の遺伝子又は［４］の遺伝子の発現が強化された微生物の、宿主（親株）となる微生物は、好ましくは細菌である。前記細菌は腸内細菌であってもよい。前記細菌は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌等のグラム陰性細菌であってもよいし、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌等のグラム陽性細菌であってもよいが、好ましくはグラム陰性細菌であり、特に好ましくは大腸菌である。
　第二の開示の１以上の実施形態に係る微生物は、微生物において所定の遺伝子を欠損させ、且つ、所定の遺伝子を発現可能に保持させた形質転換体であることができる。
＜３．２．本明細書の第二の開示に係る微生物＞
　第二の開示の１以上の実施形態は、以下の［１］の遺伝子及び［２］の遺伝子を欠損し、且つ、［３］遺伝子又は［４］の遺伝子の発現が強化された微生物：
［１］γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．２．２）をコードする遺伝子；
［２］グルタチオンレダクターゼ（ＥＣ：１．８．１．７）をコードする遺伝子；
［３］グルタミン酸－システインリガーゼ（ＥＣ：６．３．２．２）をコードする遺伝子、及び、グルタチオン合成酵素（ＥＣ：６．３．２．３）をコードする遺伝子；
［４］二機能性グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子、
に関する。
　前記微生物は、発酵によるグルタチオン生産能が高いため、グルタチオンの製造に適している。前記微生物は、培地中での培養により、グルタチオンを生産することができる。
　前記微生物は、より好ましくは、更に以下の［５］の遺伝子を欠損した微生物である。
［５］トリペプチドペプチダーゼ（ＥＣ：３．４．１１．４）をコードする遺伝子。
　更にトリペプチドペプチダーゼ遺伝子を欠損している前記微生物は、グルタチオン生産能が特に高いため好ましい。
　第二の開示の１以上の実施形態に係る微生物の宿主となる微生物は既述の通りである。
　第二の開示の１以上の実施形態に係る微生物における所定の遺伝子の欠損について説明する。
　第二の開示の１以上の実施形態に係る微生物における、γ－グルタミルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及びグルタチオンレダクターゼをコードする遺伝子、或いは更に、トリペプチドペプチダーゼをコードする遺伝子（以下「欠損対象遺伝子」と称する場合がある）の「欠損」とは、前記欠損対象遺伝子がコードする酵素の活性が親株と比較して低下していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。第二の開示の１以上の実施形態に係る微生物は、前記欠損対象遺伝子の機能が失われている状態、または、当該機能が減少している状態にある微生物であり、具体的には、前記欠損対象遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質の発現量が低下している状態や、前記欠損対象遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質が、ｍＲＮＡまたはタンパク質として正常に機能しない状態にある微生物が挙げられる。
　前記欠損対象遺伝子の欠損は、例えば、微生物親株の遺伝子を人為的に改変することにより達成できる。そのような改変は、例えば、突然変異処理、遺伝子組換え技術、ＲＮＡｉを用いた遺伝子発現抑制処理、遺伝子編集等により達成できる。
　突然変異処理としては、紫外線照射、または、Ｎ－メチル－Ｎ'－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤による処理が挙げられる。
　遺伝子組換え技術としては、例えば、公知の技術（FEMS Microbiology Letters 165 (1998) 335-340、JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Dec. 1995, p7171-7177、Curr Genet 1986; 10(8):573-578、WO 98/14600等）を利用できる。
　γ－グルタミルトランスフェラーゼ、グルタチオンレダクターゼ、或いは、トリペプチドペプチダーゼをコードする遺伝子とは、各タンパク質のアミノ酸配列のコード領域だけでなく、その発現調節配列（プロモーター配列等）、エクソン配列、イントロン配列等を区別することなく示す。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。
　第二の開示における前記欠損対象遺伝子の欠損は、より好ましくは、微生物のゲノムＤＮＡにおける前記欠損対象遺伝子の欠損である。前記欠損対象遺伝子の欠損としては、発現調節配列の一部または全部の欠損であってもよいし、前記酵素のアミノ酸配列のコード領域の一部または全部の欠損であってもよい。ここで「欠損」とは、欠失または損傷を意味し、好ましくは欠失である。
　微生物親株のゲノムＤＮＡにおいて、前記欠損対象遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。前記欠損対象遺伝子がコードする酵素のアミノ酸配列のコード領域の一部または全部を欠失させる場合、酵素活性の低下が達成できる限り、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域を欠失させてもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。好ましい実施形態では、ゲノムＤＮＡにおいて、前記欠損対象遺伝子のうちアミノ酸配列のコード領域および／または発現調節配列の少なくとも一部、例えば、コード領域および／または発現調節配列の全体の塩基数に対して好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは１００％の塩基数からなる領域、が欠失した微生物である。特に好ましくは、ゲノムＤＮＡにおいて、前記欠損対象遺伝子のうち開始コドンから終止コドンまでの領域が欠損した微生物である。
　また、酵素活性が低下するような、前記欠損対象遺伝子の欠損の他の例としては、ゲノムＤＮＡ上の前記欠損対象遺伝子のアミノ酸配列コード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１～２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等の、前記遺伝子の損傷が例示できる。
　また、酵素活性が低下するような、前記欠損対象遺伝子の欠損は、例えば、ゲノムＤＮＡ上の前記欠損対象遺伝子の発現調節配列またはアミノ酸配列コード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の機能を低下または消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、マーカー遺伝子やグルタチオン等のγ－グルタミル化合物の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
　ゲノムＤＮＡ上の前記欠損対象遺伝子を上記のように欠損させることは、例えば、前記欠損対象遺伝子を、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した不活性遺伝子を作製し、該不活性遺伝子を含む組換えＤＮＡで微生物を形質転換して、不活性遺伝子とゲノムＤＮＡ上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、ゲノムＤＮＡ上の遺伝子を不活性遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。また、前記組換えＤＮＡは、制限酵素で切断する等により直鎖状にしておくと、ゲノムＤＮＡに組換えＤＮＡが組み込まれた株を効率よく取得することができる。不活性遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下または消失する。
　また、例えば、任意の配列を含む線状ＤＮＡであって、当該任意の配列の両端にゲノムＤＮＡ上の置換対象部位（典型的には、前記欠損対象遺伝子の一部または全部）の上流および下流の配列を備える線状ＤＮＡ、或いは、ゲノムＤＮＡ上の前記置換対象部位の上流および下流の配列を直結した線状ＤＮＡで微生物を形質転換して、微生物のゲノムＤＮＡの置換対象部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、１ステップで置換対象部位を前記線状ＤＮＡの配列に置換することができる。前記任意の配列には、例えば、マーカー遺伝子配列を含んでもよい。マーカー遺伝子は、その後、必要により除去してもよい。マーカー遺伝子を除去する場合には、マーカー遺伝子を効率的に除去できるよう、相同組換え用の配列をマーカー遺伝子の両端に付加しておいてもよい。
　微生物において前記欠損対象遺伝子が欠損していることの確認は、前記欠損対象遺伝子がコードする酵素の活性の低下により確認することができる。前記酵素の活性が低下したことの確認は、前記酵素の活性を測定することによって行うことができる。例えば、グルタチオンレダクターゼの活性は、公知の手法（コスモバイオ社製Glutathione Reductase Assay Kit品番7510-100-K等）により測定することができる。
　前記欠損対象遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を親株と比較することによって行うことができる。ｍＲＮＡの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ－ＰＣＲ等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。ｍＲＮＡの量は、親株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下しているのが好ましい。
