WO2012161522A2 - Ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-오르니틴의 제조방법 - Google Patents

Ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-오르니틴의 제조방법 Download PDF

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    • C12Y101/99—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with other acceptors (1.1.99)
    • C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism of the genus Corynebacterium with improved L-ornithine production capacity and a method for producing L-ornithine using the same, and more specifically, the present invention reduces or decreases the activity of endogenous glucose dehydrogenase (GDH). Inactivated, the microorganism of the genus Corynebacterium with improved L- ornithine production capacity, a method for producing the microorganism and the microorganism using glucose as a carbon source, and recovering L- ornithine from the culture It relates to a method for producing L-ornithine.
  • GDH endogenous glucose dehydrogenase
  • Ornithine is one of the amino acids present on the urea cycle in vivo. High levels of ammonia in the blood cause liver damage. Ornithine and citrulline combine with ammonia in the blood to form citrulline and arginine, respectively, to reduce the level of ammonia in the blood. L-ornithine has a detoxifying function against ammonia, such as citrulline and proline, and is used not only as a therapeutic agent for liver disease but also as a food material to prevent obesity, and has new functions such as skin care such as wrinkle improvement. It turned out.
  • Corynebacterium strain (Corynebacterium), in particular Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) is a Gram-positive microorganism that is widely used for L-amino acid production.
  • Corynebacterium strain in particular Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) is a Gram-positive microorganism that is widely used for L-amino acid production.
  • microorganisms used for ornithine production include micrococcus glutamicus (Kyowahako Co., Ltd., Japan, US Pat. No. 2,988,489), which is a citrulline or arginine nutrient-mutant mutant strain by ultraviolet light treatment, and the like.
  • ketoglutamicum Arthrobacter paraffineus, Corynebacterium hydrocarboclastus (Korynebacterium hydrocarboclastus) (Kyowahako Industry Co., Ltd., US Pat. No. 3,574,061) and the like are known. have.
  • A. citreus B. Lactofermentum
  • C. glutamicum Ajinomoto (Ajinomoto), which are nutritionally demanding strains of arginine or citrulline
  • European Patent Publication No. 0393708 A2 is used for the production of ornithine by selecting a nutritionally demanding mutant strain that is resistant to mycophenolic acid or ornithinol.
  • U.S. Patent No. 3,574,061 discloses a method for preparing L-ornithine by culturing a nutritionally demanding mutant Brevibacterium ketoglutamum (ATCC 21092) in a medium containing hydrocarbons, for example, paraffin as the main carbon source.
  • ATCC 21092 Brevibacterium ketoglutamum
  • the productivity of ornithine was not very high at 8.6 mg / ml in 4 days of culture.
  • industrial mass production of L-ornithine is still required, and thus, there is a need to further develop L-ornithine production methods.
  • L-ornithine is biosynthesized from L-glutamic acid by Corynebacterium glutamicum via a cyclic pathway (Cunin et al., 1986), and the third step of the biosynthesis process is performed by the argC gene. Catalyzed by the encoded NADPH dependent reductase. A direct link between NADPH regeneration and the biosynthesis of specific metabolites was revealed through the biosynthesis of L-lysine by Corynebacterium glutamicum (Wittmann and Heinzle 2002; Marx et al. 2003; Ohnishi et al. 2005), NADPH can be produced mostly by oxidation of the pentose phosphate pathway.
  • Enzymes that catalyze this pathway during L-lysine production include glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and 6-phosphogluconate dehydrogenase (6-phosphogluconate dehydrogenase, 6PGD) (Marx et al. 1997; Wittmann and Heinzle 2002).
  • G6PDH glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • 6PGD 6-phosphogluconate dehydrogenase
  • a series of studies has suggested that the conversion of carbon flow in the pentose phosphorylation pathway may be a metabolic target for increasing the biosynthesis of certain metabolites that require NADPH supply (Mascarenhas et al. 1991; Sauer et al. 1996; Marx et al. 2003; Ohinishi et al. 2005).
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a method for producing L-ornithine more effectively, and as a result, by reducing the activity of the endogenous glucose dehydrogenase enzyme, and increasing the production of NADPH through the pentose sugar phosphorylation pathway, L-ornithine It was confirmed that the production of tin can be increased, and the present invention was completed.
  • the main object of the present invention is to provide a microorganism of the genus Corynebacterium with improved L-ornithine production capacity, characterized in that the activity of endogenous glucose dehydrogenase (GDH) is reduced or inactivated.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing microorganisms of the genus Corynebacterium with improved L-ornithine production capacity.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing L-ornithine using microorganisms of the genus Corynebacterium having improved L-ornithine production ability.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the central carbon metabolism process including the pentose phosphate (Pentose phosphate) and GDH pathway of Corynebacterium glutamicum.
  • 2A is a schematic diagram showing a gene map of a vector pSJ3513 for mutating NCgl2053, a GDH gene present in the chromosome of Corynebacterium glutamicum.
  • 2B is a schematic diagram showing a gene map of the vector pSJ3515 for mutating NCgl2582, a GDH gene present in the chromosome of Corynebacterium glutamicum.
  • Fig. 2C is a schematic diagram showing a gene map of the vector pSJ3517 for mutating NCgl0281, a GDH gene present in the chromosome of Corynebacterium glutamicum.
  • the present invention is a modified Corynebacterium genus, characterized in that the activity of endogenous glucose dehydrogenase (GDH) is reduced or inactivated to improve L- ornithine production capacity Provide microorganisms.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • GDH glucose dehydrogenase
  • GDH glucose dehydrogenase
  • the GDH is not particularly limited thereto, and may be expressed from NCgl0281 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, NCgl2582 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or NCgl2053 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and the like. Can be.
  • the term "intrinsic" of the present invention means that the microorganisms have a natural state, in the present invention is used to indicate the activity of GDH or GDH naturally possessed by microorganisms of Corynebacterium.
  • the term "decrease in activity of glucose dehydrogenase enzyme” of the present invention means that the activity of GDH is reduced by the mutation of the gene encoding GDH.
  • the genes NCgl0281, NCgl2582 and / or NCgl2053 that encode GDH present on the chromosome of a microorganism belonging to Corynebacterium are mutated and used to indicate a reduced activity of GDH expressed therefrom.
  • activation means that when the expression of the gene encoding the GDH is reduced to a low level or no expression at all compared to the wild strain, and even if the expression is not active or reduced, Activation can be by any inactivation method known in the art.
  • the reduction or inactivation of the glucose dehydrogenase (GDH) activity is not particularly limited, but is preferably an insertion mutation by insertion of one or more base pairs into the gene encoding the GDH, of one or more base pairs in the gene.
  • Deletion mutations having deletions, and nonsense codons or phases in the genes may be caused by one or more mutation methods selected from the group consisting of transition, transition mutations of base pairs introducing codons, more preferably May be induced by transformation by a recombinant vector comprising an antibiotic marker and a gene capable of inhibiting or reducing or inactivating GDH expression.
  • a recombinant vector comprising a portion of a gene encoding GDH and an antibiotic marker is introduced into a microorganism to induce homologous recombination, thereby reducing or inactivating GDH activity.
  • the antibiotic marker is not particularly limited, but it is preferable to use a kanamycin resistance gene
  • the recombinant vector is not particularly limited thereto, but it is preferable to use one derived from a pK18mobsacB vector. More preferably, the recombinant vector is not particularly limited thereto, but pSJC3513 having a cleavage map shown in FIG. 2A, pSJC3515 having a cleavage map shown in FIG. 2B, pSJC3517 having a cleavage map shown in FIG. 2C, and the like may be used.
  • the recombinant vector may further include a sacB gene, which is a gene encoding the glycan transfer enzyme Levansukraase.
  • the present inventors mutated a gene encoding GDH present on the chromosome of a microorganism of the genus Corynebacterium, thereby reducing the activity of GDH, resulting in glucose that is not used by GDH, depending on the pentose phosphorylation pathway, glucose-6-phosphate.
  • G6PDH Glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • the specific activities of G6PDH and 6PGD, enzymes involved in the production of NADPH in the pentose phosphorylation pathway are increased. Was found to improve the production yield of L-ornithine using NADPH.
  • FIG. One is a schematic diagram showing the central carbon metabolism process including the pentose phosphate (Pentose phosphate) and GDH pathway of Corynebacterium glutamicum.
  • 6-phosphategluconate dehydrogenase of the present invention is a redox enzyme involved in the pentose phosphorylation pathway present in the cytoplasm, and converts 6-PG to ribulose 5-P.
