WO2012124978A2

WO2012124978A2 - 3차원 세포배양으로 수득한 조정 배지를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: WO2012124978A2
Application number: PCT/KR2012/001838
Authority: WO
Inventors: 김병수; 방석호
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-03-14
Filing date: 2012-03-14
Publication date: 2012-09-20
Also published as: KR20120104771A; KR101349183B1; WO2012124978A3

Abstract

본 발명은 성체 줄기세포를 세포 배양용 배지에서 3차원적으로 배양하여 얻은 배양물로부터 수거한 조정 배지를 유효성분으로 포함하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조정 배지는 2차원 배양법에 의해 얻어진 조정 배지에 비해 혈관생성 촉진 인자의 농도 및 함량이 매우 높아 허혈성 혈관 질환의 혈관 재생에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 종래 세포 배양 배지 또는 조정 배지에 사용되던 동물 유래 성분과 완충용액 및 지시약 성분들이 없어 임상에 안전하게 적용가능하며, 적은 양으로도 허혈성 혈관 질환 등에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

명세서

3차원 세포배양으로 수득한조정 배지를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물 발명의 분야 본 발명은 3차원 세포배양으로 수득한 조정 배지 (conditioned medium)를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 성체 기세포를 세포 배양용 배지에서 3차원적으로 배양하여 얻은 배양물로부터 수거한 조정 배지를 유효성분으로 포함하는， 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 발명의 배경 줄기세포 치료제를 포함한 세포치료제 (cell therapy product)는 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous )， 동종 (allogeneic) 또는 이종 (xenogeneic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 여타의 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위 (최소한 이상의 조작: more-than-minimal manipulation)를 통하여 치료， 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로 정의된다. 줄기세포 치료제는 이 중 특히 줄기세포를 포함하는 치료제를 의미하며 현재 대표적인 응용 분야로서 신경질환， 심질환, 폐질환, 간질환, 암과 같이 손실된 세포의 회복과 재생이 필수적이면서도 자연스럽게는 잘 이루어지지 않는 질환의 치료용으로 활발하게 개발이 진행되고 있다.

줄기세포는 다분화 잠재능을 가지고 있어서 손상된 조직에서 필요한 세포로 분화할 수 있다는 점에서 세포치료에서 잠재력이 크지만， 현재 개발수준에서는 체내 이식 후 생존율이 높지 않아서 실제로 임상 적용에서 광범위하고 안정적으로 성공한 예를 찾기 어렵다.

특히， 지방, 골수 또는 제대혈 유래 줄기세포치료제가 허혈성 질환 치료에 사용될 수 있고, 혈관을 재생시킬 수 있는 것으로 밝혀졌으나， 2차원 배양으로 허혈부위에 이식된 줄기세포의 대부분은 사멸되어 세포치료제의 치료효능이 크지 않은 문제점이 있어 왔다. 또한， Rehman J 등은 지방 유래 줄기세포에서 혈관 재생에 관련된 인자가 분비된다는 것을 보： ί!하였으나 (Circulation 2004； 109(10)： 1292-8), 이 방법에서도 역시 줄기세포가 단일 세포 형태로 허혈 부위에 이식되어 이식된 세포의 생존율이 극히 낮았다. 나아가， Nakagami H. 등은 지방 유래 즐기세포를 VEGF와 HGF로 처리한 후 마우스 하지 허혈 부위에 이식하는 내용올 보고하였다 (Arterioscler Thromb Vase Biol. 2005； 25(12)： 2542-7) . 그 결과 VEGF와 HGF로 처리하지 않고 이식된 지방 유래 줄기세포보다 혈관 재생 효과가 높았으나， VEGF, HGF 등의 성장인자는 농도에 따라서는 암을 유발할 가능성이 높아 임상 적용이 어려운 문제가 있었다.

이에 줄기세포에 대한 대안으로， 상기 줄기세포의 조정 배지 (conditioned media)가 주목을 받고 있다. 조정 배지라 함은 세포를 배양한 후의 세포 자체를 포함하지 않는 배지로서, 세포 성장에 필수적인 여러 가지 성분들 (예컨대， 사이토카인， 성장인자 등)이 포함되어 있는 것으로 예측되는 배지이다. 조정 배지는 세포의 성장올 촉진시키기 위해 사용되거나， 특정 성분을 분리해내기 위해 사용되고 있으며, 이 밖에도 조정 배지 자체로 여러 가지 질환의 치료에 웅용되고 있다. 예를 들어， 세포 배양 배지를 이용하여 2차원 배양 접시에서 혈관내피전구세포를 배양한 후, 얻어진 조정 배지를 랫트의 허혈 부위에 주사하여 허혈을 치료하거나 (Stefano Di Santo et al. , PLos One, Vol.4， Issue 5, e5643, 2009), 세포 배양 배지를 이용하여 2차원 배양 접시에서 돼지 지방 유래 줄기세포를 배양한 후， 얻은 조정 배지를 돼지 피부에 생성된 창상 부위에 주사하여 치료하거나 (Fu, Xiaobing, Fang et al .， Wound Repair and Regenerat ion, vol. 15， No. 4, pp. 540-548， 2007)， 세포 배양 배지를 이용하여 2차원 배양 접시에서 인간 지방 유래 줄기세포를 배양한 후, 얻은 조정 배지를 피부 주름이 유발된 마우스 주름에 주사하여 치료한 결과가 보고된 바 있다 (Won-Serk Kim et al. , Journal of Dermato logical Science, 48, 15-24, 2007). 하지만, 상기 연구들에 사용된 배지는 동물 유래 성분인 소 혈청과 안전성이 떨어지는 완층용액 및 지시약 성분들이 포함되어 있어 임상에 직접 적용하기 어려운 단점이 있다. 또한, 종래의 일반적인 세포배양법인 2차원 배양 (배양 접시에서의 배양)의 경우 배지로 분비되는 성분들 (예를 들어, 성장 인자 등)의 농도가 낮아 임상적용시 환부에 많은 부피의 조정 배지를 사용하여야 하는 문제가 있다. 이에 본 발명자들은 상기 문제를 해결하고자 연구하던 중， 세포 부착 지지체 및 성장인자가 포함되지 않은 배양 배지를 이용하여 성체 줄기세포를 세포 스페로이드 (cell spheroid) 형태로 3차원 생물 반웅기에서 배양하여 얻은 조정 배지가 안전성과 조정 배지 내 유용 성분의 함량이 높아 허혈성 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 발명의 요약 따라서， 본 발명의 목적은 허혈성 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 조정 배지를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 창상 또는 당뇨성 족부 궤양을 치료하는데 사용될 수 있는 조정 배지를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 탈모 또는 주름의 예방 또는 개선에 사용될 수 있는 조정 배지를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라， 본 발명은 성체 줄기세포를 세포 배양용 배지에서 3차원적으로 배양하여 얻은 배양물로부터 수거한 조정 배지를 유효성분으로 포함하는, 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라， 본 발명은 성체 줄기세포를 세포 배양용 배지에서 3차원적으로 배양하여 얻은 배양물로부터 수거한 조정 배지를 유효성분으로 포함하는， 창상 및 당뇨성 족부 궤양 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적에 따라， 본 발명은 성체 즐기세포를 세포 배양용 배지에서 3차원적으로 배양하여 얻은 배양물로부터 수거한 조정 배지를 유효성분으로 포함하는， 탈모 및 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조정 배지는 2차원 배양법에 의해 얻어진 조정 배지에 비해 혈관생성 촉진 인자의 농도 및 함량이 매우 높아 허혈성 혈관 질환의 혈관 재생에 유용하게 사용될 수 있다. 또한， 종래 세포 배양 배지 또는 조정 배지에 사용되던 동물 유래 성분과 완층용액 및 지시약 성분들이 없어 임상에 안전하게 적용가능하며, 적은 양으로도 허혈성 혈관 질환 등에 효과적으로 사용될 수 있다. 도면의 간단한설명 도 1의 A 및 B는 각각 2차원 배양법 및 3차원 배양법을 도식화한 것이며 , 도 1의 C는 3차원 배양법으로 배양된 스페로이드의 사진이다.

