WO2013028034A1 - 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포 - Google Patents

인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포 Download PDF

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WO2013028034A1
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human
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양승하
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강학희
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    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/50—Fibroblast growth factors [FGF]

Definitions

  • the present invention relates to adult stem cells derived from human skin dermis.
  • Human skin adult stem cells can also be used to treat skin diseases such as burns, wounds, ulcers and atopic dermatitis.
  • skin layers consisting of the epidermis, dermis, subcutaneous adipose, and appendages, ie, epidermal stem cells from the stratum corneum, hair follicle stem cells from the appendage hair.
  • Cell populations with multiple differentiation functions, such as hair follicle stem cells have been identified.
  • dermal-derived adult stem cells have been identified using a specific culture system called suspension culture from rodents and humans, which are derived from skin derived precursors (SKPs). Only mesenchymal cells such as bone marrow and muscle cells could be isolated (Toma et al., 2001; Toma et al., 2005).
  • the stem cells may be obtained by reacting the fibroblasts with gelatin or type 4 collagen for 1 to 5 minutes.
  • the gelatin is dissolved in distilled water at a concentration of 0.1 to 1% by weight, and the collagen type 4 may be dissolved in distilled water at a content of 10 to 30 yg / ml. have.
  • the stem cells compared with human dermal dermal-derived fibroblasts, EGF (Epidermal growth factor), FGF4 (Fibroblast growth factor 4), P late let-derived growth f actor-AA (PDGF-AA), Vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGF R2), Vascular endothelial growth factor receptor 3 (VEGF R3) and Vascular endothelial growth factor D (VEGF D)
  • EGF Epidermal growth factor
  • FGF4 Fibroblast growth factor 4
  • PDGF-AA P late let-derived growth f actor-AA
  • VEGF R2 Vascular endothelial growth factor receptor 2
  • VEGF R3 Vascular endothelial growth factor receptor 3
  • VEGF D Vascular endothelial growth factor D
  • the stem cells are stem cells of Accession No. KCTC11995BP.
  • an embodiment of the present invention provides osteoblasts or adipocytes differentiated from human dermal dermal derived adult stem cells.
  • the osteoblast may be one or more genes selected from the group consisting of OGN (Osteoglycin) and ACAN (Aggrecan) compared to the dermal dermal fibroblasts.
  • the adipocytes are PPARG (Peroxisome prol if erator—activated receptor gamma), LEP (Leptin), Ad i poQ (Ad i ponec tin), compared to dermal dermal-derived fibroblasts.
  • PPARG Peroxisome prol if erator—activated receptor gamma
  • LEP Longeptin
  • Ad i poQ Ad i ponec tin
  • an embodiment of the present invention provides a composition for producing or adipogenic bone, comprising human dermal dermal derived adult stem cells, osteoblasts or adipocytes as an active ingredient.
  • the separation method in one embodiment of the present invention may be to react with gelatin or type 4 collagen for 1 to 5 minutes.
  • the separation method the gelatin in distilled water
  • the gelatin or the fourth type Collagen may be to react with fibroblasts by coating the substrate for 16-24 hours at a temperature of 0 ⁇ TC.
  • the separation method the group consisting of Sox2 (SRY (sex determining region Y) -box 2) and S100b (S100 calcium binding protein B) compared to dermal dermal-derived fibroblasts It may further comprise determining whether or not overexpressing one or more genes selected from.
  • the separation method EGF (Epidermal growth factor), FGF4 (Fibroblast growth factor4), PDGF-AA (Platelet-derived growth factor-AA) compared to dermal dermal-derived fibroblasts ), VEGF R2 (Vacular Endothelial Growth Factor Receptor 2), VEGF R3 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3) and VEGF D (Vascular Endothelial Growth Factor D). It may include.
  • an embodiment of the present invention provides a method for differentiating human skin dermis-derived adult stem cells comprising differentiating human skin dermis-derived adult stem cells separated by the separation method into osteoblasts or adipocytes. do.
  • the differentiation method after differentiating the isolated cells in adipocyte differentiation medium, the differentiated cells compared to dermal dermal-derived fibroblasts
  • PPARGCperoxisome proliferator overexpresses one or more genes selected from the group consisting of activated receptor gamma (LEEP), Leptin (LEP), Ad i poQ (Ad i ponec tin, C1Q and collagen domain containing) and FABP4 (Fatty acid binding protein 4, adipocyte) Whether or not.
  • LEEP activated receptor gamma
  • Leptin Leptin
  • Ad i poQ Ad i ponec tin, C1Q and collagen domain containing
  • FABP4 Fatty acid binding protein 4, adipocyte
  • a composition comprising osteoblasts differentiated from the stem cells or adipocytes differentiated from the stem cells can be used as a composition for bone production or fat production.
  • the separation method of the present invention makes it easy and simple to secure the dermal dermal-derived adult stem cells, genes and sex specifically expressed in the dermal dermal-derived adult stem cells isolated by the above method It is effective to separate and identify intestinal factors for later use.
  • FIG. 2 is a result of two-fold and three-fold increase in expression of dermal-derived fibroblasts versus non-Sox2 (A) and SlOOb (B) in isolated dermal dermal derived adult stem cells, respectively.
  • A non-Sox2
  • B SlOOb
  • FIG. 5 shows that the isolated dermal dermal derived adult stem cells have cell growth factors EGF (A), FGF4 (B) and angiogenesis factor PDGF-A), VEGF R2 (D), compared to skin dermal dermal fibroblasts.
  • EGF EGF
  • FGF4 B
  • PDGF-A angiogenesis factor
  • VEGF R2 D
  • VEGF R3 E
  • F VEGF-D
  • 6 relates to blood vessels present in the dermis of the skin.
  • FIG. 7 shows a classification scheme of angiogenesis factors.
  • one or more genes selected from the group consisting of Sox2 (SRY (sex determining region Y) -box 2) and S100b (S100 calcium binding protein B) are overexpressed. Characterized by human Provides dermal dermal derived adult stem cells.
  • Sox2 (SRY (sex determining region Y) -box 2) and S100b (S100 calcium binding protein B) are derived from the dermal dermal-derived adult stem cells of the present invention. Specifically, the present inventors first invented that the expression level was increased. 1 '
  • the dermal dermal-derived adult stem cells of the present invention are novel pleasure cells different from conventional dermal dermal-derived adult stem cells, which were first invented by the present inventors.
  • the present invention includes separating the cells adhered to 3 ⁇ 4 Latin or Type 4 collagen by reacting gelatin or Type 4 collagen after second or third passage of human dermal skin-derived fibroblasts.
  • separating the cells adhered to 3 ⁇ 4 Latin or Type 4 collagen by reacting gelatin or Type 4 collagen after second or third passage of human dermal skin-derived fibroblasts.
  • the reaction time may be 1 to 5 minutes, preferably 4 to 5 minutes. If it is less than 1 minute, it is difficult to expect a proper yield of stem cells, and 5 minutes or more. Reaction may mix with other general fibroblasts. In other words, when it is between 5 minutes and 30 minutes, 50-60% of cells are attached, which is caused by the attachment of normal fibroblasts to type 4 collagen or gelatin by gravity.
  • gelatin or collagen type 4 may be coated on the substrate for 16 to 24 hours at a temperature of 0 ⁇ KC, preferably 4 ° C.
  • the substrate may be selected from the group consisting of polyethylene, polypropylene, copolymer of polyethylene and polypropylene, metal, silicon, and glass, but is not limited thereto.
  • the metal may be nickel, gold or silver, but is not limited thereto.
  • the substrate may be a conventional culture vessel.
  • the shape of the substrate is exceptional It is not particularly limited, and may be spherical particles, plates, tubes and the like.
  • the coating can be carried out by a known method.
  • the separation method is compared to human dermal dermal fibroblasts from the isolated cells.
  • the method may further include determining whether overexpressing one or more genes selected from the group consisting of Sox2 (SRY (sex determining region Y) _box 2) and S100b (S100 calcium binding protein B).
  • Sox2 Sox2
  • S100b S100 calcium binding protein B
  • the separation method compared with human dermal dermal-derived fibroblasts, EGF (Epidermal growth factor), FGF4 (Fibroblast growth factor4), PDGF-AA (platelet-derived growth factor-AA), VEGF R2 (Vascular endothelial growth factor) Receptor 2), VEGF R3 (Vascular endothelial growth factor receptor 3) and VEGF D (Vascular endothelial growth factor D) may further comprise determining whether overexpressing one or more growth factors selected from the group consisting of.
