KR20130022484A - 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 피부 진피로부터 유래한 성체 줄기세포 및 그의 분리방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 분화된 골아세포 또는 지방세포 및 그의 분화방법을 제공한다. 또한, 상기 줄기세포, 골아세포 또는 지방세포를 포함하는 골 생성용 또는 지방생성용 조성물을 제공한다. 본 발명의 분리방법은 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 쉽고 간단하며, 고수득율로 확보할 수 있게 하고, 상기 방법으로 분리된 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 특이적으로 발현하는 유전자 및 성장 인자를 추후 분리 및 동정하여 이용할 수 있다.

Description

인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포{ADULT STEM CELLS DERIVED HUMAN SKIN DERMIS}
본 발명은 인간의 피부 진피로부터 유래한 성체 줄기세포에 관한 것이다.
다분화 기능(pluripotent)을 소유하는 성체 줄기세포를 조직으로부터 분리하려는 노력은 최근 몇 년 전부터 줄곧 진행되어 왔다. 이런 성체 줄기세포는 배아줄기세포의 전분화기능(totipotent)에 비해 조직 내의 모든 세포로 분화하지는 못하는 단점이 있지만, 배아줄기세포에서 문제시될 수 있는 윤리적인 문제에서는 자유로울 수 있다는 점에서 연구 및 활용의 의미가 있다. 단, 배아줄기세포와는 달리 성체 조직에서 발굴/동정을 하기에는 성체 줄기세포의 수(해당 조직의 약 1~5% 미만으로 추정)가 상당히 작아서 연구를 하는 데 어려움이 존재하는 단점이 있다.
궁극적으로 줄기세포에 관한 연구를 통해 얻고자 하는 것은 주로 치료 목적의 사용이라고 할 수 있는 데, 특정 장기 조직에 질환 또는 질병을 앓고 있는 환자들에게 줄기세포 기반의 새로운 세포를 공급하는 일종의 세포 치환(cell transplantation) 또는 교체(replacement)을 통해 건강 회복에 대한 희망을 줄 수 있다고 판단하고 있다. 인간의 피부 성체 줄기세포 역시 화상과 같은 피부 손상, 창상, 궤양, 아토피 등 피부 질환을 치료하는 데 응용될 수 있다고 판단되고 연구가 진행되고 있다. 각질층(epidermis), 진피(dermis), 피하지방층(subcutaneous adipose), 그리고, 부속기(appendage)로 구성된 이들 피부층에서 즉, 각질층으로부터 각질 줄기세포(epidermal stem cells), 부속기인 모발로부터 모낭 줄기세포(hair follicle stem cells) 같은 다분화 기능을 갖는 세포군이 동정이 되었다. 또한, 진피 유래 성체 줄기세포들의 경우에는 설취류 및 인간으로부터 현탁 배양(suspension culture)이라는 특정 배양 시스템을 사용해서 동정이 되었는데, 이런 진피 유래 성체 줄기세포들(Skin Derived Precursors, SKPs)은 지방 세포, 골세포, 근육 세포 등 중간엽(mesoderm) 형태의 세포로 분리될 수 있다는 정도만 관찰되었다(Toma et al., 2001; Toma et al., 2005).
무엇보다, 이들 피부 성체 줄기세포의 전체 피부 조직에서 차지하는 수가 현저히 낮은데, 각질 줄기세포의 경우에는 각질형성세포 수의 1-5% 미만으로 예상되며, 진피 유래 줄기세포의 경우에도 2-3% 정도로 파악되어 이를 분리하는 데 어려움이 있으며, 이에 따라 이들 피부 성체 줄기세포를 분리하는 데, 필요한 특이적인 표식자(또는 바이오마커)에 대한 발견이 거의 없는 실정이다. 현재까지 각질 줄기세포의 표식자로 밝혀진 것은 알파6-인테그린, CD71, 베타1-인테그린, p63 정도(Webb et al., 2004; Yi et., 2008)이며, 모낭 줄기세포의 경우 CD200(Garza et al., 2011)만 알려져 있는 정도이다.