도 2는 2차원 배양법 (정상 산소 조건 및 저산소 조건) 및 3차원 배양법에 따라 배양된 줄기세포의 여러^' 가지 혈관생성 촉진인자의 발현량 (A, B) 및 상기 배양법에 따라 배양된 배지 중의 세포 농도 (C) 및 혈관생성 촉진인자의 농도 (D)를 나타낸 것이다. 상기 도에서 monolayer는 2차원 배양법에 의해 배양된 것을 의미하며， spheroid는 본 발명에 따른 3차원 배양법에 의해 배양된 것을 의미한다 (**: spheroid, normoxi 그룹과 비교하여 p<0.01).

도 3은 일반 배지 (αΜΕΜ) 및 본 발명에서 제조한 CRMCclinically relevant medium) 배지에서의 배양에 따른 줄기세포의 수를 나타낸 그래프이다. 상기 도에서 serum+는 혈청을 사용한 것을 나타내며， serum-는 혈청이 포함되어 있지 않은 것을 나타낸다 (일반 배지의 경우 우태아혈청을 사용하였고 CRM 배지의 경우 인간 혈청을 사용함). 상기 도에서 monolayer는 2차원 배양법에 의해 배양된 것을 의미하고, spheroid는 본 발명에 따른 3차원 배양법에 의해 배양된 것을 의미한다.

도 4는 일반 배지 (αΜΕΜ) 및 본 발명에서 제조한 CRM 배지에서의 배양에 따른 혈관생성 촉진인자의 발현량을 나타낸 RT-PCR 결과이다. 상기 도에서 serum+는 혈청을 사용한 것올 나타내며， serum-는 혈청이 포함되어 있지 않은 것올 나타낸다 (일반 배지의 경우 우태아혈청을 사용하였고 CRM 배지의 경우 인간 혈청을 사용함). 상기 도에서 monolayer는 2차원 배양법에 의해 배양된 것을 의미하고ᅳ spheroid는 본 발명에 따른 3차원 배양법에 의해 배양된 것을 의미한다. ^'

도 5A 내지 5D는 일반 배지 (αΜΕΜ) 및 본 발명에서 제조한 CRM 배지에서의 배양에 따른 배지 중의 혈관생성 촉진인자 (A: VEGF; B: FGF2; C: HGF; D: SDF-la)의 분비량을 나타낸 결과이다. 상기 도에서 serum+는 혈청을 사용한 것을 나타내며， serum-는 혈청이 포함되어 있지 않은 것을 나타낸다 (일반 배지의 경우 우태아혈청을 사용하였고 CRM 배지의 경우 인간 혈청을 사용함). 상기 도에서 monolayer는 2차원 배양법에 의해 배양된 것을 의미하고, spheroid는 본 발명에 따른 3차원 배양법에 의해 배양된 것올 의미한다 (**: CRM (serumi), spheroid와 비교하여 ρθ.01)

도 6A 내지 6D는 내피세포의 일종인 HUVEC를 일반 배지 (αΜΕΜ), 일반 배지 (αΜΕΜ, 무혈청)， CRM 및 CRM (무혈청) 배지에서 2차원 및 3차원 배양법을 조합하여 배양한 후 세포수 (도 6A), 4일째에 생존한 세포수 (도 6B 및 6C) 및 세포사멸 (apoptosis) 관련 인자의 발현량 (도 6D)을 측정한 결과를 나타낸 것이다 (*: CRM (serum+), spheroid와 비교하여 p<0.05).

도 7은 일반 배지 (aMEM), CRM 배지 , 및 일반 배지와 CRM 배지를 2차원 및 3차원 배양하여 얻은 조정 배지를 각각 마우스에 주입한 후， 레이져 도플러 이미징 기기를 이용하여 혈류량을 측정한 결과를 그래프화한 것이다.

도 8은 일반 배지 (aMEM), CRM 배지， 및 일반 배지와 CRM 배지를 2차원 및 3차원 배양하여 얻은 조정 배지를 각각 마우스에 주입한 후, 모세혈관에ᅳ대한 면역 염색을 통해 마우스 허혈 부위 조직의 혈관 밀도를 조사한 결과를 나타낸 그래프이다 0: CRM (serum +)， spheroid와 비교하여 pO.05).

도 9 및 10은 일반 배지 (aMEM), CRM 배지, 및 일반 배지와 CRM 배지를 2차원 및 3차원 배양하여 얻은 조정 배지를 각각 마우스에 주입한 후， 세동맥 (도 10) 및 캐스파아제 (caspase; 도 11)에 대한 면역 염색을 통해 마우스 허혈 부위 조직의 혈관 밀도를 조사한 결과를 나타낸 그래프이다 (*: CRM (serumi), spheroid와 비교하여 p<0.05).

도 11은 일반 배지 (aMEM), CRM 배지， 및 일반 배지와 CRM 배지를 2차원 및 3차원 배양하여 얻은 조정 배지를 각각 마우스에 주사한 후， 허혈 부위 조직의 괴사 및 섬유화를 나타낸 사진이다.

도 12는 일반 배지 (aMEM), CRM 배지, 및 일반 배지와 CRM 배지를 2차원 및 3차원 배양하여 얻은 조정 배지를 각각 마우스에 주사한 후, 주기적으로 촬영한 하지 허혈 부위의 외형적 변화를 나타내는 사진 (도 12A) 및 사지 회복 발 괴사 및 사지 손실의 비율을 나타내는 그래프 (도 12B)이다.

도 13은 일반 배지 (aMEM CRM 배지, 및 일반 배지와 CRM 배지를 2차원 및 3차원 배양하여 얻은 조정 배지를 각각 마우스에 주사한 후， 허혈 부위의 조직으로부터 평활근 a-액틴 (도 13A)과 CD3 도 13B)의 mRNA 발현량을 나타낸 사진 및 그래프이다 0: CRM (serum +)， spheroid와 비교하여 p<0.05).

