WO2012028826A1 - Nucléus enrobé d'un revêtement filmogène aux propriétés antibactériennes et cicatrisantes et procédé d'obtention - Google Patents

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WO2012028826A1
WO2012028826A1 PCT/FR2011/051994 FR2011051994W WO2012028826A1 WO 2012028826 A1 WO2012028826 A1 WO 2012028826A1 FR 2011051994 W FR2011051994 W FR 2011051994W WO 2012028826 A1 WO2012028826 A1 WO 2012028826A1
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nucleus
eps
pearl
hyd
oyster
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Application number
PCT/FR2011/051994
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English (en)
Inventor
Jean Guezennec
Yannick Gueguen
Evelyne Bachere
Achraf Kouzayha
Christelle Simon-Colin
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Ifremer (Institut Français De Recherche Pour L'exploitation De La Mer)
Service De La Perliculture
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    • A01K61/57—Pearl seeds
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    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Definitions

  • the present invention relates to the field of coating of cores in the context of pearl farming (production of pearls by pearl oysters).
  • the subject of the present invention is therefore a nucleus coated with a film exhibiting cicatrizing and antibacterial properties, and making it possible to reduce the mortality resulting from the insertion of said nucleus into the recipient pearl oyster and the phenomenon of nucleus rejection.
  • Pearl culture is a human activity consisting of the cultivation, in the wild, of pearl oysters Pinctada sp for the production of cultured pearls.
  • the first step is the collection and rearing of pearl oysters, which will serve as either donor oyster or recipient oyster.
  • the graft consists of the surgical procedure in which the graft, a portion of the donor oyster coat epithelium (approximately 4 mm 2 ) is inserted into the recipient's oyster pearl pocket, in combination with a mother of pearl ball, the nucleus. Once inserted into the recipient oyster, the epithelial border of the graft multiplies and lines the pearl pocket to give the pearl sac that encompasses the nucleus.
  • the pearl bag deposits layers of mother-of-pearl around the nucleus, resulting in the production of the pearl (Montagnani et al., 2009).
  • the patent application JP05219856 describes the insertion in the recipient oyster, during the step of grafting and in parallel with the nucleus or with the nucleus, a solid material containing on its surface a polymer associated with an antibiotic.
  • Japanese patent applications JP02308869 and JP63215609 claim the use of a polymer-coated nucleus to improve the quality of the pearls obtained, by increasing the homogeneity of the surface of the nucleus, and to reduce the phenomena of rejection and mortality, avoiding for example the colonization of the nucleus by various parasites.
  • Japanese Patent Application JP02174621 discloses the use of a natural polymer for coating the nucleus, combined with an antifungal agent, for the purpose of limiting contamination during grafting.
  • US Pat. No. 6,514,614 describes the coating of the nucleus by a water-soluble polymer, associated with a substance having an antibacterial activity, said polymer being partially dissolved by seawater (the dissolution rate being greater than 25%) to allow an effective decrease friction and resistance to insertion of said nucleus.
  • Japanese patent application JP03183424 describes a system for coating the nucleus with a water-soluble polymer (or any other compound allowing a delayed administration), allowing the administration at a controlled rate of an antibiotic associated with said polymer.
  • the subject of the invention is a nucleus coated with a film comprising one or more exopolysaccharides (EPS).
  • EPS exopolysaccharides
  • the EPSs are produced by gram-positive or gram-negative bacteria, archeae or algae.
  • the film further comprises one or more bioactive molecules.
  • said bioactive molecules are chosen from one or more bactericidal or bacteriostatic agents, one or more cicatrizing agents and / or one or more anti-inflammatory agents.
  • the EPSs are chosen from among HE 800, EPS 721, M0245, GG1, HYD 657, HYD 1644, HYD 1545, GY 785, MS 907, ST 716, HYD 721, GY 772, HYD. 750, GY 768, GY 788, BI746, GY 786, GY 685, GY 686, ST 719, HYD 1574, HYD 1579, HYD 1582, HYD 1584, ST 708, ST 722, ST 342, ST 349, HYD 1625, and HYD 1666, preferably MO 245, HE 800, GG1, HYD 721 and ST 716.
  • the bactericidal or bacteriostatic agent or agents are chosen from antimicrobial peptides (PAM).
  • said PAM is chosen from tachyplesin or oyster defensins Cg-Defs.
  • the subject of the invention is also a process for obtaining the nucleus as described above, said process comprising a step of embedding the nucleus by the EPSs by immersion in a solution containing 0.1 to 10% by weight of EPS by relative to the volume of the solution.
  • the method comprises:
  • the process for obtaining a film-coated nucleus comprising one or more EPSs in combination with one or more bactericidal or bacteriostatic agents comprises a step of coating the nucleus with the EPS and the agents.
  • bactericidal or bacteriostatic by immersion in a solution comprising 0.05 to 10% by weight of EPS relative to the volume of the solution and 1 to 10 CMI of said bactericidal or bacteriostatic agents.
  • the invention also relates to a pearl oyster comprising a nucleus as described above.
  • the invention also relates to the use of the nucleus as described above or the method as described above to reduce the failure of transplantation of a recipient oyster by a nucleus, said failure consisting of a mortality or rejection of the nucleus by the recipient pearl oyster.
  • the subject of the invention is also a process for grafting a recipient pearl oyster comprising inserting into the pearling pocket of the recipient pearl oyster of a graft, corresponding to the epithelium of the mantle of the donor oyster, in combination with a nucleus as described above, or with a nucleus obtained by a method as described above.
  • the invention also relates to a method of manufacturing a pearl culture pearl, comprising the grafting method as described above.
  • the subject of the invention is also a method for obtaining a pearl, comprising the grafting of a nucleus according to the invention, or a nucleus obtained by a method according to the invention, in combination with a portion of the mantle epithelium of the donor oyster in the pearl pocket of the recipient oyster.
  • the invention also relates to a bead obtained by the process for obtaining a bead as described above, or comprising the nucleus according to the invention or a nucleus obtained by a process according to the invention, or comprising a film comprising one or several exopolysaccharides (EPS) produced by gram positive or gram negative bacteria, archeae or algae under one or more thicknesses of nacre.
  • EPS exopolysaccharides
  • the present invention also relates to a method for improving the quality of the pearl and / or reducing the failure of transplantation of a recipient oyster by a nucleus, said failure corresponding to a mortality or a rejection of the nucleus by the recipient pearl oyster, and said method comprising transplanting the recipient oyster by a nucleus according to the invention or by a nucleus obtained by the method for obtaining a nucleus according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of the nucleus according to the invention or of the nucleus obtained by the process for obtaining a nucleus according to the invention for reducing the failure of transplantation of a recipient oyster by a nucleus, said failure consisting of mortality or rejection of the nucleus by the recipient pearl oyster and / or to improve the quality of the pearl obtained.