  • the dermal dermal-derived adult stem cells isolated in the present invention are compared to dermal dermal-derived fibroblasts, EGF (Epidermal growth factor), FGF4 (Fibroblast growth factor4), PDGF-AA (P late let-derived growth factor-AA), One or more growth factors selected from the group consisting of Vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGF R2), Vascular endothelial growth factor receptor 3 (VEGF R3) and VEGF D Vascular endothelial growth factor D) can be overexpressed.
  • EGF Extramal growth factor
  • FGF4 Fibroblast growth factor4
  • PDGF-AA P late let-derived growth factor-AA
  • One or more growth factors selected from the group consisting of Vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGF R2), Vascular endothelial growth factor receptor 3 (VEGF R3) and VEGF D Vascular endothelial growth factor D can be overexpressed.
  • the present invention provides a method for differentiating human skin dermis-derived adult stem cells and human dermal dermal derived adults comprising differentiating human skin dermal-derived adult stem cells isolated by the separation method into osteoblasts or adipocytes. It provides osteoblasts or adipocytes differentiated from pleasant cells. ⁇
  • isolated stem cells are differentiated into osteoblast differentiation medium (hMSC Mesenchymal).
  • the stem cells are separated into adipocyte differentiation medium, specifically, DMEM medium, more specifically 10% Fetal Bovine Serum, 0.1% Insulin, ⁇ Dexamethasone, 0.5mM IBMX and ⁇ Troglitazone
  • the medium can be differentiated by replacing the medium every 2-3 days using DMEM medium (see Example 5).
  • Differentiated cells were composed of peroxisome prol if erator activated receptor gamma (PPARG), leptin (LEP), adiponect in, C1Q and collagen domain containing (FAP4), and fatty acid binding protein 4, adipocyte (FABP4). It may further comprise determining whether or not overexpressing one or more genes selected from the group consisting of.
  • the adipocytes differentiated in the present invention may overexpress one or more genes selected from the group consisting of PPARg, LEP, AdipoQ and FABP4 compared to human dermal dermal fibroblasts.
  • an embodiment of the present invention is characterized in that the skin dermis-derived adult stem cells, the skin dermis-derived adult fungal cells differentiated from osteoblasts or the skin dermis-derived adult stem cells as an active ingredient It provides a composition for producing bone or lipogenesis comprising.
  • the composition according to the present invention has osteoporosis prevention and healing, skin aging prevention and healing, skin wound healing, skin volume enhancement or skin cosmetic efficacy.
  • the composition is generally a concept encompassing the overall composition used for the skin, and specifically, may be an external skin composition, and may be, for example, a cosmetic composition or a pharmaceutical composition.
  • the cosmetic composition may include, for example, a basic cosmetic, a makeup cosmetic, a hair cosmetic, a body cosmetic, and the like, and the formulation thereof is not particularly limited, and may be appropriately selected as desired.
  • the cosmetic composition contains a cosmetically acceptable medium or base.
  • a cosmetically acceptable medium or base for example emulsions, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules or ionics (liposomes) obtained by dispersing an oil phase in a solution, gel, solid or pasty anhydrous product, aqueous phase and And / or in the form of a nonionic vesicle dispersant, or in the form of a cream, skin, lotion, powder, ointment, spray or cone stick.
  • emulsions for example emulsions, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules or ionics (liposomes) obtained by dispersing an oil phase in a solution, gel, solid or pasty anhydrous product, aqueous phase and And / or in the form of a nonionic vesicle dispersant, or in the form of a cream, skin, lotion, powder, oin
  • a solvent, a solubilizer or an emulsifier is used as the carrier component, for example, water, ethane, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzo. Ate, propylene glycol, 1,3-butyl. Fatty acid esters of glycol oils, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycols or sorbitan.
  • the carrier component is animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, salulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or oxidation. Zinc snouts can be used.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, in particular, in the case of a spray, additionally chlorofluoro Propellant such as hydrocarbon, propane / butane or dimethyl ether.
  • the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing agent
  • the aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, and sarcosy are used as carrier components.
  • Nate, fatty acid amide ether sulfate, alkylamidobetaine, aliphatic alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol can be used.
  • the cosmetic composition may further contain a thickener.
  • the thickener included in the cosmetic composition of the present invention is methyl cellulose roscar Carboxymethyl cellulose, carboxymethyl hydroxy guanine, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, carboxyvinyl polymer polyquaternium, cetearyl alcohol, stearic acid, carrageenan and the like can be used, preferably carboxy Methyl cell may be used at least one of a carboxy vinyl polymer, pulliquaternium, most preferably a carboxy vinyl polymer.
  • the cosmetic composition may contain various suitable bases and additives as necessary, and the type and amount of these components may be easily selected by the inventors. If necessary, it may contain an acceptable additive, and may further include components such as, for example, preservatives, pigments, and additives conventional in the art.
  • Preservatives specifically include phenoxyethanol (Phenoxyethanol) or 1,2-nucleodiol diol (1,2-
  • Hexanediol and the fragrance can be artificial flavors.
  • the cosmetic composition may include a composition selected from the group consisting of water-soluble vitamins, oil-soluble vitamins, polymer peptides, polymer polysaccharides, sphingolipids, and seaweed extracts.
  • Other ingredients that may be added include fats and oils, moisturizers, emollients, surfactants, organic and inorganic pigments, organic powders, UV absorbers, preservatives, fungicides, antioxidants, plant extracts, pH adjusters, alcohols, pigments and flavorings. , Blood circulation accelerators, reducing agents, limiting agents, purified water and the like.
  • the compounding component which may be added other than this is not limited to this, Moreover, any of the above components can be mix
  • a parenteral composition in the form of a solid, semi-solid or liquid by adding an inorganic or organic carrier, excipient and diluent commonly used as the dermal dermal derived adult stem cells as an active ingredient. It can be formulated as a dosage.
  • the preparation for non-oral administration may be a transdermal dosage form selected from the group consisting of drops, ointments, lotions, gels, creams, patches, sprays, suspensions and emulsions, but is not limited thereto.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the composition include lactose dexrose, sucrose oligosaccharides, sorbbi, manny, xili, erytholi, malty, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, Calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyridone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. have.
  • composition according to each dosage form other persons other than the composition of the present invention described above may be appropriately selected and blended by those skilled in the art according to the formulation or use purpose of the external preparation for skin, in which case other raw materials If applied at the same time, synergistic effects may occur.
  • composition according to the present invention when used as a pharmaceutical composition, a pharmaceutical adjuvant such as a preservative, a stabilizer, a hydrating agent or an emulsifier, a salt or a buffer for controlling osmotic uptake, and other therapeutically useful substances It may further contain and may be formulated in various oral or parenteral dosage forms according to conventional methods.
  • a pharmaceutical adjuvant such as a preservative, a stabilizer, a hydrating agent or an emulsifier, a salt or a buffer for controlling osmotic uptake, and other therapeutically useful substances It may further contain and may be formulated in various oral or parenteral dosage forms according to conventional methods.
  • the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of several relevant factors such as the severity of the symptom, the route of administration chosen, the subject's age, sex, weight and health status.
  • the dosage of the active ingredient ranges from 0.001 mg / kg / day to approximately 2000 mg / kg / day. More preferred dosages are from 0.5 mg / kg / day to 2.5 mg / kg / day.
  • External administration may be administered once a day or divided several times.
  • Nermal human dermal fibroblasts (NHDF)
  • the human dermal-derived fibroblasts are passaged in 75 cm 2 T-flask,
  • RA / SA cells were incubated for 14 days in a 6 well culture dish with IX 10 2 cell numbers, followed by room temperature for 5 minutes with a solution containing 10% ethanol and 0.1% Crystal violet. After staining with and washed four times with PBS (Phosphate Buffered Saline) was confirmed by a microscope.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • FIG. 1 The experimental results are shown in FIG. 1.
  • RA is called human dermal-derived adult pleasure cells
  • SA cells are named human dermal-derived fibroblasts.
