CN113943696A

CN113943696A - 利用猪血管内皮细胞建立缺氧诱导-三维血管生成模型的方法

Info

Publication number: CN113943696A
Application number: CN202111273098.4A
Authority: CN
Inventors: 魏宏逵; 夏茂; 周远飞; 彭健
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2021-10-29
Publication date: 2022-01-18

Abstract

本发明公开了利用猪血管内皮细胞建立缺氧诱导‑三维血管生成模型的方法，属于动物细胞培养技术领域。所述方法，包括：体外培养条件下，以猪血管内皮细胞作为猪胎盘血管内皮细胞模型，添加细胞微载体珠，低氧诱导并孵育使细胞微载体珠包裹猪血管内皮细胞，形成包被载体珠；再将包被载体珠与基质胶混合，低氧诱导并孵育，使所述基质胶包埋所述包被载体珠，形成构建猪血管内皮细胞的缺氧诱导‑三维血管生成模型。本发明的三维模型模拟猪胎盘血管内皮细胞的体内生长环境，研究低氧条件下猪内皮细胞迁移和成管。同时还能观察单个细胞行为特征比如出芽的过程，这为更加深入的探索胎盘血管生成出芽、迁移和成管等生物学过程提供方向和方法。

Description

利用猪血管内皮细胞建立缺氧诱导-三维血管生成模型的方法

技术领域

本发明涉及动物细胞培养技术领域，特别是涉及一种利用猪血管内皮细胞建立缺氧诱导-三维血管生成模型的方法。

背景技术

母猪胎盘血管发育对于胎儿发育至关重要，母猪胎盘血管发育不良所导致的胎儿营养供应不足以及缺氧等问题,会造成胎儿死亡或者胎儿弱小并降低仔猪泌乳期存活率。胎儿在妊娠后期迅速生长，因此会导致在空间有限的子宫变得拥挤缺氧，胎儿快速生长发育对于营养物质和氧气的大量需求也会导致血管中氧气供应不足，使得血管内皮细胞处于低氧状态。因此,我们认为母猪胎盘血管生成是在一个低氧的环境中发生的。血管生成是指从现有的血管中生成新的血管。血管生成是一个多阶段的过程包括活化的内皮细胞降解基底膜，从母血管中出芽，迁移、增殖、排列、成管，最终从邻近血管生成分支并与之接合。尽管目前已经掌握了研究血管生成表型-迁移和成管的技术手段，但是还不能精确区分内皮细胞具体的行为特征表型以及具有不同特征功能的功能细胞(尖端细胞和茎细胞)。

尽管人和猪在种属上有明显的差异，但是哺乳动物血管内皮细胞在成管过程中的表型和关键基因存在很大的共性。需要建立新的体外技术方法来研究低氧条件下猪血管内皮细胞的血管生成。

发明内容

本发明的目的是提供利用猪血管内皮细胞建立缺氧诱导-三维血管生成模型的方法，以解决上述现有技术存在的问题，利用低氧模块化培养箱和三维血管生成模型，为细胞培养创造稳定可控的低氧环境和三维出芽环境，为模拟猪胎盘血管生成提供新的体外细胞模型和研究方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种利用猪血管内皮细胞建立缺氧诱导-三维血管生成模型的方法，包括以下步骤：

体外培养条件下，以猪血管内皮细胞作为猪胎盘血管内皮细胞模型，添加细胞微载体珠，低氧诱导并孵育使细胞微载体珠包裹猪血管内皮细胞，形成包被载体珠；

再将包被载体珠与基质胶混合，低氧诱导并孵育，使所述基质胶包埋所述包被载体珠，形成构建猪血管内皮细胞的缺氧诱导-三维血管生成模型。

优选的是，体外培养还包括利用猪血管内皮细胞传代培养，具体包括以下步骤：将猪血管内皮细胞接种到细胞生长培养基中，于37℃、5％CO₂的条件下培养3-5d，在培养至细胞密度为80-90％时，用胰酶消化，然后再进行传代培养，当细胞生长至汇合度为70％-80％时进行传代，2-3d传代一次。