  • Nucleus element, generally spherical, formed of a natural compound (for example in mother-of-Mississippi mussel, Amblema plicata) or synthetic (for example Bironite) introduced into the recipient oyster during the graft stage, and serving as a support for the nacre deposit by the recipient pearl oyster. Said nucleus may be coated with particular substances to improve the quality of the pearl obtained.
  • Periodicculture human activity for the production of cultured pearl pearl oysters, generally of the genus Pinctada sp.
  • Bactericidal agent substance having a bactericidal action, ie causing the death of bacteria.
  • Bacteriostatic agent means a substance having a bacteriostatic action, i.e. blocking the growth, growth and / or division of bacteria.
  • MIC minimum inhibitory concentration. It corresponds to the minimum concentration from which an agent inhibits the visible growth of a microorganism after incubation on the night.
  • the methods for determining the MIC of an agent are well known in the state of the art.
  • Healing refers to an agent capable of promoting healing, or healing of a wound, specifically an open wound, such as an incision.
  • “Mother-of-pearl” a biomineralized structure composed of aragonite crystals (constituting nearly 90% of mother-of-pearl) and conchyoline.
  • Aragonite is a chemical compound of formula CaC0 3 + Sr traces; Pb; Zn.
  • pearl production results from the deposit of nacre on a nucleus inserted into the recipient oyster during the grafting stage.
  • the nucleus transplantation stage generally has a high failure rate, due to poor healing of the recipient oyster at the incision made during grafting or bacterial contamination.
  • the cores used in pearl culture are increasingly covered with a coating to reduce the failure of the graft stage.
  • the present invention therefore relates to a nucleus coated or coated with a film comprising one or more exopolysaccharides (EPS).
  • EPS exopolysaccharides
  • the EPS film would have healing properties, to accelerate the healing of wounds induced by the grafting step, and thus reduce the mortality of the recipient oyster leading to failure of the graft. It has been shown that certain bacteria have the ability to synthesize, under controlled conditions, exopolymers including exopolysaccharides (EPS), in response to conditions of nutritional imbalance.
  • Exopolysaccharides can be defined as macromolecules formed from the sequence of similar carbohydrates (commonly called sugars or dares). These exopolysaccharides can be produced on an industrial scale, and have, among other properties, adhesive properties (related to the function of these molecules in nature) and film-forming properties.
  • EPS can be produced by many microorganisms such as gram-positive or gram-negative bacteria, archaea, fungi, and some algae.
  • EPS are produced by gram-positive or gram-negative bacteria, archeae or algae.
  • EPS can be extracted from microorganism cultures by well-known physical or chemical extraction methods such as sonication, centrifugation, alkaline treatment, ethanol extraction, enzymatic extraction, etc.
  • the EPS can be chosen from those produced by marine organisms such as Bacillus, Halomonas, Planococcus, Enterobacter, Alteromonas, Pseudoalteromonas, Rhodococcus, Zoogloea, Cyanobacteria, Vibrio, as described in Satpute et al. . (Biotechnology Advances 2010, 28: 436-450). If the taxonomy were to be modified, one skilled in the art could adapt the taxonomy changes to deduce the EPS that can be used in the invention.
  • EPS can be obtained by fermentation of bacteria from deep hydrothermal ecosystems. More particularly, these EPS are those synthesized under controlled conditions (nutritional imbalance generated by a high carbon / nitrogen ratio due to a carbohydrate enriched nutritional medium) during the fermentation of bacteria from deep hydrothermal ecosystems (see for example Guezennec, J. (2002) Deep Sea Hydrothermal Winds: A Novel Source of innovative Bacterial Exopolysaccharides of Biotechnological Interest Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 29: 204- According to one embodiment, the EPSs are chosen from the group comprising uncharged (or neutral) EPSs, such as, for example, GG1.
  • the EPSs are chosen from the group comprising charged EPSs, such as, for example, HE800 and MO245.
  • the EPSs may be selected from HE 800,
  • the EPSs are native.
  • the EPS can be chemically or physically modified (as for example by adding group (s) sulfate, acetate, lactate, succinate or pyruvate).
  • the EPS film is continuous around the nucleus.
  • the invention also relates to a nucleus coated with a film comprising one or more EPS and one or more bioactive molecules.
  • these bioactive molecules are bactericidal or bacteriostatic agents.
  • a bactericidal or bacteriostatic agent on the nucleus makes it possible to limit the occurrence of bacterial contaminations in the recipient oyster, which can lead to a rejection of the nucleus or to the death of the oyster.
  • these bioactive molecules are cicatrizing or anti-inflammatory agents such as collagen, fibrinogen, laminin, or growth factors.
  • the bactericidal or bacteriostatic agents are chosen from chemical antibiotics such as, for example, tetracycline, kanamycin, sulfamonomethoxyne ampicillin.
  • the bactericidal or bacteriostatic agents are chosen from antimicrobial peptides (PAM).
  • Antimicrobial peptides are innate immune effector molecules, conserved during evolution and widespread throughout the living kingdom.
  • PAMs are generally characterized by a high representativeness in cationic and hydrophobic amino acids. These molecules are most often amphiphilic essential for their interaction with bacterial membranes (Bulet et al., 2004).
  • PAMs kill microorganisms, either by permeabilizing their membrane by a detergent-like effect or by the formation of pores, by blocking the synthesis of peptidoglycan component of the bacterial wall, or by the inhibition of bacterial metabolic pathways (Brodgen et al., 2005).
  • PAM Compared to the generally used chemical antibiotics, PAM has the advantage of being completely biodegradable. They appear as good candidates in substitution for conventional chemical antibiotics, because of their biological properties. Indeed, they have a broad spectrum of antimicrobial activity, little specificity, different modes of action and a safety on the environment.
  • PAMs can be produced by chemical synthesis or expression in bacterial or yeast recombinant (cloning, expression, purification) systems.
  • PAM may belong to the family of alpha-helical linear PAMs, to the family of PAMs with overrepresentation in one or more amino acids, to the family of hairpin PAMs (beta Hairpin) with 1 or 2 disulfide bridges, or cyclic PAM and alpha helix families with 3 or more disulfide bridges (Bulet et al., Immunological reviews, 2004, 198: 169-184; Brogden, Nature Review Microbiology 2005, 3: 238-250).
  • linear alpha-helical PAM examples include, but are not limited to, cecropin, stomoxyne, ponericin, spinigerin, oxyopinin, cupienin, clavanin, styeline, pardaxine, misgurine, pleurocidin, parasin, oncorhyncin, moronecidin, magainin, temporin, cathelicidin and indolicidin.
  • PAM enriched in one or more amino acids, proline, arginine, glycine, or tryptophan include, but are not limited to, bactenicins, PR-39, abaecins, apidaecins, drosocine, pyrrhocoricins, Cg-Prp, prophenine, and indolicin. .