  • the present inventors have isolated human dermal-derived adult stem cells from the present invention to KCTC (Korean Collection for Type Cultures) in Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Aug. 2011). It was deposited on the 8th and its accession number is KCTC11995BP.
  • Example 1 isolated human dermal derived adult stem cells and dermal derived fibroblasts were washed with 2 ml of PBS, followed by Trizol reagent (Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA). , USA) was used to isolate RNA in cells.
  • the isolated RNA was purified once more with QIAGEN RNeasy kit (QIAGEN, Valencia, CA), and then Agilent's BioAnalyzer 2100 model instrument (Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) was used to confirm the quality of RNA.
  • CDNA was synthesized from the RNA using Invitrogen's reverse transcriptase kit (Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA). -RT-PCR) for quantitative analysis.
  • RT Superscript Reverse Transcriptase
  • ⁇ 86> Changes in expression patterns of Sox2 and SlOOb genes, known as toxin markers (gene markers) in isolated adult dermal-derived adult stem cells and dermal-derived fibroblasts, respectively.
  • toxin markers gene markers
  • toxin markers gene markers
  • S100b gene primer Hs00389217_ml
  • osteoblast differentiation medium hMSC Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium, PT-3002
  • PT-3002 hMSC Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium
  • Isolated human dermal-derived adult fungal cells and dermal-derived fibroblasts were cultured in 6 well culture dishes, each of 20 X 10 4 cells, followed by induction of differentiation for 14 days with osteoblast differentiation medium and confirmed by gene expression.
  • Adipocyte differentiation was achieved by DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum, 0.1% Insulin ⁇ ⁇ dexamethasone, 0.5 mM IBMX, and ⁇ troglitazone. Derived using. The adult human dermal-derived adult cells and dermal-derived fibroblasts were cultured in 20 wells each in 6 well culture dishes, followed by induction of differentiation with adipocyte differentiation medium for 7 days and confirmed by gene expression. Due to
  • the biomarkers OGN, ACAN and fat Changes in the expression patterns of PPARG, Leptin, Adi oQ, and FABP4 genes (TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA) (0GN gene primer: Hs00247901_ml, ACAN) Gene primer: Hs00153936_ml, PPARG gene primer: Hs01115513_ml, Leptin gene primer: Hs00174877_ml ⁇ AdipoQ gene primer: Hs00605917_ml, FABP4 gene primer: Hs01086177_ml).
  • the isolated human dermis-derived adult stem cells and dermis-derived fibroblasts were subjected to a number of growth factors, the array, the harvested culture fluid after each 20 X 10 4 cultures in each well 6 times the amount of the plate.
  • 2 ml of blocking buffer was treated at room temperature for 30 minutes, and then 1 ml of the culture solution was treated at room temperature for 2 hours. After 5 minutes of washing with 2ml wash buffer for 5 minutes and reacted at room temperature with an anti-growth factor (ant i-growth factor) antibody bound to Biotin (Biotin).
  • EGF EGF
  • FGF4 PDGF-AA
  • VEGF R2, VEGF R3, and VEGF D were increased by more than 10% in the culture medium of adult dermal derived human stem cells (FIG. 5).
  • EGF and FGF4 are important growth factors for the growth of keratin and fibroblasts, it is predicted that the human dermal-derived adult stem cells discovered in the present invention will assist in the recovery, such as wound healing of aging or damaged dermal layers.
  • VEGF R2, VEGF R3, and VEGF D are important growth factors that induce blood vessel formation. Human dermal-derived adult stem cells discovered in the present invention allow the growth or migration of capillaries in the dermal layer, and nutrition through blood It suggests that it can play a role to facilitate supply (Fig. 6, 7).
  • Microorganisms described in I above are accompanied by the following:
  • microorganisms listed in I have been repaired by Evon International and have received an application to change the original deposit to a deposit under the Butafest Treaty.
  • Human skin dermis-derived adult stem cells, osteoblasts differentiated from the stem cells or a composition comprising adipocytes differentiated from the stem cells can be used as a composition for producing bone or fat.

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Abstract

본 발명은 인간 피부 진피로부터 유래한 성체 줄기세포 및 그의 분리방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 분화된 골아세포 또는 지방세포 및 그의 분화방법을 제공한다. 또한, 상기 줄기세포, 골아세포 또는 지방세포를 포함하는 골 생성용 또는 지방생성용 조성물을 제공한다. 본 발명의 분리방법은 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 쉽고 간단하며, 고수득율로 확보할 수 있게 하고, 상기 방법으로 분리된 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 특이적으로 발현하는 유전자 및 성장 인자를 추후 분리 및 동정하여 이용할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의명칭】
인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포
【기술분야】
본 발명은 인간의 피부 진피로부터 유래한 성체 줄기세포에 관한 것이다. 【배경기술】
다분화 기능 (pluripotent)을 소유하는 성체 즐기세포를 조직으로부터 분리하 려는 노력은 최근 몇 년 전부터 줄곧 진행되어 왔다. 이런 성체 줄기세포는 배아줄 기세포의 전분화기능 (totipotent)에 비해 조직 내의 모든 세포로 분화하지는 못하 는 단점이 있지만, 배아줄기세포에서 문제시될 수 있는 윤리적인 문제에서는 자유 로울 수 있다는 점에서 연구 및 활용의 의미가 있다. 단, 배아줄기세포와는 달리 성체 조직에서 발굴 /동정을 하기에는 성체 줄기세포의 수 (해당 조직의 약 1~5% 미 만으로 추정)가 상당히 작아서 연구를 하는 데 어려움이 존재하는 단점이 있다. 궁극적으로 즐기세포에 관한 연구를 통해 얻고자 하는 것은 주로 치료 목적 의 사용이라고 할 수 있는 데, 특정 장기 조직에 질환 또는 질병을 앓고 있는 환자 들에게 줄기세포 기반의 새로운 세포를 공급하는 일종의 세포 치환 (cell transplantation) 또는 교체 (replacement)을 통해 건강 회복에 대한 회망을 줄 수 있다고 판단하고 있다. 인간의 피부 성체 줄기세포 역시 화상과 같은 피부 손상， 창상， 궤양, 아토피 등 피부 질환을 치료하는 데 웅용될 수 있다고 판단되고 연구 가 진행되고 있다. 각질층 (epidermis), 진피 (dermis), 피하지방층 (subcutaneous adipose), 그리고， 부속기 (appendage)로 구성된 이들 피부층에서 즉, 각질층으로부 터 각질 줄기세포 (epidermal stem cells), 부속기인 모발로부터 모낭 줄기세포 (hair follicle stem cells) 같은 다분화 기능을 갖는 세포군이 동정이 되었다. 또 한， 진피 유래 성체 줄기세포들의 경우에는 설취류 및 인간으로부터 현탁 배양 (suspension culture)이라는 특정 배양 시스템을 사용해서 동정이 되었는데， 이런 진피 유래 성체 줄기세포들 (Skin Derived Precursors, SKPs)은 지방 세포, 골세포， 근육 세포 등 중간엽 (mesoderm) 형태의 세포로 분리될 수 있다는 정도만 관찰되었 다 (Toma et al . , 2001； Toma et al . , 2005) .
무엇보다， 이들 피부 성체 줄기세포의 전체 피부 조직에서 차지하는 수가 현 저히 낮은데， 각질 줄기세포의 경우에는 각질형성세포 수의 1-5% 미만으로 예상되 며， 진피 유래 즐기세포의 경우에도 2-3% 정도로 파악되어 이를 분리하는 데 어려 움이 있으며， 이에 따라 이들 피부 성체 줄기세포를 분리하는 데， 필요한 특이적인 표식자 (또는 바이오마커)에 대한 발견이 거의 없는 실정이다. 현재까지 각질 줄기 세포의 표식자로 밝혀진 것은 알파 6-인테그린， CD71, 베타 1-인테그린， p63 정도 (Webb et al . , 2004； Yi et . , 2008)이며， 모낭 줄기세포의 경우 CD200(Garza et al. , 2011)만 알려져 있는 정도이다.
<5> 최근에 인간 진피층으로부터 정상적인 진피 섬유아세포 배양 시스템을 사용 하여， 분리한 진피 유래 성체 줄기세포의 경우 독특하게 지방 세포， 골 세포， 연골 세포 둥으로 다분화 기능을 하는 것이 발견이 되었으며， 이들은 특이적으로 vimentin+ (발현)， nest in- (비발현) 하는 것으로 관찰되었다 (Chen FG et al. , 2007) . 그러나， 이들을 분리하는 방법은 정상적인 섬유아세포 배양 시스템과 크게 다르지 않아서 효과적으로 수율을 높이는 데는 문제점이 있다.
