WO2013026989A2 - Liposome comprenant au moins un derive de cholesterol - Google Patents

Liposome comprenant au moins un derive de cholesterol Download PDF

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WO2013026989A2
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oxime
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cholest
alkyl
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Corinne Chaimbault
Magali MICHAUD
Patrick Berna
Sophie SCHALLER
Firas BASSISSI
Simon Eastman
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Trophos
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • Liposome comprising at least one cholesterol derivative.
  • the present invention relates to a new dosage form of cholesterol derivatives.
  • the invention relates to liposomes comprising at least one cholesterol derivative corresponding to formula (I) described below and compositions comprising said liposomes.
  • cholesterol derivative may be used to designate the compounds of formula (I), or their counterparts not specifically described in the present application, and their analogues. Indeed, all these compounds of formulas I have in common the skeleton cholesterol.
  • the invention relates to liposomes comprising at least one compound corresponding to the following formula (I)
  • R 2 may represent a hydrogen atom or an alkyl group Ci-C 6 cycloalkyl, C 3 -C 6 alkenyl, C 2 -C 6 alkynyl, C 2 -C 6 alkyl, aryl, heterocycle, or halogen atom or a group -CN, -CF 3 , -NO 2 , -OR a , -SR a , -SO 2 R a , -NR a R b , -C (O) -R a , -OC (O) R a , -OC (O) NR a R b , -C (O) OR a , -C (O) NR a R b , wherein
  • R a and R b may be chosen from a hydrogen atom or a CC 6 alkyl group, a C 2 -C 6 alkenyl group, a cycloalkyl group; C 3 -C 6 , an aryl group, a heterocyclic group or
  • R a and R b together can form a hydrocarbon chain, linear or branched, having from 2 to 6 carbon atoms, optionally comprising one or more double bonds and / or optionally interrupted by one or more atom (s) of oxygen, sulfur or nitrogen, or
  • R a and R b taken together with the nitrogen to which they are attached may form a C 3 -C 6 heterocyl, said heterocycle may comprise one or more double bonds and / or one or more d atom (s) oxygen, sulfur or nitrogen;
  • R 3 may represent a hydrogen atom or a C 1 -C 6 alkyl group, or
  • R 4 may represent a hydrogen atom or a C 1 -C 6 alkyl group, or a hydroxyamino group (-NH 2 -OH); or
  • R 3 and R 4 taken together may form an additional carbon-carbon bond between the carbon atoms to which they are attached, or a C 3 -C 6 cycloalkyl group;
  • R 5 mayirrirun hydrogen atom or an alkyl group Ci-C 6 cycloalkyl, C 3 -C 6 alkenyl, C 2 -C 6 alkynyl, C 2 -C 6 alkyl, aryl, or -CN, -OR a , -SR a , -SO 2 R a , -NR a R b , -C (O) -R a , -OC (O) R a , -OC (O) NR a R b , R a and R b being as defined above, or a hydroxyamino group (-NH 2 -OH);
  • R 8 may represent a group selected from a C 4 -C 4 alkyl group
  • Ru may represent a C 4 -C 6 alkyl group; 2 or a C 4 -C 12 alkenyl group, especially a C 5 -C 10 alkyl group, preferentially the following G 7 grouping
  • Y may represent an oxygen atom or a group -NR a with R a being as previously described, and
  • R15 may be an alkyl -C 6 cycloalkyl, C 3 -C 6 alkyl, aryl, heterocycle, -C (0) -C 6 -C, -C (0) -cycloalkyl, C3-C6 alkyl, -C (0 ) -aryl, -C (O) -heterocycle, in particular a group represented by one of the formulas (III) or (IV)
  • R 6 may represent a hydrogen atom or a halogen atom or a hydroxyl group, preferably a hydrogen atom;
  • R 7 may represent a hydrogen atom, or a group -OR a , R a being as defined above, preferably a hydrogen atom;
  • R 1 can represent a hydrogen atom or a group -CH 3, -CH 2 -CN, -CH 2 -OR a , -CH 2 -SR a , -CH 2 -SeR a , -C (O) -R a , -C (O) OR a , -O-C (O) NR a R b , -C (O) NR a R b , R a and R b being as defined above,
  • R a and R b being as previously defined and
  • n can represent an equal integer that can take any of the values from 0 to 4, or
  • m can represent an integer that can take any of the values from 1 to 8.
  • Q may represent an oxygen atom or a group -NR a in which R a is as defined above and
  • R c can represent
  • R 9 may represent a hydrogen atom, a C 1 -C 6 alkyl group or a halogen atom;
  • Rg and Ru taken together may form an additional carbon-carbon bond between the carbon atoms to which they are attached, or a C 3 -C 6 cycloalkyl group;
  • R 0 may represent a hydrogen atom, a halogen atom or a group -OR a , -SR a , -CN, -NR a R b , -R a and -R b being as defined above;
  • Ru may represent a hydrogen atom, or an alkyl group -C 6 cycloalkyl, C 3 -C 6 aryl or a halogen atom;
  • R-I2 may represent a hydrogen atom or an alkyl group Ci-C 6 or a halogen atom or a -CN, -OR a, -SR a, -SeR a, -C (0) -R a , -C (O) OR a , -NR a R b , -OC (O) NR a R b , -R a and -R b being as defined above; or
  • R13 may represent a hydrogen atom or an alkyl group Ci-C 6, or a halogen atom or a -CN, -CF 3, -N0 2, -OR a, -SR a, -S0 2 R a , -NR a R b , -C (O) -R a , -OC (O) R a , -OC (O) NR a R b , -C (O) OR a , -C (O) NR a R b or together with Z a carbon-carbon bond
  • Z can represent a hydrogen atom, a hydroxyl group, a hydroxyamino group or together with R 13 a carbon-carbon bond and R 1 may represent a hydrogen atom or a group -CH 3 , -CH 2 -CN, -CH 2 -SR a , -CH 2 -SeR a or a group corresponding to formula (VII) or (VIII) next :
  • + W may represent an oxygen atom or a group -NR a in which R a is as defined above or a spacer arm consisting of an optionally substituted linear or branched hydrocarbon chain containing from 2 to 20 carbon atoms and further comprising at least one heteroatom;
  • esters and their addition salts with pharmaceutically acceptable acids are generally not directly active in themselves but are prodrugs for the corresponding hydroxylated analogs.
  • esters which are metabolized in the human body, lead to the active compounds.
  • esters are also the subject of the present invention. Esters which introduce chemical functionalities such as sulphates, phosphates, acids and basic chains which increase aqueous solubility and bioavailability can be mentioned.
  • Esters of compounds having a basic function such as dialkylglycine analogs with alkyls of 1 to 4 carbon atoms and most particularly dimethylglycine and diethylglycine are preferred. and also methylpiperazine.
  • Fatty acid esters or polyethylene glycol chain esters which increase the affinity for lipophilic phases may be mentioned. Saturated fatty acid chains of 3 to 18 carbons are preferred.
  • C x -C y alkyl refers to a linear or branched hydrocarbon radical comprising from x to y carbon atoms.
  • the invention according to the listed cases covers linear or branched hydrocarbon radicals, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, neopentyl, n-hexyl, n- heptyl, n-octyl, n-nonyl, n-decyl, n-undecyl, n-dodecyl.
  • Alkyl groups CrC 6 are preferred.
  • the alkyl groups may optionally be substituted by an aryl group as defined below, in which case it is called an arylalkyl group.
  • arylalkyl groups include benzyl and phenethyl.
  • the alkyl groups may be substituted one or more times with one or more substituents, which may be identical or different, chosen independently from a halogen atom or a group -CN, -CF 3 , -C (O) -R a , -C (O) OR a , -C (O) NR a R b , -O-C (O) NR a R b , -NR a R b , -OR a , -SR b , the groups R a and R b may be as described above.
  • C x -C y alkenyl refers to a linear or branched or cyclic hydrocarbon radical, comprising one or more double bonds, having from x to y carbon atoms.
  • the alkenyl groups may be substituted one or more times with one or more substituents, which may be identical or different, chosen independently from a halogen atom or a group -CN, -CF 3) -C (O) -R a , -C (O) OR a , -C (O) NR a R b , -O-C (O) NR a R b , -NR a R b , -OR a , -SR b , the groups R a , R b may be as previously described;
  • C x -C y cycloalkyl refers to a saturated or partially unsaturated cyclic hydrocarbon radical having from x to y carbon atoms.
  • Cycloalkyl groups include, in particular, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclopentenyl, cyclohexyl and cyclohexenyl substituents.
  • the cycloalkyl groups may be substituted one or more times with one or more substituents, which may be identical or different, chosen independently from a halogen atom or a group -CN, -CF 3 , -C (O) -R a , -C (O) OR a , -C (O) NR a R b , -O-C (O) NR a R b , -NR a R b , -OR a , -SR a , the group R a , R b may be as previously described;
  • alkynyl, C x -C y refers to a hydrocarbon radical straight, branched, including at least one triple bond, having from x to y carbon atoms.
  • the alkynyl groups include, in particular, the ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, 1-butynyl, 2-butynyl, 1-pentynyl, 2-pentynyl, 1-heptynyl, 2-heptynyl, 1-octynyl and 2-octynyl substituents.
  • the alkynyl groups may be substituted one or more times with one or more substituents, which may be identical or different, chosen independently from a halogen atom or a group -CN, -CF 3 , -C (O) -R a , -C (O) OR a , -C (O) NR a R b , -O-C (O) NR a R b , -NR a R b , -OR a , -SR a , the groups R a , R b may be as previously described;
  • C x -C y aryl refers to an aromatic hydrocarbon radical having x to y carbon atoms.
  • aromatic hydrocarbon radicals having 6 carbon atoms are preferred.
  • the aryl groups include in particular the phenyl, naphthyl and biphenyl radicals.
  • the aryl groups may be substituted one or more times with one or more substituents, which may be identical or different, chosen independently from a halogen atom or an alkyl group, -CN, -CF 3 , -N 3 , -NO 2 , -C (O) OR a , -C (O) -R a , -C (O) NR a R b , -O-C (O) NR a R b , -NR a R b , -OR a -SR a , the groups R a , R b may be as previously described;
  • C x -C y heterocycle refers to an optionally substituted mono- or polycyclic, saturated, unsaturated or aromatic radical, which can have from one to four carbon atoms and comprising one or more heteroatoms.
  • the heteroatoms are selected from oxygen, sulfur and nitrogen.
  • heterocycle examples include furyl, thienyl, pyrrole, imidazole, isothiazole, thiazole, isoxazole, oxazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, indole, isoindole, indazole, quinoline, isoquinoline, phthalazine, quinazoline, pyrrolidine, imidazolidine, pyrrazolidine, piperidine, piperazine, morpholine, thiazolidine or phthalimide. benzimidazole.
  • the heterocyl groups may be substituted one or several times by one or more substituents the same or different selected (s) independently selected from a halogen atom or an alkyl group, -CN, -CF 3, -N 3l -N0 2> -C (0) OR a, - C (O) -R a , -C (O) NR a R b , -O-C (O) NR a R b , -NR a R b , -OR a , -SR a , the groups R a , R b may be as previously described;
  • halogen refers to a chlorine, bromine, fluorine and iodine atom.
  • the halogen will be a fluorine atom.