　前記欠損対象遺伝子がコードする酵素の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。第二の開示の１以上の実施形態に係る微生物では、前記欠損対象遺伝子がコードする酵素の量は、親株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下しているのが好ましい。
　続いて、第二の開示の１以上の実施形態に係る微生物における所定の遺伝子の発現の強化について説明する。
　所定の発現強化遺伝子（グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子及びグルタチオン合成酵素遺伝子、或いは、二機能性グルタチオン合成酵素遺伝子）の「発現が強化された」微生物とは、該微生物の親株（野生株）が元来前記発現強化遺伝子を発現する場合に、前記発現強化遺伝子の発現量が親株と比較して増加していることと、親株が元来前記発現強化遺伝子を発現しない場合に、前記発現強化遺伝子を発現する能力が親株に付与されていることの両方を包含する。
　前記発現強化遺伝子の発現量の増加は、微生物の細胞内での、前記発現強化遺伝子のコピー数を増加させることや、微生物の細胞のゲノムＤＮＡ上において前記発現強化遺伝子の発現を制御するプロモーターをより強力な発現プロモーターに置換することにより達成することができる。
　微生物の細胞内での、前記発現強化遺伝子のコピー数の増加は、
（Ａ）前記発現強化遺伝子を含む発現ベクターを、微生物の細胞内に導入すること、或いは、
（Ｂ）前記発現強化遺伝子を、微生物の細胞のゲノムＤＮＡに導入すること
により達成することができる。
　前記（Ａ）の態様で用いる発現ベクターとしては、前記発現強化遺伝子を含むプラスミドベクター等が使用できる。発現ベクターは、微生物細胞内において自律複製可能であることが好ましい。発現ベクターは、グルタミン酸－システインリガーゼ、グルタチオン合成酵素、及び、二機能性グルタチオン合成酵素から選択される１以上の酵素をコードするＤＮＡと、該ＤＮＡを転写できる位置に機能的に連結されたプロモーターとを含有することが好ましい。発現ベクターは、好ましくは、微生物細胞中で自律複製可能であり、且つ、プロモーター、リボソーム結合配列、前記１以上の酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び転写終結配列により構成された塩基配列を含む組換えＤＮＡである。
　第二の開示の１以上の実施形態に係る微生物は、好ましくは、前記発現強化遺伝子をコードする塩基配列を含む発現ベクターを保持する。当該微生物は、前記発現ベクターから、前記発現強化遺伝子を発現可能である。
　好適なプラスミドベクターとしてはｐＱＥＫ１、ｐＣＡ２４Ｎ（ＤＮＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ，１２，１９１－２９９（２００５））、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４（（株）ニッポンジーンから入手可能）、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０及びｐＱＥ９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＴｉｐＱＣ１（Ｑｉａｇｅｎまたは北海道システムサイエンスから入手可能）、ｐＴｉｐＲＴ２（北海道システムサイエンスから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ及びｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０及びｐＲＩＴ５（Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能）；ｐＲＳＦ（ＭＥＲＣＫから入手可能）；並びに、ｐＡＣ（（株）ニッポンジーンから入手可能）、ｐＵＣＮ１８（ｐＵＣ１８（（株）タカラバイオから入手可能）を改変して作製可能）、ｐＳＴＶ２８（（株）タカラバイオから入手可能）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第９４／０３６１３号公報）等が例示できる。
　前記発現ベクターは、好ましくは、前記発現強化遺伝子の転写を制御するプロモーターを含む。
　第二の開示の１以上の実施形態においてプロモーターは誘導性プロモーターであることが好ましい。
　誘導性プロモーターとしては、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーター、光の照射下で遺伝子発現を誘導する光誘導性プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター（アラビノース誘導性）、ｒｈａＢＡＤプロモーター（ラムノース誘導性）、ｔｅｔプロモーター（薬剤誘導性）、ｐｅｎＰプロモーター（薬剤誘導性）、ｃｓｐＡプロモーター（低温に応答する温度誘導性プロモーター）、オペレーター配列としてｔｅｔＯ又はｌａｃＯオペレーターを含むプロモーター等が例示でき、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｒｈａＢＡＤプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター、或いは、オペレーター配列としてｔｅｔＯ又はｌａｃＯオペレーターを含むプロモーターが好ましい。
　ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの具体例としては、Ｔ５プロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｔａｃプロモーター等が例示できる。誘導性プロモーターとしてはＩＰＴＧ誘導性プロモーターが特に好ましく、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターのなかでも特に、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター又はｔａｃプロモーターが好ましい。
　プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターを高活性型に改変したプロモーターを用いることもできる。例えば、プロモーター領域内の－３５、－１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開WO00/18935号）。高活性型プロモーターの例としては、各種ｔａｃ様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文 (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)) 等に記載されている。
　前記発現強化遺伝子を含む発現ベクターを微生物の細胞内に導入する場合、細胞内の前記発現ベクターのコピー数が、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、より好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、より好ましくは１５以上、より好ましくは２０以上であることが好ましい。
　微生物の細胞において前記発現強化遺伝子のうち２以上の発現量を増加させる場合、１つの発現ベクター内に、２以上の遺伝子が含まれてもよく、この場合、１つの発現プロモーターの制御下に、２以上の遺伝子が配置されていてもよい。また、２以上の遺伝子が、それぞれ別の発現ベクター内に含まれてもよい。
　前記（Ｂ）の態様により、前記発現強化遺伝子を、微生物の細胞のゲノムＤＮＡに導入する場合、相同組換えを利用することができる。
　微生物の細胞のゲノムＤＮＡ上において前記発現強化遺伝子のプロモーターをより強力な発現プロモーターに置換する場合、発現プロモーターとしては、発現ベクターと同様のプロモーター、より好ましくは誘導性プロモーターを利用できる。好ましいプロモーターの具体例は上記の通りである。
　第二の開示の１以上の実施形態に係る微生物において、前記発現強化遺伝子の発現の強化（発現量の増加）の程度は特に限定されない。前記発現強化遺伝子の発現量は、細胞から抽出した前記発現強化遺伝子に対応するｍＲＮＡ（すなわち、グルタミン酸－システインリガーゼ、グルタチオン合成酵素、及び、二機能性グルタチオン合成酵素から選択される１以上の酵素のアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡ）の量として表すことができる。このｍＲＮＡに基づく発現量は、適当な内部標準タンパク質をコードするｍＲＮＡの量に対する相対値として表すことが好ましい。グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子の発現が強化された微生物の１以上の実施形態では、微生物中のグルタミン酸－システインリガーゼの発現量（好ましくは、微生物中のグルタミン酸－システインリガーゼのｍＲＮＡ量を、同一株中の内部標準タンパク質をコードするｍＲＮＡ量で割った相対値）が、親株中のグルタミン酸－システインリガーゼの発現量（好ましくは、野生株中のグルタミン酸－システインリガーゼのｍＲＮＡ量を、同一株中の内部標準タンパク質をコードするｍＲＮＡ量で割った相対値）の、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、より好ましくは２０倍以上である。グルタチオン合成酵素遺伝子の発現が強化された微生物の１以上の実施形態では、微生物中のグルタチオン合成酵素の発現量（好ましくは、微生物中のグルタチオン合成酵素のｍＲＮＡ量を、同一株中の内部標準タンパク質をコードするｍＲＮＡ量で割った相対値）は、野生株中のグルタチオン合成酵素の発現量（好ましくは、野生株中のグルタチオン合成酵素のｍＲＮＡ量を、同一株中の内部標準タンパク質をコードするｍＲＮＡ量で割った相対値）の好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上、より好ましくは２０倍以上である。内部標準タンパク質としては、ハウスキーピング遺伝子として知られるｈｃａＴ遺伝子がコードするタンパク質が例示できる。
