WO2012063877A1 - 分離容器および分離方法 - Google Patents

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WO2012063877A1
WO2012063877A1 PCT/JP2011/075858 JP2011075858W WO2012063877A1 WO 2012063877 A1 WO2012063877 A1 WO 2012063877A1 JP 2011075858 W JP2011075858 W JP 2011075858W WO 2012063877 A1 WO2012063877 A1 WO 2012063877A1
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container
inner container
separation
outer container
sperm
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PCT/JP2011/075858
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French (fr)
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聡 平井
典子 武田
摂 沖津
Original Assignee
株式会社ジェイ・エム・エス
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Publication date
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B04—CENTRIFUGAL APPARATUS OR MACHINES FOR CARRYING-OUT PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES
    • B04B—CENTRIFUGES
    • B04B7/00—Elements of centrifuges
    • B04B7/08—Rotary bowls
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5021—Test tubes specially adapted for centrifugation purposes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D21/00—Separation of suspended solid particles from liquids by sedimentation
    • B01D21/26—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force
    • B01D21/262—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force by using a centrifuge
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/02—Adapting objects or devices to another
    • B01L2200/025—Align devices or objects to ensure defined positions relative to each other
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
    • B01L2300/0854—Double walls

Definitions

  • the present invention relates to a separation container and a separation method.
  • Infertility accounts for more than 50% of cases that are thought to be caused by men.
  • male infertility include oligospermia with low sperm concentration in semen, asthenozoospermia with poor sperm motility, and the like.
  • assisted reproduction medicine such as artificial insemination method, in vitro fertilization method and microinsemination method using sperm collected from semen is applied.
  • Examples of the method for preparing a sperm sample include a separation method using density gradient centrifugation (density gradient centrifugation method) and a separation method using sperm motility (swim-up method).
  • density gradient centrifugation method density gradient centrifugation method
  • sperm motility sperm motility
  • the solid is submerged in the bottom of the container containing the culture medium.
  • mature sperm having motility swims up from the bottom to the top of the medium by linear motion.
  • mature sperm can be obtained by recovering the upper layer of the medium.
  • Patent Document 1 discloses a sampling tool in which a sampling tube is arranged in a centrifuge tube.
  • the sampling tube is disposed on the centrifuge tube with its tip reaching the bottom of the centrifuge tube. Then, percoll and semen are put into the centrifuge tube and centrifuged. After the centrifugation, a syringe is connected to the collection tube, and sperm precipitated at the bottom of the centrifuge tube is aspirated and collected.
  • the tip of the sampling tube is positioned at the bottom of the centrifuge tube, the sperm may be physically damaged by the tip of the sampling tube during centrifugation.
  • Patent Document 2 discloses a tool whose inside is partitioned into a sample introduction chamber and a separation object recovery chamber in the axial direction by a partition wall.
  • the partition has a through hole that allows the sample introduction chamber and the recovery chamber to communicate with each other at a lower portion.
  • the density gradient centrifugation using this tool is performed as follows. First, percoll is introduced into the sample introduction chamber and the recovery chamber, and semen is further layered on the sample introduction chamber. Next, sperm is precipitated in the lower part of the sample introduction chamber by centrifugation. At this time, since the sample introduction chamber and the recovery chamber communicate with each other through the lower through-hole, the precipitated sperm moves to the recovery chamber through the through-hole.
  • Patent Document 2 discloses a tool in which an attachment serving as the sample introduction chamber is arranged inside a container body.
  • the inside of the container body is partitioned into the sample introduction chamber and the collection chamber in the axial direction by the side wall of the attachment. That is, the inside of the attachment serves as the sample introduction chamber, and the remaining area inside the container body serves as the collection chamber.
  • the side wall of the attachment has a through hole in the lower part thereof.
  • an object of the present invention is to provide a separation container that can prevent unnecessary components from being mixed and can efficiently separate a separation object.
  • the separation container of the present invention comprises: A separation container for separating an object to be separated from a sample, An outer container, an inner container and a lid,
  • the outer container is It is a bottomed cylinder with an open top and a closed bottom
  • the inner container is It has a cylindrical shape with an open top and bottom
  • the outer container and the inner container can be arranged inside the outer container in a state in which the respective upper and lower directions are aligned, With the inner container disposed inside the outer container, Inside the outer container, a region below the arranged inner container is a container for a precipitate from the sample,
  • the lid is Removable to the opening at the upper end of the inner container, When the lid is attached to the opening of the inner container, the inside of the inner container is in a liquid-tight state.
  • the separation method of the present invention is a separation method for separating a separation object from a sample
  • the separation container of the present invention is used, and the following steps (A1) to (D1) are included.
  • (A1) The step of placing the inner container inside the outer container and filling the inside of the inner container and the accommodating portion of the outer container with a centrifuge liquid (B1) After the step (A1), the contents Step of introducing the sample into the vessel (C1) After the step (B1), the separation container is subjected to centrifugation, and the precipitate derived from the sample is accommodated in the accommodating portion of the outer container (D1) After the step (C1), the step of taking out the inner container from the outer container while the lid is attached to the inner container
  • a separation object to be precipitated can be accommodated in the accommodating portion of the outer container from the inner container through the tip opening at the lower end thereof by centrifugation. And since the said inner container will be in a liquid-tight state by mounting
  • the size of the accommodating portion can be arbitrarily designed. For this reason, by reducing the size of the container, the amount of liquid remaining in the outer container after the inner container is removed can be set to an arbitrary amount, for example, a small amount.
  • the amount of liquid is relatively small, a sample with a relatively high concentration of the separation target can be obtained. Moreover, since the amount of the centrifugation processing liquid to be used can also be reduced in connection with this, for example, when using Percoll, cost reduction is possible.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view illustrating an example of a constituent member of a separation container according to the present invention, in which (A) is an outer container, (B) is an inner container, and (C) is a cross-sectional view of a lid.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view showing an example of the separation container of the present invention.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view showing an example of a constituent member of the separation container of the present invention, in which (A) is an outer container, (B) is an inner container, and (C) is a cross-sectional view of a lid.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view showing an example of the separation container of the present invention.
  • FIG. 5A, 5B, and 5C are cross-sectional views showing an example of the separation container of the present invention.
  • 6A and 6B are schematic views showing an example of the outer container in the present invention, in which FIG. 6A is a cross-sectional view, FIG. 6B is a plan view of the upper portion, and FIG. 6C is a perspective view of the upper portion.
  • 7A and 7B are schematic views showing an example of the inner container in the present invention, in which FIG. 7A is a cross-sectional view and FIG. 7B is a perspective view of the upper part thereof.
  • FIG. 7A is a cross-sectional view
  • FIG. 7B is a perspective view of the upper part thereof.
  • FIG. 8 is a schematic view showing an example of the separation container according to the present invention, and (A) and (B) are cross-sectional views showing a state in which protrusions are inserted into the inner container in different groove portions of the outer container, respectively. is there.
  • FIG. 9 is a schematic view showing an example of a constituent member in the present invention
  • (A) is a perspective view showing the upper part of the outer container
  • (B) is a perspective view showing the upper part of the inner container.
  • FIG. 10 is a perspective view showing an example of the outer container in the present invention.
  • 11A and 11B are schematic views showing an example of the outer container in the present invention.
  • FIG. 11A is a cross-sectional view in the axial direction
  • FIG. 11B is a cross-sectional view in the II direction of FIG. 12A and 12B are schematic views showing an example of the inner container in the present invention, where FIG. 12A is a sectional view in the axial direction, and FIG. 12B is a sectional view in the II-II direction of FIG.
  • FIG. 13 is a cross-sectional view showing an example of the separation container of the present invention.
  • FIG. 14 is a schematic view showing an example of a constituent member in the present invention, where (A) is a cross-sectional view of an outer container, and (B) is a cross-sectional view of an inner container.
  • FIG. 15 is a schematic view showing an example of the outer container in the present invention, (A) is a plan view of the tip portion thereof, and (B) is a sectional view of the outer container.
  • 16A and 16B are schematic views showing an example of the separation container of the present invention, in which FIG. 16A is an axial sectional view, and FIG. 16B is a sectional view taken along the line III-III of FIG.
  • FIG. 17 is a schematic view showing an example of the separation container of the present invention, in which (A) is a cross-sectional view of the separation container in which the inner container has protrusions, and (B) is the separation in which the outer container has protrusions. It is sectional drawing of a container.
  • FIG. 18A and 18B are schematic views showing an example of the separation container according to the present invention, in which FIG. 18A is a perspective view showing a tip of an inner container having a rib, and FIG. 18B has the inner container of FIG. It is sectional drawing of a separation container.
  • FIG. 19 is a schematic view showing an example of the separation container of the present invention, in which (A) is a cross-sectional view of the separation container having an elliptical inner container, and (B) is arranged with the inner container biased to one side. It is sectional drawing of the made separation container.
  • FIG. 20 is a graph showing the average concentration rate of viable sperm collected in Example 2 of the present invention.
  • the separation container of the present invention is a separation container for separating a separation object from a sample as described above,
  • An outer container, an inner container and a lid
  • the outer container is It is a bottomed cylinder with an open top and a closed bottom
  • the inner container is It has a cylindrical shape with an open top and bottom
  • the outer container and the inner container can be arranged inside the outer container in a state in which the respective upper and lower directions are aligned, With the inner container disposed inside the outer container, Inside the outer container, a region below the arranged inner container is a container for a precipitate from the sample,
  • the lid is Removable to the opening at the upper end of the inner container, When the lid is attached to the opening of the inner container, the inside of the inner container is in a liquid-tight state.
  • the outer container and the inner container are each cylindrical, and a cylindrical shape is particularly preferable.
  • the lower end of the inner container has at least one of the end surface of the front end and the outer peripheral surface of the front end. It is preferable to be in contact with the inner peripheral surface.
  • the end surface of the distal end may be in contact with the inner peripheral surface of the outer container, and the outer peripheral surface of the front end may be in contact with the inner peripheral surface of the outer container. However, you may contact the internal peripheral surface of the said outer container.
  • the separation container of the present invention is also suitable for separating sperm by, for example, the swim-up method.
  • the swim-up method for example, sperm is disposed in the housing portion of the outer container, and a liquid capable of swimming sperm is introduced into the inner container. Good sperm exhibiting motility emerges from the housing portion through the opening at the lower end of the inner container into the inner container by linear motion.
  • the separation container of the present invention the lower end of the inner container is in contact with the inner peripheral surface of the outer container. For this reason, the sperm which floated from the said accommodating part is efficiently guide
  • the lower end of the inner container may be, for example, the entire end surface of the tip opening may contact the inner peripheral surface of the outer container, or the partial area of the end surface may contact the inner peripheral surface of the outer container. May be. In the latter case, for example, the number of locations that contact the outer container may be one, or two or more.
  • the entire outer peripheral surface at the tip thereof may contact the inner peripheral surface of the outer container, or the partial region of the end surface contacts the inner peripheral surface of the outer container. May be. In the latter case, for example, the number of locations that contact the outer container may be one, or two or more.
  • the inner container may have a protrusion on the outer peripheral surface of the tip, for example.
  • the lower end of the inner container may contact the inner peripheral surface of the outer container at the protrusion.
  • the protrusion is not particularly limited, and may be one or two or more, for example.
  • the outer container may have, for example, a protrusion on the inner peripheral surface of the upper end portion of the housing portion.
  • the lower end of the inner container may be in contact with the protruding portion of the outer container on at least one of the end face of the tip opening or the outer peripheral face of the tip.
  • the protrusion is not particularly limited, and may be one or two or more, for example.
  • the outer container may have, for example, a protruding portion in a circumferential shape on the inner peripheral surface of the upper end portion of the housing portion.
  • a side wall forming the housing portion may be a circumferential protrusion, and a circumferential groove may be formed on the outer periphery of the housing portion.
  • the end surface of the tip opening may be in contact with the protruding portion, specifically, the inner surface of the protruding portion.
  • the inner peripheral surface of the said outer container contains the surface of the said projection part, when it has the said projection part, for example.
  • the outer container and the inner container have a concave portion (for example, a groove portion) and a convex portion (protrusion portion) that can be engaged with each other at corresponding locations. You may have.
  • a concave portion and the convex portion for example, when the inner container is mounted on the outer container, more stable mounting property can be realized.
  • the engagement between the concave portion and the convex portion can be recognized with a tactile sensation by the fingers of the operator, so that the operability can be further improved.
  • the lower end of the inner container is in contact with the inner peripheral surface of the outer container.
  • the lower end of the inner container and the inner peripheral surface of the outer container may be partially in contact with each other, whereby the lower end of the inner container and the upper end of the housing portion of the outer container
  • a gap may or may not exist between the outer peripheral surface of the inner container and the inner peripheral surface of the outer container, and the latter is preferable.
  • the gap is preferably a gap through which sperm cannot pass, for example. If it is the said gap
  • the gap through which the sperm cannot pass is not particularly limited.
  • the distance between the outer peripheral surface of the lower end of the inner container and the inner peripheral surface of the outer container facing the gap in the direction perpendicular to the axis is preferably 200 ⁇ m or less, more preferably 100 ⁇ m or less. More preferably, it is 50 ⁇ m or less.
  • the inner container may have a tapered portion whose outer peripheral surface is tapered.
  • the tapered portion may be in contact with the inner peripheral surface of the outer container, for example, in whole or in part. Further, in the inner container, the inner peripheral surface of the tapered portion may be tapered like the outer peripheral surface.
  • the position of the tapered portion is not particularly limited, and may be, for example, a downward direction and may be a lower end.
  • the said inner container may have a cylindrical front-end
  • the outer container may have a tapered portion whose inner peripheral surface is tapered.
  • the position of the tapered portion is not particularly limited, and for example, the upward direction of the accommodating portion may be raised and connected to the upper end portion of the accommodating portion.
  • the tapered outer peripheral surface of the inner container in a state where the inner container is disposed inside the outer container, is, for example, entirely or partially on the tapered inner peripheral surface of the outer container. You may touch.
  • the inner container may further have, for example, a protrusion on the outer peripheral surface of the upper end thereof.
  • a protrusion on the outer peripheral surface of the upper end thereof.
  • the protruding portion is not inserted into the outer container and is exposed on the opening of the outer container.
  • the protrusion is, for example, a grip portion for the inner container.
  • the gap between the outer container and the inner container is closed by the protrusion, for example, at the upper end.
  • the lid can be closed by attaching the lid to the opening at the upper end of the inner container. It is preferable that the lid portion also closes the opening at the upper end of the outer container, for example, by being attached to the inner container disposed inside the outer container.
  • the lid portion may be connected to the inner container, or may be a separate member from the inner container and may be attached to the inner container at the time of use.
  • the lid may be connected to the outer container.
  • the mounting form of the lid is not particularly limited, and examples thereof include screwing, occlusion, fitting, and pressure welding.
  • one of the inner peripheral surface of the outer container and the outer peripheral surface of the inner container has a projection (projection), and the other has a groove (depression) that can be engaged with the projection.
  • the protrusion and the groove are preferably capable of locking the inner container inside the outer container, for example, and are referred to as an engaging protrusion and an engaging groove, respectively.
  • any of the outer container and the inner container may have the protrusion
  • any of the outer container and the inner container may have the groove.
  • the protrusion and the groove are disposed at a site where both can be engaged.
  • the groove may be provided on the inner peripheral surface of the outer container, the protrusion may be provided on the outer peripheral surface of the inner container, or the protrusion may be provided on the inner peripheral surface of the outer container.
  • the groove portion may be provided on the outer peripheral surface of the inner container.
  • the groove and the protrusion are preferably provided in the axial direction, for example.
  • the outer container is inserted into the groove provided in the axial direction by inserting a protrusion provided in the axial direction. It is preferable to engage the inner container.
  • the outer container may have a plurality of grooves having different depths, for example.
  • the inner container preferably has a protrusion having a length that can be inserted into the deepest groove.
  • the depth of insertion of the inner container into the outer container that is, depending on which of the groove portions the protrusion is inserted, that is, The position of the inner container in the axial direction can be adjusted inside the outer container.
  • the outer container may have the protrusion
  • the inner container may have the groove.
  • the outer container for example, it is preferable that the outer container has a concentric groove on the outside of the housing portion, and the inner container has a concentric protrusion on the outer side of the tip, for example. . And when arrange
  • the groove portion in the outer container is formed by an outer wall of the housing portion and an outer wall of the outer container.
  • the material for forming the separation container is not particularly limited.
  • the material include synthetic resin materials, metal materials, and glass materials. Among these, for example, formability, assemblability, workability of materials such as adhesiveness as necessary; hygiene aspects such as elution of additives into samples; functionality such as visibility;
  • the synthetic resin material is preferable.
  • the material include fluorine resin, polypropylene, polyethylene, polycarbonate, polyester, polyurethane, polymethylpentene, methacryl, ABS (acrylonitrile / butadiene / styrene copolymer), PET (polyethylene terephthalate), polyvinyl chloride, silicone, and ethylene.
  • Synthetic resins such as vinyl acetate copolymer, synthetic rubber and various elastomers can be mentioned.
  • fluororesin, polypropylene, polyethylene and polycarbonate are preferable.
  • the fluororesin is preferably a hydrophobic fluororesin, and particularly preferably polytetrafluoroethylene (PTFE).
  • the separation container of the present invention is not particularly limited.
  • the separation container of the present invention is preferably for separation of sperm from a sample, for example.