  • the enzyme refers to an enzyme involved in the reaction of reducing nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP +) to NADPH.
  • glucose-6-phosphate dehydrogenase As used herein, the term “glucose-6-phosphate dehydrogenase (Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH (EC 1.1.1.49)) refers to glucose-6 in the glucose-phosphate pathway, which is a glucose degradation pathway other than glycolysis. Means an enzyme that is involved in the reaction of reducing nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP +) to NADPH while carrying out a reaction for converting phosphate to 6-phosphono- ⁇ -lactone.
  • NADP + nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • L-ornithine of the present invention is a kind of basic amino acid which exists on the urea circuit in a living body of a higher animal, and protects the liver by converting ammonia, which is highly toxic to the liver, into a non-toxic urea and excreted by urine Amino acids that play a role. L-ornithine is widely used as a food material for preventing obesity by increasing muscle synthesis and promoting basal metabolism by secreting growth hormone. Recently, it has been found that there are new functions such as skin beauty action such as wrinkle improvement.
  • L-ornithine is in the form of L-ornithine alpha ketoglutarate (OKG: L-ornithine and alpha ketoglutaric acid in a 2: 1 ratio) for muscle enhancement, prevention of obesity and immunity. It is widely used as a material. L-ornithine is used as a medicine for improving liver disorders in Europe, in the form of L-ornithine salt in Japan, and as a food supplement in the United States.
  • microorganism of the genus Corynebacterium with improved L-ornithine production ability refers to a microorganism of the genus Corynebacterium in which the gene encoding the GDH present on the chromosome is mutated to decrease or inactivate the GDH activity.
  • the microorganism is not particularly limited, but preferably Corynebacterium glutamicum SJC8252 (KACC9 1633P), SJC8251 (KACC9 1632P) deposited at the National Institute of Agricultural Science on March 07, 2011 Or SJC8250 (KACC9 1631P).
  • the present invention comprises a method of homologous recombination of a gene encoding GDH present on a chromosome of a microorganism of the genus Corynebacterium, thereby reducing GDH activity.
  • a method for producing microorganisms of the genus Corynebacterium with improved productivity of tin is provided.
  • the method for producing a microorganism of the genus Corynebacterium having improved L-ornithine production capacity of the present invention is (i) obtaining a polynucleotide fragment in which some sequences of the gene encoding glucose dehydrogenase (GDH) are mutated.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • step (ii) introducing the obtained polynucleotide fragment into a vector capable of introducing into a host cell capable of producing L-ornithine and performing homologous recombination on chromosomes to obtain a recombinant vector; (iii) introducing the obtained recombinant vector into a host cell to obtain a homologous recombination product; And (iv) selecting a strain in which the activity of GDH is reduced or inactivated in the homologous recombination.
  • the gene encoding the GDH is not particularly limited, but NCgl0281 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 having the open reading frame DNA sequence of Genbank accession number NC_003450, NCgl2582 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: It is preferable to use NCgl2053 which consists of 3 base sequences.
  • the host cell is not particularly limited thereto, and may use microorganisms that produce L-ornithine, and preferably, NADPH may be produced by an pentose phosphorylation pathway including a GDH pathway, thereby producing L-ornithine.
  • Microorganisms can be used, and more preferably, Corynebacterium hydrocarboclastus, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoamino, which produce L-ornithine Microorganisms of the genus Corynebacterium, such as Gen. (C. thermoaminogenes) may be used, and most preferably Corynebacterium glutamicum SJC8039 (C. glutamicum ATCC13032, argF ⁇ , argR ⁇ (Hwang et al., J Microbiol Biotechnol 18: 704-710, 2008).
  • recombinant vector of the present invention is a vector that cannot be replicated separately from a chromosome of a host cell, and refers to a gene construct including an essential component capable of homologous recombination with a specific gene on a chromosome of the host cell.
  • the gene may include a transgene such as an antibiotic resistance gene and a levansucrase (sacB) gene.
  • sacB levansucrase
  • commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, ⁇ MBL3, ⁇ MBL4, ⁇ IXII, ⁇ ASHII, ⁇ APII, ⁇ t10, ⁇ t11, Charon4A, and Charon21A can be used as the phage vector or cosmid vector
  • pBR, pUC, and pBluescriptII systems are used as plasmid vectors.
  • pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based and the like can be used.
  • the inventors of the present invention are directed to a pK18mobsacB vector (Schafer et al. 1) which is capable of performing marker-free deletion of a target gene without replication in Corynebacterium glutamicum. Gene 145: 69-73, 1994) was used to perform gene deletion.
  • the pK18mobsacB vector comprises a polynucleotide fragment obtained by mutating, preferably deleting, a portion of NCgl0281, NCgl2582 and / or NCgl2053, which are genes encoding GDH, including an antibiotic marker and levansukraase gene (sacB).
  • a recombinant vector is prepared, and the recombinant vector is introduced into a host cell capable of biosynthesis of L-ornithine including a gene encoding GDH on a chromosome by any method known in the art, followed by homologous recombination in the chromosome.
  • Corynebacterium microorganisms for producing L-ornithine with reduced or inactivated GDH activity were prepared.
  • a recombinant vector pSJ3517 was prepared by inserting a polynucleotide fragment obtained by deleting a portion of NCgl0281 into a pK18mobsacB vector
  • a recombinant vector pSJ3515 was prepared by inserting a polynucleotide fragment obtained by deleting a portion of NCgl2582 into a pK18mobsacB vector.
  • the recombinant vector pSJ3513 was constructed by inserting a polynucleotide fragment obtained by deleting part of NCgl2053 in the pK18mobsacB vector.
  • each of the recombinant vectors pSJ3517, pSJ3515 or pSJ3513 thus prepared was introduced into Corynebacterium glutamicum SJC8039, a host cell capable of producing L-ornithine, and an kanamycin resistance phenotype was selected for the gene specificity. Diagnostic PCR using a gene-specific primer confirmed that the plasmid was introduced into the chromosomal region of the gene by a single crossover. Subsequently, selection of secondary recombination in 10% sucrose medium and diagnostic PCR using gene-specific primers confirmed the excision of the plasmid from the chromosomal region of the gene. It was.
  • the strain Corynebacterium glutamicum which lacks a gene encoding GDH, NCgl0281, NCgl2582 or NCgl2053, on the chromosome is named SJC8252, SJC8251 or SJC8250, respectively. Deposited at the Genetic Resource Center, they were assigned SJC8252 (Accession Number KACC9 1633P), SJC8251 (Accession Number KACC9 1632P) or SJC8250 (Accession Number KACC9 1631P), respectively.
  • the present invention comprises (i) inoculating and culturing a microorganism of the genus Corynebacterium having improved production capacity of L-ornithine of the present invention in a culture medium containing glucose as part or all of a carbon source. To obtain a culture; And, (ii) it provides a method for producing L- ornithine comprising recovering L- ornithine from the culture.
  • culture in the present invention means to grow microorganisms under environmental conditions that are appropriately artificially controlled.
  • the method of culturing Corynebacterium sp. Microorganisms may be performed using a method well known in the art. Specifically, the culturing may be a batch process or an injection batch or repeated fed batch process. It can be cultured continuously in a batch process, but is not limited thereto.
  • the medium used for cultivation must meet the requirements of the particular strain in an appropriate manner.
  • Culture media for Corynebacteria strains are known (e.g., Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology.Washington D.C., USA, 1981).
  • Sugar sources that can be used include sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, stearic acid Fatty acids such as linoleic acid, alcohols such as glycerol, ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials can be used individually or as a mixture.
  • Nitrogen sources that can be used include peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate. Nitrogen sources can also be used individually or as a mixture. Personnel that may be used include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts.
  • the culture medium should contain metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate required for growth.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used.
  • suitable precursors to the culture medium may be used. The above-mentioned raw materials may be added batchwise or continuously in a manner appropriate to the culture during the culturing process.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or acid compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid can be used in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble generation.
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, preferably 25 ° C to 40 ° C.
  • Incubation is continued until the maximum amount of L-ornithine production is obtained. For this purpose it is usually achieved in 10 to 160 hours.
  • L-ornithine may be excreted in culture medium or contained in cells.
  • the step of recovering L-ornithine from the culture can be carried out by methods known in the art.
  • the known L-ornithine recovery method is not particularly limited, but centrifugation, filtration, extraction, spraying, drying, thickening, precipitation, crystallization, electrophoresis, fractional dissolution (e.g. ammonium sulfate precipitation), chromatography Preference is given to using methods such as chromatography (eg ion exchange, affinity, hydrophobicity and size exclusion).