优选的是，猪血管内皮细胞传代培养3-4代时，加入细胞微载体珠、基质胶，低氧诱导0-24h，检测细胞株微载体珠上诱导猪血管内皮细胞出芽、迁移以及成管情况。

优选的是，细胞微载体珠的制备方法包括：

在PBS中水化和膨胀的干珠，在摇床上室温处理3h以上，形成微载体珠；

将所得微载体珠静置15min以上，弃去上清液，再用PBS冲洗后，加入新鲜的PBS制备成3000珠/mL的储备液；

将所得储备液高温灭菌消毒，得到细胞微载体珠。

优选的是，所述细胞生长培养基为含有体积浓度为10％的胎牛血清、1％的青霉素-链霉素混合溶液的RPMI培养基。

优选的是，低氧诱导时所用的低氧诱导培养基为：含有体积浓度为10％的胎牛血清、20ng/mL血管内皮生长因子、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、1％的青霉素-链霉素混合溶液的RPMI培养基。

优选的是，按照1×10⁶个猪血管内皮细胞活细胞与80-85μL细胞微载体的配比混合孵育，以使细胞微载体包裹猪血管内皮细胞，形成包被载体珠；

按照包被载体珠：基质胶的体积比为50：60-150混合孵育，以用基质胶包埋所述包被载体珠。

本发明还提供所述的方法构建的猪血管内皮细胞的缺氧诱导-三维血管生成模型。

本发明还提供所述的猪血管内皮细胞的缺氧诱导-三维血管生成模型在检测和筛选影响血管生成药物中的用途。

本发明公开了以下技术效果：

本发明将猪髋动脉内皮细胞(PIEC)培养在微载体上，然后将其包埋在纤维蛋白凝胶中，在培养基中添加bFGF和VEGF协同作用的因子，低氧诱导以促进最佳发芽和定量尖端细胞，第1-2天观察到出芽现象，成功形成猪血管内皮细胞的缺氧诱导-三维血管生成模型。体外内皮细胞的基因表达与体内血管内皮细胞表达具有较高的相似性，并在出芽过程中经历相同的形态学变化。因此，该模型多角度评价了猪体内胎盘血管生成，并提供了一个易于操作、可实时可视化的体外模型。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是RT-PCR检测常氧和低氧诱导时间对PIEC细胞中低氧诱导标记基因HIF1α的表达水平；数据以平均值±标准误差呈现，n＝3；因素O低氧处理，因素T低氧诱导时间，O×C交互作用；

图2是RT-PCR检测常氧和低氧诱导时间对PIEC细胞血管生成标记基因VEGFA的表达水平；数据以平均值±标准误差呈现，n＝3；因素O低氧处理，因素T低氧诱导时间，O×C交互作用；

图3低氧诱导时间分别在0h、6h、12h和24h对PIEC细胞迁移的影响(×100)；

图4是低氧诱导时间对PIEC细胞成管的影响(×40)；

图5是内皮细胞中尖端细胞丝状伪足；

图6是载体珠孵育内皮细胞(×100)；

图7是低氧条件下三维血管生成模型诱导时间对出芽的影响(×100)；

图8是低氧条件下三维血管生成模型基质胶体积对出芽的影响(×100)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

低氧气室的调制

本发明提供的低氧装置封闭性较好，前期预实验发现，通过氮气充填5-10分钟能使得小室内氧气浓度达到目标值。具体地，本发明提供的低氧的装置(低氧模块化培养箱)包括低氧小室和气瓶组件(气罐(比如氧气罐、氮气罐)、气体调节器、燃气软管卡箍、钢瓶气体软管、进口过滤器、进气软管、流量计、出口软管)，所述低氧小室，为透明的顶端开口的玻璃容器，所述玻璃容器还包括与其开口相匹配的透明的玻璃盖子，盖合即构成气室；在低氧小室中，将装有无菌水的培养皿放置在低氧小室的底部，以避免干燥；然后将之前准备好的细胞培养板或烧瓶放在小室的架子上。