  • the separation method is not particularly limited, and can be applied to, for example, a density gradient centrifugation method, a swim-up method, and the like.
  • the separation container of the present invention is used for density gradient centrifugation, in addition to sperm separation, for example, separation of organelles, separation of DNA or RNA, specific components of blood (for example, red blood cells, mononuclear cells, plasma) ).
  • the sample is not particularly limited, and examples include a sample containing the separation object, and specific examples include semen and blood.
  • the separation method of the present invention is a separation method for separating a separation object from a sample, Using the separation container of the present invention, It has the following processes (A1) to (D1).
  • A1 The step of placing the inner container inside the outer container and filling the inside of the inner container and the accommodating portion of the outer container with a centrifuge liquid (B1) After the step (A1), the contents Step of introducing the sample into the vessel (C1) After the step (B1), the separation container is subjected to centrifugation, and the precipitate derived from the sample is accommodated in the accommodating portion of the outer container (D1) After the step (C1), the step of taking out the inner container from the outer container while the lid is attached to the inner container
  • the centrifugal treatment liquid is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the type of the sample and the separation target.
  • the centrifugation solution include a density gradient carrier, a medium, a buffer solution, and the like.
  • the density gradient carrier can also be referred to as a specific gravity adjusting agent, for example.
  • the density gradient carrier is not particularly limited, and examples thereof include percoll, modified colloidal silica, sucrose polymer, and ficoll.
  • the percoll is usually a colloidal silica sol having a polyvinylpyrrolidone film.
  • the percoll is preferably, for example, percoll that is made isotonic by removing the endotoxin and then adding the medium.
  • the concentration of Percoll is not particularly limited and is preferably 90 to 98%, for example.
  • the medium include a HEPES-containing solution when the separation target is sperm.
  • the order of the arrangement of the inner container inside the outer container and the filling of the centrifugal treatment liquid is not limited.
  • the step (A1) may be, for example, any of the following steps (A1-1) and (A1-2).
  • (A1-1) After placing the inner container inside the outer container, by introducing the centrifugal treatment liquid into the inner container, the inside of the inner container and the housing portion of the outer container, Step (A1-2) of filling the centrifuge processing liquid After introducing the centrifuge processing liquid into the outer container, the inner container is disposed inside the outer container, so that the inside of the inner container and The step of filling the storage portion of the outer container with the centrifugal treatment liquid
  • the centrifugal treatment liquid is injected into the inner container.
  • the centrifugal treatment liquid can be filled into the accommodating portion of the outer container from the opening at the lower end of the inner container.
  • the inner container is placed inside the outer container.
  • the inside of the inner container can be filled with a centrifugal treatment liquid.
  • the centrifugal treatment liquid is introduced into the inside through the opening at the lower end of the inner container.
  • the method for introducing the sample is not particularly limited.
  • the centrifugal treatment liquid is a density gradient carrier, for example, the sample is preferably layered on the density gradient carrier.
  • the centrifugation conditions are not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the type of the sample and the separation object.
  • the condition is 1000 G (1000 ⁇ 9.80665 m / s 2 ) for 20 to 30 minutes.
  • the centrifugation is preferably performed, for example, in a state where the lid is attached to the inner container. By the centrifugation, the precipitate derived from the sample is led out from the opening at the lower end of the inner container to the housing part of the outer container.
  • step (D1) when the lid is attached to the inner container, the inside of the inner container is in a liquid-tight state. For this reason, the inner container can be taken out from the outer container without the liquid inside the inner container leaking from the opening at the lower end. Since the precipitate derived from the sample is stored in the storage portion of the outer container, the precipitated separation target can be recovered by recovering the liquid in the storage portion.
  • the separation object is not particularly limited as described above, and the separation method of the present invention is preferably applied to sperm separation.
  • the separation container of the present invention can be applied to, for example, a centrifugal separation method and a swim-up method.
  • the separation method of the present invention includes, for example, as a first embodiment, a centrifugation method, that is, a method of collecting sperm by precipitating sperm by centrifugation.
  • a centrifugation method that is, a method of collecting sperm by precipitating sperm by centrifugation.
  • a sample containing sperm, such as semen is introduced into the inner container, and in the step (C1), the separation container is subjected to centrifugation, Sperm in the sample is accommodated in the accommodating part of the outer container by precipitation, and subsequently, in the step (D1), the inner container is taken out from the outer container, and the sperm in the accommodating part of the outer container is collected. Is preferably recovered.
  • the first form is preferably a density gradient method using, for example, the density gradient carrier as the centrifugal treatment liquid.
  • the first embodiment can be further combined with a swim-up method.
  • the separation container is subjected to centrifugation, and the sperm in the sample is stored in the storage part of the outer container by precipitation
  • the step (D1) The inner container is taken out from the outer container.
  • E1) After the step (D1), placing the new inner container in the outer container, and filling the inner container with a liquid in which sperm can swim, either before or after the placement
  • the centrifugal treatment liquid containing precipitated sperm is present in the housing portion of the outer container.
  • the sperm having excellent mobility can be transferred from the housing portion of the outer container to the inner container. It swims toward the inside of the inner container through the opening. For this reason, the sperm which is excellent in mobility can be collected by collecting the liquid inside the inner container.
  • the filling of the liquid into the inner container is not particularly limited.
  • the inner container may be filled after being placed in the outer container, or the inner container filled with the liquid in advance may be used.
  • the liquid container may be arranged in the outer container while maintaining a liquid-tight state.
  • the inner container may be taken out from the outer container while the lid is attached to the inner container, and the sperm in the inner container may be collected.
  • the lower end thereof is put into another container such as a test tube, the lid is removed, and the liquid-tight state is released, so that the inside of the inner container is removed.
  • the liquid may be transferred to the other container.
  • a liquid containing sperm may be recovered from the inside of the inner container using a pipette or the like.
  • the liquid in which the sperm can swim is not particularly limited, and examples thereof include the medium.
  • Specific examples of the medium include a liquid containing HEPES.
  • the separation method of the present invention includes, for example, a swim-up method as the second form.
  • the separation method preferably includes the following steps (A2) to (C2) using the separation container of the present invention.
  • A2) A step of introducing a sample containing sperm into the housing portion of the outer container (B2) After the step (A2), the inner container is arranged inside the outer container, and either before or after the arrangement And (C2) the step of filling the inner container with a liquid in which sperm can swim (C2) the step of recovering the sperm swimming in the inner container from the housing portion of the outer container after the step (B2).
  • step (C2) it is preferable that the inner container is taken out from the outer container and the sperm in the inner container is recovered while the lid is attached to the inner container.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of members constituting a separation container, in which (A) is an outer container, (B) is an inner container, and (C) is a lid.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the separation container.
  • the outer container 10 has a bottomed cylindrical shape having an opening 104 at the upper end, and includes a main body portion 101, a tapered portion 102, and a storage portion 103.
  • the inner container 11 has openings 114 and 113 at the upper end and the lower end, respectively, and is composed of a main body portion 111 and a tapered portion 112.
  • the protrusion 115 is provided in the circumferential shape.
  • the protrusion 115 serves as a grip portion of the inner container 11 as described above, for example.
  • the lid part 12 has a grip part 121 and an insertion part 122.
  • the size of the outer container 10, the inner container 11 and the lid 12 is not particularly limited.
  • the inner container 11 can be disposed inside the outer container 10, and the inner container 11 is disposed on at least one of the end surface of the opening 113 at the lower end and the outer peripheral surface of the opening 113.
  • the lid 12 can be attached to the opening 114 at the upper end of the inner container 11 in contact with the inner peripheral surface, and the interior of the inner container 11 becomes liquid-tight by the attachment of the lid 12 to the inner container 11. That's fine.
  • each member can be appropriately determined according to, for example, the type of the sample and the separation object, the amount of the sample, and the like.
  • axial direction means the vertical direction of the separation container, inner container and outer container
  • vertical direction means a direction perpendicular to the axial direction
  • height means the length in the axial direction
  • diameter means the diameter in the cross section in the vertical direction.
  • the size of the outer container 10 is not particularly limited, and examples thereof include the following conditions.
  • the total volume is, for example, 0.5 to 100 mL, and preferably 1.0 to 50 mL.
  • the overall height of the outer container 10 is, for example, 30 to 200 mm, preferably 50 to 120 mm.
  • the height of the main body 101 is, for example, 80 to 120 mm, preferably 105 to 115 mm.
  • the height of the tapered portion 102 is, for example, 5 to 20 mm, and preferably 10 to 15 mm.
  • the height of the accommodating portion 103 is, for example, 5 to 15 mm, preferably 8 to 12 mm.
  • the diameter of the inner periphery of the opening 104 is, for example, 10 to 20 mm, and preferably 13 to 15 mm.
  • the inner peripheral diameter of the upper end of the tapered portion 102 is, for example, 8 to 18 mm, and preferably 10 to 13 mm.
  • the diameter of the inner periphery of the upper end of the accommodating portion 103 is, for example, 5 to 15 mm, preferably 6 to 7 mm.
  • the capacity of the storage unit 103 is, for example, 0.1 to 0.5 mL, and preferably 0.2 to 0.4 mL.
  • the height of the inside of the accommodating portion 103 is, for example, 4 to 10 mm, and preferably 5 to 8 mm.
  • the size of the inner container 11 is not particularly limited, and examples thereof include the following conditions.
  • the total volume is, for example, 0.3 to 100 mL, preferably 0.5 to 50 mL.
  • the total height of the inner container 11 is, for example, 60 to 100 mm, and preferably 80 to 90 mm.
  • the height of the main body 111 is, for example, 50 to 90 mm, preferably 60 to 70 mm.
  • the height of the tapered portion 112 is, for example, 5 to 30 mm, and preferably 10 to 20 mm.
  • the inner peripheral diameter of the upper end opening 114 is, for example, 5 to 20 mm, and preferably 10 to 14 mm.
  • the diameter of the outer periphery of the upper end opening 114 is, for example, 10 to 20 mm, and preferably 14 to 18 mm.
  • the diameter of the outer periphery of the upper end of the tapered portion 112 is, for example, 8 to 18 mm, preferably 10 to 15 mm.
  • the diameter of the outer periphery of the lower end of the tapered portion 112, that is, the diameter of the outer periphery of the opening 113 at the lower end is, for example, 3 to 8 mm, and preferably 4 to 7 mm.
  • the diameter of the inner periphery of the lower end opening 113 is, for example, 2 to 7 mm, preferably 3 to 6 mm.
  • the size of the lid 12 is not particularly limited, and examples thereof include the following conditions.
  • the outer diameter of the grip portion 121 is, for example, 10 to 20 mm, and preferably 12 to 18 mm.
  • the outer diameter of the insertion portion 122 is, for example, 5 to 20 mm, and preferably 10 to 14 mm.
  • the height of the insertion part 122 is, for example, 2 to 10 mm, and preferably 4 to 6 mm.
  • the inner container 11 is placed inside the outer container 10. At this time, the outer peripheral surface of the lower end of the inner container 11 is in contact with the inner peripheral surface of the outer container 10.
  • the outer peripheral surface of the tapered portion 112 of the inner container 11 is in contact with the inner peripheral surface of the tapered portion 102 of the outer container 10.
  • the inner container 11 and the outer container 10 may be such that the outer peripheral surface of the lower end of the inner container 11 is in contact with the inner peripheral surface of the outer container 10.
  • the outer circumferential surface of the outer container 10 may not be in contact.
  • a centrifuge solution is injected into the inner container 11.
  • the lower end of the inner container 11 has an opening 113.
  • the centrifuge processing liquid injected into the inner container 11 is introduced into the accommodating part 103 of the outer container 10 through the opening 113.
  • the amount of the centrifugal treatment liquid is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the sizes of the outer container 10 and the inner container 11.
  • the centrifugal treatment liquid is, for example, 1 to 10 mL, preferably 2 to 5 mL.
  • a sample containing sperm is introduced into the inner container 11.
  • the sample is preferably overlaid on the centrifugal treatment liquid in the inner container 11.
  • Centrifugation conditions are not particularly limited, and are, for example, conditions of 1000 G (1000 ⁇ 9.80665 m / s 2 ) for 20 to 30 minutes.
  • sperm is separated from the sample, and sperm is precipitated from the opening 113 of the inner container 11 into the accommodating part 103 of the outer container 10. According to this example, physical stability is also excellent in centrifugation.
  • the inner container 11 After centrifugation, the inner container 11 is removed from the outer container 10 with the lid 12 attached.
  • the inside of the inner container 11 contains unnecessary materials of the sample.
  • the inside of the inner container 11 is in a liquid-tight state due to the attachment of the lid portion 12.
  • the inner container 11 can be taken out from the outer container 10 without liquid leaking from the inside of the inner container 11.
  • the centrifugal processing liquid containing sperm is collected in the accommodating portion 103 of the outer container 10.
  • the centrifuge processing liquid recovered in the storage unit 103 can be used as a sample of recovered sperm.
  • a swim-up method can also be performed.
  • a new inner container 11 is placed in the outer container 10. It is preferable to fill a new inner container 11 with a liquid that allows sperm to swim.
  • the inner container 11 can be disposed in the outer container 10 without the liquid leaking from the opening 113. .
  • leave it in this state As a result, sperm showing motility swims up from the housing portion 103 of the outer container 10 into the inner container 11 through the opening 113 of the inner container 11.
  • the separation container 1 has no gap between the outer peripheral surface of the opening 113 of the inner container 11 and the inner peripheral surface of the outer container 10, the sperm that has been swim-up can be efficiently contained inside the inner container 11. You can swim up.
  • the lid portion 12 is attached to the inner container 11 and the inner container 11 is taken out from the outer container 10 while maintaining the liquid-tightness of the inner container 11, so that only sperm showing motility can be collected.
  • the sperm inside the taken out inner container 11 may be recovered, for example, by removing the lid 12 from the inner container 11 to release the liquid-tightness, leading out the liquid from the inside, and collecting it in another container.
  • Centrifugation is usually performed by setting a separation container on a centrifugal rotor. At this time, when a gap is generated between the set separation container of the present example and the centrifugal rotor, an adjuster may be attached to the separation container.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of members constituting the separation container, in which (A) is an outer container, (B) is an inner container, and (C) is a lid.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the separation container.
  • the outer container 20 has a bottomed cylindrical shape having an opening 104 at the upper end, and includes a main body portion 101, a tapered portion 102, and a storage portion 103, and the upper end of the storage portion 103.
  • Protrusions 200 are circumferentially formed on the inner peripheral surface. The size of the protrusion 200 is not particularly limited.
  • 3B and 3C are the same as FIGS. 1B and 1C described above.
  • the inner container 11 is disposed inside the outer container 20, and the lid portion 12 is attached to the upper opening.
  • the protrusion 200 of the outer container 20 and the opening 113 at the lower end of the inner container 11 have the following forms, for example, as the diameters of the respective inner circumferences.
  • the first form is, for example, a form in which the diameter of the inner periphery of the protrusion 200 substantially matches the diameter of the inner periphery of the opening 113 of the inner container 11.
  • FIG. 5A is a cross-sectional view of the separation container 2 when the inner container 11 is disposed inside the outer container 20. As shown in FIG. 5A, the protrusion 200 and the opening 113 of the inner container 11 have substantially the same inner peripheral diameter.
  • the second form is, for example, a form in which the inner diameter of the protrusion 200 is larger than the inner diameter of the opening 113 of the inner container 11.
  • FIG. FIG. 5B is a cross-sectional view of the separation container 2 when the inner container 11 is disposed inside the outer container 20.
  • the inner peripheral diameter of the protrusion 200 is larger than the inner peripheral diameter of the opening 113 of the inner container 11.
  • the third form is, for example, a form in which the inner peripheral diameter of the protrusion 200 is smaller than the inner peripheral diameter of the opening 113 of the inner container 11. An example of this form is shown in FIG. FIG.
  • 5C is a cross-sectional view of the separation container 2 when the inner container 11 is disposed inside the outer container 20. As shown in FIG. 5C, the inner peripheral diameter of the protrusion 200 is smaller than the inner peripheral diameter of the opening 113 of the inner container 11.
  • the first embodiment illustrated in FIG. 5A and the second embodiment illustrated in FIG. 5B are preferable.
  • the liquid moves from the inside of the inner container 11 to the accommodating portion of the outer container 20
  • a non-flow channel can be configured.
  • the separation container is centrifuged and moved from the inside of the inner container to the housing part of the outer container, the physical load due to the target separation object coming into contact with the convex part can be suppressed.
  • the separation object is, for example, sperm
  • a decrease in the survival rate of sperm can be suppressed by reducing the physical load.
  • the sperm swims up from the container and the sperm having excellent motility is collected, for example, the first form illustrated in FIG. 5A and the example illustrated in FIG.
  • the third form is preferred. According to these aspects, for example, when the sperm moves from the inside of the housing part 103 of the outer container 20 to the inside of the inner container 11, the sperm swims up between the housing part 103 and the inner container 11. It is possible to configure a flow path that does not have a protruding convex portion. For this reason, the swim-up sperm can be efficiently led into the inner container 11.
  • the inner container 11 is disposed inside the outer container 20 as in the first embodiment. At this time, the end surface of the opening 113 at the lower end of the inner container 11 is in contact with the inner peripheral surface of the outer container 20, that is, the upper end surface of the protrusion 200.
  • the separation container 2 of this example can be used in the same manner as in the first embodiment.