  • hairpin PAM containing 2 to 4 cysteines include, but are not limited to, tachyplesin, protectrin, thanatin, androctonine, gomesin, polyphemusin, hepcidin, brevinine, esculentin, tigerinin and bactenecin.
  • cyclic PAMs containing 6 or more cysteine or open-cycle residues include, but are not limited to, defensins (vertebrates, invertebrates, or plants), proin, heliomicin, drosomycin, ASABF, pBD, penaeidines, ALF and big-defensins.
  • defensins verbrates, invertebrates, or plants
  • heliomicin heliomicin
  • drosomycin ASABF
  • pBD penaeidines
  • ALF big-defensins
  • invertebrate defensins are defenses of oyster Cg-Defs or defensins of MGD mussels.
  • the PAM is chosen from tachyplesin and oyster defensins Cg-Defs.
  • the PAMs are synthesized by chemical synthesis. According to another embodiment of the invention, the PAMs are synthesized by biological synthesis in a bacterial or fungal recombinant system and preferably in a yeast system.
  • the mortality or rejection of nucleus following transplantation of the recipient oyster generally occurs during the 45 days following the operation, mainly during the first 3 weeks following the intervention.
  • the PAMs are associated with said EPS film stably.
  • the film comprising EPS and optionally bacteriostatic or bactericidal agents is resistant to washing with seawater and is stable for more than 3 weeks, preferably more than one month at varying temperatures. between 4 and 30 ° C.
  • the film including EPS and optionally, bacteriostatic or bactericidal agents do not dissolve when placed in contact with seawater (Example 1) for at least 3 weeks.
  • the film comprising EPS and optionally bacteriostatic or bactericidal agents retains a bacterial growth inhibition activity for more than 3 weeks, preferably more than 1 month, at a temperature of 37. ° C.
  • the association between the EPS film and the bacteriostatic or bactericidal agent (s) such as PAMs results from an adsorption phenomenon or a chemical reaction between the EPSs and said agents.
  • the present invention also relates to a process for coating the pearl culture nucleus with a film comprising one or more exopolysaccharides of bacterial origin.
  • said method comprises a first step of immersing the nucleus in an aqueous solution of EPS, preferably an EPS solution in osmosis water.
  • said aqueous EPS solution has an EPS concentration of 0.1 to 10% w / v, more preferably 0.5 to 5, still more preferably 1% by weight of EPS per volume of the aqueous solution.
  • said first step of immersing the nucleus in a solution containing one or more EPS is carried out at a constant temperature, preferably at room temperature (ie from 15 to 25 ° C.), more preferably approximately 20 ° C.
  • said first step of immersing the nucleus in a solution containing one or more EPS is preferably carried out for 1 to 60 minutes, more preferably for 5 to 20 minutes, more preferably 10 minutes.
  • said first step of immersing the nucleus in a solution containing one or more EPS is carried out at a constant temperature, preferably from 1 to 10 ° C, more preferably about 4 ° C.
  • said first step of immersing the material in a solution containing one or more EPS is carried out preferably for 1 to 3 hours, more preferably for about 2 hours.
  • the coated nucleus is then dried under vacuum.
  • the first step described above is followed by a second step comprising immersing the nucleus in a solution comprising one or more bactericidal or bacteriostatic agents at a concentration. from 1 to 10 CMI, preferably 10 CMI.
  • the bactericidal or bacteriostatic agent is in solution in a biologically acceptable polar solvent such as water (for example osmosis water), ethanol, trifluoroethanol (CF 3 CH 2 OH, TFE) or their mixture, for example water / TFE, preferably trifluoroethanol (CF 3 CH 2 OH) or osmosis water.
  • a biologically acceptable polar solvent such as water (for example osmosis water), ethanol, trifluoroethanol (CF 3 CH 2 OH, TFE) or their mixture, for example water / TFE, preferably trifluoroethanol (CF 3 CH 2 OH) or osmosis water.
  • the second nucleus immersion step is carried out at a constant temperature, preferably from 1 to 10 ° C, more preferably about 4 ° C.
  • said second nucleus immersion step is preferably carried out for 24 to 120 hours, more preferably for 48 to 96 hours, even more preferably 72 hours.
  • said second nucleus immersion step is carried out for 12 to 48 hours, preferably 12 to 24 hours, and more preferably for 24 hours.
  • the second nucleus immersion step is carried out at a constant temperature, preferably at ambient temperature (from 20 to 30 ° C.), more preferably to about 25 ° C.
  • said second nucleus immersion step is preferably carried out for 30 minutes to 3 hours, preferably for 1 to 2 hours, even more preferably for about 1:30.
  • the coated nucleus is then dried under vacuum.
  • said method optionally comprises a step of rinsing the nucleus between the first immersion step and the second immersion stage.
  • the nucleus is rinsed with a volume of 10 to 1000 ml of distilled water, preferably 100 to 300 ml of distilled water, more preferably about 200 ml of distilled water.
  • the invention also relates to a process for obtaining a nucleus coated with a film comprising one or more EPS and one or more bacteriostatic or bactericidal agents, said process comprising a single step of immersing the nucleus in a solution comprising EPS and bacteriostatic or bactericidal agents.
  • the EPS are present in the solution at a concentration of 0.05 to 10% by weight relative to the total volume of the solution, preferably from 0.1 to 5%, more preferably at a concentration of 1%.
  • the bactericidal or bacteriostatic agents are present in the solution at a concentration of 1 to 10 CMI.
  • this immersion step is carried out at a constant temperature of 1 to 10 ° C, preferably 4 ° C, and for 12 to 128 hours, preferably for 48 to 96 hours, and more preferably for 72 hours.
  • the coated nucleus according to the invention, or obtained according to a process according to the invention is stored at 4 ° C.
  • the coated core according to the invention, or obtained according to a process according to the invention is stored at ambient temperature.
  • the nucleus is of natural origin, more preferably said nucleus is in Mississippi mother-of-pearl belonging to the genus Amblema sp., Preferably Amblema plicata.
  • nucleus are those sold by Aming (Standard Aming) or by Poe Import.
  • said nucleus has a diameter of 1 to
  • said nucleus has a diameter of 2 to
  • the invention also relates to an oyster comprising a nucleus as described above or obtained by a method as described above.
  • the oyster belongs to the genus Pinctada sp., More preferably to the species Pinctada fucata, Pinctada maxima, Pinctada margaritifera.
  • the subject of the invention is also a process for grafting a recipient pearl oyster comprising inserting into the pearling pocket of the recipient pearl oyster of a graft, corresponding to the epithelium of the mantle of the donor oyster, in combination with a nucleus as described above, or obtained by a method as described above.