【발명의 내용】
【기술적 과제]
<6> 본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위해서， 특이적인 유전자 및 성장인자 를 바이오 마커로 발현하는 것을 특징으로 하는 피부로부터 분리된 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
【기술적 해결방법】
<7> 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2) 및 S100b(S100 calcium binding protein B)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 과 발현되는 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 제공한다.
<8> 또한， 본 발명의 일 실시예에서 상기 줄기세포는， 인간 피부 진피 유래 섬유 아세포를 계대배양한 후 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐에 반응시켜서 젤라틴 또는 제 4 형 콜라겐에 부착되는 세포를 분리하여 얻어진 것일 수 있다.
<9> 또한， 본 발명의 일 실시예에서 상기 줄기세포는, 상기 섬유아세포를 1~5분 동안 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐과 반웅시켜 얻어진 것일 수 있다.
<ιο> 또한， 본 발명의 일 실시예에서 상기 젤라틴은 증류수에 0.1~1 중량 %의 농도 로 용해시킨 것이고， 상기 제 4형 콜라겐은 증류수에 10~30 yg/ml의 함량으로 용해 시킨 것일 수 있다.
<ιι> 또한ᅵ 본 발명의 일 실시예에서 상기 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐은 o~i(rc의 온도에서 16~24시간 동안 기질에 코팅시킨 것일 수 있다.
<12> 또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 줄기세포는, 인간 피부 진피 유래 섬유 아세포에 비해 EGF( Epidermal growth factor), FGF4(Fibroblast growth factor4), PDGF-AA(P late let -derived growth f actor-AA) , VEGF R2(Vascular endothelial growth factor receptor 2), VEGF R3(Vascular endothelial growth factor receptor 3) 및 VEGF D(Vascular endothelial growth factor D) 로 이루어진 군에 서 선택되는 하나 이상의 성장인자가 과발현되는 것일 수 있다.
<13> 또한， 본 발명의 일 실시예에서 상기 줄기세포는 기탁번호 KCTC11995BP의 줄 기세포이다.
<14> 또한， 본 발명의 일 실시예는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 분화 된 골아세포 또는 지방세포를 제공한다.
<15> 또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 골아세포는 피부 진피 유래 섬유아세포 에 비해 OGN(Osteoglycin) 및 ACAN(Aggrecan)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 과발현되는 것일 수 있다.
<16> 또한 본 발명의 일 '실시예에서 상기 지방세포는， 피부 진피 유래 섬유아세 포에 비해 PPARG(Peroxisome prol if erator— activated receptor gamma) , LEP(Leptin) , Ad i poQ ( Ad i ponec t i n , C1Q and collagen domain containing) 및 FABP4(Fatty acid binding protein 4， adipocyte) 로 이루어진 군에서 선택되는 하 나 이상의 유전자가 과발현되는 것일 수 있다.
<I7> 또한， 본 발명의 일 실시예는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포, 골아세포 또는 지방세포를 유효성분으로 포함하는 골 생성용 또는 지방생성용 조성물을 제공 한다.
<18> 또한， 본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물은 골다공증 예방 및 치유, 피부 노화 예방 및 치유， 피부 상처 치유， 피부 혈행 개선， 피부 볼륨감 증진 또는 피부 성형 효능을 갖는 것일 수 있다.
<19> 또한， 본 발명의 일 실시예는 인간 피부 진피 유래 섬유아세포를 계대배양한 후 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐에 반웅시켜서 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐에 부착되는 세포를 분리하는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분리방법을 제공한다.
<20> 또한， 본 발명의 일 실시예에서 상기 분리방법은， 상기 섬유아세포를 1~5분 동안 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐과 반웅시키는 것일 수 있다.
<21> 또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 분리방법 ， 상기 젤라틴을 증류수에
0.1-1 중량 %의 농도로 용해시키고， 상기 제 4형 콜라겐을 증류수에 10~30 ug/ml의 함량으로 용해시켜서 섬유아세포와 반웅시키는 것일 수 있다.
<22> 또한， 본 발명의 일 실시예에서 상기 분리방법은， 상기 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐을 0~ TC의 온도에서 16-24시간 동안 기질에 코팅하여서 섬유아세포와 반웅 시키는 것일 수 있다.
<23> 또한， 본 발명의 일 실시예에서 상기 분리방법은, 피부 진피 유래 섬유아세 포에 비해 Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2) 및 S100b(S100 calcium binding protein B)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는 지 여부를 확인하는 것을 더 포함할 수 있다.
<24> 또한， 본 발명의 일 실시예에서 상기 분리방법은， 피부 진피 유래 섬유아세 포에 비해 EGF(Epidermal growth factor) , FGF4(Fibroblast growth factor4) , PDGF-AA(Platelet-derived growth factor-AA), VEGF R2( Vascular endothelial growth factor receptor 2)， VEGF R3 (Vascular endothelial growth factor receptor 3) 및 VEGF D(Vascular endothelial growth factor D)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성장인자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 포함할 수 있다.
<25> 또한， 본 발명의 일 실시예는 상기 분리방법에 의해 분리된 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 골아세포 또는 지방세포로 분화시키는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분화방법을 제공한다.
<26> 또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 분화 방법은， 분리된 줄기세포를 골세 포분화배지에서 분화시킨 후， 분화된 세포가 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해
OGN(Osteoglycin) 및 ACAN(Aggrecan)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유 전자를'과발현하는지 여부를 확인하는 것을 포함할 수 있다.
<27> 또한， 본 발명의 일 실시예에서 상기 분화 방법은， 분리된 세포를 지방세포 분화배지에서 분화시킨 후, 분화된 세포가 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해
PPARGCperoxisome proliferator— activated receptor gamma) , LEP(Leptin) , Ad i poQ ( Ad i ponec t i n , C1Q and collagen domain containing) 및 FABP4( Fatty acid binding protein 4， adipocyte)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 포함할 수 있다.
【유리한 효과】
<28> 본 발명의 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포， 상기 줄기세포에서 분화된 골아세포 또는 상기 줄기세포에서 분화된 지방세포를 포함하는 조성물은 골 생성용 또는 지방생성용 조성물로 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 분리방법은 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 쉽고 간단하며， 고수득율로 확보할 수 있게 하고, 상기 방법 으로 분리된 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 특이적으로 발현하는 유전자 및 성 장 인자를 추후 분리 및 동정하여 이용할 수 있게 하는 효과가 있다.
【도면의 간단한 설명】
<29> 도 1은 젤라틴으로 분리한 피부 진피 유래 성체 줄기세포 및 피부 진피 유래
. 섬유아세포의 줄기세포능인 군집 형성 능력을 비교한 결과이다.
<30> 도 2는 분리한 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 진피 유래 섬유아세포 대 비 Sox2(가) 및 SlOOb (나)의 발현이 각각 2배 및 3배 이상 증가한 결과이다. 종래 분리되었던 Vimentin+ (발현) /Nestin- (비발현)을 보인 인간 진피 유래 성체 줄기세 포와 동일 또는 유사한 지 확인한 결과, Vimentin(다)， Nest in (라)는 모두 발현하 며， 진피 유래 섬유아세포 대비 전혀 차이가 없었으므로， 기존에 동정된 인간 진피 유래 성체 줄기세포 (vimentin+ (발현), nest in- (비발현), Chen FG et al., 2007)와 는 본 발명의 인간 진피 유래 성체 줄기세포와는 다름을 제시한다.
<31> 도 3은 분리한 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 골아세포로 분화되며， 골 아세포의 대표적인 표식자 (유전자 마커)인 0GN (가)， ACAN (나)가 발현되는 결과이 다.
<32> 도 4는 분리한 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 지방세포로 분화되며， 지 방세포의 대표적인 표식자 (유전자 마커 )인 PPARg (가) , AdipoQ (나) , Leptin (다)， FABP4(라)가 발현되는 결과이다.