  • the compounds of formula (I) are known and are particularly described in international applications WO 2006/027454 of March 13, 2006, WO 2007/101925 of September 13, 2007, WO 2009/044011 of September 09, 2009, WO 2010/076418 of 08 July 2010, WO 2004/082581 of September 30, 2004, WO 2007/080270 of July 19, 2007, WO2007 / 118967 of October 25, 2007, WO 008/142237 of November 27, 2008, WO 2009/044010 of April 09, 2009, WO 2009 / 092892 of July 30, 2009 and WO 2010/012904 of February 4, 2010.
  • cholesteryl derivatives especially those of formula (I), especially 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-oxime
  • One and the oxime of cholest-4-en-3-one are useful as medicaments and particularly have remarkable cytoprotective properties, particularly neuroprotective, cardioprotective and hepatoprotective properties.
  • compositions comprising active ingredients having a low aqueous solubility
  • surfactants for the formation of emulsions, colloids such as micelles or liposomes which solubilize the drug and increase its solubility in an aqueous medium.
  • these emulsions and in particular the micellar suspensions are not physically or even chemically stable. For example, if the composition comes into contact with blood or plasma, the solubilizing system can lose these properties by no longer retaining the active ingredient.
  • surfactant cremophore, tween, etc.
  • particulate structures are a source of activation of the complement system of higher organisms and the triggering of reactogenicity reactions that can be fatal.
  • the invention aims among other things to overcome these problems and difficulties.
  • the Applicant has, surprisingly, discovered that the cholesterol derivatives, particularly those described in the international applications cited above, advantageously those corresponding to formula (I), have a very good affinity with liposomes, which also makes it possible to to prepare compositions, particularly pharmaceutical compositions, which are stable for several months physically and chemically and concentrated in active principle.
  • these compositions placed in contact with a biological medium such as blood are chemically stable and the active agent retains all its properties.
  • compositions once administered surprisingly have a very low reactogenicity.
  • the liposomes according to the invention have a remanence in biological fluids, particularly in the blood, which is prolonged.
  • the invention lies in the fact that the liposomes according to the invention allow a much greater solubilization of the compounds of formula (I) and while having a very low reactogenicity.
  • compounds of formula (I) when included in the liposomes according to the invention can be formulated in pharmaceutical compositions in contact with aqueous media much more easily than if they are in another form.
  • the liposomes consist of at least one lipid bilayer membrane enclosing an aqueous internal compartment. They are known as system effective formulations for transporting therapeutic agents, drugs, or active ingredients within the aqueous space present inside the vesicle (soluble agents in aqueous medium) or included in the lipid bilayer (insoluble agents in aqueous medium) . They can be characterized by the type of membrane and their size.
  • the unilamellar vesicles consist of a single bilayer membrane.
  • Multilamellar vesicles (MLVs) contain at least two lipid bilayer membranes defining several closed aqueous compartments. The membranes are organized concentrically so that the different membranes are separated by an aqueous compartment.
  • Small unilamellar vesicles can have a diameter generally between 20 and 100 nm.
  • Large unilamellar vesicles LUV: large unilamellarvesicle
  • MLV multilamellar vesicle
  • LUV large unilamellarvesicle
  • MLV multilamellarvesicle
  • Liposomes it is possible to refer to Gregory Gregoriadis (Liposome Technology: Liposome Preparation And Related
  • PEGylation which consists of the introduction of PEG (Poly Ethylene Glycol) chains often grafted on phospholipids or cholesterol.
  • PEG Poly Ethylene Glycol
  • sterols such as cholesterol into the lipid bilayer improves the stabilization of liposomes.
  • US Patent 6,143,321 describes liposomes whose active ingredient is embedded or adsorbed in the lipid bilayer using a surfactant.
  • An improvement in the physical and chemical stability of the liposomes according to the invention represents one of the great advantages of the invention since it makes it possible to envisage the preparation of low volume compositions comprising a large quantity of active ingredient, which could make it possible to consider, especially in the case of pharmaceutical compositions, to deliver to patients only few doses, or even a single dose, of drugs which can help to limit or annihilate the problems of hypersensitization (reactogenicity) that could cause the administration of several doses of drug solubilized using liposomes.
  • the active ingredient that can be included in the liposomes according to the invention is sufficient on its own to confer improved stability to the liposomes without the addition of additional sterol.
  • weakly reactogenic pharmaceutical composition is meant in the present text that the group having received the composition induces a level of reactogenicity similar to that induced in the control group of the test having received only the buffer of this composition.
  • a bolus administration corresponds to the administration of a quantity necessary to obtain the expected concentration in the blood, the lymph, the cerebrospinal fluid or any biological site targeted for reasons therapeutic or diagnostic in a short time between 1 second and 10 minutes, preferably in less than 5 minutes, very preferably in less than 2 minutes.
  • a weakly reactogenic composition increases the level of the complement by a maximum of three times compared to the basal level measured on the serum of the individual.
  • the level of C terminal complex (SC56-9) can be measured by an immunoassay kit such as that of Quibel Corporation "SC56-9 plus Elisa” kits.
  • compositions preferably pharmaceutical, having the following advantages:
  • the subject of the invention is liposomes comprising at least one of the compounds corresponding to formula (I) or a mixture of compounds corresponding to formula (I).
  • the subject of the invention is also a composition, particularly a pharmaceutical composition comprising liposomes comprising at least one of the compounds corresponding to formula (I) or a mixture of compounds corresponding to formula (I).
  • the invention is directed to any known type of liposome provided that it is used to encapsulate an active agent, particularly a compound of formula (I)
  • the final liposomal solution may comprise at least:
  • cryoprotective agent optionally a cryoprotective agent.
  • the compound of formula (I) included in the liposomes according to the invention may be chosen from
  • the compound of formula (I) included in the liposomes according to the invention may be chosen from the oxime of cholest-4-en-3-one, the oxime of cholestan-3-one, cholest-1,4-dien-3-one oxime, cholest-4,24-dien-3-one oxime, 3-hydroxy-3,5-oxime -seco-4-norcholestan-5-one, 4-fluoro-cholest-4-en-3-one oxime, 3-hydroxy-3-methyl-3,5-seco-4-norcholestan oxime 5-one, oxime of 3,3-methyl-3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one, very preferably the oxime of cholest-4-en-3-one and 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one oxime.
  • the invention also relates to liposomes for which a mixture of at least two compounds of formula (I) can be used for their constitution.
  • the compound of formula (I) may be present in the liposome at physiologically effective doses.
  • the compound of formula (I) may be present in the final liposomal solution in an amount ranging from 0.1 to 200 mg / ml, preferably above 1 mg / ml, even more preferentially at above 5 mg / mL, very preferably above 10 mg / mL).
  • final liposomal solution is meant the liposome solution obtained after carrying out the process for obtaining the liposomes according to the invention.
  • the phospholipids used may be phospholipids of natural origin, vegetable or animal, or synthetic, even more preferably natural phospholipids.
  • Said phospholipids may be chosen from phosphoacylglycerols (better known under the name of glycerophospholipids), inositophosphatides, phosphosphingolipids and phosphonosphingolipids or else phosphosaccharolipids.
  • the phospholipids may be chosen from phosphatidylcholine, lysophosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, linoleylpalmitoylphosphatidylcholine, palmitoyloleoylphosphatidylcholine, oleoylmitoylphophatidylcholine, DHAstearoylphosphatidylcholine, phosphatidylcholine of DHA-enriched avian origin, phosphatidylinositol and DHA-phosphatidylethanolamine.
  • phosphatidylserine, sphingomyelin a mixture of phospholipids of avian origin close to the composition of breast milk, a mixture of phospholipids of soy origin close to the composition of breast milk, palmitic or oleic lysophosphatidic acids, egg lysophosphatidylcholine containing more than 90% palmitic and stearic acids, soy lysophosphatidylcholine, lysophosphatidylinositol, lysophosphatidylethanolamine, lysophosphatidylserine, a mixture of egg phospholipids containing phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol and sphingomyelin, 1,2-dioleolyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-dimyristoyl-sn
  • the phospholipids of natural origin and particularly the phospholipids of egg or soya, preferably egg phospholipids, are used.
  • the invention also relates to liposomes for which a mixture of at least two phospholipids can be used for their constitution.
  • the phospholipids may be present in the final liposomal solution in an amount ranging from 10 to 300 mg / ml, preferably between 20 and 200 mg / ml, very preferably between 50 and 150 mg / ml).
  • the concentration ratio of the compound of formula (I) to that of the phospholipid can be included in the final liposomal solution between 1/100 and 70/100, preferably between 10/100. and 50/100.
  • the pH stabilizing agent may be a phosphate buffer, benzoate, citrate, glutamate, lactate, ascorbate, tartrate, succinate, adipate, glycinate, malate, triethanolaminate, diethanolaminate, tromethaminate.
  • a phosphate buffer is used.
  • the pH stabilizing agent can allow the pH of the liposomal formulation to vary between 3 and 11, preferably between 4 and 9.
  • the skilled person will easily adjust the amount of stabilizing agent to be introduced according to the invention. on the one hand, the final pH of the liposomal formulation that it wishes to obtain and as a function of the chosen buffer and its physical properties.
  • the cryoprotective agent may be for example glycerol, sucrose, dextrose, trehalose, glucose, maltose, mannose, lactose, mannitol, sorbitol, glycine, polyvinylpyrrolidone (PVP), polyvinyl alcohol (PVA), gelatin, Palanine, lysine, polyethylene glycol, dextran, aerosil, fructose, hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin.
  • glycerol, sucrose and dextrose are used according to the invention.
  • cryoprotective agent may be present in the liposomal formulation in an amount ranging from 0.01 to 30% in solution, preferably between 0.1 and 20%, very preferably between 1 and 10%.
  • the compound of formula (I) can be combined with other active therapeutic agents.
  • this active ingredient can be combined with another complementary or secondary incorporated either in said lipid lipid layer, or in the aqueous phase depending on their solubility.
  • the liposome according to the present invention may be used alone or in composition in animals or humans, particularly mammals, more specifically in humans. They can be for cosmetic, pharmaceutical or veterinary use.
  • composition comprising at least one liposome comprising at least one compound of formula (I).
  • composition of the invention may also contain usual adjuvants in the domains considered depending on the mode of administration, such as, for example, preservatives, antioxidants, pigments and dyestuffs, thickeners, flavors, sweeteners, agents that stabilize the particles of active ingredients.
  • adjuvants such as, for example, preservatives, antioxidants, pigments and dyestuffs, thickeners, flavors, sweeteners, agents that stabilize the particles of active ingredients.
  • these various adjuvants are those conventionally used in the fields under consideration, and for example from 0.0001% to 10% of the total weight of the composition. These adjuvants are introduced into the aqueous or lipophilic phase.
  • the liposome or the composition comprising at least one liposome can be administered enterally, parenterally or topically, preferably parenterally.
  • administration may be intravenous or intraarterial or intralymphatic, direct (syringe) or indirect (infusion or angioplasty).
  • a vein In the case of a vein it may be superficial, usually on the arm (peripheral venous line) or deep (central venous line), most often on the neck (jugular vein) or under the clavicle (subclavian vein) ), subcutaneously, under the skin, frequently in the abdomen or thighs, intradermally, directly into the dermis, intramuscularly, directly into a muscle or by pulmonary inhalation.
  • the administration can be made intravenously.
  • the subject of the invention is also the use of the compounds of formula (I) for preparing liposomes, advantageously stable liposomes.
  • the subject of the invention is also the use of the liposomes according to the invention for preparing a composition, advantageously a weakly reactogenic, cosmetic, pharmaceutical or veterinary composition.