최근에 인간 진피층으로부터 정상적인 진피 섬유아세포 배양 시스템을 사용하여, 분리한 진피 유래 성체 줄기세포의 경우 독특하게 지방 세포, 골 세포, 연골 세포 등으로 다분화 기능을 하는 것이 발견이 되었으며, 이들은 특이적으로 vimentin+(발현), nestin-(비발현) 하는 것으로 관찰되었다(Chen FG et al., 2007). 그러나, 이들을 분리하는 방법은 정상적인 섬유아세포 배양 시스템과 크게 다르지 않아서 효과적으로 수율을 높이는 데는 문제점이 있다.
Toma et al., 2001 Toma et al., 2005 Webb et al., 2004 Yi et., 2008 Garza et al., 2011 Chen FG et al., 2007
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위해서, 특이적인 유전자 및 성장인자를 바이오 마커로 발현하는 것을 특징으로 하는 피부로부터 분리된 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2) 및 S100b(S100 calcium binding protein B)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 과발현되는 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 줄기세포는, 인간 피부 진피 유래 섬유아세포를 계대배양한 후 젤라틴 또는 제4형 콜라겐에 반응시켜서 젤라틴 또는 제4형 콜라겐에 부착되는 세포를 분리하여 얻어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 줄기세포는, 상기 섬유아세포를 1~5분 동안 젤라틴 또는 제4형 콜라겐과 반응시켜 얻어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 젤라틴은 증류수에 0.1~1 중량%의 농도로 용해시킨 것이고, 상기 제4형 콜라겐은 증류수에 10~30 μg/ml의 함량으로 용해시킨 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 젤라틴 또는 제4형 콜라겐은 0~10℃의 온도에서 16~24시간 동안 기질에 코팅시킨 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 줄기세포는, 인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 EGF(Epidermal growth factor), FGF4(Fibroblast growth factor4), PDGF-AA(Platelet-derived growth factor-AA), VEGF R2(Vascular endothelial growth factor receptor 2), VEGF R3(Vascular endothelial growth factor receptor 3) 및 VEGF D(Vascular endothelial growth factor D) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성장인자가 과발현되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 줄기세포는 기탁번호 KCTC11995BP의 줄기세포이다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 분화된 골아세포 또는 지방세포를 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 골아세포는 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 OGN(Osteoglycin) 및 ACAN(Aggrecan)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 과발현되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 지방세포는, 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 PPARG(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), LEP(Leptin), AdipoQ(Adiponectin, C1Q and collagen domain containing) 및 FABP4(Fatty acid binding protein 4, adipocyte) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 과발현되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포, 골아세포 또는 지방세포를 유효성분으로 포함하는 골 생성용 또는 지방생성용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물은 골다공증 예방 및 치유, 피부노화 예방 및 치유, 피부 상처 치유, 피부 혈행 개선, 피부 볼륨감 증진 또는 피부 성형 효능을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 인간 피부 진피 유래 섬유아세포를 계대배양한 후 젤라틴 또는 제4형 콜라겐에 반응시켜서 젤라틴 또는 제4형 콜라겐에 부착되는 세포를 분리하는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분리방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 분리방법은, 상기 섬유아세포를 1~5분 동안 젤라틴 또는 제4형 콜라겐과 반응시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 분리방법은, 상기 젤라틴을 증류수에 0.1~1 중량%의 농도로 용해시키고, 상기 제4형 콜라겐을 증류수에 10~30 μg/ml의 함량으로 용해시켜서 섬유아세포와 반응시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 분리방법은, 상기 젤라틴 또는 제4형 콜라겐을 0~10℃의 온도에서 16~24시간 동안 기질에 코팅하여서 섬유아세포와 반응시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 분리방법은, 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2) 및 S100b(S100 calcium binding protein B)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 분리방법은, 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 EGF(Epidermal growth factor), FGF4(Fibroblast growth factor4), PDGF-AA(Platelet-derived growth factor-AA), VEGF R2(Vascular endothelial growth factor receptor 2), VEGF R3(Vascular endothelial growth factor receptor 3) 및 VEGF D(Vascular endothelial growth factor D)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성장인자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 분리방법에 의해 분리된 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 골아세포 또는 지방세포로 분화시키는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분화방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 분화 방법은, 분리된 줄기세포를 골세포분화배지에서 분화시킨 후, 분화된 세포가 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 OGN(Osteoglycin) 및 ACAN(Aggrecan)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 분화 방법은, 분리된 세포를 지방세포 분화배지에서 분화시킨 후, 분화된 세포가 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 PPARG(peroxisome proliferator-activated receptor gamma), LEP(Leptin), AdipoQ(Adiponectin, C1Q and collagen domain containing) 및 FABP4(Fatty acid binding protein 4, adipocyte)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포, 상기 줄기세포에서 분화된 골아세포 또는 상기 줄기세포에서 분화된 지방세포를 포함하는 조성물은 골 생성용 또는 지방생성용 조성물로 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 분리방법은 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 쉽고 간단하며, 고수득율로 확보할 수 있게 하고, 상기 방법으로 분리된 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 특이적으로 발현하는 유전자 및 성장 인자를 추후 분리 및 동정하여 이용할 수 있게 하는 효과가 있다.