도 14는 다양한 조정 배지 및 hADSC를 주입한 후 말초혈액과 골수에서 분리한 세포를 FACS 분석한 결과 (도 14A) 및 CD34+/CD45- 세포 비율을 나타낸 그래프 (도 14B)이다 (*: CRM (serum+), spheroid와 비교하여 p<0.05).

도 15는 하지 허혈 모델에 일반배지 (aMEM) 및 CRM, 및 일반배지 (aMEM) 및

CRM에서 3차원 배양을 통해 얻은 조정 배지， 및 hADSC를 주입한 후 허혈 부위 조직으로부터 세포사멸 (apoptosis) 관련 인자 (Bcl-2 및 p53)의 시간에 따른 mRNA 발현량 변화를 확인한 RT-PCR 결과이다. 발명의 상세한설명 이하 본 발명에 사용된 용어를 정의한다.

본 발명에 사용된 용어 "조정 배지 (conditioned media)"는 세포를 배양하여 얻은， 세포 자체를 포함하지 않는 배지로서， 세포 성장에 필수적인 여러 가지 성분들 (예컨대， 성장 인자， 사이토카인 등)이 포함되어 있는 것으로 예측되는 배지이다. 배양하는 세포 및 배양 방식에 따라 조정 배지의 구성은 달라질 수 있으며， 본 발명에 사용한 조정 배지는 성체 줄기세포， 바람직하게는 지방 유래 줄기세포， 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포를 배양한 후 얻어진 배지이다. 상기 조정 배지는 성체 즐기세포를 배양 배지에서 배양한 후， 원심분리나 여과 등의 방법을 통해 얻어질 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "2차 배양' '은 줄기세포 배양에 통상적으로 사용되던 방식으로서 배양 접시 (페트리 디쉬) 상에서 즐기세포를 배양하는 것으로서 단일층 배양 (monolayer culture)으로도 불린다 (도 1의 A 참조). 반면,. "3차 배양' '은 배양 접시가 아닌 배양 배지가 담긴 플라스크에서 적절한 교반하에 배양하는 것으로서， 스피너 배양 (spinner culture)으로도 불린다 (도 1의 B 참조). 본 발명은 성체 줄기세포를 세포 배양용 배지에서 3차원적으로 배양하여 얻은 배양물로부터 수거한 조정 배지를 유효성분으로 포함하는， 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 성체 줄기세포는 전술한 바와 같이， 지방 유래 줄기세포， 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포일 수 있으나， 이에 제한되지는 않으며, 당업계에 알려진 줄기세포가 모두 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 조정 배지는 성체 즐기세포를 3차원 배양하여 얻는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 하나의 구체예에서， 3차원 스피너 플라스크 (spinner flask) 생물 반웅기 배양 방식을 이용하여 줄기세포를 세포 스페로이드 (spheroid) 형태 (도 1의 C 참조)로 배양한 후 상기 줄기세포를 제거하여 조정 배지를 얻는다. 본 발명에 따른 3차원 배양의 경우， 시험관 내 세포 생존율을 크게 증가시킬 수 있으며， 세포당 혈관생성 인자의 분비량을 향상시킬 수 있으므로, 적은 양의 조정 배지로도 뛰어난 치료 효과를 달성할 수 있게 한다. 게다가， 종래에 사용되던 2차원 배양법들과는 달리 3차원 배양방법은 대량 배양 공정에 적합한 방법이기 때문에 임상 적용하기에 필수적인 요소인 세포량의 증대까지 달성할 수 있는 추가적인 이점이 있다. 한편， 본 발명의 3차원 배양 방법은 세포 부착 지지체 및 성장인자가 제공되지 않은 상태로 수행될 수 있다. 세포 부착 지지체는 여러 가지 요건을 요구하는 까다로운 구성으로서， 즉， 복잡한 3차원 모양으로 재현성 있게 제조할 수 있어야 하고, 세포를 접종할 때 공간적으로 일정하게 분포되도록 해야 하고, 시험관내 배양에서 확산 제한이 최소화될 수 있도록 매우 다공성인 구조로 이루어져야 하며 , 화학적， 구조적, 기계적 성질을 갖추는 등의 여러 가지 조건을 갖추어야 한다. 따라서, 본 발명은 세포 부착 지지체를 사용하지 않음으로써 보다 간단하고 편리하게 배양할 수 있는 장점이 있다.

또한， 종래 즐기세포 배양시 사용되는 성장 인자는 농도에 따라 암을 유발할 가능성이 있으나， 본 발명은 상기 성장 인자를 전혀 사용하지 않음으로써 안전성이 높은 장점이 있다. 상기 성장인자의 예로는 혈관내피성장인자 (VEGF), 염기성섬유아세포 성장인자 (bFGF) 또는 간세포 성장인자 (HGF)를 들 수 있으나， 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따른 3차원 배양은 저산소 조건 (hypoxia) 하에서 수행될 수 있으나， 정상산소 조건 (normoxia) 하에서도 동등한 수준의 결과를 얻을 수 있으므로ᅳ 정상산소 조건하에서 수행하여도 무방하다. 상기 3차원 배양에 사용되는 배양 배지는 성체 줄기 세포 배양을 위해 통상적으로 사용되는 배지， 예를 들어 α-최소 필수 배지 (MEM)로부터 임상학적으로 위험성 요인이 있는 성분들， 예를 들어 소혈청, 완층용액 지시약， 등을 제거하고， 필요에 따라 소혈청을 인간 혈청으로 대체한 배지일 수 있으며， 상기 성분 외 기타 성분을 적절히 조정한 배지일 수 있다.

또한， 상기 완층용액은

4-(2—하이드록시에틸) -1-피페라진에탄설폰산 (HEPES)일 수 있으며， 상기 지시약은 페놀 레드일 수 있다. 본 발명의 조정 배지는 소 혈청 성분을 포함하지 않음으로써 인간의 질환에 안전하게 사용될 수 있으며， 안전성이 낮은 완충용액， 지시약 등의 성분을 포함하지 않음으로써 임상에 안전하게 적용할 수 있다.

이에 따라, 본 발명에 따른 조성물 내 유효성분인 조정 배지는 임상학적으로 위험성 요인이 있는 상기 성분들 (소 혈청， 완층용액， 지시약 및 이로부터 유래한 성분)을 함유하지 않는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는， 상기 본 발명에 따른 조정 배지를 얻기 위해 사용되는 배양 배지는 이소류신， 류신， 리신, 메티오닌， 페닐알라닌， 트레오닌 트립토판， 발린， 아르기닌， 히스티딘， 알라닌， 아미노아세트산， 프롤린, 세린， N-아세틸 -L-시스테인 등과 같은 아미노산류; Na⁺, K⁺, Mg²⁺, CI^", 아세테이트ᅳ， 말레이트^_와 같은 전해질류; 레티놀 팔미테이트， 에르고칼시페롤， 토코페롤 아세테이트， 아스코브산， 염화티아민， 인산리보플라빈나트륨， 니코틴산， 염화피리독신， 덱스판테놀 등과 같은 비타민류; 및 글루코스 등과 같은 당류를 포함할 수 있다. 또한， 필요에 따라 인간 혈청을 포함할 수 있다.