  • the activity of known enzymes related to the biosynthesis of L-ornithine can be further regulated.
  • L-ornithine production may be increased by overexpressing the argCJBD gene encoding the enzyme.
  • the present inventors cultured the microorganisms of Corynebacterium genus with improved productivity of L-ornithine prepared above in a medium containing glucose as a carbon source, and compared the increased level of the production of L-ornithine produced therefrom. As a result, as the activity of GDH was significantly reduced, the concentration of NADPH and the production of L-ornithine increased.
  • G6PDH and 6PGD were further increased in the Corynebacterium glutamicum strain (SJC8252, SJC8251, or SJC8250) into which the recombinant vector pSJ3517, pSJ3515, or pSJ3513 of the present invention with reduced GDH activity was increased.
  • SJC8252, SJC8251, or SJC8250 Corynebacterium glutamicum strain into which the recombinant vector pSJ3517, pSJ3515, or pSJ3513 of the present invention with reduced GDH activity was increased.
  • G6PDH and 6PGD are allosterically known to be affected by feedback control regulation in Corynebacterium glutamicum (Moritz et al. 2000). Therefore, it is expected that the release of feedback control regulation in the SJC8252, SJC8251 and SJC8250 of these enzymes may have a greater effect on the production of L-ornithine.
  • Example 1-1 Obtaining a Gene Encoding a Mutated GDH
  • a recombinant vector including a polynucleotide fragment in which an open reading frame of the genes encoding GDH, NCgl0281, NCgl2582 or NCgl2053, was internally deleted was constructed.
  • 2053F1, 2053F2, 2053R1 and 2053R2 were prepared (Table 1).
  • DNA sequences were amplified by PCR from genomic DNA of C. glutamicum ATCC13032 cells using 2053 F1 primer (SEQ ID NO: 4) and 2053 R1 primer (SEQ ID NO: 5).
  • the PCR reaction was performed with 2 ⁇ l of 250ng C. glutamicum ATCC13032 g-DNA, 2 ⁇ l of 20pm F1 primer and 2053 R1 primer of 10pmole, 20 ⁇ l of 2unit taq DNA polymerase (Bioeseang, Co., Inc), 24 ⁇ l of sterile distilled water.
  • 1,175 bp DNA fragment was obtained using the conditions of repeating denaturation (94 DEG C for 1 minute), annealing (58 DEG C for 1 minute), and elongation (70 DEG C for 1 minute and 30 seconds) 30 times.
  • DNA sequences were amplified by PCR from genomic DNA of C. glutamicum ATCC13032 cells using 2053 F2 primer (SEQ ID NO: 6) and 2053 R2 primer (SEQ ID NO: 7).
  • the PCR reaction was performed with 250 ⁇ l of C. glutamicum ATCC13032 g-DNA, 2 ⁇ l of 10 pmole 2053 F2 primer and 2053 R2 primer, 20 ⁇ l of 2 unit taq DNA polymerase (Bioeseang, Co., Inc), 24 ⁇ l of sterile distilled water.
  • the DNA fragment of 1,237bp was obtained using the conditions which repeat 30 times of denaturation (94 degreeC 1 minute), annealing (58 degreeC 1 minute), and elongation (70 degreeC 1 minute 30 second) 30 times.
  • DNA sequences were amplified by PCR from genomic DNA of C. glutamicum ATCC13032 cells using 2582 F2 primer (SEQ ID NO: 10) and 2582 R2 primer (SEQ ID NO: 11).
  • the PCR reaction was performed with 250 ⁇ l of C. glutamicum ATCC13032 g-DNA, 2 ⁇ l of 10 pmole 2582 F2 primer and 2582 R2 primer, 20 ⁇ l of 2 units of taq DNA polymerase (Bioeseang, Co., Inc), 24 ⁇ l of sterile distilled water.
  • a DNA fragment of 962 bp was obtained using conditions of denaturation (94 ° C. 1 minute), annealing (58 ° C. 1 minute) and elongation (70 ° C. 1 minute) for 30 times.
  • Recombinant vectors pSJ3513, pSJ3515 and pSJ3517 were constructed using pK18mobsacB, a non-replicable vector in Corynebacterium glutamicum for site specific gene disruption.
  • the pSJ3513 is a recombinant vector containing the HindIII terminus of 2,938-bp NCgl2053 and includes internal gene loss of the SmaI fragment of NCgl2053.
  • the SmaI fragment was generated by cross PCR with a pair of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 genomic DNA as 2053F1-2053R1 primer and 2053F2-2053R2 primer.
  • PSJ3515 is a recombinant vector containing the HindIII terminus of 1,943-bp NCgl2582 and includes an internal gene loss of the KpnI fragment of NCgl2582.
  • the KpnI fragment was generated by cross PCR using a pair of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 genomic DNA as a template with 2582F1-2582R1 primer and 2582F2-2582R2 primer.
  • the pSJ3517 is a recombinant vector containing the HindIII terminus of 2,330-bp NCgl0281 and includes internal gene loss of KpnI fragment of NCgl0281.
  • the KpnI fragment was generated by cross PCR using a pair of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 genomic DNA as a template of 0281F1-0281R1 and 0281F2-0281R2 primers.
  • Each recombinant vector was introduced and transformed by electroporation into Corynebacterium glutamicum SJC8039, a host cell capable of producing L-ornithine (van der Rest et al. 1999), and a kanamycin resistance phenotype was selected for gene Diagnostic PCR using a gene-specific primer confirmed that the plasmid was introduced into the chromosomal region of the gene by a single crossover. Subsequently, selection of secondary recombination in 10% sucrose medium and diagnostic PCR using gene-specific primers confirmed the excision of the plasmid from the chromosomal region of the gene. It was.
  • the L-ornithine production strains prepared in Example 1, Corynebacterium glutamicum SJC8252, SJC8251 and SJC8250 were cultured in the following manner for L-ornithine production. At this time, as a control, Corynebacterium glutamicum SJC8039, which is a host cell, was cultured and used.
  • Recovery Glucose medium 80 g BHI, 20 g glucose, 60 g sorbitol / L.
  • Production medium used MMY medium [0.8 g KH 2 PO 4, 10 g (NH 4) 2 SO 4, 1 g MgSO 47 H 2 O, 1.2 g Na 2 HPO 4, 2 mg MnSO 4 H 2 O, 2 mg FeSO 47 H 2 O, 1 mg ZnSO 47 H 2 O, 10 g yeast extract, and 60 g glucose / L, pH 7.0].
  • a 100 ml baffle flask containing seed medium was inoculated with control and strain Corynebacterium glutamicum SJC8252, SJC8251 or SJC8250, respectively, and shaken (200 rmp). After harvesting the isolated glutamicum incubated in the seed medium, the glutamicum was resuspended in a 100 ml baffle flask containing 10 ml of the production medium until the absorbance at 600 nm was 0.4-0.5. Thereafter, 0.2 g of sterile CaCO 3 per 10 ml was added. The incubation was carried out in a 200 rpm rotary stirrer at 30 ° C.
  • the growth rate, concentration of NADPH and concentration of L-ornithine of each strain were measured and compared from each of the above cultures (Tables 2 and 3).
  • the cell growth rate was measured by spectroscopy at 600 nm, and the concentration of L-ornithine was quantified using Agilent 1100 series HPLC and Zorbax Eclipse C18 column.
  • the dry cell mass was measured based on a point corresponding to 0.3 g of dry weight per 1 L with an absorbance value of 600 nm as 1.
  • the concentration of NADPH was determined by enzymatic cycling reaction using the EnzyChrom TM NADP + / NADPH Assay Kit (BioAssay Systems, CA, USA).
  • the concentration of NADPH was increased by 21.6% (2.13 vs. 2.59 ⁇ M) and L-ornithine when the SJC8251 strain lacking NCgl2582 was cultured in the Corynebacterium glutamicum SJC8039 strain. Production increased by 37.7% (8.78 vs. 12.09g / l), but the concentration of NADPH remained almost unchanged (2.13 vs. 2.19 ⁇ M) in the SJC8250 strain lacking NCgl2053. 23.9% increased (8.78 vs. 10.88g / l), and SJC8252 strain lacking NCgl0281 increased the concentration of NADPH by 45.1% (2.13 vs. 3.09 ⁇ M), and the production of L-ornithine was 65.5%. Increased (8.78 vs. 14.53 g / l).
  • SJC8250 (deleted NCgl2053), SJC8251 (deleted NCgl2582) and SJC8252 (deleted NCgl0281) showed a similar or slightly decreased growth rate compared to SJC8039 (parent strain), but intracellular NADPH Concentrations and L-ornithine production increased significantly.