  • the grafting method comprises (i) manually opening the recipient pearl oyster, (ii) making an incision in the tissues of the recipient pearl oyster to access the pearling bag and allow, in a third step (iii) the insertion into the pearling pocket of the recipient pearl oyster of a graft, corresponding to a portion of the donor oyster coat epithelium (about 4 mm) 2 ), in combination with a core coated with an EPS film as described above.
  • the invention also relates to a method of manufacturing a pearl culture pearl, comprising the grafting method as described above.
  • the present invention also relates to a process for obtaining a bead comprising the use of the coated nucleus as described above, or obtained according to a coating process as described above.
  • the process for obtaining a pearl comprises the grafting of a nucleus according to the invention in the pearling pocket of a recipient oyster, in combination with a part of the epithelium of the a donor oyster.
  • said process for producing or obtaining a pearl comprises a first step comprising the collection and rearing pearl oysters, preferably belonging to the genera and species mentioned above, to obtain donor pearl oysters and recipient pearl oysters.
  • the donor and recipient pearl oysters are then cleaned to remove any parasites.
  • said production method further comprises, following the grafting, a step of culturing the recipient pearl oysters, preferably for a period of 10 to 24 months, preferably from 12 to 20 months, even more preferably from 16 to 18 months.
  • the epithelial border of the graft multiplies and lines the pearl pocket, to give a perlier bag encompassing the nucleus, and will deposit layers of mother of pearl around the nucleus, resulting in the production of a pearl.
  • the invention also relates to a bead obtained by the process for obtaining a bead as described above.
  • the invention also relates to a bead comprising a core coated according to the invention, or a nucleus obtained by a process according to the invention.
  • the present invention also relates to a pearl whose core is covered with a film of EPS, preferably EPS produced by gram-positive or gram-negative bacteria, archeae or algae, optionally in combination with one or more bioactive molecules. .
  • EPS preferably EPS produced by gram-positive or gram-negative bacteria, archeae or algae
  • the present invention also relates to a bead comprising a film of EPS, preferably EPS produced by gram-positive or gram-negative bacteria, archeae or algae, optionally in association with one or more bioactive molecules under one or more thicknesses of nacre.
  • EPS preferably EPS produced by gram-positive or gram-negative bacteria, archeae or algae
  • the bead has a size, preferably a diameter of 2 to 20 mm, preferably 5 to 15 mm, even more preferably 6.8 to 10 mm.
  • the presence of a film around the nucleus as described in the invention has several advantages: Improvement of the homogeneity of the surface of the nucleus, and / or
  • the present invention also relates to a method for improving the homogeneity of a nucleus, comprising coating said nucleus with a film as described in the present invention.
  • the present invention also relates to a method for improving the quality of the pearl obtained during the grafting of a recipient oyster, comprising the use of a nucleus according to the invention.
  • the use of the nucleus according to the invention during the grafting step limits the appearance of surface defects on the bead.
  • the present invention also relates to a method of reducing the failure of transplantation of a recipient oyster by a nucleus, said failure corresponding to a mortality or rejection of the nucleus by the recipient pearl oyster, and said method comprising the transplant of the recipient oyster with a nucleus according to the invention or obtained by the process for obtaining a nucleus according to the invention.
  • the present invention also relates to a method of inhibiting the rejection of the nucleus during the graft, said method comprising the use of a coated nucleus according to the invention during the grafting.
  • the present invention further relates to a method of reducing the mortality of recipient oysters following the grafting step, comprising using a coated nucleus according to the invention during grafting.
  • the mortality prevented by the method of the invention is due to an infection of the incision made during the graft.
  • the present invention also relates to the use of the nucleus according to the invention or obtained by the process for obtaining a nucleus according to the invention for reducing the failure of transplantation of a recipient oyster with a nucleus, said failure consisting in mortality or rejection of the nucleus by the recipient pearl oyster and / or to improve the quality of the pearl obtained.
  • the present invention furthermore relates to a method of accelerating the healing of the incision performed during the graft, comprising the use of a coated nucleus according to the invention.
  • the present invention also relates to a method for inhibiting microbial contamination phenomena occurring during grafting, said method comprising the use of a coated nucleus according to the invention during grafting.
  • PAM as bacteriostatic or bactericidal agent allows a better respect of the environment compared to the use of conventional chemical antibiotics, and health, the muscle of pearl oyster can be consumed raw.
  • Figure 1 is an assembly of photos obtained by scanning microscopy, uncoated nuclei (a) and coated (b, c and d). The marks correspond to voluntary tearing to reinforce the presence of the film.
  • Figure 2 is an assembly of Petri dishes after culturing with bacterial solutions incubated with nuclei.
  • nuclei (a) nucleus uncoated or coated with EPS alone, (b) nucleus coated with a combination EPS / PAM without rinsing, (c) core coated with an EPS / PAM combination and rinsed with seawater or water MilliQ.
  • Example 1 presence of EPS film Nuclei were coated with a film comprising EPS M0245 and optionally tachyplesin. These nuclei were obtained by a two-step process:
  • Figure 1 obtained by scanning microscopy unambiguously shows the presence of a film.
  • Figures b and c show the presence of the film after a tear and Figure d shows that the film remains stable after washing with water and / or TFE.
  • Standard diameter nuclei were used for studies on the influence of surface pretreatment by biopolymers derived from bacterial fermentation.
  • the nuclei are coated with a film comprising EPS M0245 alone or in combination with tachyplesin.
  • nuclei are obtained by a one-step process: immersion of the nuclei in a solution comprising 0.1% of M0245 and optionally 70 mg / l (ie 10 CMI) of tachyplesin for 48 h at 4 ° C.
  • nuclei were rinsed with 200 ml of seawater or MilliQ water before being dried. All the nuclei were then dried under vacuum.
  • a classical bacterial growth inhibition test was carried out on these nuclei: the nuclei were brought into contact with a bacterial solution in the exponential phase of growth of the strain Vibrio (Vibrio Pmar02-149) isolated from Pinctada margaritifera during a transplant in Tahiti for 18h at 30 ° C. The bacterial growth is then measured spectrophotometrically at an optical density of 630 nm. The bacterial solution is then spread on petri dish (Zobell Agar medium) and the colonies developed are then counted. Figure 2a shows that the presence of uncoated nuclei does not inhibit bacterial growth. Similar results were obtained with nuclei coated only with a film comprising EPS.
  • Figure 2b shows that the presence of film-coated nuclei comprising an EPS + PAM combination inhibits bacterial growth.
  • FIG. 2c shows that the antibacterial activity of the nuclei coated with a film comprising an EPS + PAM combination is preserved after washing the nuclei.
  • the antimicrobial activity of the nuclei is measured by the percentage inhibition of bacterial growth after 18 hours of contact relative to the control (bacterial culture without nuclei). The percentages of inhibition measured are shown in the table below.
