WO2012033186A1 - 多能性幹細胞からの血液細胞分化に関する培養方法 - Google Patents

多能性幹細胞からの血液細胞分化に関する培養方法 Download PDF

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進弥 佐野
浩之 江藤
直也 高山
啓光 中内
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国立大学法人東京大学
テルモ株式会社
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    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture method for differentiating into blood cells. More specifically, the present invention relates to a cell culture method for differentiating cells capable of differentiating into blood precursor cells into blood precursor cells and further differentiating them into blood cells.
  • Non-patent Documents 2 to 4 Non-patent Documents 2 to 4
  • Non-Patent Document 5 Patent Document 3 to Patent Document 5
  • Patent Document 3 a method of performing cartilage differentiation by culturing cells capable of differentiating into cartilage under hypoxic conditions
  • Patent Document 4 undifferentiated central nervous system cells
  • Patent Document 5 neural crest stem cells
  • the present inventors have already established a method for obtaining blood precursor cells from pluripotent stem cells and further differentiating them into various blood cells, but the amount of blood cells prepared by this method is small, It is in a situation where it cannot be said that the amount used for treatment is sufficient. Accordingly, in view of the above circumstances, the present invention aims to establish a larger amount and more stable in vitro blood cell preparation method, and provides a novel differentiation induction method for blood progenitor cells, and is produced by the method.
  • An object is to provide blood precursor cells and various blood cells that are induced to differentiate from the blood precursor cells.
  • the inventors performed cell culture under a low oxygen partial pressure for a certain period of time, and the number of induced blood progenitor cells was only under atmospheric oxygen partial pressure.
  • the present invention was completed by finding an increase compared to the case of culturing. That is, the present invention relates to the following (1) to (16).
  • a method for producing blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells comprising a step of culturing cells capable of differentiating into blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells in an environment in which oxygen partial pressure increases.
  • the low oxygen partial pressure is 0.1 to 10%.
  • the low oxygen partial pressure is an oxygen partial pressure at which a hypoxia-responsive gene is expressed when culturing is performed under the partial pressure, as compared with the culture under other partial pressures.
  • the timing of changing to the higher oxygen partial pressure is the time when a gene serving as an index of mesendoderm induction is expressed, the time when expression of a gene serving as an index of blood progenitor cell initiation is started, Any one of the above (5) to (7), characterized in that it is a time when expression of a gene serving as an index is started or a time when expression of a gene serving as a blood cell induction index is started.
  • a method for producing blood precursor cells or erythrocyte precursor cells. (9) The method for producing blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells according to any one of (5) to (8) above, wherein the higher oxygen partial pressure is 11 to 30%.
  • (10) The method for producing blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells according to any one of (1) to (9) above, wherein the cells that can differentiate into blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells are pluripotent stem cells.
  • (11) The blood precursor cell or erythrocyte precursor cell according to any one of (1) to (10) above, wherein the blood precursor cell or erythrocyte precursor cell is obtained from a net-like structure or embryoid body. Production method.
  • (12) The method for producing blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells according to any one of (1) to (11) above, wherein VEGF is not added to the medium for cell culture.
  • a pharmaceutical preparation comprising the blood cell according to (14).
  • a screening method for a substance that promotes or inhibits differentiation into blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells which comprises using the production method according to (1) above.
  • the present invention it is possible to increase the number of blood progenitor cells, erythrocyte progenitor cells and blood cells that are induced to differentiate as compared with the conventional method.
  • the present invention it is possible to shorten the culture period for obtaining a desired number of blood precursor cells, erythrocyte precursor cells, or blood cells.
  • blood progenitor cells can be prepared without using VEGF, which was conventionally necessary for efficient induction of blood progenitor cells.
  • blood precursor cells and erythrocyte precursor cells having high blood differentiation ability can be obtained.
  • the vertical axis is the number of blood cells generated after culture.
  • (1) shows the results of culturing at 21% oxygen partial pressure for 14 days
  • (2) shows the results of culturing at 5% oxygen partial pressure for 7 days and then 7 days at 21% oxygen partial pressure
  • (3) The results of culturing at 5% oxygen partial pressure for 14 days.
  • (1) All experiments of (2) and (3) were performed in the presence of 20 ng / ml VEGF.
  • the cells used were iPS cells (TkCB7-4 strain).
  • cultivation with respect to the differentiation to a blood precursor cell (HPC; hematopoieticprogenitorcell) is shown.
  • the effect of hypoxic culture on differentiation to HPC was examined using flow cytometry.
  • (1) shows the results of culturing at 21% oxygen partial pressure for 14 days
  • (2) shows the results of culturing at 5% oxygen partial pressure for 7 days and then 7 days at 21% oxygen partial pressure
  • (3) The results of culturing at 5% oxygen partial pressure for 14 days.
  • the cells used were iPS cells (TkCB7-4 strain). It is the result of having examined the effect of the hypoxic culture with respect to the differentiation to a blood progenitor cell by a colony assay.
  • (1) is the result of culturing at 21% oxygen partial pressure for 14 days
  • (2) is the result of culturing at 5% oxygen partial pressure for 7 days and then 7 days at 21% oxygen partial pressure.
  • n, m, E, M, and blast are neutrophils, macrophages, erythroblasts, megakaryocytes, and immature blood cells, respectively.
  • the combination of characters indicates that cells corresponding to each character are mixed (for example, nm indicates that neutrophils and macrophages are mixed).
  • the vertical axis represents the number of colonies derived from 1 ⁇ 10 4 blood cells. The numbers shown in the graph are the number of mixed colonies.
  • the cells used were iPS cells (TkCB7-2 strain). It is the result of having evaluated the effect of the hypoxic culture with respect to the differentiation to a blood progenitor cell by counting the number of CD34 positive cells.
  • ES cells KhES3 strain
  • (1) shows the result of culturing at 5% oxygen partial pressure for 7 days in the presence of VEGF and then 7 days at 21% oxygen partial pressure.
  • (2) shows culturing at 21% oxygen partial pressure for 14 days in the presence of VEGF.
  • (3) is the result of culturing at 21% oxygen partial pressure for 14 days in the absence of VEGF.
  • the vertical axis represents the result of the number of CD34 positive cells when the number of CD34 positive cells obtained by the result of (3) is 1. It is the result of examining the effect of hypoxic culture on differentiation into erythroid cells using flow cytometry.
  • (1) shows the results of culturing at 21% oxygen partial pressure for 14 days
  • (2) shows the results of culturing at 5% oxygen partial pressure for 7 days and then 7 days at 21% oxygen partial pressure
  • (3) The results of culturing at 5% oxygen partial pressure for 14 days.
  • (1) All experiments of (2) and (3) were performed in the presence of 20 ng / ml VEGF.
  • the cells used were iPS cells (TkCB7-4 strain).
  • cultivation with respect to the number of various blood cells obtained from a pluripotent stem cell is shown.
  • a and B were examined for red blood cells, C for megakaryocytes, and D for platelets.
  • A is the number of blood cells derived from ES cells (KhES-3 strain), and B to D are the number of blood cells derived from iPS cells (TkCB7-2 strain).
  • (1) shows the results of culturing at 21% oxygen partial pressure for 14 days and erythroid differentiation culture; (2) cultivating at 5% oxygen partial pressure for 7 days and then culturing for 7 days at 21% oxygen partial pressure; It is the result of subsequent erythrocyte differentiation culture. The result of having examined about the beta globin chain positive rate of HPC cultured under the low oxygen partial pressure is shown.
  • A is the ratio of ⁇ -globin chain positive cells to erythrocytes derived from ES cells (KhES-3 strain), and B is erythrocytes derived from iPS cells (TkCB7-2 strain).
  • (1) shows the results of culturing at 21% oxygen partial pressure for 14 days and erythroid differentiation culture; (2) cultivating at 5% oxygen partial pressure for 7 days and then culturing for 7 days at 21% oxygen partial pressure; It is the result of erythrocyte differentiation culture.
  • C shows the result of double staining of red blood cells with DAPI and anti-human hemoglobin antibody (left figure) or anti-human ⁇ -globin antibody (right figure). The examination result regarding VEGF substitution by low oxygen culture.
  • A shows the result of counting the number of blood cells generated after the culture
  • B shows the result of flow cytometry of the cells generated after the culture.
  • (1) is the result of culturing at 21% oxygen partial pressure for 14 days in the presence of VEGF.
  • (2) is cultivated at 5% oxygen partial pressure for 7 days in the absence of VEGF and then 7 days at 21% oxygen partial pressure.
  • the culture results are shown.
  • the cells used were iPS cells (TkCB7-4 strain). It is the result of having examined colony assay about VEGF substitution by low oxygen culture.
  • A is the result using the TkCB7-4 strain of iPS cells
  • B is the TkCB8-3 strain of iPS cells
  • C is the KhES3 strain of ES cells.
  • n, m, E, M, and blast are neutrophils, macrophages, erythroblasts, megakaryocytes, and immature blood cells, respectively.
  • the combination of letters indicates that cells corresponding to the letters are mixed (for example, nm indicates that neutrophils and macrophages are mixed).
  • the vertical axis of A represents the number of colonies derived from 5 ⁇ 10 3 blood cells
  • the vertical axis of B represents the number of colonies derived from 1 ⁇ 10 4 blood cells
  • the vertical axis of C represents It represents the number of colony forming cells derived from 1 ⁇ 10 5 ES cells.
  • the numbers shown in the graph are the number of mixed colonies.
  • the effect of culturing under 1% oxygen partial pressure was examined. In the absence of VEGF, (1) was cultured for 7 days at 5% oxygen partial pressure and then for 7 days at 21% oxygen partial pressure. (2) was cultured for 7 days at 1% oxygen partial pressure and then 21 It is the result of culturing for 7 days at% oxygen partial pressure.
  • the vertical axis represents the number of blood cell colonies per ES cell number (1 ⁇ 10 5 ) at the start of culture.
  • the cells used were ES cells (KhES3 strain). The effect of culturing under 1% oxygen partial pressure was examined. When cultured for 14 days under 21% oxygen partial pressure in the presence of VEGF (1), when cultured for 7 days under 5% oxygen partial pressure in the absence of VEGF, and cultured for 7 days under 21% oxygen partial pressure (2), The results of colony assay for blood progenitor cells produced when cultured for 7 days under 21% oxygen partial pressure after 7 days culture under 1% oxygen partial pressure in the absence of VEGF are shown.
  • n, m, E, M, and blast are neutrophils, macrophages, erythroblasts, megakaryocytes, and immature blood cells, respectively.
  • the combination of letters indicates that cells corresponding to each letter are mixed.
  • the vertical axis represents the number of blood cell colonies per ES cell number (1 ⁇ 10 5 ) at the start of culture, and the numbers in the graph indicate the number of mixed colonies.
  • the cells used were ES cells (KhES3 strain).
  • the experiment was conducted with A under 5% oxygen partial pressure and B under 1% oxygen partial pressure.
  • the vertical axis represents the relative value of the total blood cell number when N ⁇ is 1.
  • L4-, L7-, and L10- on the horizontal axis are the results of switching from a hypoxic environment to 21% oxygen partial pressure on the 4th, 7th, and 10th days after the start of culture.
  • L14 was subjected to hypoxic culture throughout.
  • N- was cultured under 21% oxygen partial pressure throughout.
  • VEGF was not added.
  • the vertical axis shows the expression relative to the expression of GAPDH.
  • L7 is changed from low oxygen partial pressure (5% oxygen partial pressure) to atmospheric oxygen partial pressure (21% oxygen partial pressure) on the seventh day after the start of culture
  • L14 is low oxygen partial pressure throughout ( This is a case where the culture is performed at 5% oxygen partial pressure).
  • Gene expression was examined on day 8 of culture.