＜３．３．本明細書の第二の開示に係るグルタチオンの製造方法＞
　第二の開示の更なる１以上の実施形態は、
　前記の第二の開示の１以上の実施形態に係る微生物を培地中で培養することを含む、
グルタチオンの製造方法に関する。
　本実施形態に係るグルタチオンの製造方法によれば、効率的にグルタチオンを製造することが可能である。
　前記培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど第二の開示に用いられる微生物の増殖、及びグルタチオンの生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。好ましくはＭ９培地を用いる。
　炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよく、グルコース、フラクトースのような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを挙げることができる。
　窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などを挙げることができる。
　無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウムなどを挙げることができる。
　ビタミンとしては、ビオチンやチアミンなどを挙げることができる。さらに必要に応じて第二の開示の１以上の実施形態に係る微生物が生育に要求する物質（例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸）を添加することができる。
　前記培地には硫黄源及びグリシンの少なくとも一方、好ましくは両方、を添加することが好ましい。グリシンの培地への添加濃度としては、例えば１００ｍＭ～２０００ｍＭ、好ましくは４００ｍＭ～１２００ｍＭが挙げられる。硫黄源の培地への添加濃度としては、例えば１００ｍＭ～２０００ｍＭ、好ましくは４００ｍＭ～１２００ｍＭが挙げられる。
　硫黄源としては、硫酸、チオ硫酸、亜硫酸、次亜硫酸又は硫化物或いはその塩等の無機硫黄化合物の１種又は複数種を添加することができる。硫酸、チオ硫酸、亜硫酸、次亜硫酸又は硫化物は、フリー体であってもよく、塩であってもよく、それらの任意の混合物であってもよい。塩としては、特に制限されず、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、カリウム塩等が挙げられる。 
　グリシンはフリー体であってもよく、塩であってもよく、それらの任意の混合物であってもよい。塩としては、特に制限されず、硫酸塩、塩酸塩等が挙げられる。
　硫黄源及び／又はグリシンは培養開始時又は培養の途中に培地に添加することができる。硫黄源及び／又はグリシンは一度に培地に添加してもよいし、連続的或いは間欠的に培地に添加してもよい。
　硫黄源及び／又はグリシンは、培養の全期間において培地に含有されていてもよく、培養の一部の期間においてのみ培地に含有されていてもよい。例えば、硫黄源およびグリシンの添加量は、グルタチオンを生産蓄積させる段階の全期間において前記の範囲である必要はなく、培養途中に含有量が前記の範囲となるよう硫黄源及び／又はグリシンを培地に含有させ、培養時間の経過に伴い硫黄源及び／又はグリシン含有量が減少してもよい。また、硫黄源及び／又はグリシンを連続的或いは間欠的に追加添加してもよい。なお、硫黄源及び／又はグリシン以外の培地成分についても、培養期間中に濃度が変動してもよく、追加添加されてもよい。
　培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は２０～５０℃、好ましくは２０～４２℃、より好ましくは２８～３８℃である。培養時のｐＨは５～９、好ましくは６～７．５である。培養時間は、３時間～５日間、好ましくは５時間～３日間である。
　培養物中に蓄積したグルタチオンは、通常の精製方法によって採取することができる。例えば、培養終了後、遠心分離などで培養物中の菌体や固形物を除いたあと、イオン交換、濃縮、結晶分別によって採取することができる。
　以下に実施例を掲げて本明細書の第一の開示及び第二の開示をさらに詳細に説明するが、本明細書の第一の開示及び第二の開示はこれら実施例に限定されるものではない。
　以下で説明する遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））の記載を参照して実施することができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、前記酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
＜第一の開示＞
　本明細書の第一の開示を説明するための実験結果を以下に示す。
［実施例１－１］グルタチオン合成系遺伝子発現ベクターの構築（１）
　配列番号４に記載のプラスミドベクターｐＱＥＫ１－ｔｅｒｍのＳｍａＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間にＴ５プロモーター、大腸菌由来ｇｓｈＡ遺伝子（配列番号１２）、及び、大腸菌由来ｇｓｈＢ遺伝子（配列番号１４）を挿入した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）の説明書に基づいてプライマーを設計し、記載通りの手順でベクター構築を行った。構築されたプラスミドベクターをｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍと称する。ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍは、ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ｇｓｈＡ－ｇｓｈＢと表記してもよい。
［実施例１－２］グルタチオン合成系遺伝子発現ベクターの構築（２）
　配列番号４に記載のプラスミドベクターｐＱＥＫ１－ｔｅｒｍのＳｍａＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間にＴ５プロモーター、大腸菌由来ｇｓｈＡ遺伝子（配列番号１２）、及び、硫黄細菌Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来グルタチオン合成酵素の変異型酵素（ＷＯ２０１８／０８４１６５）をコードするＴＤｇｓｈＢ（Ｖ２６０Ａ）遺伝子（配列番号１８）を挿入した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）の説明書に基づいてプライマーを設計し、記載通りの手順でベクター構築を行った。構築されたプラスミドベクターをｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍと称する。ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍは、ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ｇｓｈＡ－ＴＤｇｓｈＢ（Ｖ２６０Ａ）と表記してもよい。
［実施例１－３］グルタチオン合成系遺伝子発現ベクターの構築（３）
　配列番号４に記載のプラスミドベクターｐＱＥＫ１－ｔｅｒｍのＳｍａＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間にＴ５プロモーター及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来二機能性グルタチオン合成酵素遺伝子コードするＳＡｇｓｈＦ遺伝子（配列番号１９）を挿入した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）の説明書に基づいてプライマーを設計し、記載通りの手順でベクター構築を行った。構築されたプラスミドベクターをｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍと称する。ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＦＳａ－ｔｅｒｍは、ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＳＡｇｓｈＦと表記してもよい。
［実施例１－４］グルタチオン合成系遺伝子発現ベクターの構築（４）
　配列番号４に記載のプラスミドベクターｐＱＥＫ１－ｔｅｒｍのＳｍａＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間にｌａｃプロモーター、大腸菌由来ｇｓｈＡ遺伝子（配列番号１２）、及び、硫黄細菌Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来グルタチオン合成酵素の変異型酵素（ＷＯ２０１８／０８４１６５）をコードするＴＤｇｓｈＢ（Ｖ２６０Ａ）遺伝子（配列番号１８）を挿入した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）の説明書に基づいてプライマーを設計し、記載通りの手順でベクター構築を行った。構築されたプラスミドベクターをｐＱＥＫ１－Ｐｌａｃ－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍと称する。ｐＱＥＫ１－Ｐｌａｃ－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍは、ｐＱＥＫ１－Ｐｌａｃ－ｇｓｈＡ－ＴＤｇｓｈＢ（Ｖ２６０Ａ）と表記してもよい。