  • Corynebacterium glutamicum cultured in the production medium was harvested using centrifugation during the expontial phase and resuspended in 100 mM Tris / HCl buffer (pH 7.5). Cells were destroyed using glass beads and centrifuged to obtain cell extracts. All these treatments were performed at 4 ° C., and the supernatants were harvested for specific enzyme activity analysis.
  • the amount of protein in the method for enzymatic analysis was determined by the Bradford method (Bradford 1976), and the activities of G6PDH, 6PGD and GDH were determined by NADPH spectroscopic formation at 340 nm (Frunzke et al. 2008) (Table 4 ).
  • the above values represent mean values based on the results obtained in at least three independent cultures and in all cases the standard deviation was less than 10%.
  • the specific activities of G6PDH and 6PGD were significantly increased in SJC8250, SJC8251 and SJC8252 compared to SJC8039.
  • the increased production of L-ornithine by blocking the GDH pathway is thought to be the result of an increase in NADPH regeneration due to increased specific activity of G6PDH and 6PGD, and from these results NCgl0281, NCgl2582 and / or Or a mechanism of producing L-ornithine from glucose using a mutant inactivated NCgl2053 may be proposed.
  • Increasing NADPH regeneration due to increased specific enzymatic activity of G6PDH and 6GPD resulted in increased production of L-ornithine.

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Abstract

본 발명은 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-오르니틴의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 보다 구체적으로 내재적 글루코스 디하이드로게나제(GDH)의 활성이 감소 또는 불활성화되어, L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물, 상기 미생물의 제조방법 및 상기 미생물을 글루코스를 탄소원으로 사용하여 배양하고, 상기 배양물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계를 포함하는 L-오르니틴의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 내재적 글루코스 디하이드로게나제 효소의 활성이 감소된 코리네박테리움 속 미생물을 이용하면, 오탄당 인산화 경로가 활성화될 뿐만 아니라, 오탄당 인산화 경로에 관여하는 효소인 G6PDH와 6PGD의 특이적 활성의 증대에 의하여 NADPH 생산수율이 증가하고, 이에 따라 상기 NADPH를 이용한 L-오르니틴의 생산수율을 향상시킬 수 있으므로, L-오르니틴의 효율적이고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

Ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-오르니틴의 제조방법
본 발명은 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-오르니틴의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 내재적 글루코스 디하이드로게나제(GDH)의 활성이 감소 또는 불활성화되어, L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물, 상기 미생물의 제조방법 및 상기 미생물을 글루코스를 탄소원으로 사용하여 배양하고, 상기 배양물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계를 포함하는 L-오르니틴의 제조방법에 관한 것이다.
오르니틴은 생체내의 요소 회로 상에 존재하는 아미노산 중의 하나이다. 혈중의 암모니아 농도가 높으면 간 손상을 일으키는데 오르니틴과 시트룰린은 혈중의 암모니아와 결합하여 각각 시트룰린과 아르기닌이 되어 혈중의 암모니아 농도를 감소시켜준다. L-오르니틴은 시트룰린, 프롤린과 같이 암모니아에 대한 해독기능을 갖고 있어 간장 질환의 치료제로서 사용될 뿐 아니라, 비만을 예방하는 식품소재로서도 이용되고 있으며, 주름살개선과 같은 피부미용작용 등 새로운 기능성이 있는 것으로 밝혀졌다.
한편, 코리네박테리움 균주 (Corynebacterium), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 이와 같이 코리네박테리움 균주를 이용한 L-아미노산의 제법은 중요하기 때문에 그 제조방법을 개선하기 위해 많은 시도가 행해지고 있다.
구체적으로 오르니틴 생산에 이용되는 미생물로는 자외선 처리 등에 의하여 시트룰린 또는 아르기닌 영양 요구성 돌연변이주인 마이크로코커스 글루타미쿠스 (Micrococcus glutamicus) (교와하꼬공업 (주), 일본, 미국 특허 제 2,988,489호), 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum), 동속 카와사키 (B. kawasaki), 동속 플라붐 (B. flavum) (아지노모토, 일본 특허공고 제68-8712, 68-8714 및 69-26,910호), 동속 케토글루타미쿰 (B. ketoglutamicum), 아스로박터 파라피네우스 (Arthrobacter paraffineus), 코리네박테리움 히드로카보클라스투스 (Corynebacterium hydrocarboclastus) (교와하꼬공업 (주), 미국 특허 제3,574,061호)등이 알려져 있다. 또한 아르기닌이나 시트룰린의 영양 요구성 균주인 아스로박터 시트레우스 (A. citreus), 브레비박테리움 락토페르멘툼 (B. Lactofermentum), 코리네박테리움 글루타미쿰 (C. glutamicum) (아지노모토 (주), 유럽특허 공개 제 0393708 A2)을 마이코페놀산 (mycophenolic acid) 또는 오르니티놀 (ornithinol)에 저항성을 갖는 영양 요구성 돌연변이 주를 선별하여 오르니틴 생산에 사용한다.
상기 미국 특허 제3,574,061호에서는 영양 요구성 돌연변이주인 브레비박테리움 케토글루타미쿰 (ATCC 21092)을 탄화수소, 예를 들어, 파라핀을 주요 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 L-오르니틴을 제조하는 방법을 개시하고 있으나, 이 방법에 의하면 오르니틴의 생산성은 4일간의 배양에서 8.6 mg/ml로 그다지 높지 않았다. 그러나 상기와 같은 연구 성과에도 불구하고 L-오르니틴의 산업적 대량생산은 여전히 요구되고 있기 때문에 이를 위하여 L-오르니틴의 생산방법을 더욱 더 개발할 필요성이 있다.
한편, L-오르니틴은 코리네박테리움 글루타미쿰에 의해 L-글루탐산으로부터 순환경로 (cyclic pathway)를 통해 생합성 되고 (Cunin et al.,1986), 상기 생합성 과정 중 3 단계는 argC 유전자에 의해 코딩된 NADPH 의존성 환원효소에 의해 촉매화된다. NADPH 재생과 특정 대사체의 생합성간의 직접적인 연관관계는 코리네박테리움 글루타미쿰에 의한 L-라이신의 생합성을 통해 밝혀졌고 (Wittmann and Heinzle 2002; Marx et al. 2003; Ohnishi et al. 2005), NADPH는 대부분 오탄당 인산화경로(pentose phosphate pathway)의 산화과정에 의해 생산될 수 있다. L-라이신을 생산하는 동안 상기 경로를 촉매하는 효소는 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제 (glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH) 및 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제 (6-phosphogluconate dehydrogenase, 6PGD)이다 (Marx et al. 1997; Wittmann and Heinzle 2002). 일련의 연구들은 오탄당 인산화경로의 탄소흐름의 전환이 NADPH 공급이 필요한 특정 대사물질의 생합성을 증대하기 위한 대사공학적 타겟일 수 있다는 점을 제시하였다 (Mascarenhas et al. 1991; Sauer et al. 1996; Marx et al. 2003; Ohinishi et al. 2005).
본 발명자들은 이전의 연구에서, 시트룰린과 프롤린 생합성 유전자가 결손되고 아르기닌 억제자 (ArgR)에 의한 피드백 제어가 차단된 돌연변이 균주에서 argCJBD 유전자의 상동적 발현 (homologous expression)으로 L-오르니틴의 생산량이 증가하였음을 보여주었다 (Hwang et al., J Microbiol Biotechnol 18:704-710, 2008). 그러나 L-오르니틴의 생합성 경로로 최대의 카본 플럭스를 유지하기 위해서는 argCJBD의 과발현뿐만 아니라, 오탄당 인산화 경로로의 탄소 흐름의 전환에 따른 NADPH의 생합성 증대 및 L-오르니틴의 생합성 경로로 NADPH의 충분한 공급이 확보되어야 할 것이다.
본 발명자들은 L-오르니틴을 보다 효과적으로 생산하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 내재적 글루코스 디하이드로게나제 효소의 활성을 감소시켜서, 오탄당 인산화 경로를 통해 NADPH의 생산을 증가시킬 경우, L-오르니틴의 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 내재적 글루코스 디하이드로게나제(GDH)의 활성이 감소 또는 불활성화된 것을 특징으로 하는, L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 L-오르니틴을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 내재적 글루코스 디하이드로게나제 효소의 활성이 감소된 코리네박테리움 속 미생물을 이용하면, 오탄당 인산화 경로가 활성화될 뿐만, 아니라, 오탄당 인산화 경로에 관여하는 효소인 G6PDH와 6PGD의 특이적 활성의 증대에 의하여 NADPH 생산수율이 증가하고, 이에 따라 상기 NADPH를 이용한 L-오르니틴의 생산수율을 향상시킬 수 있으므로, L-오르니틴의 효율적이고 경제적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰의 펜토오스 인산(pentose phosphate) 및 GDH 경로를 포함하는 중심탄소 대사과정을 나타내는 개요도이다.