도 1은 젤라틴으로 분리한 피부 진피 유래 성체 줄기세포 및 피부 진피 유래 섬유아세포의 줄기세포능인 군집 형성 능력을 비교한 결과이다.
도 2는 분리한 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 진피 유래 섬유아세포 대비 Sox2(가) 및 S100b(나)의 발현이 각각 2배 및 3배 이상 증가한 결과이다. 종래 분리되었던 Vimentin+(발현)/Nestin-(비발현)을 보인 인간 진피 유래 성체 줄기세포와 동일 또는 유사한 지 확인한 결과, Vimentin(다), Nestin(라)는 모두 발현하며, 진피 유래 섬유아세포 대비 전혀 차이가 없었으므로, 기존에 동정된 인간 진피 유래 성체 줄기세포(vimentin+(발현), nestin-(비발현), Chen FG et al., 2007)와는 본 발명의 인간 진피 유래 성체 줄기세포와는 다름을 제시한다.
도 3은 분리한 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 골아세포로 분화되며, 골아세포의 대표적인 표식자(유전자 마커)인 OGN(가), ACAN(나)가 발현되는 결과이다.
도 4는 분리한 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 지방세포로 분화되며, 지방세포의 대표적인 표식자(유전자 마커)인 PPARg(가), AdipoQ(나), Leptin(다), FABP4(라)가 발현되는 결과이다.
도 5는 분리한 피부 진피 유래 성체 줄기세포가 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 세포 성장 인자 EGF(가), FGF4(나) 및 혈관 생성 인자 PDGF-A(다), VEGF R2(라), VEGF R3(마), VEGF-D(바)가 과발현되는 결과이다.
도 6은 피부 진피 내에 존재하는 혈관에 관한 것이다.
도 7은 혈관 생성 인자의 분류 체계도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 피부 조직 특히, 각질 줄기세포나 모낭 줄기세포에 비해 아직까지 실체가 명확하게 규명이 되지 않은 인간 진피 유래 성체 줄기세포에 대한 동정 및 수득율을 높이는 방법을 고안하는 과정 중, 젤라틴 또는 제4형 콜라겐이 세포와 부착력이 시간에 따라 상이함을 확인하고, 이를 바탕으로 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2) 및 S100b(S100 calcium binding protein B)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 과발현되는 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 제공한다.
상기 Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2) 및 S100b(S100 calcium binding protein B) 는 다른 인간 조직 성체 줄기세포의 여러 종류의 유전자 마커 중에 본 발명의 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 특이적으로 발현량이 증가한 것으로 본 발명자들이 최초로 발명한 것이다.
종래에 알려진 피부 진피 유래 성체 줄기세포는 Nestin-(비발현), Vimentin +(발현)으로 알려져 있다. 본 발명에서 분리한 피부 진피 유래 성체 줄기세포는 피부 진피 유래 섬유아세포 대비 Nestin 및 Vimentin의 발현양상에 차이가 없는 것을 특징으로 가지므로, 종래의 피부 진피 유래 성체 줄기세포와는 다른 줄기세포이다.
종래 제4형 콜라겐를 활용하여 분리한 피부 성체 줄기세포는 여러 유형의 피부 성체 줄기세포 중에서도 각질 줄기세포만이 알려져 있다. 본 발명의 피부 진피 유래 성체 줄기세포는 종래의 피부 진피 유래 성체 줄기세포와는 다른 신규한 줄기세포로서, 본 발명자들이 최초로 발명한 것이다.