보다 바람직하게는, 상기 본 발명에 따른 조정 배지를 얻기 위해 사용되는 배양 배지는 상기 아미노산류 중 이소류신， 류신, 리신, 트레오닌， 발린， 아르기닌, 히스티딘， 알라닌， 아미노아세트산， 프를린 및 세린을 0.1% 내지 0.9% (w/v)의 범위로 함유하고， 메티오닌, 페닐알라닌， 트립토판， N-아세틸 -L-시스테인을 0.01% 내지 0.09% (w/v)의 범위로 함유하며; 상기 전해질류 중에서 Na⁺, K+ᅳ CI^", 아세테이트 ^_, 및 말레이트―를 20 내지 70 mM의 범위로 함유하고, Mg²⁺를 2 내지 7 mM의 범위로 함유하며; 비타민 중에서 레티놀 팔미테이트， 에르고칼시페롤 및 토코페를 아세테이트를 0.1 내지 5000 IU의 범위로 함유하고， 아스코브산, 염화티아민, 인산리보플라빈나트륨， 니코틴산， 염화피리독신 및 덱스판테놀을 0.1% 내지 20% (w/v)로 포함하며; 당류 중에서 글루코스를 0.1 내지 10% (w/v)로 포함하며; 인간 혈청을 2 내지 20¾(v/v)로 포함할 수 있다.

가장 바람직하게는, 상기 본 발명에 따른 조정 배지를 얻기 위해 사용되는 배양 배지는 10%(v/v) 인간 혈청을 포함하는 표 3의 조성을 가진 배지일 수 있다. 본 발명에 따른 조정 배지를 포함하는 약학적 조성물은 허혈성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 허혈성 질환의 예로는 허혈성 뇌질환, 허혈성 신질환, 허혈성 폐질환， 사지의 허혈성 질환， 버거스병, 하지동맥 폐색증， 뇌졸중， 뇌경색, 허혈성 심근증, 심근경색증, 허혈성 심부전 또는 폐색성 동맥경화증 등을 들 수 있으나， 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명에 따른 조정 배지를 포함하는 약학적 조성물은 창상 및 당뇨성 족부 궤양을 치료하는데 사용될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 비경구적 경로를 통하여 투여될 수 있으며， 바람직하게는 치료가 필요한 조직 부위에 정맥내 주사를 통해 주입될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 다양한 인자에 의해 달라질 수 있으나, 바람직하게는 0.5 내지 2 mL/kg 체중의 양으로 사용될 수 있다. 나아가， 본 발명에 따른 조정 배지를 포함하는 조성물은 탈모 및 주름 예방또는 개선용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 비경구 경로， 바람직하게는 피부 도포를 통해 적용될 수 있다. 본 발명에 따른 조정 배지를 포함하는 약학적 조성물 또는 화장료 조성물은 당해 기술분야의 숙련자에게 알려진 통상의 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 또한， 본 발명의 상기 조성물에 사용되는 조정 배지는 조정 배지 자체 또는 그 농축물 형태로 사용될 수 있다. 이하의 실시예를 통하여 본 발명의 특정 구체예를 설명한다.

이하에 기재하는 구체예는 예시적인 목적으로 기술된 것일 뿐이며， 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 실시예 1: 지방유래 줄기세포의 2차원 배양 및 3차원 배양의 비교분석

<!-!>지방 유래 줄기 세포의 2차원 배양

인간 지방 조직을 추출하여， 포스페이트 -완충 식염수 (phosphate-buffered saline: PBS)로 세척 후에 잘게 조각을 내었다. 지방 조직의 조각을 콜라게나아제 타입 1 용액에서 37^°C에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 조직에서 분리된 세포를 α-최소 필수 배지 (minimal essential medium; α-ΜΕΜ, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에서 배양하였다. 이때， 정상산소 조건 (normoxia; 20% 0₂, 10% 혈청 (FBS, Gibco BRL), 다른 언급이 없는 경우 이하 같음)과 저산소 조건 (hypoxia; 1% 0₂₍ 10% 혈청， 다른 언급이 없는 경우 이하 같음)으로 나누어 배양하였다.

<1-2>지방 유래 줄기 세포의 3차원 배양

지방 유래 줄기 세포를 20 mL의 α-최소 필수 배지 (a— MEM, Gibco BRL)가 들어 있는 3차원 스피너 플라스크 (spinner flask; 100ml)에서 세포 부착 지지체 및 다른 성장인자를 첨가하지 않고 정상산소 조건하에서 3일간 3차원 배양 (교반속도: 45rpm, 배양조건 : 37^°C, 5%C0₂)하였다. 배양 후， 상기 지방 유래 줄기 세포를 주사전자현미경 (SEM)을 통하여， 그리고 헤마록실린 (hematoxylin)과 에오신 (eosin) H & E) 염색 후 광학 현미경을 통하여 관찰한 결과, 세포 스페로이드 (spheroid)가 형성되었음을 확인할 수 있었다 (도 1의 C 참조). <1-3>성장인자 및 세포 농도의 비교분석

상기 실시예 <1-1> 및 <1_2>의 배양 방법상의 차이에 따른 세포내 및 배양 배지 중의 유용 성분의 함량을 비교하기 위하여， RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR을 통하여 저산소 조건에서 발현되는 HIF-Ια (hypoxia-inducible factor)와 여러 가지 혈관생성인자， 즉 bFGFCbasic Fibroblast Growth Factor), VEGF( Vascular Endothelial Growth Factor) 및 HGF(hepatocyte growth factor)의 발현량을 비교하였다. ^' 구체적으로, 수거된 세포와 조직들을 세포 용해 용액 (TRIzol reagent , Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 처리하거나 잘게 부순 후 분쇄기를 이용하여 완전히 용액 상태로 제작하였다. 여기에 클로로포름 0.2 mL을 처리하여 15초간 뒤섞은 뒤 15분 동안 상온에서 방치하였다. 12,000rpm으로 15분간 4^°C에 원심분리한 뒤 투명한 층만 뽑아 80% 이소프로판올을 동량 처리하였다. 4^°C에서 10분 동안 방치한 후 다시 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 여기에 1ml의 75% 에탄올에 넣어 4^°C, 3분 정도 방치한 후, 다시 원심분리하여 상등액을 제거한 뒤 공기 중에 10분간 건조하여 RNA를 얻었다.

RNA 에 RNA 완층용액 7 와 이차 증류수 를 넣고 비특이 결합용 프라이머 1≠ 처리 후 Super Script Π 역전사효소 (SuperScriptTM II , Invitrogen) 등의 처리를 거쳐 cDNA를 제작하였다. 이후 하기 표 1의 센스 프라이머 0.5 및 안티센스 프라이머 2x 완층용액 I 12.5쑤 증류수 dNTP흔합용액 와 표지인자텍 0.25/^,를 흔합한 반웅용액에 시료 cDNA 0.5 £를 가하고 RT-PCR을 94 ^°C 5분간 DNA 변성 후, 94 ^°C 30초 I 60 ^°C 45초 I 72 ^°C 45초의 사이클을 30회 반복하여 실시하였다. 상기 RT-PCR산물을 전기영동하여 발현량을 비교하였다.