  • the vertical axis shows the expression relative to the expression of GAPDH.
  • L7 and L14 are the same as those in FIG. Gene expression was examined on day 10 of culture.
  • the examination result of the expression change of the gene (VEGF (A) and EPOR (B)) used as the parameter
  • the vertical axis shows the expression relative to the expression of GAPDH. L7 and L14 are the same as those in FIG. VEGF expression was examined on day 14 of culture and EPOR expression was examined on day 8 of culture.
  • the examination result of the expression change of the gene (CD41a (A) and Glycophorin-A (B)) used as the parameter
  • the vertical axis shows the expression relative to the expression of GAPDH. L7 and L14 are the same as those in FIG. Gene expression was examined on day 14 of culture.
  • hypoxia responsive gene HIF2a
  • the vertical axis shows the expression relative to the expression of GAPDH.
  • N- is the case where the culture is performed under 21% oxygen partial pressure from start to finish, and L7 is the same as the description of FIG. Gene expression was examined on day 7 of culture.
  • One of the embodiments of the present invention is a method for differentiating into blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells, comprising a step of culturing cells that can differentiate into blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells in an environment where oxygen partial pressure is increased, Alternatively, it is a method for producing blood precursor cells or erythrocyte precursor cells, comprising a step of culturing cells that can differentiate into blood precursor cells or erythrocyte precursor cells under a low oxygen partial pressure.
  • a method for differentiating into blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells comprising a step of culturing cells that can differentiate into blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells under a low oxygen partial pressure
  • a method for producing blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells comprising a step of culturing cells that can differentiate into blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells under a low oxygen partial pressure.
  • “cells that can differentiate into blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells” are not particularly limited.
  • pluripotent stem cells ES cells, iPS cells, etc.
  • pluripotent stem cells and blood Any cell may be used as long as it is in a differentiation stage between progenitor cells, and preferably an ES cell or an iPS cell.
  • the ES cells used in the present invention are not particularly limited, and generally, fertilized eggs at the blastocyst stage are cultured together with feeder cells to separate the cells derived from the proliferated inner cell mass. Furthermore, the operation of planting can be repeated to finally establish an ES cell line. Thus, ES cells are obtained from fertilized eggs. Other ES cell-like cells that are obtained from cells and tissues other than fertilized eggs, such as adipose tissue, chorionic villi, amniotic fluid, placenta, testis cells, etc., have ES cell-like characteristics and have pluripotency There may be.
  • iPS cells used in the present invention have several types of transcription factors (hereinafter referred to as “differentiation pluripotency factors”) that confer differentiation pluripotency to somatic cells (for example, fibroblasts, blood cells, etc.).
  • the cell may be of any origin as long as it has acquired pluripotency equivalent to that of an ES cell by introducing a gene.
  • differentiation pluripotency factors include, for example, the Oct family (for example, Oct3 / 4), the SOX family (for example, SOX2, SOX1, SOX3, SOX15, and SOX17).
  • Klf family for example, Klf4, Klf2, etc.
  • MYC family for example, c-MYC, N-MYC, L-MYC, etc.
  • NANOG LIN28 and the like. Since many literatures are published about the iPS cell establishment method, they can be referred to (for example, Takahashi et al., Cell 2006, 126: 663-676; Okita et al., Nature 2007, 448: 313).
  • Blood progenitor cells differentiated or produced according to the present invention include CD34 ⁇ (CD34 negative), CD34 + (CD34 positive), Lin ⁇ (CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20. , CD24, CD41, CD45, CD56, CD66b or CD235a negative), CD38 ⁇ (CD38 negative), CD90 + (CD90 positive), CD49f + (CD49f positive), VEGFR2 + (VEGFR2 positive), CD31 + (CD31 positive) ), CD43 + (CD43 positive), CD34 + / CD45 + (CD34 positive and CD45 positive), Rhodamine weak positive, or Hoechst negative / weak positive, singly or in combination of multiple markers Be Hematopoietic cells.
  • the erythroid progenitor cells differentiated or produced according to the present invention include CD71 + (CD71 positive), GPA (Glycophorin A) + (GPA positive), GPA + / CD41 + (GPA positive / CD41 positive) or GPA ( Glycophorin A) A cell of the hematopoietic system characterized as + / CD45 + (GPA positive / CD45 positive).
  • the megakaryocytes and platelets differentiated or produced according to the present invention are CD41 + (CD41 positive), CD42b + (GPA positive), CD41 + / CD42b + (CD41 positive / CD42b positive), or GPA ⁇ / CD41. + Hematopoietic cells characterized as (GPA negative / CD41 positive).
  • the animals from which the “cells” used in the present invention are derived are human and non-human animals (eg, mice, rats, cows, horses, pigs, sheep, monkeys, dogs, cats, birds, etc.) and are not particularly limited. However, human is particularly preferable.
  • conditions other than oxygen partial pressure conditions among cell culture conditions performed for inducing differentiation of blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells may be any conditions selectable by those skilled in the art, for example When ES cells or iPS cells are used as “cells that can differentiate into blood precursor cells or erythrocyte precursor cells”, a net-like structure or embryoid body is formed in the process of inducing differentiation of blood precursor cells or erythrocyte precursor cells Such conditions can be used as examples of culture conditions.
  • the “net-like structure” prepared from ES cells or iPS cells is a three-dimensional sac-like structure (with internal space) derived from ES cells or iPS cells, such as an endothelial cell population. It is formed and contains blood progenitor cells and erythrocyte progenitor cells inside.
  • the culture conditions under which a net-like structure is formed from ES cells or iPS cells differ depending on the ES cells or iPS cells used. For example, IMDM supplemented with FBS at a final concentration of 15% is used as the medium.
  • VEGF In the case of serum, those appropriately added with growth factors and supplements can be used.
  • VEGF (0 to 100 ng / ml, more preferably about 20 ng / ml) is added to culture, but this is disclosed in the present invention.
  • the culture environment other than oxygen partial pressure varies depending on the type of ES cells or iPS cells used, but for example, conditions of 5% CO 2 , 36 to 38 ° C., preferably 37 ° C. can be used.
  • the culture period until the net-like structure is formed varies depending on the type of ES cell or iPS cell, but is about 14 to 16 days after seeding on the feeder cell.
  • the formed net-like structure has a follicular structure, and blood progenitor cells and erythrocyte progenitor cells are present in a concentrated state. Blood progenitor cells and erythrocyte progenitor cells present inside the net-like structure can be separated by passing them through physical means, for example, a sterilized sieve device (for example, a cell strainer).
  • the blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells thus obtained can be further cultured and differentiated into various blood cells.
  • a condition for culturing blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells from ES cells or iPS cells conditions other than oxygen partial pressure
  • a cell mass containing differentiated cells of endoderm, mesoderm, and ectoderm called embryoid bodies
  • the conditions vary depending on the ES cells or iPS cells to be used.
  • the medium used is IMDM supplemented with 15% final concentration of FBS, transferrin, etc., and other appropriate growth factors and supplements are used. can do.
  • the culture environment other than the oxygen partial pressure varies depending on the type of ES cell or iPS cell to be used. For example, 5% CO 2 , 36 to 38 ° C., preferably 37 ° C. can be used.
  • the “environment in which the oxygen partial pressure increases” means an environment having conditions for increasing the oxygen partial pressure during culture. This environment may be an artificially created environment.
  • Oxygen partial pressure increases means that the oxygen partial pressure may increase in the range of low oxygen partial pressure, or the oxygen partial pressure may increase in the range of higher oxygen partial pressure. In addition, the oxygen partial pressure may be increased in a range where the low oxygen partial pressure shifts to a higher oxygen partial pressure. Even in an environment where the oxygen partial pressure fluctuates up and down during culture, the environment in which the oxygen partial pressure temporarily rises is the “environment in which the oxygen partial pressure increases” in the present invention.
  • the “low oxygen partial pressure” in the present invention is, for example, an oxygen partial pressure of 0.1% to 10%, preferably 1% to 5%, more preferably about 5%.
  • the oxygen partial pressure at which a hypoxia-responsive gene is expressed may be selected as the “low oxygen partial pressure”.
  • the hypoxia responsive gene includes, for example, HIF2 ⁇ , HIF1 ⁇ , HIF3 ⁇ , HIF1 ⁇ , GLUT-1, p21, p57, FoxO, Notch1, VEGF, ABCG2 / Bcrp-1, CXCR4, PDK-1, c-Kit Etc.
  • expression means, for example, that a gene is transcribed and mRNA is synthesized, that a gene mRNA is translated into a protein, or that a gene protein exerts its function.
  • the whole process may be under low oxygen partial pressure, but culture of cells that can differentiate into blood progenitor cells
  • the period from the start until, for example, cells showing KDR + , CD34 + , CD43 + appear is cultured under low oxygen partial pressure, and then under higher oxygen partial pressure, for example, oxygen partial pressure of 21% atmospheric oxygen partial pressure
  • oxygen partial pressure for example, oxygen partial pressure of 21% atmospheric oxygen partial pressure
  • the culture is preferably performed under a low oxygen partial pressure (for example, about 5% oxygen partial pressure) for about 7 days, and then cultured under a higher oxygen partial pressure.
  • the timing for switching from a low oxygen partial pressure to a higher oxygen partial pressure may be determined using an expression change of a specific gene as an index.
  • a specific gene for example, the gene used as an index of mesendoderm induction, the gene used as an index of blood progenitor cell induction, the gene used as an index of differentiation proliferative cytokine, or the index of blood cell induction Can be mentioned.
  • the gene that serves as an indicator of blood progenitor cell induction changes the oxygen partial pressure from low oxygen to atmospheric oxygen before and after the start of its expression. It is desirable to switch.
  • the genes that serve as an indicator of mesendoderm induction are T, SOX-17, GATA-4, HNF-3 ⁇ , GSC, Cer1, Nodal, FGF8, Mixl1, FGF4 CD48, DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4 , C-Kit, CD99, OTX2, Nodal and the like.
  • genes that serve as indicators of blood progenitor cell induction include TAL-1, KDR, CD34, CXCR4, c-Kit, RUNX-1, GATA-1, GATA-2, CD43, ETV-2, Tie-2, CD31, CLOUDIN5, Sca-1, etc. are mentioned.
  • Examples of the gene serving as an indicator of the above-mentioned differentiation-proliferating cytokine include VEGF, EPOR, EPO, TPO, BMP4, FGF-2, FLT-1, Ang-1, SDF-1, and SCF.
  • genes that serve as indicators of blood cell induction include CD41, Glycophorin-A, c-MPL, Rh antigen, ⁇ 4 integrin, KLF-1, BCL-11A, CD45, ⁇ -Globin, ⁇ -Globin, ⁇ -Globin , ⁇ -Globin and the like.
  • the “higher oxygen partial pressure” is an oxygen partial pressure higher than the oxygen partial pressure (low oxygen partial pressure) at the start of culturing of cells that can differentiate into blood precursor cells, for example, 11% to 30%. % Oxygen partial pressure, more preferably about 15% to 25% oxygen partial pressure. In particular, the “higher oxygen partial pressure” is preferably an atmospheric oxygen partial pressure of about 21%.
  • Another embodiment of the present invention is a method of further culturing blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells produced by the method of the present invention to induce differentiation or produce various blood cells.
  • Many methods are known in the art for inducing differentiation of various blood cells from blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells (eg, Miharada et al., Nat Biotechnol 2006, 24: 1255-1256; Qiu).
  • the culture conditions include TPO, IL-1 ⁇ , IL-3, IL-4, IL-5.
