WO2012080985A2

WO2012080985A2 - Proteínas cry insecticidas de bacillus thuringiensis con actividad anticancerígena

Info

Publication number: WO2012080985A2
Application number: PCT/IB2011/055722
Authority: WO
Inventors: Jorge Olmos Soto; Efraín ARIAS BAÑUELOS; Gretel Mendoza Almanza
Original assignee: Centro De Investigación Científica Y De Educación Superior De Ensenada, Baja California
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2012-06-21
Also published as: US20140073582A1; MX2011000894A; WO2012080985A3

Abstract

Resumen. La presente invención describe moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de la familia Cry insecticidas derivadas de Bacillus thuringiensis, que presentan actividad citotóxica contra células de cáncer y/o tumores de humanos y/o animales, pero no contra células normales. Asimismo, la presente invención provee proteínas y composiciones de proteínas de la familia Cry derivadas de la bacteria Bacillus thuringiensis, que exhiben actividad citotóxica preferentemente contra células de cáncer de humanos y/o animales, sin afectar a las células normales. Las proteínas Cry de la invención no presentan actividad hemolítica ni pertenecen al grupo de las parasporinas. La invención también se refiere a métodos para tratar células de cáncer y/o tumores de humanos y/o animales, así como para prevenir metástasis, empleando proteínas Cry insecticidas de Bacillus thuringiensis.

Description

Proteínas Cry insecticidas de Bacillus thuringiensis con actividad anticancerígena

Campo técnico de la invención.

La presente invención se relaciona con el campo técnico de la biomedicina y biotecnología, particularmente con la producción y uso de moléculas alternativas para tratar el cáncer, y más específicamente al uso de las proteínas Cry insecticidas derivadas de las cepas de Bacillus thuringiensis (Bt), como moléculas con actividad citotóxica específica contra cáncer, por ejemplo contra líneas celulares de cáncer de humanos, pero que no afectan células normales. También se relaciona con métodos para tratar células cancerígenas, utilizando estas proteínas y las composiciones farmacéuticas que se deriven de ellas.

Antecedentes de la invención.

Actualmente se sabe que el cáncer es una de las enfermedades más devastadoras en humanos, y que es originada por fallas en los mecanismos de regulación que controlan el crecimiento y proliferación celular. La mortalidad causada por el cáncer se ha incrementado en los últimos años, por lo que es necesaria la búsqueda de tratamientos alternativos a los hasta hoy utilizados. La radioterapia, quimioterapia o remoción del tumor, muestran ser efectivos para reprimir la enfermedad solo si son aplicados en la primera fase. Además, su costo es elevado y los efectos adversos de las terapias perjudican seriamente la salud del individuo (INEGI, 2008). Con la finalidad de encontrar una cura y suprimir estos inconvenientes, en la actualidad se están buscando biomoléculas que se puedan emplear como una alternativa nueva para la erradicación del cáncer. Algunas biomoléculas estudiadas a la fecha han demostrado tener un efecto sobre la función celular del organismo o tejido, inhibiendo la proliferación celular. Un ejemplo son los extractos y compuestos de diferentes organismos terrestres o marinos, aunque la gran mayoría de éstas son moléculas muy difíciles de producir lo que ha dificultado la realización de pruebas clínicas (Chu y Radhakrishnan, 2008).

Por lo anterior, existe una constante necesidad de contar con biomoléculas novedosas que logren curar y/o eliminar el cáncer, que sean económicamente factibles de producir en grandes cantidades y que sean específicas, para que al mismo tiempo no generen efectos adversos tan severos como los generados por la radioterapia y quimioterapia.

Al día de hoy no existe cura para el cáncer, por lo que la búsqueda de alternativas es intensa, motivo por el cual la presente invención propone dar una posible solución con resultados efectivos que muestra ser más eficiente que las terapias empleadas a la fecha.

Bacillus thuringiensis (Bt) es un bacilo gram positivo, de flagelación perítrica, que mide de 3 a 5 μΠΊ de largo por 1 a 1 .2 μΐη de ancho. Es un microorganismo anaerobio facultativo, quimioorganótrofo y con actividad de catalasa. Pertenece a la familia Bacillaceae y se ubica dentro del grupo 1 del género Bacillus. Se caracteriza porque en su proceso de esporulación produce una inclusión parasporal formada por uno o más cuerpos cristalinos de naturaleza proteica que son tóxicos para distintos invertebrados, especialmente para larvas de insectos del género Lepidóptera, Díptera y Coleóptera (Bravo y Güereca, 1998; Sauka y Benintende, 2008). Estas proteínas son conocidas como proteínas cristal insecticidas (ICP) o δ-endotoxinas. Se clasifican en proteínas Cry (45-160 kDa) y en proteínas Cyt (22-30 kDa), diferenciándose principalmente por su mecanismo de acción insecticida y su actividad hemolítica, respectivamente. Las proteínas Cry son utilizadas en insecticidas comerciales a nivel mundial (Bravo y Güereca, 1998; Rukmini et al, 1999; Sauka y Benintende, 2008; Sun et al 2008; Yan Wu et al, 2008).