  • the invention further relates to the use of liposomes according to the invention for the transport of active principles other than the compounds of formula (I).
  • EPC L- ⁇ -Phosphatidylcholine of egg
  • DMPG 1,2-dimyristoylphosphatidylglycerol
  • DSPE-PEG 1, 2-distearoyl-SA7-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000]
  • PBS Phosphate phosphate buffer
  • Intralipide® injectable lipid emulsion, generally used in parenteral nutrition, sold by the Fresenius Kabi France laboratory
  • Solutol HS15® nonionic solubilizer sold by BASF.
  • the liposomal formulation allows a solubility of the compounds of formula (I) in an aqueous medium greater than or equal to 8 mg / ml and at a concentration equal to or greater than a highly lipophilic medium but immiscible with an aqueous biological medium.
  • a solution of lipids at 250 mg / mL is prepared by dissolving defined amounts of EPC and the compound of formula (I) in tert-butanol or a mixture of tert-butanol and absolute ethanol (v / v). This lipid solution is mixed at a certain temperature on the aqueous buffer in order to obtain a final solvent concentration of 15 to 17% and a product of formula (I) of 25 or 50 mg / ml.
  • the large multilamellar vesicles are then extruded at a temperature fixed through 3 polycarbonate filters by 10 consecutive passes.
  • the unencapsulated compound of formula (I) is removed on the filters.
  • the solvent is removed by membrane filtration by washing with buffer in order to reach a final solvent percentage of the order of 0.4%.
  • the liposome solutions with the compounds were carried out with concentrations between 3 and 15 mg / mL.
  • the size of the vesicles is very homogeneous from one compound to another, of the order of 80 nm corresponding to small unilamellar vesicles.
  • a 250 mg / mL lipid solution is prepared by dissolving defined amounts of phospholipids and compound 1 in a mixture of tert-butanol and absolute ethanol (v / v). This lipid solution is mixed at ambient temperature with the aqueous buffer in order to obtain a final solvent concentration of 20% and total lipids of 50 mg / ml.
  • the large multilamellar vesicles are then extruded at room temperature through 3 to 5 polycarbonate filters. From 5 to 10 passages are required to generate small unilamellar vesicles of size between 70 and 90 nm.
  • the solvent and the unencapsulated 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one oxime are removed by diafiltration using 10 volumes of buffer wash. Ultrafiltration is then put in place to concentrate the formulation at the final concentration.
  • composition Composition (compound 1 + phospholipids of column B)
  • compositions have small unilamellar vesicles of 50 to 100 nm with concentrations around 20 to 35 mg / ml, with the exception of composition 2.
  • a small percentage of DSPE-PEG seems to form large unilamellar vesicles or multilamellar of 220 nm in the same range of final concentration of compound 1.
  • the in vitro evaluation of the reactogenicity is performed by measuring the production of the SC5 ⁇ -9 complex after incubation in human serum. Levels of SC56-9 are measured with an ELISA kit according to the method described (QuidelCorporation SC56-9 Plus EIA kit, Ref A029).
  • the solutions tested are diluted with buffer to reach a compound concentration of the compound (I) of 20 mg / ml.
  • 1 volume of liposomal solution prepared in Example 3 is added to 3 volumes of serum to reach a final tested concentration of 5 mg / ml.
  • the mixture is stirred vigorously and incubated for 45 minutes at 37 ° C.
  • the reaction is stopped with the "stop" solution of the Elisa kit.
  • a Phase 1 clinical study was performed with liposomal formulation No. 1 exemplified in Example 3 of 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one oxime.
  • the formulation was administered to 54 healthy volunteers intravenously at several doses and rates according to the protocol submitted to the AFSSAPS and the committee for the protection of persons.
  • This formulation showed a very good tolerance up to the maximum tested dose of 13 mg / kg at 10 mL / min and the maximum flow of 35 mL / min for the dose of 10 mg / kg and a good exposure of the product of formula (I).
  • the liposome solution No. 11 exemplified in Example 3 of the 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one oxime was set at +5 and + 25 ° C and analyzed after 3, 6, 12 months. Parameters T0 3 months 6 months 12 months
  • the measured parameters are stable for at least one year at 25 ° C.
  • the liposomal solution can be stored for at least 1 year at 25 ° C

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Abstract

La présente invention concerne une nouvelle forme galénique de dérivé de cholestérol. Plus particulièrement l'invention concerne des liposomes comprenant au moins un dérivé de cholestérol et des compositions comprenant lesdits liposomes.

Description

Liposome comprenant au moins un dérivé de cholestérol.
La présente invention concerne une nouvelle forme galénique de dérivés de cholestérol.
Plus particulièrement l'invention concerne des liposomes comprenant au moins un dérivé de cholestérol répondant à la formule (I) décrite ci-après et des compositions comprenant lesdits liposomes.
Par simplification, dans le présent texte l'expression "dérivé de cholestérol" pourra être utilisée pour désigner les composés de formule (I), voire leurs homologues non spécifiquement décrits dans la présente demande, ainsi que leurs analogues. En effet, tous ces composés de formules I ont en commun le squelette cholestérol.
Tous ces composés et leurs homologues non cités ici présentent des similarités de structure et sont concernés par l'invention, mais ne constituent pas à eux seuls l'invention.
Ainsi l'invention concerne des liposomes comprenant au moins un composé répondant à la formule (I) suivante
Figure imgf000002_0001
dans laquelle,
• R2 peut représenter un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C6, cycloalkyle en C3-C6, alcényle en C2-C6, alcynyle en C2-C6, aryle, un héterocycle, ou un atome d'halogène ou un groupe -CN, -CF3, -NO2, -ORa, -SRa, -S02Ra, -NRaRb, -C(0)-Ra, -OC(0)Ra, -OC(0)NRaRb, -C(0)ORa, -C(0)NRaRb, dans lequel
(i) Ra et Rb, simultanément ou indépendamment l'un de l'autre, peuvent être choisis parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C C6, un groupe alcényle en C2-C6, un groupe cycloalkyle en C3-C6, un groupe aryle, un groupe hétérocyclique ou
(ii) Ra et Rb ensemble peuvent former une chaîne hydrocarbonée, linéaire ou ramifiée, ayant de 2 à 6 atomes de carbone, comportant éventuellement une ou plusieurs doubles liaison et/ou éventuellement interrompue par un ou plusieurs atome(s) d'oxygène, de soufre ou d'azote, ou
(iii) Ra et Rb pris ensemble avec l'azote sur lequel ils sont attachés peuvent former un hétérocyle en C3-C6, ledit hétérocycle pouvant comporter une ou plusieurs doubles liaisons et/ou un ou plusieurs atome(s) d'oxygène, de soufre ou d'azote;
R3 peut représenter un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en CrC6, ou
R2 et R3 pris ensemble avec le carbone sur lequel ils sont attachés, peuvent représenter un atome d'oxygène ou un groupe cycloalkyle en C3-C6 ou un groupement =N-OH, =CH-alkyle en CfC6, =CH-aryle, =CH-cycloalkyle en C3-
R4 peut représenter un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C6, ou un groupe hydroxyamino (-NH2-OH) ; ou
R3 et R4 pris ensemble peuvent former une liaison carbone-carbone additionnelle entre les atomes de carbone sur lesquels ils sont attachés, ou un groupe cycloalkyle en C3-C6 ;
R5 peut représenterun atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C6, cycloalkyle en C3-C6, alcényle en C2-C6, alcynyle en C2-C6, aryle, ou un groupe -CN, -ORa, -SRa, -S02Ra, -NRaRb, -C(0)-Ra, -OC(0)Ra, -OC(0)NRaRb, Ra et Rb étant tels que définis précédemment, ou un groupe hydroxyamino (-NH2-OH);
R8 peut représenter un groupe choisi parmi un groupe alkyle en C4-C-|2 ou un groupe alcényle en C4-Ci2, en parti un roupe choisi parmi
Figure imgf000004_0001
(ii) un groupement répondant à la formule (II) suivante :
R14-Y-Ri5 (ll)
dans laquelle :
- Ru peut représenter un groupe alkyle en C4-C-|2 ou un groupe alcényle en C4-Ci2, notamment un groupe alkyle en C5-C10, préférentiellement le groupement G7 suivant
Figure imgf000004_0002
- Y peut représenter un atome d'oxygène ou un groupe -NRa avec Ra étant tel que décrit précédemment, et
- R15 peut représenter un groupement alkyle en CrC6, cycloalkyle en C3-C6, aryle, hétérocycle, -C(0)-alkyle en CrC6, -C(0)-cycloalkyle en C3-C6, -C(0)-aryle, -C(0)-hétérocycle, en particulier un groupement représenté par l'une des formules (III) ou (IV)
Figure imgf000004_0003
• R6 peut représenter un atome d'hydrogène ou un atome d'halogène ou un groupe hydroxyle, préférentiellement un atome d'hydrogène ;
• R7 peut représenter un atome d'hydrogène, ou un groupe -ORa, Ra étant tel que défini précédemment, préférentiellement un atome d'hydrogène ;
étant entendu que
o Si X et Z pris ensemble avec le carbone sur lequel ils sont attachés représentent un groupe cétone (=0), un groupe oxime (=N-OH) ou un groupe alkyle oxime (=N-0-alkyle) dont le groupe alkyle peut être en C C6 alors
• Ri peut représenter un atome d'hydrogène ou un groupe -CH3, -CH2-CN, -CH2-ORa, -CH2-SRa, -CH2-SeRa, -C(0)-Ra, -C(0)ORa , -0-C(0)NRaRb, -C(0)NRaRb, Ra et Rb étant tels que définis précédemment,
• A peut représenter
- un atome d'hydrogène, ou
- un groupe alkyle en CrC8, ou
- un alcényle en C2-C8> ou
- un alcynyle en C2-Ce, ou
- un cycloalkyle en C3-C6, ou
- un aryle, ou
- un héterocycle, ou
- un atome d'halogène ou
- un groupe -(CH2)n-CN, -(CH2)n-CF3, -(CH2)n-N02l -(CH2)n-ORa, -(CH2)n-C(Me)2ORa, -(CH2)n-CHMeORa -(CH2)n-SRa J -(CH2)n-S02Ra, -CH2-SeRa, -(CH2)n-NRaRb, -C(0)Ra, -OC(0)NRaRb, -C(0)ORa, -C(0)NRaRb dans lequel
(i) Ra et Rb, étant tels que définis précédemment et
(ii) n peut représenter un entier égal pouvant prendre l'une quelconque des valeurs de 0 à 4, ou encore
- un groupement répondant à la formule (V) :
Rc-Q-(CH2)m (V)
dans laquelle (i) m peut représenter un entier pouvant prendre l'une quelconque des valeurs de 1 à 8 ; et
(ii) Q peut représenter un atome d'oxygène ou un groupe -NRa dans lequel Ra est tel que défini précédemment et
(iii) Rc peut représenter
a. un atome d'hydrogène ou
b. un alkyle en C1-C6,
c. un aryle,
d. un hétéroaryîe,
e. un hétérocycle,
f. un alkyle-C(O)-, dont l'alkyle peut être en d-C6,
g. un aryle-C(O)-,
h. un hétéroaryle-C(O)-,
i. un hétérocycle-C(O)-,
j. un groupement représenté par l'une des formules (III) ou (IV)
Figure imgf000006_0001
ou
k. un groupe -O-C(O)- ou
I. un groupe -NRa-C(0)- dans lequel Ra est tel que défini
précédemment
o Si A avec X pris ensemble avec les carbones sur lesquels ils sont attachés représentent une chaîne de formule (VI)
Figure imgf000007_0001
dans laquelle
• Y peut représenter un groupe cétone (=0), un groupe oxime (=N-OH) ou un groupe alkyle oxime (=N-0-alkyle) dont le groupe alkyle peut être en C-\-Ce;
• R9 peut représenter un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Ci-C6, un atome d'halogène ; ou
• Rg et Ru pris ensemble peuvent former une liaison carbone-carbone additionnelle entre les atomes de carbone sur lesquels ils sont attachés, ou un groupe cycloalkyle en C3-C6 ;
• R 0 peut représenter un atome d'hydrogène, un atome d'halogène ou un groupe -ORa, -SRa, -CN, -NRaRb, -Ra et -Rb étant tels que définis précédemment ;
• Ru peut représenter un atome d'hydrogène, ou un groupe alkyle en CrC6, cycloalkyle en C3-C6, aryle ou un atome d'halogène ;
• R-I2 peut représenter un atome d'hydrogène, ou un groupe alkyle en Ci-C6 ou un atome d'halogène ou un groupe -CN, -ORa, -SRa, -SeRa, -C(0)-Ra, -C(0)ORa, -NRaRb, -OC(0)NRaRb, -Ra et -Rb étant tels que définis précédemment ; ou
• Ru et R-12 pris ensemble avec le carbone sur lequel ils sont attachés, peuvent former un groupe cycloakyle en C3-C6 ;
• R13 peut représenter un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C6, ou un atome d'halogène ou un groupe -CN, -CF3, -N02, -ORa, -SRa, -S02Ra, -NRaRb, -C(0)-Ra, -OC(0)Ra, -OC(0)NRaRb, -C(0)ORa, -C(0)NRaRb ou ensemble avec Z une liaison carbone-carbone
alors
• Z peut représenter un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle, un groupe hydroxyamino ou ensemble avec Ri3 une liaison carbone-carbone et • Ri peut représenter un atome d'hydrogène ou un groupe -CH3, -CH2-CN, -CH2-SRa, -CH2-SeRa ou encore un groupement répondant à la formule (VII) ou (VIII) suivante :
-CH2-W-RC (VII) ou -C(0)-W-Rc (VIII) dans laquelle
+ W peut représenter un atome d'oxygène ou un groupe -NRa dans lequel Ra est tel que défini précédemment ou, un bras espaceur constitué d'une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, éventuellement substituée, comportant de 2 à 20 atomes de carbone et comprenant en outre au moins un hétéroatome ;
+ Rc étant tel que défini précédemment ;
ainsi que :
- ses isomères géométriques SYN, ANTI, lorsqu'ils existent,
- ses isomères optiques (énantiomères, diastéréoisomères), lorsqu'ils existent, - ses sels d'addition à un acide ou à une base pharmaceutiquement acceptable,
- ses hydrates et ses solvates,
- ses prodrogues,
- ou l'un de ses esters.