<33> 도 5는 분리한 피부 진피 유래 성체 줄기세포가 피부 진피 유래 섬유아세포 에 비해 세포 성장 인자 EGF (가)， FGF4(나) 및 혈관 생성 인자 PDGF-A 다)， VEGF R2(라)， VEGF R3(마)， VEGF-D (바)가 과발현되는 결과이다.
<34> 도 6은 피부 진피 내에 존재하는 혈관에 관한 것이다.
<35> 도 7은 혈관 생성 인자의 분류 체계도를 나타낸 것이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
<36> 이하， 본 발명을 상세히 설명한다.
<37> ' 본 발명자들은 피부 조직 특히， 각질 즐기세포나 모낭 줄기세포에 비해 아직 까지 실체가 명확하게 규명이 되지 않은 인간 진피 유래 성체 줄기세포에 대한 동 정 및 수득율을 높이는 방법을 고안하는 과정 중, 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐이 세 포와 부착력이 시간에 따라 상이함을 확인하고 이를 바탕으로 본 발명을 완성하였 다.
<38> 본 발명은 인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2) 및 S100b(S100 calcium binding protein B)로 이루 어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 과발현되는 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 제공한다.
<39> 상기 Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2) 및 S100b(S100 calcium binding protein B) 는 다론 인간 조직 성체 줄기세포의 여러 종류의 유전자 마커 중에 본 발명의 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 특이적으로 발현량이 증가한 것 으로 본 발명자들이 최초로 발명한 것이다. 1 '
<40> 종래에 알려진 피부 진피 유래 성체 줄기세포는 Nest in- (비발현 )ᅳ Vimentin
+ (발현)으로 알려져 있다. 본 발명에서 분리한 피부 진피 유래 성체 줄기세포는 피 부 진피 유래 섬유아세포 대비 Nestin 및 Vimentin의 발현양상에 차이가 없는 것을 특징으로 가지므로， 종래의 피부 진피 유래 성체 줄기세포와는 다른 줄기세포이다.
<41> 종래 제 4형 콜라겐를 활용하여 분리한 피부 성체 줄기세포는 여러 유형의 피 부 성체 줄기세포 중에서도 각질 줄기세포만이 알려져 있다. 본 발명의 피부 진피 유래 성체 줄기세포는 종래의 피부 진피 유래 성체 줄기세포와는 다른 신규한 즐기 세포로서, .본 발명자들이 최초로 발명한 것이다.
<42> 또한, 본 발명은 인간 피부 잔피 유래 섬유아세포를 2번째 또는 3번째 계대 배양한 후 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐에 반웅시켜서 ¾라틴 또는 제 4형 콜라겐에 부 착되는 세포를 분리하는 것을 포함하는 피부 진피 유래 성체 줄기세포 분리방법 및 그 분리방법으로 분리된 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 제공한다.
<43> 상기 반응시간은 1~5분， 바람직하게는 4~5분일 수 있다. 1분 미만이면 줄기 세포의 적절한 수득율을 기대하기 어렵고, 5분 이상.반응시키면 다른 일반 섬유아 세포들이 섞일 수 있다. 즉， 5분 초과 30분 사이 정도가 되면 50~60% 정도의 세포 들이 붙게 되며 이는 중력에 의해 일반 섬유아세포들이 제 4형 콜라겐 혹은 젤라틴 과 결합하여 붙은 것이다.
<44> 상기 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐은, 젤라틴 0.1 ~ 1 ¾ (중량 /용매부피) 또는 제 4형 콜라겐 10 ~ 30 yg/ml의 함량으로 섬유아세포와 반웅할 수 있다. 상기 용매 는 증류수， 구체적으로는 3차 증류수일 수 있다. 상기 콜라겐은 0.25% 아세트산에 lmg/ml의 농도로 stock을 만든 후， 3차 증류수로 희석하여 사용할 수 있다.
<45> 또한， 상기 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐은， 0~K C, 바람직하게는 4°C의 온도 에서 16~24시간 동안 기질에 코팅된 것일 수 있다.
<46> 상기 기질은 폴리에틸렌， 폴리프로필렌， 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌의 공중 합체， 금속， 실리콘 및 유리로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 금속은 니켈, 금 또는 은일 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아 니다. 구체적으로 상기 기질은 통상의 배양용기일 수 있다. 상기 기질의 형상은 특 별히 한정되지 않으며， 구형 입자, 플레이트， 튜브 등일 수 있다. 상기 코팅은 공 지의 방법으로 실시할 수 있다.
<47> 상기 분리방법은， 분리된 세포에서 인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해
Sox2(SRY(sex determining region Y)_box 2) 및 S100b(S100 calcium binding protein B)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부 를 확인하는 것을 더 포함할 수 있다.
<48> 상기 분리방법은， 인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 EGF(Epidermal growth factor) , FGF4(Fibroblast growth factor4) , PDGF—AA(platelet— derived growth factor-AA) , VEGF R2(Vascular endothelial growth factor receptor 2)， VEGF R3 (Vascular endothelial growth factor receptor 3) 및 VEGF D(Vascular endothelial growth factor D)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성장인자 를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 분 리한 피부 진피 유래 성체 줄기세포는 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 EGF( Epidermal growth factor) , FGF4(Fibroblast growth factor4) , PDGF- AA(P late let-derived growth factor-AA) , VEGF R2(Vascular endothelial growth factor receptor 2)， VEGF R3 (Vascular endothelial growth factor receptor 3) 및 VEGF D Vascular endothelial growth factor D) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성장인자를 과발현할 수 있다.
<49> 본 발명은 상기 분리방법에 의하여 분리된 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세 포를 골아세포 또는 지방세포로 분화시키는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성 체 줄기세포의 분화방법 및 인간 피부 진피 유래 성체 즐기세포에서 분화된 골아세 포 또는 지방세포를 제공한다. ·
<50> 상기 분화 방법은， 분리된 줄기세포를 골아세포 분화배지 (hMSC Mesenchymal
Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium, Lonza PT-3002)에서 분화 시켰으 며， 총 14일 기간동안 2~3일에 한번씩 배지를 교환하여 분화시킬 수 있다 (실시예 4 참조)에서 분화시킨 후， 분화된 세포가 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 OGN(Osteoglycin) 및 ACAN(Aggrecan)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유 전자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 더 포함할 수 있다. 또한， 본 발명에 서 분화된 골아세포는 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 OGN(Osteoglycin) 및 ACAN(Aggrecan)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현할 수 있다.
<51> 상기 분화 방법은, 분리된 줄기세포를 지방세포 분화배지， 구체적으로는 DMEM 배지， 더욱 구체적으로는 10% 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum)과 0.1% 인슐린 (Insulin), ΙμΜ의 덱사메타손 (Dexamethasone)， 0.5mM의 아이비엠엑스 ( IBMX) , ΙμΜ 의 트로글리타존 (Troglitazone)이 첨가된 DMEM배지를 이용하여 7일간 2~3일마다 배 지를 교환하여 분화시킬 수 있다 (실시예 5 참조). 분화된 세포가 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 PPARG(peroxisome prol if erator activated receptor gamma) , LEP(Leptin) , AdipoQ(Adiponect in, C1Q and collagen domain containing) 및 FABP4(Fatty acid binding protein 4， adipocyte) 로 이루어진 군에서 선택되는 하 나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 더 포함할 수 있다. 또 한， 본 발명에서 분화된 지방세포는 인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 PPARg, LEP, AdipoQ 및 FABP4로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현할 수 있다.
<52> 또한， 본 발명의 일 실시예는 상기 피부 진피 유래 성체 줄기세포, 상기 피 부 진피 유래 성체 즐기세포에서 분화된 골아세포 또는 상기 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 분화된 지방세포를 유효성분으로 포함하는 골 생성용 또는 지방생성 용 조성물을 제공한다.
<53> 본 발명에 의한 상기 조성물은 골다공증 예방 및 치유, 피부노화 예방 및 치 유， 피부 상처 치유， 피부 볼륨감 증진 또는 피부 성형 효능을 가진다. 상기 조성 물은 일반적으로 피부에 사용하는 조성물 전반을 포괄하는 개념이며， 구체적으로 피부 외용제 조성물일 수 있고， 예를 들어 화장료 조성물 또는 약학 조성물일 수 있다.
<54> 화장료 조성물로는 예를 들어 , 기초 화장료， 메이크업 화장료 , 모발용 화장 료， 바디용 화장료 등이 있을 수 있고, 그 제형은 특별히 제한되지 않으며， 목적하 는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다.