在低氧小室外，将气室上的进气口软管连接到气体软管，以连通气罐。打开气室的进、出口端口。此时，气体调节器应该保持关闭状态。所述低氧模块化培养箱的各元件均为商购产品，按照上述方式进行连接即可直接使用，本领域技术人员均可根据上文记载内容毫无疑义的确定所述低氧模块化培养箱的结构，且其结构并非本发明的保护要点，在此不做赘述。小心地打开气体调节阀。以25L/min的气流量冲洗4分钟，完全取代腔内的空气。

冲洗小室后，关闭气体调节阀，然后用燃气软管卡箍卡住软管以关闭小室的进出口端口。

拔掉进气室入口处的流量计出口软管，将气室放入37℃的细胞培养箱中。

静置一个小时，使得培养瓶或者培养皿中的气体更新到与气室中的气体成分一致。

实施例2

低氧诱导时间的确定

1、试验方法

获得具有出芽能力的猪髋动脉内皮细胞(PIEC细胞)，其步骤包括复苏冻存PIEC细胞，传代培养和观察PIEC细胞出芽特征。

将冻存PIEC细胞置于37℃水浴锅水浴3-5分钟，1000rpm离心3min，弃掉冻存液，加入4ml生长培养基，转移到T25培养瓶中传代培养。

每天观察细胞形态，当PIEC细胞增殖到70-80％时，按照1：2传代比例稀释后进行传代培养，细胞传代第3-4代时，可以观察到PIEC细胞膜上出现丝状伪足(如图1)，即表示细胞具有出芽能力。在血管出芽发生过程中，尖端细胞会伸展出许多的丝状伪足，并在微环境中感知和响应吸引或排斥丝状伪足的诱导信号，随着丝状伪足的不断搜索，尖端细胞在其微环境中感知和响应引导信号比如VEGFA，类似神经系统中的轴突生长椎或果蝇呼吸系统的上皮顶端细胞探索其周围环境的方式。

将具有出芽能力的PIEC细胞消化后，以2.5×10⁵接种在6孔板中，以含10％胎牛血清的1640培养基培养。

同时，在气室内，将细胞暴露下所需气体中，每24小时重新注入混合气体，更新气体成分，保持气体成分稳定。

分别在体外低氧(3％O₂)和常氧(21％O₂)条件下培养PIEC细胞。试验分为0h、6h、12h和24h组，分别在不同时间点收集细胞RNA样品。

具体过程如下：

细胞处理结束时用PBS洗涤2-3次，弃去液体后每孔加入1mL Trizol，4rmp摇床上低速振荡30min，转移液体至1.5mL EP管中，每管加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置5min；再于4℃，13000rpm离心15min，小心吸取上清液转入另一个RNase-free的离心管中，加入预冷的异丙醇0.5mL，混匀后室温放置10min；再于4℃，13000rpm离心15min，小心移去上清液，加入75％的酒精(无水乙醇与DEPC-H₂O现配现用)1mL，上下颠倒EP管，混匀后静置5min；再于4℃，8000rpm离心5min，尽可能彻底弃去上清，风干10min；加入20min弃去上清，DEPC-H₂O溶解。使用Nanodrop超微量分光光度计检测纯化后得到的总RNA浓度，并通过OD_260/280及OD_260/230判断RNA的纯度，OD_260/280值在1.8到2.0之间，表明RNA纯度较好。

用RT-PCR检测常氧和低氧条件下，不同时间点PIEC细胞中低氧诱导因子HIF1α和内皮细胞生长因子VEGFA的mRNA表达水平。

其中，引物设计：各目的基因引物采用Primer6.0软件进行设计或参考有关文献，由上海生工合成，HIF1α和VEGFA以及内参GAPDH的引物序列如下所示：

表1实时荧光定量PCR引物序列

反转录后的cDNA经过10倍稀释后进行实时荧光定量PCR检测。实时荧光定量PCR反应体系(10μL)如下：SYBR Green Supermix 5μL，20倍稀释的cDNA 4.4μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL。