Comme le comprend l'homme du métier, un certain nombre de composés de formule (I) qui comprennent un ou plusieurs groupements hydroxyles, peuvent être estérifiés. Ces esters ainsi que leurs sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables ne sont généralement pas directement actifs en eux-mêmes mais constituent des prodrogues pour les analogues hydroxylés correspondants. Ces esters, qui sont métabolisés dans l'organisme humain, conduisent aux composés actifs. Ces esters sont également l'objet de la présente invention. On peut citer les esters introduisant des fonctionnalités chimiques comme les sulfates, les phosphates, les acides et les chaînes basiques qui augmentent la solubilité aqueuse et la biodisponibilité. On préfère les esters de composés portant une fonction basique comme les analogues de dialkylglycine avec des alkyles de 1 à 4 atomes de carbone et tout particulièrement la diméthylgiycine et la diéthylglycine et aussi de la méthylpipérazine. On peut citer les esters d'acide gras ou les esters de chaîne polyéthylèneglycol qui augmentent l'affinité pour les phases lipophiles. On préfère les chaînes d'acides gras saturés de 3 à 18 carbones.
Par ailleurs selon le présent texte,
le terme "alkyle en Cx-Cy" fait référence à un radical hydrocarboné linéaire ou ramifié, comprenant de x à y atomes de carbone. Ainsi à titre d'exemple, l'invention selon les cas énumérés couvre des radicaux hydrocarbonés linéaires ou ramifiés, tels que méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tert- butyle, pentyle, néopentyle, n-hexyle, n-heptyle, n-octyle, n-nonyle, n-décyle, n- undécyle, n-dodécyle. Les groupes alkyles en CrC6 sont préférés. Les groupes alkyles peuvent éventuellement être substitués par un groupe aryle tel que défini ci-après, auquel cas on parle de groupe arylalkyle. Des exemples de groupes arylalkyle sont notamment le benzyle et le phénéthyle. Optionnellement, les groupes alkyles peuvent être substitués une ou plusieurs fois par un ou des substituants, identiques ou différents choisi(s) indépendamment parmi un atome d'halogène ou un groupe -CN, -CF3, -C(0)-Ra, -C(0)ORa, -C(0)NRaRb, -0-C(0)NRaRb, -NRaRb, -ORa, -SRb, les groupes Ra et Rb pouvant être tels que décrits précédemment.
> Le terme "alcényle en Cx-Cy" fait référence à un radical hydrocarboné linéaire ou ramifié ou cyclique, comprenant une ou plusieurs double-liaisons, ayant de x à y atomes de carbone. On peut citer, par exemple, le radical éthényle, 1-propényle, 2-propényle, 1-butényle, 2-butényle, 1-pentényle, 2-pentényle, 3-méthyl-3-butényle, 1-hexényle, 1-heptényle, 1-octényle. Optionnellement, les groupes alcényles peuvent être substitués une ou plusieurs fois par un ou des substituants, identiques ou différents choisi(s) indépendamment parmi un atome d'halogène ou un groupe -CN, -CF3) -C(0)-Ra, -C(0)ORa, -C(0)NRaRb, -0-C(0)NRaRb, -NRa Rb, -ORa, -SRb, les groupes Ra, Rb pouvant être tels que décrits précédemment ;
> le terme "cycloalkyle en Cx-Cy" fait référence à un radical hydrocarboné cyclique saturé ou partiellement insaturé, ayant de x à y atomes de carbone. Les groupes cycloalkyles incluent notamment les substituants cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclopentényle, cyclohexyle, cyclohéxényle. Optionnellement, les groupes cycloalkyles peuvent être substitués une ou plusieurs fois par un ou des substituants, identiques ou différents choisi(s) indépendamment parmi un atome d'halogène ou un groupe -CN, -CF3, -C(0)-Ra, -C(0)ORa, -C(0)NRaRb, -0-C(0)NRaRb, -NRaRb, -ORa, -SRa, le groupe Ra, Rb pouvant être tel que décrit précédemment ;
le terme "alcynyle en Cx-Cy" fait référence à un radical hydrocarboné linéaire, ramifié comprenant au moins une triple liaison, ayant de x à y atomes de carbone. Les groupes alcynyles incluent notamment les substituants éthynyle, 1-propynyle, 2-propynyle, 1 -butynyle, 2-butynyle, 1-pentynyle, 2-pentynyle, 1-heptynyle, 2-heptynyle, 1-octynyle, 2-octynyle. Optionnellement, les groupes alcynyles peuvent être substitués une ou plusieurs fois par un ou des substituants, identiques ou différents choisi(s) indépendamment parmi un atome d'halogène ou un groupe -CN, -CF3, -C(0)-Ra, -C(0)ORa, -C(0)NRaRb, -0-C(0)NRaRb, -NRaRb, -ORa, -SRa, les groupes Ra, Rb pouvant être tels que décrits précédemment ;
le terme "aryle en Cx-Cy" fait référence à un radical hydrocarboné aromatique, ayant x à y atomes de carbone. Préférentiellement selon l'invention on préfère les radicaux hydrocarbonés aromatiques ayant 6 atomes de carbone. Les groupes aryles incluent notamment les radicaux phényle, naphtyle et bi- phényle. Optionnellement, les groupes aryles peuvent être substitués une ou plusieurs fois par un ou des substituants, identiques ou différents choisi(s) indépendamment parmi un atome d'halogène ou un groupe alkyle, -CN, -CF3, -N3, -N02, -C(0)ORa, -C(0)-Ra, -C(0)NRaRb, -0-C(0)NRaRb, -NRaRb, -ORa, -SRa, les groupes Ra, Rb pouvant être tels que décrits précédemment ;
> le terme "hétérocycle en Cx-Cy" fait référence à un radical mono- ou poly- cyclique, saturé, insaturé ou aromatique, éventuellement substitué, pouvant comporter de x à y atomes de carbone et comprenant un ou plusieurs hétéroatomes. De préférence, les hétéroatomes sont choisis parmi l'oxygène, le soufre et l'azote. Des exemples d'hétérocycle sont les radicaux furyle, thiényle, pyrrole, imidazole, isothiazole, thiazole, isoxazole, oxazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, indole, isoindole, indazole, quinoléine, isoquinoléine, phthalazine, quinazoline, pyrrolidine, imidazolidine, pyrrazolidine, pipéridine, pipérazine, morpholine, thiazolidine ou phthalimide. benzimidazole. Optionnellement, les groupes hétérocyles peuvent être substitués une ou plusieurs fois par un ou des substituants, identiques ou différents choisi(s) indépendamment parmi un atome d'halogène ou un groupe alkyle, -CN, -CF3, -N3l -N02> -C(0)ORa, -C(0)-Ra, -C(0)NRaRb, -0-C(0)NRaRb, -NRaRb, -ORa, -SRa, les groupes Ra, Rb pouvant être tels que décrits précédemment ;
le terme "halogène" fait référence à un atome de chlore, de brome, de fluor et d'iode. Préférentiellement selon l'invention, l'halogène sera un atome de fluor.
Les composés de formule (I) sont connus et sont particulièrement décrits dans les demandes internationales WO 2006/027454 du 13 mars 2006, WO 2007/101925 du 13 septembre 2007, WO 2009/044011 du 09 septembre 2009, WO 2010/076418 du 08 juillet 2010, WO 2004/082581 du 30 septembre 2004, WO 2007/080270 du 19 juillet 2007, WO2007/118967 du 25 octobre 2007, WO 008/142237 du 27 novembre 2008, WO 2009/044010 du 09 avril 2009, WO 2009/092892 du 30 juillet 2009 et WO 2010/012904 du 4 février 2010.
II est bien connu (voir les demandes internationales précédemment citées) que les dérivés de cholestérol, comme particulièrement par exemple ceux de formule (I), particulièrement l'oxime de 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one et l'oxime de cholest-4-èn-3-one sont utilisables comme médicaments et particulièrement présentent de remarquables propriétés cytoprotectrices, particulièrement neuroprotectrices, cardioprotectrices et hépatoprotectrices.
Mais ces composés sont très lipophiles et très insolubles en milieu aqueux compatible avec une administration par exemple parentérale, ce qui rend leur introduction dans des compositions, particulièrement pharmaceutiques, particulièrement délicate voire impossible. Il est ainsi difficile d'obtenir de telles compositions chimiquement et physiquement stables.