<55> 예를 들면, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액， 페이스트， 겔， 크 림， 로션, 파우더, 비누， 계면활성제 -함유 클린싱， 오일， 분말 파운데이션， 유탁액 파운데이션， 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나， 이에 한정 되는 것은 아니다. 보다 상세하게는， 유연화장수， 영양화장수, 로션， 바디로션 영 양 크림， 마사지 크림， 모이스처 크림， 핸드크림， 에센스, 아이 크림， 클렌징 크 림， 클렌징 품, 클렌징 워터, 팩， 젤， 패치, 수중유 (0/W)형, 유중수 (0/W)형 등의 기초 화장료， 립스틱， 메이크업베이스 또는 파운데이션 등의 색조 화장료, 샴푸， 린스， 바디클렌저， 치약 또는 구강 청정제 등의 세정료, 헤어토닉, 젤 또는 무스 둥의 정발제， 양모제 또는 염모제 등의 모발용 화장료 조성물로 제형화 될 수 있 다.
<56> 상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한 다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물， 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼， 현탁액， 마이크로에멀견, 마이 크로캡슐， 미세과립구 또는 이온형 (리포좀) 및 /또는 비이온형의 소낭 분산제의 형 태로， 또는 크림， 스킨， 로션, 파우더， 연고， 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.
<57> 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매， 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고， 예컨대 물 , 에탄을， 이소프로판올， 에틸 카보네이 트， 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트， 프로필렌 글리콜， 1,3-부틸 . 글리콜 오일， 글리세롤 지방족 에스테르， 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방 산 에스테르가 있다.
<58> 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄을 또는 프로 필렌 글리콜과 같은 액상의 회석제, 에록실화 이소스테아릴 알코을, 폴리옥시에틸 렌 소르비를 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제， 미소 결정성 셀를로오스， 알루미늄 메타히드톡시드, 벤토나이트， 아가 또는 트라칸트 등 이 이용될 수 있다.
<59> 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물 성유, 식물성유， 왁스， 파라핀， 전분, 트라칸트， 샐를로오스 유도체， 폴리에틸렌 글리콜， 실리콘， 벤토나이트， 실리카， 탈크 또는 산화아연 둥이 이용될 수 있다.
<60> 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토 스, 탈크， 실리카， 알루미늄 히드록시드， 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더 가 이용될 수 있고， 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카 본， 프로판 /부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
<61> 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지 방족 알코을 설페이트， 지방족 알코올 에테르 설페이트 , 설포숙신산 모노에스테르， 이세티오네이트， 이미다졸리늄 유도체， 메틸타우레이트， 사르코시네이트， 지방산 아미드 에테르 설페이트， 알킬아미도베타인， 지방족 알코을， 지방산 글리세리드， 자방산 디에탄올아미드， 식물성 유， 라놀린 유도체 또는 에록실화 글리세를 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
<62> 본 발명의 일 실시태양에서， 상기 화장료 조성물에 추가적으로 점증제를 함 유할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 점증제는 메틸 셀를로스ᅳ 카르 복시 메틸 셀를로스， 카르복시 메틸 하이드록시 구아닌 , 하이드록시 메틸 셀를로 스， 하이드록시에틸셀를로스， 카르복시 비닐 폴리머 폴리쿼터늄， 세테아릴 알콜， 스테아릭산， 카라기난 등을 사용할 수 있으며， 바람직하게는 카르복시 메틸 셀를로 스 카르복시 비닐 폴리머， 풀리쿼터늄 중에서 1종 이상을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 카르복시 비닐 폴리머가 될 수 있다.
<63> 본 발명의 일 실시태양에서 상기 화장료 조성물은 필요에 따라 적절한 각종 의 기제와 첨가제를 함유할 수 있으며 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용 이하게 선정될 수 있다. 필요에 따라 허용 가능한 첨가제를 함유할 수 있으며, 예 를 들면, 당업계에 통상적인 방부제， 색소， 첨가제 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
<64> 방부제는 구체적으로 페녹시에탄을 (Phenoxyethanol) 또는 1，2-핵산디올 (1,2-
Hexanediol) 등이 될 수 있고， 향료는 인공향료 둥이 될 수 있다.
<65> 그리고, 본 발명의 일 실시태양에서 화장료 조성물은 수용성 비타민， 유용성 비타민, 고분자 펩티드， 고분자 다당， 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군 에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다. 이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제， 계면 활성제， 유기 및 무기 안료， 유기 분체， 자외선 흡수제 , 방부제， 살균제， 산화 방지제， 식물 추출물， pH 조정제， 알콜， 색 소， 향료, 혈행 촉진제, 넁감제, 제한 (制汗)제， 정제수 등을 들 수 있다.
<66> 또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또， 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가 능하다.
<67> 본 발명의 일 실시예에서 약학 조성물은 상기 피부 진피 유래 성체 줄기세포 를 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체， 부형제 및 회석제를 가하 여 고체， 반고체 또는 액상의 형태로 비경구 투여제로 제제화 할 수 있다. 상기 비 경구 투여를 위한 제재로는 점적제， 연고， 로션, 겔， 크림， 패취， 스프레이， 현탁 제 및 유제로 이루어진 군에서 선택되는 경피 투여형 제형일 수 있으나， 이에 제한 되지 않는다.
<68> 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체 , 부형제 및 희석제로는 락토즈 덱스트 로즈， 수크로스 올리고당， 솔비를， 만니를， 자일리를， 에리스리를 말티를， 전분， 아카시아 고무， 알지네이트， 젤라틴， 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트， 셀롤로 즈， 메틸 셀를로즈， 미정질 셀를로스, 폴리비닐 피를리돈, 물， 메틸히드록시벤조에 이트， 프로필히드록시벤조에이트， 탈크， 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. ' <69> 각 제형에 의한 조성물에 있어서， 상기한 본 발명의 조성물 이외의 다른 성 분들을 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며， 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승효 과가 일어날 수 있다.
<70> 또한， 본 발명에 의한 조성물이 약학 조성물로 사용될 경우에， 방부제， 안정 화제， 수화제 또는 유화 촉진제， 삼투업 조절을 위한 염 또는 완층제 등의 약학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며， 통상적인 방 법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다.
<71> 유효성분의 실제 투여량은 증상의 중증도， 선택된 투여 경로, 대상의 연령， 성별， 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이 해되어야 한다.
<72> 일반적으로 유효성분의 투여량은 0.001mg/kg/일 내지 대략 2000mg/kg/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.5mg/kg/일 내지 2.5mg/kg/일이다. 외용투여는 ' 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
【발명의 실시를 위한 형태】
<73> 이하， 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐， 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.
<74>
<75> [실시예 1] 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐를 이용한 인간 진피 유래 섬유아세포 에서 RA/SA 세포의 분리
<76> 인간 진피유래 섬유아세포 (Normal human dermal fibroblasts, NHDF)를 론자
(Lonza, Inc. Walkersvi 1 le, MD, USA, NHDF-Ad-Der Fibroblasts, CC-2511,)에서 구
' 입하였다. 상기 인간 진피유래 섬유아세포를 75 cm2 T-flask에 계대배양을 하여,
C02 배양기 (C02 Incubator)에서 37°C， 5% C02 조건하에서 배양을 하였다. 통상적으 로 2번째 또는 3번째에서 세포의 계대 배양 (passage)을 진행하였다.
<7?> 0.1 ~ 1% 젤라틴 또는 10 ~ 30 «g/ml의 제 4형 콜라겐을 100 mm 배양 접시에
5ml씩 넣어주어 4°C에 16시간 ~ 24시간 코팅하였다. 인간 진피 유래 섬유아세포를 0.25% 트립신 (Trypsin-EDTA)으로 100 瞧 배양 접시로부터 분리한 뒤 1200rpm에서 5 분간 세포를 가라앉힌 다음， 배양액을 제거한 뒤에 5ml의 DMEM배지를 넣어주어 세 포를 현탁한 후， 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐이 코팅된 배양 접시에 5분간 배양하여 배양 접시에 붙은 세포 (RA; Rapidly Adhering) 와 초기 5분 내에 배양 접시에 붙지 는 않지만 4시간 이내에 붙는 세포 (SA; Slowly Adhering)로 각각 분리하였다.