【표 1】

상기 RT-PCR 결과를 도 2의 (A)에 나타내었다. 도 2의 (A)의 결과에서 보는 바와 같이， 정상산소 조건하에서 2차원 배양된 세포에서는 HIF-la가 전혀 발현되지 않은 반면, 저산소 조건하에서 2차원 배양된 세포와 정상산소 조건하에서 3차원 배양된 스페로이드 세포에서는 HIF-la가 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 특히， HIF-la 의 발현은 정상산소 조건하에서 3차원 배양한 경우가 저산소 조건하에서 2차원 배양한 경우에 비해 높게 나타났다.

외부의 추가적인 자극이 없이도 (예: 유전자 전달， 단백질 전달 등) 세포 스페로이드는 구조 상 스페로이드 내부에 저산소 (hypoxia) 조건이 형성되어 저산소 조건에서 생존율을 유지시키기 위한 인자 (HIF-la)가 발현되는 것으로 판단되었다.

또한, 상기 결과와 유사하게 여러 가지 혈관생성인자, 즉 bFGF, VEGF 및 HGF의 경우에도 2차원 배양에 비해 3차원 배양이 발현량이 더 높은 것으로 나타났으며， 특히 저산소 조건하에서의 2차원 배양에 비해서도 정상산소 조건하에서의 3차원 배양이 혈관생성인자의 발현에 유리한 것으로 확인되었다. 상기 결과를 ELISA 분석을 통해 재확인하였다. ELISA 분석을 위하여， VEGF, FGF2, HGF ELISA듀오 세트 키트 (duo set kit, R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여， 96 웰 플레이트의 웰에 각 혈관생성인자에 상웅하는 항체를 상온에서 12— 16시간 코팅하였다. 이후 상온에서 수거된 배지를 웰에 가하여 배지 내의 VEGF, FGF2, HGF와 항체의 반응을 유도하였으며， 4시간 정도의 반웅 후, 각각의 항체와 특이적으로 반웅하는 2차 발색 시약을 처리함으로써 수거된 배지 내 혈관생성인자의 양을 얻었고 이를 총 세포수로 나누어 세포당 혈관생성인자의 양을 계산하였다.

상기 ELISA 분석에 의한 조정 배지 내 혈관생성인자의 양을 도 2의 (D)에 나타내었고, 이를 총 세포수로 나눈 세포당 혈괌생성인자의 양을 도 2의 (B)에 나타내었다. 상기 결과에서 보는 바와 같이, 2차원 배양에 비해 3차원 배양으로 얻은 세포에서 혈관생성인자, 즉 bFGF, VEGF 및 HGF의 발현량이 월등히 높은 것으로 나타났다. 한편 실시예 <1-1>의 2차원 배양 및 실시예 <1-2>의 3차원 배양으로 인한 세포 농도 차이를 살펴보기 위하여, 트립신 처리를 통해 세포를 단일 세포로 만들고 혈구계 (hemocytometer)를 이용하여 세포 개수를 측정하였다. 측정 결과， 도 2의 (C)에서 보는 바와 같이, 3차원 배양이 2차원 배양에 비해 세포 성장 속도가 높아 배지 중의 세포의 농도가 훨씬 높은 것으로 나타났다. 상기 결과를 종합하여 볼 때， 3차원 스피너 플라스크를 이용하여 인간지방 유래줄기세포를 스페로이드 형태로 배양할 경우 2차원 세포 배양법에 비해 혈관생성인자의 농도가 월등히 높은 조정 배지를 생성할 수 있음을 확인하였다. 실시예 2: 인간혈청포함조정 배지와 일반 세포배양 조정 배지의 특성비교 통상적으로 사용되는 세포배양 배지 (α-최소 필수 배지 (minimal essential medium)의 경우에는 소 혈청， 완층용액， 지시약 등의 성분이 포함되어 있어， 이로부터 조정 배지를 제조하는 경우 임상에 직접 적용하기 어려운 문제가 있다. 따라서, 본 실시예에서는 상기 성분들이 대체 또는 제거된 배양 배지를 설계하여 이로부터 조정 배지를 제조하였다.

통상적인 세포배양배지 (α-최소 필수 배지 (minimal essential medium) 및 본 실시예에 사용한 세포배양배지의 조성올 각각 표 2 및 3에 나타내었다. 표 2의 배양배지의 경우 10%우태아혈청을 포함한다. 한편 표 3의 배양배지의 경우 10% 인간 혈청을 포함하며， 이를 CRM clinically relevant medium)이라 명명하였다.

【표 2]

통상적인 세포배양배지 ( a -MEM)의 조성 (10%우태아혈청 포함)

성부 농도 성분 농도 아미노산 무기염

글리신 0.667 mM 염화칼슘 (무수) 1.8 mM

Lᅳ알라닌 0.281 mM 염화칼륨 (KC1) 5.33 mM

L-아스파트산 0.226 mM 염화나트륨 117.24 mM

L-시트틴 2HC1 0.0999 mM 황산마그네슴 (무수) 0.814 mM

Lᅳ글루타민 2 mM 탄산수소나트륨 26.19 mM

L-이소류신 0.4 mM 제일인산나트륨 1.01 mM

L—리신 0.399 mM 리보뉴클레오사이드

L-페닐알라닌 0.194 mM 아데노신 0.0375 mM

L-세린 0.238 mM 구아노신 0.0353 mM

L-트립토판 0.049 mM 시티딘 ^' 0.0412 mM

L-발린 0.393 mM 우리딘 0.041 mM

L-아르기닌 0.498 mM 데옥시리보뉴클레오사이드

L-아스파라긴 -H20 0.333 mM 2'데옥시아데노신 0.0398 mM

L-염화시스테인 -H20 0.568 mM 2'데옥시구아노신 0.0375 mM L-글루탐산 0.051 mM 2'데옥시시티딘 HC1 Q.0417 mM

L-히스티딘 0.2 mM 티미딘 0.0413 mM

L-류신 0.397 mM 기타 성분

L-메티오닌 0.101 mM 리포산 0.000971 mM

L-프를린 0.348 mM 피루브산나트륨 1 mM

L-트레오닌 0.403 mM D-글루코스 (Dextrose) 5.56 mM

L-티로신 이나트륨염 0.231 mM 페놀 레드 0.0266 mM 비타민

아스코브산 0.284 mM

염화콜린 0.00714 mM

D-관토텐산칼슘 0.0021 mM

니아신아미드 0.0082 mM

리보플라빈 0.000266 mM

비타민 B12 0.001 mM

바이오틴 0.00041 mM

엽산 0.00227 mM

염화피리독살 0.0049 mM

염화티아민 0.00297 mM

i一이노시틀 0.0111 mM

【표 3】

CRM 배양배지의 조성 (10% 인간 1청 포함)