  • the conditions for inducing differentiation of mature megakaryocytes and platelets are, for example, in the presence of TPO (10 to 200 ng / mL, preferably about 100 ng / mL) or TPO (10 to 200 ng / mL, Preferably about 100 ng / mL), SCF (10 to 200 ng / mL, preferably about 50 ng / mL) and Heparin (10 to 100 U / mL, preferably about 25 U / ml) in the presence of about 7 to 15 days.
  • the conditions to do can be illustrated.
  • the culture environment may be any environment suitable for inducing differentiation of blood cells in vitro.
  • the culture is performed under conditions of 5% CO 2 , 36 to 38 ° C., preferably 37
  • conditions suitable for inducing differentiation of mature erythroid cells from erythroid progenitor cells produced by the method of the present invention include, for example, TPO, IL-1 ⁇ , IL-3, IL-4, IL-5, One of IL-6, IL-9, IL-11, EPO, GM-CSF, SCF, G-CSF, Flt3 ligand, IGF-I, IGF-II, Dexamethasone, Hydrocortisone, Mifepristone, Heparin, etc.
  • TPO TPO
  • IL-1 ⁇ IL-3
  • IL-4 IL-5
  • EPO GM-CSF
  • SCF GM-CSF
  • G-CSF G-CSF
  • Flt3 ligand Flt3 ligand
  • IGF-I IGF-II
  • Dexamethasone Hydrocortisone
  • Mifepristone Heparin
  • the condition for inducing differentiation of red blood cells is in the presence of EPO (2 to 100 U / mL, preferably about 10 U / mL) or EPO (2 to 100 U / mL, preferably about 10 U / mL). ), SCF (10 to 200 ng / mL, preferably about 50 ng / mL) and TPO (5 to 200 ng / mL, preferably about 20 ng / mL) in the presence of about 7 to 25 days.
  • the culture environment may be any environment suitable for inducing differentiation of blood cells in vitro.
  • the culture is performed under conditions of 5% CO 2 , 36 to 38 ° C., preferably 37 ° C. Also good.
  • various blood cells produced according to the present invention can be stably supplied in the form of a preparation.
  • a fraction of a culture solution rich in platelets is collected, and a leukocyte removal filter or the like is used to detect megakaryocytes, etc. It can be prepared by removing blood cell components other than platelets.
  • other components that contribute to the stabilization of platelets or red blood cells can also be included.
  • a component that contributes to such stabilization can be selected from those known to experts in the technical field.
  • the obtained platelets can be formulated, for example, by the following method.
  • ACD-A solution FFP (fresh frozen plasma; prepared from whole blood obtained by blood donation, including all components other than blood components such as albumin and coagulation factors) is adjusted at a ratio of 1:10, and 15-50 Gy After irradiation, store at 20-24 ° C with shaking.
  • ACD-A solution 22 g of sodium citrate / 8 g of citric acid / 22 g of glucose are adjusted to a total of 1 L with water for injection.
  • the platelet concentration is preferably about 1 ⁇ 10 9 platelets / mL, for example.
  • GM6001 a broad-range hydroacidic-based metalloprotease inhibitor
  • platelet function molecule GPIb-V-VI that occurs during cryopreservation and room temperature storage. Inactivation associated with GPVI cleavage can be prevented.
  • the present inventors have confirmed that inactivation of mouse ES cell-derived platelets can be prevented by this method.
  • as a reference paper on the mechanism of this platelet inactivation using human platelets see Bergmeier, W et al. , Circ Res 95: 677-683, 2004 and Gardiner, EE et al. , J Thrombosis and Haemostasis, 5: 1530-1537, 2007.
  • red blood cells when producing red blood cells and formulating them, it can be carried out as follows. Prepare the culture supernatant by adding MAP solution (see below for composition) to the concentrated erythrocyte solution after centrifugation and store at 2-6 ° C. after irradiation with 15-50 Gy.
  • concentration of red blood cells is preferably about 1 ⁇ 10 10 red blood cells / mL, for example.
  • the obtained erythrocytes can be used as an erythrocyte storage additive solution (MAP solution), for example, D-mannitol (14.57 g), adenine (0.14 g), crystalline sodium dihydrogen phosphate (0.94 g), sodium citrate ( 1.50 g), citric acid (0.20 g), glucose (7.21 g), and sodium chloride (4.97 g) can be dissolved in water for injection to a total volume of 1000 ml.
  • MAP solution erythrocyte storage additive solution
  • the embodiment of the present invention promotes or inhibits differentiation into blood progenitor cells or erythroid progenitor cells, characterized by using the method for differentiation or production of blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells of the present invention.
  • Substance screening methods are included. Specifically, in the cell culturing step performed as the method of the present invention, a blood progenitor cell obtained by adding a candidate differentiation promoting substance or differentiation inhibiting substance to a medium at an appropriate time for an appropriate period Alternatively, the effect of the promoter or inhibitor can be evaluated by measuring the number of erythrocyte progenitor cells and comparing with an experiment conducted as a control (the same culture step is performed without adding a candidate substance). If the number is higher than the number of blood progenitor cells or erythrocyte progenitor cells obtained from the control experiment, it can be evaluated as a promoter, and if it is smaller, it can be evaluated as an inhibitor.
  • TkCB7-2, TkCB7-4, and TkCB8-3 established by introduction of Yamanaka 4 factor (OCT3 / 4, KLF4, SOX2, c-MYC) were used.
  • the maintenance culture of iPS cells was carried out by using Dulbecco modified Eagle medium and Ham F-12 medium (SIGMA), 0.1 mM non-essential amino acid (Invitrogen), 2 mM L-glutamine (Invitrogen), 20% knockout serum replenishment, A medium supplemented with 1 mM 2-mercaptoethanol (SIGMA) and 5 ng / mL basic fibroblast growth factor (bFGF; Upstate) was used.
  • iPS cells were cultured on irradiated (50 Gy) mouse fetal fibroblasts (MEF) and subcultured every 3 days to maintain an undifferentiated state.
  • mouse C3H10T1 / 2 cells used as feeder cells were cultured by adding 10% fetal bovine serum (FBS) and 2 mM L-glutamine to Eagle basal medium (Invitrogen).
  • Differentiation medium was prepared by combining Iscove modified Dulbecco medium (SIGMA) with 10 ⁇ g / mL human insulin, 5.5 ⁇ g / mL human transferrin, 5 ng / mL sodium selenite (SIGMA), 2 mM L-glutamine, 0.45 mM ⁇ -monothio.
  • Glycerol SIGMA
  • 50 ⁇ g / mL ascorbic acid SIGMA
  • 15% high filtered FBS Celect Gold; ICN Biomedicals
  • human vascular endothelial growth factor R & D Systems
  • HERA CELL 150i Thermo SCIENTIFIC
  • ES cells maintenance culture and differentiation were performed using the KhES3 strain under the same conditions as iPS cells.
  • iPS-Sac net-like structure derived from iPS cell or ES cell
  • ES-Sac The culture process for preparing the net-like structure performed in this example is described below (for details, see TAKAYAMA et al., BLOOD 2008, 111: 5298-5306).
  • C3H10T1 / 2 irradiated with 50 Gy in advance was prepared in a 100-mm dish, and human iPS cells or ES cells were seeded at 1 ⁇ 10 5 in differentiation medium.
  • Nitrogen gas was injected and the oxygen concentration was set to atmospheric oxygen (21% O 2 ) and low oxygen (5% or 1% O 2 ) in a CO 2 incubator with an appropriate period set between 1 and 14 days. Went.
  • the cells cultured in hypoxia were then transferred to atmospheric oxygen conditions or continued as they were and cultured for a total of 14 days to produce iPS-Sac or ES-Sac.
  • Cells include phycoerythrin (PE) binding-anti-CD34 antibody, phycoerythrin (PE) binding-anti-CD42b antibody, Alexa405 binding-anti-CD45 antibody, allophycocylanin (APC) binding-anti-glycophorin (Glycophorin) A antibody, allophycocynin (APC) binding. -Stained with anti-CD41a antibody (BD Biosciences).
  • Hematopoietic progenitor cell colony assay HPC recovered from iPS-Sac or ES-Sac, Metho Cult GF H4434 with 5-10 ⁇ 10 3 added to 50 ng / ml thrombopoietin (R & D systems) (R & D systems) After being suspended in Stem Cell Technologies), it was seeded in a 35 mm dish. The cells were cultured for 13-14 days in a CO2 incubator, and the resulting colonies were picked up. The colonies were centrifuged at 800 rpm for 1 minute with Chandon Cytospin 4 (Thermo SCIENTIFIC), and stained with Hemocolor Rapid staining of blood smear (MERCK) for observation.
  • HPC Hematopoietic progenitor cell colony assay
  • the sample was encapsulated with VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI (Vector Laboratories) and observed with a confocal microscope FV1000 (Olympus).
  • the ⁇ -globin chain-positive cell rate was calculated by ( ⁇ -globin chain-positive cell number / hemoglobin-positive cell number) ⁇ 100.
  • Applied Biosystems Applied Biosystems
  • Roche Universal Probe Roche Universal Probe
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • T forward; gctgtgacaggtacccaacc (SEQ ID NO: 1) T: reverse; catgcaggtgagttgtcagaa (SEQ ID NO: 2) TAL-1: forward; ctatgagatggagattactgatggtc (SEQ ID NO: 3) TAL-1: reverse; gtgtggggatcagcttgc (SEQ ID NO: 4) KDR: forward; gaacatttgggaaatctcttgc (SEQ ID NO: 5) KDR: reverse; cggaagaacaatgtagtctttgc (SEQ ID NO: 6) CD34: forward; gtgaaattgactcagggcatc (SEQ ID NO: 7) CD34: reverse; cccctgtccttctttaaactcc (SEQ ID NO: 8) VEGF: forward; ccttgctgctctacctccac
  • ⁇ Result> 1 Effect of Hypoxic Culture on Blood Cell Differentiation When iPS cells (TkCB7-4) are seeded in a differentiation medium and cultured under atmospheric oxygen partial pressure (21%) for 14 days (FIG. 1 (1)), 7 days After culturing under low oxygen partial pressure (5%), when cultured for 7 days under atmospheric oxygen partial pressure (21%) (Fig. 1 (2)), when cultured for 14 days under low oxygen partial pressure (5%) (Fig. For each of 1 (3)), the number of blood cells generated in iPS-Sac was counted. As a result, after culturing under low oxygen partial pressure for 7 days, the number of blood cells produced was the highest when cultured under atmospheric oxygen partial pressure for 7 days (FIG. 1 (2)). From this result, it was found that the number of blood cells formed can be increased by culturing iPS cells under low oxygen partial pressure and culturing under low oxygen partial pressure for a certain period.
  • HPC blood precursor cells
  • Human iPS cells were cultured under atmospheric oxygen partial pressure (21%) for 14 days (FIG. 2 (1)), under low oxygen partial pressure (5%) for 7 days, and then under atmospheric oxygen partial pressure (21%) for 7 days ( 2 (2)), cultured for 14 days under low oxygen partial pressure (5%) (FIG. 2 (3)), and for cells generated in iPS-Sac, CD34 and CD45 which are markers of blood progenitor cells, respectively.
  • the ratio of cells positive for both was measured by flow cytometry. As a result, it was found that the ratio of blood progenitor cells was improved by culturing under low oxygen partial pressure for a certain period (FIG. 2 (2)) (FIG. 2 (3)).
  • Amplification effect of various blood cells by hypoxic culture HPC produced by switching the oxygen partial pressure from 5% (7 days culture) to 21% (7 days culture) is differentiated into mature erythrocytes, megakaryocytes, and platelets.
  • the amplification effect of peripheral blood cells by optimizing the partial pressure was confirmed.
  • the number of mature erythrocytes obtained per 1 ⁇ 10 5 ES cells (KhES-3) was about 2.2 times that in the case of using 21% oxygen partial pressure (FIG. 6A), and iPS cells ( In TkCB7-2), it was about 5 times (FIG. 6B).