  • Embodiment 3 The separation container of the present embodiment is an example of a form that can vary the capacity of the accommodating portion inside the outer container.
  • Embodiment 3-1 The outer container and the inner container constituting the separation container of this example are shown in FIGS. 6, 7 and 8 (the lid is not shown).
  • FIG. 6 is a schematic view of the outer container, in which (A) is a cross-sectional view of the outer container, (B) is a plan view of the upper part of the outer container, and (C) is a perspective view of the upper part of the outer container.
  • the outer container 30 has a bottomed cylindrical shape having an opening 304 at the upper end, and includes a main body 301, a tapered portion 302, and a tip 305.
  • four engaging grooves (recesses) 306a, 306b, 306c, and 306d are formed on the inner peripheral surface of the upper portion of the main body 301. Has been.
  • the groove portions 306a, 306b, 306c, and 306d are formed with different lengths from the end portion on the opening portion 304 side of the main body portion 301 toward the axial direction.
  • the length (depth) of each groove is set to be longer in the order of 306a, 306b, 306c and 306d.
  • the shape of the groove is not particularly limited, and examples thereof include a V shape in addition to the rectangular shape shown in FIG.
  • FIG. 7 is a schematic view of the inner container, (A) is a cross-sectional view, and (B) is a perspective view of the upper part of the inner container.
  • the inner container 31 has openings 314 and 313 at the upper end and the lower end, respectively, and includes a main body portion 311, a tapered portion 312, and a tip portion 317.
  • the inner container 31 has a protrusion 315 in a circumferential shape on the outer peripheral surface of the upper portion of the main body 311, and this is a grip portion of the inner container 31 as in the first embodiment.
  • the inner container 31 is further formed with an engaging protrusion (convex portion) 316 on the outer peripheral surface of the main body portion 311 and below the grip portion 315.
  • the shape of the protruding portion 316 is not particularly limited, and preferably corresponds to the shape of the groove portion of the outer container 30. For example, in addition to the rectangular shape as shown in FIG.
  • the engaging protrusion 316 of the inner container 31 is placed in one of the engaging grooves 306a, 306b, 306c, 306d of the outer container 30. Insert the outer container 30 and the inner container 31 into engagement.
  • the engaging protrusion 316 of the inner container 31 is preferably longer than the deepest engaging groove 306d.
  • the engaging grooves 306a, 306b, 306c, and 306d of the outer container have different lengths. For this reason, the arrangement
  • FIG. 8 is a cross-sectional view showing a state in which the inner container 31 is disposed inside the outer container 30.
  • FIG. 8A is a diagram illustrating the engagement protrusion 316 of the inner container 31 in the engagement groove 306 a of the outer container 30. The inserted state is shown, and (B) shows a state where the engaging protrusion 316 of the inner container 31 is inserted into the engaging groove 306 d of the outer container 30.
  • FIG. 8 when the protrusion 316 is inserted into the groove, the inner container 31 is inserted relatively shallowly into the outer container 30 as the length of the groove is shorter (FIG. 8).
  • the inner container 31 can be Further insertion into the inside of the container 30 can be sufficiently suppressed. Further, the engagement can sufficiently suppress the inner container 31 from rotating inside the outer container 30.
  • the size of the outer container 30 and the inner container 31 and each of these parts is not particularly limited, and for example, the illustration of the first embodiment can be used.
  • the size of the outer container 30 is not particularly limited, and examples thereof include the following conditions.
  • the internal height of the tip 305 is, for example, 4 to 20 mm, and preferably 5 to 15 mm.
  • the width of the engaging groove is, for example, 0.5 to 4 mm, and preferably 1.5 to 2.5 mm.
  • the length of the engaging groove is, for example, 1 to 20 mm, preferably 2 to 5 mm, and the length is preferably changed in each groove.
  • the number of engaging groove portions is not limited at all, and the lower limit is preferably 2, for example, more preferably 3, 4, and the upper limit is preferably 10, for example.
  • the size of the inner container 31 is not particularly limited, and examples thereof include the following conditions.
  • the width of the engaging protrusion is preferably smaller than the width of the engaging groove, for example, 0.4 to 3.9 mm, and preferably 1 to 2 mm.
  • the length of the engaging protrusion is preferably the same as or longer than the depth of the longest engaging groove, for example, 2 to 21 mm, and preferably 3 to 6 mm.
  • the size of the accommodating portion in the state in which the inner container 31 is disposed inside the outer container 30 is not particularly limited, and may be, for example, from the lower limit volume to the upper limit by combining the engaging groove portion and the engaging protrusion portion as described above. It is preferable that the volume can be changed stepwise.
  • the lower limit is, for example, 0.05 to 0.1 mL
  • the upper limit is, for example, 0.6 to 1.0 mL.
  • the number of the engaging protrusions of the inner container is not particularly limited.
  • the number of the engaging protrusions may be, for example, one or two or more, for example, 1 to 4, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2.
  • the stability of the inner container in the outer container can be further improved.
  • the engaging protrusions of the inner container are, for example, two engaging protrusions (protrusions) that are paired at opposing positions on the outer peripheral surface of the inner container. Part set).
  • the said engaging groove part of the said outer container is a pair of two engaging groove parts (groove part of a groove part) in the position which opposes in the internal peripheral surface of the outer container 30 so that it may correspond to the set of the said projection part, for example. It is preferable to have a plurality of sets.
  • FIG. 9 shows an example of the outer container and the inner container in this example.
  • 9A is a perspective view showing the upper part of the outer container
  • FIG. 9B is a perspective view showing the upper part of the inner container.
  • the outer container 40 has six groove portions (recess portions) 406a, 406b, 406c, 406a ', 406b' and 406c 'formed on the inner peripheral surface thereof.
  • the groove portions 406a and 406a ', 406b and 406b', and 406c and 406c ' are formed at opposing positions, respectively.
  • the groove portions 406a and 406a ', 406b and 406b', 406c and 406c ' have the same length, and are set to be longer in this order.
  • the inner container 41 has two engaging portions (convex portions) 416a and 416a ′ formed on the outer peripheral surface thereof at the opposite positions with the same length. ing.
  • the protrusions 416a and 416a 'of the inner container 41 may be inserted into the grooves 406a and 406a', 406b and 406b ', or 406c and 406c' of the outer container 40.
  • the accommodating portion formed by disposing the inner container 41 in the outer container 40 has a relatively small volume in the order of the grooves 406a and 406a ', 406b and 406b', and 406c and 406c '.
  • Embodiment 3-3 the shape of the engaging groove portion of the outer container can be exemplified by another form.
  • FIG. 10 shows another example of the outer container.
  • FIG. 10 is a perspective view of the upper part of the outer container.
  • the outer container 50 has a bottomed cylindrical shape having an opening at the upper end, and includes a main body portion 501, a tapered portion, and a tip portion.
  • six groove portions (concave portions) 506 a, 506 b, 506 c, 506 a ′, 506 b ′, and 506 c ′ are formed on the inner peripheral surface of the upper portion of the main body portion 501. Further, on the inner peripheral surface of the outer container 50, when the inner container is inserted into the outer container 50, the tip of the engaging projection of the inner container is guided to a desired groove.
  • a guide portion is formed. Specifically, guide portions 506ab and 506bc are provided between the groove portions 506a and 506b and between the groove portions 506b and 506c, respectively. Each of the guide portions 506ab and 506bc is preferably in a shape inclined toward a deeper groove portion. Similarly, the guide portions 506ab 'and 506bc' are also provided for the grooves 506a ', 506b' and 506c 'corresponding to the grooves 506a, 506b and 506c.
  • Embodiment 4 The separation container according to the present embodiment is an example of a form that prevents fluctuations in the liquid amount in the housing portion of the outer container after the inner container is taken out from the outer container.
  • the centrifugal processing liquid may enter the gap.
  • the centrifugal treatment liquid flows into the storage unit, for example, the collected sperm may be diluted and the concentration may be lowered. Therefore, the separation container according to the present embodiment is an example of a form that sufficiently prevents the change in the amount of liquid in the container due to the mixing of the centrifugal treatment liquid.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view of the outer container
  • (A) is a cross-sectional view in the axial direction of the outer container
  • (B) is a cross-sectional view in the II direction of the tip of the outer container in (A).
  • FIG. 12 is a cross-sectional view of the inner container
  • (A) is a cross-sectional view in the axial direction of the inner container
  • (B) is a cross-sectional view in the II-II direction of the tip of the inner container in (A).
  • FIG. 13 is a cross-sectional view of the separation container including the outer container and the inner container.
  • the outer container 60 has a bottomed cylindrical shape having an opening 604 at the upper end, and is composed of a main body 601, a tip 605, and a groove 606.
  • the front end portion 605 is cylindrical, and a circumferential groove 606 is formed by the circumferential side wall 607 and the side wall of the main body 601.
  • a side wall 607 serves as a partition wall and a groove 606 is formed concentrically around a cylindrical tip 605.
  • the inner container 61 has openings 614 and 613 at the upper end and the lower end, respectively, has a main body portion 611, a tapered portion 612, and a distal end portion 617, and surrounds the distal end portion 617.
  • a circumferential protrusion 618 is formed.
  • a circumferential projection 618 is formed around a cylindrical tip 617.
  • the inner container 61 in the outer container 60, it can be used as the separation container 6. As shown in FIG. 13, in the separation container 6, the distal end 605 of the inner container 61 is inserted into the distal end 605 of the outer container 60, and the accommodating part 603 is formed in the distal end 605 of the outer container 60. Further, the protrusion 618 of the inner container 61 is inserted into the groove 606 of the outer container 60.
  • Embodiment 5 The separation container according to this embodiment is an example of a form that prevents liquid inside the inner container from entering the inside of the outer container when the inner container is taken out from the outer container.
  • FIG. 14A is a cross-sectional view of the outer container.
  • the separation container of this example can be used by combining the outer container of FIG. 14A and the inner container of FIG. In FIG. 14A, the same portions as those in FIG.
  • the outer container 70 has a form in which the outer container in FIG. 3 (A) further has a one-way valve 701 in the opening on the upper side of the housing portion 103.
  • the valve 701 allows the liquid to pass from the upper direction to the lower direction by pressure change such as centrifugation. Therefore, only while the inner container 11 shown in FIG. 3B is placed inside the outer container 70 and centrifugation is performed, the inner container 11 passes through the one-way valve 701 to the housing portion 103 of the outer container 70. Liquid is introduced.
  • the liquid After the centrifugal separation, for example, even when the liquid falls from the lower opening 113 of the inner container 11, the liquid is prevented from being mixed into the accommodating portion 103 of the outer container 70 via the one-way valve 701. it can.
  • the liquid present on the upper portion of the one-way valve 701 can be easily removed with a spoid or the like, and thereafter, the recovered liquid in the storage unit 103 can be collected.
  • FIG. 14B is a cross-sectional view of the inner container.
  • the separation container of this example can be used by combining, for example, the outer container of FIG. 3A and the inner container of FIG. In FIG. 14B, the same parts as those in FIG.
  • the inner container 71 has a form in which the inner container of FIG. 3 (B) further has a one-way valve 701 at the opening 113 at the tip.
  • the housing portion 103 of the outer container 20 from the inner container 71 is interposed via the one-way valve 701 only while the inner container 71 is placed and centrifuged in the outer container 20 of FIG. The liquid is introduced into the.
  • the one-way valve 701 is mounted, so that it is possible to prevent liquid from leaking from the opening 113 of the inner container 71 to the outside.
  • the separation accuracy can be further improved.
  • the type of one-way valve is not limited at all, and examples thereof include a duckbill type and an umbrella type, and the former is preferable.
  • Embodiment 6 The separation container of this embodiment is an example of a form that reduces physical damage due to a load applied during centrifugation.
  • FIG. 15 shows an outer container constituting the separation container of this example.
  • 15A is a plan view of the distal end portion of the outer container
  • FIG. 15B is a cross-sectional view of the outer container.
  • the outer container 80 is a form in which the outer container of FIG. 6 (A) further has a rib 81 on the outer peripheral surface of the tip.
  • the outer container preferably has a smaller volume of the accommodating portion. Therefore, as illustrated in, for example, FIG.
  • tip part can be reduced by arrange
  • the rib conditions such as size, number and shape are not particularly limited.
  • the number of ribs is not particularly limited, and is preferably 2 or more, for example.
  • the ribs are preferably arranged at equal intervals radially on the outer peripheral surface.
  • Embodiment 7 This embodiment illustrates the state of contact between the lower end of the inner container and the outer container.
  • the outer peripheral surface of the outer container and the inner peripheral surface of the outer container may be non-contact, for example.
  • An example of the separation container of this form is shown in the sectional view of FIG. 16A is a cross-sectional view of the separation container, and FIG. 16B is a cross-sectional view in the III-III direction of (A).
  • the outer peripheral surface of the inner container 11 and the inner peripheral surface of the outer container 10 may be non-contact.
  • a gap 105 may be provided between the inner container 11 and the outer container 10.
  • the distance between the outer peripheral surface of the inner container 11 and the inner peripheral surface of the outer container 10 is preferably 200 ⁇ m or less, and more preferably 100 ⁇ m or less, as described above. More preferably, it is 50 ⁇ m or less.
  • the inner container 11 and the outer container 10 May be non-contact.
  • Embodiment 8 This embodiment illustrates the state of contact between the lower end of the inner container and the outer container.
  • the outer peripheral surface of the inner container and the inner peripheral surface of the outer container may be in partial contact, for example.
  • An example of this type of separation container is shown in the cross-sectional view of FIG. 17 (A) and 17 (B) are cross-sectional views in the III-III direction of the separation container of FIG. 16 (A).
  • the outer peripheral surface of the inner container 11 has protrusions (116a, 116b, 116c, 116d), and these protrusions are in contact with the inner peripheral surface of the outer container 10.
  • the inner peripheral surface of the outer container 10 has protrusions (106a, 106b, 106c, 106d), and these protrusions contact the outer peripheral surface of the inner container 11. ing.
  • FIG. 18A is a perspective view showing an outline of the distal end portion of the inner container
  • FIG. 18B is a separation of FIG. 16A related to the separation container provided with the inner container of FIG.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of the container in the III-III direction.
  • the inner container 11 has a protruding rib 16 on the outer peripheral surface of the tip. Then, as shown in FIG. 18B, in the separation container, the inner container 11 and the outer container 10 are in contact via the ribs 16. Since the rib 16 has not a circumferential shape but a deletion portion, a void 105 is formed in the deletion portion.
  • the rib 16 is provided at the tip of the inner container 11, but the present invention is not limited to this. For example, a rib may be formed on the outer peripheral surface above the tip.
  • the outer peripheral surface of the inner container 11 has the rib 16, but is not limited thereto, and the rib 16 may be formed on the inner peripheral surface of the outer container 10.
  • FIG. 19A and 19B are cross-sectional views in the III-III direction of the separation container of FIG.
  • the inner container 11 has an elliptical cylindrical shape, and is in contact with the inner peripheral surface of the outer container 10 at the outer peripheral surfaces at both ends in the longitudinal direction in the direction perpendicular to the axis. Also good.
  • the inner container 11 is arranged non-coaxially in the outer container 10, and a part of the outer peripheral surface is in contact with the inner peripheral surface of the outer container 10, The corresponding outer peripheral surface may be non-contact with the inner peripheral surface of the outer container 10.
  • Example 1 In this example, using the separation container of the present invention, the precipitate fraction containing sperm was collected by centrifugation, and the recovery rate of viable sperm was confirmed.
  • the separation container shown in FIGS. 3 and 4 was produced.
  • the size of the separation container was as follows.
  • Outer container 20 Total volume: 9.85 mL Overall internal height: 85mm
  • the height of the main body 101 60 mm Tapered portion 102 height: 14 mm Height of housing part 103: 12 mm
  • Diameter of opening 104 14.5 mm
  • Diameter of the inner circumference at the upper end of the tapered portion 102 12.41 mm
  • Inner diameter of the lower end of the tapered portion 102 7.2 mm
  • Diameter of the inner periphery of the protrusion 200 6.2 mm
  • Inner height of housing 103 11 mm
  • Inner container 11 Total volume: 7.7 mL
  • Diameter of outer periphery of upper end opening 114 16.3 mm Dia
  • the inner container 11 is arranged inside the outer container 20.
  • Percoll trade name Percoll, manufactured by GE Healthcare Japan
  • the lid 12 was attached to the opening 114 of the inner container 11 and centrifuged at 700 G (700 ⁇ 9.80665 m / s 2 ) for 30 minutes. After centrifugation, the inner container 11 was taken out from the outer container 20 with the lid 12 attached. And about the percoll liquid (total amount 300 microliters) in the outer container 20, the viable sperm, the dead cell, and the impurity were measured by flow cytometry, and each ratio (%) was computed.
  • a centrifuge tube having a capacity of 15 mL (product name: 15 mL centrifuge tube, manufactured by Corning), a nozzle (product name: ART Capillal, manufactured by Nipro), and a syringe (product name: JMS) Syringe JMS Co., Ltd.) was used as a separation container.
  • the nozzle was arranged inside the centrifuge tube so that its tip was located at the bottom.
  • the percoll was introduced into the centrifuge tube. Specifically, first, 1.5 mL of 90% percoll was introduced, and 1.5 mL of 45% percoll was laminated thereon. Furthermore, 0.28 mL of the semen was overlaid on the percoll.