PCR反应条件如下：95℃，预变性5min；95℃，10s；退火(退火温度见表2)10s和延伸30s，共40个循环。每个循环结束时采集一次荧光信号，反应完毕后进行溶解曲线分析。最后，以GAPDH为内参基因，使用2^-ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。

2、试验结果

PIEC细胞在传代培养到第三代至第四代时，细胞膜边缘出现丝状伪足(如图5)。传代到第五代及以后，未能观察到PIEC细胞的细胞膜边缘出现丝状伪足。因此，尖端细胞出芽的研究条件一：PIEC细胞传代至3-4代；利用RT-Qpcr检测到低氧诱导处理能显著提高PIEC细胞中低氧诱导因子HIF1α和血管内皮细胞生长VEGFA的6h、12h和24h的表达水平(如图1和图2)。

另外，低氧诱导时间对HIF1α的mRNA表达有显著影响，随低氧诱导时间延长，HIF1α的mRNA表达显著提高，且低氧诱导24h时HIF1α的mRNA表达水平最高(如图1)。说明低氧诱导装置确实为PIEC细胞提供了稳定的低氧诱导环境。但是低氧诱导时间对VEGFA的mRNA表达没有显著影响(如图2)。说明VEGFA的mRNA表达并不依赖于低氧诱导时间的变化。

实施例3

细胞划痕检测细胞迁移能力

第3-4代处于对数生长期的PIEC细胞从培养瓶中消化下来，以2.5×10⁵接种在6孔板中，以含10％胎牛血清的1640培养基培养。

待细胞长至90％融合时，用无菌的1000μL枪头在培养板底划十字划痕，再用无菌PBS冲洗3遍，洗去划掉的细胞并在显微镜中十字划痕中心点上方和下方分别拍照测定空白区域面积，加入以含10％胎牛血清的1640培养基，在37℃，5％CO₂培养箱中低氧培养(3％O₂)。分别在0h、6h、12h和24h细胞板中相同位置拍摄照片并统计空白区域面积。通过两次统计相同位置面积差来作为细胞迁移面积，评估细胞相对迁移水平。

如图3所示，相对于0h，6h、12h和24h细胞相对迁移能力显著提高，且12h细胞迁移能力显著高于6h和24h。

上述结果表明，低氧诱导12h时，细胞迁移能力最强。

实施例4

Matrigel基质胶细胞成管实验检测细胞成管能力

实验原理：Matrigel基质是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出BDMatrigel基底膜基质，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。能够模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，可用来研究体外血管生成。

将Matrigel基质胶于实验前12h置于4℃冰箱融化过夜，预先在-20℃预冷枪头和96孔培养板。在超净台中于冰面上将预冷的Matrigel加入96孔板，每孔加50μL，操作中避免产生气泡，然后置于37℃细胞培养箱中60min。

将经过处理重悬的细胞以2×10⁴每孔细胞加入到96孔板，置于细胞培养箱中继续培养8h，随后转移至低氧诱导装置中，在倒置显微镜下观察0h、6h、12h和24h不同时间点PIEC细胞成管情况并拍照。

如图4所示，相对于0h，低氧诱导6h显著提高管腔数，但是对于节点数和总分支长度没有显著影响；相对于0h，低氧诱导12h显著提高管腔数、节点数和总分支长度；相对于0h，低氧诱导24h显著提高总分支长度，但是对于管腔数和节点数没有显著影响。

上述结果表明，低氧诱导12小时对PIEC细胞成管效果最佳。

实施例5

低氧诱导条件下的内皮细胞三维模型建立

在上述低氧诱导模型中建立三维内皮细胞模型，便于观察内皮细胞出芽以及定量内皮细胞中的尖端细胞，以及研究尖端细胞出芽过程中蛋氨酸调控内皮细胞表观遗传变化和探索其中受到蛋氨酸代谢影响的关键作用的调控基因。