또한, 본 발명은 인간 피부 진피 유래 섬유아세포를 2번째 또는 3번째 계대배양한 후 젤라틴 또는 제4형 콜라겐에 반응시켜서 젤라틴 또는 제4형 콜라겐에 부착되는 세포를 분리하는 것을 포함하는 피부 진피 유래 성체 줄기세포 분리방법 및 그 분리방법으로 분리된 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 제공한다.
상기 반응시간은 1~5분, 바람직하게는 4~5분일 수 있다. 1분 미만이면 줄기세포의 적절한 수득율을 기대하기 어렵고, 5분 이상 반응시키면 다른 일반 섬유아세포들이 섞일 수 있다. 즉, 5분 초과 30분 사이 정도가 되면 50~60% 정도의 세포들이 붙게 되며 이는 중력에 의해 일반 섬유아세포들이 제4형 콜라겐 혹은 젤라틴과 결합하여 붙은 것이다.
상기 젤라틴 또는 제4형 콜라겐은, 젤라틴 0.1 ~ 1 %(중량/용매부피) 또는 제4형 콜라겐 10 ~ 30 μg/ml의 함량으로 섬유아세포와 반응할 수 있다. 상기 용매는 증류수, 구체적으로는 3차 증류수일 수 있다. 상기 콜라겐은 0.25% 아세트산에 1mg/ml의 농도로 stock을 만든 후, 3차 증류수로 희석하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 젤라틴 또는 제4형 콜라겐은, 0~10℃, 바람직하게는 4℃의 온도에서 16~24시간 동안 기질에 코팅된 것일 수 있다.
상기 기질은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌의 공중합체, 금속, 실리콘 및 유리로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 금속은 니켈, 금 또는 은일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 기질은 통상의 배양용기일 수 있다. 상기 기질의 형상은 특별히 한정되지 않으며, 구형 입자, 플레이트, 튜브 등일 수 있다. 상기 코팅은 공지의 방법으로 실시할 수 있다.
상기 분리방법은, 분리된 세포에서 인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2) 및 S100b(S100 calcium binding protein B)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 분리방법은, 인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 EGF(Epidermal growth factor), FGF4(Fibroblast growth factor4), PDGF-AA(platelet-derived growth factor-AA), VEGF R2(Vascular endothelial growth factor receptor 2), VEGF R3(Vascular endothelial growth factor receptor 3) 및 VEGF D(Vascular endothelial growth factor D)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성장인자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 분리한 피부 진피 유래 성체 줄기세포는 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 EGF(Epidermal growth factor), FGF4(Fibroblast growth factor4), PDGF-AA(Platelet-derived growth factor-AA), VEGF R2(Vascular endothelial growth factor receptor 2), VEGF R3(Vascular endothelial growth factor receptor 3) 및 VEGF D(Vascular endothelial growth factor D) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성장인자를 과발현할 수 있다.
본 발명은 상기 분리방법에 의하여 분리된 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 골아세포 또는 지방세포로 분화시키는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분화방법 및 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 분화된 골아세포 또는 지방세포를 제공한다.
상기 분화 방법은, 분리된 줄기세포를 골아세포 분화배지(hMSC Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium, Lonza PT-3002)에서 분화 시켰으며, 총 14일 기간동안 2~3일에 한번씩 배지를 교환하여 분화시킬 수 있다(실시예 4 참조)에서 분화시킨 후, 분화된 세포가 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 OGN(Osteoglycin) 및 ACAN(Aggrecan)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 분화된 골아세포는 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 OGN(Osteoglycin) 및 ACAN(Aggrecan)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현할 수 있다.
상기 분화 방법은, 분리된 줄기세포를 지방세포 분화배지, 구체적으로는 DMEM 배지, 더욱 구체적으로는 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum)과 0.1% 인슐린(Insulin), 1μM의 덱사메타손(Dexamethasone), 0.5mM의 아이비엠엑스(IBMX), 1μM의 트로글리타존(Troglitazone)이 첨가된 DMEM배지를 이용하여 7일간 2~3일마다 배지를 교환하여 분화시킬 수 있다(실시예 5 참조). 분화된 세포가 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 PPARG(peroxisome proliferator-activated receptor gamma), LEP(Leptin), AdipoQ(Adiponectin, C1Q and collagen domain containing) 및 FABP4(Fatty acid binding protein 4, adipocyte) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 분화된 지방세포는 인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 PPARg, LEP, AdipoQ 및 FABP4로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 피부 진피 유래 성체 줄기세포, 상기 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 분화된 골아세포 또는 상기 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 분화된 지방세포를 유효성분으로 포함하는 골 생성용 또는 지방생성용 조성물을 제공한다.