［実施例１－５］グルタチオン合成系遺伝子発現ベクターの構築（５）
　配列番号４に記載のプラスミドベクターｐＱＥＫ１－ｔｅｒｍのＳｍａＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間にｌａｃＵＶ５プロモーター、大腸菌由来ｇｓｈＡ遺伝子（配列番号１２）、及び、硫黄細菌Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来グルタチオン合成酵素の変異型酵素（ＷＯ２０１８／０８４１６５）をコードするＴＤｇｓｈＢ（Ｖ２６０Ａ）遺伝子（配列番号１８）を挿入した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）の説明書に基づいてプライマーを設計し、記載通りの手順でベクター構築を行った。構築されたプラスミドベクターをｐＱＥＫ１－ＰｌａｃＵＶ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍと称する。ｐＱＥＫ１－ＰｌａｃＵＶ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍは、ｐＱＥＫ１－ＰｌａｃＵＶ５－ｇｓｈＡ－ＴＤｇｓｈＢ（Ｖ２６０Ａ）と表記してもよい。
［実施例１－６］宿主株の作製
　国立大学遺伝学研究所より入手した大腸菌株ＢＷ２５１１３に対し、同機関より入手したプラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１を用い、特開２００４－３４４０２９においてシトシンデアミナーゼ欠損株の作製方法として示されている方法と同様に、γ－グルタミルトランスフェラーゼ遺伝子（配列番号２１）及びトリペプチドペプチダーゼ遺伝子（配列番号２３）を欠損した株を作製した。
［実施例１－７］グルタチオン合成遺伝子強化株の作製
　実施例１－６で作製した宿主株のコンピテントセルを常法により作製し、実施例１－１～５で作製したプラスミドベクターで形質転換し、それぞれの形質転換体を得た。
［実施例１－８］グルタチオンの発酵生産評価
　実施例１－６で作製した宿主株（プラスミドなし）又は実施例１－７で作製したグルタチオン合成遺伝子強化株を５ｍＬ　ＬＢ培地（２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む）に植菌し、３００ｒｐｍ、３０℃で８時間振盪培養した。この培養液１ｍＬを、２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを添加したＭ９培地（６ｇ／Ｌリン酸水素二ナトリウム、３ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、０．５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、０．００１％チアミン―塩酸、０．１ｍＭ塩化カルシウム、２％グルコース）１００ｍＬに植菌した。植菌後の培養液を、培養装置（エイブル社製Ｂｉｏ　Ｊｒ．８）を用いて３４℃、ｐＨ６．５、撹拌１０００ｒｐｍ、通気１００ｍＬ／ｍｉｎで１８時間培養した。１８時間培養後の培養液の２０ｍＬを、２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを添加したＭ９培地２Ｌに植菌した。２回目の植菌後の培養液を更に、培養装置（丸菱バイオエンジ社製Ｂｉｏｎｅｅｒ－Ｎｅｏ）を用いて３４℃、ｐＨ６．７、撹拌６００ｒｐｍ、通気４Ｌ／ｍｉｎで培養した。培養中、５０ｗ／ｖ％グルコース溶液を随時添加し、系中グルコース濃度が１５ｇ／Ｌを下回らないように調整した。６時間培養後に０．１ｍＭイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドを添加し、同時に７８０ｍＭグリシン及び７８０ｍＭ硫酸ナトリウムも添加した。培養２４時間目に培養液を適量サンプリングし、遠心分離により菌体と上清を分離した。上清を蒸留水で適当に希釈し、ＷＯ２０１６／００２８８４に記載した方法で培養上清中のＧＳＨおよびＧＳＳＧを定量し合計濃度を求めた。培養上清中のＧＳＨとＧＳＳＧの合計濃度の定量結果を表１に示す。以上の実験で用いた培養液はシステイン及びシスチンを実質的に含まず、それらの合計濃度は０．５ｇ／Ｌ未満である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例１－９］グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子およびグルタチオン合成酵素遺伝子の転写解析
　リアルタイムＰＣＲにより、プラスミドを用いて過剰発現した遺伝子の発現量解析を行った。実施例１－８に記載の培養において２回目の植菌後の培養液を６時間培養後に０．１ｍＭイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドを添加してから１時間後に適量をサンプリングした。タカラバイオ社から購入したＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＲＮＡを用い、添付の説明書に従ってＲＮＡを抽出した。各ＲＮＡサンプルを水で希釈することにより濃度５０ｎｇ／μＬに調整した。タカラバイオ社から購入したＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）を用い、添付の説明書に従って逆転写を行い、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。タカラバイオ社より購入したＴＢ　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＩＩ（Ｔｌｉ　ＲＮａｓｅＨ　Ｐｌｕｓ）およびサーモフィッシャーサイエンティフィック社製ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ　３リアルタイムＰＣＲシステムを用いて、各サンプルにおけるｇｓｈＡ、ＴＤｇｓｈＢ（Ｖ２６０Ａ）、ｇｓｈＢ、ＳＡｇｓｈＦを定量した。内部標準として、ハウスキーピング遺伝子として知られるｈｃａＴ（配列番号２７）を使用した。ｈｃａＴ、ｇｓｈＡ、ｇｓｈＢについては、宿主大腸菌のゲノムＤＮＡを用いてサンプルと同時にリアルタイムＰＣＲ反応に供し、検量線を作製した。検量線に基づいて、各ｃＤＮＡに含まれる各遺伝子の量を定量した。ＴＤｇｓｈＢ（Ｖ２６０Ａ）についてはＷＯ２０１８／０８４１６５に記載のプラスミドｐＴＤＧＳＨ２ｍ１５、ＳＡｇｓｈＦについてはＷＯ２０１６／０１７６３１に記載のプラスミドｐＮＧＳＨＦを用いて検量線を作製した。同一サンプルにおいて、各遺伝子の定量値を内部標準であるｈｃａＴの定量値で割ることで標準化した値を各遺伝子の発現量とした。ｈｃａＴを増幅するためのフォワードプライマーは配列番号２８、リバースプライマーは配列番号２９、ｇｓｈＡを増幅するためのフォワードプライマーは配列番号３０、リバースプライマーは配列番号３１、ＴＤｇｓｈＢ（Ｖ２６０Ａ）を増幅するためのフォワードプライマーは配列番号３２、リバースプライマーは配列番号３３、ｇｓｈＢを増幅するためのフォワードプライマーは配列番号３４、リバースプライマーは配列番号３５、ＳＡｇｓｈＦを増幅するためのフォワードプライマーは配列番号３６、リバースプライマーは配列番号３７に示したものを使用した。
　大腸菌由来ｇｓｈＡ遺伝子を含むプラスミドベクターであるｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍ、ｐＱＥＫ１－Ｐｌａｃ－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍ、ｐＱＥＫ１－ＰｌａｃＵＶ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍ、又は、ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍを導入した形質転換体による大腸菌由来ｇｓｈＡ遺伝子の発現量（各形質転換体のｇｓｈＡ遺伝子の発現量の定量値を、同一の形質転換体におけるｈｃａＴの発現量の定量値で割って標準化した発現量）の、実施例１－６で作製した、形質転換していない宿主株による大腸菌由来ｇｓｈＡ遺伝子の発現量（宿主株のｇｓｈＡ遺伝子の発現量の定量値を、同一の宿主株におけるｈｃａＴの発現量の定量値で割って標準化した発現量）を１とした相対量として求め、前記相対量が５以上１０未満を「＋」、１０以上２０未満を「＋＋」、２０以上を「＋＋＋」と評価した。同様に、大腸菌由来ｇｓｈＢ遺伝子を含むプラスミドベクターであるｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍを導入した形質転換体による大腸菌由来ｇｓｈＢ遺伝子の発現量（各形質転換体のｇｓｈＢ遺伝子の発現量の定量値を、同一の形質転換体におけるｈｃａＴの発現量の定量値で割って標準化した発現量）を、形質転換していない宿主株による大腸菌由来ｇｓｈＢ遺伝子の発現量（宿主株のｇｓｈＢ遺伝子の発現量の定量値を、同一の宿主株におけるｈｃａＴの発現量の定量値で割って標準化した発現量）を１とした相対量として求め、前記相対量が５以上１０未満を「＋」、１０以上２０未満を「＋＋」、２０以上を「＋＋＋」と評価した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　大腸菌である前記宿主株が本来有していないＴＤｇｓｈＢ（Ｖ２６０Ａ）遺伝子又はＳＡｇｓｈＦ遺伝子を含むプラスミドベクターｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍ、ｐＱＥＫ１－Ｐｌａｃ－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍ、ｐＱＥＫ１－ＰｌａｃＵＶ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍ又はｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍを導入した形質転換体による、ＴＤｇｓｈＢ（Ｖ２６０Ａ）遺伝子又はＳＡｇｓｈＦ遺伝子の発現量については、各遺伝子の発現量の定量値を、同一サンプルにおけるｈｃａＴ遺伝子の定量値で割ることで標準化した。ネガティブコントロールとして、形質転換していない前記宿主株（プラスミドなし）についても同様に遺伝子発現量を求めた。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜第二の開示＞