  • the centrifuge tube was capped and centrifuged as in Example 1. After centrifugation, the lid is removed, the syringe is set at the rear end of the nozzle disposed in the centrifuge tube, and 0.3 mL of Percoll solution is added through the nozzle from the bottom of the centrifuge tube. It was aspirated as a precipitate fraction containing sperm. With respect to the collected Percoll solution, in the same manner as in Example 1, viable sperm, dead cells and impurities were measured, and the respective percentages (%) were calculated.
  • a centrifuge tube having a capacity of 15 mL (trade name: 15 mL centrifuge tube, manufactured by Corning) and a pipette were used as a separation container.
  • Percoll was introduced into the centrifuge tube. Specifically, first, 1.5 mL of 90% percoll was introduced, and 1.5 mL of 45% percoll was laminated thereon. Furthermore, 0.28 mL of the semen was overlaid on the percoll. Then, the centrifuge tube was capped and centrifuged as in Example 1.
  • Example 2 In this example, using the separation container of the present invention, the precipitate fraction containing sperm was recovered by centrifugation, and the reproducibility of the recovery rate of viable sperm was confirmed.
  • Example 1 As the separation container, the separation container of Example 1 and the separation container of Comparative Example 1-2 were used. As the sperm, fresh pig semen was used. And three experimenters inexperienced in sperm separation operation separated live sperm from the sperm using each separation container.
  • the separation method was performed in the same manner as in Example 1 and Comparative Example 1-2 according to each separation container except that the conditions for Percoll were changed as follows. Percoll conditions were (1) 90% percoll 1.5 mL introduced, 45% percoll 1.5 mL laminate, (2) 80% percoll 1.5 mL introduced, 50% percoll 1.5 mL laminate, ( 3) An introduction of 3.0 mL of 80% percoll was made.
  • Example 2 After separation, as in Example 1, the viable sperm in the sperm before centrifugation and the viable sperm in the percoll solution (total volume 300 mL) in the outer container after centrifugation were measured by flow cytometry. The latter ratio in the case of 1 was determined as the concentration ratio. And about each condition, the average value was computed about the result of the concentration rate of three experimenters.
  • the vertical axis represents the average concentration rate of viable sperm.
  • 90% -45% indicates the Percoll condition (1)
  • 80% -50% indicates the Percoll condition (2)
  • 80% indicates the Percoll condition (3).
  • two bars indicate the results of the separation container of Comparative Example 1-2 and the separation container of Example 1 from the left.
  • the highest concentration rate was realized under any Percoll condition.
  • the variation among the experimenters was extremely small as compared with the separation container of Comparative Example 1-2. From these results, it was found that according to the separation container of the present invention, viable sperm can be recovered in a highly reproducible and efficient manner regardless of whether the operator is an expert or not.
  • Example 3 In this example, the motility rate of sperm collected using the separation container of the present invention was confirmed.
  • the separation container of Example 1 As the separation container, the separation container of Example 1, the separation container of Comparative Example 1-1, and the separation container of Comparative Example 1-2 were used. Then, five human semen samples were prepared in the same manner as in Example 1, Comparative Example 1-1, and Comparative Example 1-2, depending on each separation container.
  • the motility rate and the high-speed forward motility rate of the collected spermatozoa are shown in the WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen FIFTH EDITION (2010) (Japanese version: WHO Semen Inspection Lab Manual 5th edition (2010)). Then, for each separation container, the average value of 5 samples was obtained, and these results are shown in Table 2. As shown in Table 2, the sperm collected in the separation container of Example 1 was The results showed superior results compared to the comparative example, especially the high-speed forward movement rate, which was much superior to the comparative example, and according to these results, the separation container of the example affected the sperm. It was found that viable sperm could be recovered without giving.
  • a separation object to be precipitated can be accommodated in the accommodation portion of the outer container through the tip opening at the lower end of the inner container by centrifugation. And since the inside of the said inner container can be made into a liquid-tight state by mounting

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Abstract

　不要な成分の混入を防止でき、効率よく分離対象物を分離可能な分離容器を提供する。　試料から分離対象物を分離するための分離容器であって、外容器、内容器および蓋部を有し、 前記外容器は、上端が開口し、下端が閉口した有底筒状であり、 前記内容器は、上端および下端が開口した筒状であり、 前記外容器および前記内容器は、それぞれの上下の方向を揃えた状態で、前記外容器の内部に前記内容器が配置可能であり、 前記外容器の内部に前記内容器を配置した状態で、前記外容器の内部において、配置された前記内容器よりも下方の領域が、前記試料からの沈殿物の収容部であり、 前記蓋部は、前記内容器の上端の開口部に、脱着可能であり、 前記蓋部を前記内容器の前記開口部に装着した際、前記内容器の内部が液密状態となることを特徴とする。

Description

分離容器および分離方法
　本発明は、分離容器および分離方法に関する。
　不妊症は、男性側に原因があると考えられるケースが５０％以上を占める。男性不妊症は、例えば、精液中の精子濃度が低い乏精子症、精子の運動能力が乏しい精子無力症等があげられる。このようなケースには、例えば、精液から回収した精子を使用する、人工授精法、体外受精法および顕微授精法等の生殖補助医療が適用されている。
　精子サンプルの調製方法は、密度勾配遠心による分離法（密度勾配遠心法）および精子の運動性を利用した分離法（スイムアップ法）があげられる。前者は、まず、遠沈管にパーコールを入れ、前記パーコールに精液を重層し、遠心分離を行う。これによって密度勾配が形成され、精子は、最下層に分離される。前記遠沈管の上部からピペットを挿入して、前記最下層の画分を採取することにより、精子サンプルが得られる。後者は、まず、遠心分離によって、精液を、精漿を含む上層と固形物の濃度が高い下層とに分離する。前記下層には、精子が含まれる。つぎに、培地を入れた容器の底部に、前記固形物を沈める。この際、運動性を有する成熟精子は、直線運動により、前記底部から前記培地の上部に、泳いで浮かび上がってくる。そこで、前記培地の上層を回収することによって、成熟精子が得られる。
　しかしながら、前者の密度勾配遠心法は、前記ピペットを上部から下層に挿入するため、前記パーコールの中層付近に存在する成分が前記ピペットに付着する。このため、採取した精子サンプル中に、不要な成分が混入するという問題がある。前記中層付近には、精漿または精巣組織成分が存在し、細菌またはウイルスが存在する場合もある。精漿等の混入は、精子サンプルにおける精子の希釈化につながり、精子の運動性に影響を及ぼすおそれがある。細菌等の混入は、受精卵および胎児の安全性に影響を及ぼすおそれがあり、また、精子の調製を行う操作者の安全性にも影響を及ぼすおそれがある。また、同じ理由により、後者のスイムアップ法も、同様の影響を及ぼすおそれがある。このような問題を解決するために、以下のような精子採取用具が提案されている。
　特許文献１には、遠沈管の中に採取管を配置した採取用具が開示されている。前記採取管は、その先端が、前記遠沈管の底部に達する状態で、前記遠沈管に配置される。そして、前記遠沈管に、パーコールおよび精液を入れ、遠心分離を行う。前記遠心分離後、前記採取管にシリンジを接続し、前記遠沈管の底部に沈殿した精子を吸引して採取する。しかしながら、前記採取用具は、前記採取管の先端が、前記遠沈管の底部に位置しているため、遠心分離時に、前記採取管の先端によって、精子が物理的損傷を受けるおそれがある。
　特許文献２には、軸方向において、隔壁により、内部が試料導入室と分離対象物の回収室とに区画された用具が開示されている。前記用具において、前記隔壁は、前記試料導入室と前記回収室とを下部で連通可能とする貫通孔を有する。この用具を用いた密度勾配遠心法は、以下のように行われる。まず、前記試料導入室と前記回収室とにパーコールを導入し、前記試料導入室には、さらに、精液を重層する。つぎに、遠心分離によって、精子を、前記試料導入室の下部に沈殿させる。この際、前記試料導入室と前記回収室は、下部の前記貫通孔で連通しているため、沈殿した精子は、前記貫通孔を通じて、前記回収室に移動する。そして、前記回収室にピペットを挿入して、パーコール液を採取する。前記回収室には、精子のみが移動するため、不純物が混入していない精子サンプルが得られる。しかしながら、この用具は、軸方向において、前記試料導入室と前記回収室とに区画されているため、前記試料導入室に十分な容積を確保できず、また、前記回収室にピペットを挿入し難い場合がある。
　また、特許文献２には、容器本体の内部に、前記試料導入室となるアタッチメントが配置された用具が開示されている。前記容器本体に前記アタッチメントを配置すると、前記アタッチメントの側壁により、軸方向において、前記容器本体の内部が、前記試料導入室と前記回収室とに区画される。すなわち、前記アタッチメントの内部は、前記試料導入室となり、前記容器本体の内部の残りの領域は、前記回収室となる。前記アタッチメントの側壁は、その下部に貫通孔を有している。この用具を使用する場合、遠心によって、前記試料導入室内部で精子が沈殿すると、前記貫通孔を通じて、前記試料導入室から前記回収室に、精子が移動する。遠心後、前記アタッチメントの内部の液密性を保持した状態で、前記アタッチメントを前記容器本体から取り出せば、前記容器本体の内部には、精子を含むパーコールのみが存在することとなる。このため、前記アタッチメントを取り外すだけで、不純物が混入していない精子サンプルが得られる。しかしながら、遠心前、前記回収室にも、多量のパーコールが導入される。このため、遠心後、前記容器本体に残る精子サンプルは、精子の濃度が低いという問題がある。また、パーコールは、比較的高価であるため、コストの問題もある。
　このような問題は、精子サンプルの調製だけでなく、遠心分離により試料から分離対象物を分離する分野においても共通する。
特開２００４－３１３５００号公報 特開２００９－１１９４５７号公報
　そこで、本発明は、不要な成分の混入を防止でき、効率よく分離対象物を分離可能な分離容器の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明の分離容器は、
試料から分離対象物を分離するための分離容器であって、
外容器、内容器および蓋部を有し、
前記外容器は、
　上端が開口し、下端が閉口した有底筒状であり、
前記内容器は、
　上端および下端が開口した筒状であり、
前記外容器および前記内容器は、それぞれの上下の方向を揃えた状態で、前記外容器の内部に前記内容器が配置可能であり、
前記外容器の内部に前記内容器を配置した状態で、
　前記外容器の内部において、配置された前記内容器よりも下方の領域が、前記試料からの沈殿物の収容部であり、
前記蓋部は、
　前記内容器の上端の開口部に、脱着可能であり、
前記蓋部を前記内容器の前記開口部に装着した際、前記内容器の内部が液密状態となることを特徴とする。
　本発明の分離方法は、試料から分離対象物を分離する分離方法であって、
前記本発明の分離容器を使用し、下記の（Ａ１）から（Ｄ１）の工程を有することを特徴とする。
（Ａ１）前記外容器の内部に前記内容器を配置し、前記内容器の内部および前記外容器の前記収容部に、遠心処理液を充填する工程
（Ｂ１）前記（Ａ１）工程後、前記内容器の内部に、前記試料を導入する工程
（Ｃ１）前記（Ｂ１）工程後、前記分離容器を遠心分離に供して、前記試料由来の沈殿物を、前記外容器の前記収容部に収容する工程
（Ｄ１）前記（Ｃ１）工程後、前記内容器に前記蓋部を装着した状態で、前記外容器から前記内容器を取り出す工程
　本発明の分離容器によれば、例えば、遠心分離によって、沈殿する分離対象物を、前記内容器から、その下端の先端口を通じて、前記外容器の前記収容部に収容できる。そして、前記内容器は、前記蓋部の装着により液密状態となるため、前記内容器を取り外すだけで、前記外容器に分離対象物を回収できる。また、本発明の分離容器によれば、前記収容部の大きさは、任意に設計できる。このため、前記収容部を小型化することによって、前記内容器を取り外した後、前記外容器の内部に残る液量を、任意の量、例えば、少量に設定可能となる。前記液量が相対的に少量であれば、分離対象物が相対的に高濃度であるサンプルが得られる。また、これにともない、使用する遠心処理液の量も低減できるため、例えば、パーコールを使用する場合、低コスト化が可能である。