본 발명에 의한 상기 조성물은 골다공증 예방 및 치유, 피부노화 예방 및 치유, 피부 상처 치유, 피부 볼륨감 증진 또는 피부 성형 효능을 가진다. 상기 조성물은 일반적으로 피부에 사용하는 조성물 전반을 포괄하는 개념이며, 구체적으로 피부 외용제 조성물일 수 있고, 예를 들어 화장료 조성물 또는 약학 조성물일 수 있다.
화장료 조성물로는 예를 들어, 기초 화장료, 메이크업 화장료, 모발용 화장료, 바디용 화장료 등이 있을 수 있고, 그 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다.
예를 들면, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연화장수, 영양화장수, 로션, 바디로션, 영양 크림, 마사지 크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 젤, 패치, 수중유(O/W)형, 유중수(O/W)형 등의 기초 화장료, 립스틱, 메이크업베이스 또는 파운데이션 등의 색조 화장료, 샴푸, 린스, 바디클렌저, 치약 또는 구강 청정제 등의 세정료, 헤어토닉, 젤 또는 무스 등의 정발제, 양모제 또는 염모제 등의 모발용 화장료 조성물로 제형화 될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, 상기 화장료 조성물에 추가적으로 점증제를 함유할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 점증제는 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 하이드록시 구아닌, 하이드록시 메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄, 세테아릴 알콜, 스테아릭산, 카라기난 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 카르복시 메틸 셀룰로스, 카르복시 비닐 폴리머, 폴리쿼터늄 중에서 1종 이상을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 카르복시 비닐 폴리머가 될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서 상기 화장료 조성물은 필요에 따라 적절한 각종의 기제와 첨가제를 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 발명자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. 필요에 따라 허용 가능한 첨가제를 함유할 수 있으며, 예를 들면, 당업계에 통상적인 방부제, 색소, 첨가제 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
방부제는 구체적으로 페녹시에탄올(Phenoxyethanol) 또는 1,2-헥산디올(1,2-Hexanediol) 등이 될 수 있고, 향료는 인공향료 등이 될 수 있다.
그리고, 본 발명의 일 실시태양에서 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다. 이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서 약학 조성물은 상기 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 담체, 부형제 및 희석제를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 비경구 투여제로 제제화 할 수 있다. 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 패취, 스프레이, 현탁제 및 유제로 이루어진 군에서 선택되는 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
각 제형에 의한 조성물에 있어서, 상기한 본 발명의 조성물 이외의 다른 성분들을 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승효과가 일어날 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 조성물이 약학 조성물로 사용될 경우에, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투업 조절을 위한 염 또는 완충제 등의 약학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다.
유효성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.
일반적으로 유효성분의 투여량은 0.001mg/kg/일 내지 대략 2000mg/kg/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.5mg/kg/일 내지 2.5mg/kg/일이다. 외용투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.
[실시예 1] 젤라틴 또는 제4형 콜라겐를 이용한 인간 진피 유래 섬유아세포에서 RA/SA 세포의 분리
인간 진피유래 섬유아세포(Normal human dermal fibroblasts, NHDF)를 론자(Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA, NHDF-Ad-Der Fibroblasts, CC-2511,)에서 구입하였다. 상기 인간 진피유래 섬유아세포를 75 cm2 T-flask에 계대배양을 하여, CO2 배양기(CO2 Incubator)에서 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양을 하였다. 통상적으로 2번째 또는 3번째에서 세포의 계대 배양(passage)을 진행하였다.