Dans l'art antérieur, le développement de compositions comprenant des principes actifs présentant une faible solubilité aqueuse, se focalise traditionnellement sur l'utilisation d'agents tensio-actifs permettant la formation d'émulsions, de colloïdes tels que les micelles ou de liposomes qui solubilisent le médicament et augmentent sa solubilité en milieu aqueux. Néanmoins, ces émulsions et en particulier les suspensions micellaires ne sont pas physiquement, voire chimiquement stables. Par exemple si la composition entre en contact avec du sang ou du plasma, le système solubilisant peut ainsi perdre ces propriétés en ne retenant plus le principe actif.
Par ailleurs, l'utilisation de tensioactif (crémophore, tween, etc ..) et la formation de structures particulaires sont source d'activation du système du complément des organismes supérieurs et du déclenchement de réaction de réactogénicité qui peuvent être mortelles.
Ces problèmes de solubilité et de réactogénicité s'amplifient d'autant, lorsque l'on cherche à obtenir une composition présentant une concentration en principe actif élevée ce qui entre autres peut permettre d'envisager l'administration d'un volume de composition le plus petit possible ou dans un temps le plus court.
L'invention vise entre autres à surmonter ces problèmes et difficultés.
La Demanderesse a, de manière surprenante, découvert que les dérivés de cholestérol, particulièrement ceux décrits dans les demandes internationales citées précédemment, avantageusement ceux répondant à la formule (I), présentent une très bonne affinité avec les liposomes, ce qui permet en outre de préparer des compositions, particulièrement des compositions pharmaceutiques, stables plusieurs mois physiquement et chimiquement et concentrées en principe actif. De plus ces compositions mises en contact avec un milieu biologique tel que le sang sont stables chimiquement et l'agent actif conservent toutes ses propriétés.
Par ailleurs, ces compositions une fois administrées présentent de manière surprenante une réactogénicité très faible.
En outre, les liposomes, selon l'invention, présentent une rémanence dans les liquides biologiques particulièrement dans le sang, prolongée.
L'invention, réside dans le fait que les liposomes selon l'invention permettent une solubilisation beaucoup plus importante des composés de formule (I) et tout en présentant une très faible réactogénicité. Ainsi les composés de formule (I) lorsqu'ils sont inclus dans les liposomes selon l'invention peuvent être formulés dans des compositions pharmaceutiques en contact avec les milieux aqueux bien plus aisément que s'ils se présentent sous une autre forme.
Les liposomes consistent en au moins une membrane bicouche lipidique enfermant un compartiment interne aqueux. Ils sont connus comme système efficace de formulations pour transporter des agents thérapeutiques, des drogues, ou des principes actifs au sein de l'espace aqueux présent l'intérieur de la vésicule (agents solubles en milieu aqueux) ou inclus dans la bicouche lipidique (agents insolubles en milieu aqueux). Ils peuvent être caractérisés par le type de membrane et leur taille. Les vésicules unilamellaires sont constituées d'une seule membrane bicouche. Les vésicules multilamellaires (MLV : multilamellar vesicle) présentent au moins deux membranes bicouches lipidiques définissant plusieurs compartiments fermés aqueux. Les membranes sont organisées de manière concentrique de façon à ce que les différentes membranes soient séparées par un compartiment aqueux.
Les petites vésicules unilamellaires (SUV : small unilamellar vesicle) peuvent avoir un diamètre généralement compris entre 20 et 100 nm. Les larges vésicules unilamellaires (LUV : large unilamellarvesicle) et les vésicules multilamellaires (MLV : multilamellarvesicle) peuvent avoir un diamètre généralement supérieurs à 100nm.
Concernant les liposomes, il est possible de se référer à l'ouvrage de Gregory Gregoriadis (Liposome Technology: Liposome Préparation And Related
Techniques, 3ème édition, 2007) pour ce qui est de leur description, fabrication et applications.
Mais un des inconvénients majeurs au développement des formulations liposomales, de l'échelle expérimentale au marché pharmaceutique, est leur instabilité chimique et physique et leur relative stabilité durant la production et le stockage.
Ainsi, depuis Bangham en 1965 (Bangham AD., Standish MM., Watkins JC. (1965). J. Mol. Biol. 13, p. 238-252) qui fut le premier à fabriquer des liposomes, de nombreuses améliorations ont été apportées en particulier pour augmenter leur stabilisation stérique et augmenter leur temps de séjour dans le système vasculaire ce qui permet en particulier de limiter les injections ou même d'envisager des thérapies ciblées ou des formes retard.
Parmi ces améliorations on pourra citer à titre d'exemple la "PEGylation" qui consiste en l'introduction de chaînes de PEG (Poly Ethylène Glycol) souvent greffées sur des phospholipides ou du cholestérol. L'introduction de stérols tels que le cholestérol dans la bicouche lipidique permet d'améliorer la stabilisation des liposomes.
Le brevet US 6,143,321 décrit des liposomes dont le principe actif est enchâssé ou adsorbé dans la bicouche lipidique à l'aide d'un tensioactif.
Une amélioration de la stabilité physique et chimique des liposomes selon l'invention représente un des grands avantages de l'invention car cela permet d'envisager la préparation de compositions de faible volume comprenant une grande quantité de principe actif, ce qui pourrait permettre d'envisager, particulièrement dans le cas de compositions pharmaceutiques, de ne délivrer aux patients que peu de doses, voire une seule dose, de médicaments ce qui peut permettre de limiter voire annihiler les problèmes d'hypersensibilisation (réactogénicité) que pourrait provoquer l'administration de plusieurs doses de médicament solubilisé à l'aide de liposomes.
De plus, le principe actif pouvant être compris dans les liposomes selon l'invention, suffit à lui seul à conférer une stabilité améliorée aux liposomes sans ajout de stérol supplémentaire.
Un autre inconvénient majeur au développement pharmaceutique de formulation liposomale notamment par voie parentérale est le risque accru de réactogénicité liée à l'activation du complément (Szebeni J., Toxicology, 2005, 216, 106). Ces réactions sont d'autant plus fréquentes ou intenses que l'administration de la solution est réalisée à un débit élevé tel qu'un bolus. Une composition pharmaceutique faiblement réactogène permettrait une administration parentérale en bolus et non en infusion d'une quantité massive de principe actif. En outre cette formulation pourrait permettre une administration en bolus rapide et préférentiellement manuellement.
Par "composition pharmaceutique faiblement réactogène" on entend dans le présent texte que le groupe ayant reçu la composition induit un niveau de réactogénicité similaire à celui induit dans le groupe contrôle de l'essai ayant reçu seulement le tampon de cette composition.
Une administration en bolus correspond à l'administration d'une quantité nécessaire pour obtenir la concentration attendue dans le sang, la lymphe, le liquide céphalo-rachidien ou tout site biologique ciblé pour des raisons thérapeutiques ou de diagnostic en un temps court compris entre 1 seconde et 10 minutes, préférentiellement en moins de 5 minutes, très préférentiellement en moins de 2 minutes.
Une composition faiblement réactogène augmente le niveau du Complément au maximum de trois fois par rapport au niveau basai mesuré sur le sérum de l'individu. Le niveau de complexe terminal C (SC56-9) peut être mesuré par un kit de test immunologique tel que celui de Quibel Corporation "SC56-9 plus Elisa" Kits.
C'est un des buts de l'invention que de fournir des liposomes faiblement réactogènes, utilisables seuls ou dans des compositions pharmaceutiques.
Ainsi les propriétés des liposomes selon l'invention permettent de préparer des compositions, préférentiellement pharmaceutiques, présentant les avantages suivants :
- stabilité physique et chimique au moins 12 mois en phase de conservation à 25°C ;
- utilisation possible pour une administration en bolus par voie parentérale ;
- réactogénicité très faible ;
- procédé transposable en production industrielle ;
- intégration d'autres principes actifs, avec possibilité éventuellement d'une administration massive en bolus.
Ainsi l'invention a pour objet premier des liposomes comprenant au moins un des composés répondant à la formule (I) ou un mélange de composés répondant à la formule (I).
L'invention a aussi pour objet une composition, particulièrement une composition pharmaceutique comprenant des liposomes comprenant au moins un des composés répondant à la formule (I) ou un mélange de composés répondant à la formule (I).
L'Homme du métier connaît parfaitement les liposomes et les techniques non seulement pour les préparer mais aussi pour y introduire un agent actif. L'invention s'adresse à n'importe quel type connu de liposome pour peu qu'il soit utilisé pour encapsuler un agent actif, particulièrement un composé de formule (I)·
Selon une forme particulière de l'invention, la solution liposomale finale peut comprendre au moins :
- un composé de formule (I) ;
- un phospholipide ou un mélange de phospholipides ;
- un agent stabilisant du pH ;
- et éventuellement un agent cryoprotecteur.
Avantageusement le composé de formule (I) compris dans les liposomes selon l'invention peut être choisi parmi
l'oxime de cholest-4-èn-3-one,
l'oxime de cholest-4,24-dièn-3-one
l'oxime de cholestan-3-one,
l'oxime de 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
l'oxime de 1 ,4-cholestadièn-3-one,
l'oxime de 2-méthyl-cholest-4-èn-3-one,
l'oxime de 2a-fluoro-cholest-4-èn-3-one,
l'oxime de 4-méthoxy-cholest-4-èn-3-one,
l'oxime de 4-fluoro-cholest-4-èn-3-one,
l'oxime de 6p-fluoro-cholest-4-èn-3-one,
l'oxime de 19-hydroxy-cholest-4-èn-3-one,
l'oxime de 19-biotinyloxy-cholest-4-èn-3-one,
l'oxime de 25-((N-(+)-biotinoyl-N-méthyl) amino)-27-norcholest-4-èn-3-one, l'oxime de 25-[méthyl(7-nitro-2,1 ,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-27-norcholest-4- èn-3-one,
l'oxime de 2,2-difluoro-cholest-4-èn-3-one,
l'oxime de 2,6-difluoro-cholest-4-èn-3-one,
le 3-oxime de cholest-4-èn-3,6-dione, le3-oxime de cholest-4,21-dièn-3,6-dione,
le 3-oxime de 24-éthyl-cholest-4-èn-3,6-dione,
le 3-oxime de 24-éthyl-cholest-4,21-dièn-3,6-dione,
le 3-oxime de 24-méthyl-cholest-4,21-dièn-3,6-dione,
l'oxime de 3-[méthyl(7-nitro-2,1 ,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-3,5-seco-4- norcholestan-5-one,
l'oxime de 2-hydroxy-2,5-seco-3,4-dinor-cholestan-5-one,
l'oxime de 3-[(N-(+)-biotinoyl-N-méthyl)amino]-3,5-seco-4-norcholestan-5-one, l'oxime de 25-fluoro-3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
l'oxime de 3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
l'oxime de 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholest-24-èn-5-one,
l'oxime de 3-hydroxy-3,5-seco-3-trifluorométhyl-4-norcholestan-5-one, l'oxime de 24 -éthyl-3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholest-22-èn-5-one,
l'oxime de 3-hydroxy-3-méthyl-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
l'oxime de 3,3-diméthyl-3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
l'oxime de 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
le dioxime de cholest-4-èn-3,6-dione,
le dioxime de cholest-4,24-dièn-3,6-dione,
le dioxime de 24-méthyl-cholest-4,21-dièn-3,6-dione,
le dioxime de 24-éthyl-cholest-4-èn-3,6-dione,
le dioxime de 24-éthyl-cholest-4,21-dièn-3,6-dione,
la cholest-4-èn-3-one,
la cholest-4,24-dièn-3-one,
la 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
la 3-hydroxy-3-méthyl-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
la 3,3-diméthyl-3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
le méthyloxime de 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one.