　続いて、本明細書の第二の開示を説明するための実験結果を以下に示す。
（培養液中のグルタチオン濃度の分析）
　培養液中のグルタチオン濃度は、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ、島津製作所）を用いて測定した。
ＨＰＬＣの分析条件は以下の通り。
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＯＤＳ－ＨＧ－３　４．６ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ（野村化学）
移動相：リン酸二水素カリウム３０．５ｇ、ヘプタンスルホン酸ナトリウム１８ｇを蒸留水４．５Ｌに溶解後、リン酸でｐＨ３に調整。メタノール２５０ｍＬを添加後、再度リン酸でｐＨ３に調整。
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ検出器，λ＝２１０ｎｍ
カラム温度：４０℃
注入量：１０μＬ
　培養液に含まれるグルタチオン濃度を分析する際は、遠心分離によって菌体を除去した後、上清をシリンジフィルター（アドバンテック、φ＝０．２μｍ）を通すことによって培養上清を得た。得られた培養上清を、蒸留水で１０倍に希釈してＨＰＬＣに供した。
（製造例２－１）ＢＷ２５１１３Δｇｇｔ株の作製
　まず、ｇｇｔ（γ－グルタミルトランスフェラーゼ）遺伝子（配列番号２１）を破壊するためのプラスミドベクターを作製した。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｇｇｔ遺伝子の上流配列と下流配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１）を得た。取得した断片をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＡＢ０１９６１０）〔Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．，Ｇｅｎｅ，２４１，１８５－１９１（２０００）〕をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られる断片と、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　Ｖｅｒ．２（東洋紡）にて連結し、プラスミドベクターｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｇｔ－ＵＤを得た。
　次に、ｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｇｔ－ＵＤを用いて、ＢＷ２５１１３Δｇｇｔ株を作製した。ｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｇｔ－ＵＤをエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＷ２５１１３株に導入し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレートに塗布して３０℃で培養し、形質転換体を得た。取得した形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ液体培地にて３０℃で一晩振盪培養し、培養液をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で培養し、形質転換体を得た。取得した形質転換体を４２℃でＬＢ液体培地にて一晩培養した後、ＬＢ寒天プレートに塗布してコロニーを取得した。取得したコロニーを、ＬＢ寒天プレートと、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレートにそれぞれレプリカし、クロラムフェニコール感受性を示す形質転換体を選抜した。選抜した形質転換体から、ＰＣＲ及びＤＮＡシーケンサーによる解析により、染色体上ｇｇｔ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＢＷ２５１１３Δｇｇｔ株と命名した。
　ＢＷ２５１１３Δｇｇｔ株は、大腸菌ＢＷ２５１１３株を宿主とし、染色体上ｇｇｔ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株である。
（製造例２－２）ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ株の作製
　まず、ｐｅｐＴ（トリペプチドペプチダーゼ）遺伝子（配列番号２３）を破壊するためのプラスミドベクターを作製した。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｐｅｐＴ遺伝子の上流配列と下流配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２）を得た。取得した断片をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＴＨ１８ｃｓ１をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られる断片と、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　Ｖｅｒ．２にて連結し、プラスミドベクターｐＴＨ１８ｃｓ１－ｐｅｐＴ－ＵＤを得た。
　次に、製造例２－１で作製したＢＷ２５１１３Δｇｇｔ株を親株とし、ｐＴＨ１８ｃｓ１－ｐｅｐＴ－ＵＤを用いて製造例２－１と同様の方法で染色体上ｐｅｐＴ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ株と命名した。
　ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ株は、大腸菌ＢＷ２５１１３株を宿主とし、染色体上ｇｇｔ遺伝子及びｐｅｐＴ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株である。
（製造例２－３）ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍの作製
　まず、大腸菌に遺伝子導入するためのベクターを構築するため、ｐＱＥ－８０Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ）をベースに、薬剤体制マーカーをテトラサイクリン耐性遺伝子に変更し、配列番号３に示すｐＱＥＫ１ベクターを構築した。さらに、ｐＱＥＫ１のＨｉｎｄＩＩＩローカスにラムダファージ由来のターミネーター配列を挿入し、配列番号４に示すｐＱＥＫ１－ｔｅｒｍベクターを構築した。
　次に、合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ｔ５プロモーター、大腸菌由来ｇｓｈＡ遺伝子、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来ｇｓｈＢ遺伝子（Ｖ２６０Ａ変異保有）からなるＤＮＡ断片（配列番号５）を得た。取得した断片を、ｐＱＥＫ１－ｔｅｒｍをＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られる断片と、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて連結し、配列番号６に示すｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍを得た。
（製造例２－４）ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍ株の作製
　製造例２－２で作製したＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ株に、製造例２－３で作製したｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍをエレクトロポレーション法を用いて導入し、テトラサイクリン２０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレートに塗布して形質転換体を選抜した。選抜した形質転換体から、ＰＣＲによる解析によりｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍが導入された菌株１株を単離した。この株をＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍ株と命名した。
（製造例２－５）ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ株の作製