Mientras que un gran número de proteínas Cry son tóxicas a insectos, estudios recientes han demostrado que existen inclusiones parasporales donde las proteínas Cry producidas carecen de actividad insecticida, incluso aún y cuando son sometidas a pruebas in vitro que simulan las condiciones de los insectos. Sin embargo, estas proteínas Cry inocuas para insectos, presentan actividad citotóxica contra una gran variedad de líneas celulares de cáncer de humano (Ohba et al, 2009). De estas proteínas que se les ha denominado parasporinas (PS), a la fecha se encuentran reportadas alrededor de 13 y han sido clasificadas en 4 grupos. Las PS no poseen actividad insecticida ni hemolítica, ni tampoco poseen gran homología de secuencia con las proteínas Cry y Cyt. Su actividad citotóxica preferentemente por células cancerosas, hace de las PS posibles candidatos como agentes anticancerígenos para uso médico, aunque hasta el momento no se han hecho pruebas clínicas con humanos ni animales (Jung et al, 2007; Kitada et al, 2005; Mizuki et al, 2000, Nadarajah et al, 2006 y 2008; Ohba et al, 2009; Sauka y Benintende, 2008).

Las proteínas Cry insecticidas en su forma de protoxina ó toxina no tienen actividad citotóxica contra células normales de humanos ni de animales, como se ha descrito en los documentos US5616319, US5985267, US2005/01551 12, AU652774 y en la presente invención. Adicionalmente, hasta antes de la presente invención, ninguna proteína Cry insecticida ha sido reportada con actividad citotóxica contra líneas celulares de cáncer de animales ni de humanos.

En este sentido, la presente invención proporciona proteínas Cry aisladas a partir de cepas nuevas de Bt, presentan actividad citotóxica contra líneas celulares de cáncer pero no contra líneas celulares normales, no son parasporinas (PS) y no tienen actividad hemolítica como las proteínas Cyt. Sin embargo, las proteínas Cry de la presente invención presentan actividad insecticida debido a que pertenecen a los grupos de proteínas Cry insecticida más importantes. La actividad anticancerígena es una propiedad que hasta la fecha no había sido descrita para una proteína Cry insecticida de Bt. Objetivos de la invención.

La presente invención tiene como objetivo proporcionar moléculas novedosas de ácido nucleico (SEQ. ID. No. 1 a 10) provenientes de diferentes cepas nuevas de Bt, recolectadas de la región de Baja California, México, las cuales codifican proteínas ó fragmentos de proteínas Cry insecticidas de los grupos 1 , 2, 3, y 4 principalmente, que presentan actividad citotóxica específica contra líneas celulares de cáncer, por ejemplo de humanos y/o animales, y sin afectar células normales.

La presente invención tiene también como objetivo proporcionar proteínas Cry insecticidas novedosas (SEQ. ID. 1 1 a 20) o fragmentos de las mismas que comprenden principal pero no exclusivamente a los grupos 1 , 2, 3, 4, así como sus mutantes, las que una vez activadas, presentan actividad citotóxica contra líneas celulares, por ejemplo de humanos y/o animales, y sin afectar células normales.

Otro objetivo de esta invención, es el de aportar composiciones y/o formulaciones que comprendan las proteínas Cry de la presente invención (SEQ. ID. 1 1 a 20) para tratar células de cáncer y/o neoplásicas de animales y/o humanos, donde dichas composiciones comprenden además proteínas Cry de los grupos 1 , 2, 3, 4 principalmente, así como también la combinación con otras proteínas Cry y/o moléculas biológicas y/o químicas que tengan actividad anticancerígena.

Por otra parte, la presente invención comprende también métodos para curar y/o eliminar el cáncer, por ejemplo en humanos y/o animales, los cuales comprenden aplicar una cantidad terapéuticamente efectiva de las composiciones mencionadas anteriormente, donde la aplicación se puede realizar por cualquier vía de administración utilizada en la terapia contra cáncer.

Otro objetivo de esta invención es el uso de las proteínas Cry y sus mutantes, como por ejemplo de los grupos 1 , 2, 3, 4 e incluyendo las proteínas de la presente invención (SEQ. ID. 1 1 a 20), así como el uso de las composiciones donde se encuentren en la preparación de composiciones farmacéuticas, que auxilien para prevenir, curar y/o eliminar el cáncer de origen animal y/o humano. Breve descripción de las figuras.

Figura 1. Se muestra una electroforesis de las proteínas Cry de la invención en poliacrilamida. De izquierda a derecha, (1 ) marcador de peso molecular, (2) perfil de proteínas de la cepa E obtenido después de sonicar los cristales, (3) la misma muestra que en (2) mas el proceso de solubilización, (4) la misma muestra que en (2) mas la activación con tripsina, (siguientes carriles) perfil proteico de otras cepas de Bt activadas con tripsina y (último carril) cepa K activada con tripsina.