Très préférentiellement le composé de formule (I) compris dans les liposomes selon l'invention peut être choisi parmi l'oxime de la cholest-4-èn-3-one, l'oxime de cholestan-3-one, l'oxime de cholest-1 ,4-dièn-3-one, l'oxime de la cholest-4,24-dièn- 3-one, l'oxime de 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one, l'oxime de 4-fluoro- cholest-4-èn-3-one, l'oxime de 3-hydroxy-3-méthyl-3,5-seco-4-norcholestan-5-one, l'oxime de 3,3-méthyl-3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one, très préférentiellement l'oxime de la cholest-4-èn-3-one et l'oxime de 3-hydroxy-3,5- seco-4-norcholestan-5-one.
Bien entendu, l'invention concerne également les liposomes pour lesquels un mélange d'au moins deux composés de formule (I) peut être utilisé pour leur constitution.
Selon l'invention le composé de formule (I) peut être présent dans le liposome à des doses physiologiquement efficaces. Selon l'invention, le composé de formule (I) peut être présent, dans la solution liposomale finale, en une quantité allant de 0,1 à 200 mg/mL, préférentiellement au-dessus de 1 mg/mL, encore plus préférentiellement au-dessus de 5 mg/mL, très préférentiellement au-dessus de 10 mg/mL).
Par "solution liposomale finale" on entend la solution de liposomes obtenue après mise en oeuvre du procédé permettant l'obtention des liposomes selon l'invention.
Selon l'invention, les phospholipides utilisés peuvent être des phospholipides d'origine naturelle, végétale ou animale, ou synthétique, encore plus avantageusement des phospholipides naturels. Lesdits phospholipides peuvent être choisis parmi les phosphoacylgiycérols (plus connus sous le nom de glycérophospholipides), les inositophosphatides, les phosphosphingolipides et les phosphonosphingolipides ou encore les phosphosaccharolipides.
De façon préférentielle les phospholipides peuvent être choisis parmi la phosphatidylcholine, la lysophosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, la linoléylpalmitoylphosphatidylcholine, la palmitoyloléoylphosphatidylcholine, l'oléoylpalmitoylphophatidylcholine, la DHAstéaroylphosphatidyl choline, la phosphatidylcholine d'origine aviaire enrichie en DHA, le phosphatidylinositol, la DHA-phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylsérine, la sphingomyéline, un mélange de phospholipides d'origine aviaire proche de la composition du lait maternel, un mélange de phospholipides d'origine de soja proche de la composition du lait maternel, les acides lysophosphatidiques palmitique ou oléique, la lysophosphatidylcholine d'œuf renfermant des acides palmitique et stéarique à plus de 90%, la lysophosphatidylcholine de soja, le lysophosphatidylinositol, la lysophosphatidyléthanolamine, la lysophosphatidylsérine, un mélange de phospholipides d'œuf contenant de la phosphatidylcholine, de la phosphatidyléthanolamine, de la phosphatidylsérine, du phosphatidylinositol et de la sphingomyéline, le 1 ,2-dioléolyl-sn-glycéro-3- phosphocholine (DOPC), la 1 ,2-Dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphorylcholine (DMPC), le 1 ,2-dimyristoylphosphatidylglycérol (DMPG), la L-a- phosphatidylcholine d'œuf, la L-a-phosphatidylcholine de soja, la 1 ,2-distéaroyl- sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy (polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG).
De façon préférée, on utilise selon l'invention les phospholipides d'origine naturelle et particulièrement les phospholipides d'œuf ou de soja, de préférence les phospholipides d'œuf.
Bien entendu, l'invention concerne également les liposomes pour lesquels un mélange d'au moins deux phospholipides peut être utilisé pour leur constitution.
Selon l'invention les phospholipides peuvent être présents dans la solution liposomale finale, en une quantité allant de 10 à 300 mg/mL, préférentiellement entre 20 et 200 mg/mL, très préférentiellement entre 50 et 150 mg/mL).
L'Homme du métier saura sans difficulté établir le rapport de concentration du composé de formule (I) sur celle du phospholipide à utiliser pour obtenir les liposomes selon l'invention, particulièrement en se référant à Gregory Gregoriadis(Liposome Technology: Liposome Préparation And Related Techniques, 3ème édition, 2007).
A titre d'exemple mais sans être limitatif on peut indiquer que le rapport de concentration du composé de formule (I) sur celle du phospholipide peut être compris dans la solution liposomale finale entre 1/100 et 70/100, préférentiellement entre 10/100 et 50/100.
Selon l'invention, l'agent stabilisant du pH peut être un tampon phosphate, benzoate, citrate, glutamate, lactate, ascorbate, tartrate, succinate, adipate, glycinate, malate, triéthanolaminate, diéthanolaminate, trométhaminate. De façon préférentielle, on utilise selon l'invention un tampon phosphate.
Selon l'invention l'agent stabilisant du pH peut permettre que le pH de la formulation liposomale varie entre 3 et 11 , préférentiellement entre 4 et 9. L'Homme du métier saura sans difficulté ajuster la quantité d'agent stabilisant à introduire en fonction d'une part du pH final de la formulation liposomale qu'il souhaite obtenir et en fonction du tampon choisi et de ses propriétés physiques.
De même selon l'invention, l'agent cryoprotecteur peut être par exemple le glycérol, le sucrose, le dextrose, le tréhalose, le glucose, le maltose, le mannose, le lactose, le mannitol, le sorbitol, la glycine, le polyvinylpyrrolidone (PVP), le polyvinylalcool (PVA), la gélatine, Palanine, la lysine, le polyéthylène glycol, le dextrane, l'aérosil, le fructose, l'hydroxypropyl-p-cyclodextrine. De façon préférentielle, on utilise selon l'invention le glycérol, le sucrose, le dextrose.
Selon l'invention l'agent cryoprotecteur peut être présent dans la formulation liposomale en une quantité allant de 0,01 à 30% en solution, préférentiellement entre 0,1 et 20%, très préférentiellement entre 1 et 10%.
Selon l'invention on peut combiner le composé de formule (I) avec d'autres agents thérapeutiques actifs. Ainsi, il est possible de combiner ce principe actif avec un autre complémentaire ou secondaire incorporé soit dans ladite couche lipidique du liposome, soit dans la phase aqueuse en fonction de leur solubilité. Le liposome selon la présente invention peut être utilisé seul ou en composition chez les animaux ou les humains, particulièrement les mammifères, plus précisément chez l'homme. Ils peuvent être à usage cosmétique, pharmaceutique ou encore vétérinaire.
Ainsi l'invention a également pour objet une composition comprenant au moins un liposome comprenant au moins un composé de formule (I).
De façon connue, la composition de l'invention peut contenir également des adjuvants habituels dans les domaines considérés dépendant du mode d'administration, tels que par exemple les conservateurs, les antioxydants, les pigments et les matières colorantes, les épaississants, les arômes, les édulcorants, les agents stabilisant les particules d'actifs.
Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés, et par exemple de 0,0001 % à 10 % du poids total de la composition. Ces adjuvants sont introduits dans la phase aqueuse ou lipophile.
Selon l'invention, le liposome ou la composition comprenant au moins un liposome, peut être administré par voie entérale, parentérale ou topique, préférentiellement par voie parentérale. Par voie parentérale, l'administration peut être faite par voie intraveineuse ou intraartérielle ou intralymphatique, directe (seringue) ou indirecte (par une perfusion ou une sonde d'angioplastie).
Dans le cas d'une veine celle-ci peut être superficielle, habituellement au bras (voie veineuse périphérique) ou profonde (voie veineuse centrale), le plus souvent au niveau du cou (veine jugulaire) ou sous la clavicule (veine sous-clavière), par voie sous-cutanée, sous la peau, fréquemment au niveau du ventre ou des cuisses, par voie intradermique, directement dans le derme, par voie intramusculaire, directement dans un muscle ou encore par voie pulmonaire par inhalation. Préférentiellement, l'administration peut être faite par voie intraveineuse.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation des composés de formule (I) pour préparer des liposomes, avantageusement des liposomes stables.
L'invention a également pour objet l'utilisation des liposomes selon l'invention pour préparer une composition, avantageusement une composition faiblement réactogène, cosmétique, pharmaceutique, ou vétérinaire.
L'invention a en outre pour objet l'utilisation des liposomes selon l'invention pour le transport de principes actifs autres que les composés de formule (I).
D'autres caractéristiques et propriétés de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples suivants qui illustrent l'invention sans pour autant la limiter.
Abréviations utilisées :
EPC : L-a-phosphatidylcholine d'œuf
SPC : L-a-phosphatidylcholine de soja
DOPC : 1 ,2-dioléoyl-SA?-glycéro-3-phosphocholine
DMPG : 1 ,2 -dimyristoylphosphatidylglycérol
DSPE-PEG : 1 ,2-distéaroyl-SA7-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy (polyéthylène glycol)-2000] PBS : Tampon phosphate salin
Eth : Ethanol
terBut : terf-Butanol
Liste des composés de formule (I) testés :
Figure imgf000022_0001
Exemple 1 : comparaison de solubilité des dérivés de formule (I)
La solubilité maximale de composés de formule (I) a été testée dans l'eau et différents solvants :
Figure imgf000022_0002
Concentration en mg/mL
Intralipide® : émulsion lipidique injectable, généralement utilisée en nutrition parentérale, vendu par le laboratoire Fresenius Kabi France Solutol HS15® : solubilisant non ionique vendu par la société BASF.
CONCLUSION : La formulation liposomale permet une solubilité des composés de formule (I) dans un milieu aqueux supérieure ou égale à 8 mg/mL et à une concentration égale ou supérieure à un milieu hautement lipophile mais non miscible à un milieu biologique aqueux.
Exemple 2 : préparation de suspensions de liposomes contenant des dérivés de formule (I)
Une solution de lipides à 250 mg/mL est préparée en dissolvant des quantités définies d'EPC et du composé de formule (I) dans du tert-butanol ou un mélange de terf-butanol et d'éthanol absolu (v/v). Cette solution lipidique est mélangée à une certaine température sur le tampon aqueux afin d'obtenir une concentration finale en solvant de 15 à 17% et en produit de formule (I) de 25 ou 50 mg/mL.
Les larges vésicules multilamellaires sont ensuite extrudées à une température fixée à travers 3 filtres polycarbonates par 10 passages consécutifs. Le composé de formule (I) non encapsulé est éliminé sur les filtres.
Le solvant est éliminé par filtration sur membrane par lavage avec du tampon afin d'atteindre un pourcentage de solvant final de l'ordre de 0.4%.
Figure imgf000023_0001
A : Composé
B : Solvant(s)(v/v) C : Température de solubilisation en °C
D : Température d'extrusion en °C
E : Concentration initiale en mg/mL dans Tampon [Composé / EPC]
F : Concentration en composé en mg/mL dans les liposomes
G : Pression d'extrusion (Bars)
H : Taille des particules (nm)
CONCLUSION : Les solutions de liposomes avec les composés ont été réalisées avec des concentrations entre 3 et 15 mg/mL. La taille des vésicules est très homogène d'un composé à l'autre, de l'ordre de 80 nm correspondant à des petites vésicules unilamellaires.