　まず、ｇｏｒ（グルタチオンレダクターゼ）遺伝子を破壊するためのプラスミドベクターを作製した。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、ｇｏｒ遺伝子の上流配列と下流配列を有するＤＮＡ断片（配列番号７）を得た。取得した断片をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＴＨ１８ｃｓ１をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られる断片と、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　Ｖｅｒ．２にて連結し、プラスミドベクターｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｏｒ－ＵＤを得た。
　次に、製造例２－２で作製したＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ株を親株とし、ｐＴＨ１８ｃｓ１－ｇｏｒ－ＵＤを用いて製造例２－１と同様の方法で染色体上ｇｏｒ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ株と命名した。
（製造例２－６）ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍ株の作製
　製造例２－５で作製したＢＷ２５１１３　ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ株に、製造例２－３で作製したｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍをエレクトロポレーション法を用いて導入し、テトラサイクリン２０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレートに塗布して形質転換体を選抜した。選抜した形質転換体から、ＰＣＲによる解析によりｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍが導入された菌株１株を単離した。この株をＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍ株と命名した。
（製造例２－７）ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍの作製
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ｔ５プロモーター、大腸菌由来ｇｓｈＡ遺伝子、大腸菌由来ｇｓｈＢ遺伝子からなるＤＮＡ断片（配列番号８）を得た。取得した断片を、ｐＱＥＫ１－ｔｅｒｍをＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られる断片と、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘを用いて連結し、配列番号９に示すｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍを得た。
（製造例２－８）ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍ株の作製
　製造例２－２で作製したＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ株に、製造例２－７で作製したｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍをエレクトロポレーション法を用いて導入し、テトラサイクリン２０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレートに塗布して形質転換体を選抜した。選抜した形質転換体から、ＰＣＲによる解析によりｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍが導入された菌株１株を単離した。この株をＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍ株と命名した。
（製造例２－９）ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍ株の作製
　製造例２－５で作製したＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ株に、製造例２－３で作製したｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍをエレクトロポレーション法を用いて導入し、テトラサイクリン２０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレートに塗布して形質転換体を選抜した。選抜した形質転換体から、ＰＣＲによる解析によりｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍが導入された菌株１株を単離した。この株をＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍ株と命名した。
（製造例２－１０）ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍの作製
　合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ｔ５プロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来ｇｓｈＦ遺伝子からなるＤＮＡ断片（配列番号１０）を得た。取得した断片を、ｐＱＥＫ１－ｔｅｒｍをＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られる断片と、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘを用いて連結し、配列番号１１に示すｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍを得た。
（製造例２－１１）ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍ株の作製
　製造例２－２で作製したＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ株に、製造例２－１０で作製したｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍをエレクトロポレーション法を用いて導入し、テトラサイクリン２０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレートに塗布して形質転換体を選抜した。選抜した形質転換体から、ＰＣＲによる解析によりｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍが導入された菌株１株を単離した。この株をＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍ株と命名した。
（製造例２－１２）ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍ株の作製
　製造例２－５で作製したＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ株に、製造例２－１０で作製したｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍをエレクトロポレーション法を用いて導入し、テトラサイクリン２０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ寒天プレートに塗布して形質転換体を選抜した。選抜した形質転換体から、ＰＣＲによる解析によりｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍが導入された菌株１株を単離した。この株をＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍ株と命名した。
（実施例２－１）ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍ株によるグルタチオンの発酵生産
　製造例２－６で取得したＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍ株を以下の条件で培養し、ＧＳＨ及びＧＳＳＧを生産した。５ｍＬ　ＬＢ培地（２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む）に植菌し、３００ｒｐｍ、３０℃で８時間振盪培養した。この培養液１ｍＬを、２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを添加したＭ９培地（６ｇ／Ｌリン酸水素二ナトリウム、３ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、０．５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、０．００１％チアミン－塩酸、０．１ｍＭ塩化カルシウム、２％グルコース）１００ｍＬに１ｍＬ植菌し、培養装置（エイブル社製Ｂｉｏ　Ｊｒ．８）を用いて３４℃、ｐＨ６．５、撹拌１０００ｒｐｍ、通気１００ｍＬ／ｍｉｎで１８時間培養した。１８時間培養後の培養液の２０ｍＬを、２０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを添加したＭ９培地２Ｌに植菌し、培養装置（丸菱バイオエンジ社製Ｂｉｏｎｅｅｒ－Ｎｅｏ）を用いて３４℃、ｐＨ６．７、撹拌６００ｒｐｍ、通気４Ｌ／ｍｉｎで培養した。培養中、５０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を随時添加し、系中グルコース濃度が１５ｇ／Ｌを下回らないように調整した。６時間培養後に０．１ｍＭイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドを添加し、同時に終濃度１００ｍＭとなるようにグリシン及び硫酸ナトリウムを添加した。培養３０時間目に培養液を適量サンプリングし、遠心分離により菌体と上清を分離した。上清を蒸留水で適当に希釈し、ＨＰＬＣ分析にてＧＳＨ及びＧＳＳＧを定量した。定量結果を表４に示した。