성부 농도 선부 농도 아미노산 전해질

L-이소류신 (K.P.) 0.6775% (w/v) Na⁺ 35 mM

L-류신 (K.P.) 0.8275% (w/v) ⁺ 25 mM 리신 하이드로클라이드 (K.P.) 0.6934% (w/v) Mg⁺ 2.5 mM

Lᅳ 메티오닌 (K.P.) 0.045% (w/v) cr 63 mM

L-페닐알라닌 (K.P.) 0.06% (w/v) 아세테이트一 27.5 mM

Lᅳ트레오닌 (K.P.) 0.3375% (w/v) 말레이트— 23 mM

L-트립토판 ( .P.) 0.0375% (w/v) 비타민

L-발린 (K.P.) 0.63% (w/v) 레티놀 팔미테이트 2000 IU

L-아르기닌 (U.S.P.) 0.45% (w/v) 에르고칼시페를 200 IU

L-히스티딘 (U.S.P.) 0.1875% (w/v) 토코페롤 아세테이트 1 IU

L-알라닌 (U.S.P.) 0.5475 (w/v) 아스코브산 10% (w/v) 아미노아세트산 (K.P.) 0.675% (w/v) 염화티아민 1% (w/v)

L-프를린 (U.S.P.) 0.6 (w/v) 인산리보플라빈나트륨 0.254% (w/v)

L-세린 (U.S.P.) 0.345% (w/v) 니코틴산 2% (w/v)

N-아세틸 -L-시스테인 0.0337% (w/v) 염화피리독신 0.3% (w/v) (U.S.P.)

덱스관테놀 0.5% (w/v) 당류

글루코스 0.5% (w/v) 상기 표 2 및 3의 배지를 기준으로， 일반배지, 일반배지 (무혈청)， CRM 및 CRM (무혈청) 배지를 각각 제조하고 2차원 및 3차원 배양법을 조합하여 인간 지방유래 줄기세포 (MDSC)를 배양하였다.

배양 후， 세포 수 측정 및 세포 및 배양배지 중의 HIF-la 인자 및 혈관생성인자의 발현 (분비)량 측정을 수행하였다. 세포 수는 실시예 <1-3>에 기술된 혈구계 (hemotocytometer) 측정 방법에 의해 측정하였고， 세포 중의 HIF-la 인자 및 혈관생성인자의 발현량은 실시예 <1ᅳ3>에 기술된 RT-PCR에 의해 측정하였으며， 배양배지 중의 분비량은 실시예 <1-3>에 기술된 ELISA에 의해 측정하였다. 세포 수 측정결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 결과에서 보는 바와 같이, hADSC의 증식은 소혈청 혹은 인간혈청을 포함한 경우에서 전형적인 세포 증식을 보인 반면, 혈청을 포함하지 않은 경우에는 세포 증식이 일어나지 않는 것으로 나타났다. 또한， 소혈청을 사용한 경우와 인간혈청을 사용한 경우의 실험군 간의 통계학적 차이는 없었다.

HIF-la 인자 및 혈관생성인자를 암호화하는 유전자의 발현량 측정 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이, 소혈청과 인간혈청을 포함한 배지를 사용한 경우 상기 유전자들의 발현이 높게 나타난 반면， 위와 같은 혈청을 포함하지 않는 배지를 사용한 경우에는 상기 유전자들의 발현이 크게 감소한 것으로 나타났다. 또한, 같은 배지를 사용하더라도 3차원 스페로이드 배양을 한 경우가 2차원 세포 배양법에 비해 혈관생성인자 유전자의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다. 배지 중으로 분비되는 혈관생성인자 (VEGF, bFGF, HGF 및 SDS-la)의 농도 측정 결과를 도 5A 내지 5D에 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이， CRM을 사용한 3차원 스페로이드 배양의 경우, 일반 배지나 CRM을 사용한 2차원 세포 배양에 비해 혈관생성인자의 분비가 증가함을 확안하였다. 실시예 3: 내피세포에서의 배양 방식에 따른 비교분석 내피세포의 일종인 HUVEC를 실시예 2의 일반배지 (aMEM 일반배지 (aMEM, 무혈청)， CRM 및 CRM (무혈청) 배지에서 2차원 및 3차원 배양법을 조합하여 배양하였다. 대조군으로 혈청과 각종 사이토카인을 포함하여 내피세포 배양에 일반적으로 사용되는 EGMᅳ 2 배지 (L0NZA)를 사용하였다.

배양 후， 세포수， 4일째 살아있는 세포수 짖 세포사멸 (apoptosis) 관련 인자의 발현량을 측정하였다. 세포수는 실시예 <1-3>에 기술된 혈구계 (hematocytometer) 측정 방법에 의해 측정하였고, 4일째 살아있는 세포수는 중성 레드 (neutral red;

3-amino-7-dimethylamino-2-methylphenazine hydrochloride, Sigma, Chemical Company, St. Louis, MO, USA) 염색법과 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 염색법에 의해 측정한 다음 각각 대조군 대비 퍼센트로 나타내었으며， 세포사멸 관련 인자인 Bcl-2 및 p53의 발현량은 실시예 <1— 3>에 기술된 RT-PCR에 의해 측정하였다. 세포 수 측정결과를 도 6A에 나타내었다. 도 6A의 결과에서 보는 바와 같이， 3차원 배양 조정배지를 사용하였을 때 2차원 배양 조정 배지를 사용하였을 때보다 HUVEC의 증식이 증가하였다. 소혈청을 사용한 경우와 인간혈청을 사용한 경우의 실험군간의 통계학적 차이는 없었다. 혈청을 사용하지 않은 경우에는 배지의 종류와 상관없이 세포증식이 일어나지 않았다.

4일째 살아있는 세포수 측정 결과를 도 6B와 6C에 나타내었다. 도 6B와 6C의 결과에서 보는 바와 같이， 3차원 배양 조정 배지를 사용하였을 때 2차원 배양 조정 배지를 사용하였을 때보다 4일째에 살아있는 HUVEC의 세포수가 증가하였다. 통상적인 HUVEC 배양 배지 (EGM-2)를 사용한 경우에 비해서도 3차원 배양 조정 배지를 사용하였을 때의 생육 세포수가 더 많았다ᅳ.

세포사멸 (apoptosis) 관련 인자의 발현량의 측정 결과를 도 6D에 나타내었다. 도 6D의 결과에서 보는 바와 같이 , 3차원 배양 조정 배지를 사용한 그룹에서 항세포사멸 신호전달체계의 중요인자인 Bcl-2의 mRNA 발현이 증가하였다. 한편， 혈청을 사용하지 않은 경우에는 세포사멸 촉진인자인 p53의 mRNA 발현이 증가하였다. 실시예 4: 조정 배지의 생체 내 이식 및 특성 확인

<4-1>마우스 허혈 모델 제조

마우스 하지 허혈 모델을 문헌 [ChoSW, MoonSH, Lee SH et al. Circulation. 2007, 116 :2409-2419]에 개시된 방법대로 제조하였다. 실험에 사용된 마우스들은 모두 "실험동물의 관리와 사용에 대한 지침 (the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)" (국립보건연구원 (NIH) 공개번호 85-23, 1996년 개정)에 따라 관리하였다.