0.1 ~ 1% 젤라틴 또는 10 ~ 30 ㎍/ml의 제4형 콜라겐을 100 mm 배양 접시에 5ml씩 넣어주어 4℃에 16시간 ~ 24시간 코팅하였다. 인간 진피 유래 섬유아세포를 0.25% 트립신(Trypsin-EDTA)으로 100 mm 배양 접시로부터 분리한 뒤 1200rpm에서 5분간 세포를 가라앉힌 다음, 배양액을 제거한 뒤에 5ml의 DMEM배지를 넣어주어 세포를 현탁한 후, 젤라틴 또는 제4형 콜라겐이 코팅된 배양 접시에 5분간 배양하여 배양 접시에 붙은 세포(RA; Rapidly Adhering) 와 초기 5분 내에 배양 접시에 붙지는 않지만 4시간 이내에 붙는 세포(SA; Slowly Adhering)로 각각 분리하였다.
[실시예 2] 분리된 RA/SA세포의 세포군집형성 능력(Colony forming assay) 확인
젤라틴 또는 제4형 콜라겐로 분리된 RA/SA세포의 줄기세포능(stemness)을 비교하기 위하여 세포군집형성 능력을 확인하였다.
분리된 RA/SA 세포를 6 well 배양 접시에 1 X 102 개의 세포수로 14일간 배양한 후, 10% 에탄올과 0.1% 크리스탈 바이올렛(Crystal violet)이 함유된 용액으로 5분간 실온에서 염색한 다음 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 4회 세척하여 현미경으로 확인하였다.
상기 실험결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 분리된 RA세포에서 세포군집형성 능력이 증가함을 확인할 수 있다(이하 RA를 인간 진피 유래 성체 줄기세포라고 하며, SA세포를 인간 진피 유래 섬유아세포라고 명명한다). 본 발명자들은 본 발명에서 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포를 한국생명공학연구원(KRIBB: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 내의 KCTC(미생물자원센터: Korean Collection for Type Cultures) 에 2011년 8월 8일자로 기탁하였으며, 기탁번호는 KCTC11995BP이다.
[실시예 3] mRNA 발현양 측정을 통한 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 특정 표식자(유전자 마커) 선정
실시예 1에서 본 바와 같이, 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포 및 진피 유래 섬유아세포를 2 ml의 PBS로 세포를 세척한 다음, 이후, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kit, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트사의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase(RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)을 통해 정량적으로 분석하였다.
분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포 및 진피 유래 섬유아세포에서 각각 다른 성체 줄기세포에서 특징적인 표식자(유전자 마커)로 알려진 Sox2, S100b 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan gene expression assay kit,Applied Biosystems, Foster City, CA)(Sox2 유전자 프라이머: Hs01053049_s1,S100b 유전자 프라이머: Hs00389217_m1)을 이용하여 평가하였으며, 그 결과를 도2 가, 나 에 나타내었다. 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포에서의 각 유전자의 발현 양이 인간 진피 유래 섬유아세포 대비, 약 2~3배 정도 증가함을 확인하였다. 한편, Nestin-(비발현), Vimentin+(발현)의 특징을 갖는 기존에 알려진 인간 진피 유래 성체 줄기세포와 동일 또는 유사한 지 Nestin(Hs00707120_s1) 및 Vimentin(Hs00185584_m1) 유전자의 발현 양을 조사하였다. 본 발명자가 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포에서는 Nestin(Hs00707120_s1) 및 Vimentin(Hs00185584_m1) 모두 발현이 되었으며, 진피 유래 섬유아세포와 비교해 본 결과, 발현량에 있어서 전혀 차이를 보이지 않았다(도2 다, 라). 따라서 본 발명자가 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포는 기존에 동정되지 않았던, 신규한 진피 유래 성체 줄기세포이다
이러한 증가는 통계적으로 유의하였으며, 통계는 양측 스튜던트 t 테스트로 검증하였으며, p 값이 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 표시하였다.
[실시예 4] 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 분화능력 확인
젤라틴 또는 제4형 콜라겐로 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 분화능력을 파악하기 위하여 골아세포(Osteoblast)와 지방세포(Adipocyte)로 각각 분화를 유도하였다.
골아세포의 분화는 론자(Lonza, Inc. Walkersville, MD, USA)의 골아세포 분화배지(hMSC Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium, PT-3002)를 이용하여 유도되었다. 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포 및 진피 유래 섬유아세포는 각각 6 well 배양 접시에 각각 20 X 104 개씩 배양한 후 골아세포 분화배지로 14일간 분화를 유도한 후 유전자 발현으로 확인하였다.