  • genes that serve as indicators of blood progenitor cell induction eg, TAL-1 (FIG. 14A), KDR (FIG. 14B), CD34 (FIG. 14C)
  • genes that serve as cytokine indicators eg, , VEGF (FIG. 15A), EPOR (FIG. 15B)
  • genes that serve as indicators of blood cell induction eg, CD41a (FIG. 16A), Glycophorin-A (FIG. 16B)
  • the present invention provides a method for efficiently differentiating blood cells in vitro.
  • the present invention makes it possible to easily supply a sufficient amount of blood cells in vitro, and therefore the present invention greatly contributes to the development of fields such as medicine.

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Abstract

　本発明は、効率的な血液細胞への分化方法の提供を目的とする。具体的に、本発明は、インビトロにおいて、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞から血液細胞を調製する際に、低酸素分圧下において培養を行うことにより、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞などへの分化効率を増大させ、最終的に得られる所望の血液細胞の数を増大させる。

Description

多能性幹細胞からの血液細胞分化に関する培養方法
　本発明は血液細胞へ分化させるための細胞培養方法に関する。より具体的には、本発明は、血液前駆細胞へ分化し得る細胞を血液前駆細胞に分化させ、さらに、血液細胞にまで分化させるための細胞培養法に関する。
　血液関連疾患の治療に際し、各種血液細胞の必要量を安定に供給することは、非常に重要なことである。これまでは、主として、ドナーによる献血により採取される血液から、各種血液細胞を調製し、手術などの治療に用いてきた。しかしながら、慢性的なドナー不足のため、十分な量の血液細胞を必要な時に迅速に確保することは容易なことではなかった。特に、血液凝固（止血）に必須の細胞である血小板は、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおいて、必須の細胞であるにもかかわらず、ドナーから採取した血小板を凍結して保存することができないため、安定供給のための有効な手段に対するニーズは極めて高いものである。
　最近では、ドナーからの提供に依存せずに、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞から、生体外において、各血液細胞を調製する試みもさかんに行われるようになり、その実用化に注目が集まっている。例えば、Ｔａｋａｙａｍａらは、ヒトＥＳ細胞から血小板を産生することに成功したことを報告している（特許文献１及び非特許文献１）。また、同様にｉＰＳ細胞からも血小板の調製が可能なことも開示されている（特許文献２）。
　生体外において、多能性幹細胞から血液細胞を調製する方法が開発されたことにより、今後の医療の現場において使用される各種血液細胞の多くが、多能性幹細胞から調製されることになり、慢性的な血液細胞不足も容易に解消されるとの期待も生じている。しかし、これまでに報告されているｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞からの血液細胞の調製法では、調製される血液細胞の量が少なく、手術などの治療に必要とされる量を確保するのは難しいのが現状である。従って、血液細胞への分化を何らかの方法により促進させるべく、そのため、従来法の改良を行う必要がある。
　細胞の分化誘導を行う場合、生体内と生体外で大きく異なる条件の１つとして、酸素濃度を挙げることができる。生体外において、細胞の分化誘導を行う場合、各前駆細胞を大気酸素環境より低い酸素濃度下で培養等を行い、分化誘導をしている例がいくつか報告されている（非特許文献２～非特許文献５、特許文献３～特許文献５）。例えば、これまでに、軟骨に分化し得る細胞を低酸素条件下で培養して軟骨分化を行う方法（特許文献３）、未分化中枢神経系細胞（特許文献４）又は神経冠幹細胞（特許文献５）を低酸素条件下で培養する方法、ＥＳ細胞を低酸素濃度で培養後、大気酸素濃度で培養し、心筋細胞へ分化させる方法（非特許文献５）などが報告されている。しかしながら、血液細胞への分化に対する低酸素濃度の影響について詳細に報告されている例は未だに存在していない。
ＷＯ２００８／０４１３７０ ＷＯ２００９／１２２７４７ 特開２００３－１２５７８７ ＷＯ００／２９５５０ ＷＯ００／２９５４９
Ｔａｋａｙａｍａら，Ｂｌｏｏｄ，１１１：５２９８－５３０６　２００８ Ｋｅｎｎｅｄｙら，Ｂｌｏｏｄ，１０９：２６７９－２６８７　２００７ Ｐｒａｄｏ－Ｌｏｐｅｚら，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，２８：４０７－４１８　２０１０ Ｍａｒｔｉｎ－Ｒｅｎｄｏｎら，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，２５：１００３－１０１２　２０１０ Ｂａｕｗｅｎｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｅｎｇ．，９０：４５２－４６１　２００５
　本発明者らは、すでに、多能性幹細胞から血液前駆細胞を取得し、さらに、各種血液細胞にまで分化させる方法を確立しているが、この方法によって調製される血液細胞の量は少なく、治療等に使用する量として十分であるとまではいえない状況にある。
　そこで、本発明は、上記事情に鑑み、より大量かつ安定的なインビトロにおける血液細胞の調製法の確立を目指し、血液前駆細胞への新規な分化誘導方法の提供、並びに、該方法で製造される血液前駆細胞及び該血液前駆細胞から分化誘導される各種血液細胞の提供を目的とする。
　発明者らは、多能性幹細胞から血液前駆細胞を誘導する工程において、細胞培養を、一定期間、低酸素分圧下で行ったところ、誘導された血液前駆細胞の数が大気酸素分圧下のみで培養を行った場合と比較して増大することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（１６）に関する。
（１）血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を酸素分圧が上昇する環境において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（２）前記酸素分圧が上昇する環境が、低酸素分圧下において細胞培養する工程を含む環境である、上記（１）に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（３）前記低酸素分圧が０．１～１０％である上記（２）に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（４）前記低酸素分圧が、該分圧下で培養を行った場合、他の分圧下での培養と比較して低酸素応答性の遺伝子が発現する酸素分圧であることを特徴とする、上記（２）又は（３）に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（５）前記低酸素分圧において細胞培養開始から一定期間細胞培養を行った後、より高い酸素分圧下でさらに細胞培養を行う上記（２）乃至（４）のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（６）前記一定期間が、４～１０日間である上記（５）に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（７）前期一定期間が、ＫＤＲ陽性、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陽性を示す細胞が出現するまでである上記（５）又は（６）に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（８）前記より高い酸素分圧下に変える時期が、中内胚葉誘導の指標となる遺伝子が発現する時期、血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子の発現が開始される時期、分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子の発現が開始される時期、又は、血液細胞誘導の指標となる遺伝子の発現が開始される時期であることを特徴とする上記（５）乃至（７）のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（９）前記より高い酸素分圧が、酸素分圧１１～３０％である上記（５）乃至（８）のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（１０）前記血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞が、多能性幹細胞である上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（１１）前記血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞がネット様構造又は胚様体から取得されることを特徴とする上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（１２）前記細胞培養を行う培地中にＶＥＧＦを添加しないことを特徴とする上記（１）乃至（１１）のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
（１３）上記（１）乃至（１２）のいずれかに記載の方法で製造される血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞。
（１４）上記（１３）に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞をさらに培養して製造される血液細胞。
（１５）上記（１４）に記載の血液細胞を含む医薬製剤。
（１６）上記（１）に記載の製造方法を使用することを特徴とする血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法。
　本発明によれば、従来法と比較して、分化誘導される血液前駆細胞、赤血球前駆細胞並びに血液細胞の数を増大させることが可能となる。
　本発明によれば、所望の数の血液前駆細胞、赤血球前駆細胞又は血液細胞を取得するための培養期間を短縮することが可能となる。
　本発明によれば、従来、効率的な血液前駆細胞の誘導のために必要であったＶＥＧＦを使用することなく、血液前駆細胞を調製することができる。
本発明によれば、血液分化能力の高い血液前駆細胞、赤血球前駆細胞を得ることができる。
低酸素分圧下での培養が血液細胞分化に与える効果。縦軸は、培養後に生じた血液細胞の数である。（１）は、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果を、（２）は、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果、（３）は、１４日間５％酸素分圧で培養した結果である。（１）（２）及び（３）の全ての実験は、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下で行った。使用した細胞は、ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７－４株）。 血液前駆細胞（ＨＰＣ；ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ）への分化に対する低酸素培養の効果を示す。ＨＰＣへの分化に対する低酸素培養の効果をフローサイトメトリーを使用して検討した。（１）は、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果を、（２）は、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果、（３）は、１４日間５％酸素分圧で培養した結果である。使用した細胞は、ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７－４株）。 血液前駆細胞への分化に対する低酸素培養の効果について、コロニーアッセイにより検討した結果である。（１）は、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果を、（２）は、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果である。ｎ、ｍ、Ｅ、Ｍ及びｂｌａｓｔは、各々、好中球、マクロファージ、赤芽球、巨核球、幼若血球のことである。文字の組合せは、各文字に対応する細胞が混在することを示す（例えば、ｎｍは、好中球とマクロファージが混在することを示す）。また、縦軸は、１×１０４個の血液細胞に由来するコロニー数を表す。グラフ中に示す数字はミックスコロニーの数である。使用した細胞は、ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７－２株）。 血液前駆細胞への分化に対する低酸素培養の効果について、ＣＤ３４陽性細胞数をカウントすることで評価した結果である。ここでは、多能性幹細胞として、ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３株）を使用した。（１）は、ＶＥＧＦ存在下、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果、（２）は、ＶＥＧＦ存在下、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果、（３）は、ＶＥＧＦ非存在下、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果である。縦軸は、（３）の結果をして得られたＣＤ３４陽性細胞の数を１とした場合のＣＤ３４陽性細胞数の結果である。 赤血球系細胞への分化に対する低酸素培養の効果について、フローサイトメトリーを使用して検討した結果である。（１）は、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果を、（２）は、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果、（３）は、１４日間５％酸素分圧で培養した結果である。（１）（２）及び（３）の全ての実験は、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの存在下で行った。使用した細胞は、ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７－４株）。 多能性幹細胞から得られる各種血液細胞数に対する低酸素培養の効果を調べた結果を示す。