  • EPS-coated nuclei in combination with PAM strongly inhibited bacterial growth (97 and 95% for M0245 and GG1 EPS respectively).
  • Uncoated nuclei or coated with EPS M0245 and a PAM
  • a film according to the invention comprising an EPS and a PAM, makes it possible to reduce the rejection of the nucleus by more than 20%.

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Abstract

La présente invention concerne un nucléus revêtu d'un film, comprenant un ou plusieurs exopolysaccharides (EPS) et éventuellement une ou plusieurs molécules bioactives telles que des agents bactéricides ou bactériostatiques, des agents cicatrisants et/ou des agents anti-inflammatoires et un procédé d'obtention dudit nucléus, afin d'inhiber le rejet de greffe par l'huître perlière.

Description

NUCLÉUS ENROBÉ D'UN REVÊTEMENT FILMOGÈNE AUX PROPRIÉTÉS ANTIBACTÉRIENNES ET CICATRISANTES ET PROCÉDÉ D'OBTENTION
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine de l'enrobage de nucléus dans le cadre de la perliculture (production de perles par des huîtres perlières). La présente invention a donc pour objet un nucléus revêtu d'un film présentant des propriétés cicatrisantes et antibactériennes, et permettant de réduire la mortalité consécutive à l'insertion dudit nucléus dans l'huître perlière receveuse et le phénomène de rejet de nucléus.
ÉTAT TECHNIQUE ANTÉRIEUR À L'INVENTION
La perliculture est une activité humaine consistant en la culture, en milieu naturel, d'huîtres perlières Pinctada sp en vue de la production de perles de culture. La première étape concerne la collecte et l'élevage des huîtres perlières qui serviront soit d'huître donneuse soit d'huître receveuse. La greffe consiste en l'opération chirurgicale au cours de laquelle le greffon, une partie de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse (environ 4 mm2) est inséré dans la poche perlière de l'huître receveuse, en combinaison avec une bille de nacre, le nucléus. Une fois insérée dans l'huître receveuse, la bordure épithéliale du greffon se multiplie et tapisse la poche perlière pour donner le sac perlier qui englobe le nucléus. Ledit sac perlier dépose des couches de nacre autour du nucléus, résultant en la production de la perle (Montagnani et al., 2009).
Des mortalités et des rejets de nucléus se produisent pendant environ 45 jours après la greffe, à des taux variables. Ces phénomènes, qui touchent de 40 à 50% des huîtres dans les trois semaines suivant l'intervention, semblent résulter de pathologies infectieuses, ou d'une pratique de greffe inadaptée. Le développement d'une réaction inflammatoire suite à l'insertion du nucléus et la contamination par des bactéries pathogènes, combinées à l'absence de cicatrisation rapide des tissus incisés lors de la greffe sont probablement les causes principales de rejet de nucléus (Cochennec et al., 2010).
Il existe donc un besoin de procédés ayant pour résultat la diminution du taux d'échec des opérations de greffe, se traduisant notamment par la diminution de la mortalité et du rejet de nucléus.
La demande de brevet JP05219856 décrit l'insertion dans l'huître receveuse, pendant l'étape de greffe et en parallèle du nucléus ou au moyen du nucléus, d'un matériau solide contenant à sa surface un polymère associé à un antibiotique.
Les demandes de brevet japonais JP02308869 et JP63215609 revendiquent l'utilisation d'un nucléus recouvert d'un polymère pour améliorer notamment la qualité des perles obtenues, en augmentant l'homogénéité de la surface du nucléus, et pour diminuer les phénomènes de rejet et de mortalité, en évitant par exemple la colonisation du nucléus par divers parasites.
La demande de brevet japonais JP02174621 décrit l'utilisation d'un polymère naturel pour enrober le nucléus, associé à un agent antifongique, dans le but de limiter les contaminations lors de la greffe.
Le brevet US6514614 décrit l'enrobage du nucléus par un polymère hydrosoluble, associé à une substance ayant une activité antibactérienne, ledit polymère étant partiellement dissous par l'eau de mer (le taux de dissolution étant supérieur à 25%) pour permettre une diminution effective des frictions et de la résistance à l'insertion dudit nucléus.
Enfin, la demande de brevet japonais JP03183424 décrit un système d'enrobage du nucléus par un polymère hydrosoluble (ou par tout autre composé permettant une administration différée), permettant l'administration à un taux contrôlé d'un antibiotique associé audit polymère.
Cependant, les publications citées ci-dessus ne résolvent pas le problème de la cicatrisation de l'incision pratiquée durant la greffe. D'autre part, l'utilisation d'antibiotiques pose un problème environnemental, du fait de leur biodégradabilité incomplète, et de santé publique par le biais du développement de résistances bactériennes. De façon surprenante, le déposant a remarqué que l'enrobage du nucléus par un film d'EPS (exopolysaccharides) permet de réduire le taux d'échec des opérations de greffe. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, l'enrobage du nucléus par un film d'EPS permettrait d'accélérer la cicatrisation de l'huître receveuse. De plus, l'association dudit film d'EPS avec des agents bactéricides ou bactériostatiques, comme par exemple les peptides antimicrobiens (PAM), permet de diminuer l'occurrence de contaminations microbiennes. La présence des EPS seuls ou en combinaison avec un agent bactéricide ou bactériostatique permet ainsi de diminuer les échecs de l'étape de greffe, et notamment de diminuer la mortalité des huîtres receveuses et le rejet de nucléus par lesdites huîtres.
RÉSUMÉ
L'invention a pour objet un nucléus revêtu d'un film comprenant un ou plusieurs exopolysaccharides (EPS).
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS sont produits par des bactéries gram positive ou gram négative, des archeae ou des algues.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le film comprend en outre une ou plusieurs molécules bioactives.
Selon un mode de réalisation de l'invention, lesdites molécules bioactives sont choisies parmi un ou plusieurs agents bactéricides ou bactériostatiques, un ou plusieurs agents cicatrisants et/ou un ou plusieurs agents anti-inflammatoires.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS sont choisis parmi HE 800, EPS 721, M0245, GGl, HYD 657, HYD 1644, HYD 1545, GY 785, MS 907, ST 716, HYD 721, GY 772, HYD 750, GY 768, GY 788, BI746, GY 786, GY 685, GY 686, ST 719, HYD 1574, HYD 1579, HYD 1582, HYD 1584, ST 708, ST 722, ST 342, ST 349, HYD 1625, et HYD 1666, de préférence MO 245, HE 800, GGl, HYD 721 et ST 716. Selon un mode de réalisation de l'invention, le ou les agents bactéricides ou bactériostatiques sont choisis parmi les peptides antimicrobiens (PAM).