도 2a는 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 내에 존재하는 GDH 유전자인 NCgl2053을 변이시키기 위한 벡터 pSJ3513의 유전자 지도를 나타내는 개요도이다.
도 2b는 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 내에 존재하는 GDH 유전자인 NCgl2582를 변이시키기 위한 벡터 pSJ3515의 유전자 지도를 나타내는 개요도이다.
도 2c는 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 내에 존재하는 GDH 유전자인 NCgl0281을 변이시키기 위한 벡터 pSJ3517의 유전자 지도를 나타내는 개요도이다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태에 의하면, 본 발명은 내재적 글루코스 디하이드로게나제(GDH)의 활성이 감소 또는 불활성화되어 L-오르니틴 생산능이 향상된 것을 특징으로 하는 변이된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 발명의 용어 "글루코스 디하이드로게나제(glucose dehydrogenase, GDH)"란, 5탄당 인산경로에서 D-글루코스를 D-글루코노-1, 5-락톤으로 전환시키는 탈수소효소를 의미하며, 글루코스 탈수소효소 또는 D-글루코스:1-산화환원효소라고도 한다. 본 발명의 목적상 상기 GDH는 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 NCgl0281, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 NCgl2582 또는 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 NCgl2053 등으로부터 발현될 수 있다.
본 발명의 용어 "내재적"이란, 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 것을 의미하는데, 본 발명에서는 코리네박테리움 속 미생물이 천연적으로 가지고 있는 GDH 또는 GDH의 활성을 표시할 때 사용한다.
본 발명의 용어 "글루코스 디하이드로게나제 효소의 활성감소"란, GDH를 코딩하는 유전자의 변이에 의해 GDH의 활성이 감소되는 것을 의미한다. 본 발명에서는 코리네박테리움 속 미생물의 염색체 상에 존재하는 GDH를 코딩하는 유전자 NCgl0281, NCgl2582 및/또는 NCgl2053가 변이되어, 이로부터 발현되는 GDH의 활성이 감소된 상태를 표시할 때 사용한다.
본 발명의 용어 "불활성화"란, 상기 GDH를 코딩하는 유전자의 발현이 야생 균주에 비하여 낮은 수준으로 감소하거나 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미하고, 상기 불활성화는 당업계에 알려진 임의의 불활성화 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
상기 글루코스 디하이드로게나제(GDH) 활성의 감소 또는 불활성화는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 GDH를 코딩하는 유전자 내로 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 상기 유전자 내의 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이, 및 상기 유전자 내의 넌센스 코돈 또는 상이 코돈을 도입시키는 염기쌍의 전이(transition), 전환(transversion) 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이 방법에 의하여 유발될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 GDH의 발현을 억제하거나 또는 감소 또는 불활성화된 GDH를 발현시킬 수 있는 유전자와 항생제 마커를 포함하는 재조합 벡터에 의한 형질전환에 의해 유발될 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 GDH를 코딩하는 유전자의 일부분과 항생제 마커를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 도입하여 상동재조합을 유도함으로써, GDH의 활성을 감소 또는 불활성화시켰다. 이때, 상기 항생제 마커는 특별히 이에 제한되지 않으나, 카나마이신 내성부여 유전자를 사용함이 바람직하고, 상기 재조합 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, pK18mobsacB 벡터로부터 유래된 것을 사용함이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 도 2a에 도시된 개열지도를 갖는 pSJC3513, 도 2b에 도시된 개열지도를 갖는 pSJC3515, 도 2c에 도시된 개열지도를 갖는 pSJC3517 등을 사용할 수 있다.
아울러, L-오르니틴의 생산능을 보다 향상시키기 위하여, 상기 재조합 벡터에 당전이 효소인 레반수크라아제를 코딩하는 유전자인 sacB 유전자를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명자들은 코리네박테리움 속 미생물의 염색체 상에 존재하는 GDH를 코딩하는 유전자를 변이시켜서, GDH의 활성을 감소시키면, GDH에 의하여 사용되지 않는 글루코스가 오탄당 인산화 경로에 따라, 글루코스-6-포스페이트탈수소효소(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)를 거치면서, NADPH를 생산하게 될 뿐만 아니라, 상기 오탄당 인산화 경로에서 NADPH의 생산에 관여하는 효소인 G6PDH와 6PGD의 특이적 활성이 증가되므로, 결과적으로는 NADPH를 이용한 L-오르니틴의 생산수율을 향상시킴을 확인할 수 있었다.
통상적인 오탄당 인산화 경로에 따르면, GDH는 글루코스를 글루코네이트로 전환시키고, 상기 글루코네이트는 6-PG로 전환된 다음, 6PGD에 의하여 NADPH를 생성하면서 리불로스 5-P로 전환되는 것으로 알려져 있다(도 1). 도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰의 펜토오스 인산(pentose phosphate) 및 GDH 경로를 포함하는 중심탄소 대사과정을 나타내는 개요도이다.
그러나, 본 발명자들은 상기 오탄당 인산화 경로에서 GDH를 불활성화 시키거나 또는 그의 활성을 감소시키면, 글루코스가 G6P로 전환되고, 상기 G6P는 G6PDH에 의하여 NADPH를 생성하면서 6-PG로 전환된 다음, 6PGD에 의하여 NADPH를 생성하면서 리불로스 5-P로 전환되므로, NADPH의 생합성량이 증가할 것으로 예상하였다. NADPH의 생합성량이 증가한다는 것은 곧 NADPH의 cofactor를 요구하는 L-오르니틴의 생합성량이 증가한다는 것을 의미하는 바, 결과적으로는 GDH의 불활성화 또는 활성감소에 의하여 L-오르니틴의 생합성 증가를 유도할 수 있을 것으로 예상하였으며, 이를 실험적으로 입증하였다.
본 발명의 용어 "6-포스페이트글루코네이트 탈수소효소(6-phosphategluconate dehydrogenase, 6PGD)"란, 세포질에 존재하는 오탄당 인산화 경로에 관여하는 산화환원 효소로, 6-PG를 리불로스 5-P로 전환시키는 반응을 수행함과 동시에, 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP+)를 NADPH로 환원시키는 반응에 관여하는 효소를 의미한다.
본 발명의 용어 "글루코스-6-포스페이트탈수소효소(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH (EC 1.1.1.49))"란, 해당경로(glycolysis) 외의 포도당 분해경로인 5탄당-인산경로에서 글루코스-6-포스페이트를 6-포스포노-δ-락톤으로 전환시키는 반응을 수행함과 동시에, 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP+)를 NADPH로 환원시키는 반응에 관여하는 효소를 의미한다.
본 발명의 용어 "L-오르니틴"이란, 고등동물의 생체 내의 요소 회로 상에 존재하는 염기성 아미노산의 일종으로서, 간에 대해 독성이 강한 암모니아를 무독성의 요소로 변환, 오줌으로 배출함으로써 간을 보호하는 역할을 하는 아미노산을 의미한다. L-오르니틴은 성장호르몬을 분비시킴으로써 근육합성을 증가시키고 기초대사를 촉진시켜 비만을 예방하는 식품소재로서 많이 이용되고 있다. 최근에는 주름살 개선과 같은 피부미용 작용 등의 새로운 기능이 있는 것으로 밝혀졌다. L-오르니틴은 L-오르니틴알파케토글루타릴산염(OKG: L-오르니틴과 알파케토글루타릴산이 2:1의 비율로 함유되어 있음)의 형태로 근육증강, 비만예방 및 면역증강소재로서도 폭넓게 이용되고 있다. L-오르니틴은 유럽에서는 간장장애를 개선하는 의약품으로서 이용되고 있고, 일본에서는 L-오르니틴산염의 형태로 식품소재로서 사용되고 있으며, 미국에서는 식품보조제로서 사용되고 있다.
본 발명의 용어 "L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물"이란, 염색체 상에 존재하는 GDH를 코딩하는 유전자가 변이되어 GDH의 활성이 감소 또는 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물을 의미하는데, 상기 미생물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 2011년 03월 07일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8252(KACC9 1633P), SJC8251(KACC9 1632P) 또는 SJC8250(KACC9 1631P)이다.
