WO2012057454A2 - 골 이식재 제조방법 및 그로 인해 제조된 골 이식재 - Google Patents

골 이식재 제조방법 및 그로 인해 제조된 골 이식재 Download PDF

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WO2012057454A2
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Lee Yun Jin
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Definitions

  • the present invention relates to a method for manufacturing a bone graft using human hard tissue such as extracted tooth or bone, and more particularly, to a method for producing a bone graft using extracted autologous or allogeneic teeth and a bone graft prepared thereby.
  • bone grafts include autologous bone, allogeneic bone (male bone), xenograft bone (mainly bovine bone), and synthetic bone (calcium complex).
  • autologous bone which contains cells, organic matter and proteins, is the best implant, but has the disadvantage of creating new wounds.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • xenograft Since xenograft has high immune response, only minerals (calcium complex) from which organic matter is removed are used, and bone regeneration ability is lower than that of autologous bone or allogeneic bone. In addition, because of the risk of mad cow disease, some people use synthetic bone, a synthetic calcium complex.
  • Conventional techniques for applying a tooth as a bone graft material include the invention described in Korean Patent Publication No. 2010-040427, which includes collecting a tooth of a patient in need of an implant procedure, grinding it into powder, , To crush the teeth, dehydrate, degrease and demineralize the rinsed teeth, lyophilize and apply the lyophilized teeth to the alveolar bone where the patient's implant is to be treated and implant the implant into the alveolar bone. The method of application is described.
  • the present invention is to provide a method for producing a bone graft material and a bone graft material produced thereby that can significantly shorten the time required to prepare a bone graft by treating human hard tissue such as extracted teeth or bone.
  • the present invention is to provide a bone graft material manufacturing method and a bone graft material produced thereby that can be produced in the implant site without separately transferring the extracted tooth.
  • the chemical reagent treatment step provides a method involving the ultrasonic treatment, including vacuum ultrasonic treatment to irradiate the ultrasonic wave under reduced pressure.
  • the ultrasonic treatment may be performed in the ultrasonic frequency range of 15kHz to 40kHz in terms of preventing the efficiency of deliming and preventing breakage of tissue.
  • vacuum ultrasonication may be performed in a vacuum in the range of 10 mmHg (torr) to 700 mmHg (torr). More preferably, vacuum sonication may be performed in a vacuum in the range of 100 mmHg (torr) to 600 mmHg (torr).
  • the ultrasonic treatment is a vacuum ultrasonic treatment for irradiating the ultrasonic waves under reduced pressure
  • the ratio of irradiating the ultrasonic waves without the reduced pressure Vacuum ultrasonication and vacuum ultrasonication in which ultrasonic waves are irradiated under reduced pressure may be sequentially performed.
  • the chemical reagent treatment step may be carried out under the condition that the temperature range is from room temperature to 60 °C.
  • the distilled water treatment step provides a method involving the ultrasonic treatment.
  • step S1 removing and cleaning the soft tissue and dimensions of the tooth extracted (step S1); Separating the crown and root of the tooth that passed through step S1 and forming at least one hole in the separated crown and root (step S2); Washing the tooth which has undergone the step S2 (step S3); It may include; immersed in the hydrochloric acid solution accompanied by the ultrasonic treatment, step out and wash the teeth after step S3 (step S4).
  • step S4 immersed in the PBS solution containing a protease inhibitor with ultrasonic treatment, the tooth passed through step S4, the step of removing and washing (step S5); Immersing the tooth which has passed the step S5 in the calcium chloride solution accompanied by the ultrasonic treatment, taking it out and washing it (step S6); It is provided with a method comprising the step of immersing the tooth passed through step S6 in the EDTA solution accompanied by sonication, taking out and washing (step S7); if gelatinized collagen additionally, if the tooth passed through step S7 Immersing in a lithium chloride solution with treatment, taking out and washing (step S8); It may further include a step (step S9) of immersing the teeth having passed through step S8 in distilled water accompanied by ultrasonic treatment.
  • Processed teeth can be cryopreserved or lyophilized and stored at room temperature, and EO gas sterilization can be performed as needed.
  • the tooth extracted by the embodiments of the present invention can be produced directly in the field without a separate migration, the tooth extracted in the method for producing a bone graft according to one embodiment
  • the immersion in sterile physiological saline, distilled water or ethanol may be refrigerated, or frozen after removing the immersion solution.
  • the immersion in step S4 is carried out for 60 minutes to 75 minutes in the room temperature to 60 °C temperature considering the point for preserving proteins related to bone formation, etc. It may be desirable.
  • step S5 the immersion in step S5, step S6, step S7 and step S8 is considered, in view of preserving the proteins related to bone formation and removing unnecessary proteins. It may be preferable to perform for 5 to 10 minutes in the room temperature to 60 °C temperature range.
  • the immersion in the step S5 and step S7 can be carried out under pH 7 to 8 conditions.
  • the hydrochloric acid solution in step S4 has a concentration of 0.5N to 2N. It may be desirable to range. More preferably, the hydrochloric acid solution in step S4 may be in the range of 0.5N to 0.6N concentration.
  • Method for producing a bone graft material according to one embodiment of the present invention can be carried out in the field using a tooth extracted without a separate transfer action.
  • Method for producing a bone graft material may include the step of cryopreserving the teeth after the step S9 in a sterile state when storage is required.
  • the method for producing a bone graft material according to an embodiment of the present invention can be stored at room temperature by freeze-drying immediately after the step of cryopreserving or sterilizing the tooth after step S9 if the storage is required and if necessary, in this case Additional EO gas sterilization may be performed for additional sterilization.
  • Method for producing a bone graft material is a reagent treatment time according to the ultrasonic treatment including vacuum sonication in the suitable preparation of bone graft material by treating a human hard tissue such as extracted teeth with a chemical reagent It can be significantly shortened, and can also be used as a implant within at least 2 hours using the tooth extracted because the tooth extracted can be processed in the field without a separate transfer action.
  • the present invention can drastically shorten the time required for manufacturing bone graft material by treating human hard tissues such as extracted teeth or bones, and in the field without separately transferring the extracted teeth. There is an advantage that it can be made into an implant.
  • FIG. 1 is an electron micrograph of a human hard tissue subjected to chemical treatment with ultrasonic treatment to irradiate ultrasonic waves under reduced pressure according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is an electron micrograph of the human hard tissue subjected to chemical treatment accompanied by ultrasonic treatment to irradiate the ultrasonic waves without decompression.
  • Figure 3 is a photograph showing the results of the western blot of the dental graft treated according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a photograph showing the results of the SEM of the dental implant treated in accordance with one embodiment of the present invention.
  • Figure 5 is a photograph showing the results of XRD analysis of the dental graft treated according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 is a photograph of the bacterial culture results and pre-treatment bacterial culture results according to the storage solution during the step S1 ⁇ S3 of the bone graft material of the present invention.
  • the present invention relates to a bone graft material and a method for producing the same, and more particularly, to a method for producing a bone graft material using human hard tissue such as autologous teeth or bone. This, of course, can be applied to the processing of allogeneic teeth and allografts.
  • Human hard tissue also includes bone tissue extracted by pathological findings of hard tissue.
  • the tooth is described as the center, but this is not limited to the tooth.
  • Gum bone graft should be bone remodeled due to the characteristics of alveolar bone.
  • the organic component of the tooth component is type 1 collagen such as alveolar bone, and the inorganic substance is composed of factors of bone remodeling process.
  • the present invention relates to a method of making a gingival bone therapeutic implant using discarded teeth having the same composition as the alveolar bone.
  • 'tooth discarded' or 'extracted tooth' includes both neurotherapy or prosthetic teeth or tooth with cavities, which include autologous or allogeneic teeth. Will be understood.
  • the bone graft material manufacturing method of the present invention is a method for producing a bone graft material through the chemical reagent treatment using the extracted tooth, the chemical reagent treatment is for various purposes, for example, degreasing, deliming, tooth extraction from the tooth extracted All processes for bone grafts, such as the extraction of various components of the process, includes at least one chemical reagent treatment step.
  • the chemical reagent treatment can significantly shorten the overall treatment time by significantly improving the chemical reagent treatment efficiency by the ultrasonic treatment including vacuum ultrasonic treatment for irradiating the ultrasonic waves under reduced pressure.
  • the cavitation is controlled according to the degree of vacuum in addition to the ultrasonic frequency, and in the present invention, it is attached to the surface of the hard tissue of the human body such as a sample in a solution, tooth extracted in the present invention. It can induce the removal of bubbles and penetrate deep into the sample.
  • the relative size of the cavitation decreases, and the effect on the size of the cavitation does not change significantly when the pressure is reduced above a certain vacuum.
  • the vacuum in the range of 10mmHg (torr) to 700mmHg (torr) during the vacuum sonication. More preferably, it may be preferable that the vacuum of 100mmHg (torr) to 600mmHg (torr). If the vacuum is too weak, the effect of the vacuum is relatively poor, there is a problem that the results pursued in the present invention is too late.
  • sonication including vacuum sonication may include all other sonication methods in addition to vacuum sonication which irradiates ultrasonic waves under reduced pressure.