Ａ及びＢは赤血球細胞、Ｃは巨核球細胞、Ｄは血小板について検討した。なお、ＡはＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－３株）に由来する血球細胞、Ｂ～ＤはｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７－２株）に由来する血球細胞の細胞数である。（１）は、１４日間２１％酸素分圧で培養し、赤血球分化培養した結果を、（２）は、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養し、その後赤血球分化培養した結果である。 低酸素分圧下で培養したＨＰＣのβグロビン鎖陽性率につい検討した結果を示す。ＡはＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－３株）に由来する赤血球、ＢはｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７－２株）に由来する赤血球に関するβグロビン鎖陽性細胞の割合である。（１）は、１４日間２１％酸素分圧で培養し、赤血球分化培養した結果を、（２）は、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養し、赤血球分化培養した結果である。また、Ｃは赤血球細胞をＤＡＰＩと抗ヒトヘモグロビン抗体（左図）又は抗ヒトβグロビン抗体（右図）で二重染色した結果である。 低酸素培養によるＶＥＧＦ代替性に関する検討結果。Ａは、培養後に生じた血球数をカウントした結果を、Ｂは、培養後に生じた細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。（１）は、ＶＥＧＦ存在下、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果、（２）は、ＶＥＧＦ非存在下、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果を示す。使用した細胞は、ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７－４株）。 低酸素培養によるＶＥＧＦ代替性について、コロニーアッセイにより検討した結果である。Ａは、ｉＰＳ細胞のＴｋＣＢ７－４株、Ｂは、ｉＰＳ細胞のＴｋＣＢ８－３株、Ｃは、ＥＳ細胞のＫｈＥＳ３株を用いた結果である。（１）は、ＶＥＧＦ存在下、１４日間２１％酸素分圧で培養した結果、（２）は、ＶＥＧＦ非存在下、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果を示す。ｎ、ｍ、Ｅ、Ｍ及びｂｌａｓｔは、各々、好中球、マクロファージ、赤芽球、巨核球、幼若血球のことである。文字の組合せは、各文字に対応する細胞が混在することを示す（例えば、ｎｍは、好中球とマクロファージが混在することを表す）。Ａの縦軸は、５×１０３個の血液細胞に由来するコロニー数を表し、Ｂの縦軸は、１×１０４個の血液細胞に由来するコロニー数を表し、Ｃの縦軸は、１×１０５個のＥＳ細胞に由来するコロニー形成細胞数を表す。グラフ中に示す数字はミックスコロニーの数である。 １％酸素分圧下での培養の効果について検討した。ＶＥＧＦ非存在下、（１）は、７日間５％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果、（２）は、７日間１％酸素分圧で培養した後２１％酸素分圧で７日間培養した結果である。縦軸は、培養開始時のＥＳ細胞数（１×１０５）あたりの血球コロニー数を表す。使用した細胞は、ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３株）。 １％酸素分圧下での培養の効果について検討した。ＶＥＧＦ存在下において２１％酸素分圧下で１４日間培養した場合（１）、ＶＥＧＦ非存在下において５％酸素分圧下で７日間培養後、２１％酸素分圧下で７日間培養した場合（２）、ＶＥＧＦ非存在下において１％酸素分圧下で７日間培養後、２１％酸素分圧下で７日間培養した場合（３）に生じる血液前駆細胞について、コロニーアッセイを行った結果を示す。ｎ、ｍ、Ｅ、Ｍ及びｂｌａｓｔは、各々、好中球、マクロファージ、赤芽球、巨核球、幼若血球のことで、文字の組合せは、各文字に対応する細胞が混在することを示す。縦軸は、培養開始時のＥＳ細胞数（１×１０５）あたりの血球コロニー数を表し、グラフ中の数字はミックスコロニーの数を示す。使用した細胞は、ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３株）。 低酸素分圧下での培養からより高い酸素分圧下での培養へ切り替えるタイミングに関する検討結果。Ａは、５％酸素分圧下、Ｂは、１％酸素分圧下で実験を行った。縦軸は、Ｎ－を１とした場合の、全血液細胞数の相対値である。横軸の、Ｌ４－、Ｌ７－、Ｌ１０－は、培養開始後４日、７日、１０日目に低酸素環境から２１％酸素分圧下に切り替えた結果である。また、Ｌ１４は、終始低酸素培養を行った。Ｎ－は終始２１％酸素分圧下で培養を行った。全ての培養において、ＶＥＧＦは添加しなかった。 酸素分圧変化に伴う、中内胚葉誘導の指標となる遺伝子（Ｔ）の発現変化の検討結果。縦軸は、ＧＡＰＤＨの発現に対する相対的な発現を示す。また、Ｌ７は培養開始後７日目に低酸素分圧下（５％酸素分圧）から大気酸素分圧下（２１％酸素分圧）に切り替えた場合、また、Ｌ１４は、終始低酸素分圧下（５％酸素分圧）で培養を行った場合である。遺伝子発現は、培養８日目に調べた。 酸素分圧変化に伴う、血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子（ＴＡＬ－１（Ａ）、ＫＤＲ（Ｂ）及びＣＤＲ３４（Ｃ））の発現変化の検討結果。縦軸は、ＧＡＰＤＨの発現に対する相対的な発現を示す。Ｌ７及びＬ１４は図１３の説明と同じ。遺伝子発現は、培養１０日目に調べた。 酸素分圧変化に伴う、サイトカインの指標となる遺伝子（ＶＥＧＦ（Ａ）及びＥＰＯＲ（Ｂ））の発現変化の検討結果。縦軸は、ＧＡＰＤＨの発現に対する相対的な発現を示す。Ｌ７及びＬ１４は図１３の説明と同じ。ＶＥＧＦの発現は培養１４日目に、ＥＰＯＲの発現は培養８日目に調べた。 酸素分圧変化に伴う、血液細胞誘導の指標となる遺伝子（ＣＤ４１ａ（Ａ）及びＧｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ－Ａ（Ｂ））の発現変化の検討結果。縦軸は、ＧＡＰＤＨの発現に対する相対的な発現を示す。Ｌ７及びＬ１４は図１３の説明と同じ。遺伝子発現は培養１４日目に調べた。 酸素分圧変化に伴う、低酸素応答性遺伝子（ＨＩＦ２ａ）の発現変化の検討。縦軸は、ＧＡＰＤＨの発現に対する相対的な発現を示す。また、Ｎ－は終始２１％酸素分圧下で培養を行った場合で、Ｌ７は図１３の説明と同じ。遺伝子発現は培養７日目に調べた。
　本発明の実施形態の１つは、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を酸素分圧が上昇する環境において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化方法、あるいは、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を低酸素分圧下において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法である。
　また、本発明の他の実施形態は、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を低酸素分圧下において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化方法、あるいは、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を低酸素分圧下において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法である。
　ここで、「血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞」とは、特に限定するものではなく、例えば、多能性幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞など）、あるいは、多能性幹細胞と血液前駆細胞の間の分化段階にある細胞であればいずれの細胞であってもよく、好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。
　本発明で使用されるＥＳ細胞は、特に限定されるものではなく、一般的には、胚盤胞期の受精卵をフィーダー細胞と共に一緒に培養し、増殖した内部細胞塊由来の細胞をばらばらにして、さらに、植え継ぐ操作を繰り返し、最終的にＥＳ細胞株として樹立することができる。このように、ＥＳ細胞は受精卵から取得するものである。その他、例えば、脂肪組織、絨毛膜絨毛、羊水、胎盤、精巣細胞など、受精卵以外の細胞、組織から取得され、ＥＳ細胞類似の特徴を持ち、分化多能性を有するＥＳ細胞様の細胞であってもよい。
　また、本発明で使用されるｉＰＳ細胞は、体細胞（例えば、線維芽細胞や血液細胞など）へ分化多能性を付与する数種類の転写因子（以下、ここでは「分化多能性因子」と称する）遺伝子を導入することにより、ＥＳ細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞であれば、如何なる由来の細胞であってもよい。分化多能性因子としては、すでに多くの因子が報告されており、限定はしないが、例えば、Ｏｃｔファミリー（例えば、Ｏｃｔ３／４）、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ２、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５及びＳＯＸ１７など）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２など）、ＭＹＣファミリー（例えば、ｃ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、Ｌ－ＭＹＣなど）、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８などを挙げることができる。ｉＰＳ細胞の樹立方法については、多くの文献が発行されているので、それらを参考にすることができる（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ　２００６，１２６：６６３－６７６；Ｏｋｉｔａら，Ｎａｔｕｒｅ　２００７，４４８：３１３－３１７；Ｗｅｒｎｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ　２００７，４４８：３１８－３２４；Ｍａｈｅｒａｌｉら，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　２００７，１：５５－７０；Ｐａｒｋら，Ｎａｔｕｒｅ　２００７，４５１：１４１－１４６；Ｎａｋａｇａｗａら，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２００８，２６：１０１－１０６；Ｗｅｒｎｉｇら，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　２００８，１０：１０－１２；Ｙｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００７，３１８：１９１７－１９２０；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ　２００７，１３１：８６１－８７２；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２００８　３２２：９４５－９４９などを参照のこと）。
本発明により分化又は製造される血液前駆細胞とは、ＣＤ３４－（ＣＤ３４陰性）、ＣＤ３４＋（ＣＤ３４陽性）、Ｌｉｎ－（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、または、ＣＤ２３５ａ陰性）、ＣＤ３８－（ＣＤ３８陰性）、ＣＤ９０＋（ＣＤ９０陽性）、ＣＤ４９ｆ＋（ＣＤ４９ｆ陽性）、ＶＥＧＦＲ２＋（ＶＥＧＦＲ２陽性）、ＣＤ３１＋（ＣＤ３１陽性）、ＣＤ４３＋（ＣＤ４３陽性）、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋（ＣＤ３４陽性、かつ、ＣＤ４５陽性）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ弱陽性、あるいは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陰性／弱陽性ののうち、単独、あるいは複数のマーカーの組み合わせで特徴付けられる造血系の細胞の事である。また、本発明により分化又は製造される赤血球前駆細胞とは、ＣＤ７１＋（ＣＤ７１陽性）、ＧＰＡ（Glycophorin A）＋（ＧＰＡ陽性）、ＧＰＡ＋／ＣＤ４１＋（ＧＰＡ陽性／ＣＤ４１陽性）あるいは、ＧＰＡ（Glycophorin A）＋／ＣＤ４５＋（ＧＰＡ陽性／ＣＤ４５陽性）として、特徴付けられる造血系の細胞のことである。また、本発明により分化又は製造される巨核球、血小板とは、ＣＤ４１＋（ＣＤ４１陽性）、ＣＤ４２ｂ＋（ＧＰＡ陽性）、ＣＤ４１＋／ＣＤ４２ｂ＋（ＣＤ４１陽性／ＣＤ４２ｂ陽性）、あるいは、ＧＰＡ－／ＣＤ４１＋（ＧＰＡ陰性／ＣＤ４１陽性）として特徴付けられる造血系の細胞の事である。
　本発明で使用される「細胞」が由来する動物は、ヒト及び非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなど）であり特に限定はされないが、特に好ましくは、ヒトである。
　本発明において、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞を分化誘導するために行う細胞培養の条件のうち酸素分圧条件以外の条件については、当業者により選択可能な如何なる条件を使用してもよく、例えば、「血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞」としてＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を使用する場合、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞を分化誘導する過程において、ネット様構造物又は胚様体が形成されるような条件などを培養条件の例として使用することができる。
　ここで、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から調製される「ネット様構造物」とは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞由来の立体的な嚢状（内部に空間を伴うもの）構造体で、内皮細胞集団などで形成され、内部に血液前駆細胞及び赤血球前駆細胞を含むもののことである。ネット様構造物の詳細については、例えば、ＴＡＫＡＹＡＭＡら，ＢＬＯＯＤ　２００８，１１１：５２９８－５３０６、を参照のこと。
　ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞からネット様構造物が形成される培養条件とは、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞によって異なるが、例えば、培地としては、最終濃度１５％のＦＢＳを添加したＩＭＤＭを用い、その他無血清の場合においても適宜増殖因子およびサプリメント等を加えたものを使用することができる。なお、従来法では、ネット様構造物を効率的に形成させるために、ＶＥＧＦ（０～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、２０ｎｇ／ｍｌ程度）を加えて培養を行っているが、本発明で開示されるように低酸素環境下での培養を行う場合には、ＶＥＧＦを添加しなくても、ＶＥＧＦを添加した場合と同等の効果を得ることができる。酸素分圧以外の培養の環境としては、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、例えば、５％　ＣＯ２、３６～３８℃、好ましくは３７℃の条件を用いることができる。ネット様構造物が形成されるまでの培養期間は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、フィーダー細胞上に播いてから、１４～１６日間程度である。形成されたネット様構造物は、濾胞状構造になっており、内部には、血液前駆細胞及び赤血球前駆細胞が濃縮された状態で存在している。ネット様構造物の内部に存在する血液前駆細胞及び赤血球前駆細胞は、物理的な手段、例えば、滅菌済みの篩状器具（例えば、セルストレイナーなど）に通すことにより、分離することができる。このようにして得られる血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞は、さらに培養して、各種血液細胞へ分化させることができる。
　また、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞を培養する条件（酸素分圧以外の条件）として、胚様体と呼ばれる内胚葉、中胚葉、外胚葉の分化細胞を含む細胞塊が形成されるような条件を使用することも可能である。その条件としては、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞によって異なるが、例えば、培地としては、最終濃度１５％のＦＢＳ、トランスフェリンなどを添加したＩＭＤＭを用い、その他適宜増殖因子およびサプリメント等を加えたものを使用することができる。また、酸素分圧以外の培養環境としては、用いるＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の種類によって異なるが、例えば、５％　ＣＯ２、３６～３８℃、好ましくは３７℃の条件を用いることができる。
　本発明において、「酸素分圧が上昇する環境」とは培養中に酸素分圧が上昇する条件を備えた環境を意味する。この環境は人工的に作り出された環境であってよい。「酸素分圧が上昇する」とは低酸素分圧の範囲において酸素分圧が上昇してもよいし、より高い酸素分圧の範囲において酸素分圧が上昇してもよい。また低酸素分圧からより高い酸素分圧へ移行するような範囲において酸素分圧が上昇してもよい。培養中に酸素分圧が上下に変動するような環境であっても、一時的に酸素分圧が上昇するような環境は、本発明の「酸素分圧が上昇する環境」である。
　本発明における「低酸素分圧」とは、例えば、酸素分圧０．１％～１０％、好ましくは、１％～５％、より好ましくは５％程度のことである。あるいは、低酸素応答性の遺伝子が発現する酸素分圧を「低酸素分圧」として選択してもよい。ここで、低酸素応答性遺伝子とは、例えば、ＨＩＦ２α、ＨＩＦ１α、ＨＩＦ３α、ＨＩＦ１β、ＧＬＵＴ－１、ｐ２１、ｐ５７、ＦｏｘＯ、Ｎｏｔｃｈ１、ＶＥＧＦ、ＡＢＣＧ２／Ｂｃｒｐ－１、ＣＸＣＲ４、ＰＤＫ－１、ｃ－Ｋｉｔなどが挙げられる。
　本発明における「発現」とは、例えば、遺伝子が転写されてｍＲＮＡが合成されること、遺伝子のｍＲＮＡが翻訳されてタンパク質となること、あるいは遺伝子のタンパク質が機能を発揮することである。
　また、血液前駆細胞へ分化し得る細胞から血液前駆細胞を分化誘導又は製造するために行う細胞培養において、全工程を低酸素分圧下にしてもよいが、血液前駆細胞へ分化し得る細胞の培養開始から、例えば、ＫＤＲ＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ４３＋を示す細胞が出現するまでの期間を低酸素分圧下で培養し、その後、より高い酸素分圧、例えば大気酸素分圧２１％の酸素分圧下で培養することが好ましい。例えば、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞からネット様構造物を形成させる条件で培養を行う場合、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の培養開始から、１～１０日間、好ましくは、４～８日間、より好ましくは、７日間程度、低酸素分圧下（例えば、酸素分圧５％程度）で培養を行い、その後、より高い酸素分圧下で培養することが好ましい。
　あるいは、低酸素分圧からより高い酸素分圧に切り替えるタイミングは、特定の遺伝子の発現変化を指標にして決定してもよい。特定の遺伝子としては、限定はしないが、例えば、中内胚葉誘導の指標となる遺伝子、血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子、分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子、又は、血液細胞誘導の指標となる遺伝子を挙げることができる。例えば、中内胚葉誘導の指標となる遺伝子が発現するタイミングの前後で酸素分圧を低酸素から大気酸素へ切り替える事が望ましい。また、血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子、分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子、及び血液細胞誘導の指標となる遺伝子は、その発現が始まる前後までに酸素分圧を低酸素から大気酸素へ切り替えることが望ましい。
　前述の中内胚葉誘導の指標となる遺伝子とは、Ｔ、ＳＯＸ－１７、ＧＡＴＡ－４、ＨＮＦ－３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｍｉｘｌ１、ＦＧＦ４　ＣＤ４８、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ－６、ＣＸＣＲ４、ｃ－Ｋｉｔ、ＣＤ９９、ＯＴＸ２、Ｎｏｄａｌなどが挙げられる。前述の血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子とは、ＴＡＬ－１、ＫＤＲ、ＣＤ３４、ＣＸＣＲ４、ｃ－Ｋｉｔ、ＲＵＮＸ－１、ＧＡＴＡ－１、ＧＡＴＡ－２、ＣＤ４３、ＥＴＶ－２、Ｔｉｅ－２、ＣＤ３１、ＣＬＯＵＤＩＮ５、Ｓｃａ－１などが挙げられる。前述の分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子とは、ＶＥＧＦ、ＥＰＯＲ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ－２、ＦＬＴ－１、Ａｎｇ－１、ＳＤＦ－１、ＳＣＦなどが挙げられる。前述の血液細胞誘導の指標となる遺伝子とは、ＣＤ４１、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ－Ａ、ｃ－ＭＰＬ、Ｒｈ抗原、α４インテグリン、ＫＬＦ－１、ＢＣＬ－１１Ａ、ＣＤ４５、β－Ｇｌｏｂｉｎ、α－Ｇｌｏｂｉｎ、ε－Ｇｌｏｂｉｎ、γ－Ｇｌｏｂｉｎなどが挙げられる。
　ここで、「より高い酸素分圧」とは、血液前駆細胞へ分化し得る細胞の培養開始時の酸素分圧（低酸素分圧）よりも高い酸素分圧であり、例えば、１１％～３０％程度の酸素分圧、より好ましくは、１５％～２５％程度の酸素分圧である。特に、「より高い酸素分圧」とは、大気酸素分圧２１％程度が好ましい。
　本発明の他の実施形態は、本発明の方法により製造される血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞をさらに培養し、各種血液細胞を分化誘導又は製造する方法である。
　血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞から様々な血液細胞を分化誘導する方法は、当該技術分野において、多くの方法が公知になっており（例えば、Ｍｉｈａｒａｄａら，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２００６，２４：１２５５－１２５６；Ｑｉｕら，Ｂｌｏｏｄ　２００８，１１１：２４００－２４０８；Ｍａら，ＰＮＡＳ　２００８，１０５：１３０８７－１３０９２；Ｌｕら，Ｂｌｏｏｄ　２００８，１１２：４４７５－４４８４；Ｂａｅｋら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　２００９，１１：２２８５―２２９５；Ｌａｐｉｌｌｏｎｎｅら，ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ　２０１０，ｄｏｉ：１０．３３２４）、当業者であれば容易に選択し、実施することができる。
　例えば、本発明の方法により製造された血液前駆細胞から、成熟巨核球細胞、さらに、血小板を製造する場合、その培養条件として、ＴＰＯ、ＩＬ－１α、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＥＰＯ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｆｌｔ３リガンド、Ｈｅｐａｒｉｎなどのいずれか又はこれらのうちの２つ以上を組合せて添加した条件を挙げることができる。より具体的に、成熟巨核球細胞及び血小板を分化誘導する条件として、例えば、ＴＰＯ（１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ程度）の存在下で、あるいは、ＴＰＯ（１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ程度）、ＳＣＦ（１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ程度）及びＨｅｐａｒｉｎ（１０～１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは２５Ｕ／ｍｌ程度)の存在下で、７～１５日間程度培養する条件を例示することができる。培養環境としては、インビトロで血球系細胞の分化誘導を行うにあたり適した環境であればよいが、例えば、５％　ＣＯ２、３６～３８℃、好ましくは３７℃の条件下で培養を実施してもよい。
　また、本発明の方法により製造された赤血球前駆細胞から、成熟赤血球細胞を分化誘導するために適した条件とは、例えば、ＴＰＯ、ＩＬ－１α、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１１，ＥＰＯ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ、Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ、Ｈｅｐａｒｉｎなどのいずれか又はこれらのうちの２つ以上を組合せて添加した条件を挙げることができる。より具体的に、赤血球細胞を分化誘導する条件として、ＥＰＯ（２～１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ程度）の存在下で、あるいは、ＥＰＯ（２～１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ程度）、ＳＣＦ（１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ程度）、ＴＰＯ（５～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ程度）の存在下で、７～２５日間程度培養する条件を例示することができる。培養環境としては、インビトロで血球系細胞の分化誘導を行うにあたり適した環境であればよいが、例えば、５％　ＣＯ２、３６～３８℃、好ましくは３７℃の条件下で培養を実施してもよい。
　また、本発明によって製造される各種血液細胞は、製剤の形態で安定に供給することも可能である。本発明の方法によって、例えば、血小板を製造し、これを製剤化する場合、血小板が豊富に存在する培養液の画分を回収し、白血球除去フィルターなどを使用して、巨核球細胞、その他、血小板以外の血球系細胞成分を除去して、調製することができる。血液製剤を調製するにあたっては、血小板又は赤血球細胞の安定化に資する他の成分を含有せしめることもできる。このような安定化に資する成分は、当該技術分野の専門家において周知のものを選択することが可能である。
　より具体的には、取得した血小板は、例えば、以下の方法により製剤化することができる。
　ＡＣＤ－Ａ液：ＦＦＰ（ｆｒｅｓｈ　ｆｒｏｚｅｎ　ｐｌａｓｍａ；献血で得られた全血液から調整したもの、アルブミン、凝固因子など血液成分以外のものをすべて含む）を１：１０の比率で調整し、１５－５０Ｇｙの放射線照射後に２０－２４℃にて振とうしながら保存する。ＡＣＤ－Ａ液；クエン酸ナトリウム２２ｇ／クエン酸８ｇ／ブドウ糖２２ｇを注射用水で全体を１Ｌとするように調整する。
　以上の方法を使用する場合、血小板の濃度としては、例えば、１×１０９血小板／ｍＬ程度が望ましい。
　また、ＧＭ６００１（ａ　ｂｒｏａｄ－ｒａｎｇｅ　ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ　ａｃｉｄ－ｂａｓｅｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加しておくと、冷凍保存および室温保存中に起きる血小板機能分子ＧＰＩｂ－Ｖ－ＩＸやＧＰＶＩの切断に伴う不活化を予防できる。本発明者らは、この方法により、マウスＥＳ細胞由来血小板に関し不活性化の予防が可能であることを確認している。なお、ヒト血小板を使用したこの血小板不活性化に関する機序の参考論文として、Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ，Ｗ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｉｒ　Ｒｅｓ　９５：６７７－６８３，２００４及び　Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＥＥ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，５：１５３０－１５３７，２００７を参照のこと。
　なお、血小板を含む製剤を収納する容器は、ガラスのように血小板を活性化する材質のものを避けるのが好ましい。
　また、本発明により、例えば、赤血球細胞を製造し、これを製剤化する場合、以下のように行うことができる。
　培養上清を遠心後濃縮した濃厚赤血球液にＭＡＰ液（組成は以下参照）を加えて調製し、１５－５０Ｇｙの放射線照射後に２～６℃で保存する。
　以上の方法を使用する場合、赤血球の濃度としては、例えば、１×１０１０赤血球／ｍＬ程度が望ましい。取得した赤血球は、赤血球保存用添加液　（ＭＡＰ液）として、例えば、Ｄ－マンニトール（１４．５７ｇ）、アデニン（０．１４ｇ）、結晶リン酸二水素ナトリウム（０．９４ｇ）、クエン酸ナトリム（１．５０ｇ）、クエン酸（０．２０ｇ）、ブドウ糖（７．２１ｇ）、塩化ナトリム（４．９７ｇ）を、注射用水を加えて溶かし、全量を１０００ｍｌとしたものを使用することができる。
　その他、赤血球の製剤化に適当と思われる公知の方法を適宜選択することは、当業者において容易なことである。