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit PAM est choisi parmi la tachyplésine ou les défensines d' huître Cg-Defs. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention du nucléus tel que décrit ci- dessus, ledit procédé comprenant une étape d'enrobage du nucléus par les EPS par immersion dans une solution contenant 0.1 à 10 % en poids d'EPS par rapport au volume de la solution.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé comprend :
une première étape telle que décrite ci-dessus, et
une seconde étape d'association d'un ou plusieurs agents bactéricides ou bactériostatiques avec le film d'EPS préalablement formé, par immersion dans une solution comprenant 1 à 10 CMI dudit ou desdits agents bactéricides ou bactériostatiques.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé d'obtention d'un nucléus revêtu d'un film comprenant un ou plusieurs EPS en combinaison avec un ou plusieurs agents bactéricides ou bactériostatiques comprend une étape d'enrobage du nucléus par les EPS et les agents bactéricides ou bactériostatiques, par immersion dans une solution comprenant 0.05 à 10 % en poids d'EPS par rapport au volume de la solution et 1 à 10 CMI dudit ou desdits agents bactéricides ou bactériostatiques.
L'invention a également pour objet une huître perlière comprenant un nucléus tel que décrit ci-dessus.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation du nucléus tel que décrit précédemment ou du procédé tel que décrit précédemment pour réduire l'échec de greffe d'une huître receveuse par un nucléus, ledit échec consistant en une mortalité ou un rejet du nucléus par l'huître perlière receveuse.
L'invention a également pour objet un procédé de greffe d'une huître perlière receveuse comprenant l'insertion dans la poche perlière de l'huître perlière receveuse d'un greffon, correspondant à de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse, en combinaison avec un nucléus tel que décrit ci-dessus, ou avec un nucléus obtenu par un procédé tel que décrit ci-dessus.
L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'une perle de perliculture, comprenant le procédé de greffe tel que décrit ci-dessus.
L'invention a également pour objet un procédé d'obtention de perle, comprenant la greffe d'un nucléus selon l'invention, ou d'un nucléus obtenu par un procédé selon l'invention, en combinaison avec une partie de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse dans la poche perlière de l'huître receveuse.
L'invention concerne également une perle obtenue par le procédé d'obtention de perle tel que décrit ci-dessus, ou comprenant le nucléus selon l'invention ou un nucléus obtenu par un procédé selon l'invention, ou comprenant un film comprenant un ou plusieurs exopolysaccharides (EPS) produits par des bactéries gram positive ou gram négative, des archeae ou des algues sous une ou plusieurs épaisseurs de nacre.
La présente invention concerne également un procédé d'amélioration de la qualité de la perle et/ou de réduction de l'échec de greffe d'une huître receveuse par un nucléus, ledit échec correspondant à une mortalité ou à un rejet du nucleus par l'huître perlière receveuse, et ledit procédé comprenant la greffe de l'huître receveuse par un nucléus selon l'invention ou par un nucléus obtenu par le procédé d'obtention d'un nucléus selon l'invention.
La présente invention concerne également l'utilisation du nucléus selon l'invention ou du nucléus obtenu par le procédé d'obtention d'un nucléus selon l'invention pour réduire l'échec de greffe d'une huître receveuse par un nucléus, ledit échec consistant en une mortalité ou un rejet du nucléus par l'huître perlière receveuse et/ou pour améliorer la qualité de la perle obtenue.
DÉFINITIONS
Dans la présente invention, les termes suivants ont la signification suivante :
« Nucléus » : élément, généralement sphérique, formé d'un composé naturel (par exemple en nacre de moule du Mississipi, Amblema plicata) ou synthétique (par exemple en Bironite) introduit dans l'huître receveuse lors de l'étape de greffe, et servant de support au dépôt de nacre par l'huître perlière receveuse. Ledit nucléus peut-être enrobé de substances particulières pour améliorer la qualité de la perle obtenue.
« Perliculture » : activité humaine ayant pour but la production de perle de cultures par des huîtres perlières, appartenant généralement du genre Pinctada sp. « Agent bactéricide » : substance ayant une action bactéricide, i.e. entraînant la mort des bactéries.
« Agent bactériostatique » : substance ayant une action bactériostatique, i.e. bloquant le développement, la croissance et/ou la division des bactéries.
« CMI » : concentration minimale inhibitrice. Elle correspond à la concentration minimale à partir de laquelle un agent inhibe la croissance visible d'un microorganisme après incubation sur la nuit. Les méthodes de détermination de la CMI d'un agent sont bien connues dans l'état de l'art.
« Cicatrisant » : se dit d'un agent capable de favoriser la guérison, ou cicatrisation d'une blessure, plus précisément d'une blessure ouverte, telle une incision.
« Environ » : placé devant un élément numérique, signifie plus ou moins 10% de cet élément numérique.
« Nacre » : structure biominéralisée formée de cristaux d'aragonite (constituant près de 90% de la nacre) et de conchyoline. L'aragonite est un composé chimique de formule CaC03 + traces de Sr ; Pb ; Zn.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE
En perliculture, la production de la perle résulte du dépôt de nacre sur un nucléus inséré dans l'huître receveuse lors de l'étape de greffe. L'étape de greffe du nucléus présente généralement un taux d'échec élevé, du fait d'une faible cicatrisation de l'huître receveuse au niveau de l'incision pratiquée lors de la greffe ou de contaminations bactériennes. Ainsi, les nucléus utilisés en perliculture sont de plus en plus souvent recouverts d'un revêtement permettant de diminuer l'échec de l'étape de greffe.
La présente invention concerne donc un nucléus revêtu ou enrobé d'un film comprenant un ou plusieurs exopolysaccharides (EPS).
Le film d'EPS présenterait des propriétés cicatrisantes, permettant d'accélérer la cicatrisation des blessures induites par l'étape de greffe, et donc de réduire la mortalité de l'huître receveuse conduisant à l'échec de la greffe. Il a été démontré que certaines bactéries ont la capacité de synthétiser, dans des conditions contrôlées, des exopolymères dont les exopolysaccharides (EPS), en réponse à des conditions de déséquilibre nutritionnel. Les exopolysaccharides peuvent être définis comme des macromolécules formées de l'enchaînement de glucides similaires (appelés couramment sucres ou oses). Ces exopolysaccharides peuvent être produits à l'échelle industrielle, et possèdent, entre autres propriétés, des propriétés adhésives (liées à la fonction de ces molécules dans la nature) et filmogènes.
Les EPS peuvent être produits par de nombreux microorganismes tels que des bactéries gram positive ou gram négative, des archeae, des champignons, et quelques algues. Avantageusement, les EPS sont produits par des bactéries gram positives ou gram négatives, des archeae ou des algues.
Les EPS peuvent être extraits à partir de cultures de microorganismes par des méthodes d'extraction physiques ou chimiques bien connues comme par exemple sonication, centrifugation, traitement alcalin, extraction à l'éthanol, extraction enzymatique...