  • the sonication is preferably performed within the frequency range of 15 kHz to 40 kHz in terms of maximizing the efficiency of chemical reagent treatment and thus preventing tissue destruction. More preferably, it is performed within the range of 20 kHz to 40 kHz. For example, when the frequency is increased, it is difficult to meet the efficiency of the reagent treatment because the ultrasonic intensity is weak, and when the frequency is small, the ultrasonic intensity is increased to meet the efficiency of the reagent treatment, but there is a possibility of tissue destruction.
  • Most preferred ultrasonic treatment in the present invention may be a combination of vacuum ultrasonic treatment and non-vacuum ultrasonic treatment.
  • non-vacuum sonication will be understood as sonication without accompanying decompression.
  • it may be desirable to sequentially perform vacuum sonication, non-vacuum sonication and vacuum sonication.
  • vacuum ultrasonic treatment removes air in the microcavity (ivory tubules, Volkman's canal) in the teeth and bone tissue that hinders the penetration of ultrasonic waves. If sonication is performed in a non-vacuum state following release of the reduced pressure, the cavitation can be maximized again to facilitate the intended chemical reagent treatment on the hard tissue surface.
  • vacuum sonication removes fine air, which hinders the delivery of ultrasonic waves, and cavitation is minimized again to increase the penetration of ultrasonic waves to promote chemical treatment effects inside hard tissues. Minimization of the destruction of the site where the treatment occurred.
  • the temporal distribution of vacuum sonication / non-vacuum sonication / vacuum sonication may vary depending on the ultrasonic intensity and the state of the sample.
  • the weight was taken out at that time, washed with distilled water, dried with a dry gauze to dry the surface, and the weight was measured by using a scale (model name: MWP, CAS) of 1 / 100g. .
  • the weight loss rate was calculated based on the following equation 1.
  • the weight loss rate is indirectly treated with hydrochloric acid solution to disprove the efficiency of chemical reagent treatment that achieves its intended purpose.
  • the removal time of about 40% or more of the initial tooth weight at the time of deliming by using the manufacturing method of the present invention and the conventional processing method is about 60 to 70 minutes in the case of the present invention, and the conventional method takes about 48 hours or more Confirmed.
  • One of the objectives of the present invention is to quickly perform chemical reagent treatment in situ without a separate transfer.
  • the major chemical reagent treatment takes about 1 hour and It is desirable that the efficiency be 40% or more.
  • the time required for processing the extracted teeth is about 2 hours, preferably about 1.5 hours. It may be possible to treat teeth in situ without additional migration.
  • the temperature is raised to an appropriate temperature to further improve the process treatment efficiency.
  • the proper temperature it may be preferable that the temperature range from room temperature to 60 °C.
  • the elevated temperature includes a natural elevated temperature due to the ultrasonic treatment.
  • step S1 first remove the soft tissue and dimensions of the extracted tooth, and wash (step S2).
  • the tooth extracted may be sufficient as it is placed in sterile saline solution, distilled water or ethanol, as it is possible to manufacture the implant by chemical treatment in a short time using autologous teeth. .
  • Requesting treatment by a professional supplier using extracted tooth requires a process of refrigeration or cryopreservation of the extracted tooth for storage and transportation after extraction, and this process may be omitted. If the patient's transplantation is postponed, they may be refrigerated or frozen at any stage of the procedure, including extraction, removal of soft tissues and pulp, separation of the crown and roots, opening a hole or treatment. have.
  • step S1 For removing soft tissue and pulp in step S1, hydrogen peroxide solution or ethanol at a concentration of 3 to 7% (w / w) can be used, and physical agitation can be combined to improve the efficiency.
  • step S2 the crown and root of the tooth having passed through step S1 are separated and several small holes are formed in the separated crown and root (step S2).
  • the separation form such as vertical separation or horizontal separation to a desired shape is not particularly limited.
  • the method of forming holes in the crown and root is not particularly limited.
  • a high speed bur can be used, and the number of holes is not particularly limited. It may be desirable to form 10 to 16 holes per 1 cm 2 of tooth area in view of increasing the transmission effect and the like.
  • step S3 the teeth having passed through step S2 are washed.
  • saline or distilled water may be used, or an ultrasonic bath may be used. Hydrogen peroxide can also be used for washing.
  • the time required for the process from step S1 to step S3 is sufficient within 15 minutes. This time can be reduced because the time required for subsequent chemical reagent processing can be significantly shortened, so that the above-described steps can be performed in the field.
  • step S3 the tooth which passed through step S3 is immersed in the hydrochloric acid solution accompanying an ultrasonic treatment, it is taken out and washed (step S4).
  • Step S4 is a process for removing extracted minerals and extracting soluble protein. Extracted tooth minerals or soluble proteins delay the activation of various proteins for osteoinduction and are important for the initial bone formation. It may act to inhibit anger, so it must be removed or extracted.
  • the concentration of the hydrochloric acid solution may be used in the range of 0.5N to 2N, more preferably, the concentration in the range of 0.5N to 0.6N may be preferable in terms of removing the mineral while preserving the effective organic materials such as various proteins. have. If the concentration of hydrochloric acid is excessively high, the rate of demineralization is increased but organic damage is severe, resulting in deterioration of the function of the implant. It is preferable to raise the temperature together with the sonication and to carry out in the range from room temperature to 60 ° C in view of preventing denaturation of various proteins, and the treatment time is sufficient to be about 60 to 75 minutes.
  • the mineral content is about 95%, and it is possible to control the amount of remaining minerals by adjusting the settling time in hydrochloric acid solution. If so, it is also possible to adjust the immersion time in the hydrochloric acid solution to about 30 minutes. In this case, it can also be used as a implant containing minerals can be used clinically.
  • the amount of the hydrochloric acid solution is not limited so long as the tooth extracted can be immersed.
  • the hydrochloric acid solution may be used in an amount of 50 to 100 ml per tooth in consideration of the size of the container.
  • washing out to wash may be performed using distilled water.
  • the pressure is repeated for a predetermined time at a cycle of depressurization (vacuum-on) and then atmospheric pressure (vacuum-off, vacuum-off). Doing so can maximize the deliming effect.
  • step S4 the tooth which passed through step S4 is immersed in PBS (phosphate buffer solution) containing a protease inhibitor accompanied by sonication, pulled out, and washed (step S5).
  • PBS phosphate buffer solution
  • Step S5 is a treatment step for preserving extracted non-collagenous proteins (NCPs), EX: dentin matrix protein (DMP), and dentin sialophosphoprotin (DSP) in extracted teeth. It must be preserved when it is made into an implant, without being removed or reduced during the processing step, to function as an implant.
  • NCPs non-collagenous proteins
  • DMP dentin matrix protein
  • DSP dentin sialophosphoprotin
  • the phosphate buffer solution has a pH of about 7 to 8, more preferably, with iodoacetic acid and sodium azide in order to remove various enzymes and preserve various proteins. pH is adjusted to about 7.4.
  • the amount of the phosphate buffer solution is not limited so long as the tooth extracted can be immersed.
  • the phosphate buffer solution may be used in an amount of 10 to 20 ml per tooth in consideration of the size of the container.
  • washing out by washing may be performed using distilled water.
  • step S5 the tooth which passed through step S5 is immersed in the calcium chloride solution accompanying an ultrasonic treatment, it is taken out and wash
  • Step S6 is the extraction of low molecular weight proteoglycans from extracted teeth (crown), wherein the calcium chloride solution has a concentration of 1.5 It may be preferred to be from 2.5M.
  • a lithium chloride solution, a guanidine chloride solution (4 to 5M), urea (6 to 8M), or the like may be used in addition to the calcium chloride solution.
  • a potassium chloride solution or the like may be considered.
  • the amount of the calcium chloride solution is not limited so long as the tooth extracted can be immersed.
  • the calcium chloride solution may be used in an amount of 10 to 20 ml per tooth in consideration of the size of the container.
  • washing off and washing may be performed using distilled water.
  • step S6 the tooth which passed through step S6 is immersed in the EDTA solution accompanying sonication, it is picked out and wash
  • EDTA solution of step S7 may be preferably adjusted to a pH of about 7 to 8, more preferably about 7.4 pH.
  • the amount of the EDTA solution is not limited so long as the tooth extracted can be immersed.
  • the amount of EDTA solution may be used in an amount of 10 to 20 ml per tooth in consideration of the size of the container.
  • washing out by washing may be performed using distilled water.
  • step S7 the teeth which have undergone step S7 are immersed in a lithium chloride solution accompanied by sonication, taken out and washed (step S8).
  • Step S8 is a step of gelatinizing, specifically, a step for contracting collagen fibrils and converting collagen of teeth into gelatin.
  • the lithium chloride solution has a concentration of 7 It may be desirable to adjust to about 9M.
  • the amount of the lithium chloride solution is not limited so long as the tooth extracted can be immersed.
  • the lithium chloride solution may be used in an amount of 10 to 20 ml volume per tooth in consideration of the size of the container.
  • washing out by washing may be performed using distilled water.
  • Teeth having passed through step S8 are immersed in distilled water accompanied by sonication (step S9).