Figura 2. Se muestra el efecto de las proteínas Cry de la invención en la línea celular MDA- MB-231 . (a) células MDA-MB-231 sin proteínas Cry y (b) células MDA-MB-231 con 1 μg/ml de proteínas Cry producidas por la cepa H. El efecto de citotoxicidad se puede distinguir por la morfología circular sin brillo, que presentan las células tratadas con las proteínas Cry de la invención.

Figura 3. Se muestra el efecto de las proteínas Cry de la invención en tumores inducidos con células MDA-MB-231. (a) ratón nud con un tumor de seis días, (b) el mismo ratón después de 15 días de la aplicación de las proteínas Cry producidas por la cepa H y (c) el mismo ratón a los 25 días de la aplicación de las proteínas Cry producidas por la cepa H.

Descripción detallada de la invención.

La presente invención proporciona novedosas proteínas Cry de Bt (SEQ. ID. 1 1 a 20) con efecto anticancerígeno, que pueden ser utilizadas en la terapia y/o tratamiento de cáncer, así como las secuencias de ácidos nucleicos capaces de codificarlas (SEQ. ID. 1 a 10), con lo cual es posible producir dichas proteínas mediante métodos de producción y/o expresión de proteínas conocidos en el arte.

En una de sus modalidades, la presente invención proporciona también composiciones que comprenden las proteínas Cry de la invención que pueden utilizarse para proporcionar terapia y/o tratamiento en sujetos afectados con cáncer. Así mismo, la presente invención proporciona nuevos usos de las proteínas Cry en terapia y/o tratamiento de cáncer, particularmente de aquellas proteínas Cry que presentan al mismo tiempo actividad insecticida, actividad citotóxica contra líneas celulares de cáncer pero no contra líneas celulares normales, que no sean parasporinas (PS) y que no tengan actividad hemolítica como las proteínas Cyt.

Conforme a la presente invención, las proteínas Cry descritas aquí son codificadas por secuencias de ácidos nucleicos que potencialmente puedan transcribirse, incluso mediante métodos conocidos en el arte, o bien mediante secuencias que presenten variaciones conforme al uso de codones del sistema de producción pero que sean capaces de producir la proteína de interés, permitiendo que ésta conserve sus propiedades y actividad descrita. Dentro de estas secuencias de ácidos nucleicos, se incluyen aquellas que presenten al menos un 90% de homología con las SEQ. ID. No. 1 a 10 de la invención.

Para efectos de la invención, las composiciones descritas aquí comprenden las proteínas Cry de la invención en cantidades terapéuticamente efectivas, de manera tal que permitan proporcionar los efectos anticancerígenos mencionados cuando éstas son administradas a sujetos, por ejemplo humanos y/o animales, que necesiten terapia contra el cáncer. En este sentido, el régimen de administración dependerá de diversos factores, entre los que se incluyen la condición misma del sujeto, el grado de avance de la condición cancerosa, el tipo de tratamiento, la vía de administración y el seguimiento que proporcione el especialista médico al sujeto. Adicionalmente, las composiciones de la invención pueden administrarse al sujeto por diversas vías, de manera tal que las proteínas Cry, incluyendo las descritas aquí (SEQ. ID. 1 1 a 20), puedan llegar a su sitio blanco de acción, lo cual puede lograrse preferentemente mediante administración parenteral.

Por otra parte, las composiciones de la invención también comprenden proteínas Cry que sean capaces de proporcionar el efecto anticancerígeno de las proteínas Cry descritas aquí y que al mismo tiempo no afecten células normales del sujeto.

La presente invención proporciona proteínas novedosas Cry y/o fragmentos de las mismas, que presentan efectos anticancerígenos, de manera tal que cuando se administran a modelos animales afectados con cáncer y/o tumores, son capaces de revertir el crecimiento de dicho cáncer y/o tumor sin que se presenten efectos colaterales adversos con dicha administración. Dentro de estas proteínas, se incluyen aquellas que presenten al menos una de las SEQ. ID. No. 1 1 a 20 o un fragmento proteico de las mismas en su secuencia de aminoácidos, así como aquellas proteínas que presenten al menos un 80% de homología en su secuencia de aminoácidos, con las SEQ. ID. No. 1 1 a 20 de la invención.

Por lo anterior, la administración de las composiciones de la presente invención permite proporcionar terapias efectivas en animales afectados con cáncer, por ejemplo afectados por tumores cancerosos y que al mismo tiempo no generan efectos adversos por dicho tratamiento. La presente invención describe también métodos para el tratamiento de cáncer mediante la utilización de composiciones que comprendan proteínas Cry de Bt que exhiben actividad anticancerígena, particularmente proteínas Cry de los grupos 1 a 4 y preferentemente las proteínas Cry de la presente invención (SEQ. ID. 1 1 a 20). En este sentido, las proteínas Cry anteriormente mencionadas, pueden utilizarse por si solas, o bien en mezclas de las mismas, de tal forma que conserven su actividad anticancerígena descrita y que les permita administrarse para proporcionar tratamiento.