지방세포의 분화는 10% 우태아혈청과 0.1% 인슐린(Insulin), 1μM의 덱사메타손(Dexamethasone), 0.5mM의 아이비엠엑스(IBMX), 1μM의 트로글리타존(Troglitazone)이 첨가된 DMEM배지를 이용하여 유도되었다. 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포 및 진피 유래 섬유아세포는 각각 6 well 배양 접시에 각각 20 X 104 개씩 배양한 후 지방세포 분화배지로 7일간 분화를 유도한 후 유전자 발현으로 확인하였다.
[실시예 5] 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포 및 진피 유래 섬유아세포의 골아세포와 지방세포로 분화된 세포의 분화 바이오마커 발현량 측정
분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포 및 진피 유래 섬유아세포를 골아세포와 지방세포로 각각 분화를 유도한 후, 위 실시예 3과 동일한 방법으로, 골아세포의 바이오마커인 OGN, ACAN과 지방세포의 바이오마커인 PPARG, Leptin, AdipoQ, FABP4 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)(OGN 유전자 프라이머: Hs00247901_m1, ACAN 유전자 프라이머: Hs00153936_m1, PPARG 유전자 프라이머: Hs01115513_m1, Leptin 유전자 프라이머: Hs00174877_m1, AdipoQ 유전자 프라이머: Hs00605917_m1, FABP4 유전자 프라이머: Hs01086177_m1)을 이용하여 평가하였으며, 그 결과를 도 3과 도 4에 나타내었다. 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포 각 유전자의 발현 양이 진피 유래 섬유아세포 대비, 약 2배 이상 증가함을 확인하였다. 이러한 증가는 통계적으로 유의하였으며, 통계는 양측 스튜던트 t 테스트로 검증하였으며, p 값이 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 표시하였다.
[실시예 6] 분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포에서 특이적으로 분비하는 성장 인자(Growth factor) 선정
분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포로부터 배양액으로 분비되는 성장인자 발현 양상을 파악하기 위하여 성장 인자 어레이(Growth factor array, Raybio, Norcross, GA, USA)를 실시하였다.
분리한 인간 진피 유래 성체 줄기세포 및 진피 유래 섬유아세포는 6 well 배양 접시에 각각 20 X 104 개씩 배양한 후 배양액을 수획하여 성장인자 어레이를 수행하였다. 2ml의 차단 버퍼를 실온에서 30분 처리한 후 1ml의 배양액을 상온에서 2시간 처리하였다. 이후 2ml의 워싱버퍼로 5분간 5회 세척하고 바이오틴(Biotin)이 결합된 항성장 인자(anti-growth factor) 항체로 상온에서 2시간 반응시킨다. 추가적으로 2ml의 워싱버퍼로 5분간 5회 세척하고 HRP가 결합한 스트렙토아비딘(streptoavidin)을 2ml 처리하여 2시간 반응하고 워싱버퍼로 세척후 디텍션(detection) 버퍼로 반응시켜 LAS-3000(Fujifilm)기기로 현상하였다.
총 41종의 성장인자를 분석하였을 때 인간 진피 유래 섬유아세포 배양액 과 비교해볼 때, 인간 진피 유래 성체 줄기세포의 배양액에서 성장인자 EGF, FGF4, PDGF-AA, VEGF R2, VEGF R3, VEGF D가 10% 이상 증가되었음을 관찰하였다(도 5). 특히, EGF 및 FGF4는 각질과 섬유아세포의 성장에 중요한 성장 인자로서 본 발명에서 발굴한 인간 진피 유래 성체 줄기세포가 노화 또는 손상된 진피층의 상처 치유 같은 회복에 도움을 줄 것으로 예측이 된다. 또한, VEGF R2, VEGF R3, VEGF D는 혈관 생성을 유도하는 중요한 성장 인자로서, 본 발명에서 발굴한 인간 진피 유래 성체 줄기세포가 진피층에 모세 혈관을 성장 또는 이동하게 하여, 혈액을 통한 영양 공급을 원활하게 해주는 역할을 수행할 수 있음을 제시해준다(도 6, 도 7).