Exemple 3 : préparation de suspensions de liposomes contenant l'oxime de 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one (composé 1)
Une solution de lipides à 250 mg/mL est préparée en dissolvant des quantités définies de phospholipides et du composé 1 dans un mélange de ter/-butanol et d'éthanol absolu (v/v). Cette solution lipidique est mélangée à température ambiante au tampon aqueux afin d'obtenir une concentration finale en solvant de 20% et en lipides totaux de 50 mg/mL.
Les larges vésicules multilamellaires sont ensuite extrudées à température ambiante à travers 3 à 5 filtres polycarbonates. De 5 à 10 passages sont nécessaires pour générer les petites vésicules unilamellaires de taille entre 70 et 90 nm.
Le solvant et l'oxime de 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one non encapsulé sont éliminés par diafiltration en utilisant 10 volumes de lavage de tampon. Une ultrafiltration est ensuite mise en place pour concentrer la formulation à la concentration finale.
A B C D E F
10 mM Phosphate
1 EPC 81 ,40 31 ,30 73,00
300 mM Sucrose
DOPC 10 mM Phosphate
2 51 ,50 22,06 212,00 DSPE-PEG (96/4) 300 m M Sucrose
10 mM Phosphate
3 EPC 53,20 25,30 70,80
145 mMNaCI 10 mM Phosphate
4 SPC-DMPG (96/4) 63,30 27,80 70,70
145 mMNaCI
DOPC-DMPG 10 mM Phosphate
5 71 ,70 29,30 95,70
(96/4) 145 mMNaCI
10 mM Phosphate
6 EPC 63,40 26,20 57,40
300 mM sucrose
10 mM Phosphate
7 EPC 300 m M sucrose 46,30 21 ,88
145 mMNaCI
10 mM Phosphate
8 EPC 5% dextrose 46,30 22,00
145 mMNaCI
10 mM Phosphate
9 EPC 5% glycérol 46,30 22,00
145 mMNaCI
10 mM Phosphate
10 EPC 66,50 27,70 69,20
5% glycérol
10 mM Phosphate
1 1 EPC 76,7 19,6 67,0
5% glycérol
A : Composition (composé 1 + phospholipides de la colonne B)
B : Phospholipides utilisés pour préparer les liposomes
C : Tampon
D : Concentration en Phospholipides en mg/mL
E : Concentration finale du composé 1 en mg/mL
F : Taille des vésicules en nm
CONCLUSION : Les différentes compositions liposomales présentent des petites vésicules unilamellaires de 50 à 100 nm avec des concentrations autour de 20 à 35 mg/mL, à l'exception de la composition 2. Un faible pourcentage de DSPE-PEG semble former des vésicules unilamellaires larges ou multilamellaires de 220 nm dans la même gamme de concentration finale en composé 1.
Exemple 4 : Evaluation in vitro de la réactogénicité
L'évaluation in vitro de la réactogénicité est réalisée par mesure de la production du complexe SC5Ô-9 après incubation dans du sérum humain. Les niveaux de SC56-9 sont mesurés avec un kit ELISA selon la méthode décrite (QuidelCorporation; SC56-9 Plus EIA kit, Réf. A029).
Les solutions testées sont diluées avec du tampon pour atteindre une concentration en composé de lormule (I) de 20 mg/mL. 1 volume de solution liposomale préparée à l'exemple 3 est ajouté à 3 volumes de sérum pour atteindre une concentration finale testée de 5 mg/mL. Le mélange est agité vigoureusement et incubé pendant 45 minutes à 37°C. La réaction est stoppée avec la solution "stop" du kit Elisa.
Les niveaux de production du complexe SC56-9 dans les sera ont été mesurés avec comme contrôle :
• la moyenne des concentrations obtenues sur l'ensemble des sera seuls (contrôle négatif) (C1 ),
• les tampons (T1 , T2)
• un contrôle positif (Zymosan-A®, polyoside de levures vendu par SIGMA ALDRICH)
• un composé de référence (AmBisome®) (contrôle liposomal positif).
Figure imgf000026_0001
5% dextrose
145 mMNaCI
10 mM Phosphate
9 EPC 5% glycérol 22,00 5,8
145 mMNaCI
10 mM Phosphate
10 EPC 27,70 2,1
5% glycérol
N° : numéro de la solution testée.
A : Phospholipides
B : Tampon
C : Concentration en composé mg/mL
D : Concentration en SC56-9 (pg/mL)
CONCLUSION : Le niveau de SC56-9 obtenu dans le sérum avec le contrôle positif liposomal Ambisome® est 3 à 15 fois supérieur aux niveaux obtenus avec les solutions liposomales préparées à l'exemple 3. Celles-ci induisent la formation de SC56-9 à des niveaux faibles, similaires à ceux obtenus avec du tampon ou du sérum seul. Les solutions liposomales préparées sont donc faiblement réactogènes.
Exemple 5 : Evaluation chez l'Homme de la réactogénicité de la formulation liposomale.
Une étude clinique de Phase 1 a été réalisée avec la formulation liposomale n°1 1 exemplifiée à l'exemple 3 de l'oxime de 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5- one. La formulation a été administrée à 54 volontaires sains par voie intraveineuse à plusieurs doses et débits selon le protocole déposé à l'AFSSAPS et au comité de protection des personnes. Cette formulation a montré une très bonne tolérance jusqu'à la dose maximale testée de 13 mg/kg à 10 mL/min et au débit maximal de 35 mL/min pour la dose de 10 mg/kg ainsi qu'une bonne exposition du produit de formule (I).
CONCLUSION :
Aucun signe clinique significatif relatif à l'activation du complément n'a été observé chez l'homme dans cette étude.
Exemple 6 : Evaluation de la stabilité de la formulation liposomale
La solution de liposome n°11 exemplifiée à l'exemple de 3 de l'oxime de 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one a été mise en stabilité à +5 et +25°C et analysée au bout de 3, 6, 12 mois. Paramètres T0 3 mois 6 mois 12 mois
Solution Solution Solution Solution
Apparence
translucide translucide translucide translucide
Cristallisation Absence de Absence de Absence de Absence de cristaux cristaux cristaux cristaux
Taille des vésicules (nm) 67,0 68,3 68,9 70,7
Concentration en mg/mL 19,6 19,2 19,2 18,4
Impuretés (% d'aire) 2,38 2,29 2,52 2,25
Conclusion :
Les paramètres mesurés sont stables au moins un an à 25°C. La solution liposomale peut être conservée au moins 1 an à 25°C

Claims

REVENDICATIONS Liposome comprenant au moins un composé répondant à la
formule (I) suivante
Figure imgf000029_0001
dans laquelle,
• R2 peut représenter un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en CrC6, cycloalkyle en C3-C6, alcényle en C2-C6, alcynyle en C2-C6, aryle, un héterocycle, ou un atome d'halogène ou un groupe -CN, -CF3, -N02, -ORa, -SRa, -S02Ra, -NRaRb, -C(0)-Ra, -OC(0)Ra, -OC(0)NRaRb, -C(0)ORa,
-C(0)NRaRb, dans lequel
(i) Ra et Rb, simultanément ou indépendamment l'un de l'autre, peuvent être choisis parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C6, un groupe alcényle en C2-C6, un groupe cycloalkyle en C3-C-6, un groupe aryle, un groupe hétérocyclique ou
(ii) Ra et Rb ensemble peuvent former une chaîne hydrocarbonée, linéaire ou ramifiée, ayant de 2 à 6 atomes de carbone, comportant éventuellement une ou plusieurs doubles liaison et/ou éventuellement interrompue par un ou plusieurs atome(s) d'oxygène, de soufre ou d'azote, ou
(iii) Ra et Rb pris ensemble avec l'azote sur lequel ils sont attachés peuvent former un hétérocyle en C3-C6, ledit hétérocycle pouvant comporter une ou plusieurs doubles liaisons et/ou un ou plusieurs atome(s) d'oxygène, de soufre ou d'azote; • R3 peut représenter un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C C6, ou
• R2 et R3 pris ensemble avec le carbone sur lequel ils sont attachés, peuvent représenter un atome d'oxygène ou un groupe cycloalkyle en C3-C6 ou un groupement =N-OH, =CH-alkyle en C-i-C6l =CH-aryle, =CH-cycloalkyle en
• R4 peut représenter un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C6, ou un groupe hydroxyamino (-NH2-OH) ; ou
• R3 et R4 pris ensemble peuvent former une liaison carbone-carbone additionnelle entre les atomes de carbone sur lesquels ils sont attachés, ou un groupe cycloalkyle en C3-C6 ;
• R5 peut représenter un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C6, cycloalkyle en C3-C6, alcényle en C2-C6, alcynyle en C2-C6j aryle, ou un groupe -CN, -ORa, -SRa, -S02Ra, -NRaRb, -C(0)-Ra, -OC(0)Ra, -OC(0)NRaRb, Ra et Rb étant tels que définis précédemment, ou un groupe hydroxyamino (-NH2-OH);
• R8 peut représenter un groupe choisi parmi
(i) un groupe alkyle en C4-C12 ou un groupe alcényle en C4-C12, en particulier un groupe choisi parmi
Figure imgf000030_0001
groupement répondant à la formule (II) suivante
Ri4-Y- i5 (ll)
dans laquelle :
- R-| peut représenter un groupe alkyle en C4-Ci2 ou un groupe alcényle en C4-Ci2, notamment un groupe alkyle en C5-C10, préférentiellement le groupement G7 suivant
Figure imgf000031_0001
Y peut représenter un atome d'oxygène ou un groupe -NRa avec Ra étant tel que décrit précédemment, et
Ris peut représenter un groupement alkyle en Ci-C6, cycloalkyle en C3-C6, aryle, hétérocycle, -C(0)-alkyle en C C6, -C(0)-cycloalkyle en C3-C6, -C(0)-aryle, -C(0)-hétérocycle, en particulier un groupement représenté par l'une des formules (III) ou (IV)
Figure imgf000031_0002
· Re peut représenter un atome d'hydrogène ou un atome d'halogène ou un groupe hydroxyle, préférentiellement un atome d'hydrogène ;
• R7 peut représenter un atome d'hydrogène, ou un groupe -ORa, Ra étant tel que défini précédemment, préférentiellement un atome d'hydrogène ;
étant entendu que
o Si X et Z pris ensemble avec le carbone sur lequel ils sont attachés représentent un groupe cétone (=0), un groupe oxime (=N-OH) ou un groupe alkyle oxime (=N-0-alkyle) dont le groupe alkyle peut être en C C6 alors
• Ri peut représenter un atome d'hydrogène ou un groupe -CH3, -CH2-CN, -CH2-ORa, -CH2-SRa, -CH2-SeRa, -C(0)-Ra, -C(0)ORa , -0-C(0)NRaRb, -C(0)NRaRb, Ra et Rb étant tels que définis précédemment,
• A peut représenter - un atome d'hydrogène, ou
- un groupe alkyle en C C8, ou
- un alcényle en C2-C8, ou
- un alcynyle en C2-C8l ou
- un cycloalkyle en C3-C6, ou
- un aryle, ou
- un héterocycle, ou
- un atome d'halogène ou
- un groupe -(CH2)n-CN, -(CH2)n-CF3> -(CH2)n-N02, -(CH2)n-ORa, -(CH2)n-C(Me)2ORa > -(CH2)n-CHMeORa >-(CH2)n-SRa, -(CH2)n-S02Ra, -CH2-SeRa, -(CH2)n-NRaRb, -C(0)Ra, -OC(0)NRaRb, -C(0)ORa, -C(0)NRaRbdans lequel
(i) Ra et Rb, étant tels que définis précédemment et
(ii) n peut représenter un entier égal pouvant prendre l'une quelconque des valeurs de 0 à 4, ou encore
- un groupement répondant à la formule (V) :
Rc-Q-(CH2)m (V)
dans laquelle
(i) m peut représenter un entier pouvant prendre l'une quelconque des valeurs de 1 à 8 ; et
(ii) Q peut représenter un atome d'oxygène ou un groupe -NRa dans lequel Ra est tel que défini précédemment et