Las moléculas Cry de la presente invención pueden estar comprendidas en un vector de expresión que comprenda la secuencia de ácido nucleico que codifique para al menos una molécula Cry de la invención, de tal forma que permita la expresión de dicha molécula. En este sentido, el vector puede contener secuencias que codifiquen ambas cadenas de la molécula

Cry; así mismo, dichos vectores conteniendo las moléculas Cry de la invención, pueden estar contenidas en células de mamífero, por ejemplo, en células humanas.

Después de producidas las moléculas Cry de la invención, estas puede utilizarse para la obtención de composiciones farmacéuticas que posteriormente pueden ser administradas a los sujetos de interés a través de métodos conocidos en el arte.

Las composiciones de la invención que comprenden las moléculas Cry descritas aquí, pueden comprender vehículos de liberación, incluyendo liposomas, acarreadores, diluyentes y sus sales, o bien formulaciones farmacéuticamente aceptables adaptadas a las diferentes formas de administración que lleguen a ser necesarias, como por ejemplo tabletas, aerosoles, soluciones, sólidos micronizados, soluciones inyectables, geles, cremas, emulsiones, lociones o bien otras presentaciones farmacéuticas bien conocidas en el arte. Las composiciones de la invención, pueden utilizarse en métodos o procedimientos terapéuticos para tratar o prevenir enfermedades, desórdenes o tratar condiciones desfavorables para la salud relacionadas con la cáncer en un sujeto u organismo que comprende administrar a dicho sujeto u organismo una cantidad terapéuticamente efectiva de dichas composiciones bajo condiciones tales que permitan la inhibición, eliminación y/o progreso de cáncer, de manera tal que la reducción en la evolución de la condición cancerosa permita tratar dicha condición así como los síntomas asociados a ella. En este caso, la administración de las composiciones de la invención conteniendo las moléculas Cry aquí descritas, puede realizarse vía local o sistémica (intravenosa, intramuscular, subcutánea o por otra vía parenteral semejante) a los tejidos ó células que resulten relevantes para ello, tales como por ejemplo aquellos involucrados en el desarrollo de la condición a tratar en el sujeto u organismo, así como con la frecuencia (régimen de administración) y dosis necesaria hasta lograr el tratamiento deseado. Por otra parte, la administración de las composiciones de la presente invención puede combinarse con otros tratamientos conocidos en el arte para tales condiciones del sujeto u organismo, lo que favorece el restablecimiento del estado de salud del individuo.

A continuación se describe la metodología y los detalles característicos de la invención, así mismo se acompaña a la presente descripción, una serie de tablas y figuras con el objeto de ayudar a la mejor comprensión de la misma e ilustrarla, sin que ello pretenda limitar su alcance.

Ejemplo 1. Obtención de proteínas Cry con actividad anticancerígena.

Aislamiento y selección de cepas de Bacillus thurinqiensis.

Se recolectaron 120 muestras de suelo y agua de la región de Baja California, México. Las muestras se trataron por el método de selección de esporas y se crecieron en medio Luria Bertani (LB) durante 24 hrs. a 30°C. Se aislaron colonias de acuerdo a su morfología semejante a la descrita para Bt en medio LB y se incubaron durante 24 hrs. a 30°C. Las colonias elegidas se resembraron en medio SP líquido y se incubaron a 30°C durante 96 hrs. con agitación constante de 275 rpm, para inducir la producción de cristales paraesporales. Aquéllas cepas que presentaban similitud en su morfología con Bt y producían cristales, se calificaron como presuntivas.

Caracterización molecular de las cepas de Bt y de los genes cry.

- Extracción de ADN.

Para el aislamiento del ADN de las cepas de Bacillus thuringiensis identificadas y seleccionadas, se utilizó el método de lisis alcalina y fenol-cloroformo (Sambrook et al., 1989). La integridad del ADN fue verificada en un gel de agarosa al 0.8% sometido a luz ultravioleta. Del ADN de las cepas seleccionadas se amplificaron los genes 16S rDNA utilizando oligonucleótidos universales (Arellano y Olmos, 2002). Los genes cry se amplificaron también por medio de la técnica de PCR utilizando oligos específicos para cada grupo (tabla 1 ). Para las reacciones de PCR se utilizaron las siguientes condiciones: un ciclo de 2 min a 95°C, 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min a la temperatura de alineamiento indicada para cada oligonucleótido, 1 min a 72°C y uno más de 5 min a 72°C. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis utilizando un marcador de peso molecular, se secuenciaron (SEQ. ID. No. 1 a 10) y posteriormente se analizaron mediante el programa BLAST para corroborar la identidad de las cepas de Bt e identificar los genes cry presentes en las cepas seleccionadas (tabla 2).