1、材料与试剂

PIEC细胞(猪髋动脉内皮细胞)，培养到3-5代使用；

RPMI1640基础培养基(RPMI1640+10％FBS)，细胞增殖培养期间使用；

生长因子-VEGFA，使用剂量20mg/mL，VEGFA溶解在0.1％BSA的无菌水中；

生长因子-FGF，使用剂量10mg/mL，bFGF溶解在含有0.1％牛血清白蛋白的DPBS中；

Cytodex 3微载体(Sigma 10g)，内皮细胞包被在微载体上，在三维空间中迁移出芽；

基质胶(康宁，低生长因子GFR)，模拟内皮细胞基质成分包括：层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等、生长因子和基质金属蛋白酶等；

12孔细胞板；96孔细胞板；T75培养瓶；T25培养瓶。

内皮细胞生长因子浓度参考以下研究内容：

HUVEC细胞生长因子补充剂：VEGF-A(20ng/ml)FGF-B(10ng/ml)IGF-1(10ng/ml)EGF(10ng/ml)(Jeong et al.,2017)(Nature Communications)。

2、试验方法

(1)复苏PIEC细胞后，接种细胞的第0-4天，在T25培养瓶中用RPMI-1640培养基培养增殖传代，传代到T75细胞瓶中培养(PIEC细胞增殖速度较快，可24h传代一次)，将PIEC细胞传代至第4代时(T75细胞瓶中细胞密度75％-85％)接到细胞板(12孔板)中。

(2)第5天均匀接种到12孔板中后待细胞的细胞密度达到85％，细胞边缘能观察到丝状伪足(如图5)，开始进入饥饿培养阶段。

(3)第6天，细胞饥饿和细胞微载体珠的制备以及载体珠孵育内皮细胞

①细胞微载体珠的制备(已经制备好，4℃冰箱储存)，包括：

使用一个50mL的试管，在50mL PBS(pH＝7.4)中水化和膨胀0.5g干珠(3×10⁶beads/g)，把它放在摇床上，室温低速振荡至少3h，获取微载体珠。

让微载体珠静置至少15分钟。弃去上清液，在新鲜的PBS(50ml)中洗几分钟。

丢弃PBS，用50mL PBS代替，制备成微载体珠浓度为3000beads/mL的储备液。

将珠子悬浮液放入玻璃瓶中，用115℃高压15min对载体珠进行消毒，在4℃存储。

②在载体珠上包裹PIEC细胞

让载体珠沉淀(不要离心)，去上清，添加1mL的RPMI 1640(无FBS)中，简单清洗水珠。

消化12孔板中细胞(0-3min)，200μL胰酶/孔，显微镜观察消化完全后立即+200μL含血清的RPMI 1640基础培养基终止酶促反应。

③细胞计数：将消化好的细胞转移到1.5mL离心管中，3个孔合并到1.5mL离心管中，合计1.2mL。3000rmp离心2min，去上清，添加800μL对照或处理培养基混合均匀，TrypanBlue染色，计数仪计数。保证活细胞浓度不低于8×10⁵/mL(终体积<1.5mL)。

1.5mL试管中，将2500珠子(83μL载体珠储备液30000beads/mL)和1×10⁶PIEC细胞加入1.5mL离心管中，用相应培养基补足到1mL，垂直放置于培养箱中(一个离心管对应一个对照或者处理组),37℃孵育4h，每20min倒转搅拌一次(轻轻上下颠倒一到两次，内皮细胞在载体珠上的良好的涂层对出芽至关重要。珠子经过内皮细胞孵育后，应该看起来像迷你高尔夫球，如图6)。4h后，将孵育后的珠子转移到T25组织培养瓶中，37℃和5％的二氧化碳并在5mL RPMI 1640基础培养基中培养，并加入10ng/mL FGF(储备液为10μg/mL)和20ng/mLVEGFA(储备液为10μg/mL)，孵育过夜。