이러한 증가는 통계적으로 유의하였으며, 통계는 양측 스튜던트 t 테스트로 검증하였으며, p 값이 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 표시하였다.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC11995BP 20110808

Claims (21)

  1. 인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2) 및 S100b(S100 calcium binding protein B)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 과발현되는 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는,
    인간 피부 진피 유래 섬유아세포를 계대배양한 후 젤라틴 또는 제4형 콜라겐에 반응시켜서 젤라틴 또는 제4형 콜라겐에 부착되는 세포를 분리하여 얻어진 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 줄기세포는,
    상기 섬유아세포를 1~5분 동안 젤라틴 또는 제4형 콜라겐과 반응시켜 얻어진 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 젤라틴은 증류수에 0.1~1 중량%의 농도로 용해시킨 것이고, 상기 제4형 콜라겐은 증류수에 10~30 μg/ml의 함량으로 용해시킨 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 젤라틴 또는 제4형 콜라겐은 0~10℃의 온도에서 16~24시간 동안 기질에 코팅시킨 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는,
    인간 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 EGF(Epidermal growth factor), FGF4(Fibroblast growth factor4), PDGF-AA(Platelet-derived growth factor-AA), VEGF R2(Vascular endothelial growth factor receptor 2), VEGF R3(Vascular endothelial growth factor receptor 3) 및 VEGF D(Vascular endothelial growth factor D) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성장인자가 과발현되는 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는,
    기탁번호 KCTC11995BP의 줄기세포인 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포.
  8. 제1항의 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포에서 분화된 골아세포 또는 지방세포.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 골아세포는.
    피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 OGN(Osteoglycin) 및 ACAN(Aggrecan)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 과발현되는 것을 특징으로 하는 골아세포.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 지방세포는,
    피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 PPARG(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), LEP(Leptin), AdipoQ(Adiponectin, C1Q and collagen domain containing) 및 FABP4(Fatty acid binding protein 4, adipocyte) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 과발현되는 것을 특징으로 하는 지방세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포, 골아세포 또는 지방세포를 유효성분으로 포함하는 골 생성용 또는 지방생성용 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 조성물은,
    골다공증 예방 및 치유, 피부노화 예방 및 치유, 피부 상처 치유, 피부 혈행 개선, 피부 볼륨감 증진 또는 피부 성형 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 골 생성용 또는 지방생성용 조성물.
  13. 인간 피부 진피 유래 섬유아세포를 계대배양한 후 젤라틴 또는 제4형 콜라겐에 반응시켜서 젤라틴 또는 제4형 콜라겐에 부착되는 세포를 분리하는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분리방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 분리방법은,
    상기 섬유아세포를 1~5분 동안 젤라틴 또는 제4형 콜라겐과 반응시키는 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분리방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 분리방법은,
    상기 젤라틴을 증류수에 0.1~1 중량%의 농도로 용해시키고, 상기 제4형 콜라겐을 증류수에 10~30 μg/ml의 함량으로 용해시켜서 섬유아세포와 반응시키는 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분리방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 분리방법은,
    상기 젤라틴 또는 제4형 콜라겐을 0~10℃의 온도에서 16~24시간 동안 기질에 코팅하여서 섬유아세포와 반응시키는 것을 특징으로 하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분리방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 분리방법은,
    피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2) 및 S100b(S100 calcium binding protein B)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 더 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분리방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 분리방법은,
    피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 EGF(Epidermal growth factor), FGF4(Fibroblast growth factor4), PDGF-AA(Platelet-derived growth factor-AA), VEGF R2(Vascular endothelial growth factor receptor 2), VEGF R3(Vascular endothelial growth factor receptor 3) 및 VEGF D(Vascular endothelial growth factor D)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성장인자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분리방법.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 의해 분리된 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포를 골아세포 또는 지방세포로 분화시키는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분화방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 분화 방법은,
    분리된 줄기세포를 골세포분화배지에서 분화시킨 후,
    분화된 세포가 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 OGN(Osteoglycin) 및 ACAN(Aggrecan)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분화방법.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 분화 방법은,
    분리된 세포를 지방세포 분화배지에서 분화시킨 후,
    분화된 세포가 피부 진피 유래 섬유아세포에 비해 PPARG(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), LEP(Leptin), AdipoQ(Adiponectin, C1Q and collagen domain containing) 및 FABP4(Fatty acid binding protein 4, adipocyte)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 과발현하는지 여부를 확인하는 것을 포함하는 인간 피부 진피 유래 성체 줄기세포의 분화방법.
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