Tabla 1. Oligos específicos para la amplificación de genes codificantes

para proteínas Cry

Tamaño

Nombre Secuencia¹ Gene T (°C)² Referencia³

(pb)

5'ATTCGCTAGGAACCAAGC (f) Thammasittirong scryIA cryIA 55 398

5AATCCGGTCCCCATACAC (r) y Attathom 2008

5' CTTCATCACGATGGAGTAA (f) EF102874.1 cryI B cryIB 50 369

5' CATAATTTGGTCGTTCTGTT (r)

5' CAAAGATCTGGAACACCTT (f)

cryI C cryIC 50 131 AY955268.1

5' CAAACTCTAAATCCTTTCAC (r)

5' AAGGGAAGGAAATACAGAGC (f) Thammasittirong cryI D cryID 54 641

5' CGAACGAACGAGATGTTAG (r) y Attathom 2008

5' GAACCAAGACGAACTATTG (f)

cryl E cryIE 50 144 M73252.1

5' TGAATGAACCCTACTCCC (r)

5' GCAGGAAGTGATTCATGG (f)

cryl F cryIF 50 432 EU679501.1

5'CAATGTGAATGTACTTTGCG (r)

5' CAAGCGAATATAAGGGAGT (f)

cry2Aa cry2Aa 50 460 AF273218.1

5' TAGCGCCAGAAGATACCA (r)

5' CACCTGGTGGAGCACGAG (f)

cry2Ab cry2Ab 50 771 AF3361 15.1

5' GTCTACGATGAATGTCCC (r)

5' TTAACCG I I I I CGCAGAGA (f)

cry3 cry3 50 713 Cerón et al, 1995

5' TCCGCACTTCTATGTGTCCAAG (r)

5' TCAAAGATCATTTCAAAATTACATG (f) I barra et al., cry4 cry4 50 459

5' CGGCTTGATCTATGTCATAATCTGT (r) 2003

1. (f) delantero; (r) reversa; 2. Temperatura de alineamiento; 3. Incluye nos. de acceso.

Como se puede observar en la tabla 2, solo se muestran las cepas de Bt que amplificaron genes cr de los grupos 1 , 2, 3 y 4, por considerarse los grupos insecticidas más importantes y abundantes, sin embargo no se descarta el uso de otros grupos. Es importante comentar que todas las cepas seleccionadas fueron especies de Bt según los resultados de secuencia del rDNA 16S. Adicionalmente, se utilizaron oligonucleótidos específicos para identificar si alguna de las cepas seleccionadas contenía genes que codificaran para proteínas del grupo de las parasporinas (PS) (Ohba et al, 2003). Los resultados obtenidos (no mostrados) comprobaron que ninguna de las cepas seleccionadas producía parasporinas, por lo que se descarta que la actividad citotóxica contra células de cáncer de las proteínas de la presente invención fuera generada por este tipo de proteínas.

Tabla 2. Caracterización por PCR de los genes cry presentes en las cepas de Bt seleccionadas.

Las cepas que amplificaron genes cyt fueron excluidas del estudio por contener actividad hemolítica contra eritrocitos de humanos y animales, lo que no eran apropiadas para su uso. Los resultados de secuencia de los productos de PCR amplificados con los oligonucleótidos específicos para los grupos 1 , 2, 3 y 4, comprobaron que los genes amplificados efectivamente eran de los genes mencionados (SEQ. ID. No. 1 a 10).

- Electroforesis de proteínas Cry activadas.

Una vez identificados los genes, se procedió a confirmar la presencia de las proteínas Cry insecticidas en las cepas de Bt seleccionadas (tabla 2). Las cepas fueron crecidas en medio SP y los cristales obtenidos fueron sonicados, solubilizados y activados por proteólisis enzimática. Las muestras tratadas se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida para proteínas. Las proteínas Cry insecticidas se caracterizan por presentar bandas entre 45 a 160 kDa, para los grupos 1 , 2, 3 y 4. En la figura 1 , se muestra el perfil de proteínas de algunas de las cepas aisladas en la región de Baja California conforme a la presente invención. En la figura 1 , el perfil de la cepa E muestra una banda mayoritaria de 130 kDa y otra de 70 KDa, en las muestras sonicadas y solubilizadas, que corresponden a las protoxinas de Cry1 y Cry2. En la muestra activada con tripsina se pueden observar proteínas de 60 y 65 kDa, tamaños esperados para toxinas Cry1 y Cry2 activadas.

Ejemplo 2. Actividad insecticida de las proteínas Cry de la invención producidas por las cepas de Bt.

Los cristales obtenidos conforme al ejemplo 1 fueron lavados y diluidos para obtener concentraciones de 2

las proteínas Cry. Con las diluciones se determinó la actividad insecticida en larvas de Manduca sexta. Las evaluaciones de toxicidad se realizaron en placas de 24 pozos, conteniendo una larva por pozo. Se agregaron las concentraciones mencionadas de la proteína y las placas se incubaron por 7 días. En la tabla 3, se muestra la actividad insecticida a los 7 días de experimentación con las cepas de Bt seleccionadas. Los resultados demuestran que las proteínas Cry evaluadas de la invención, ya sea en conjunto o por separado tienen actividad tóxica importante contra insectos.