図１は、本発明の分離容器の構成部材の一例を示す断面図であり、（Ａ）は外容器、（Ｂ）は内容器、（Ｃ）は蓋部の断面図である。 図２は、本発明の分離容器の一例を示す断面図である。 図３は、本発明の分離容器の構成部材の一例を示す断面図であり、（Ａ）は外容器、（Ｂ）は内容器、（Ｃ）は蓋部の断面図である。 図４は、本発明の分離容器の一例を示す断面図である。 図５（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、本発明の分離容器の一例を示す断面図である。 図６は、本発明における外容器の一例を示す概略図であって、（Ａ）は断面図、（Ｂ）はその上部の平面図、（Ｃ）は前記上部の斜視図である。 図７は、本発明における内容器の一例を示す概略図であって、（Ａ）は断面図、（Ｂ）はその上部の斜視図である。 図８は、本発明の分離容器の一例を示す概略図であって、（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ外容器の異なる溝部に、内容器に突起部を挿入した状態を示す断面図である。 図９は、本発明における構成部材の一例を示す概略図であり、（Ａ）は外容器の上部を示す斜視図であり、（Ｂ）は内容器の上部を示す斜視図である。 図１０は、本発明における外容器の一例を示す斜視図である。 図１１は、本発明における外容器の一例を示す概略図であり、（Ａ）は軸方向における断面図、（Ｂ）は前記（Ａ）のＩ－Ｉ方向断面図である。 図１２は、本発明における内容器の一例を示す概略図であり、（Ａ）は軸方向における断面図、（Ｂ）は前記（Ａ）のII－II方向断面図である。 図１３は、本発明の分離容器の一例を示す断面図である。 図１４は、本発明における構成部材の一例を示す概略図であり、（Ａ）は外容器の断面図、（Ｂ）は内容器の断面図である。 図１５は、本発明における外容器の一例を示す概略図であり、（Ａ）はその先端部の平面図であり、（Ｂ）は外容器の断面図である。 図１６は、本発明の分離容器の一例を示す概略図であって、（Ａ）は、軸方向断面図、（Ｂ）は、前記（Ａ）のIII－III方向断面図である。 図１７は、本発明の分離容器の一例を示す概略図であって、（Ａ）は、内容器が突起部を有する分離容器の断面図、（Ｂ）は、外容器が突起部を有する分離容器の断面図である。 図１８は、本発明の分離容器の一例を示す概略図であって、（Ａ）は、リブを備える内容器の先端を示す斜視図、（Ｂ）は、前記（Ａ）の内容器を有する分離容器の断面図である。 図１９は、本発明の分離容器の一例を示す概略図であって、（Ａ）は、楕円状の内容器を有する分離容器の断面図、（Ｂ）は、内容器が一方に偏って配置された分離容器の断面図である。 図２０は、本発明の実施例２において回収した生存精子の平均濃縮率を示すグラフである。
分離容器
　本発明の分離容器は、前述のように、試料から分離対象物を分離するための分離容器であって、
外容器、内容器および蓋部を有し、
前記外容器は、
　上端が開口し、下端が閉口した有底筒状であり、
前記内容器は、
　上端および下端が開口した筒状であり、
前記外容器および前記内容器は、それぞれの上下の方向を揃えた状態で、前記外容器の内部に前記内容器が配置可能であり、
前記外容器の内部に前記内容器を配置した状態で、
　前記外容器の内部において、配置された前記内容器よりも下方の領域が、前記試料からの沈殿物の収容部であり、
前記蓋部は、
　前記内容器の上端の開口部に、脱着可能であり、
前記蓋部を前記内容器の前記開口部に装着した際、前記内容器の内部が液密状態となることを特徴とする。
　前記外容器および前記内容器は、それぞれ筒状であり、特に、円筒状が好ましい。
　本発明の分離容器は、例えば、前記外容器の内部に前記内容器を配置した状態で、前記内容器の下端は、その先端口の端面およびその先端の外周面の少なくとも一方が、前記外容器の内周面に接触していることが好ましい。このように、前記内容器の下部で、前記外容器と接触させることにより、例えば、遠心時において、前記内容器にかかる物理的負荷を、低減できる。
　前記内容器の下端は、その先端口の端面が、前記外容器の内周面に接触してもよく、その先端の外周面が、前記外容器の内周面に接触してもよく、両方が、前記外容器の内周面に接触してもよい。
　このように、前記内容器の下端が、前記外容器の内周面に接触することで、例えば、さらに、以下のような効果が得られる。すなわち、本発明の分離容器は、例えば、スイムアップ法による精子の分離にも適している。スイムアップ法の場合、例えば、前記外容器の前記収容部に精子を配置し、前記内容器の内部に、精子が遊泳可能な液体を導入する。運動性を示す良好な精子は、直線運動により、前記収容部から、前記内容器の下端の開口部を通じて、前記内容器の内部に浮かび上がってくる。本発明の分離容器は、前述のように、前記内容器の下端が、前記外容器の内周面に接触している。このため、前記収容部から浮かび上がった精子は、前記開口部を通じて、効率良く前記内容器の内部に誘導される。このため、運動性能を示す精子を、優れた回収率で回収できる。
　前記内容器の下端は、例えば、その先端口の端面の全体が、前記外容器の内周面に接触してもよいし、前記端面の部分領域が、前記外容器の内周面に接触してもよい。後者の場合、例えば、前記外容器と接触する箇所は、１ヶ所でもよいし、２カ所以上でもよい。
　前記内容器の下端は、例えば、その先端の外周面の全体が、前記外容器の内周面に接触してもよいし、前記端面の部分領域が、前記外容器の内周面に接触してもよい。後者の場合、例えば、前記外容器と接触する箇所は、１ヶ所でもよいし、２カ所以上でもよい。
　前記内容器は、例えば、その先端の外周面に、突起部を有してもよい。この場合、前記内容器の下端は、前記突起部において、前記外容器の内周面に接触してもよい。前記内容器において、前記突起部は、特に制限されず、例えば、１個または２個以上でもよい。
　前記外容器は、例えば、前記収容部の上端部の内周面に、突起部を有してもよい。この場合、前記内容器の下端は、前記先端口の端面またはその先端の外周面の少なくとも一方において、前記外容器の前記突起部と接触してもよい。前記外容器において、前記突起部は、特に制限されず、例えば、１個または２個以上でもよい。
　前記外容器は、例えば、前記収容部の上端部の内周面に、周状に突起部を有してもよい。具体的には、例えば、前記収容部を形成する側壁が周状の突起部となり、前記収容部の外周に、周状の溝部が形成されてもよい。この場合、前記内容器の下端は、前記先端口の端面が、前記突起部に接触してもよく、具体的には、前記突起部の内表面に接触してもよい。本発明において、前記外容器の内周面は、例えば、前記突起部を有する場合、前記突起部の表面を含む。
　前記外容器と前記内容器とは、例えば、前記外容器に前記内容器を配置した際、両者を係合可能な凹部（例えば、溝部）と凸部（突起部）を、それぞれ対応する箇所に有してもよい。前記凹部および前記凸部を備えることによって、例えば、前記内容器を前記外容器に装着した際、より安定な装着性が実現できる。さらに、例えば、前記内容器を前記外容器に装着する際、前記凹部と前記凸部との係合を、操作する者の手指による触覚的感覚で、認知できることから、さらに操作性を向上できる。
　前記内容器の下端は、前述のように、前記外容器の内周面に接触している。前記内容器の下端と、前記外容器の内周面とは、前述のように、部分的に接触してもよく、これによって、前記内容器の下端と、前記外容器の前記収容部の上端との境において、例えば、前記内容器の外周面と前記外容器の内周面との間には、間隙が存在してもよいし、間隙が存在しなくてもよく、後者が好ましい。また、前者の場合、前記間隙は、例えば、精子が通過できない間隙であることが好ましい。前記間隙であれば、例えば、前記外容器の前記収容部から精子がスイムアップする際、前記精子を効率良く前記内容器の内部に導くことができる。前記精子が通過できない間隙とは、特に制限されない。前記間隙は、例えば、軸に対する垂直方向において、前記内容器の下端の外周面と、それに対面する前記外容器の内周面との距離が、２００μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１００μｍ以下であり、さらに好ましくは５０μｍ以下である。
　前記内容器は、その外周面がテーパー状であるテーパー部を有してもよい。前記テーパー部は、例えば、全体的または部分的に、前記外容器の内周面に接触してもよい。また、前記内容器は、前記テーパー部の内周面が、前記外周面と同様に、テーパー状であってもよい。前記内容器において、前記テーパー部の位置は、特に制限されず、例えば、下方向があげられ、下端でもよい。また、前記内容器は、例えば、テーパー部の下方向に、円筒状の先端部を有してもよい。
　前記外容器は、その内周面がテーパー状であるテーパー部を有してもよい。前記外容器において、前記テーパー部の位置は、特に制限されず、例えば、前記収容部の上方向があげられ、前記収容部の上端部に連結してもよい。この場合、前記外容器の内部に前記内容器を配置した状態で、前記内容器の前記テーパー状の外周面は、例えば、全体的または部分的に、前記外容器のテーパー状の内周面に接触してもよい。また、前記外容器において、前記テーパー部は、例えば、その外周面が、前記内周面と同様に、テーパー状であってもよい。
　前記内容器は、例えば、さらに、その上端の外周面に、周状に突起部を有してもよい。前記突起部は、例えば、前記外容器の内部に挿入されず、前記外容器の開口部上に露出していることが好ましい。前記突起部は、例えば、前記内容器の把持部となる。また、前記突起部により、例えば、前記上端において、前記外容器と前記内容器との間隙を閉塞することが好ましい。
　前記蓋部は、前記内容器の上端の開口部に装着することにより、前記開口部を閉塞可能である。前記蓋部は、例えば、前記外容器の内部に配置した前記内容器への装着により、前記外容器の上端の開口部も閉塞することが好ましい。前記蓋部は、例えば、前記内容器と連結された形態でもよいし、前記内容器とは別個の部材であり、使用時に前記内容器に装着する形態でもよい。前記蓋部は、例えば、前記外容器と連結された形態でもよい。前記蓋部の装着形態は、特に制限されず、例えば、螺合、咬合、嵌合、圧接等があげられる。
　前記外容器の内周面および前記内容器の外周面は、例えば、いずれか一方が、突起部（凸部）を有し、他方が、前記突起部と係合可能な溝部（凹部）を有することが好ましい。前記突起部と前記溝部は、例えば、前記外容器の内部に前記内容器を係止可能であることが好ましく、それぞれ、例えば、係合用突起部および係合用溝部という。前記外容器および前記内容器は、例えば、いずれが前記突起部を有してもよく、いずれが前記溝部を有してもよい。前記突起部と前記溝部は、前記外容器の内部に前記内容器を配置する際、例えば、両者が係合できる部位に配置されている。具体例として、前記外容器の内周面に前記溝部を有し、前記内容器の外周面に前記突起部を有してもよいし、前記外容器の内周面に前記突起部を有し、前記内容器の外周面に前記溝部を有してもよい。前記突起部および前記溝部の形状および数は、特に制限されない。
　前記溝部と前記突起部は、例えば、軸方向に設けられていることが好ましい。前記外容器の上方の開口部から、その内部に、前記内容器を挿入する際、前記軸方向に設けられた溝部に、前記軸方向に設けられた突起部を挿入することで、前記外容器と前記内容器とを係合することが好ましい。前記外容器は、例えば、深さが異なる溝部を複数有してもよい。この場合、前記内容器は、最も深い溝部に挿入可能な長さの突起部を有することが好ましい。前述のように、外容器が、深さが異なる溝部を複数有する場合、いずれの前記溝部に前記突起部を挿入するかによって、前記外容器の内部への前記内容器の挿入の深さ、すなわち、前記外容器の内部において、軸方向における前記内容器の位置を調節できる。なお、前述のように、前記外容器が前記突起部を有し、前記内容器が前記溝部を有してもよい。
　前記外容器は、例えば、前記外容器が、前記収容部の外側に、同心円状の溝部を有し、前記内容器は、例えば、前記先端の外側に、同心円状の突起部を有することが好ましい。そして、前記外容器の内部に、前記内容器を配置する際、前記外容器の前記溝部に、前記内容器の前記突起部が挿入可能であることが好ましい。前記外容器における前記溝部は、前記収容部の外壁と前記外容器の外壁とによって形成されていることが好ましい。このように、前記外容器において、前記収容部の外側に前記溝部を有することで、例えば、前記外容器の上部に付着した液体が、前記外容器の内壁を伝って流れ落ちる場合でも、前記溝部に前記液体を収容でき、前記収容部への混入を防止できる。これによって、例えば、前記外容器から前記内容器をとりはずした際、前記収容部における液量の増加を十分に防止できる。
　前記分離容器を形成するための材料は、特に制限されない。前記材料は、例えば、合成樹脂材料、金属材料、ガラス材料等があげられる。これらの中でも、例えば、成形性、組立性、必要に応じて接着性等の材料の加工性；添加物の試料への溶出等の衛生面；視認性等の機能性；コスト面等の観点から、前記合成樹脂材料が好ましい。前記材料は、例えば、フッ素樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリウレタン、ポリメチルペンテン、メタクリル、ＡＢＳ（アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン共重合体）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ポリ塩化ビニル、シリコーン、エチレン酢酸ビニル共重合体、合成ゴム、各種エラストマー等の合成樹脂があげられ、これらの中でも、フッ素樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネートが好ましい。前記フッ素樹脂は、例えば、疎水性フッ素樹脂が好ましく、特に、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）が好ましい。
　本発明の分離容器の用途は、特に制限されない。本発明の分離容器は、例えば、試料からの精子の分離用であることが好ましい。本発明の分離容器を、試料からの精子の分離に用いる場合、その分離方法は、特に制限されず、例えば、密度勾配遠心法、スイムアップ法等に適用できる。本発明の分離容器を密度勾配遠心法に使用する場合、精子の分離以外にも、例えば、細胞小器官の分離、ＤＮＡまたはＲＮＡの分離、血液の特定成分（例えば、赤血球、単核球、血漿）の分離等にも使用可能である。前記試料は、特に制限されず、前記分離対象物を含む試料があげられ、具体例としては、精液、血液等があげられる。
分離方法
　本発明の分離方法は、試料から分離対象物を分離する分離方法であって、
前記本発明の分離容器を使用し、
下記の（Ａ１）から（Ｄ１）の工程を有することを特徴とする。
（Ａ１）前記外容器の内部に前記内容器を配置し、前記内容器の内部および前記外容器の前記収容部に、遠心処理液を充填する工程
（Ｂ１）前記（Ａ１）工程後、前記内容器の内部に、前記試料を導入する工程
（Ｃ１）前記（Ｂ１）工程後、前記分離容器を遠心分離に供して、前記試料由来の沈殿物を、前記外容器の前記収容部に収容する工程
（Ｄ１）前記（Ｃ１）工程後、前記内容器に前記蓋部を装着した状態で、前記外容器から前記内容器を取り出す工程
　前記遠心処理液は、特に制限されず、例えば、試料および分離対象物の種類に応じて適宜決定できる。前記遠心処理液は、例えば、密度勾配担体、培地、緩衝液等があげられる。前記密度勾配担体は、例えば、比重調整剤ということもできる。前記密度勾配担体は、特に制限されず、例えば、パーコール、修飾コロイドシリカ、ショ糖重合体、フィコール等があげられる。前記パーコールは、通常、ポリビニルピロリドン皮膜を持つコロイド状シリカゾルである。前記パーコールは、例えば、エンドトキシンを除去した後、前記培地を添加して等張化したパーコールが好ましい。パーコールの濃度は、特に制限されず、例えば、９０～９８％が好ましい。前記培地は、例えば、分離対象物が精子の場合、ＨＥＰＥＳ含有液等があげられる。
　前記（Ａ１）工程において、前記外容器の内部への前記内容器の配置と、前記遠心処理液の充填は、順序は制限されない。前記（Ａ１）工程は、例えば、下記（Ａ１－１）工程および（Ａ１－２）工程のいずれでもよい。
（Ａ１－１）前記外容器の内部に前記内容器を配置した後、前記内容器の内部に前記遠心処理液を導入することで、前記内容器の内部および前記外容器の前記収容部に、前記遠心処理液を充填する工程
（Ａ１－２）前記外容器の内部に、前記遠心処理液を導入した後、前記外容器の内部に前記内容器を配置することで、前記内容器の内部および前記外容器の前記収容部に、前記遠心処理液を充填する工程
　前記（Ａ１－１）工程は、例えば、前記外容器の内部に前記内容器を配置した後、前記内容器の内部に、前記遠心処理液を注入する。これによって、例えば、前記内容器の下端の開口部から、前記外容器の前記収容部にも、前記遠心処理液を充填できる。また、前記（Ａ１－２）工程は、例えば、前記外容器の内部に前記遠心処理液を注入した後、前記内容器を前記外容器の内部に配置する。これによって、例えば、前記内容器の内部に遠心処理液を充填することもできる。この場合、前記内容器の下端の開口部から、内部に前記遠心処理液が導入される。
　前記（Ｂ１）工程において、前記試料の導入方法は、特に制限されない。前記遠心処理液が密度勾配担体の場合、例えば、前記試料は、前記密度勾配担体の上に重層することが好ましい。
　前記（Ｃ１）工程において、遠心分離の条件は特に制限されず、例えば、試料および分離対象物の種類に応じて適宜決定できる。具体例として、例えば、１０００Ｇ（１０００×９．８０６６５ｍ／ｓ２）で２０～３０分間の条件である。前記遠心分離は、例えば、前記内容器に前記蓋部を装着した状態で行うことが好ましい。前記遠心分離によって、前記試料由来の沈殿物が、前記内容器の下端の開口部から、前記外容器の前記収容部に導出される。
　前記（Ｄ１）工程において、前記内容器に前記蓋部を装着すると、前記内容器の内部は、液密状態となる。このため、前記内容器の内部の液体が、下端の開口部から漏れることなく、前記外容器から前記内容器を取り出すことができる。前記試料由来の沈殿物は、前記外容器の収容部に収容されているため、前記収容部の液体を回収することで、沈殿した分離対象物を回収できる。
　前記分離対象物は、前述のように、特に制限されず、本発明の分離方法は、精子の分離に適用することが好ましい。精子を分離する場合、本発明の分離容器は、例えば、遠心分離法、スイムアップ法に適用できる。
　本発明の分離方法は、例えば、第１形態として、遠心分離法、すなわち、遠心分離により精子を沈殿させて、精子を回収する方法があげられる。この場合、例えば、前記（Ｂ１）工程において、精子を含む試料、例えば、精液等を前記内容器の内部に導入し、そして、前記（Ｃ１）工程において、前記分離容器を遠心分離に供し、前記試料中の精子を、沈殿により、前記外容器の前記収容部に収容し、続いて、前記（Ｄ１）工程において、前記外容器から前記内容器を取り出し、前記外容器の前記収容部内の前記精子を回収することが好ましい。