  • Step S9 is a step of extracting the water-soluble collagen, in which it may be preferable to perform the immersion in distilled water at least twice repeatedly with sonication in that it can increase the extraction efficiency.
  • the amount of distilled water is not limited so long as the tooth extracted can be immersed.
  • the amount of distilled water may be used in an amount of 50 to 2000 ml per tooth in consideration of the size of the container.
  • Steps S8 and S9 of the above-described steps are steps for gelatinizing collagen of teeth, and if the original collagen is to be used, the corresponding steps may be omitted.
  • the reagents used in the chemical reagent treatment in the above-described whole process is a sterilization process.
  • Processed teeth can be cryopreserved or lyophilized and stored at room temperature, and when lyophilized, they can be stored for a long time depending on the sealing condition, and EO gas sterilization can be performed if necessary.
  • the time required to manufacture the bone graft material from the tooth extracted through the entire process described above is at most about 2 hours.
  • the processing time can be shortened if each step is omitted.
  • Decompression treatment may be applied at all stages of sonication. Pressure reduction does not have to be combined with sonication. Depending on the condition of the tooth or bone to be treated, it may be sufficient to apply it only to the S4 stage, which takes the most time. However, in order to shorten the treatment time, it is preferable to apply at all stages of the ultrasonic treatment.
  • Decompression may begin through a vacuum vaccum-on and continue to maintain a reduced pressure.
  • cycle cycle of vacuum application when applying the reduced pressure
  • the ultrasonic cavitation is adjusted, and ultimately the processing time is shortened.
  • the method of controlling the cycle of vacuum application when applying decompression with ultrasonic waves is to turn on the vacuum device and start depressurizing the pressure inside the device where the tooth or bone is treated. Keep it in equilibrium with The cycle of vacuum application was preferred when the time ratio of reduced pressure (vacuum-on) and atmospheric pressure (vacuum-off, vacuum-off) was in the range of 1: 1 to 1: 4. For example, a cycle of 40 seconds under reduced pressure (vacuum-on) followed by 120 seconds of atmospheric pressure (vacuum-off) may be repeated.
  • the application time of the reduced pressure may vary depending on the efficiency of the vacuum apparatus, but usually 30 seconds to 2 minutes was found to be preferable.
  • the time ratio of the depressurization operation and the atmospheric pressure operation may vary depending on the structural features of the vacuum apparatus as a problem depending on how quickly the processing apparatus arrives in parallel with the atmospheric pressure after the vacuum apparatus is turned off. It depends on how quickly it reaches its target vacuum and how quickly it equilibrates with atmospheric pressure. In general, excessive increases in decompression time or too long decompression-atmospheric exchange cycles have not been shown to increase or decrease the deliming effect.
  • the bone graft obtained in this manner can be directly implanted in the extraction site of a patient who has been directly extracted, and may have an effect equal to or higher than that of a conventional implant manufacturing method using an autologous tooth.
  • step S1 to S9 of the bone graft of the present invention The presence of the protein contained in the dental graft treated through the manufacturing method (steps S1 to S9) of the bone graft of the present invention was confirmed through a western blot.
  • Western blot is a technique for detecting a specific protein through an antigen-antibody reaction using an antibody that targets the protein to be searched.
  • Subject sample prepared a total of three samples as follows, and prepared four kinds of target proteins together.
  • step S1 Preparation process before bone graft material of the present invention ⁇ 1> (step S1 ⁇ step S9), using 0.6N HCL, repeated vacuum
  • step S1 to step S4, step S9 Process up to ⁇ 2> (step S1 to step S4, step S9) during the bone graft material manufacturing process of the present invention (some reagents omitted), 0.6N HCL, vacuum repeated
  • step S1 Preparation process before bone graft material of the present invention ⁇ 3> (step S1 ⁇ step S9), using 1.0N HCL, vacuum
  • DMP-1 (57kDa): protein involved in the induction of osteoblasts
  • DSP 54kDa: Dentin sialophosphoprotin is involved in dentin formation
  • MMP-2 (74kDa)
  • MMP-20 (54kDa): involved in wound healing, bone growth, blood vessel formation and tissue remodeling
  • the bone graft treated through the manufacturing method (steps S1 to S9) of the bone graft material of the present invention was confirmed by SEM.
  • Subject samples prepared a total of five samples as described above.
  • step S1 Preparation process before bone graft material of the present invention ⁇ 1> (step S1 ⁇ step S9), 0.6N HCL use (demining time 70 minutes), vacuum repeat
  • step S1 process only up to ⁇ 2> (step S1 ⁇ step S4, step S9: some reagents not treated) during the bone graft material manufacturing process of the present invention, using 0.6N HCL (demining time 70 minutes), vacuum repeat
  • step S1 Preparation process before bone graft material of the present invention ⁇ 3> (step S1 ⁇ step S9), using 1.0N HCL, demineralization time 70 minutes, vacuum
  • Step S1 Manufacturing process before general bone graft material ⁇ 4> (Step S1 ⁇ Step S9), 0.6N HCL, Demineralization time 63 hours, Vacuum not used
  • GBM ⁇ 5> (gelatinized bone matrix; implant processed using human ribs), 0.6N HCL, demineralization time 24 hours, no vacuum
  • subject sample ⁇ 2> only part of the ivory tubules were observed by proceeding with demineralization, and the sample looks similar in appearance to subject samples ⁇ 1> and ⁇ 5>, but there is a limitation in the rearrangement of proteins including collagen at molecular biological level. It was observed that the expression of the protein in the Western blot was significantly lower than that of the subject sample. There are significant limitations on the outflow of growth factors and on the expression of effects in vivo. In the case of subject sample ⁇ 3>, relatively rough surface was observed by deliming with 1.0 HCL, and the growth factor in dentin was impaired.
  • steps S1 to S3 helps to remove the inner calcium component.
  • the sterilization state before the treatment and the sterilization state after treatment according to the storage solution of the teeth of steps S1 ⁇ S3.
  • steps S1-S3 of the present invention were stored in ethanol as shown in Figure 6A, and stored in physiological saline as shown in Figure 6B (contaminated), Figure 6C (relatively contaminated).
  • the present invention can significantly shorten the time required for manufacturing bone graft material by treating human hard tissues such as extracted teeth or bones, and implants in the field without separately transferring the extracted teeth. It is possible to manufacture the furnace, and it can be seen that it can be used without side effects even in clinical application and exhibits excellent bone healing effect due to the use of self teeth.

Abstract

본 발명은 발치된 치아를 이용하여 골 이식재를 제조하는 방법과 그로 인해 제조된 골 이식재에 관한 것으로서, 특히 발치된 자가 치아 내지는 동종 치아를 이용하여 단시간 내에 이식재로의 제조가 가능한 골 이식재의 제조방법을 개시한다.

Description

골 이식재 제조방법 및 그로 인해 제조된 골 이식재
본 발명은 발치된 치아나 뼈와 같은 인체 경조직을 이용하여 골 이식재를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 특히 발치된 자가 치아 내지 동종 치아를 이용한 골 이식재 제조방법 및 그로 인해 제조된 골 이식재에 관한 것이다.
정형외과 및 치과 영역에서 골 이식재는 자가골, 동종골(남의 뼈), 이종골(주로 소뼈), 합성골(칼슘복합체) 등이 있다. 이들 중 세포, 유무기질 및 단백질이 포함된 자가골이 가장 좋은 이식재이지만 새로운 상처를 만든다는 단점이 있다.
동종골은 약간의 면역반응이 있기 때문에 항원성을 줄이기 위해 냉동(freezing) 또는 냉동-건조(feeze-drying)를 하고, 주로 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein, 이하 "BMP"라 약칭함)과 콜라젠을 이용하는 칼슘을 제거한 탈회골이 비탈회골보다 임상결과가 좋은 것으로 알려져 있다.
이종골은 면역반응이 높기 때문에 유기질을 제거한 무기질(칼슘 복합체)만을 사용하고, 골 재생 능력에 있어서는 자가골이나 동종골에 비하여 낮다. 또한 광우병의 위험이 있기 때문에 일부에서는 합성 칼슘 복합체인 합성골을 사용한다.
골 이식재가 빠른 골형성을 보이기 위해서는 새로운 혈관 형성이 빨리 일어나고 세포가 증식할 수 있는 환경을 제공해야 하는데, 자가골이나 동종골에서 칼슘을 제거하는 것이 이를 위한 중요한 과정이다.
치아가 골 이식재료로 사용될 수 있다는 것은 아주 오래전 연구에 의해 밝혀져 있다. 그러나 동물실험 수준에 머물러 있었다.
치아를 골 이식재료로 적용하기 위한 종래의 기술로는 한국 특허공개 제2010-040427호에 기재된 발명을 들 수 있는데, 여기에는 임플란트 시술이 요구되는 환자의 치아를 채취하고, 이를 파우더로 분쇄한 다음, 분쇄된 치아를 세척하고, 세척된 치아를 탈수, 탈지 및 탈회하고, 냉동건조한 다음 냉동건조된 치아를 환자의 임플란트가 시술될 치조골에 적용하고, 치조골에 임플란트를 시술하는 방법으로 자기 치아를 이식재로 적용하는 방법이 기재되어 있다.