Tabla 3. Porcentaje de mortalidad de larvas de Manduca sexta

con las proteínas Cry de la invención

- Activación de protoxinas Cry de las cepas de Bt seleccionadas. Los cristales provenientes de las cepas de Bt seleccionadas, se sometieron a diferentes tratamientos para solubilizar y activar las protoxinas que estaban contenidas en las inclusiones parasporales. La solubilización se realizó una vez cosechado y lavado el cultivo de Bt. El botón se resuspendió con buffer TTN y se incubó a 37°C por 30 min, para pasar a un proceso de sonicado de 6 min. Las muestras sonicadas se solubilizaron a través de un pH alcalino de 9 a 1 1 , para obtener las protoxinas. Las protoxinas se activaron utilizando tripsina a concentraciones de 5 a 50 μg/ml, así como diferentes tiempos de incubación dependiendo de la cepa utilizada. Las toxinas activadas se filtraron utilizando un disco de 0.2 μηη, con la intención de eliminar toda posible contaminación de bacterias o esporas remanentes. Las toxinas activadas se preservaron a -20°C para su posterior purificación por HPLC.

- Ensayo de citotoxicidad in-vitro utilizando líneas celulares de cáncer y las proteínas Cry de la invención.

La línea celular de queratinocitos humanos (HaCat), fue utilizada como control no canceroso y se cultivó en medio RPMI. Las líneas celulares de cáncer cérvico-uterino (HeLa) y cáncer de mama (MDA-MB-231 ), fueron cultivadas en el mismo medio que HaCat. El medio fue suplementado con 10% de SFB (suero fetal bovino) y 1 % de antibiótico-antimicótico. Los cultivos se incubaron a 37°C con 5% de C0₂ y atmósfera humidificada. Las células se mantuvieron en crecimiento por medio de subcultivos dos veces por semana. Previo a realizar los ensayos con líneas celulares, las toxinas de las cepas seleccionadas, se sometieron a una prueba de actividad hemolítica con eritrocitos humanos, para descartar efectos hemolíticos ocasionados por la presencia de proteínas Cyt. De acuerdo a lo esperado, las toxinas de las cepas seleccionadas no presentaron actividad hemolítica, ya que al momento de la selección por PCR se descartaron aquellas que contenían genes cyt.

Ejemplo 3. Efecto citotóxico de las proteínas Cry insecticidas de la invención en líneas celulares de cáncer.

En 100μΙ de medio se sembraron 2x10⁴ células por pozo en placas de microcultivo de 96 pocilios. Se incubaron por 5 hrs. a 37°C y 5% de C0₂. Después de transcurrido el tiempo de adhesión, se desechó el medio y se adicionó la toxina activada en concentraciones de 1.0, 0.5 y 0.25 μ9/ηιΙ, utilizando la misma cantidad de medio como vehículo. Cada concentración se analizó por triplicado. Después de 24 hrs. de incubación en las condiciones mencionadas, se procedió a medir la viabilidad celular por medio de microscopía (figura 2) y con la técnica de MTT. En la tabla 4, se muestra la actividad citotóxica de las proteínas Cry insecticidas de las cepas de Bt seleccionadas. Las toxinas que presentaron mayor actividad citotóxica en HeLa y MDA y por consecuencia mayor porcentaje de mortalidad en estas líneas celulares, fueron las producidas por las cepas B y H. Sin embargo, la mayoría de las cepas de Bt seleccionadas en esta invención, también presentaron actividad citotóxica importante contra las líneas celulares analizadas (tabla 4). En el caso particular de HaCat la cual fue utilizada como control no canceroso, se observó que ninguna de las proteínas Cry insecticidas utilizadas, presentaron actividad citotóxica por lo que la sobrevivencia se mantuvo al 100%, incluso a concentraciones de 10 μς/ηηΙ. Lo que confirma que la actividad citotóxica de las proteínas Cry insecticidas de la invención, fue específica y exclusiva para líneas celulares de cáncer. Otro control utilizado en los ensayos con líneas celulares fue el uso de las protoxinas Cry insecticidas, dando como resultado que no hubo actividad citotóxica en las líneas celulares de cáncer (HeLa y MDA-MB- 231 ), ni en las normales (HaCat), lo que demuestra que las protoxinas tienen que ser activadas para que lleven a cabo su efecto en contra de las líneas celulares de cáncer.