본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 코리네박테리움 속 미생물의 염색체상에 존재하는 GDH를 코딩하는 유전자를 상동재조합의 방법으로 변이시켜서, GDH 활성을 감소시키는 단계를 포함하는, L-오르니틴의 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물의 제조방법은 (i) 글루코스 디하이드로게나제(GDH)를 코딩하는 유전자의 일부 서열이 변이된 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계; (ii) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을, L-오르니틴을 생산할 수 있는 숙주세포에 도입될 수 있고 염색체상에서 상동재조합을 수행할 수 있는 벡터에 도입하여 재조합 벡터를 수득하는 단계; (iii) 상기 수득한 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 상동재조합체를 수득하는 단계; 및, (iv) 상기 상동재조합체 중에서 GDH의 활성이 감소 또는 불활성화된 균주를 선발하는 단계를 포함한다.
이때, GDH를 코딩하는 유전자는 특별히 이에 제한되지 않으나, Genbank accession number NC_003450의 개방해독틀 DNA 서열을 가지는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 NCgl0281, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 NCgl2582 또는 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 NCgl2053을 사용함이 바람직하다.
아울러, 상기 숙주세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, L-오르니틴을 생산하는 미생물을 이용할 수 있는데, 바람직하게는 GDH 경로를 포함하는 오탄당 인산화 경로에 의하여 NADPH를 생산하고 이에 의하여 L-오르니틴을 생산하는 미생물을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 L-오르니틴을 생산하는 코리네박테리움 히드로카보클라스투스(Corynebacterium hydrocarboclastus), 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(C. thermoaminogenes) 등의 코리네박테리움 속 미생물을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8039(C. glutamicum ATCC13032, argF△ , argR△(Hwang et al., J Microbiol Biotechnol 18:704-710, 2008)를 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "재조합 벡터"란 숙주세포의 염색체와 따로 복제될 수 없는 벡터로서, 유전자 삽입물이 상기 숙주세포의 염색체상의 특정 유전자와 상동재조합될 수 있는 필수적인 구성요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 구체적으로 항생제 내성 유전자와 레반수크라아제(levansucrase, sacB) 유전자와 같은 선발유전자를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제되지 않고 표적 유전자의 마커-프리 결실(marker-free deletion)을 수행하는 기능이 있는 pK18mobsacB 벡터(Schafer et al., Gene 145: 69-73, 1994)를 이용함으로써 유전자 결실을 수행하였다. 구체적으로, 상기 pK18mobsacB 벡터에 GDH를 코딩하는 유전자인 NCgl0281, NCgl2582 및/또는 NCgl2053의 일부를 변이, 바람직하게는 결실시켜 수득한 폴리뉴클레오티드 단편, 항생제 마커 및 레반수크라아제 유전자(sacB)를 포함하는 재조합 벡터를 제작하고, 상기 재조합 벡터를 당업계에 알려진 임의의 방법으로 염색체상에 GDH를 코딩하는 유전자를 포함하여 L-오르니틴을 생합성할 수 있는 숙주세포에 도입시킨 후, 염색체 내에서 상동 재조합시킴으로써, GDH 활성이 감소 또는 불활성화된 L-오르니틴 생산용 코리네박테리움 미생물을 제작하였다.
구체적으로, pK18mobsacB 벡터에 NCgl0281의 일부를 결실시켜 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 삽입하여 재조합 벡터 pSJ3517을 제작하고, pK18mobsacB 벡터에 NCgl2582의 일부를 결실시켜 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 삽입하여 재조합 벡터 pSJ3515를 제작하였으며, pK18mobsacB 벡터에 NCgl2053의 일부를 결실시켜 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 삽입하여 재조합 벡터 pSJ3513을 제작하였다.
그런 다음, 상기 제작된 각 재조합 벡터 pSJ3517, pSJ3515 또는 pSJ3513를 L-오르니틴을 생산할 수 있는 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8039에 전기천공법으로 도입하고, 카나마이신 내성 표현형을 선발하여 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 상기 플라스미드가 싱글 크로스오버에 의해 해당 유전자의 염색체 부위에 도입되었음을 확인하였다. 그 후 10%의 수크로오스 배지에서 2 차 재조합의 선발과 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 해당 유전자의 염색체 부위로부터 플라스미드가 절제(excision)되었음을 확인하였다. 그 결과 염색체 상에서 GDH를 코딩하는 유전자인 NCgl0281, NCgl2582 또는 NCgl2053의 일부가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 각각 SJC8252, SJC8251 또는 SJC8250이라 명명하고, 2011년 03월 07일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 각각 SJC8252(기탁번호 KACC9 1633P), SJC8251(기탁번호 KACC9 1632P) 또는 SJC8250(기탁번호 KACC9 1631P)의 기탁번호를 부여받았다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 (i) 탄소원의 일부 또는 전부로서 글루코스가 포함된 배양 배지에 본 발명의 L-오르니틴의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 접종하고 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, (ii) 상기 배양물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계를 포함하는 L-오르니틴을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다.구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 L-오르니틴의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. L-오르니틴은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
아울러, 배양물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 L-오르니틴 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용함이 바람직하다.
한편, 본 발명에서는 L-오르니틴 생산량을 더욱 증가시키기 위해, L-오르니틴의 생합성에 관련된 공지의 효소들의 활성을 추가로 조절할 수 있다. 바람직하게 본 발명에서는 추가로 ArgCJBD 효소의 활성을 조절하기 위하여 상기 효소를 암호화하는 argCJBD 유전자를 과발현시켜 L-오르니틴 생산량을 증대시킬 수 있다.
본 발명자들은 상기 제조된 L-오르니틴의 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 글루코스를 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양하고, 이로부터 생산되는 L-오르니틴의 생산량의 증가수준을 상호 비교하였다. 그 결과, GDH의 활성이 크게 감소될 수록 NADPH의 농도와 L-오르니틴의 생산량이 증가함을 확인 할 수 있었다.
아울러, GDH의 활성이 감소된 본 발명의 재조합 벡터 pSJ3517, pSJ3515 또는 pSJ3513가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(SJC8252, SJC8251 또는 SJC8250)에서는 G6PDH와 6PGD의 특이적 활성이 더욱 증가함을 확인할 수 있었다.
따라서, GDH의 활성 감소에 의하여 오탄당 인산화 경로가 활성화될 뿐만 아니라, 오탄당 인산화 경로에 관여하는 효소인 G6PDH와 6PGD의 특이적 활성이 증가함에 의하여, NADPH의 생산량이 증가하며, NADPH의 생산량 증가에 의하여 L-오르니틴의 생합성량이 증가함을 다시 한번 확인할 수 있었다.
G6PDH 및 6PGD는 알로스테릭적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 피드백 제어 조절작용의 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Moritz et al. 2000). 그러므로 상기 효소들의 SJC8252, SJC8251 및 SJC8250 내에서 피드백 제어 조절작용의 해제는 L-오르니틴의 생산에 더 큰 영향을 미칠 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 부위-특이적 유전자가 결실된 변이주의 제조
실시예 1-1: 변이된 GDH를 코딩하는 유전자의 수득
GDH가 불활성화된 형질전환체를 제조하기 위하여, GDH를 코딩하는 유전자인 NCgl0281, NCgl2582 또는 NCgl2053의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 결실된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 재조합 벡터를 제작하였다.
먼저, NCgl0281, NCgl2582 및 NCgl2053의 염기서열이 내부적으로 결실된 폴리뉴클레오티드 단편을 제작하기 위하여 NCgl0281, NCgl2582 및 NCgl2053의 서열을 근거로 각각 프라이머 0281F1, 0281F2, 0281R1, 0281R2, 2582F1, 2582F2, 2582R1, 2582R2, 2053F1, 2053F2, 2053R1 및 2053R2를 제작하였다(표 1).
표 1 프라이머의 염기서열
프라이머 명칭 염기서열 서열번호
2053F1 cccaagcttAAGACACCGGTCATGGTG (HindIII) 4
2053R1 tcccccgggTGCTACGGCAGCTCCAAT (SmaI) 5
2053F2 tcccccgggGACGAAGCCAGCTATGTG (SmaI) 6
2053R2 cccaagcttACTCCTGTGCTTCCTTCC (HindIII) 7
2582F1 cccaagcttCCTCCGCCCCAATTATTC (HindIII) 8
2582R1 cggggtaccGGTCTCTGCAGCTTGTTC (KpnI) 9
2582F2 cggggtaccGGTCTGGTTTCGTTCCTG (KpnI) 10
2582R2 cccaagcttCCATCCTGCACTTCTCAG (HindIII) 11
0281F1 cccaagcttGTCCAAGCCGATTGACTC (HindIII) 12
0281R1 cggggtaccGATTGCTGCGACAGTCTC (KpnI) 13
0281F2 cggggtaccCAGGAACGTGGCAAGAAC (KpnI) 14
0281R2 cccaagcttCGGCTTCGGTGAGAACTT (HindIII) 15
상기 표 1에서, 밑줄친 서열은 괄호 안에 나타낸 바와 같은 제한효소에 대한 제한위치를 나타내며, 대문자는 세균성 유전자의 서열을 의미한다.