　前記第１形態は、例えば、前記遠心処理液として前記密度勾配担体を使用した、密度勾配法であることが好ましい。
　前記第１形態は、さらに、スイムアップ法と組み合わせることもできる。この場合、例えば、前記（Ｃ１）工程において、前記分離容器を遠心分離に供して、前記試料中の精子を、沈殿により、前記外容器の前記収容部に収容し、前記（Ｄ１）工程において、前記外容器から前記内容器を取り出す。そして、さらに、下記（Ｅ１）および（Ｆ１）の工程を有することが好ましい。
（Ｅ１）前記（Ｄ１）工程後、前記外容器に、新たな前記内容器を配置し、前記配置の前後いずれかに、前記内容器に、精子が遊泳可能な液体を充填する工程
（Ｆ１）前記（Ｅ１）工程後、前記外容器の前記収容部から、前記内容器に遊泳してきた精子を回収する工程
　前記（Ｄ１）工程において、前記外容器から前記内容器を取り出すことによって、前記外容器の前記収容部には、沈殿した精子を含む前記遠心処理液が存在する。そして、前記（Ｅ１）工程において、新たな前記内容器を配置し、前記内容器に、前記液体を充填することによって、運動性に優れる精子は、前記外容器の前記収容部から、前記内容器の開口部を通じて、前記内容器の内部に向かって遊泳する。このため、前記内容器の内部の液体を回収することによって、運動性に優れる精子を回収できる。前記（Ｅ１）工程において、前記内容器への前記液体の充填は、特に制限されず、例えば、前記外容器に配置してから充填してもよいし、予め前記液体を充填した前記内容器を、液密状態を維持した状態で、前記外容器に配置してもよい。
　前記（Ｆ１）工程において、例えば、前記内容器に前記蓋部を装着した状態で、前記外容器から前記内容器を取り出し、前記内容器内の前記精子を回収してもよい。この場合、前記内容器を取り出した後、例えば、その下端を、試験管等の他の容器に入れ、前記蓋部を取り外して、液密状態を解放することで、前記内容器の内部から前記液体を前記他の容器に移してもよい。また、前記（Ｆ１）工程において、例えば、ピペット等を使用して、前記内容器の内部から、精子を含む液体を回収してもよい。
　前記精子が遊泳可能な液体は、特に制限されず、例えば、前記培地があげられる。前記培地の具体例としては、例えば、ＨＥＰＥＳを含有した液体等があげられる。
　また、本発明の分離方法は、第２形態として、例えば、スイムアップ法があげられる。この場合、前記分離方法は、本発明の分離容器を使用し、下記の（Ａ２）から（Ｃ２）の工程を有することが好ましい。
（Ａ２）前記外容器の前記収容部に、精子を含む試料を導入する工程
（Ｂ２）前記（Ａ２）工程後、前記外容器の内部に、前記内容器を配置し、前記配置の前後いずれかに、前記内容器の内部に、精子が遊泳可能な液体を充填する工程
（Ｃ２）前記（Ｂ２）工程後、前記外容器の前記収容部から、前記内容器に遊泳してきた精子を回収する工程
　前記（Ｃ２）工程において、前記内容器に前記蓋部を装着した状態で、前記外容器から前記内容器を取り出し、前記内容器内の前記精子を回収することが好ましい。
　以下に、本発明の分離容器およびこれを用いた分離方法を例示する。本発明の分離容器および分離方法は、これらの形態には制限されない。以下、図面を用いて説明するが、特に示さない限り、各図において、同一箇所には、同一の符号を付している。また、特に示さない限り、各実施形態は、それぞれの説明を援用できる。
実施形態１
　本例の分離容器を、図１および図２の断面図に示す。図１は、分離容器を構成する部材の断面図であり、（Ａ）が外容器、（Ｂ）が内容器、（Ｃ）が蓋部である。図２は、分離容器の断面図である。
　図１（Ａ）に示すように、外容器１０は、上端に開口部１０４を有する有底の円筒状であり、本体部１０１、テーパー部１０２および収容部１０３から構成される。図１（Ｂ）に示すように、内容器１１は、上端および下端に、それぞれ開口部１１４、１１３を有し、本体部１１１、テーパー部１１２から構成され、本体部１１１の上部の外周面に、周状に突起部１１５を有する。突起部１１５は、例えば、前述のように、内容器１１の把持部となる。また、前記突起部により、例えば、前記上端において、図１（Ｃ）に示すように、蓋部１２は、把持部１２１および挿入部１２２を有する。
　外容器１０、内容器１１および蓋部１２の大きさは、特に制限されない。前記各部材は、例えば、外容器１０の内部に内容器１１が配置可能であり、内容器１１が、下端の開口部１１３の端面および開口部１１３の外周面の少なくとも一方において、外容器１０の内周面に接触し、蓋部１２が、内容器１１の上端の開口部１１４に装着可能であり、内容器１１への蓋部１２の装着により、内容器１１の内部が液密状態となればよい。
　各部材の大きさは、例えば、試料および分離対象物の種類、前記試料の量等に応じて、適宜決定できる。本発明において、「軸方向」とは、分離容器、内容器および外容器について、上下方向を意味し、「垂直方向」とは、前記軸方向に対して垂直の方向を意味し、「高さ」とは、前記軸方向の長さをいい、「直径」とは、前記垂直方向の断面における直径を意味する。
　外容器１０の大きさは、特に制限されず、例えば、以下の条件が例示できる。全体の容量は、例えば、０．５～１００ｍＬであり、好ましくは１．０～５０ｍＬである。外容器１０全体の内部の高さは、例えば、３０～２００ｍｍであり、好ましくは５０～１２０ｍｍである。本体部１０１の高さは、例えば、８０～１２０ｍｍであり、好ましくは１０５～１１５ｍｍである。テーパー部１０２の高さは、例えば、５～２０ｍｍであり、好ましくは１０～１５ｍｍである。収容部１０３の高さは、例えば、５～１５ｍｍであり、好ましくは８～１２ｍｍである。開口部１０４の内周の直径は、例えば、１０～２０ｍｍであり、好ましくは１３～１５ｍｍである。テーパー部１０２の上端の内周の直径は、例えば、８～１８ｍｍであり、好ましくは１０～１３ｍｍである。収容部１０３の上端の内周の直径は、例えば、５～１５ｍｍであり、好ましくは６～７ｍｍである。収容部１０３の容量は、例えば、０．１～０．５ｍＬであり、好ましくは０．２～０．４ｍＬである。収容部１０３の内部の高さは、例えば、４～１０ｍｍであり、好ましくは５～８ｍｍである。
　内容器１１の大きさは、特に制限されず、例えば、以下の条件が例示できる。全体の容量は、例えば、０．３～１００ｍＬであり、好ましくは０．５～５０ｍＬである。内容器１１全体の高さは、例えば、６０～１００ｍｍであり、好ましくは８０～９０ｍｍである。本体部１１１の高さは、例えば、５０～９０ｍｍであり、好ましくは６０～７０ｍｍである。テーパー部１１２の高さは、例えば、５～３０ｍｍであり、好ましくは１０～２０ｍｍである。上端の開口部１１４の内周の直径は、例えば、５～２０ｍｍであり、好ましくは１０～１４ｍｍである。上端の開口部１１４の外周の直径、すなわち、突起部１１５の外周直径は、例えば、１０～２０ｍｍであり、好ましくは１４～１８ｍｍである。テーパー部１１２の上端の外周の直径は、例えば、８～１８ｍｍであり、好ましくは１０～１５ｍｍである。テーパー部１１２の下端の外周の直径、すなわち、下端の開口部１１３の外周の直径は、例えば、３～８ｍｍであり、好ましくは４～７ｍｍである。下端の開口部１１３の内周の直径は、例えば、２～７ｍｍであり、好ましくは３～６ｍｍである。
　蓋部１２の大きさは、特に制限されず、例えば、以下の条件が例示できる。把持部１２１の外周直径は、例えば、１０～２０ｍｍであり、好ましくは１２～１８ｍｍである。挿入部１２２の外周直径は、例えば、５～２０ｍｍであり、好ましくは１０～１４ｍｍである。挿入部１２２の高さは、例えば、２～１０ｍｍであり、好ましくは４～６ｍｍである。
　つぎに、図１および図２に基づいて、本例の分離容器を用いて、遠心分離により、精子を分離する方法を説明する。
　まず、外容器１０の内部に、内容器１１を配置する。この際、内容器１１の下端の外周面は、外容器１０の内周面と接触している。図２において、具体的には、内容器１１のテーパー部１１２の外周面は、外容器１０のテーパー部１０２の内周面と接触している。本例において、内容器１１と外容器１０とは、内容器１１の下端の外周面が、外容器１０の内周面と接触していればよく、例えば、内容器１１の外周面の全体が、外容器１０の内周面と接触していなくてもよい。
　つぎに、内容器１１の内部に、遠心処理液を注入する。内容器１１の下端は、開口部１１３を有する。このため、内容器１１に注入された前記遠心処理液は、開口部１１３を通じて、外容器１０の収容部１０３に導入される。前記遠心処理液の量は、特に制限されず、外容器１０および内容器１１の大きさに応じて適宜決定できる。前記遠心処理液は、例えば、１～１０ｍＬであり、好ましくは２～５ｍＬである。
　つぎに、内容器１１の内部に、精子を含む試料を導入する。前記試料は、内容器１１の内部における前記遠心処理液に、重層することが好ましい。
　そして、内容器１１の開口部１１４に蓋部１２の挿入部１２２を挿入し、内容器１１の内部を液密状態にする。そして、分離容器１を遠心分離に供する。遠心分離の条件は、特に制限されず、例えば、１０００Ｇ（１０００×９．８０６６５ｍ／ｓ２）で２０～３０分間の条件である。遠心分離によって、前記試料から精子が分離され、内容器１１の開口部１１３から、外容器１０の収容部１０３に、精子が沈殿する。本例によれば、遠心分離においても、物理的な安定性に優れる。
　遠心後、蓋部１２を装着した状態で、内容器１１を外容器１０から取り出す。内容器１１の内部には、前記試料の不要物が含まれる。しかしながら、蓋部１２の装着により、内容器１１の内部は液密状態となっている。このため、内容器１１の内部から液体が漏れることなく、外容器１０から内容器１１を取り出すことができる。これによって、外容器１０の収容部１０３において、精子を含んだ前記遠心処理液が回収される。収容部１０３において回収された遠心処理液を、回収精子のサンプルとして使用できる。
　本例においては、さらに、スイムアップ法を行うこともできる。まず、外容器１０から内容器１１を取り出した後、外容器１０に、新たな内容器１１を配置する。新たな内容器１１に、予め、精子が遊泳可能な液体を充填しておくことが好ましい。この場合、内容器１１の開口部１１４に蓋部１２を挿入すれば、液密状態を維持できるため、前記液体が開口部１１３から漏れることなく、内容器１１を外容器１０に配置可能である。そして、この状態で、放置する。これによって、運動性を示す精子は、外容器１０の収容部１０３から、内容器１１の開口部１１３を通じて、内容器１１の内部にスイムアップしてくる。この際、分離容器１は、内容器１１の開口部１１３の外周面と外容器１０の内周面との間に、隙間がないため、スイムアップした精子は、効率よく、内容器１１の内部にスイムアップできる。
　このように、運動性を示す精子のみが内容器１１に移動する。したがって、放置した後、内容器１１に蓋部１２を装着して、内部の液密性を保持した状態で、内容器１１を外容器１０から取り出すことにより、運動性を示す精子のみを回収できる。また、取出した内容器１１の内部の精子は、例えば、内容器１１から蓋部１２を取り外して液密性を解除し、前記内部から液体を導出させ、他の容器に回収してもよい。
　遠心分離は、通常、遠心ローターに分離容器をセットして行われる。この際、セットした本例の分離容器と、前記遠心ローターとの間に隙間が生じる場合、前記分離容器にアジャスターを装着してもよい。
実施形態２
　本例の分離容器を、図３および図４に示す。図３は、分離容器を構成する部材の断面図であり、（Ａ）が外容器、（Ｂ）が内容器、（Ｃ）が蓋部である。図４は、分離容器の断面図である。
　図３（Ａ）に示すように、外容器２０は、上端に開口部１０４を有する有底の円筒状であり、本体部１０１、テーパー部１０２および収容部１０３から構成され、収容部１０３の上端の内周面に、周状に突起部２００を有する。突起部２００の大きさは、特に制限されない。図３（Ｂ）および（Ｃ）は、前述した図１（Ｂ）および（Ｃ）と同じである。そして、図４に示すように、分離容器２は、外容器２０の内部に内容器１１が配置され、上部の開口部に蓋部１２が装着される。
　外容器２０の突起部２００および内容器１１の下端の開口部１１３は、例えば、それぞれの内周の直径として、以下の形態があげられる。第１の形態は、例えば、突起部２００の内周の直径が、内容器１１の開口部１１３の内周の直径とほぼ一致する形態である。この形態の一例を、図５（Ａ）に示す。図５（Ａ）は、外容器２０の内部に内容器１１を配置した際における分離容器２の断面図である。図５（Ａ）に示すように、突起部２００と内容器１１の開口部１１３は、それぞれの内周の直径がほぼ同一である。第２の形態は、例えば、突起部２００の内周の直径が、内容器１１の開口部１１３の内周の直径より大きい形態である。この形態の一例を、図５（Ｂ）に示す。図５（Ｂ）は、外容器２０の内部に内容器１１を配置した際における分離容器２の断面図である。図５（Ｂ）に示すように、突起部２００の内周の直径は、内容器１１の開口部１１３の内周の直径よりも大きい。第３の形態は、例えば、突起部２００の内周の直径が、内容器１１の開口部１１３の内周の直径より小さい形態である。この形態の一例を、図５（Ｃ）に示す。図５（Ｃ）は、外容器２０の内部に内容器１１を配置した際における分離容器２の断面図である。図５（Ｃ）に示すように、突起部２００の内周の直径は、内容器１１の開口部１１３の内周の直径よりも小さい。
　試料から、遠心分離によって分離対象物を沈澱させる場合、例えば、図５（Ａ）に例示する前記第１の形態および図５（Ｂ）に例示する第２の形態が好ましい。これらの態様によれば、例えば、内容器１１の内部から外容器２０の収容部に液体が移動する際に、内容器１１と外容器２０との間に、液体の移動を妨げる凸部が存在しない流路を構成できる。このため、分離容器を遠心分離して、内容器の内部から外容器の収容部に移動させる際に、目的の分離対象物が、前記凸部に接触することによる物理的負荷を抑制できる。前記分離対象物が、例えば、精子の場合、物理的負荷の低減により、精子の生存率の低下を抑制できる。
　分離対象物が精子であり、収容部から精子をスイムアップさせ、運動性に優れる精子を回収する場合、例えば、図５（Ａ）に例示する前記第１の形態および図５（Ｃ）に例示する第３の形態が好ましい。これらの態様によれば、例えば、外容器２０の収容部１０３の内部から、内容器１１の内部に精子が移動する際に、収容部１０３と内容器１１との間に、精子のスイムアップを妨げる凸部が存在しない流路を構成できる。このため、スイムアップした精子を、効率よく、内容器１１の内部に導くことができる。
　本例の分離容器２は、前記実施形態１と同様に、外容器２０の内部に、内容器１１を配置する。この際、内容器１１の下端の開口部１１３の端面は、外容器２０の内周面、すなわち、突起部２００の上側の端面と接触している。本例の分離容器２は、前記実施形態１と同様に使用できる。
実施形態３
　本実施形態の分離容器は、前記外容器の内部における前記収容部の容量を変動できる形態の一例である。
（１）実施形態３－１
　本例の分離容器を構成する外容器および内容器を、図６、図７および図８に示す（蓋部は、図示せず）。
　図６は、外容器の概略図であり、（Ａ）が外容器の断面図、（Ｂ）が外容器の上部の平面図、（Ｃ）が外容器の上部の斜視図である。図６（Ａ）に示すように、外容器３０は、上端に開口部３０４を有する有底の円筒状であり、本体部３０１、テーパー部３０２および先端部３０５から構成される。そして、図６（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、本体部３０１の上部の内周面には、係合用の４つの溝部（凹部）３０６ａ、３０６ｂ、３０６ｃ、３０６ｄが形成されている。溝部３０６ａ、３０６ｂ、３０６ｃ、３０６ｄは、本体部３０１の開口部３０４側の端部から、軸方向に向かって、異なる長さで、形成されている。図６において、各溝部の長さ（深さ）は、３０６ａ、３０６ｂ、３０６ｃおよび３０６ｄの順序で、より長くなるように設定されている。溝部の形状は、特に制限されず、例えば、図６に示すような長方形状の他に、Ｖ字状等があげられる。
　図７は、内容器の概略図であり、（Ａ）が断面図、（Ｂ）が内容器の上部の斜視図である。図７に示すように、内容器３１は、上端および下端に、それぞれ開口部３１４、３１３を有し、本体部３１１、テーパー部３１２および先端部３１７から構成される。内容器３１は、本体部３１１の上部の外周面に、周状に突起部３１５を有し、これは、前記実施形態１と同様に、内容器３１の把持部となる。内容器３１は、さらに、本体部３１１の外周面であって、把持部３１５の下部に、係合用の突起部（凸部）３１６が形成されている。突起部３１６の形状は、特に制限されず、外容器３０の溝部の形状に対応することが好ましく、例えば、図７に示すような長方形状の他に、Ｖ字状等があげられる。
　本例の分離容器は、外容器３０の内部に内容器３１を配置する際、外容器３０の係合用溝部３０６ａ、３０６ｂ、３０６ｃ、３０６ｄのいずれかに、内容器３１の係合用突起部３１６を挿入し、外容器３０と内容器３１とを係合する。内容器３１の係合用突起部３１６は、もっとも深い係合用溝部３０６ｄよりも、長いことが好ましい。前述のように、外容器の係合用溝部３０６ａ、３０６ｂ、３０６ｃ、３０６ｄは、それぞれ長さが異なる。このため、いずれの前記係合用溝部に係合用突起部３１６を挿入するかによって、外容器３０の内部における内容器３１の配置部位を調節できる。
　具体的に、図８の概略図を用いて説明する。図８は、外容器３０の内部に、内容器３１を配置した状態を示す断面図であり、（Ａ）は、外容器３０の係合用溝部３０６ａに、内容器３１の係合用突起部３１６を挿入した状態を示し、（Ｂ）は、外容器３０の係合用溝部３０６ｄに、内容器３１の係合用突起部３１６を挿入した状態を示す。図８に示すように、前記溝部に突起部３１６を挿入する場合、溝部の長さが短い程、内容器３１は、外容器３０の内部に相対的に浅く挿入されることになり（図８（Ａ））、前記溝部の長さが長い程、内容器３１は、外容器の内部に相対的に深く挿入されることになる（図８（Ｂ））。このため、前者と後者とを比較すると、前者は、外容器３０の内部への内容器３１の配置により形成される収容部３０３ａの体積が、相対的に大きくなり、後者は、外容器３０の内部への内容器３１の配置により形成される収容部３０３ｂの体積が、相対的に小さくなる。このように、外容器３０の係合用溝部と内容器３１の係合用突起部との組合せにより、外容器３０の内部への内容器３１の挿入の深さを調節できるため、これによって、外容器３０の内部への内容器３１の配置により形成される収容部の体積を容易に調節できる。
　また、本例の分離容器によれば、例えば、前述のように、外容器３０の溝部と内容器の突起部とを係合させているため、遠心処理時等に、内容器３１が、外容器３０の内部に、さらに挿入されることを十分に抑制できる。また、前記係合により、外容器３０の内部において、内容器３１が回転することを十分に抑制できる。
　本例において、外容器３０および内容器３１とこれらの各部位の大きさは、特に制限されず、例えば、実施形態１の例示を援用できる。