(iii) Rc peut représenter
a. un atome d'hydrogène ou
b. un alkyle en C C6,
c. un aryle,
d. un hétéroaryle,
e. un hétérocycle,
f. un alkyle-C(O)-, dont l'alkyle peut être en CrC6,
g. un aryle-C(O)-,
h. un hétéroaryle-C(O)-, un hétérocycle-C(O)-,
un groupement représenté par l'une des formules (III)
Figure imgf000033_0001
ou
k. un groupe -O-C(O)- ou
I. un groupe -NRa-C(0)- dans lequel Ra est tel que défini
précédemment
o Si A avec X pris ensemble avec les carbones sur lesquels ils sont attachés représentent une chaîne de formule (VI)
Figure imgf000033_0002
dans laquelle
• Y peut représenter un groupe cétone (=0), un groupe oxime (=N-OH) ou un groupe alkyle oxime (=N-0-alkyle) dont le groupe alkyle peut être en C C6 ;
• R9 peut représenter un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en d-C-6, un atome d'halogène ; ou
• R9 et Ru pris ensemble peuvent former une liaison carbone-carbone additionnelle entre les atomes de carbone sur lesquels ils sont attachés, ou un groupe cycloalkyle en C3-C6 ; • Rio peut représenter un atome d'hydrogène, un atome d'halogène ou un groupe -ORa, -SRa, -CN, -NRaRb, -Ra et -Rb étant tels que définis précédemment ;
• Ru peut représenter un atome d'hydrogène, ou un groupe alkyle en C1-C6, cycloalkyle en C3-C6, aryle ou un atome d'halogène ;
• R12 peut représenter un atome d'hydrogène, ou un groupe alkyle en Ci-C6 ou un atome d'halogène ou un groupe -CN, -ORa, -SRa, -SeRa, -C(0)-Ra, -C(0)ORa, -NRaRb, -OC(0)NRaRb, -Ra et -Rb étant tels que définis précédemment ; ou
· R11 et R12 pris ensemble avec le carbone sur lequel ils sont attachés, peuvent former un groupe cycloakyle en C3-C6 ;
• R-13 peut représenter un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en CrC6, ou un atome d'halogène ou un groupe -CN, -CF3, -N02, -ORa, -SRa, -S02Ra, -NRaRb, -C(0)-Ra, -OC(0)Ra, -OC(0)NRaRb, -C(0)ORa, -C(0)NRaRb ou ensemble avec Z une liaison carbone-carbone
alors
• Z peut représenter un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle, un groupe hydroxyamino ou ensemble avec R-13 une liaison carbone-carbone et
• Ri peut représenter un atome d'hydrogène ou un groupe -CH3, -CH2-CN, -CH2-SRa, -CH2-SeRa ou encore un groupement répondant à la formule (VII) ou (VIII) suivante :
-CH2-W-RC (VII) ou -C(0)-W-Rc (VIII)
dans laquelle
+ W peut représenter un atome d'oxygène ou un groupe -NRa dans lequel Ra est tel que défini précédemment ou, un bras espaceur constitué d'une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée, éventuellement substituée, comportant de 2 à 20 atomes de carbone et comprenant en outre au moins un hétéroatome ;
+ Rc étant tel que défini précédemment ;
ainsi que :
- ses isomères géométriques SYN, ANTI, lorsqu'ils existent, - ses isomères optiques (énantiomères, diastéréoisomères), lorsqu'ils existent,
- ses sels d'addition à un acide ou à une base pharmaceutiquement acceptable,
- ses hydrates et ses solvates,
- ses prodrogues,
- ou l'un de ses esters.
Liposome selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé de formule I ou un mélange de composés de formule I, un phospholipide ou un mélange de phospholipides et un agent stabilisant du pH. Liposome selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un agent cryoprotecteur.
Liposome selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le composé de formule I est choisi parmi
• l'oxime de cholest-4-èn-3-one,
· l'oxime de cholest-4,24-dièn-3-one
• l'oxime de cholestan-3-one,
• l'oxime de 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
• l'oxime de 1 ,4-cholestadièn-3-one,
• l'oxime de 2-méthyl-cholest-4-èn-3-one,
· l'oxime de 2a-fluoro-cholest-4-èn-3-one,
• l'oxime de 4-méthoxy-cholest-4-èn-3-one,
• l'oxime de 4-fluoro-cholest-4-èn-3-one,
• l'oxime de 6 -fluoro-cholest-4-èn-3-one,
• l'oxime de 19-hydroxy-cholest-4-èn-3-one,
· l'oxime de 19-biotinyloxy-cholest-4-èn-3-one,
• l'oxime de 25-((N-(+)-biotinoyl-N-méthyl) amino)-27-norcholest-4-èn-3-one,
• l'oxime de 25-[méthyl(7-nitro-2,1 ,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-27-norcholest- 4-èn-3-one,
• l'oxime de 2,
2-difluoro-cholest-4-èn-3-one, • l'oxime de 2,6-difluoro-cholest-4-èn-3-one,
• le 3-oxime de cholest-4-èn-3,6-dione,
• le3-oxime de cholest-4,21-dièn-3,6-dione,
• le 3-oxime de 24-éthyl-cholest-4-èn-3,6-dione,
• le 3-oxime de 24-éthyl-cholest-4,21-dièn-3,6-dione,
• le 3-oxime de 24-méthyl-cholest-4,21-dièn-3,6-dione,
• l'oxime de 3-[méthyl(7-nitro-2,1 ,
3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-3,5-seco-4- norcholestan-5-one,
• l'oxime de 2-hydroxy-2,5-seco-3,
4-dinor-cholestan-5-one,
• l'oxime de 3-[(N-(+)-biotinoyl-N-méthyl)amino]-3,5-seco-4-norcholestan-5- one,
• l'oxime de 25-fluoro-3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
• l'oxime de 3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
• l'oxime de 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholest-24-èn-5-one,
• l'oxime de 3-hydroxy-3,5-seco-3-trifluorométhyl-4-norcholestan-5-one,
• l'oxime de 24p-éthyl-3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholest-22-èn-5-one,
• l'oxime de 3-hydroxy-3-méthyl-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
• l'oxime de 3,3-diméthyl-3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
• l'oxime de 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
• le dioxime de cholest-4-èn-3,6-dione,
• le dioxime de cholest-4,24-dièn-3,6-dione,
• le dioxime de 24-méthyl-cholest-4,21-dièn-3,6-dione,
• le dioxime de 24-éthyl-cholest-4-èn-3,6-dione,
• le dioxime de 24-éthyl-cholest-4,21-dièn-3,6-dione,
• la cholest-4-èn-3-one,
• la cholest-4,24-dièn-3-one,
• la 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
• la 3-hydroxy-3-méthyl-3,5-seco-4-norcholestan-5-one, • la 3,3-diméthyl-3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one,
• le méthyloxime de 3-hydroxy-3,5-seco-4-norcholestan-5-one.
5. ) Liposome selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le composé de formule I est présent dans la solution liposomale finale, en une quantité allant de 0,1 à 200 mg/mL, préférentiellement au-dessus de 1 mg/mL, encore plus préférentiellement au-dessus de 5 mg/mL, très préférentiellement au-dessus de 10 mg/mL).
6. ) Liposome selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que le phospholipide est choisi parmi phosphoacylqlvcérols (plus connus sous le nom de glycérophospholipides), les inositophosphatides, les phosphosphingolipides et les phosphonosphingolipides ou encore les phosphosaccharolipides, avantageusement parmi les phospholipides peuvent être choisis parmi la phosphatidylcholine, la lysophosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, la linoléylpalmitoylphosphatidylcholine, la palmitoyloléoylphosphatidylcholine, l'oléoylpalmitoylphophatidylcholine, la DHAstéaroylphosphatidyl choline, la phosphatidylcholine d'origine aviaire enrichie en DHA, le phosphatidylinositol, la DHA-phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylsérine, la sphingomyéline, un mélange de phospholipides d'origine aviaire proche de la composition du lait maternel, un mélange de phospholipides d'origine de soja proche de la composition du lait maternel, les acides lysophosphatidiques palmitique ou oléique, la lysophosphatidylcholine d'œuf renfermant des acides palmitique et stéarique à plus de 90%, la lysophosphatidylcholine de soja, le lysophosphatidylinositol, la lysophosphatidyléthanolamine, la lysophosphatidylsérine, un mélange de phospholipides d'œuf contenant de la phosphatidylcholine, de la phosphatidyléthanolamine, de la phosphatidylsérine, du phosphatidylinositol et de la sphingomyéline, le 1 ,2- dioléolyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), la 1 ,2-Dimyristoyl-sn- glycéro-3-phosphorylcholine (DMPC), le 1 ,2- dimyristoylphosphatidylglycérol (DMPG), la L-a-phosphatidylcholine d'œuf, la L-a-phosphatidylcholine de soja, la 1 ,2-distéaroyl-sn-glycéro-3- phosphoéthanolamine-N-[méthoxy (polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG). encore plus avantageusement parmi les phospholipides d'œuf ou de soja, de préférence les phospholipides d'œuf.
7. ) Liposome selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que le phospholipide est présent dans la solution liposomale finale dans le liposome en une quantité allant de 10 à 300 mg/mL, préférentiellement entre
20 et 200 mg/mL, très préférentiellement entre 50 et 150 mg/mL).
8. ) Liposome selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que l'agent stabilisant le pH est un tampon phosphate, benzoate, citrate, glutamate, lactate, ascorbate, tartrate, succinate, adipate, glycinate, malate, triéthanolaminate, diéthanolaminate, ou trométhaminate, avantageusement un tampon phosphate.
9. ) Liposome selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisé en ce que l'agent cryoprotecteur est choisi parmi le glycérol, le sucrose, le dextrose, le tréhalose, le glucose, le maltose, le mannose, le lactose, le mannitol, le sorbitol, la glycine, le polyvinylpyrrolidone (PVP), le polyvinylalcool (PVA), la gélatine, l'alanine, la lysine, le polyéthylène glycol, le dextrane, l'aerosil, le fructose, l'hydroxypropyl-p-cyclodextrine, préférentiellement parmi le glycérol, le sucrose ou le dextrose.
10. ) Liposome selon l'une quelconque des revendications 3 à 9, caractérisé en ce que l'agent cryoprotecteur peut être présent dans la formulation liposomale en une quantité allant de 0,01 à 30% en solution, préférentiellement entre 0,1 et 20%, très préférentiellement entre 1 et 10%.
1 1. ) Composition comprenant au moins un liposome comprenant au moins un composé de formule (I) tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12. ) Utilisation d'au moins un composé de formule (I) pour préparer des liposomes.
13. ) Utilisation des liposomes selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour préparer une composition, avantageusement une composition faiblement réactogène, cosmétique, pharmaceutique, ou vétérinaire.
14.) Utilisation des liposomes selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour le transport de principes actifs autres que les composés de formule (I).
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