<78>
<79> [실시예 2] 분리된 RA/SA세포의 세포군집형성 능력 (Colony forming assay) 확인
<80> 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐로 분리된 RA/SA세포의 줄기세포능 (sternness)을 비 교하기 위하여 세포군집형성 능력을 확인하였다.
<8i> 분리된 RA/SA 세포를 6 well 배양 접시에 I X 102 개의 세포수로 14일간 배 양한 후， 10% 에탄올과 0.1% 크리스탈 바이을렛 (Crystal violet)이 함유된 용액으 로 5분간 실온에서 염색한 다음 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 4회 세척하여 현미경으로 확인하였다.
<82> 상기 실험결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 분리 된 RA세포에서 세포군집형성 능력이 증가함을 확인할 수 있다 (이하 RA를 인간 진피 유래 성체 즐기세포라고 하며， SA세포를 인간 진피 유래 섬유아세포라고 명명한다 ). 본 발명자들은 본 발명에서 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포를 한국생명공 학연구원 (KRIBB: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 내 의 KCTC (미생물자원센터: Korean Collection for Type Cultures) 에 2011년 8월 8 일자로 기탁하였으며， 기탁번호는 KCTC11995BP이다.
<83>
<84> [실시예 3] mRNA 발현양 측정을 통한 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 특정 표식자 (유전자 마커) 선정
<85> 실시예 1에서 본 바와 같이， 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포 및 진피 유래 섬유아세포를 2 ml의 PBS로 세포를 세척한 다음， 이후, 트리졸 시약 (Trizol reagent , Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였 다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트 (QIAGEN RNeasy kit, QIAGEN, Valencia, CA) 로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기 (Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA 의 질 (quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트 (Superscript Reverse Transcriptase(RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고， 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반웅 (real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)을 통해 정량적으로 분석하였 다. <86> 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포 및 진피 유래 섬유아세포에서 각각 다 른 성체 즐기세포에서 톡징적인 표식자 (유전자 마커)로 알려진 Sox2, SlOOb 유전자 의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템 (TaqMan gene expression assay kit .Applied Biosystems , Foster City, CA)(Sox2 유전자 프 라이머: Hs01053049_sl,S100b 유전자 프라이머: Hs00389217_ml)을 이용하여 평가하 였으며， 그 결과를 도 2 가， 나 에 나타내었다. 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세 포에서의 각 유전자의 발현 양이 인간 진피 유래 섬유아세포 대비， 약 2~3배 정도 증가함을 확인하였다. 한편, Nestin- (비발현)， Vimentin+ (발현)의 특징을 갖는 기 존에 알려진 인간 진피 유래 성체 즐기세포와 동일 또는 유사한 지 Nestin(Hs00707120_sl) 및 Vimentin(Hs00185584_ml) 유전자의 발현 양을 조사하였 다. 본 발명자가 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포에서는 Nestin(Hs00707120_sl) 및 Vimentin(Hs00185584_ml) 모두 발현이 되었으며, 진피 유래 섬유아세포와 비교해 본 결과， 발현량에 있어서 전혀 차이를 보이지 않았다 ( 도 2 다， 라). 따라서 본 발명자가 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포는 기존에 동정되지 않았던, 신규한 진피 유래 성체 즐기세포이다
<87> 이러한 증가는 통계적으로 유의하였으며， 통계는 양측 스튜던트 t 테스트로 검증하였으며， p 값이 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 표시하였다.
<88 . <89> [실시예 4] 인간 진피 유래 성체 즐기세포의 분화능력 확인
<90> 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐로 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 분화능 력을 파악하기 위하여 골아세포 (Osteoblast)와 지방세포 (Adipocyte)로 각각 분화를 유도하였다.
<9i> 골아세포의 분화는 론자 (Lonza, Inc. alkersvi 1 le, MD, USA)의 골아세포 분 화배지 (hMSC Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium, PT-3002) 를 이용하여 유도되었다. 분리한 인간 진피 유래 성체 즐기세포 및 진피 유래 섬유 아세포는 각각 6 well 배양 접시에 각각 20 X 104 개씩 배양한 후 골아세포 분화배 지로 14일간 분≤!·를 유도한 후 유전자 발현으로 확인하였다.
<92> 지방세포의 분화는 10% 우태아혈청과 0.1% 인슐린 (Insulin)ᅳ ΙμΜ의 덱사메 타손 (Dexamethasone)， 0.5mM의 아이비엠엑스 (IBMX) , ΙμΜ의 트로글리타존 (Troglitazone)이 첨가된 DMEM배지를 이용하여 유도되었다. 분리한 인간 진피 유래 성체 즐기세포 및 진피 유래 섬유아세포는 각각 6 well 배양 접시에 각각 20 X Ιθ' 개씩 배양한 후 지방세포 분화배지로 7일간 분화를 유도한 후 유전자 발현으로 확 인하였다.
<93>
<94> [실시예 5] 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포 및 진피 유래 섬유아세포 의 골아세포와 지방세포로 분화된 세포의 분화 바이오마커 발현량 측정
<95> 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포 및 진피 유래 섬유아세포를 골아세포 와 지방세포로 각각 분화를 유도한 후， 위 실시예 3과 동일한 방법으로， 골아세포 의 바이오마커인 OGN, ACAN과 지방세포의 바이오마커인 PPARG, Leptin, Adi oQ, FABP4 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템 (TaqMan gene expression assay kit , Applied Biosystems , Foster City, CA)(0GN 유전자 프라이머: Hs00247901_ml, ACAN 유전자 프라이머: Hs00153936_ml, PPARG 유전자 프라이머: Hs01115513_ml, Leptin 유전자 프라이머: Hs00174877_mlᅳ AdipoQ 유전자 프라이머: Hs00605917_ml, FABP4 유전자 프라이머: Hs01086177_ml) 을 이용하여 평가하였으며， 그. 결과를 도 3과 도 4에 나타내었다. 분리한 인간 진 ' 피 유래 성체 줄기세포 각 유전자의 발현 양이 진피 유래 섬유아세포 대비, 약 2배 이상 증가함을 확인하였다. 이러한 증가는 통계적으로 유의하였으며， 통계는 양측 스류던트 t 테스트로 검증하였으며， p 값이 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다 고 표시하였다.
<96>
<97> [실시예 6] 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포에서 특이적으로 분비하는 성장 인자 (Growth factor) 선정
<98> '분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포로부터 배양액으로 분비되는 성장인자 발현 양상을 파악하기 위하여 성장 인자 어레이 (Growth factor array, Raybio,
Norcross, GA, USA)를 실시하였다.
<99> 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포 및 진피 유래 섬유아세포는 6 well 배 양 접시에 각각 20 X 104 개씩 배양한 후 배양액을 수획하여 성장인자 어레이를 수 행하였다. 2ml의 차단 버퍼를 실온에서 30분 처리한 후 1ml의 배양액을 상온에서 2 시간 처리하였다. 이후 2ml의 워싱버퍼로 5분간 5회 세척하고 바이오틴 (Biotin)이 결합된 항성장 인자 (ant i -growth factor) 항체로 상온에서 2시간 반웅시킨다. 추가 적으로 2ml의 워싱버퍼로 5분간 5회 세척하고 HRP가 결합한 스트렙토아비딘 (streptoavidin)을 2ml 처리하여 2시간 반응하고 워성버퍼로 세척후 디텍션 (detection) 버퍼로 반응시켜 LAS-3000(Fuj if i lm)기기로 현상하였다.
=ιοο> 총 41종의 성장인자를 분석하였을 때 인간 진피 유래 섬유아세포 배양액 과 비교해블 때， 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 배양액에서 성장인자 EGF, FGF4, PDGF-AA, VEGF R2, VEGF R3, VEGF D가 10% 이상 증가되었음을 관찰하였다 (도 5). 특히， EGF 및 FGF4는 각질과 섬유아세포의 성장에 중요한 성장 인자로서 본 발명에 서 발굴한 인간 진피 유래 성체 줄기세포가 노화 또는 손상된 진피층의 상처 치유 같은 회복에 도움을 줄 것으로 예측이 된다. 또한, VEGF R2, VEGF R3, VEGF D는 혈 관 생성을 유도하는 중요한 성장 인자로서， 본 발명에서 발굴한 인간 진피 유래 성 체 줄기세포가 진피층에 모세 혈관을 성장 또는 이동하게 하여， 혈액을 통한 영양 공급을 원활하게 해주는 역할을 수행할 수 있음올 제시해준다 (도 6， 도 7).