　外容器３０の大きさは、特に制限されず、例えば、以下の条件が例示できる。先端部３０５の内部の高さは、例えば、４～２０ｍｍであり、好ましくは５～１５ｍｍである。係合用溝部の幅は、例えば、０．５～４ｍｍであり、好ましくは１．５～２．５ｍｍである。係合用溝部の長さは、例えば、１～２０ｍｍであり、好ましくは２～５ｍｍであり、各溝部で長さを変化させることが好ましい。係合用溝部の数は、何ら制限されず、下限は、例えば、２個が好ましく、より好ましくは、３個、４個であり、上限は、例えば、１０個が好ましい。
　内容器３１の大きさは、特に制限されず、例えば、以下の条件が例示できる。係合用突起部の幅は、例えば、前記係合用溝部の幅より小さいことが好ましく、例えば、０．４～３．９ｍｍであり、好ましくは１～２ｍｍである。係合用突起部の長さは、例えば、最も長い前記係合用溝部の深さと同じまたはそれより長いことが好ましく、例えば、２～２１ｍｍであり、好ましくは３～６ｍｍである。
　外容器３０の内部に内容器３１を配置した状態における収容部の大きさは、特に制限されず、前述のような係合用溝部と係合用突起部との組合せにより、例えば、下限の体積から上限の体積に、段階的に変化できることが好ましい。前記下限は、例えば、０．０５～０．１ｍＬであり、上限は、例えば、０．６～１．０ｍＬである。
（２）実施形態３－２
　本実施形態において、前記内容器の前記係合用突起部の数は、特に制限されない。前記係合用突起部の数は、例えば、１個でもよいし、２個以上でもよく、例えば、１～４個、好ましくは、１～３個、より好ましくは、１個または２個である。係合用突起部を複数設けることで、例えば、外容器内における内容器の安定性を、より向上できる。
　前記係合用突起部を２個に設定する場合、前記内容器の前記係合用突起部は、例えば、前記内容器の外周面において、対向する位置に、対となる２つの係合用突起部（突起部のセット）を有することが好ましい。そして、前記外容器の前記係合用溝部は、例えば、前記突起部のセットに対応するように、外容器３０の内周面において、対向する位置に、対となる２つの係合用溝部（溝部のセット）を複数有することが好ましい。
　本例の外容器および内容器の例を、図９に示す。図９において、（Ａ）は、外容器の上部を示す斜視図であり、（Ｂ）は、内容器の上部を示す斜視図である。図９（Ａ）に示すように、外容器４０は、その内周面に、係合用の６つの溝部（凹部）４０６ａ、４０６ｂ、４０６ｃ、４０６ａ’、４０６ｂ’および４０６ｃ’が形成されている。溝部４０６ａと４０６ａ’、４０６ｂと４０６ｂ’、４０６ｃと４０６ｃ’は、それぞれ、対向する位置に形成されている。溝部４０６ａと４０６ａ’、４０６ｂと４０６ｂ’、４０６ｃと４０６ｃ’は、それぞれ、同じ長さであり、この順序で、より長くなるように設定されている。他方、図９（Ｂ）に示すように、内容器４１は、その外周面において、係合用の２つの突起部（凸部）４１６ａおよび４１６ａ’が、同じ長さで、対向する位置に形成されている。
　外容器４０に内容器４１を配置する場合、内容器４１の突起部４１６ａと４１６ａ’を、外容器４０の溝部４０６ａと４０６ａ’、４０６ｂと４０６ｂ’、または４０６ｃと４０６ｃ’に挿入すればよい。外容器４０に内容器４１を配置することにより形成される収容部は、溝部４０６ａと４０６ａ’、４０６ｂと４０６ｂ’、４０６ｃと４０６ｃ’の順に、その体積が相対的に小さくなる。
（３）実施形態３－３
　本実施形態において、前記外容器の係合用溝部の形状は、さらに、他の形態が例示できる。
　前記外容器のその他の例を、図１０に示す。図１０は、外容器の上部の斜視図である。図１０に示すように、外容器５０は、上端に開口部を有する有底の円筒状であり、本体部５０１、テーパー部および先端部から構成される。そして、図１０に示すように、本体部５０１の上部の内周面には、係合用の６つの溝部（凹部）５０６ａ、５０６ｂ、５０６ｃ、５０６ａ’、５０６ｂ’および５０６ｃ’が形成されている。そして、外容器５０の前記内周面には、さらに、外容器５０の内部に前記内容器を挿入する際、前記内容器の係合用突起部の先端を、所望の溝部にガイドするための、ガイド部が形成されている。具体的に、溝部５０６ａと５０６ｂとの間、溝部５０６ｂと５０６ｃとの間に、それぞれ、ガイド部５０６ａｂ、５０６ｂｃが設けられている。ガイド部５０６ａｂおよび５０６ｂｃは、それぞれ、より深い溝部に向かって傾斜している形状であることが好ましい。同様に、溝部５０６ａ、５０６ｂおよび５０６ｃに対応する溝部５０６ａ’、５０６ｂ’および５０６ｃ’に関しても、同様に、ガイド部５０６ａｂ’および５０６ｂｃ’が設けられている。
実施形態４
　本実施形態の分離容器は、前記外容器から前記内容器を取り出した後、前記外容器の収容部における液量の変動を防止する形態の一例である。
　前記外容器の内部に前記遠心処理液を注入した後、前記外容器の内部に前記内容器を配置した場合、例えば、前記内容器の先端より上部において、前記外容器と前記内容器との間に隙間が生じると、前記遠心処理液が前記隙間に入り込む可能性がある。このような場合、遠心処理後、前記外容器から前記内容器を取り外すと、前記隙間に入り込んだ前記遠心処理液が、前記外容器の内周面を伝って、下方向に移動し、前記外容器の前記収容部に流れこむ可能性がある。前記収容部に前記遠心処理液が流れこむと、例えば、回収した精子が希釈され、濃度が低下する可能性がある。そこで、本実施形態の分離容器は、さらに、このような前記遠心処理液の混入による前記収容部の液量の変動を十分に防止する形態の例示である。
　本例の分離容器を、図１１、図１２および図１３に示す。図１１は、外容器の断面図であり、（Ａ）が、外容器の軸方向における断面図、（Ｂ）は、前記（Ａ）における前記外容器の先端のＩ－Ｉ方向断面図である。図１２は、内容器の断面図であり、（Ａ）は、内容器の軸方向における断面図、（Ｂ）は、前記（Ａ）における前記内容器の先端のII－II方向断面図である。図１３は、前記外容器と前記内容器から構成される前記分離容器の断面図である。
　図１１（Ａ）に示すように、外容器６０は、上端に開口部６０４を有する有底の円筒状であり、本体部６０１、先端部６０５および溝部６０６から構成される。先端部６０５は、円筒状であり、その円周状の側壁６０７と本体部６０１の側壁によって、円周状の溝部６０６が形成されている。具体的には、図１１（Ｂ）に示すように、円筒状の先端部６０５の周囲に、側壁６０７が隔壁となって、同心円状に溝部６０６が形成されている。
　図１２（Ａ）に示すように、内容器６１は、上端および下端に、それぞれ開口部６１４、６１３を有し、本体部６１１、テーパー部６１２および先端部６１７を有し、先端部６１７の周囲に、さらに、円周状の突起部６１８が形成されている。具体的には、図１２（Ｂ）に示すように、円筒状の先端部６１７の周囲に、円周状の突起部６１８が形成されている。
　そして、外容器６０に内容器６１を配置することで、分離容器６として使用できる。図１３に示すように、分離容器６において、外容器６０の先端部６０５は、内容器６１の先端部６１７が挿入され、外容器６０の先端部６０５において、収容部６０３が形成される。また、外容器６０の溝部６０６には、内容器６１の突起部６１８が挿入される。
　このような分離容器６によれば、例えば、遠心分離後、外容器６０から内容器６１を取りはずしても、外容器６０の内壁を伝って落ちる遠心処理液は、外容器６０の溝部６０６に導入され、先端部６０５内への導入を阻止できる。このため、前述のような、収容部６０３における液量の変動を十分に防止できる。また、遠心分離時において、外容器６０の溝部６０６には、内容器６１の突起部６１８が挿入されているため、外容器６０から内容器６１を取り外す前に、溝部６０６に遠心処理液が導入されることを防ぐこともできる。このため、内容器６１を取り外した際に、流れ落ちる遠心処理液を確実に溝部６０６に収容可能となる。
実施形態５
　本実施形態の分離容器は、前記外容器から前記内容器を取り出す際、前記内容器の内部の液体が、前記外容器の内部に混入することを防止する形態の一例である。
　本例の分離容器の一態様として、前記分離容器を構成する外容器を、図１４（Ａ）に示す。図１４（Ａ）は外容器の断面図である。本例の分離容器は、例えば、図１４（Ａ）の外容器と図３（Ｂ）の内容器とを組合せて使用できる。なお、図１４（Ａ）において、図３と同一箇所には同一符号を付している。
　図１４（Ａ）に示すように、外容器７０は、図３（Ａ）の外容器が、さらに、収容部１０３の上側の開口部に一方弁７０１を有する形態である。一方弁７０１は、遠心分離等の圧力変化によって、上方向から下方向に液体を通過させる。したがって、外容器７０の内部に、図３（Ｂ）の内容器１１を配置して遠心分離を行っている間のみ、一方弁７０１を介して、内容器１１から外容器７０の収容部１０３に液体が導入される。そして、遠心分離後、例えば、内容器１１の下側の開口部１１３から液体が落下した場合でも、一方弁７０１を介して、外容器７０の収容部１０３内部に前記液体が混入することを防止できる。また、内容器１１から液体が落下した場合は、例えば、一方弁７０１の上部に存在する液体をスポイド等で容易に除去できるため、その後、収容部１０３内の回収液を採取できる。
　また、本例の分離容器の他の態様として、前記分離容器を構成する内容器を、図１４（Ｂ）に示す。図１４（Ｂ）は内容器の断面図である。本例の分離容器は、例えば、図３（Ａ）の外容器と図１４（Ｂ）の内容器とを組合せて使用できる。なお、図１４（Ｂ）において、図３と同一箇所には同一符号を付している。
　図１４（Ｂ）に示すように、内容器７１は、図３（Ｂ）の内容器が、さらに、先端の開口部１１３に一方弁７０１を有する形態である。この場合、図３（Ａ）の外容器２０の内部に、内容器７１を配置して遠心分離を行っている間のみ、一方弁７０１を介して、内容器７１から外容器２０の収容部１０３に液体が導入される。そして、遠心分離後、外容器２０から内容器７１をとりはずしても、一方弁７０１が装着されていることから、内容器７１の開口部１１３から外部に液体がもれることを防止できる。
　このように前記外容器または前記内容器が一方弁を備えることで、例えば、さらに分離精度を向上できる。
　一方弁の種類は、何ら制限されず、例えば、ダックビル式およびアンブレラ式等があげられ、好ましくは前者である。
実施形態６
　本実施形態の分離容器は、遠心時の荷重負荷による物理的なダメージを軽減する形態の一例である。
　本例の分離容器を構成する外容器を、図１５に示す。図１５において、（Ａ）は外容器の先端部の平面図であり、（Ｂ）は前記外容器の断面図である。図１５（Ａ）に示すように、外容器８０は、図６（Ａ）の外容器が、さらに、その先端の外周面に、リブ８１を有する形態である。外容器は、例えば、前述のように、収容部の体積を小さくすることが好ましいことから、その先端部は、例えば、図６（Ａ）等に例示するように、本体部よりも、内周および外周の直径を小さくする形態があげられる。このため、外容器について、細い先端部の外周面に、このようにリブを配置することで、遠心時の荷重負荷による物理的ダメージを低減できる。
　リブの条件、例えば、大きさ、個数および形状等は、特に制限されない。リブの個数は特に制限されず、例えば、２個以上が好ましい。前記リブは、前記外周面において放射状に、等間隔で配置することが好ましい。
実施形態７
　本実施形態は、内容器の下端と外容器との接触の状態を例示する。
　分離容器において、外容器の外周面と外容器の内周面とは、例えば、非接触でもよい。この形態の分離容器の一例を、図１６の断面図に示す。図１６（Ａ）は、分離容器の断面図であり、図１６（Ｂ）は、前記（Ａ）のIII－III方向の断面図である。
　図１６（Ｂ）に示すように、内容器１１の外周面と外容器１０の内周面とは、非接触でもよい。非接触の場合、内容器１１と外容器１０との間は、例えば、空隙１０５を有してもよい。軸の垂直方向において、内容器１１の外周面と外容器１０の内周面との距離（空隙１０５の長さ）は、例えば、前述のように、２００μｍ以下が好ましく、より好ましくは１００μｍ以下であり、さらに好ましくは５０μｍ以下である。
　また、図１６（Ａ）のIV－IV方向の断面、V－V方向の断面および／またはVI－VI方向の断面においても、図１６（Ｂ）と同様に、内容器１１と外容器１０とが非接触でもよい。
実施形態８
　本実施形態は、内容器の下端と外容器との接触の状態を例示する。
　分離容器において、内容器の外周面と外容器の内周面とは、例えば、部分的に接触してもよい。この形態の分離容器の一例を、図１７の断面図に示す。図１７（Ａ）および（Ｂ）は、図１６（Ａ）の分離容器のIII－III方向の断面図である。
　図１７（Ａ）に示すように、内容器１１の外周面が突起部（１１６ａ、１１６ｂ、１１６ｃ、１１６ｄ）を有し、これらの突起部において、外容器１０の内周面と接触している。また、図１７（Ｂ）に示すように、外容器１０の内周面が突起部（１０６ａ、１０６ｂ、１０６ｃ、１０６ｄ）を有し、これらの突起部において、内容器１１の外周面と接触している。
　つぎに、その他の例を、図１８に示す。図１８（Ａ）は、内容器の先端部の概略を示す斜視図であり、図１８（Ｂ）は、図１８（Ａ）の内容器を備えた分離容器に関する、図１６（Ａ）の分離容器のIII－III方向の断面図である。
　図１８（Ａ）に示すように、内容器１１は、先端の外周面に、突起状のリブ１６を有する。そして、図１８（Ｂ）に示すように、分離容器は、内容器１１と外容器１０とが、リブ１６を介して、接触している。リブ１６は、周状ではなく、欠失部を有することから、この欠失部において、空隙１０５が形成される。本例では、内容器１１の先端にリブ１６を設けたが、これには制限されず、例えば、先端よりも上部において、外周面にリブが形成されてもよい。
　本例では、内容器１１の外周面がリブ１６を有するが、これには制限されず、外容器１０の内周面にリブ１６が形成されてもよい。
　さらに、その他の例を、図１９に示す。図１９（Ａ）および（Ｂ）は、図１６（Ａ）の分離容器のIII－III方向の断面図である。
　図１９（Ａ）に示すように、内容器１１は、楕円形の筒状であり、軸に対して垂直方向において、長手方向両端の外周面において、外容器１０の内周面と接触してもよい。また、図１９（Ｂ）において、内容器１１は、外容器１０内において、非同軸に配置されており、一部の外周面が外容器１０の内周面に接触し、前記接触した部位と対応する外周面は、外容器１０の内周面と非接触でもよい。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により制限されない。
［実施例１］
　本例では、本発明の分離容器を用いて、遠心分離により精子を含む沈殿画分を回収し、生存精子の回収率を確認した。
　図３および図４に示す分離容器を作製した。分離容器の大きさは、以下の通りとした。
外容器２０
　　全体の容量：９．８５ｍＬ
　　全体の内部の高さ：８５ｍｍ
　　本体部１０１の高さ：６０ｍｍ
　　テーパー部１０２の高さ：１４ｍｍ
　　収容部１０３の高さ：１２ｍｍ
　　開口部１０４の直径：１４．５ｍｍ
　　テーパー部１０２の上端の内周の直径：１２．４１ｍｍ
　　テーパー部１０２の下端の内周の直径：７．２ｍｍ
　　突起部２００の内周の直径：６．２ｍｍ
　　収容部１０３の容量：０．３ｍＬ
　　収容部１０３の内部の高さ：１１ｍｍ
内容器１１
　　全体の容量：７．７ｍＬ
　　全体の高さ：８４ｍｍ
　　本体部１１１の高さ：６８ｍｍ
　　テーパー部１１２の高さ：１６ｍｍ
　　上端の開口部１１４の内周の直径：１２．４ｍｍ
　　上端の開口部１１４の外周の直径：１６．３ｍｍ
　　テーパー部１１２の上端の外周の直径：１２．２ｍｍ
　　下端の開口部１１３の外周の直径：７ｍｍ
　　下端の開口部１１３の内周の直径：５ｍｍ
蓋部１２
　　把持部１２１の外周の直径：１６．４７ｍｍ
　　挿入部１２２の外周の直径：１２．４７ｍｍ
　　挿入部１２２の高さ：５ｍｍ
　外容器２０の内部に内容器１１を配置した。そして、内容器１１の内部に、パーコール（商品名Ｐｅｒｃｏｌｌ、ＧＥヘルスケアジャパン社製）を導入した。具体的には、まず、９０％パーコール１．５ｍＬを導入し、この上に４５％パーコール１．５ｍＬを積層した。さらに、前記パーコールに、精液０．２８ｍＬを重層した。内容器１１の開口部１１４に蓋部１２を装着し、７００Ｇ（７００×９．８０６６５ｍ／ｓ２）、３０分間、遠心分離を行った。遠心後、蓋部１２を装着した状態で、外容器２０から内容器１１を取り出した。そして、外容器２０内のパーコール液（全量３００μＬ）について、フローサイトメトリーによって、生存精子、死細胞および不純物を測定し、それぞれの割合（％）を算出した。
［比較例１］
　本例では、従来の分離容器を用いて、実施例と同じ精液０．２８ｍＬから、遠心分離により精子を含む沈殿画分を回収し、生存精子の回収率を確認した。
（比較例１－１）
　本例では、分離容器として、容量１５ｍＬの遠沈管（商品名１５ｍＬ遠沈管、コーニング社製）、および、ノズル（商品名ＡＲＴキャピラール、ニプロ社製）と前記ノズルにセット可能なシリンジ（商品名　ＪＭＳシリンジ　ジェイ・エム・エス社製）とを使用した。前記遠沈管の内部に、その先端が底部に位置するように、前記ノズルを配置した。そして、前記遠沈管の内部に、前記パーコールを導入した。具体的には、まず、９０％パーコール１．５ｍＬを導入し、この上に４５％パーコール１．５ｍＬを積層した。さらに、前記パーコールに、前記精液０．２８ｍＬを重層した。そして、前記遠沈管に蓋をして、前記実施例１と同様に遠心分離を行った。遠心後、前記蓋を取り外し、前記遠沈管内に配置した前記ノズルの後端部に、前記シリンジをセットして、前記遠沈管の底から、前記ノズルを介して、パーコール液０．３ｍＬを、精子を含む沈殿画分として吸引した。回収した前記パーコール液について、前記実施例１と同様にして、生存精子、死細胞および不純物を測定し、それぞれの割合（％）を算出した。
（比較例１－２）
　本例では、分離容器として、容量１５ｍＬの遠沈管（商品名１５ｍＬ遠沈管、コーニング社製）、および、ピペットを使用した。前記遠沈管の内部に、パーコールを導入した。具体的には、まず、９０％パーコール１．５ｍＬを導入し、この上に４５％パーコール１．５ｍＬを積層した。さらに、前記パーコールに、前記精液０．２８ｍＬを重層した。そして、前記遠沈管に蓋をして、前記実施例１と同様に遠心分離を行った。遠心後、前記蓋を取り外し、前記遠沈管に、ピペットを挿入し、前記遠沈管の底から、パーコール液０．３ｍＬを、精子を含む沈殿画分として吸引した。このようにして回収したパーコール液について、前記実施例１と同様にして、生存精子、死細胞および不純物を測定し、それぞれの割合（％）を算出した。
　これらの結果を、下記表１にあわせて示す。表１に示すように、本発明によれば、極めて不純物の割合が低く、高い効率で、生存精子を回収できた。また、本実施例の分離容器によれば、ピペッティングを行うことなく、内容器１１を取り外すのみで、３００μＬという極めて少量で、且つ、生存精子の濃度が高いサンプルを得ることができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例２］
　本例では、本発明の分離容器を用いて、遠心分離により精子を含む沈殿画分を回収し、生存精子の回収率について再現性の確認を行った。