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS peuvent être choisis parmi ceux produits par des organismes marins tels que Bacillus, Halomonas, Planococcus, Enterobacter, Alteromonas, Pseudoalteromonas, Rhodococcus, Zoogloea, Cyanobactéries, Vibrio, comme décrit dans Satpute et al. (Biotechnology Advances 2010, 28 :436-450). Si la taxonomie devait être modifiée, l'homme du métier pourrait adapter les modifications de taxonomie pour en déduire les EPS pouvant être utilisés dans l'invention.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS peuvent être obtenus par fermentation de bactéries issues d'écosystèmes hydrothermaux profonds. Plus particulièrement, ces EPS sont ceux synthétisés dans des conditions contrôlées (déséquilibre nutritionnel généré par un rapport Carbone/ Azote élevé dû à un milieu nutritionnel enrichi en carbohydrates) lors de la fermentation de bactéries issues d'écosystèmes hydrothermaux profonds (voir par exemple Guezennec, J. (2002). Deep- sea hydrothermal vents: A new source of innovative bacterial exopolysaccharides of biotechnological interest? Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 29: 204- Suivant un mode de réalisation, les EPS sont choisis dans le groupe comprenant les EPS non chargés (ou neutres), tels que par exemple GG1.
Suivant un mode de réalisation, les EPS sont choisis dans le groupe comprenant les EPS chargés, tels que par exemple HE800 et M0245.
Suivant un mode de réalisation, les EPS peuvent être choisis parmi HE 800,
EPS 721, M0245, GG1, HYD 657, HYD 1644, HYD 1545, GY 785, MS 907, ST 716, HYD 721, GY 772, HYD 750, GY 768, GY 788, BI746, GY 786, GY 685, GY 686, ST 719, HYD 1574, HYD 1579, HYD 1582, HYD 1584, ST 708, ST 722, ST 342, ST 349, HYD 1625, et HYD 1666, de préférence MO 245, HE 800, GG1, HYD 721 et ST 716.
Suivant un mode de réalisation, les EPS sont natifs. Suivant un autre mode de réalisation, les EPS peuvent être chimiquement ou physiquement modifiés (comme par exemple par ajout de groupement(s) sulfate, acétate, lactate, succinate ou pyruvate).
Selon un mode de réalisation de l'invention, le film d'EPS est continu autour du nucléus.
L'invention a également pour objet un nucléus revêtu d'un film comprenant un ou plusieurs EPS et une ou plusieurs molécules bioactives. Suivant un mode de réalisation, ces molécules bioactives sont des agents bactéricides ou bactériostatiques. En perliculture, l'ajout d'un agent bactéricide ou bactériostatique sur le nucléus permet de limiter l'occurrence de contaminations bactériennes chez l'huître receveuse, pouvant conduire à un rejet du nucléus ou à la mort de ladite huître.
Suivant un autre mode de réalisation, ces molécules bioactives sont des agents cicatrisants ou anti-inflammatoires tels que collagène, fibrinogène, laminine, ou facteurs de croissance. Suivant un mode de réalisation de l'invention, les agents bactéricides ou bactériostatiques sont choisis parmi les antibiotiques chimiques comme par exemple la tétracycline, kanamycine, sulfamonométhoxyne, ampicilline. Suivant un autre mode de réalisation de l'invention, les agents bactéricides ou bactériostatiques sont choisis parmi les peptides antimicrobiens (PAM).
Les peptides antimicrobiens (PAM) sont des molécules effectrices de l'immunité innée, conservées au cours de l'évolution et répandues dans tout le règne vivant. Une grande variété de PAMs a été identifiée au cours des dernières années, révélant une grande diversité en termes de structures, tailles et modes d'action. Les PAMs sont généralement caractérisés par une forte représentativité en acides aminés cationiques et hydrophobes. Ces molécules ont le plus souvent un caractère amphiphile essentiel pour leur interaction avec les membranes bactériennes (Bulet et al. 2004). Les PAMs tuent les microorganismes, soit en perméabilisant leur membrane par un effet de type détergent ou par la formation de pores, soit par le blocage de la synthèse de peptidoglycane composant la paroi bactérienne, soit encore par l'inhibition des voies métaboliques bactériennes (Brodgen et al., 2005).
Par rapport aux antibiotiques chimiques généralement utilisés, les PAM présentent l'avantage d'être totalement biodégradables. Ils apparaissent comme de bons candidats en substitution aux antibiotiques chimiques conventionnels, du fait de leurs propriétés biologiques. En effet, ils présentent un large spectre d'activité antimicrobienne, peu de spécificité, différents modes d'actions et une innocuité sur le milieu.
Les PAMs peuvent être produits par synthèse chimique ou par l'expression en système recombinant (clonage, expression, purification) bactérien ou levure.
Suivant un mode de réalisation de l'invention, les PAM peuvent appartenir à la famille des PAM linéaires à hélice alpha, à la famille des PAM présentant une surreprésentation en un ou plusieurs acides aminés, à la famille des PAM à épingles à cheveux (bêta Hairpin) avec 1 ou 2 ponts disulfures, ou à la famille des PAM cycliques à feuillet bêta et hélice alpha avec 3 ponts disulfure ou plus (Bulet et al., Immunological reviews, 2004, 198 : 169-184 ; Brogden, Nature Review Microbiology, 2005, 3 :238- 250). Des exemples de PAM linéaires à hélice alpha incluent, mais ne sont pas limités à, cécropine, stomoxyne, ponéricine, spinigérine, oxyopinine, cupiennine, clavanine, styeline, pardaxine, misgurine, pleurocidine, parasine, oncorhyncine, moronécidine, magainine, temporine, cathelicidine et indolicidine.
Des exemples de PAM enrichis en un ou plusieurs acides aminés, proline, arginine, glycine, ou tryptophane, incluent, mais ne sont pas limités aux bacténicines, PR-39, abaecines, apidaecines, drosocine, pyrrhocoricines, Cg-Prp, prophenine et indolicine.
Des exemples de PAM en épingles à cheveux contenant 2 à 4 cysteines incluent, mais ne sont pas limités à, tachyplesine, protégrine, thanatine, androctonine, gomesine, polyphemusine, hepcidine, brevinine, esculentine, tigerinine et bactenecine.
Des exemples de PAM cycliques contenant 6 résidus de cystéines ou plus ou à cycle ouvert incluent, mais ne sont pas limités à, défensines (de vertébrés, d'invertébrés ou de plantes), termicine, héliomicine, drosomycine, ASABF, pBD, pénaeidines, ALF et big-défensines. Des exemples de défensines d'invertébrés sont les défensines d'huitre Cg-Defs ou les défensines de moules MGD.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le PAM est choisi parmi la tachyplésine et les défensines d'huître Cg-Defs.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les PAM sont synthétisés par synthèse chimique. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les PAM sont synthétisés par synthèse biologique en système recombinant bactérien ou fongique et de préférence, en système levure.