En la patente US5824636 se describe el uso de una proteína Cyt a concentraciones de hasta 100 g/ml para poder obtener efectos citotóxicos sobre líneas celulares de cáncer. Sin embargo, las proteínas Cyt son hemolíticas y su uso no es recomendado en ningún padecimiento. Por otra parte, las patentes US2003/0210317 y US7329733 utilizan parasporinas que son proteínas de Bt pero sin actividad insecticida, con las cuales han tenido buenos resultados a concentraciones similares a las descritas aquí (0.5 g/ml), principalmente para células de leucemia. En este sentido, la presente invención representa una alternativa novedosa para tratar células de cáncer, ya que a concentraciones de 0.5 μg/ml se obtuvieron buenos resultados utilizando toxinas Cry catalogadas como insecticidas, las cuales no habían sido utilizadas ni reportadas previamente para tratar líneas celulares de cáncer. Es importante, resaltar que las proteínas Cry insecticidas de la presente invención no tuvieron efecto citotóxico contra las células HaCat utilizadas como control no canceroso.

Tabla 4. DL₅₀ de las proteínas Cry insecticidas de la invención

sobre diferentes líneas celulares

ND. No detectado. Ejemplo 4. Efecto citotóxico de las proteínas Cry insecticidas de la invención en ratones nud con tumores inducidos.

Las toxinas contenidas en las cepas de B y H de Bt fueron utilizadas para tratar ratones nud, los cuales presentan la característica de ser inmunológicamente deficientes. A estos ratones se les indujeron tumores con células HeLa y MDA, los que después de 6 días de crecimiento presentaban tumores de un tamaño promedio de 2 cm de diámetro y 1 cm de altura. En este tiempo los ratones fueron inoculados directamente en el tumor con las toxinas producidas en las cepas B y H por separado, y su progreso fue monitoreado cada 5 días. Satisfactoriamente, a los 25 días de haberse inoculado las toxinas Cry insecticidas de la invención, los ratones presentaron una recuperación del 100%, lo que significaba que no existía evidencia física del tumor y todos sus signos vitales y parámetros hematológicos eran normales (figura 3). Demostrando que in-vivo las toxinas Cry insecticidas de la invención utilizadas tampoco afectaron a las células normales o sanas, solo a las de cáncer. Los ratones fueron evaluados durante 25 días más para determinar si existía regresión del tumor, lo cual no sucedió para ninguna de las dos muestras evaluadas.

Este experimento in-vivo demostró que efectivamente las proteínas Cry insecticidas de la invención pueden ser utilizadas para tratar cáncer.

Los resultados de citotoxicidad obtenidos y mostrados en la tabla 4 así como los resultados con los ratones nud, son por demás valiosos y prometedores debido a que por primera vez se demuestra que las proteínas Cry catalogadas como insecticidas, tienen un gran potencial para ser utilizadas como anticancerígenos.

Bibliografía.

1. Aggarwall, B. y Rodríguez-Padilla, Cristina. 1998. Antiproliferative protein from Bacillus thuringiensis var. thuringiensis. US 5,824,636.

2. Arellano-Carbajal, F. y Olmos, J. 2002. Thermostable a-1-4-and a-1-6- glucosidase enzymes from Bacillus sp isolated from a marine enviroment. World Journal of Microbiology and Biotechnology 18:791 -795.

3. Bravo, A. y Güereca, L. 1998. The oligomeric state of Bacillus thuringiensis Cry toxins in solution. Biochimica and Biophysica 1429: 342-350.

4. Coté, J., Jung, Y., Mizuki, E. y Akao, T. 2008. Bacillus thuringiensis strain crystal gene and Crystal protein and uses thereof. US7329733 B2.

5. Donovan, W., Tan, Y., Jany, C. y González, José. 1997. Bacillus Thuringiensis CryEt5 Gene y related plasmids, bacteria and Insecticides. US5616319.

6. Hickle, L., Payne, J., Bradfisch, G. y Sick, August. 1994. The use of Bacillus thuringiensis microbes for controlling the lesser mealworm alphitobius diaperinus. AU652774(B2). 7. Jung, Y., Mizuki, E., Asao, T. y Coté J. 2007. Isolation and characterization of a novel Bacillus thuringiensis strain expressing a novel cristal protein with cytocidal activity against human cáncer cells. Journal of Applied Microbiology 103, p. 65-79.

8. Kitada, S., Abe, Y., Ito, A., Kuge, O., Akao, T., Mizuki, E. y Ohba, M. (2005) Molecular Identification and Cytocidal Action of Parasporin, a Protein Group of Novel Crystal Toxins

Targeting Human Cáncer Cells. 6^th Pacific Rim Conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Enviromental Impact. Victoria, BC.

9. Mizuki, E., Shin Park, Y., Saitoh, H., Yamashita, S., Akao, T., Higuchi, K. y Ohba, M.

(2000) Parasporin, a Human Leukemic Cell- Recognozing Parasporal Protein of Bacillus Thuringiensis. Clinical and Diagnostic Laboratory Inmunology, 625-634.

10. Nadarajah, V.D., Ting, D., Mohamed, SM., Kanakeswary, K y Lee, HL. (2008). Selective Cytotoxic Activity against Leukemic Cell Lines From Mosquitocidal Bacillus Thuringiensis Parasporal Inclusions. Human Biology Section. Faculty of Medicine, International Medical University.