　分離容器として、前記実施例１の分離容器および前記比較例１－２の分離容器を使用した。前記精子は、新鮮ブタ精液を使用した。そして、精子分離操作が未経験の実験者３人により、各分離容器を用いて、前記精子からの生存精子の分離を行った。分離方法は、パーコールの条件を以下に変更した以外は、各分離容器に応じて、前記実施例１および比較例１－２と同様に行った。パーコールの条件は、（１）９０％パーコール１．５ｍＬの導入後、４５％パーコール１．５ｍＬの積層、（２）８０％パーコール１．５ｍＬの導入後、５０％パーコール１．５ｍＬの積層、（３）８０％パーコール３．０ｍＬの導入とした。
　分離後、前記実施例１と同様に、フローサイトメトリーによって、遠心分離前の精子における生存精子と、遠心分離後の前記外容器内のパーコール液（全量３００ｍＬ）における生存精子を測定し、前者を１とした場合の後者の比を濃縮率として求めた。そして、各条件について、実験者３人の濃縮率の結果について平均値を算出した。
　これらの結果を、図２０のグラフに示す。図２０において、縦軸は、生存精子の平均濃縮率を示す。図２０において、９０％－４５％は、パーコール条件（１）を示し、８０％－５０％は、パーコール条件（２）を示し、８０％は、パーコール条件（３）を示す。また、各パーコール条件において、２本のバーは、左から、前記比較例１－２の分離容器、前記実施例１の分離容器の結果を示す。図２０に示すように、前記実施例１の分離容器によれば、いずれのパーコール条件においても、最も高い濃縮率が実現できた。また、前記実施例１の分離容器によれば、前記比較例１－２の分離容器と比較して、実験者間のバラツキが極めて小さかった。これらの結果から、本発明の分離容器によれば、操作する者が熟練者か否かに関わらず、高い再現性で効率良く、生存精子を濃縮した状態で回収できることがわかった。
［実施例３］
　本例では、本発明の分離容器を用いて回収した精子の運動率を確認した。
　分離容器として、前記実施例１の分離容器、前記比較例１－１の分離容器、前記比較例１－２の分離容器を使用した。そして、ヒト精液５検体について、各分離容器に応じて、前記実施例１、比較例１－１および比較例１－２と同様に行った。
　分離後、回収した精子について、運動率および高速前進運動率を、WHO　laboratory　manual　for　the　Examination　and　processing　of　human　semen　FIFTH　EDITION　（2010）（日本語版：ＷＨＯ精液検査ラボマニュアル第５版（２０１０年）にしたがって算出した。そして、各分離容器について、５検体の平均値を求めた。これらの結果を下記表２に示す。下記表２に示すように、実施例１の分離容器で回収した精子は、比較例よりも優れた結果を示した。特に、高速前進運動率については、比較例より極めて優れた結果を示した。これらの結果により、実施例の分離容器によれば、精子へ影響を与えることなく、生存精子を回収できることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明の分離容器によれば、例えば、遠心分離によって、沈殿する分離対象物を、前記内容器の下端の先端口を通じて、前記外容器の前記収容部に収容できる。そして、前記内容器は、蓋部の装着により、その内部を液密状態にできるため、前記内容器を取り外すのみで、前記外容器に分離対象物が回収できる。また、本発明の分離容器によれば、前記収容部の大きさは、任意に設計できるため、前記内容器を取り外した後、前記外容器の内部に残る液量を、任意の量、すなわち、少量に設定することが可能となる。前記液量が少量であれば、分離対象物が高濃度であるサンプルを得ることができる。また、遠心処理液としてパーコール等を使用する場合、その使用量も低減できることから、低コスト化も可能である。
　以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０１０年１１月９日に出願された日本出願特願２０１０－２５０６９９を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
１、２、６　分離容器
１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０　外容器
１１、３１、４１、６１、７１　内容器
１２　蓋部
１０１、１１１、３０１、３１１、５０１、６０１、６１１　本体部
１０２、１１２、３０２、３１２、６１２　テーパー部
１０３、３０３ａ、３０３ｂ、６０３　収容部
１０４、１１３、１１４、３０４、３１３、３１４、６０４、６１３、６１４　開口部
１２１　　　　　　　　　把持部
１２２　　　　　　　　　挿入部
１１５、２００　　　　　突起部
３０６ａ～ｄ、４０６ａ～ｃ、４０６ａ’～ｃ’、５０６ａ～ｃ、５０６ａ’～ｃ’　溝部
３０５、３１７、６０５、６１７　先端部
３１５、３１６、４１６ａ、４１６ａ’　突起部
５０６ａｂ、５０６ｂｃ、５０６ａｂ’、５０６ｂｃ’　ガイド部
６０６　溝部
６０７　側壁
６１８　突起部
７０１　一方弁
１６、８１　リブ
１０５　空隙
１０６ａ～ｄ、１１６ａ～ｄ　突起部
 

 

Claims (20)

  1. 試料から分離対象物を分離するための分離容器であって、
    外容器、内容器および蓋部を有し、
    前記外容器は、
    　上端が開口し、下端が閉口した有底筒状であり、
    前記内容器は、
    　上端および下端が開口した筒状であり、
    前記外容器および前記内容器は、それぞれの上下の方向を揃えた状態で、前記外容器の内部に前記内容器が配置可能であり、
    前記外容器の内部に前記内容器を配置した状態で、
    　前記外容器の内部において、配置された前記内容器よりも下方の領域が、前記試料からの沈殿物の収容部であり、
    前記蓋部は、
    　前記内容器の上端の開口部に、脱着可能であり、
    前記蓋部を前記内容器の前記開口部に装着した際、前記内容器の内部が液密状態となる、
    ことを特徴とする分離容器。
  2. 前記外容器の内部に前記内容器を配置した状態で、
    前記内容器の下端は、その先端口の端面およびその先端の外周面の少なくとも一方が、前記外容器の内周面に接触している、請求項１記載の分離容器。
  3. 前記内容器の下端は、その先端口の端面の全体または一部が、前記外容器の内周面に接触している、請求項２記載の分離容器。
  4. 前記内容器の下端は、その先端の外周面の全体または一部が、前記外容器の内周面に接触している、請求項２記載の分離容器。
  5. 前記外容器は、前記収容部の上端の内周面に、周状に突起部を有し、
    前記内容器の下端の先端口の端面は、前記突起部に接触する、請求項１から４のいずれか一項に記載の分離容器。
  6. 前記内容器は、その外周面がテーパー状であるテーパー部を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の分離容器。
  7. 前記内容器の前記テーパー状の外周面が、前記外容器の内周面に接触している、請求項６記載の分離容器。
  8. 前記外容器の内周面および前記内容器の外周面の一方が、突起部を有し、他方が、前記突起部と係合可能な溝部を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の分離容器。
  9. 前記外容器が、前記収容部の外側に、同心円状の溝部を有し、
    前記内容器が、前記先端の外側に、同心円状の突起部を有し、
    前記外容器の内部に、前記内容器を配置する際、前記外容器の前記溝部に、前記内容器の前記突起部が挿入可能である、請求項１から８のいずれか一項に記載の分離容器。
  10. 用途が、試料からの精子の分離用である、請求項１から９のいずれか一項に記載の分離容器。
  11. 試料から分離対象物を分離する分離方法であって、
    請求項１から１０のいずれか一項に記載の分離容器を使用し、
    下記の（Ａ１）から（Ｄ１）の工程を有することを特徴とする分離方法。
    （Ａ１）前記外容器の内部に前記内容器を配置し、前記内容器の内部および前記外容器の前記収容部に、遠心処理液を充填する工程
    （Ｂ１）前記（Ａ１）工程後、前記内容器の内部に、前記試料を導入する工程
    （Ｃ１）前記（Ｂ１）工程後、前記分離容器を遠心分離に供して、前記試料由来の沈殿物を、前記外容器の前記収容部に収容する工程
    （Ｄ１）前記（Ｃ１）工程後、前記内容器に前記蓋部を装着した状態で、前記外容器から前記内容器を取り出す工程
  12. 前記（Ａ１）工程が、下記（Ａ１－１）工程または（Ａ１－２）工程である請求項１１記載の分離方法。
    （Ａ１－１）前記外容器の内部に前記内容器を配置した後、前記内容器の内部に前記遠心処理液を導入することで、前記内容器の内部および前記外容器の前記収容部に、前記遠心処理液を充填する工程
    （Ａ１－２）前記外容器の内部に、前記遠心処理液を導入した後、前記外容器の内部に前記内容器を配置することで、前記内容器の内部および前記外容器の前記収容部に、前記遠心処理液を充填する工程
  13. 前記遠心処理液が、密度勾配担体、培地および緩衝液からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１１または１２記載の分離方法。
  14. 前記遠心処理液が、密度勾配担体であり、
    前記（Ｂ１）工程において、前記密度勾配担体の上に、前記試料を重層する、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の分離方法。
  15. 前記分離対象物が、精子であり、
    前記（Ｃ１）工程において、前記分離容器を遠心分離に供して、前記試料中の精子を、沈殿により、前記外容器の前記収容部に収容し、
    前記（Ｄ１）工程において、前記外容器から前記内容器を取り出し、前記外容器の前記収容部内の前記精子を回収する、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の分離方法。
  16. 前記分離対象物が、精子であり、
    前記（Ｃ１）工程において、前記分離容器を遠心分離に供して、前記試料中の精子を、沈殿により、前記外容器の前記収容部に収容し、
    前記（Ｄ１）工程において、前記外容器から前記内容器を取り出し、
    さらに、下記（Ｅ１）および（Ｆ１）の工程を有する、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の分離方法。
    （Ｅ１）前記（Ｄ１）工程後、前記外容器に、新たな前記内容器を配置し、前記配置の前後いずれかに、前記内容器に、精子が遊泳可能な液体を充填する工程
    （Ｆ１）前記（Ｅ１）工程後、前記外容器の前記収容部から、前記内容器に遊泳してきた精子を回収する工程
  17. 前記（Ｆ１）工程において、前記内容器に前記蓋部を装着した状態で、前記外容器から前記内容器を取り出し、前記内容器内の前記精子を回収する、請求項１６記載の分離方法。
  18. 前記試料が精液を含む、請求項１１から１７のいずれか一項に記載の分離方法。
  19. 試料から分離対象物を分離する分離方法であって、
    前記分離対象物が、精子であり、
    請求項１から１０のいずれか一項に記載の分離容器を使用し、
    下記の（Ａ２）から（Ｃ２）の工程を有することを特徴とする分離方法。
    （Ａ２）前記外容器の前記収容部に、前記試料を導入する工程
    （Ｂ２）前記（Ａ２）工程後、前記外容器の内部に、前記内容器を配置し、前記配置の前後いずれかに、前記内容器の内部に、精子が遊泳可能な液体を充填する工程
    （Ｃ２）前記（Ｂ２）工程後、前記外容器の前記収容部から、前記内容器に遊泳してきた精子を回収する工程
  20. 前記（Ｃ２）工程において、前記内容器に前記蓋部を装着した状態で、前記外容器から前記内容器を取り出し、前記内容器内の前記精子を回収する、請求項１９記載の分離方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2016147748A1 (ja) * 2015-03-17 2017-04-27 株式会社エム・ビー・エス 試料採取分離器具

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102012013642B4 (de) 2012-07-09 2020-12-24 Thermo Electron Led Gmbh Zentrifugengefäßeinheit
JP6080093B2 (ja) * 2012-07-27 2017-02-15 株式会社ジェイ・エム・エス 分離容器キット
JP6080097B2 (ja) * 2012-09-19 2017-02-15 株式会社ジェイ・エム・エス 分離容器
JP5955353B2 (ja) * 2014-07-23 2016-07-20 みゆき 山川 体液収容器
JP2015136647A (ja) * 2014-01-21 2015-07-30 株式会社ジェイ・エム・エス 分離容器キット
CN103894296B (zh) * 2014-04-08 2017-03-15 江苏欧耐尔新型材料有限公司 离心机夹具
WO2016080509A1 (ja) 2014-11-21 2016-05-26 積水メディカル株式会社 検体希釈用容器
KR101563512B1 (ko) * 2015-04-09 2015-10-28 기 수 한 혈액분리용기
WO2018042537A1 (ja) * 2016-08-31 2018-03-08 三浦工業株式会社 容器
ES2909896T3 (es) * 2016-10-03 2022-05-10 Hirokazu Okada Recipiente de conservación de semen
BR112019023374A2 (pt) * 2017-05-08 2020-10-06 Biomedical Regenerative Gf, Llc dispositivo de proteção de recipiente interno
JP6952614B2 (ja) * 2018-01-23 2021-10-20 ミツボシプロダクトプラニング株式会社 採精容器
FI20187079A1 (en) * 2018-06-05 2019-12-06 Oy Conventa Ltd Targeting and growth of microorganisms in solidifying density gradients
US20220347679A1 (en) * 2018-11-22 2022-11-03 Rigaku Corporation Sample holder unit for single-crystal x-ray structure analysis apparatus
US11344880B2 (en) * 2018-11-30 2022-05-31 Hans-Werner Heinrich Centrifuge tube separation system, and methods of use
WO2023004068A2 (en) * 2021-07-21 2023-01-26 10X Genomics, Inc. Methods, devices, and kits for purifying and lysing biological particles
WO2023153465A1 (ja) * 2022-02-10 2023-08-17 ニプロ株式会社 液状生体試料の回収容器および凍結保存方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005030399A1 (ja) * 2003-09-30 2005-04-07 Kabushiki Kaisha Kitazato Supply 遠心分離用沈殿管および生体細胞採取用チューブ
JP2009119457A (ja) * 2007-10-24 2009-06-04 Jms Co Ltd 分離容器、アタッチメントおよび分離方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4990253A (en) * 1988-01-25 1991-02-05 Abbott Laboratories Fluid sample filtration device
WO1997003348A1 (en) * 1995-07-13 1997-01-30 Immunological Associates Of Denver Self-contained device integrating nucleic acid extraction, amplification and detection
JP3062082B2 (ja) * 1996-04-19 2000-07-10 株式会社大日本精機 液体の遠心分離用沈殿管
US6280400B1 (en) * 1998-12-05 2001-08-28 Becton Dickinson And Company Device and method for separating component of a liquid sample
US6793892B1 (en) * 1999-12-06 2004-09-21 Volker Niermann Device and method for separating components of a fluid sample
US20040059255A1 (en) * 2002-09-23 2004-03-25 Dimitrios Manoussakis High bias gel tube and process for making tube
JP4269756B2 (ja) * 2003-04-17 2009-05-27 ニプロ株式会社 体液濃縮採取具
JP5051617B2 (ja) * 2007-12-17 2012-10-17 富士電機株式会社 遠心分離方法及び遠心分離装置
JP5244021B2 (ja) * 2009-04-16 2013-07-24 日立アロカメディカル株式会社 採血管、検体前処理装置、検体前処理方法及び分離剤除去具

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005030399A1 (ja) * 2003-09-30 2005-04-07 Kabushiki Kaisha Kitazato Supply 遠心分離用沈殿管および生体細胞採取用チューブ
JP2009119457A (ja) * 2007-10-24 2009-06-04 Jms Co Ltd 分離容器、アタッチメントおよび分離方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2016147748A1 (ja) * 2015-03-17 2017-04-27 株式会社エム・ビー・エス 試料採取分離器具
CN107532973A (zh) * 2015-03-17 2018-01-02 株式会社Mbs 试样提取分离器
US10730043B2 (en) 2015-03-17 2020-08-04 Micro Blood Science Inc. Sample collection and separation device

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