(4)第7天，基质胶包埋包被载体珠

提前一天(即第6天)4℃解冻基质胶，-20℃预冷枪头和96孔细胞板(用于基质胶接种细胞2×10⁴/孔)。

4℃拿出的解冻基质胶和96孔板放置于冰冻条板上，分别设置常氧组和低氧诱导组。每组分别添加60μL、80μL、100μL和150μL基质胶，并保证基质胶深度在1mm，使得细胞在基质胶内部生长而不是表面，点胶过程中避免气泡，每加6-10个孔拍拍板子，加完后37℃静置15min。

基质胶静置15min内，将孵育好的珠子从T25培养瓶转移到一个15mL的锥形管中，让珠子沉淀下来，去上清。用1mL RPMI 1640基础培养基重悬载体珠，转移到1.5mL的离心管中。用1mL RPMI 1640基础培养基将包被载体珠洗三次，用移液管缓慢地上下吹吸混合。

载体珠计数：在盖玻片上对载体珠计数，然后RPMI 1640基础培养基溶液中以1000beads/mL的浓度重悬。96孔板每孔加入50μL(50beads/孔)。

将96孔板置于37℃培养箱培养，24h后更换RPMI 1640基础培养基，分别设置常氧组和低氧诱导组，将低氧诱导组载体珠放入准备好的低氧诱导小室中，分别在0h、6h、12h和24h观察内皮细胞出芽情况并记录拍照。

结果显示低氧诱导处理载体珠后，能明显观察到细胞出芽现象。但是常氧条件下，载体珠出芽现象并不明显。另外，在不同体积基质胶中，当基质胶体积为100μL时，细胞出芽现象最明显(如图7)。

因此，后续对三维载体珠出芽试验的研究均采取添加100μL基质胶的处理方式。

如图8所示，常氧条件下，12h和24h处理均未发现三维载体珠上细胞出芽的现象。低氧诱导处理三维载体珠12h和24h后，能明显观察到12h细胞出芽情况良好，但是处理24h后载体珠出现融合现象，出芽数出现明显减少。

因此，后续对三维载体珠出芽试验的研究均采取低氧诱导处理12h的处理方式。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种利用猪血管内皮细胞建立缺氧诱导-三维血管生成模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，体外培养还包括利用猪血管内皮细胞传代培养，具体包括以下步骤：将猪血管内皮细胞接种到细胞生长培养基中，于37℃、5％CO₂的条件下培养3-5d，在培养至细胞密度为80-90％时，用胰酶消化，然后再进行传代培养，当细胞生长至汇合度为70％-80％时进行传代，2-3d传代一次。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，猪血管内皮细胞传代培养3-4代时，加入细胞微载体珠、基质胶，低氧诱导0-24h，检测细胞株微载体珠上诱导猪血管内皮细胞出芽、迁移以及成管情况。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，细胞微载体珠的制备方法包括：

将所得储备液高温灭菌消毒，得到细胞微载体珠。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞生长培养基为含有体积浓度为10％的胎牛血清、1％的青霉素-链霉素混合溶液的RPMI培养基。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，低氧诱导时所用的低氧诱导培养基为：含有体积浓度为10％的胎牛血清、20ng/mL血管内皮生长因子、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、1％的青霉素-链霉素混合溶液的RPMI培养基。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，按照1×10⁶个猪血管内皮细胞活细胞与80-85μL细胞微载体的配比混合孵育，以使细胞微载体包裹猪血管内皮细胞，形成包被载体珠；

8.如权利要求1-7任一项所述的方法构建的猪血管内皮细胞的缺氧诱导-三维血管生成模型。

9.如权利要求8所述的猪血管内皮细胞的缺氧诱导-三维血管生成模型在检测和筛选影响血管生成药物中的用途。