（比較例２－１）ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍ株によるグルタチオンの発酵生産
　製造例２－４で取得したＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＴｄ（Ｖ２６０Ａ）－ｔｅｒｍ株を実施例２－１と同様の条件で培養し、ＧＳＨ及びＧＳＳＧを生産した。結果を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜考察＞
　表４の実施例２－１と比較例２－１の結果を比べると、ｇｏｒ遺伝子の破壊により、グルタチオン生産性（ＧＳＨ＋ＧＳＳＧ）が大きく増加することが分かる。このことから、グルタチオン発酵生産において、ｇｏｒ遺伝子の破壊が有効であることが分かる。
（実施例２－２）ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍ株によるグルタチオンの発酵生産
　製造例２－９で取得したＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍ株を実施例２－１と同様の条件で培養し、ＧＳＨ及びＧＳＳＧを生産した。結果を表５に示した。
（比較例２－２）ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍ株によるグルタチオンの発酵生産
　製造例２－８で取得したＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＡＢＥｃ－ｔｅｒｍ株を実施例２－１と同様の条件で培養し、ＧＳＨ及びＧＳＳＧを生産した。結果を表５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜考察＞
　表５の実施例２－２と比較例２－２の結果を比べると、ｇｏｒ遺伝子の破壊により、グルタチオン生産性（ＧＳＨ＋ＧＳＳＧ）が大きく増加することが分かる。このことから、グルタチオン発酵生産において、ｇｏｒ遺伝子の破壊が有効であることが分かる。
（実施例２－３）ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍ株によるグルタチオンの発酵生産
　製造例２－１２で取得したＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴΔｇｏｒ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍ株を実施例２－１と同様の条件で培養し、ＧＳＨ及びＧＳＳＧを生産した。結果を表６に示した。
（比較例２－３）ＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍ株によるグルタチオンの発酵生産
　製造例２－１１で取得したＢＷ２５１１３ΔｇｇｔΔｐｅｐＴ／ｐＱＥＫ１－ＰＴ５－ＦＳａ－ｔｅｒｍ株を実施例２－１と同様の条件で培養し、ＧＳＨ及びＧＳＳＧを生産した。結果を表６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜考察＞
　表６の実施例２－３と比較例２－３の結果を比べると、ｇｏｒ遺伝子の破壊により、グルタチオン生産性（ＧＳＨ＋ＧＳＳＧ）が大きく増加することが分かる。このことから、グルタチオン発酵生産において、ｇｏｒ遺伝子の破壊が有効であることが分かる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. 　γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンの製造方法であって、
    　グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子、グルタチオン合成酵素遺伝子、及び、二機能性グルタチオン合成酵素遺伝子から選択される１以上の遺伝子の発現量が野生株と比較して増加しており、前記１以上の遺伝子の誘導発現により、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを過剰生産することが可能な原核微生物株を、システイン及びシスチンの合計濃度が０．５ｇ／Ｌ以下の培地中で培養することを含む方法。
  2. 　γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンの製造方法であって、
    　グルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子、グルタチオン合成酵素遺伝子、及び、二機能性グルタチオン合成酵素遺伝子から選択される１以上の遺伝子の発現量が野生株と比較して増加しており、前記１以上の遺伝子の誘導発現により、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを過剰生産することが可能な原核微生物株を培地中で培養することを含み、
    　前記培地中にシステイン又はシスチンを添加することを含まない方法。
  3. 　誘導性プロモーターに発現可能に連結されたグルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子、グルタチオン合成酵素遺伝子、及び、二機能性グルタチオン合成酵素遺伝子から選択される１以上の遺伝子を保持する原核微生物株であって、
    　前記誘導性プロモーターが、前記１以上の遺伝子がグルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子である場合の前記原核微生物株によるグルタミン酸－システインリガーゼ遺伝子の転写量を野生株の２０倍以上とする誘導性プロモーターである、
    　前記１以上の遺伝子の誘導発現により、γ－グルタミルシステイン、ビス－γ－グルタミルシスチン、γ－グルタミルシスチン、還元型グルタチオン及び／又は酸化型グルタチオンを過剰生産することが可能な原核微生物株。
  4. 　前記誘導性プロモーターが、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、光誘導性プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｒｈａＢＡＤプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター、或いは、オペレーター配列としてｔｅｔＯ又はｌａｃＯオペレーターを含むプロモーターである、請求項３に記載の原核微生物株。
  5. 　前記誘導性プロモーターが、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｔａｃプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｒｈａＢＡＤプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター、或いは、オペレーター配列としてｔｅｔＯ又はｌａｃＯオペレーターを含むプロモーターである、請求項４に記載の原核微生物株。
  6. 　前記誘導性プロモーターが、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター又はｔａｃプロモーターである、請求項５に記載の原核微生物株。
  7. 　前記誘導性プロモーターがＴ５プロモーターである、請求項６に記載の原核微生物株。
  8. 　腸内細菌の形質転換体である、請求項３～７のいずれか１項に記載の原核微生物株。
  9. 　大腸菌の形質転換体である、請求項３～７のいずれか１項に記載の原核微生物株。
  10. 　以下の［１］の遺伝子及び［２］の遺伝子を欠損し、且つ、［３］遺伝子又は［４］の遺伝子の発現が強化された微生物：
    ［１］γ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．２．２）をコードする遺伝子；
    ［２］グルタチオンレダクターゼ（ＥＣ：１．８．１．７）をコードする遺伝子；
    ［３］グルタミン酸－システインリガーゼ（ＥＣ：６．３．２．２）をコードする遺伝子、及び、グルタチオン合成酵素（ＥＣ：６．３．２．３）をコードする遺伝子；
    ［４］二機能性グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子。
  11. 　以下の［５］の遺伝子を欠損した、請求項１０に記載の微生物：
    ［５］トリペプチドペプチダーゼ（ＥＣ：３．４．１１．４）をコードする遺伝子。
  12. 　微生物が、細菌の形質転換体である、請求項１０又は１１に記載の微生物。
  13. 　微生物が、腸内細菌の形質転換体である、請求項１０又は１１に記載の微生物。
  14. 　微生物が、グラム陰性細菌の形質転換体である、請求項１０又は１１に記載の微生物。
  15. 　微生物が、大腸菌の形質転換体である、請求項１０又は１１に記載の微生物。
  16. 　請求項１０～１５のいずれか１項に記載の微生物を培地中で培養することを含む、グルタチオンの製造方法。
PCT/JP2020/043356 2019-11-22 2020-11-20 有用物質の製造方法 WO2021100846A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021558466A JPWO2021100846A1 (ja) 2019-11-22 2020-11-20
CN202080080653.9A CN114761541A (zh) 2019-11-22 2020-11-20 有用物质的制造方法