이와 같은 방법에 의하면 발치된 자가 치아를 이용하여 뼈 이식재로 제조하여 활용하기까지 10일 이상이 소요되는 문제가 있다.
본 발명은 발치된 치아나 뼈와 같은 인체 경조직을 처리하여 골 이식재로 제조하는 데 있어서 소요되는 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있는 골 이식재 제조방법 및 그로 인해 제조된 골 이식재를 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 발치된 치아를 별도로 이관조치하지 않고 현장 내에서 이식재로의 제조가 가능한 골 이식재 제조방법 및 그로 인해 제조된 골 이식재를 제공하고자 한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 실현하기 위한 본 발명의 일 구현예에서는 발치된 치아 및 뼈 중에서 선택되는 적어도 1종 이상의 인체 경조직으로부터 적어도 1 단계 이상의 화학적 시약처리 단계를 거쳐 골 이식재를 제조하는 방법으로, 화학적 시약처리 단계는 감압 하에서 초음파를 조사하는 진공 초음파 처리를 포함하는 초음파 처리를 수반하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서는 탈회의 효율과 조직의 파괴발생을 방지할 수 있는 측면에서 초음파 처리가 초음파 주파수 15kHz 내지 40kHz 범위에서 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서는 인체 경조직의 외부 및 내부에서의 효과적인 탈회를 고려할 때 진공 초음파 처리가 10mmHg(torr) 내지 700mmHg(torr) 범위의 진공에서 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는 진공 초음파 처리가 100mmHg(torr) 내지 600mmHg(torr) 범위의 진공에서 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서는 초음파의 세기와 진공을 효율적으로 조합하여 탈회 효과를 극대화할 수 있는 측면에서 초음파 처리가 감압 하에서 초음파를 조사하는 진공 초음파 처리, 감압을 수반하지 않고 초음파를 조사하는 비진공 초음파 처리 및 감압 하에서 초음파를 조사하는 진공 초음파 처리를 순차적으로 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 의하면 화학적 시약 처리 단계는 온도범위가 상온 내지 60℃인 조건 하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 의하면 화학적 시약 처리 단계 이외에, 세척을 위한 목적이 아닌 증류수 처리 단계를 포함하고, 증류수 처리 단계는 초음파 처리를 수반하는 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에서 발치된 치아의 탈회를 고려할 때, 발치된 치아의 연조직 및 치수를 제거하고, 세척하는 단계(단계 S1); 단계 S1을 거친 치아의 치관과 치근을 분리하고 분리된 치관 및 치근에 적어도 하나의 구멍을 형성하는 단계(단계 S2); 단계 S2를 거친 치아를 세척하는 단계(단계 S3); 단계 S3를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 염산 용액 중에 침지하고, 건져내어 세척하는 단계(단계 S4);를 포함할 수 있다. 또한 단계 S4를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 프로테아제 저해제를 포함하는 PBS 용액 중에 침지하고, 건져내어 세척하는 단계(단계 S5); 단계 S5를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 염화칼슘 용액 중에 침지하고, 건져내어 세척하는 단계(단계 S6); 단계 S6를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 EDTA 용액 중에 침지하고, 건져내어 세척하는 단계(단계 S7);를 포함하는 방법을 제공하며, 추가적으로 콜라젠을 젤라틴화하는 경우라면 단계 S7를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 염화리튬 용액 중에 침지하고, 건져내어 세척하는 단계(단계 S8); 단계 S8을 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 증류수 중에 침지하는 단계(단계 S9)를 더 포함할 수도 있다. 가공된 치아는 냉동보관하거나 또는 냉동건조하여 실온에 보관할 수 있고 필요에 따라 EO가스 멸균을 실시할 수 있다.
본 발명의 일 구현예들에 의해 발치된 치아를 이용하여 별도의 이관조치 없이 현장 내에서 직접적으로 골 이식재를 제조할 수 있음에 따라, 일 구현예에 의한 골 이식재의 제조방법에 있어서 발치된 치아는 멸균된 생리식염수, 증류수 또는 에탄올에 침지하여 냉장, 또는 침지 용액을 제거후 냉동 보관된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 의한 골 이식재의 제조방법에 있어서 단계 S4에 있어서 침지는 골형성에 관계되는 단백질 등을 보존하기 위한 점을 고려할 때 상온 내지 60℃ 온도 범위에서 60분 내지 75분 동안 수행되는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 의한 골 이식재의 제조방법에 있어서 골형성에 관계되는 단백질 등을 보존하고 불필요한 단백질을 제거하기 위한 점을 고려할 때 단계 S5, 단계 S6, 단계 S7 및 단계 S8에 있어서 침지는 상온 내지 60℃ 온도 범위에서 5 내지 10분 동안 수행되는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 의한 골 이식재의 제조방법에 있어서 골형성에 관계되는 단백질 등을 보존하기 위한 점을 고려할 때 단계 S5 및 단계 S7에 있어서 침지는 pH 7 내지 8 조건 하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 의한 골 이식재의 제조방법에 있어서 골형성에 관계되는 단백질 등을 보존하고 신속히 무기성분을 제거하기 위한 점을 고려할 때 단계 S4에 있어서 염산 용액은 농도가 0.5N 내지 2N의 범위인 것이 바람직할 수 있다. 더욱 바람직하게는 단계 S4에 있어서 염산 용액은 농도가 0.5N 내지 0.6N의 범위인 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 일 구현예들에 의한 골 이식재의 제조방법은 발치된 치아를 이용하여 별도의 이관조치 없이 현장 내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 의한 골 이식재의 제조방법은 보관을 필요로 하는 경우 단계 S9를 거친 치아를 멸균 상태로 냉동보관하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 의한 골 이식재의 제조방법은 보관을 필요로 하는 경우 단계 S9를 거친 치아를 멸균 상태로 냉동보관하는 단계 후 또는 제조 즉시 냉동건조하여 실온에 보관할 수 있고 이 경우 필요에 따라 부가적 멸균을 위해 EO 가스 멸균을 추가 시행할 수도 있다.
또한, 상기 선택된 어느 하나의 제조방법에 의해 얻어지는 골 이식재를 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 의한 골 이식재의 제조방법은 발치된 치아 등의 인체 경조직을 화학적 시약 처리하여 골 이식재로 적합하게 제조하는 데 있어서 진공 초음파 처리를 포함하는 초음파 처리를 수반함에 따라 시약 처리 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있으며, 또한 발치된 치아를 별도의 이관조치 없이 현장 내에서 처리할 수 있으므로 발치된 치아를 이용하여 적어도 2시간 이내에 이식재로 활용가능하다.
이상에서 설명한 바와 같이 본 발명은 발치된 치아나 뼈와 같은 인체 경조직을 처리하여 골 이식재로 제조하는 데 있어서 소요되는 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있고, 발치된 치아를 별도로 이관조치하지 않고 현장 내에서 이식재로의 제조가 가능한 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 감압 하에 초음파를 조사하는 초음파 처리를 수반하여 화학적 처리를 한 인체 경조직의 전자현미경 사진.
도 2는 감압하지 않은 상태로 초음파를 조사하는 초음파 처리를 수반하여 화학적 처리를 한 인체 경조직의 전자현미경 사진.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따라 처리된 치아이식재의 웨스턴 블랏의 결과를 나타낸 사진.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 처리된 치아이식재의 SEM의 결과를 나타낸 사진.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 처리된 치아이식재를 XRD분석한 결과를 나타낸 사진.
도 6은 본 발명의 골 이식재의 제조 과정 중 단계 S1~S3 동안 보관용액에 따라 처리전 세균배양결과와 처리후 세균배양결과에 대한 사진.
A: 에탄올에 보관하여 처리를 시작한 경우 에탄올에 의해 처리전에도 멸균상태이고 처리후에도 멸균상태인 것을 확인
B: 생리식염수에 보관하여 처리를 시작한 경우 처리전에는 멸균상태가 아니지만 처리후에는 멸균상태인 것을 확인
C: 생리식염수에 보관하여 처리를 시작한 경우 처리전에는 멸균상태가 아니지만 처리후에는 멸균상태인 것을 확인
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 골 이식재 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 특히 자가 치아나 뼈와 같은 인체 경조직을 이용하여 골 이식재로 제조하는 방법에 관한 것이다. 이는 동종치아 및 동종뼈이식재 가공시에도 적용될 수 있음은 물론이다.
또한 인체 경조직은 경조직의 병리적 소견에 의해 적출된 골조직을 포함한다.
하기에서는 특히 인체 경조직 중에서도 치아를 중심으로 기재하나 이것이 치아에만 국한되는 것은 아니다.
잇몸뼈 이식재는 치조골의 특성상 저작압을 견딜 수 있는 뼈로 치환(Bone Remodeling)되어야 한다. 치아의 구성성분 중 유기물의 경우 치조골과 같은 제1형 콜라젠(Type 1 Collagen)이며, 무기물은 뼈의 치환(Bone Remodeling) 과정의 인자들로 구성되어 있다.
본 발명은 이와 같이 치조골과 구성성분이 똑같은, 버려지는 치아를 이용하여 잇몸뼈 치료 이식재로 만드는 방법에 관한 것이다.