<ιοι^ 이러한 증가는 통계적으로 유의하였으며， 통계는 양측 스튜던트 t 테스트로 검증하였으며， p 값이 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 표시하였다.
<102> 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
<103> 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이 며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<104> [수탁번호]
<105> 기탁기관명 ： 한국생명공학연구원
<106> 수탁번호 ： KCTC11995BP
<107> 수탁일자 ： 2011년 8월 8일
<108>
특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약
국제 양식
원기탁의 수탁증
(규칙 7.1에 따라 발급된)
심중현
대한민국 446-729 경 기도 용인시 기홍구 보라동 314-1
아모레퍼시픽 기술연구원
I. 미생물의 식별
기탁자에 의해 부여된 식별번호 ：
국제기탁기관에 의해 부여된 수탁번호 hDSC
KCTC U995BP
(human dermal stem cell)
II. 과학적 기재 및 /또는 제안된 분류학적 지정
상기 I에 ᅳ 기재된 미생물은 하기 사항이 수반됨 :
[X] 과학적 기재
[ 3 제안된 분류학적 지정
(해당부분에 X자로 표시할 것)
in. 수령 및 수리
본 국제기탁기관은 2011년 8욈 8일에 수령된 상기 I에 기재된 미생물을 수리한다.
IV. 변경 신청 수령
상기 I에 기 재된 미생물은 에 본 국제기탁기관에 의해 수리되 었으며 , 상기 원 기탁 을 부타페스트 조약에 따른 기 탁으로 변경하는 신청을 에 수령하였다.
V. 국제기탁기관
명칭 : 생명자원센터 (Kore Collection for 서명 (기탁기관 대표자의 서명):
Type Culture, KCTC) 주소: 대한민국 305-806 대전광역시 유성구 (이정석, 이사)
과학로 111번지 한국생명공학연구원
(KRIB ) . 날짜 ： 2011, 8. 18.
Form BP/4 (KCTC Form 17) 단일 페이지
: I 09> UDArnST ΤΤΙΕΛΐΥ UN THE INTORMATIONAL lUifO mON 0" Tim tl l'lWIT
OF MlCBOORttANlSMS FOR THE PUBPOSK OF PATENT WtOCBD W
INTERNATIONAL FORM
RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT
issued pursuant to Rule 7.1
TO： SYVNl Joong Hyun
Amorepacific R&D Center
314-1 Bora-dong, Giheung-¾u Yongin-si, Gyeonggi-do 446-729
Republic of Korea
Figure imgf000019_0001
Form BP/4 (KCTC Form 17} Sftlft page 【산업상 이용 가능성】
<ιπ> 본 발명의 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포, 상기 줄기세포에서 분화된 골아세포 또는 상기 줄기세포에서 분화된 지방세포를 포함하는 조성물은 골 생성용 또는 지방생성용 조성물로 이용할 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2) 및 S100b(S100 calcium binding protein B)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 과발현되는 것을 특¾으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포.
【청구항 2】
、 제 1항에 있어서，
상기 줄기세포는
인간 피부 진피 유래 섬유아세포를 계대쎄양한 후 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐 에 반웅시켜서 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐에 부착되는 세포를 분리하여 얻어진 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포.
【청구항 3】
제 2항에 있어서，
상기 줄기세포는，
상기 섬유아세포를 5분 동안 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐과 반웅시켜 얻어진 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포.
【청구항 4]
제 2항에 있어서，
상기 젤라틴은 증류수에 0.1~1 증량 %의 농도로 용해시킨 것이고， 상기 제 4형 콜라겐은 증류수에 10~30 yg/ml의 함량으로 용해시킨 것을 특징으로 하는 인간 피 부 진피 유래 성체 줄기세포.
【청구항 5】
제 2항에 있어서，
상기 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐은 0~10°C의 온도에서 16-24시간 동안 기질에 코팅시킨 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포.
【청구항 6]
제 1항에 있어서，
상기 줄기세포는, ■
인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 EGF(Epidermal growth factor), FGF4(Fibroblast growth factor4), PDGF-AA(P late let -derived growth factor-AA), VEGF R2(Vascular endothelial growth factor receptor 2)., VEGF R3(Vascular endothelial growth factor receptor 3) 및 VEGF D(Vascul r endothelial growth factor D) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성장인자가 과발현되는 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포.
【청구항 7】
, 제 1항에 있어서，
상기 줄기세포는，
기탁번호 KCTC11995BP의 줄기세포인 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유 래 성체 줄기세포.
【청구항 8】
계 1항의 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 분화된 골아세포 또는 지방 세포.
【청구항 9】
제 8항에 있어서，
상기 골아세포는.
피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 OGN(Osteoglycin) 및 ACAN(Aggrecan)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 과발현되는 것을 특징으로 하는 골아세포.
【청구항 10】
제 8항에 있어서，
상기 지방세포는，
피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 PPARG(Peroxisome prol i ferator- activated receptor gamma) , LEP(Leptin) , AdipoQCAdiponect in, C1Q and collagen domain containing) 및 FABP4(Fatty acid binding protein 4, adi ocyte) 로 이루 어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 과발현되는 것을 특징으로 하는 지방 세포.
【청구항 111
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포, 골 아세포 또는 지방세포를 유효성분으로 포함하는 골 생성용 또는 지방생성용 조성 물
【청구항 12]
제 11항에 있어서，
상기 조성물은， 골다공증 예방 및 치유, 피부노화 예방 및 치유， 피부 상처 치유， 피부 혈행 개선， 피부 볼륨감 증진 또는 피부 성형 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 골 생성 용 또는 지방생성용 조성물.
【청구항 13】
인간 피부 진피 유래 섬유아세포를 계대배양한 후 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐 에 반응시켜서 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐에 부착되는 세포를 분리하는 것을 포함하 는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분리방법.
【청구항 14】
제 13항에 있어서，
상기 분리방법은,
상기 섬유아세포를 1~5분 동안 젤라틴 또는 게 4형 콜라겐과 반웅시키는 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 즐기세포의 분리방법.
【청구항 15】
제 13항에 있어서
상기 분리방법은，
상기 젤라틴을 증류수에 0.1~1 중량 %의 농도로 용해시키고 상기 제 4형 콜라 겐을 증류수에 10~30 yg/ml의 함량으로 용해시켜서 섬유아세포와 반웅시키는 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분리방법.
【청구항 16]
제 13항에 있어서,
상기 분리방법은,
상기 젤라틴 또는 제 4형 콜라겐을 0~10°C의 온도에서 16~24시간 동안 기질에 코팅하여서 섬유아세포와 반웅시키는 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성 체 줄기세포의 분리방법 .
【청구항 17]
제 13항에 있어서，
상기 분리방법은,
피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2) 및 S100b(S100 calcium binding protein B)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 더 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분리방법.
【청구항 18】 제 13항에 있어서，
상기 분리방법은，
피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 EGF(Epidermal growth factor), FGF4(Fibroblast growth factor4), PDGF-AA(Platelet-der ived growth factor-AA), VEGF R2(Vascular endothelial growth factor receptor 2)， VEGF R3(Vascular endothelial growth factor receptor 3) 및 VEGF D(Vascular endothelial growth factor D)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성장인자를 과발현하는지 여부 를 확인하는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분리방법.
【청구항 19】
제 13항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 의해 분리된 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 골아세포 또는 지방세포로 분화시키는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분화방법.
【청구항 20】
제 19항에 있어세
상기 분화 방법은，
분리된 줄기세포를 골세포분화배지에서 분화시킨 후,
분화된 세포가 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 OGN(Osteoglycin) 및 ACAN(Aggrecan)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분화방법. 【청구항 21】
제 19항에 있어서，
상기 분화 방법은，
분리된 세포를 지방세포 분화배지에서 분화시킨 후,
분화된 세포가 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 PPARG(Peroxisome prol i ferator-act ivated receptor gamma) , LEP(Lept in) , AdipoQ(Adiponect in, C1Q and collagen domain containing) 및 FABP4( Fatty acid binding protein 4， adipocyte)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부 를 확인하는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분화방법.
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