US17/749,857 US20220290203A1 (en) 2019-11-22 2022-05-20 Method for producing useful substance

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-211477 2019-11-22
JP2019211477 2019-11-22
JP2020002363 2020-01-09
JP2020-002363 2020-01-09

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US17/749,857 Continuation US20220290203A1 (en) 2019-11-22 2022-05-20 Method for producing useful substance

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021100846A1 true WO2021100846A1 (ja) 2021-05-27

Family

ID=75980127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/043356 WO2021100846A1 (ja) 2019-11-22 2020-11-20 有用物質の製造方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220290203A1 (ja)
JP (1) JPWO2021100846A1 (ja)
CN (1) CN114761541A (ja)
WO (1) WO2021100846A1 (ja)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090069548A1 (en) * 2006-03-22 2009-03-12 Charles Dale Poulter Immobilized Proteins and Methods and Uses Thereof
WO2013054447A1 (ja) * 2011-10-14 2013-04-18 味の素株式会社 γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙまたはその塩の製造方法、および変異型グルタチオン合成酵素
US20140011235A1 (en) * 2010-12-02 2014-01-09 Salk Institute For Biological Studies Release factor 1 (rf1) in escherichia coli
WO2016140349A1 (ja) * 2015-03-04 2016-09-09 株式会社カネカ グルタチオンの製造方法
CN108456664A (zh) * 2018-03-29 2018-08-28 上海理工大学 一种乳杆菌来源的双功能谷胱甘肽合成酶表达盒及其构建和应用
CN109055291A (zh) * 2018-07-31 2018-12-21 张家港市华天药业有限公司 用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090069548A1 (en) * 2006-03-22 2009-03-12 Charles Dale Poulter Immobilized Proteins and Methods and Uses Thereof
US20140011235A1 (en) * 2010-12-02 2014-01-09 Salk Institute For Biological Studies Release factor 1 (rf1) in escherichia coli
WO2013054447A1 (ja) * 2011-10-14 2013-04-18 味の素株式会社 γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｇｌｙまたはその塩の製造方法、および変異型グルタチオン合成酵素
WO2016140349A1 (ja) * 2015-03-04 2016-09-09 株式会社カネカ グルタチオンの製造方法
CN108456664A (zh) * 2018-03-29 2018-08-28 上海理工大学 一种乳杆菌来源的双功能谷胱甘肽合成酶表达盒及其构建和应用
CN109055291A (zh) * 2018-07-31 2018-12-21 张家港市华天药业有限公司 用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HARA, KIYOTAKA Y. ET AL.: "Improvement of glutathione production by metabolic engineering the sulfate assimilation pathway of Saccharomyces cerevisiae", APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 94, no. 5, 11 January 2012 (2012-01-11), pages 1313 - 1319, XP035056750 *
KIRIYAMA, KENTARO ET AL.: "Oxidized glutathione fermentation using Saccharomyces cerevisiae engineered for glutathione metabolism", APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 97, no. 16, 3 July 2013 (2013-07-03), pages 7399 - 7404, XP035328706 *
LI, YIN ET AL.: "Using Lactococcus lactis for glutathione overproduction", APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 67, 2005, pages 83 - 90, XP019331776, DOI: 10.1007/s00253-004-1762-8 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114761541A (zh) 2022-07-15
US20220290203A1 (en) 2022-09-15
JPWO2021100846A1 (ja) 2021-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8114649B2 (en) L-cysteine producing microorganism and a method for producing L-cysteine
JP5978579B2 (ja) γ‐Ｇｌｕ‐Ｘ‐Ｙの製造方法
US10113161B2 (en) Mutant glutamate-cysteine ligase and method for manufacturing gamma glutamyl-valyl-glycine
EP4077695A1 (en) Method for the fermentative production of guanidinoacetic acid
US9677106B2 (en) Method for producing gamma-glutamylvalylglycine or a salt thereof
CN108463555A (zh) 生产苯甲醛的方法
WO2016002884A1 (ja) 酸化型γ－グルタミルシステイン及び酸化型グルタチオンの製造方法
JP6690529B2 (ja) γ−グルタミルバリン合成酵素、及び、γ−グルタミルバリルグリシンの製造法
CN116018400A (zh) 改进的产生半胱氨酸的菌株
JP7124338B2 (ja) 変異型グルタチオン合成酵素、及び、γ－グルタミルバリルグリシンの製造法
WO2022131323A1 (ja) 有用物質を製造する微生物、および製造方法
US20100047861A1 (en) Process for producing useful substance
WO2021100846A1 (ja) 有用物質の製造方法
WO2021220970A1 (ja) 有用物質を製造する微生物、および製造方法
JP4516712B2 (ja) Ｌ−ピペコリン酸の生物学的な製造方法
JP2021158969A (ja) 有用物質を製造する微生物、および製造方法
US20100047872A1 (en) Process for producing useful substance
JP4376038B2 (ja) 生育が向上した微生物菌株
JP5579456B2 (ja) Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
JP7181712B2 (ja) グルタチオンの製造方法
US20210207182A1 (en) Method for producing l-methionine using a bacterium
JP2021003034A (ja) Ｅｆｐタンパク質を発現する大腸菌およびそれを用いたフラボノイド化合物製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20889948

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021558466

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20889948

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1