상기 및 이하의 기재에서 '버려지는 치아' 또는 '발치된 치아'는 신경치료나 보철 치료된 치아 또는 충치가 있는 치아를 모두 포함하며, 이는 자가 치아이거나 동종 치아를 모두 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 골 이식재 제조방법은 발치된 치아를 이용하여 화학적 시약처리를 통해 골 이식재로 제조하는 방법으로, 화학적 시약처리라 함은 다양한 목적, 일예로 발치된 치아의 탈지, 탈회, 발치된 치아로부터의 다양한 성분의 추출 등 골 이식재화를 위한 모든 과정을 포함하며 이는 적어도 1단계 이상의 화학적 시약처리단계를 포함한다.
본 발명에서는 화학적 시약처리가 감압 하에서 초음파를 조사하는 진공 초음파 처리를 포함하는 초음파 처리를 수반하여 화학적 시약처리 효율을 현저하게 향상시킴으로써 전체 처리 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있다.
초음파 처리에 있어서 감압 하에서 초음파를 조사하는 진공 초음파 처리의 경우는 초음파 주파수 이외에 진공 정도에 따라 캐비테이션 현상(cavitation)을 제어함으로써 용액 속의 시료, 본 발명에서는 발치된 치아 등의 인체 경조직의 표면에 부착되어 있는 기포의 제거 및 시료 내부 깊숙한 곳까지의 침투를 유도할 수 있다.
진공 초음파 처리가 치아의 화학적 시약처리에 있어서 발휘하는 기작을 명확히 설명하기는 어려우나, 예측컨대 주어진 초음파 주파수(초음파 세기) 범위에서 진공 초음파 처리를 수반하는 화학적 시약처리를 수행하는 경우 감압의 시작 단계에서는 캐비테이션의 상대적 크기는 큰 상태로 파괴력은 강해 치아 표면의 상아질칼슘 성분을 제거하기 시작하고, 일정 압력 이하로 감압되는 경우(저압인 경우)라면 즉 진공도가 일정 범위 내에 있는 경우라면 시료 내의 미세 공기 같은 초음파의 전달을 방해하는 요소를 음압을 통해 제거할 수 있으며 캐비테이션의 상대적 크기는 최소화되고 파괴력은 약하나 제거된 상아질 속으로 캐비티(cavity)가 침투되어 목적하는 화학적 처리가 수행될 수 있다.
진공이 커질수록 캐비테이션의 상대적인 크기는 줄어들며 일정 진공 이상으로 감압되는 경우에는 캐비테이션의 크기에 미치는 영향이 크게 달라지지 않는다.
이러한 점을 고려할 때, 진공 초음파 처리 시 10mmHg(torr) 내지 700mmHg(torr) 범위의 진공인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 100mmHg(torr) 내지 600mmHg(torr)의 진공인 것이 바람직할 수 있다. 진공이 너무 약하면 진공의 효과가 상대적으로 빈약하여 본 발명에서 추구하는 결과가 너무 늦게 발현되는 문제점이 있다.
상기 및 이하에서 "진공 초음파 처리를 포함하는 초음파 처리"는 감압 하에서 초음파를 조사하는 진공 초음파 처리 이외에 여타의 초음파 처리 방법을 모두 포함할 수 있음을 일컫는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서 초음파 처리는 주파수 범위 15kHz 내지 40kHz 범위 이내에서 수행되는 것이 화학적 시약처리의 효율을 극대화하면서도 그에 따른 조직의 파괴를 방지할 수 있는 측면에서 바람직하다. 더욱 바람직하게는 20kHz 내지 40kHz 범위 이내에서 수행한다. 일예로 주파수가 커지는 경우는 초음파 세기가 약하여 시약처리의 효율을 충족시키기 어렵고 주파수가 작은 경우는 초음파 세기는 커져서 시약처리의 효율을 충족하는 반면 조직의 파괴가 발생할 여지가 있다.
본 발명에서 가장 바람직한 초음파 처리는 진공 초음파 처리와 비진공 초음파 처리가 병행되는 것일 수 있다. 여기서 비진공 초음파 처리라 함은 감압을 수반하지 않는 초음파 처리로 이해될 것이다. 구체적으로는 진공 초음파 처리, 비진공 초음파 처리 및 진공 초음파 처리가 순차적으로 수행되는 것이 바람직할 수 있다.
일예로 화학적 시약처리시 일정 초음파 주파수 내에서 감압을 시작하면, 즉 진공 초음파 처리를 수행하면 초음파의 침투를 방해하는 치아와 골 조직 내의 미세공간(상아세관, Volkman's canal) 내의 공기를 제거하고, 이후 감압의 해제에 따라 비진공 상태에서 초음파 처리를 수행하면 캐비테이션은 다시 최대화되어 경조직 표면에서의 의도하는 화학적 시약 처리를 촉진할 수 있다. 또한 일정 시간 후 다시 감압하면, 즉 진공 초음파 처리를 수행하면 초음파의 전달을 방해하는 미세공기 등을 제거하고, 캐비테이션은 다시 최소화되어 초음파의 침투력이 증가되어 경조직 내부의 화학적 처리효과를 촉진하며, 화학적 처리가 일어난 부위의 파괴를 최소화하게 된다.
진공 초음파 처리/ 비진공 초음파 처리 / 진공 초음파 처리의 시간적인 분배는 초음파 세기와 시료의 상태 등에 따라서 달라질 수 있다.
화학적 시약처리시에 초음파 처리에 있어서 감압의 여부에 따른 효과를 확인하기 위하여, 각각 초기 중량이 다른 인체 경조직을 이용하여 진공 초음파 처리(초음파 주파수 20kHz에서 600mmHg(torr)의 진공을 걸어줌)를 수반하는 염산 용액(0.6N 농도) 50 내지 200 ㎖중에 60분 동안 침지한 경우와, 진공을 걸어주지 않고 초음파 주파수 20kHz 조건으로 초음파 처리하여 동일 조건으로 시약처리한 경우 경조직의 중량 변화를 측정하여 화학적 시약처리 효과를 확인한 결과 다음 표 1 및 2와 같은 결과를 얻을 수 있었다. 제시된 실험자료는 염산 용액이 0.6N 농도를 사용하였으며, 이외에도 본 발명의 바람직한 염산 용액의 농도 범위에서도 유사한 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다. 또한 대조군으로 한국 특허공개 제2010-040427호에 기재된 기존의 방법으로 화학적 시약처리 후의 중량변화를 관찰하여 표3의 결과를 얻을 수 있었다.
중량은 해당 시간에 조직을 꺼내어 증류수로 세척한 다음 마른 거즈로 표면의 물기를 제거한 방법으로 건조한 다음, 그 중량을 1/100g 단위의 저울(모델명 : MWP, (주)CAS)을 이용하여 측정하였다.
중량감소율은 다음의 식 1에 의거 산출하였다.
식 1
중량감소율(%) = (시료의 초기중량-해당 시간 경과 후 시료의 중량)/초기중량 × 100
중량감소율은 간접적으로 염산 용액으로 처리하여 의도하는 목적을 달성한 화학적 시약처리 효율을 반증한다.
표 1
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상기 표 1을 보면, 초음파와 진공을 동시에 한 경우 60분 경과시 40%이상의 무기질 감소를 확인할 수 있었으며, 상기 표 2에서 보듯이 진공을 걸지 않고 초음파만 한 경우 약 30%대의 무기질 감소만이 이루어졌고, 상기 표 3에서 보듯이 초음파 및 진공을 모두 사용하지 않은 경우에는 40%대의 무기질 감소를 위해선 최소 48시간 이상의 시간이 경과함을 관찰할 수 있다. 상술한 본 발명의 바람직한 초음파 범위와 바람직한 진공(음압) 범위의 다양한 값들을 선택한 경우에서도 상기 표 1에서 표 3과 유사한 결과를 실험적으로 얻을 수 있었다.
결국, 본 발명의 제조방법과 종래의 가공방법을 사용하여 탈회시 초기 치아 무게의 약 40%이상 제거되는 시간이 본 발명의 경우 약 60~70분이고, 종래의 경우 약 48시간 이상이 소요되는 것이 확인되었다.
표 1의 결과로부터 진공 초음파 처리를 수반한 화학적 시약처리와 비진공 초음파 처리를 수반한 화학적 시약처리의 경우, 초음파와 진공을 모두 사용하여 제조한 시료 1의 60분 화학적 처리 후의 결과물을 전자현미경(LEO1530, CAL ZEISS-NORAN THERMOFIXHER사 제품)으로 관찰하여 그 결과를 도 1로 나타내었으며, 초음파만 사용하여 제조한 시료 1의 60분 화학적 처리 후의 결과물의 전자현미경 사진을 도 2로 나타내었다.
본 발명에서 목적하는 것 중의 하나가 별도의 이관조치없이 현장 내에서 화학적 시약처리를 빠르게 수행하기 위한 것인데, 이러한 점을 고려할 때 주요한 화학적 시약처리는 1시간 정도 소요되는 것이 바람직하고 또한 화학적 시약처리의 효율이 40% 이상 되는 것이 바람직하다.