<4-2>조정 배지의 생체 내 이식

일반 배지 (αΜΕΜ)를 각각 2차원 및 3차원 세포 배양하여 수거한 조정 배지 (CM[aMEM(seruiti+), monolayer) 및 CRM 배지를 3차원 배양하여 수거한 조정 배지 (CM[CRM(serum+), spheroid)를 다른 세포 이식용 지지체를 사용하지 않고， 7일간 40 μΐ씩 허혈 부위에 매일 근육 주사하였다. 인간 지방유래 줄기세포 (hADSC)를 배양하지 않은 일반 배지 (α MEM) 및 CRM 배지를 이식한 실험군， MDSC를 트립신 처리하여 이식한 실험군 및 아무것도 이식하지 않은 실험군을 대조군으로 설정하였다. 일반 배지 (αΜΕΜ) 및 CRM 배지는 다른 세포 이식용 지지체를 사용하지 않고 7일간 40 μΐ씩 허혈 부위에 매일 근육 주사하였고， hADSC는 0.01M 인산염완층용액에 10⁷ 세포 /mL 농도로 부유시킨 상태로 20( i l를 허혈 유도 직후 허혈 부위에 근육 주사하였다. 각 실험군 및 대조군 당 10마리의 마우스를 사용하였다. <4-3>조정 배지 이식 후 혈류량 측정

실시예 <4-2>에서 제조된 각 시료를 7일간 주사한 후 레이져 도플러 이미징 기기 (Moor Instruments, Devon, UK)를 이용하여 정기적으로 하지허혈 부위의 혈류량 증가를 확인하였다. 상기와 같은 방식으로 매회 마우스를 마취하여 혈류량을 촬영하였다. 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 보는 바와 같이， 일반 배지를 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 한 뒤 수거한 조정 배지가 2차원 배양 조정 배지에 비해 월등히 높은 혈류량의 증가를 보였다. 특히， 3차원 스페로이드 배양으로 얻은 조정 배지를 이식한 경우， 인간 지방유래 줄기세포를 직접 이식한 경우에 비해서도 훨씬 효과가 뛰어난 것으로 나타났다. <4-4> 조정 배지 주사를 통한 허혈 부위의 신생혈관형성 및 조직괴사방지 효과 비교

마우스 하지 허혈 모델 유도 후 28일째 허혈이 유도된 하지 근육 조직을 수거하여 동결박절용 고정 용액에 담근 후 냉동 보관하였다. 동결 박절은 10 m 두께로 영하 20^°C에서 제작되었다. 동결 박절된 조직들을 4% 파라포름알데히드 용액에서 10분간 상온 고정시키고， 이후 영하 20^°C에서 에탄을과 아세트산 (2:1) 흔합 용액에서 2차 고정시켰다. 실험에 사용된 모든 형광 면역 염색에서 모세혈관과 세동맥을 염색하기 위해서 CD31 항체와 평활근 알파 액틴 (smooth muscle(SM)-actin) 항체를 각각 사용하였다. 각 항체에 대응하는 형광 2차 표지로서 녹색의 FITC-표지된 이차 항체를 사용하였다. 허혈 조작 부위의 괴사를 확인하기 위하여 세포괴사인자 (caspase-3) 항체를 사용하였으며, 형광 2차 표지로서 붉은색의 Rhodamin-표지된 이차 항체를 사용하였다. 상기 면역 염색이 종료된 후， 모든 샘플들을 DAPI 용액올 사용하여 덮었다. 실험에 사용된 염색 방법과 염색용 시료들은 문헌 [Cho SW, Moon SH, Lee SH et al . Circulation, 2007， 116 :2409-2419]에 개시된 내용에 기초하였다.

실험 결과, 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이， 일반배지를 사용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조정 배지의 경우가 2차원 세포 배양을 통해 수거한 조정 배지에 비해 모세혈관 및 세동맥의 생성이 월등히 높게 나타났다.

또한， 도 10에서 보는 바와 같이， 상기와 같은 혈관 생성으로 인해 혈류가 증가됨에 따라 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조정 배지의 경우가 2차원 세포 배양을 통해 수거한 조정 배지에 비해 조직의 괴사가 현저히 저해되는 것으로 나타났다.

<4-5>조정 배지 주사를 통한 허혈 부위의 근육의 괴사 및 섬유화 확인

각 시료가 주사된 실험군 및 대조군을 대상으로 근육 조직의 괴사 저해 및 섬유화 저해를 H&E와 마손 트리크롬 (Masson's tri chrome) 염색법으로 확인하였다. 각 조직을 파라포름알데하이드에 16 내지 18시간 동안 고정시킨 다음， 에탄을을 이용한 단계적 탈수 과정 (dehydration)올 거친 후， 자일렌 (xylene)으로 처리하였다. 이후 파라핀를에 조직을 담근 뒤， 4 mi 두께로 박절하고， 다시 자일렌에서 여분의 파라핀을 제거한 뒤 에탄올을 이용한 단계적 함수 과정을 거친 뒤 염색을 실시하였다.

염색 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에서 보는 바와 같이, 일반배지 혹은 CRM을 이용하여 스페로이드 배양을 한 뒤 수거된 조정 배지를 사용한 경우, 허혈 부위의 조직들이 정상 조직에 가까운 형태를 보였으며 섬유화 역시 거의 진행되지 않았음을 확인할 수 있었다. <4^~6>조정 배지 이식에 따른 외형적 변화

한편， 허혈이 일어나면 조직이 괴사 (foot necrosis)하여 마우스 족부가 손실 (limb loss)되므로， 외형적 변화를 관찰하여 본 발명의 조정 배지의 효과를 확인하였다. 상기 측정 결과를 도 12 및 표 4에 나타내었다.