2053 F1 프라이머(서열번호4)와 2053 R1 프라이머(서열번호5)를 이용하여 C. glutamicum ATCC13032 세포의 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 특정 DNA 염기서열을 증폭하였다. PCR 반응물은 C. glutamicum ATCC13032 g-DNA 250ng을 2㎕, 10pmole의 2053 F1 프라이머 및 2053 R1 프라이머를 각각 2㎕, 2unit의 taq DNA 중합효소(Bioeseang, Co., Inc) 20㎕, 멸균 증류수 24㎕로 구성하였으며, 변성(94℃ 1분), 어닐링(58℃ 1분) 및 신장(70℃ 1분30초)을 30번 반복하는 조건을 사용하여, 1,175bp의 DNA단편을 수득하였다.
2053 F2 프라이머(서열번호6)와 2053 R2 프라이머(서열번호7)를 이용하여 C. glutamicum ATCC13032 세포의 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 특정 DNA 염기서열을 증폭하였다. PCR 반응물은 C. glutamicum ATCC13032 g-DNA 250ng을 2㎕, 10pmole의 2053 F2 프라이머 및 2053 R2 프라이머를 각각 2㎕, 2unit의 taq DNA 중합효소(Bioeseang, Co., Inc) 20㎕, 멸균 증류수 24㎕로 구성하였으며, 변성(94℃ 1분), 어닐링(58℃ 1분) 및 신장(70℃ 1분30초)을 30번 반복하는 조건을 사용하여, 1,237bp의 DNA단편을 수득하였다.
2582 F1 프라이머(서열번호8)와 2582 R1 프라이머(서열번호9)를 이용하여 C. glutamicum ATCC13032 세포의 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 특정 DNA 염기서열을 증폭하였다. PCR 반응물은 C. glutamicum ATCC13032 g-DNA 250ng을 2㎕, 10pmole의 2582 F1 프라이머 및 2582 R1 프라이머를 각각 2㎕, 2unit의 taq DNA 중합효소(Bioeseang, Co., Inc) 20㎕, 멸균 증류수 24㎕로 구성하였으며, 변성(94℃ 1분), 어닐링(58℃ 1분) 및 신장(70℃ 1분)을 30번 반복하는 조건을 사용하여, 981bp의 DNA단편을 수득하였다.
2582 F2 프라이머(서열번호10)와 2582 R2 프라이머(서열번호11)를 이용하여 C. glutamicum ATCC13032 세포의 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 특정 DNA 염기서열을 증폭하였다. PCR 반응물은 C. glutamicum ATCC13032 g-DNA 250ng을 2㎕, 10pmole의 2582 F2 프라이머 및 2582 R2 프라이머를 각각 2㎕, 2unit의 taq DNA 중합효소(Bioeseang, Co., Inc) 20㎕, 멸균 증류수 24㎕로 구성하였으며, 변성(94℃ 1분), 어닐링(58℃ 1분) 및 신장(70℃ 1분)을 30번 반복하는 조건을 사용하여, 962bp의 DNA단편을 수득하였다.
0281 F1 프라이머(서열번호12)와 0281 R1 프라이머(서열번호13)를 이용하여 C. glutamicum ATCC13032 세포의 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 특정 DNA 염기서열을 증폭하였다. PCR 반응물은 C. glutamicum ATCC13032 g-DNA 250ng을 2㎕, 10pmole의 0281 F1 프라이머 및 0281 R1 프라이머를 각각 2㎕, 2unit의 taq DNA 중합효소(Bioeseang, Co., Inc) 20㎕, 멸균 증류수 24㎕로 구성하였으며, 변성(94℃ 1분), 어닐링(58℃ 1분) 및 신장(70℃ 1분30초)을 30번 반복하는 조건을 사용하여, 1,185bp의 DNA단편을 수득하였다.
0281 F2 프라이머(서열번호14)와 0281 R2 프라이머(서열번호15)를 이용하여 C. glutamicum ATCC13032 세포의 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 특정 DNA 염기서열을 증폭하였다. PCR 반응물은 C. glutamicum ATCC13032 g-DNA 250ng을 2㎕, 10pmole의 0281 F2 프라이머 및 0281 R2 프라이머를 각각 2㎕, 2unit의 taq DNA 중합효소(Bioeseang, Co., Inc) 20㎕, 멸균 증류수 24㎕로 구성하였으며, 변성(94℃ 1분), 어닐링(58℃ 1분) 및 신장(70℃ 1분30초)을 30번 반복하는 조건을 사용하여, 1,145bp의 DNA단편을 수득하였다.
실시예 1-2: 재조합 벡터 및 형질전환체의 수득
부위-특이적 유전자 결실(site specific gene disruption)을 위하여 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 벡터인 pK18mobsacB를 이용하여 재조합 벡터 pSJ3513, pSJ3515 및 pSJ3517를 제작하였다
상기 pSJ3513은 2,938-bp짜리 NCgl2053의 HindIII 말단을 포함하는 재조합 벡터로서 NCgl2053의 SmaI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 SmaI 절편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2053F1-2053R1 프라이머와 2053F2-2053R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 것이다.
상기 pSJ3515는 1,943-bp짜리 NCgl2582의 HindIII 말단을 포함하는 재조합 벡터로서 NCgl2582의 KpnI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 KpnI 절편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2582F1-2582R1 프라이머와 2582F2-2582R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 것이다.
상기 pSJ3517는 2,330-bp짜리 NCgl0281의 HindIII 말단을 포함하는 재조합 벡터로서 NCgl0281의 KpnI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 KpnI 절편은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 0281F1-0281R1 프라이머와 0281F2-0281R2 프라이머 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 것이다.
각각의 재조합 벡터를 L-오르니틴을 생산할 수 있는 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8039에 전기천공법으로 도입하여 형질전환시키고(van der Rest et al. 1999) 카나마이신 내성 표현형을 선발하여 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 상기 플라스미드가 싱글 크로스오버에 의해 해당 유전자의 염색체 부위에 도입되었음을 확인하였다. 그 후 10%의 수크로오스 배지에서 2 차 재조합의 선발과 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer)를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 해당 유전자의 염색체 부위로부터 플라스미드가 절제(excision)되었음을 확인하였다. 그 결과 NCgl0281, NCgl2582 또는 NCgl2053 유전자의 특정부위가 각각 결실된 돌연변이 균주를 제작하여 이들을 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8252, 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8251 및 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8250이라 각각 명명하였고, 2011년 03월 07일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 기탁번호 KACC9 1633P, KACC9 1632P 및 KACC9 1631P를 각각 부여받았다.
실시예 2 : NCgl0281, NCgl2582 및/또는 NCgl2053 유전자가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 L-오르니틴 생산
상기 실시예 1에서 제조한 각각의 L-오르니틴 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8252, SJC8251 및 SJC8250으로부터 L-오르니틴 생산을 위해 하기와 같은 방법으로 배양하였다. 이때, 대조군으로서는 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8039을 배양하여 사용하였다.
종배지로 Recovery Glucose 배지(80g BHI, 20g 클루코오스, 60g 소르비톨/L)을 사용하여 24 시간 배양하였다. 생산배지는 MMY 배지[0.8g KH2PO4, 10g (NH4)2SO4, 1g MgSO47H2O, 1.2g Na2HPO4, 2mg MnSO4H2O, 2mg FeSO47H2O, 1mg ZnSO47H2O, 10g 효모 추출액, 및 60g 글루코스/L, pH 7.0]를 사용하였다.
종배지를 함유하는 100 ㎖ 배플 플라스크에 대조군과 본 발명의 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8252, SJC8251 또는 SJC8250을 각각 접종하고 진탕배양(200 rmp)하였다. 종배지에서 배양된 상기 클루타미쿰을 분리하여 수확한 후 상기 글루타미쿰을 600 nm에서 흡광도가 0.4 ~ 0.5일 때까지 상기 생산배지 10 ㎖을 함유하는 100 ㎖ 배플 플라스크에서 재현탁하였다. 그 후, 10 ㎖당 0.2 g의 멸균된 CaCO3를 첨가하였다. 상기의 배양은 30℃의 200rpm 회전식 교반기에서 수행되었다.