결과적으로 감압 하에서 초음파를 조사하는 진공 초음파 처리는 골 이식재를 제조하기 위한 시료의 화학적 시약처리에 있어서 효과적으로 작용함을 알 수 있다.
물론, 화학적 시약처리뿐만 아니라 세척공정이 아닌 증류수 처리 공정에서도 마찬가지로 초음파 처리를 수반함으로써 전체 처리 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있다.
이와 같이 발치된 치아로부터 골 이식재로 제조하는 데 있어서 초음파 처리를 수반하는 화학적 시약처리를 수행하는 경우 발치된 치아를 처리하는 데 소요되는 시간이 최대 2시간 정도, 바람직하기로는 1.5 시간 정도이어서 발치된 치아를 별도의 이관조치없이 현장 내에서 처리하는 것이 가능해질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 의하면 화학적 시약 처리시에 초음파 처리와 함께 화학적 시약 처리에 사용되는 시약의 특성을 고려하여 적정 온도로 승온하여 주면 공정 처리 효율을 더욱 향상시킬 수 있다. 여기서 적정 온도의 일예로는 상온 내지 60℃ 범위인 것이 바람직할 수 있다. 여기서의 승온은 초음파 처리에 기인하는 자연적 승온을 포함함은 물론이다.
본 발명의 일 구현예에 의한 골 이식재의 제조방법을 좀 더 구체적으로 살펴보면, 먼저 발치된 치아의 연조직 및 치수를 제거하고, 세척한다(단계 S1).
상술한 것과 같이 본 발명의 방법에 의하면 자가 치아를 이용하여 단시간 내에 화학적 처리를 통한 이식재로의 제조가 가능함에 따라 발치된 치아는 멸균된 생리식염수, 증류수 또는 에탄올에 넣어 둔 상태의 것이면 충분할 수 있다.
발치된 치아를 이용하여 전문가공업체에 처리를 요청하게 되면 발치 후 보관 및 운송을 위해 발치된 치아를 냉장 또는 냉동보관하는 과정을 필요로 하는데, 본 발명에서는 이러한 과정을 생략할 수 있다. 만약 환자의 이식수술이 연기되는 경우가 발생한다면 발치된 상태, 발치후 연조직과 치수를 제거하고 치관과 치근을 분리하여 구멍을 형성한 상태 또는 처리를 시행한 상태 등 어떤 과정에서도 냉장 또는 냉동 보관할 수 있다.
단계 S1에서 연조직 및 치수 제거에는 3 내지 7% 농도(w/w)의 과산화수소수 용액 또는 에탄올을 사용할 수 있으며, 물리적 교반을 병행하여 그 효율을 향상시키는 것도 고려될 수 있다.
다음으로, 단계 S1을 거친 치아의 치관과 치근을 분리하고 분리된 치관 및 치근에 여러 개의 작은 구멍을 형성한다(단계 S2).
치관 및 치근의 분리시에 치근이 두꺼운 경우 세로 분리 또는 원하는 형태로의 가로 분리 등 분리 형태에는 각별히 한정이 있는 것은 아니다.
치관 및 치근에 구멍을 형성하는 것은 단시간 내의 시약 투과 효과를 높이면서 신생혈관의 침투를 용이하게 할 수 있는 효율을 높일 수 있기 때문이다.
치관 및 치근에 구멍을 형성하는 방법에는 각별히 한정이 있는 것은 아니며, 일예로 고속 절삭기구(high speed bur) 등을 이용할 수 있고, 구멍의 수 또한 각별히 제한이 있는 것은 아니나 치아의 형태를 유지하면서 시약투과 효과 등을 높이는 것을 고려할 때 치아 면적 1cm2 당 10 내지 16개의 구멍을 형성하는 것이 바람직할 수 있다.
다음으로 단계 S2를 거친 치아를 세척한다(단계 S3).
세척에는 생리식염수 또는 증류수를 이용할 수 있고 초음파 욕조를 사용할 수도 있다. 또한 세척에는 과산화수소를 이용할 수도 있다.
본 발명에 따르면 상기 단계 S1으로부터 단계 S3까지의 과정을 거치는데 소요시간은 15분 이내이면 충분하다. 이와 같이 소요시간을 줄일 수 있는 것은 후속되는 화학적 시약처리에 소요되는 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있음에 따라 현장 내에서 상술한 단계를 수행할 수 있기 때문이다.
다음으로, 단계 S3를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 염산 용액 중에 침지하고, 건져내어 세척한다(단계 S4).
단계 S4는 발치된 치아의 무기질을 제거하고 산용해 단백질을 추출하기 위한 과정으로, 발치된 치아의 무기질이나 산용해 단백질은 골유도를 위한 여러 단백질의 활성화를 지연시키고 초기 골형성 단계에서 중요한 신생혈관화를 저해하는 작용을 할 수 있으므로 제거하거나 추출해내야 한다.
이때 염산 용액의 농도는 0.5N 내지 2N 범위의 것이 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.5N 내지 0.6N 범위의 농도가 여러 단백질 등의 유효유기질을 보존하면서 무기질을 제거할 수 있는 측면에서 바람직할 수 있다. 염산의 농도가 과도하게 진한 경우는 탈회의 속도는 증가되지만 유기질의 손상이 심하여 이식재로의 기능이 저하되는 결과를 초래한다. 초음파 처리를 수반하는 것과 함께 승온하여 상온 내지 60℃ 범위에서 수행하는 것이 여러 단백질의 변성을 방지하는 측면에서 바람직하고, 처리 시간은 60분 내지 75분 정도이면 충분하다.
한편 치관의 경우는 무기질 성분이 약 95%로, 염산 용액 중에의 침전시간을 조정함으로써 잔존 무기질양을 조절하는 것이 가능한바, 만일 발치된 치아를 무기질을 함유하고 물리적 흡수성을 늦추기 위한 이식재로 사용하고자 할 경우라면 염산 용액 중에의 침지시간을 약 30분 내외로 조정하는 것도 가능하다. 이 경우 무기질을 함유한 이식재로도 사용할 수 있어 임상적으로 다양하게 사용될 수 있다.
염산 용액의 양은 발치된 치아가 침지될 수 있는 정도의 양이면 그 한정이 있는 것은 아니며, 좋기로는 용기의 크기를 고려하여 치아 한 개 당 50 내지 100㎖ 부피되는 양으로 사용할 수 있다.
상기와 같이 초음파 처리를 수반하는 산용액에 처리한 후, 건져내어 세척하는데 세척은 증류수를 이용하여 수행될 수 있다.
상기와 같은 단계 S1 내지 S4를 거침으로써 치아의 탈회는 완료될 수 있다.
본 단계에서 상술한 것과 같은 진공 초음파 처리, 비진공 초음파 처리를 반복수행하는 경우라면, 감압 (진공 개시, vacuum-on)과, 이후 대기압 (진공 종료, vacuum-off)의 주기로 일정시간 동안 반복해 수행하면 탈회 효과를 최대화시킬 수 있다.
다음으로, 단계 S4를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 프로테아제 저해제를 포함하는 PBS(인산완충 용액) 중에 침지하고, 건져내어 세척한다(단계 S5).
단계 S5는 발치된 치아(치관)의 비교원질성단백인자(NCPs; non-collagenous proteins, EX: DMP(dentin matrix protein), DSP(dentin sialophosphoprotin) 등 을 보존하기 위한 처리 단계로, 여러 단백질은 화학적 처리 단계 중에 제거되거나 감소되지 않고 유지되어 이식재로 제조되었을 때도 보존되어야 이식재로서의 기능을 발휘할 수 있다.
이때 인산완충 용액은 여러 효소를 제거하여 여러 단백질을 보존하기 위해아이오도아세트산과 소듐아자이드가 포함된 상태로 pH가 7 내지 8 정도, 보다 좋기로는 pH 7.4정도로 조절된 것이다.
초음파 처리를 수반하는 것과 함께 승온하여 상온 내지 60℃ 온도범위에서 수행하는 것이 바람직하고, 처리 시간은 5분 내지 10분 정도이면 충분하다.
인산완충 용액의 양은 발치된 치아가 침지될 수 있는 정도의 양이면 그 한정이 있는 것은 아니며, 좋기로는 용기의 크기를 고려하여 치아 한 개 당 10 내지 20㎖ 부피되는 양으로 사용할 수 있다.
초음파 처리를 수반하는 인산완충 용액으로 처리한 후, 건져내어 세척하는데 세척은 증류수를 이용하여 수행될 수 있다.
다음으로, 단계 S5를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 염화칼슘 용액 중에 침지하고, 건져내어 세척한다(단계 S6).
단계 S6는 발치된 치아(치관) 중의 저분자량 단백당류(low molecule weight proteoglycans)를 추출해내는 단계이며 이때 염화칼슘 용액은 농도가 1.5 내지 2.5M인 것이 바람직할 수 있다. 단백당류를 추출해내기 위해서는 염화칼슘 용액 이외에 염화리튬 용액, 염화구아니딘 용액(4 내지 5M) 또는 우레아(6 내지 8M) 등을 사용할 수도 있다. 이외에 염화칼륨 용액 등을 고려할 수도 있다.