【표 4】

도 12 및 표 4에서 보는 바와 같이， CRM올 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조정 배지를 사용하는 경우 마우스 족부 손실도가 다른 실험군들에 비해 큰 폭으로 감소함을 확인할 수 있었다. 상기 결과들은 본 발명의 3차원 스페로이드 배양으로 얻은 조정 배지가 2차원 배양으로 얻은 조정 배지에 비해 허혈을 개선시키는 효과가 훨씬 뛰어남을 보여준다. 실시예 5: 배양법 및 배양배지를 달리하여 얻은 조정 배지의 특성 확인 실시예 4의 마우스 하지 허혈 모델에 일반 배지를 주사한 실험군 (aMEM(serum+)), CRM을 주사한 실험군 (CRM(serum+))， 일반 배지를 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조정 배지를 주사한 실험군 (CM[aMEM(serum+), spheroid]), CRM을 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조정 배지를 주사한 실험군 (CM[CRM(se^'rum +)， spheroid]), 인간 지방 유래 줄기세포를 이식한 실험군 (MDSC), 및 아무것도 처리하지 않은 대조군 (No treatment)을 대상으로， 허혈 유도후 7일， 14일 및 28일째에 허혈 부위의 조직을 떼어내어 RT-PCR을 통해 동맥 마커인 평활근 α-액틴 및 혈관내피세포 마커인

CD31의 mRNA 발현량을 측정하였다. RT-PCR은 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 실시예 <1_3〉에 기재된 방식대로 수행하였다. 상기 실험결과를 도 13A 및 13B에 나타내었다. 상기 도 Γ7Α 및 17B에서 보는 바와 같이, 조정 배지를 주사한 군에서 CD31 및 평활근 α-액틴의 mRNA 발현량이 증가한 것으로 나타났다. 이는 조정 배지의 주사에 의해 혈관 생성을 촉진시킬 수 있음을 입증한다. 실시예 6: 본 발명에 따른 조정 배지가 혈관내피세포 전구세포의 가동화에 미치는 효과 분석 실시예 4의 마우스 하지 허혈 모델에 일반 배지 (αΜΕΜ)를 이용하여 2차원 세포 배양올 통해 수거한 조건 배지를 주사한 실험군， 일반 배지를 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조건 배지를. 주사한 실험군 (CM[aMEM(serum +)， spheroid]), CRM을 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조건 배지를 주사한 실험군 (CM[CRM(serum+), spheroid]) 및 인간 지방 유래 줄기세포를 이식한 실험군 (MDSC)을 대상으로， 혈관내피전구세포 (CD34+/CD45- endothelial progenitor cell)의 가동화 (mobilization)를 평가하기 위하여 마우스의 골수와^' 말초혈액으로부터 분리한 CD34+/CD45- 세포수를 측정하였다. 대조군으로 허혈을 유도하지 않은 정상 쥐의 골수와 말초혈액으로부터 분리한 CD34+/CD45-세포수를 측정하였다. 허혈 유도후 28일이 지난 마우스를 마취한 후 심장채혈올 통해 얻은 말초혈액을 헤파린이 처리된 튜브에 모았다. 그 후 마우스를 안락사시키고 골수를 수거하였다. 수거한 혈액과 골수로부터 곧바로 단핵세포 (mononuclear cell)를 분리한 후 세포 표면 마커인 CD34와 CD45의 발현을 유세포형광분석기 (fluorescence activated cell sorter； FACS, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 상기 실험결과를 도 14에 나타내었다. 상기 도 14A 및 14B에서 보는 바와 같이， 3차원 배양 조정 배지를 주사한 그룹에서 정상 대조군보다 CD34+/CD45- 혈관내피전구세포의 수가 2배 이상 되었다. 상기 결과는 3차원 배양 조정 배지 중에 농축된 성장인자의 영향으로 마우스의 골수에 있던 즐기세포가 허혈조직으로 이동하여 혈관재생에 도움을 줄 수 있음을 보여준다. 실시예 7: 본 발명에 따른 조정배지가 항세포사멸 인자 및 세포사멸 촉진인자에 미치는 효과 분석 실시예 4의 마우스 하지 허혈 모델에 일반 배지를 주사한 실험군 (aMEM(serum+)), CRM을 주사한 실험군 (CRM(serum+)) , 일반 배지를 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조건 배지를 주사한 실험군 (CM[aMEM(serum +)， spheroid]), CRM을 이용하여 3차원 스페로이드 배양을 통해 수거한 조건 배지를 주사한 실험군 (CM[CRM(serum+), spheroid]), 인간 지방 유래 줄기세포를 이식한 실험군 (MDSC), 및 아무것도 처리하지 않은 대조군 (No treatment)을 대상으로， 허혈 유도후 3일, 7일， 14일， 28일째 허혈 부위의 조직을 수거하여 RT-PCR을 통해 항세포사멸 인자인 Bcl-2와 세포사멸촉진인자인 p53의 mRNA 발현량을 확인하였다. 상기 RT-PCR은 실시예 <1-3>에 기재된 방법과 동일하게 수행하였다. 상기 실험결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에서 보는 바와 같이， 3차원 배양 조건배지를 주사한 그룹에서 항세포사멸 인자인 Bcl-2의 mRNA 발현량이 높음을 확인하였다. 인간지방세포유래 줄기세포를 이식한 그룹에서도 대조군이나 일반배지, CRM을 주사한 그룹에 비해서 Bcl-2의 발현량이 높았지만 14일째부터 발현량이 감소하였다. 한편 대조군과 일반배지， CRM올 주사한 그룹에서 세포사멸촉진인자인 p53의 발현량이 높았다.

Claims

특허청구범위: 청구항 1. 성체 줄기세포를 세포 배양용 배지에서 3차원적으로 배양하여 얻은 배양물로부터 수거한 조정 배지를 유효성분으로 포함하는， 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물. 청구항 2. 제 1항에 있어서， 성체 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는， 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물. 청구항 3. 제 1항에 있어서， 상기 배양시 세포 부착 지지체 및 성장인자를 이용하지 않는 것을 특징으로 하는， 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물. 청구항 4. 제 3항에 있어서, 상기 성장인자가 혈관내피 성장인자 (VEGF), 염기성 섬유아세포 성장인자 (bFGF) 또는 간세포 성장인자 (HGF)인 것을 특징으로 하는， 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물. 청구항 5. 제 1항에 있어서， 상기 성체 줄기세포가 배양시 스페로이드 (spheroid) 형태를 갖는 것을 특징으로 하는， 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물. 청구항 6. 제 1항에 있어서， 상기 성체 줄기세포가 저산소 조건에서 배양되는 것을 특징으로 하는， 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물. 청구항 Ί. 제 1항에 있어서 상기 세포 배양용 배지가 소 혈청， 완층용액， 지시약， 및 이로부터 유래한 성분을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는， 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물. 청구항 8. 계 7항에 있어서， 상기 완층용액이

4-(2-하이드톡시에틸) -1-피페라진에탄설폰산 (HEPES) 완충용액인 것을 특징으로 하는， 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물. 청구항 9. 제 7항에 있어서， 상기 지시약이 페놀 레드인 것을 특징으로 하는， 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물. 청구항 10. 제 1항에 있어서, 상기 허혈성 질환이 허혈성 뇌질환, 허혈성 신질환， 허혈성 폐질환 사지의 허혈성 질환， 버거스병， 하지동맥 폐색증， 뇌졸증, 뇌경색 허혈성 심근증, 심근경색증 허혈성 심부전 및 폐색성 동맥경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는， 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물. 청구항 11. 성체 줄기세포를 세포 배양용 배지에서 3차원적으로 배양하여 얻은 배양물로부터 수거한 조정 배지를 유효성분으로 포함하는， 창상 및 당뇨성 족부 궤양 치료용 약학적 조성물. 청구항 12. 성체 줄기세포를 세포 배양용 배지에서 3차원적으로 배양하여 얻은 배양물로부터 수거한 조정 배지를 유효성분으로 포함하는， 탈모 및 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.