상기 각각의 배양물로부터 각 균주의 성장률, NADPH의 농도 및 L-오르니틴의 농도를 측정하고 비교하였다(표 2 및 3). 이때, 600 nm에서 분광법으로 세포 성장률을 측정하였고, L-오르니틴의 농도는 Agilent 1100 series HPLC 및 Zorbax Eclipse C18 column을 사용하여 정량하였다. 건조균체량은 600 nm에서의 흡광도 값을 1로 하여 1L당 건조중량 0.3 g에 해당하는 점을 기초로 측정하였다. NADPH의 농도는 EnzyChrom™NADP+/NADPH 분석 키트를 사용한 효소적 순환 반응(enzymatic cycling reaction)으로 측정하였다(BioAssay Systems, CA, USA).
표 2 균주의 성장률
코리네박테리움 글루타미쿰 성장률(μmax)
SJC8039 0.69
SJC8250 0.70
SJC8251 0.70
SJC8252 0.61
표 3 NADPH의 농도 및 L-오르니틴의 농도
코리네박테리움 글루타미쿰 NADPH(μM) L-오르니틴(g/l)
SJC8039 2.13 8.78
SJC8250 2.19 10.88
SJC8251 2.59 12.09
SJC8252 3.09 14.53
상기 표 2 및 표 3에서 보듯이, 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8039 균주에서 NCgl2582가 결손된 SJC8251 균주를 배양한 경우 NADPH의 농도는 21.6% 증가하였고(2.13 vs. 2.59μM), L-오르니틴의 생산량은 37.7% 증가하였지만(8.78 vs. 12.09g/l), NCgl2053이 결손된 SJC8250 균주를 배양한 경우 NADPH의 농도는 거의 변화하지 않았고(2.13 vs. 2.19μM), L-오르니틴의 생산량은 23.9% 증가하였으며(8.78 vs. 10.88g/l), NCgl0281이 결손된 SJC8252 균주를 배양한 경우에는 NADPH의 농도는 45.1% 증가하였고(2.13 vs. 3.09μM), L-오르니틴의 생산량은 65.5% 증가하였다(8.78 vs. 14.53g/l).
이러한 결과는 과량의 NADPH가 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 L-오르니틴의 생합성을 증가시키기 위해 요구된다는 것을 나타낸다.
아울러, SJC8250(NCgl2053이 결손된 것), SJC8251(NCgl2582이 결손된 것) 및 SJC8252(NCgl0281이 결손된 것)는 SJC8039(모균주)에 비교하여, 성장률은 거의 비슷하거나 다소 감소하지만, 세포내 NADPH 농도와 L-오르니틴의 생산량은 현격히 증가하였다.
실시예 3 : GDH의 활성도 비교
상기 생산배지에서 배양된 코리네박테리움 글루타미쿰은 지수 성장기(exponetial phase)동안 원심분리법을 사용하여 수확하였고 100 mM Tris/HCl 완충액(pH 7.5)으로 재현탁하였다. 세포는 유리알(glass bead)를 사용하여 파괴하였고 세포 추출물을 얻기 위해 원심분리하였다. 이 모든 처리는 4℃에서 이루어졌으며, 상층액은 특이적 효소 활성 분석을 위하여 채취하였다.
효소분석을 위한 방법으로 단백질의 양은 브래드포드법(Bradford 1976)에 의해 결정하였으며, G6PDH, 6PGD 및 GDH의 활성은 340 nm에서 NADPH 분광학적 형성을 통해 측정하였다(Frunzke et al. 2008)(표 4).
표 4 중심탄소대사과정의 핵심 효소의 특이적 활성도
코리네박테리움 글루타미쿰 특이적 활성(U mg-1 protein)
G6PDH 6PGD GDH
SJC8239 0.19 0.33 7.12
SJC8250 0.33 0.38 4.37
SJC8251 0.42 0.74 2.97
SJC8252 0.84 1.13 1.41
상기의 값은 적어도 3개의 독립적인 배양에서 얻어진 결과를 기초로 한 평균값을 나타내며 모든 경우에 있어서 표준편차가 10 % 이하였다.
표 4에서 보듯이, SJC8251의 경우 GDH의 특이적 활성이 41.7% 정도 남아있게 되는 것으로 나타났으며(7.12 vs. 2.97 U/mg protein), SJC8250의 경우 64.1%(7.12 vs. 4.37 U/mg protein), 그리고 SJC8252의 경우 GDH의 특이적 활성이 19.8%(7.12 vs. 1.41 U/mg protein) 정도 남아있게 되는 것으로 나타났다.
구체적으로 G6PDH와 6PGD의 특이적 활성을 비교하면, G6PDH 및 6PGD의 특이적 활성은 SJC8039에 비해 SJC8250, SJC8251 및 SJC8252 내에서 현격히 증가하였다.
GDH 경로를 차단함으로써 L-오르니틴의 생산량이 증가한 것은 G6PDH 및 6PGD의 특이적 활성 증가로 인한 NADPH 재생량의 증가에 의한 결과로 판단되고, 상기의 결과로부터 GDH 유전자로 추정되는 NCgl0281, NCgl2582 및/또는 NCgl2053을 불활성화시킨 변이주를 사용하여 글루코스로부터 L-오르니틴을 생산하는 방법의 메카니즘이 제안될 수 있다. G6PDH 및 6GPD의 특이적 효소활성의 증가로 인한 NADPH 재생량의 증가는 L-오르니틴의 생산량 증가를 유도하였다.
Figure PCTKR2012004089-appb-I000001
Figure PCTKR2012004089-appb-I000002
Figure PCTKR2012004089-appb-I000003

Claims (13)

  1. 내재적 글루코스 디하이드로게나제(GDH)의 활성이 감소 또는 불활성화되어 L-오르니틴 생산능이 향상된 것을 특징으로 하는 변이된 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 GDH는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 NCgl0281, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 NCgl2582 또는 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 NCgl2053로부터 발현되는 것인 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 감소 또는 불활성화는 상기 GDH를 코딩하는 유전자 내로 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 상기 유전자 내의 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이, 및 상기 유전자 내의 넌센스 코돈 또는 상이 코돈을 도입시키는 염기쌍의 전이(transition) 또는 전환(transversion) 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이 방법에 의하여 유발되는 것인 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 감소 또는 불활성화는 상기 GDH의 발현을 억제하여 유발되거나 또는 감소 또는 불활성화된 GDH를 발현시킬 수 있는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의한 형질전환에 의해 유발되는 것인 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 pK18mobsacB 벡터로부터 유래된 것인 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 sacB 유전자를 추가로 포함하는 것인 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 도 2a에 도시된 개열지도를 갖는 pSJC3513, 도 2b에 도시된 개열지도를 갖는 pSJC3515 또는 도 2c에 도시된 개열지도를 갖는 pSJC3517인 것인 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 변이된 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8250(KACC91631P), 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8251(KACC91632P) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 SJC8252(KACC91633P)인 것인 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  9. 제1항에 있어서,
    argCJBD 유전자가 과발현되는 것인 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  10. 제1항에 있어서,
    오탄당 인산화 경로가 활성화되고, 글루코스-6-포스페이트탈수소효소(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)와 6-포스페이트글루코네이트 탈수소효소(6-phosphategluconate dehydrogenase, 6PGD)의 특이적 활성이 증가하며, NADPH의 생산량이 증가하는 것인 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  11. (i) 글루코스 디하이드로게나제(GDH)를 코딩하는 유전자의 일부 서열이 변이된 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계;
    (ii) 상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을, L-오르니틴을 생산할 수 있는 숙주세포에 도입될 수 있고 염색체상에서 상동재조합을 수행할 수 있는 벡터에 도입하여 재조합 벡터를 수득하는 단계;
    (iii) 상기 수득한 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 상동재조합체를 수득하는 단계; 및,
    (iv) 상기 상동재조합체 중에서 GDH의 활성이 감소 또는 불활성화된 균주를 선발하는 단계를 포함하는, L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 미생물은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물인 것인 방법.
  13. (i) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 L-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물, 또는 제9항의 방법에 의해 제조된 코리네박테리움 속 미생물을 탄소원의 일부 또는 전부로서 글루코스가 포함된 배양 배지에 접종하고 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및,
    (ii) 상기 배양물로부터 L-오르니틴을 회수하는 단계를 포함하는 L-오르니틴을 생산하는 방법.
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