1 1. Nadarajah, V.D., Chai, S.H., Mohamed, SM., Chan, K.K. y Kanakeswary, K. (2006).

Malaysian Mosquitocidal Soil Bacterium (Bacillus thuringiensis) Strains with Selective Hemolytic and Lectin Activity Against Human and Rat Erythrocytes. Human Biology Section. Faculty of Medicine, International Medical University 37: no.1.

12. Ohba, M., Mizuki, E. y Uemori, A. (2009). Parasporin, a new anticancer Protein Group from Bacillus thuringiensis. Anticancer Research 29: 427-434.

13. Ohba, M., Mizuki, E. y Uemori, A., Akao, T., Saito, H., Katayama, H., Yamashita, S. y Lee, D. Protein Having Cell recognizing activity and/or cytocidal activity. US2003/0216317 A1 .

14. Payne, J., Sick, A., Narva, K., Schnepf, H. y Shwab, G. 1999. Protein toxins active against Lepidopteran pests. US5985267.

15. Rukmini, V., Reddy, C. y Venkateswerlu, G. 1999. Bacillus thuringiensis cristal - endotoxin:

Role of porteases in the conversión of protoxin to toxin. Biochimie 82: 109-1 16.

16. Sambrook, K.T., Frisch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning. A laboratory Manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

17. Sauka, D. y Benintende, G. (2008). Bacillus thuringiensis: generalidades. Un acercamiento a su empleo en el biocontrol de insectos lepidóptéros que son plagas agrícolas. Revista

Argentina de Microbiología 40: 124-140.

18. Sun, Y., Fu, Z., Ding, X. y Xia, L. (2008) Evaluating the Insecticidal Genes and their Expressed Products in Bacillus Thuringiensis Strains by Combining PCR with Mass Spectrometry. Applied and Enviromental Microbiology. P. 681 1 -6813.

19. Chu, W.L. y Radhakrishnan, A. (2008). Research on bioactive molecules: Achievements and the Way Forward. JSME Suppl 1 , S21 -S24. Wu, Y., Gao, M., Dai, S., Yi, D. y Fan, H. (2008). Investigation of the cyt gene in Bacillus thuringiensis and the biological activities of Bt isolates from the soil of China. Biological Control 47; 335-339.

Claims

Reivindicaciones.

I . Una proteína Cry de Bacillus thuringiensis con actividad anticancerígena, caracterizada porque presenta actividad citotóxica específica contra células cancerosas y no es citotóxica para células normales.

2. La proteína Cry de la reivindicación 1 , caracterizada porque se selecciona del grupo que comprende proteínas Cry de los grupos Cry1 , Cry2, Cry3, Cry4, proteínas que comprenden al menos una secuencia seleccionada de la SEQ. ID. No. 1 1 a SEQ. ID. No. 20, proteínas con una similitud en su secuencia de aminoácidos de al menos un 80% respecto de las SEQ. ID. No. 1 1 a SEQ. ID. No. 20, fragmentos ó péptidos derivados de las proteínas anteriores y mezclas de las mismas.

3. La proteína Cry de la reivindicación 2, caracterizada porque comprende al menos una secuencia seleccionada de las SEQ. ID. No. 1 1 a SEQ. ID. No. 20.

4. La proteína Cry de la reivindicación 1 a 3, caracterizada porque no presenta actividad hemolítica.

5. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para la proteína Cry de la reivindicación 1 .

6. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para la proteína Cry de la reivindicación 2.

7. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque codifica para la proteína Cry de la reivindicación 3.

8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación no. 7, caracterizada porque se selecciona del grupo que comprende la SEQ. ID. No. 1 a SEQ. ID. No. 10.

9. Un vehículo molecular de expresión caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 5 a 7.

10. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vehículo molecular de la reivindicación 9.

I I . Una composición farmacéutica con efecto anticancerígeno, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína Cry de las reivindicaciones 1 a 4 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 1 , caracterizada porque comprende la proteína Cry de la reivindicación 3.

13. Un método para el tratamiento de cáncer en animales, caracterizado porque comprende administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de la reivindicación 1 1 a 12.

14. El uso de las proteínas de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer en mamíferos.

15. El uso de proteínas Cry insecticidas de Bacillus thuringiensis con actividad anticancerígena para el tratamiento de cáncer y/o tumores en animales.

16. El uso de proteínas Cry insecticidas de Bacillus thuringiensis con actividad anticancerígena para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer y/o tumores en animales.

17. Un método para la obtención de las proteínas Cry de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende las etapas de a) hacer crecer la célula hospedera de la reivindicación 10 en un medio de crecimiento en condiciones tales que permitan la expresión de las proteínas Cry, y b) purificar las proteínas Cry del medio de crecimiento.

18. Un método para la obtención de la composición farmacéutica de las reivindicaciones 1 1 y 12, caracterizado porque comprende mezclar una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína Cry de las reivindicaciones 1 a 4 con un vehículo farmacéuticamente aceptable.