초음파 처리를 수반하는 것과 함께 승온하여 상온 내지 60℃ 온도범위에서 수행하는 것이 바람직하고, 처리 시간은 5분 내지 10분 정도이면 충분하다.
염화칼슘 용액의 양은 발치된 치아가 침지될 수 있는 정도의 양이면 그 한정이 있는 것은 아니며, 좋기로는 용기의 크기를 고려하여 치아 한 개 당 10 내지 20㎖ 부피되는 양으로 사용할 수 있다.
초음파 처리를 수반하는 염화칼슘 용액으로 처리한 후, 건져내어 세척하는데 세척은 증류수를 이용하여 수행될 수 있다.
다음으로, 단계 S6를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 EDTA 용액 중에 침지하고, 건져내어 세척한다(단계 S7).
단계 S7의 EDTA 용액은 pH가 7 내지 8 정도, 보다 좋기로는 pH 7.4정도로 조절된 것이 바람직할 수 있다.
초음파 처리를 수반하는 것과 함께 승온하여 상온 내지 60℃ 온도범위에서 수행하는 것이 바람직하고, 처리 시간은 5분 내지 10분 정도이면 충분하다.
EDTA 용액의 양은 발치된 치아가 침지될 수 있는 정도의 양이면 그 한정이 있는 것은 아니며, 좋기로는 용기의 크기를 고려하여 치아 한 개 당 10 내지 20㎖ 부피되는 양으로 사용할 수 있다.
초음파 처리를 수반하는 EDTA 용액으로 처리한 후, 건져내어 세척하는데 세척은 증류수를 이용하여 수행될 수 있다.
추가적으로 콜라젠을 젤라틴화하고자 하는 경우라면, 단계 S7를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 염화리튬 용액 중에 침지하고, 건져내어 세척한다(단계 S8).
단계 S8은 젤라틴화하는 단계로, 구체적으로는 콜라젠 피브릴을 수축시키고 치아의 콜라젠을 젤라틴으로 바꾸기 위한 단계이다.
이때 염화리튬 용액은 그 농도가 7 내지 9M 정도로 조절된 것이 바람직할 수 있다.
초음파 처리를 수반하는 것과 함께 승온하여 상온 내지 60 온도범위에서 에서 수행하는 것이 바람직하고, 처리 시간은 5분 내지 10분 정도이면 충분하다.
염화리튬 용액의 양은 발치된 치아가 침지될 수 있는 정도의 양이면 그 한정이 있는 것은 아니며, 좋기로는 용기의 크기를 고려하여 치아 한 개 당 10 내지 20㎖ 부피되는 양으로 사용할 수 있다.
초음파 처리를 수반하는 염화리튬 용액으로 처리한 후, 건져내어 세척하는데 세척은 증류수를 이용하여 수행될 수 있다.
단계 S8을 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 증류수 중에 침지한다(단계 S9).
단계 S9은 수용성 콜라젠을 추출하는 단계이며, 이때 초음파 처리를 수반하는 증류수 중에 침지를 적어도 2회 반복적으로 수행하는 것이 추출 효율을 높일 수 있는 점에서 바람직할 수 있다.
증류수의 양은 발치된 치아가 침지될 수 있는 정도의 양이면 그 한정이 있는 것은 아니며, 좋기로는 용기의 크기를 고려하여 치아 한 개 당 50 내지 2000㎖ 부피되는 양으로 사용할 수 있다.
상술한 단계들 중 단계 S8과 단계 S9의 경우는 치아의 콜라젠을 젤라틴화시키고자 하는 단계들로, 만일 치아 고유의 콜라젠을 이용하고자 할 경우라면 해당 단계들을 생략할 수 있다.
상술한 전 과정에 있어서 화학적 시약 처리에 사용되는 시약은 멸균 과정을 거친 것임은 물론이다.
가공된 치아는 냉동보관하거나 또는 냉동건조하여 실온에 보관할 수 있고, 냉동건조한 경우 밀봉상태에 따라 장기간 보관할수 있고, 필요에 따라 EO가스 멸균을 실시할 수 있다.
상술한 전 과정을 통해 발치된 치아로부터 골 이식재를 제조하는 데 소요되는 시간은 길어야 2시간 정도이다.
필요에 따라 각 단계를 생략하는 경우 처리시간이 단축가능 할 수 있다.
감압처리는 초음파처리를 하는 모든 단계에서 적용될 수 있다. 감압처리는 반드시 초음파 처리와 병행되어야 하는 것은 아니다. 처리하고자 하는 치아나 뼈의 상태에 따라 가장 처리시간이 많이 소요되는 S4 단계에만 적용하는 것으로 충분할 수도 있다. 그러나 처리시간을 단축시키기 위해서는 초음파처리가 되는 모든 단계에서 적용하는 것이 바람직하다.
감압은 진공 개시 (vaccum-on)를 통해서 시작하여 감압되는 상태를 계속하여 유지할 수 있다. 그러나 본 발명에서는 감압을 적용시 진공 인가의 사이클(주기)을 조절하여, 초음파 캐비테이션을 조절하고, 궁극적으로 처리시간이 단축된다는 것을 확인하였다.
초음파와 함께 감압을 적용시 진공 인가의 주기를 조절하는 방법은 진공장치를 켜서 치아 혹은 뼈가 처리되는 장치내부의 압력을 대기압 보나 낮게 감압을 시작하고, 일정시간 후 진공장치를 꺼서 장치내부를 대기압과 평형이 되도록 유지시켜 준다. 진공 인가의 주기는 감압 (진공 개시, vacuum-on)과 대기압 (진공 종료, vacuum-off)의 시간 비율을 1:1에서 1:4의 범위인 경우 바람직하였다. 예를 들면, 감압 (진공 개시, vacuum-on) 40초와 이후 대기압 (진공 종료, vacuum-off) 120초의 주기로 반복할 수 있다. 상기 감압의 적용 시간은 진공장치의 효율에 따라 다를 수 있으나, 통상 30초에서 2분 정도가 바람직한 것으로 나타났다. 너무 짧은 경우 진공의 영향이 미치는 시간적인 여유가 없고, 너무 긴 경우에는 진공의 효과가 더 이상 발현되지 않았다. 이렇게 진공의 인가와 대기압으로의 릴리스(release)를 통해 치아와 용액의 반응을 방해하는 미세부위의 공기방울을 효과적으로 제거하고, 초음파 캐비테이션(cavitation)의 전달을 (각 처리단계에 맞게) 극대화 할 수 있다.
여기서, 감압 작동과 대기압 작동의 시간 비율은 진공장치를 off시킨 후 처리장치가 얼마나 빨리 대기압과 평행하게 도달되는지에 의존하는 문제로 진공장치의 구조적 특징에 따라 달라질 수도 있다. 즉, 얼마나 빨리 목표 진공에 도달하고, 얼마나 빨리 대기압과 평형을 이루는지에 의존한다. 일반적으로 감압 시간의 과도한 증가나 너무 긴 감압-대기압 교환 주기는 탈회효과를 증대시키지 못하거나 감소시키는 것으로 나타났다.
이와 같이 처리되어 얻어지는 골 이식재는 직접적으로 발치된 환자의 발치 부위에 그대로 식립 될 수 있으며, 이식효과 자가 치아를 이용한 기존의 이식재 제조방법에 비하여 동등 이상의 효과를 나타낼 수 있다.
[실험예 1]
본 발명의 골 이식재의 제조방법(단계 S1~S9)을 거쳐 처리된 치아이식재 내에 함유하고 있는 단백질의 존재를 웨스턴 블랏(western blot)을 통해 확인해 보았다.
웨스턴 블랏(western blot)은 찾고자 하는 단백질을 표적화 하는 항체를 이용하여 항원-항체 반응을 통해 특정한 단백질을 검출해 내는 기법이다.
대상샘플로는 하기와 같이 총 3종류 샘플들을 준비하였으며, 4종의 표적단백질을 함께 준비하였다.
- 대상샘플
1) 본 발명의 골이식재 전 제조 과정<1> (단계S1~단계S9), 0.6N HCL사용, 진공반복
2) 본 발명의 골이식재 제조 과정 중<2> (단계S1~단계S4, 단계 S9)까지만 처리(일부시약처리생략), 0.6N HCL사용, 진공반복
3) 본 발명의 골이식재 전 제조과정<3> (단계S1~단계S9), 1.0N HCL 사용, 진공
4) 일반적인 방법으로 가공한 이식재<4> 0.6N HCL사용, 진공 사용안함
- 표적 단백질
1) DMP-1(57kDa) : 골아세포(osteoblast)의 유도에 관여하는 단백질
2) DSP(54kDa) : dentin sialophosphoprotin으로 상아질(dentin) 형성에 관여
3) MMP-2(74kDa), 4) MMP-20(54kDa): 상처 치유, 뼈성장, 혈관 형성, 조직재형성에 관여
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조과정을 거친 대상샘플 <1>의 경우, 치아조직에 포함되어 있는 골형성에 관여하는 성장인자 단백질인 DMP-1(57kDa), DSP(54kDa), MMP-2(74kDa)가 기타 다른 방법으로 가공한 결과(대상샘플 <2><3><4>)보다 월등히 우수함이 확인되었다.