　さらに、本発明の実施形態には、本発明の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の分化方法又は製造方法を使用することを特徴とした、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法が含まれる。具体的には、本発明の方法として実施される細胞の培養工程において、適当な時期に、適当な期間、培地中に候補となる分化促進物質又は分化阻害物質を添加し、得られる血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の数を測定し、対照として行われる実験（候補物質を加えず同じ培養工程を行う）との比較により、該促進物質又は阻害物質の効果を評価することができる。対照の実験から得られる血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の数よりも多ければ、促進物質であり、少なければ阻害物質として評価することができる。
　以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、実施例は、あくまでも本発明の一部の態様を示すものであって、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
＜材料及び方法＞
１．細胞と試薬
　ヒトｉＰＳ細胞は、山中４因子（ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ）の導入によって樹立したＴｋＣＢ７－２、ＴｋＣＢ７－４、ＴｋＣＢ８－３を用いた。ｉＰＳ細胞の維持培養は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ａｎｄ　Ｈａｍ　Ｆ－１２　ｍｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ）に、０．１ｍＭ　非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０％　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ）、及び５ｎｇ／ｍＬ　塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｕｐｓｔａｔｅ）を加えた培地を使用した。ｉＰＳ細胞は、放射線照射（５０Ｇｙ）したマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）上にて培養し、３日おきに継代して未分化状態を維持した。また、フィーダー細胞として使用したマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は、Ｅａｇｌｅ　ｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、１０％　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミンを加えて培養した。
　分化培地は、Ｉｓｃｏｖｅ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ｍｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ）に、１０μｇ／ｍＬ　ヒトインスリン、５．５μｇ／ｍＬ　ヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍＬ　亜セレン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、０．４５ｍＭ　α－モノチオグリセロール（ＳＩＧＭＡ）、５０μｇ／ｍＬ　アスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ）、及び１５％　ｈｉｇｈｌｙ　ｆｉｌｔｅｒｅｄ　ＦＢＳ　（Ｃｅｌｌｅｃｔ　Ｇｏｌｄ；　ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を加えて使用し、これに、ヒト血管内皮細胞増殖因子（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加、又は、未添加で行った。
　以上の培養はＣＯ２インキュベーターＨＥＲＡ　ＣＥＬＬ　１５０ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて３７℃、５％　ＣＯ２下で実施した。
　また、ＥＳ細胞については、ＫｈＥＳ３株を用い、ｉＰＳ細胞と同じ条件で、維持培養及び分化等を行った。
２．ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞由来のネット様構造物（以下、ｉＰＳ－Ｓａｃ又はＥＳ－Ｓａｃ）の作製
　本実施例において行ったネット様構造物を調製するための培養工程について以下に説明する（詳細は、ＴＡＫＡＹＡＭＡら，ＢＬＯＯＤ　２００８，１１１：５２９８－５３０６を参照のこと）。
　事前に、５０Ｇｙの放射線照射を行ったＣ３Ｈ１０Ｔ１／２を１００－ｍｍディッシュに用意し、ヒトｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞を１×１０５ずつ分化培地にて播種した。窒素ガスを注入して酸素濃度を大気酸素（２１％　Ｏ２）と低酸素（５％又は１％　Ｏ２）としたＣＯ２インキュベーター内で、１～１４日の間で適宜期間を設定し培養を行った。低酸素で培養した細胞は、その後大気酸素条件へ移すか、そのまま培養を続け、計１４日間の培養を行い、ｉＰＳ－Ｓａｃ又はＥＳ－Ｓａｃを作製した。
３．ｉＰＳ－Ｓａｃ又はＥＳ－Ｓａｃからの血液細胞の回収
　ｉＰＳ－Ｓａｃ又はＥＳ－Ｓａｃをディッシュから剥がして破砕し、３％　ＦＢＳを含むＰＢＳに懸濁した後、４０μｍセルストレイナー（ＢＤ）を通過させた。通過した溶液を４４０×ｇ、１０分間遠心分離して血液細胞を回収し、細胞数をカウントした。
４．フローサイトメトリー解析
　細胞表面抗原の発現は、フローサイトメトリー（ＭｏＦｌｏ，Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）で解析した。細胞は、ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）結合－抗ＣＤ３４抗体、ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）結合－抗ＣＤ４２ｂ抗体、Ａｌｅｘａ４０５結合－抗ＣＤ４５抗体、ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）結合－抗ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ（グリコフォリン）Ａ抗体、ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）結合－抗ＣＤ４１ａ抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色した。
５．血液前駆細胞（ＨＰＣ；ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ）のコロニーアッセイ
　ｉＰＳ－Ｓａｃ又はＥＳ－Ｓａｃから回収したＨＰＣ、５－１０×１０３を５０ｎｇ／ｍｌ　トロンボポイエチン（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＭｅｔｈｏ　Ｃｕｌｔ　ＧＦ　Ｈ４４３４（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁した後、３５ｍｍディッシュへ播種した。ＣＯ２インキュベーター内で１３－１４日間培養し、生じたコロニーをピックアップした。コロニーは、シャンドン　サイトスピン　４（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）にて８００ｒｐｍ、１分間遠心し、Ｈｅｍａｃｏｌｏｒ　Ｒａｐｉｄ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｆ　ｂｌｏｏｄ　ｓｍｅａｒ　（ＭＥＲＣＫ）によって染色して観察した。
６．成熟赤血球の免疫染色
　ｉＰＳ－Ｓａｃ又はＥＳ－Ｓａｃから回収したＨＰＣを成熟赤血球へと分化させ、シャンドン　サイトスピン４にて遠心してスライドグラスへ貼り付けた。これを４％パラホルムアルデヒドで固定後、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で透過処理してから、スキムミルクでブロッキングを行った。一次抗体として、抗ヒトヘモグロビン抗体（Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗ヒトβグロビン抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と赤血球を反応させ、二次抗体として、Ａｌｅｘａ４８８結合－抗ヤギ抗体及びＡｌｅｘａ５４６結合－抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ　Ｍｏｕｎｔｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で封入して、共焦点顕微鏡ＦＶ１０００（オリンパス）で観察した。βグロビン鎖陽性細胞率は、（βグロビン鎖陽性細胞数／ヘモグロビン陽性細胞数）×１００で算出した。
７．リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析
　ｉＰＳ－Ｓａｃ又はＥＳ－ＳａｃをＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて処理し、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを精製した。ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成し、Ｒｏｃｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｏｂｅ（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて７９００ＨＴ　Ｆａｓｔ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。内部標準遺伝子として、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）を使用した。
　Ｔ、ＴＡＬ－１、ＫＤＲ、ＣＤ３４、ＶＥＧＦ、ＥＰＯＲ、ＣＤ４１ａ、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ－Ａ、ＨＩＦ２α、ＧＡＰＤＨの各遺伝子のプライマー配列は、下記の通りである。
T:forward; gctgtgacaggtacccaacc（配列番号１）
T:reverse; catgcaggtgagttgtcagaa（配列番号２）
TAL-1:forward; ctatgagatggagattactgatggtc（配列番号３）
TAL-1:reverse; gtgtggggatcagcttgc（配列番号４）
KDR:forward; gaacatttgggaaatctcttgc（配列番号５）
KDR:reverse; cggaagaacaatgtagtctttgc（配列番号６）
CD34:forward; gtgaaattgactcagggcatc（配列番号７）
CD34:reverse; cccctgtccttcttaaactcc（配列番号８）
VEGF:forward; ccttgctgctctacctccac（配列番号９）
VEGF:reverse; ccacttcgtgatgattctgc（配列番号１０）
EPOR:forward; ttggaggacttggtgtgtttc（配列番号１１）
EPOR:reverse; agcttccatggctcatcct（配列番号１２）
CD41a:forward; gagacacccatgtgcagga（配列番号１３）
CD41a:reverse; agctggggcacacatacg（配列番号１４）
Glycophorin-A:forward; gacacatatgcagccactcct（配列番号１５）
Glycophorin-A:reverse; atgatgggcaagttgtaccc（配列番号１６）
HIF2α:forward; gacatgaagttcacctactgtgatg（配列番号１７）
HIF2α:reverse; gcgcatggtagaattcatagg（配列番号１８）
GAPDH: forward; aacagcctcaagatcatcagc（配列番号１９）
GAPDH: reverse; ttggcaggtttttctagacgg（配列番号２０）
＜結果＞
１．血液細胞への分化に対する低酸素培養の効果
　ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７－４）を分化培地に播種した後、１４日間大気酸素分圧下（２１％）で培養した場合（図１（１））、７日間低酸素分圧下（５％）で培養後、７日間大気酸素分圧下（２１％）で培養した場合（図１（２））、１４日間低酸素分圧下（５％）で培養した場合（図１（３））の各々について、ｉＰＳ－Ｓａｃ内に生じた血液細胞の数をカウントした。その結果、７日間の低酸素分圧下での培養を行った後、７日間の大気酸素分圧下で培養した場合に、生じた血液細胞の数が最も多かった（図１（２））。この結果から、ｉＰＳ細胞を低酸素分圧下で培養を開始し、一定期間低酸素分圧下で培養することで、形成される血球数を増加できることが分かった。
２．血液前駆細胞（ＨＰＣ；ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ）への分化に対する低酸素培養の効果
　ＨＰＣへの分化に対する低酸素培養の効果について検討を行った。ヒトｉＰＳ細胞を、大気酸素分圧下（２１％）で１４日間（図２（１））、低酸素分圧下（５％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間（図２（２））、低酸素分圧下（５％）で１４日間培養（図２（３））し、各々、ｉＰＳ－Ｓａｃ内に生じた細胞について、血液前駆細胞のマーカーであるＣＤ３４及びＣＤ４５が共に陽性の細胞の比率をフローサイトメトリーにより測定した。その結果、血液前駆細胞の比率は、一定期間低酸素分圧下での培養することで、向上することが分かった（図２（２））（図２（３））。
　次に、血液前駆細胞への分化に対する低酸素培養の効果について、ＨＰＣのコロニーアッセイにより検討を行った。
　ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７－２）により形成されたｉＰＳ－Ｓａｃより回収した血液細胞を、１×１０４播種し、培養後に生じたコロニー数をカウントし、各コロニー中に存在する血液細胞の種類（ｎ（好中球）、ｍ（マクロファージ）、Ｅ（赤芽球）、Ｍ（巨核球）、ｂｌａｓｔ（幼若血球））を観察した。その結果、低酸素分圧下（５％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間（図３（２））培養した場合、大気酸素分圧下（２１％）で１４日間（図２（１））培養した場合に比べて、形成されるコロニー数が増加していた。さらに、４種類の血液細胞の全てが含まれるミックスコロニー（ｍｉｘ）は、造血幹細胞／血液前駆細胞を含むことの指標となるものであるが、このミックスコロニーも低酸素分圧下での培養を行った場合の方が多く形成された（図３；大気酸素分圧下での培養では１８個であったのに対し、低酸素分圧下での培養を行うと３４個であった。）。
　ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３）からＨＰＣへの分化に対する低酸素培養の効果についても検討を行った。ＥＳ細胞を、低酸素分圧下（５％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間（図４（１））（＋ＶＥＧＦ）、大気酸素分圧下（２１％）で１４日間（＋ＶＥＧＦ）（図４（２））、大気酸素分圧下（２１％）で１４日間（－ＶＥＧＦ）（図４（３））培養を行った後、ＥＳ－Ｓａｃ内に生じたＣＤ３４陽性の細胞数を、カウントした。その結果、ＥＳ細胞を用いた場合において、低酸素分圧下での培養を行うことで血液前駆細胞の数が増加することが分かった（図４の（１）と（２）を比較。縦軸は、大気酸素分圧下（２１％）で１４日間（－ＶＥＧＦ）培養した場合の血液前駆細胞数を１とした場合の相対数）。
　以上のことから、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞などの多能性幹細胞から血液前駆細胞を分化させる場合、低酸素分圧下における培養過程を含めることで、生じる血液前駆細胞の数を増加できることが明かとなった。
３．赤血球系細胞への分化に対する低酸素培養の効果
　赤血球前駆細胞への分化に対する低酸素培養の効果について検討を行った。ヒトｉＰＳ細胞を、大気酸素分圧下（２１％）で１４日間（図５（１））、低酸素分圧下（５％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間（図５（２））、低酸素分圧下（５％）で１４日間培養（図５（３））し、各々、ｉＰＳ－Ｓａｃ内に生じた細胞について、赤血球前駆細胞のマーカーであるＧＰＡ陽性かつＣＤ４５陰性の細胞の比率をフローサイトメトリーにより測定した。その結果、赤血球前駆細胞の比率は、７日間の低酸素分圧下での培養を行った後、７日間の大気酸素分圧下で培養した場合に、最も大きくなることが分かった（図５（２））。
　このように、多能性幹細胞から赤血球系細胞の分化させる場合においても、低酸素分圧下における培養が効果的であることが示された。
４．低酸素培養による各種血液細胞の増幅効果
　酸素分圧を５％（７日間培養）から２１％（７日間培養）へ切り替えて作製したＨＰＣを成熟赤血球、巨核球、血小板へと分化させ、培養酸素分圧の最適化による末梢血液細胞の増幅効果を確認した。
　その結果、１×１０５　ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－３）あたり得られる成熟赤血球数は、２１％酸素分圧を用いて作製した場合と比べて約２．２倍となり（図６Ａ）、ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７－２）では約５倍となった（図６Ｂ）。さらに巨核球／血小板分化では、１×１０５　ｉＰＳ細胞あたり得られる巨核球数は約４．４倍であり（図６Ｃ）、血小板数は２．８倍に増加した（図６Ｄ）。以上のことから、本技術は、各種血液細胞を多能性幹細胞から作製する際に有効であることが示された。
５．赤血球細胞のβグロビン鎖陽性率に対する低酸素培養の効果
　酸素分圧を５％（７日間培養）から２１％（７日間培養）へ切り替えて作製したＨＰＣを成熟赤血球へと分化させ、赤血球成熟度の指標となるβグロビン鎖陽性細胞率を測定した。
　その結果、ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－３）では、２１％酸素分圧を用いて作製したＨＰＣを分化させて得られた赤血球のβグロビン鎖陽性細胞率は１９．５％であるが（図７Ａ（１））、５％酸素分圧から２１％酸素分圧への切り替えを用いて作製したＨＰＣを分化させて得た赤血球のβグロビン鎖陽性細胞率は３７．３％であり（図７Ａ（２））、赤血球成熟度が向上していた。同様にｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７－２）では、２１％酸素分圧を用いて作製したＨＰＣを分化させて得られた赤血球のβグロビン鎖陽性細胞率は３１．３％であるが（図７Ｂ（１））、５％酸素分圧から２１％酸素分圧への切り替えを用いて作製したＨＰＣを分化させて得た赤血球のβグロビン鎖陽性細胞率は５１．２％であった（図７Ｂ（２））。
　以上のことから、本技術を用いることで、成熟度の高い末梢血液細胞を作製することが可能であると分かった。
６．低酸素培養によるＶＥＧＦ代替性に関する検討
　多能性幹細胞からネット様構造体を経て、血液細胞を効率よく分化させるには、ＶＥＧＦを添加することが望ましい。そこで、血液細胞を効率よく分化させＶＥＧＦの効果を、低酸素培養により代替することができるか検討を行った。
　ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７－４）を、ＶＥＧＦ存在下で１４日間大気酸素分圧下（２１％）にて培養した場合（図８Ａ（１））、ＶＥＧＦ非存在下で、７日間低酸素分圧下（５％）で培養後、７日間大気酸素分圧下（２１％）で培養した場合（図８Ａ（２））について、ｉＰＳ－Ｓａｃ内に生じた血液細胞の数をカウントした。その結果、ＶＥＧＦを添加せずに低酸素分圧下において培養した場合の方が、若干多く血液細胞が生じていた。
　次に、ｉＰＳ－Ｓａｃ内に生じた細胞について、血液前駆細胞のマーカーであるＣＤ３４及びＣＤ４５が共に陽性の細胞の比率をフローサイトメトリーにより測定した結果、血液前駆細胞の比率は、ＶＥＧＦを添加せずに低酸素分圧下において培養した場合の方がやや大きかった（図８Ｂ）。
　さらに、低酸素培養のＶＥＧＦ代替性について、コロニーアッセイにより検討を行った。ｉＰＳ細胞（ＴｋＣＢ７－４（図９Ａ）及びＴｋＣＢ８－３（図９Ｂ））より回収した血液細胞を、５×１０３（ＴｋＣＢ７－４（図９Ａ））又は１×１０４（ＴｋＣＢ８－３（図９Ｂ））播種し、コロニーアッセイを行った。その結果、ＶＥＧＦ非存在下にて低酸素分圧下（５％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間培養した場合（図９Ａ（２）及びＢ（２））の方が、ＶＥＧＦ存在下において大気酸素分圧下（２１％）で培養した場合（図９Ａ（１）及びＢ（１））よりも、形成されるコロニー数が増加し、また、ミックスコロニーの数も増加していた。
　さらに、ＶＥＧＦ存在下において、ＥＳ細胞を酸素分圧を５％から２１％へ切り替えて得られた血液細胞は、ＶＥＧＦ非存在下の場合と比べて、形成されるコロニー数が多くなる傾向が認められた（図９Ｃ）。
　以上のことから、低酸素培養は、ＶＥＧＦの効果を代替するとともに、さらにＶＥＧＦとの組み合わせによっても血液前駆細胞数を増加させ、血液分化能力の高い血液前駆細胞を生み出す事が示された。
７．１％酸素分圧下での培養の効果
　ＶＥＧＦ非存在下において、低酸素分圧下（５％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間培養した場合（図１０（１））と、より低い低酸素分圧下（１％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間培養した場合（図１０（２））において、同数のＥＳ細胞から形成される血球コロニー数を比較した。その結果、５％酸素分圧下で培養した場合の方が、血球コロニー数は多く形成され、血液前駆細胞が多数得ることができた。
　そこで、次に、１％低酸素分圧下において生じる血液前駆細胞の血液細胞への分化能力について、生じるミックスコロニーの数を指標に検討した。ＶＥＧＦ存在下において大気酸素分圧下（２１％）で１４日間培養した場合（図１１（１））、ＶＥＧＦ非存在下において低酸素分圧下（５％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間培養した場合（図１１（２））、さらに、ＶＥＧＦ非存在下において低酸素分圧下（１％）で７日間培養後、大気酸素分圧下（２１％）で７日間培養した場合（図１１（３））において、ＣＤ３４＋細胞を各々から同数回収し、コロニーアッセイを行った。その結果、１％酸素分圧下で培養を開始した場合に、コロニー数が最も多く得られ、ミックスコロニーの数も一番多く出現していた（全期間の大気酸素分圧下で培養した場合の約５倍、５％酸素分圧下で培養を開始した場合の約２．６倍）。この結果から、より低い酸素分圧下（例えば、１％程度）で細胞培養を開始すると、血液細胞への分化能のより高い血液前駆細胞を作製することができる。
８．低酸素環境から大気酸素環境への切り替えのタイミングに関する検討
　ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ３株）を、低酸素分圧下（５％（図１２Ａ）又は１％（図１２Ｂ））で４日間、７日間、１０日間培養後、残りの期間を大気酸素分圧下で培養したもの、全期間（１４日間）を低酸素分圧下で培養したもの、全期間（１４日間）を大気酸素分圧下で培養したもの、各々について培養後に生じた血球数をカウントした。その結果、低酸素分圧下における培養期間が７日間の場合に生じる血球数は最も多く、さらに低酸素分圧下における培養期間を長くすると、血球の形成効率は低下することが分かった（図１２Ａ及びＢのＬ７）。従って、低酸素分圧下での培養７日目頃に大気酸素分圧下での培養に切り替えると最も効率よく血液細胞を分化させることができ、長くても、低酸素分圧下の培養１０日間程度で、大気酸素分圧下での培養に切り替えることが望ましいといえる。
９．低酸素分圧下での培養条件における遺伝子発現変化の検討
　ＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－３）を１４日間低酸素分圧下（５％）で培養した場合（５％Ｌ１４）と、７日間低酸素分圧下（５％）で培養後、大気酸素分圧下（２１％）で培養した場合（５％Ｌ７）の遺伝子発現変化をリアルタイムＰＣＲにて分析した。
　５％Ｌ１４と比べて、５％Ｌ７は、培養８日目に中内胚葉誘導の指標となる遺伝子（例えば、Ｔ）（図１３）の発現が増加していた。その後Ｔ遺伝子の発現は、酸素分圧にかかわらず培養８日目以降徐々に低下していた。
　また、培養８日目以降には血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子（例えば、ＴＡＬ－１（図１４Ａ）、ＫＤＲ（図１４Ｂ）、ＣＤ３４（図１４Ｃ））、サイトカインの指標となる遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ（図１５Ａ）、ＥＰＯＲ（図１５Ｂ））、及び血液細胞誘導の指標となる遺伝子（例えば、ＣＤ４１ａ（図１６Ａ）、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ－Ａ（図１６Ｂ））の発現が増加していた。これら遺伝子の発現は、その後培養１４日目まで増加を続け、一貫して５％Ｌ７が高い発現傾向を示していた。
　また、酸素分圧を変化させる前の培養７日目において、大気酸素（２１％Ｎ）と低酸素（５％Ｌ７）を比較した結果、低酸素応答性の遺伝子（例えば、ＨＩＦ２α）の発現が上昇していた（図１７）。
　以上の結果より、これらの遺伝子の発現は酸素分圧に伴って変化し、酸素分圧の切り替え時期や、使用する酸素分圧を決める際の指標とすることができると分かった。
　本発明は、生体外において血液細胞を効率よく分化させる方法を提供するものである。本発明により、十分な量の血液細胞を生体外で容易に供給することが可能となるため、本発明は、医療等の分野の発展に大きく貢献するものである。

Claims (16)

  1. 　血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞を酸素分圧が上昇する環境において細胞培養する工程を含む、血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
  2. 　前記酸素分圧が上昇する環境が、低酸素分圧下において細胞培養する工程を含む環境である、請求項１に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
  3. 　前記低酸素分圧が０．１～１０％である請求項２に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
  4. 　前記低酸素分圧が、該分圧下で培養を行った場合、他の分圧下での培養と比較して低酸素応答性の遺伝子が発現する酸素分圧であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
  5. 　前記低酸素分圧において細胞培養開始から一定期間細胞培養を行った後、より高い酸素分圧下でさらに細胞培養を行う請求項２乃至４のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
  6. 　前記一定期間が、４～１０日間である請求項５に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
  7. 　前期一定期間が、ＫＤＲ陽性、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４３陽性を示す細胞が出現するまでである請求項５又は６に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
  8. 　前記より高い酸素分圧下に変える時期が、中内胚葉誘導の指標となる遺伝子が発現する時期、血液前駆細胞誘導の指標となる遺伝子の発現が開始される時期、分化増殖性サイトカインの指標となる遺伝子の発現が開始される時期、又は、血液細胞誘導の指標となる遺伝子の発現が開始される時期であることを特徴とする請求項５乃至７のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
  9. 　前記より高い酸素分圧が、酸素分圧１１～３０％である請求項５乃至８のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
  10. 　前記血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞へ分化し得る細胞が、多能性幹細胞である請求項１乃至９のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
  11. 　前記血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞がネット様構造又は胚様体から取得されることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
  12. 　前記細胞培養を行う培地中にＶＥＧＦを添加しないことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞の製造方法。
  13. 　請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法で製造される血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞。
  14. 　請求項１３に記載の血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞をさらに培養して製造される血液細胞。
  15. 　請求項１４に記載の血液細胞を含む医薬製剤。
  16. 　請求項１に記載の製造方法を使用することを特徴とする血液前駆細胞又は赤血球前駆細胞への分化を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法。
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