[실험예 2]
본 발명의 골 이식재의 제조방법(단계 S1~S9)을 거쳐 처리된 치아이식재를 SEM을 통해 확인해 보았다.
대상샘플로는 하기에 전술한 바와 같이 총 5종류 샘플들을 준비하였다.
- 대상샘플
1) 본 발명의 골이식재 전 제조 과정 <1>(단계S1~단계S9), 0.6N HCL사용(탈회시간 70분), 진공반복
2) 본 발명의 골이식재 제조 과정 중<2>(단계S1~단계S4, 단계 S9: 일부 시약처리 안함)까지만 처리, 0.6N HCL사용(탈회시간 70분), 진공반복
3) 본 발명의 골이식재 전 제조과정<3>(단계S1~단계S9), 1.0N HCL 사용, 탈회시간 70분, 진공
4) 일반적인 골이식재 전 제조과정<4>(단계S1~단계S9), 0.6N HCL사용, 탈회시간 63시간, 진공 사용안함
5) GBM<5>(gelatinized bone matrix; 인체 늑골을 이용하여 가공된 이식재), 0.6N HCL사용, 탈회시간 24시간, 진공 사용안함
SEM 확인결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 제조 과정을 거친 대상샘플 <1>의 경우, 이미 이식재로 검증된 대상샘플 <5>의 GBM(동종뼈막)과 가장 유사한 표면을 나타냄으로써 대상샘플 <1>이 가공처리에 최적 상태를 나타냄을 알 수 있었다.
대상샘플 <2>의 경우 탈회만 진행시켜 상아세관의 일부가 관찰되고, 대상샘플 <1>과 <5>와 외형상 유사하게 보이나, 분자생물학적 수준에서의 콜라겐을 비롯한 단백질의 재배열에 제한이 있어 웨스턴 블롯에서 단백질의 발현이 대상샘플 <1>에 비해 현저히 떨어지는 것이 관찰되어. 생체 내에서 성장인자의 유출과 효과 발현에 상당한 제한이 있을 것으로 보인다. 대상샘플 <3>의 경우 1.0 HCL로 탈회시킴으로써 대상샘플 <1>과 비교하여 보면 비교적 거친 표면이 관찰되었고, 상아질 내의 성장인자가 손상되었음을 알 수 있었다.
대상샘플 <4>의 경우 약 40% 이상 탈회를 진행시키기 위해 63 시간이 필요하였으며(인체 늑골의 경우 약 24~36시간), 장시간의 탈회 용액 노출로 상아세관이 보이나 콜라겐의 재배열을 관찰할 수 없었으며 웨스턴 블롯에서 성장인자의 발현되지 않음을 알 수 있었다.
[실험예 3]
상기 실험예 2의 대상샘플 <1>의 결정구조를 분석하기 위하여 XRD분석을 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 전체 조성에서 칼슘성분이 충분히 제거된 상태임을 알 수 있으며, 특히 포지션(position) 별로 확인한 바 포지션 1,2,3,4,5에 따라 내측에서부터 표면으로 진행할수록 칼슘성분이 많이 제거된 것을 확인할 수 있었다.
이는 본 발명의 제조 과정, 단계 S1~S3를 거치는 동안 치아 표면에 구멍을 형성하는 것이 내측의 칼슘 성분을 제거하는 것에 도움이 되는 것임을 알 수 있었다.
[실험예 4]
본 발명의 제조 과정, 단계 S1~S3의 치아의 보관용액에 따라 처리전 멸균상태 및 처리후 멸균 상태를 확인해보았다.
본 발명의 단계 S1~S3의 치아를, 도 6A에 나타낸 바와 같이 에탄올에 저장하고, 도 6B(오염심함), 도 6C(비교적 오염덜심함)에 도시된 바와 같이 생리식염수에 저장해 보았다.
그 결과, 처리후 모두 멸균이 가능함을 알 수 있었고 처리전 보관용액을 에탄올로 하는 경우 발치직후 오염상태인 치아가 에탄올 보관만으로 멸균상태를 유지하는 것을 알 수 있었다.
이상에서 설명한 바와 같이 본 발명은 발치된 치아나 뼈와 같은 인체 경조직을 처리하여 골 이식재로 제조하는데 있어서 소요되는 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있고, 발치된 치아를 별도로 이관조치하지 않고 현장 내에서 이식재로의 제조가 가능하며, 자가치아를 이용함으로 인해 임상에 적용시에도 부작용 없이 사용가능하고 뛰어난 골치유 효과를 나타냄을 알 수 있다.
상기의 본 발명은 바람직한 구현예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 구현예 및 실험예를 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (21)

  1. 발치된 치아 및 뼈 중에서 선택되는 적어도 1종 이상의 인체 경조직으로부터 적어도 1 단계 이상의 화학적 시약처리 단계를 거쳐 골 이식재를 제조하는 방법에 있어서,
    화학적 시약처리 단계는 감압 하에서 초음파를 조사하는 진공 초음파 처리를 포함하는 초음파 처리를 수반하는 골 이식재의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    초음파 처리는 초음파 주파수 15kHz 내지 40kHz 범위에서 수행되는 골이식재의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    진공 초음파 처리는 10mmHg(torr)에서 700mmHg(torr) 범위의 진공에서 수행되는 골 이식재의 제조방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    진공 초음파 처리는 100mmHg 내지 600mmHg 범위의 진공에서 수행되는 골 이식재의 제조방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4항의 어느 한항에 있어서,
    초음파 처리는,
    감압 하에서 초음파를 조사하는 진공 초음파 처리, 감압을 수반하지 않고 초음파를 조사하는 비진공 초음파 처리, 및 감압 하에서 초음파를 조사하는 진공 초음파 처리를 순차적으로 수행하는 골 이식재의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    화학적 시약처리 단계는 온도범위가 상온 내지 60℃인 조건 하에서 수행되는 골 이식재의 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    세척을 위한 목적이 아닌 증류수 처리 단계를 포함하고, 증류수 처리 단계는 초음파 처리를 수반하는 골 이식재의 제조방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    발치된 치아의 연조직 및 치수를 제거하고, 세척하는 제1 단계;
    제1 단계를 거친 치아의 치관과 치근을 분리하고 분리된 치관 및 치근에 적어도 하나의 구멍을 형성하는 제2 단계;
    제2 단계를 거친 치아를 세척하는 제3 단계; 및
    제3 단계를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 염산 용액 중에 침지하고, 건져내어 세척하는 제4 단계;를 포함하는 골 이식재의 제조방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    제4 단계를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 프로테아제 저해제를 포함하는 PBS 용액 중에 침지하고, 건져내어 세척하는 제5 단계;
    제5 단계를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 염화칼슘 용액 중에 침지하고, 건져내어 세척하는 제6 단계; 및
    제6 단계를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 EDTA 용액 중에 침지하고, 건져내어 세척하는 제7 단계;를 포함하는 골 이식재의 제조방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    제7 단계를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 염화리튬 용액 중에 침지하고, 건져내어 세척하는 제8 단계; 및
    제8 단계를 거친 치아를 초음파 처리를 수반하는 증류수 중에 침지하는 제9 단계;를 포함하는 골 이식재의 제조방법.
  11. 제 1 항 또는 제 8 항에 있어서,
    발치된 치아는 멸균된 생리식염수, 증류수 또는 에탄올에 보관되는 골 이식재의 제조방법.
  12. 제 8 항에 있어서,
    제4 단계에 있어서 침지는 상온 내지 60℃ 온도 범위에서 60분 내지 75분 동안 수행되는 골 이식재의 제조방법.
  13. 제 9 항에 있어서,
    제5 단계, 제6 단계 및 제7 단계에 있어서 침지는 상온 내지 60℃ 온도 범위에서 5분 내지 10분 동안 수행되는 골 이식재의 제조방법.
  14. 제 9 항에 있어서,
    제5 단계 및 제7 단계에 있어서 침지는 pH 7 내지 8인 조건 하에서 수행되는 골 이식재의 제조방법.
  15. 제 8 항에 있어서,
    제4 단계에 있어서 염산 용액은 농도가 0.5N 내지 2N의 범위인 골 이식재의 제조방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    제4 단계에 있어서 염산 용액은 농도가 0.5N 내지 0.6N의 범위인 골 이식재의 제조방법.
  17. 제 10 항에 있어서,
    제8 단계에 있어서 침지는 상온 내지 60℃ 온도 범위에서 5분 내지 10분 동안 수행되는 골 이식재의 제조방법.
  18. 제 10 항에 있어서,
    제9 단계를 거친 치아를 멸균 상태로 냉동보관하는 단계를 더 포함하는 골 이식재의 제조방법.
  19. 제 9 단계를 거친 치아를 멸균 상태로 냉동보관 후 또는 즉시 냉동건조하여 실온에 보관하는 방법
  20. 제 9 단계를 거친 치아를 멸균 상태로 냉동보관 후 또는 즉시 냉동건조하여 EO가스 멸균하는 방법
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 선택된 어느 한 항의 제조방법에 의해 얻어지는 골 이식재.
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