La mortalité ou le rejet de nucléus consécutifs à la greffe de l'huître receveuse interviennent généralement durant les 45 jours suivant l'intervention, majoritairement pendant les 3 premières semaines suivant l'intervention.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les PAM sont associés avec ledit film d'EPS de façon stable.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le film comprenant des EPS et optionnellement des agents bactériostatiques ou bactéricides résiste au lavage par l'eau de mer et est stable pendant plus de 3 semaines, préférentiellement plus d'un mois à des températures variant entre 4 et 30°C. Ainsi, le film comprenant des EPS et optionnellement des agents bactériostatiques ou bactéricides ne se dissout pas lors de la mise en contact avec l'eau de mer (Exemple 1) et ce, pendant au moins 3 semaines.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le film comprenant des EPS et optionnellement des agents bactériostatiques ou bactéricides conserve une activité d'inhibition de la croissance bactérienne pendant plus de 3 semaines, de préférence plus de 1 mois, à une température de 37°C.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'association entre le film d'EPS et le ou les agents bactériostatiques ou bactéricides tels que les PAMs résulte d'un phénomène d'adsorption ou d'une réaction chimique entre les EPS et lesdits agents.
La présente invention concerne également un procédé de revêtement du nucléus de perliculture par un film comprenant un ou plusieurs exopolysaccharides d'origine bactérienne.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé comprend une première étape d'immersion du nucléus dans une solution aqueuse d'EPS, préférentiellement une solution d'EPS dans de l'eau osmosée. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ladite solution aqueuse d'EPS possède une concentration en EPS de 0.1 à 10 % poids/volume, plus préférentiellement de 0.5 à 5 , encore plus préférentiellement de 1 % en poids d'EPS par volume de la solution aqueuse.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite première étape d'immersion du nucléus dans une solution contenant un ou plusieurs EPS est réalisée à une température constante, préférentiellement à température ambiante (i.e. de 15 à 25 °C), plus préférentiellement environ 20 °C. Selon ce mode de réalisation de l'invention, ladite première étape d'immersion du nucléus dans une solution contenant un ou plusieurs EPS est réalisée préférentiellement pendant 1 à 60 minutes, plus préférentiellement pendant 5 à 20 minutes, encore plus préférentiellement 10 minutes.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ladite première étape d'immersion du nucléus dans une solution contenant un ou plusieurs EPS est réalisée à une température constante, préférentiellement de 1 à 10 °C, plus préférentiellement environ 4 °C. Selon ce mode de réalisation de l'invention, ladite première étape d'immersion du matériau dans une solution contenant un ou plusieurs EPS est réalisée préférentiellement pendant 1 à 3 heures, plus préférentiellement pendant environ 2 heures.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le nucléus enrobé est ensuite séché sous-vide.
Lorsque le film enrobant le nucléus comprend également un ou plusieurs agents bactéricides ou bactériostatiques, la première étape décrite ci-dessus est suivie d'une seconde étape comprenant l'immersion du nucléus dans une solution comprenant un ou plusieurs agents bactéricides ou bactériostatiques à une concentration de 1 à 10 CMI, de préférence de 10 CMI.
Selon l'invention, l'agent bactéricide ou bactériostatique est en solution dans un solvant polaire biologiquement acceptable tel que l'eau (par exemple l'eau osmosée), l'éthanol, le trifluoroéthanol (CF3CH2OH, TFE) ou leur mélange comme par exemple eau/TFE, de préférence le trifluoroéthanol (CF3CH2OH) ou l'eau osmosée.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la seconde étape d'immersion du nucléus est réalisée à une température constante, préférentiellement de 1 à 10 °C, plus préférentiellement environ 4 °C. Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite seconde étape d'immersion du nucléus est réalisée préférentiellement pendant 24 à 120 heures, plus préférentiellement pendant 48 à 96 heures, encore plus préférentiellement 72 heures. Selon un autre mode de réalisation, ladite seconde étape d'immersion du nucléus est réalisée pendant 12 à 48h, préférentiellement 12 à 24h, et plus préférentiellement pendant 24h.
Selon un second mode de réalisation de l'invention, la seconde étape d'immersion du nucléus est réalisée à une température constante, préférentiellement à température ambiante (de 20 à 30°C), plus préférentiellement à environ 25°C. Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite seconde étape d'immersion du nucléus est réalisée préférentiellement pendant 30 minutes à 3 heures, préférentiellement pendant 1 à 2 heures, encore plus préférentiellement pendant environ lh30.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le nucléus enrobé est ensuite séché sous-vide.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé comporte optionnellement une étape de rinçage du nucléus entre la première étape d'immersion et la seconde étape d'immersion. Selon ce mode de réalisation, le nucléus est rincé par un volume de 10 à 1000 mL d'eau distillée, préférentiellement 100 à 300 mL d'eau distillée, plus préférentiellement environ 200 mL d'eau distillée. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'un nucléus revêtu d'un film comprenant un ou plusieurs EPS et un ou plusieurs agents bactériostatiques ou bactéricides, ledit procédé comprenant une seule étape d'immersion du nucléus dans une solution comprenant des EPS et des agents bactériostatiques ou bactéricides.
Selon un mode de réalisation, les EPS sont présents dans la solution à une concentration de 0.05 à 10 % en poids par rapport au volume total de la solution, préférentiellement de 0.1 à 5%, plus préférentiellement à une concentration de 1%.
Selon un mode de réalisation, les agents bactéricides ou bactériostatiques sont présents dans la solution à une concentration de 1 à 10 CMI.
Selon un mode de réalisation, cette étape d'immersion est réalisée à une température constante, de 1 à 10°C, préférentiellement 4°C, et pendant 12 à 128 h, préférentiellement pendant 48 à 96 heures, et plus préférentiellement pendant 72h.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le nucléus enrobé selon l'invention, ou obtenu selon un procédé selon l'invention, est conservé à 4°C. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le nucléus enrobé selon l'invention, ou obtenu selon un procédé selon l'invention, est conservé à température ambiante.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le nucléus est d'origine naturelle, plus préférentiellement ledit nucléus est en nacre de moule du Mississipi appartenant au genre Amblema sp., de préférence Amblema plicata. Des exemples de nucléus sont ceux vendus par Aming (Standard Aming) ou par Poe Import.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit nucléus a un diamètre de 1 à
20 mm, préférentiellement de 2 à 15 mm, plus préférentiellement de 2 à 4 mm, et encore plus préférentiellement de 2,1 à 3.5 mm.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit nucleus a un diamètre de 2 à
2.5 BU, de préférence d'environ 2.4 BU. Le BU est une unité de mesure, 1BU correspondant à 3,03 mm. L'invention a également pour objet une huître comprenant un nucléus tel que décrit ci-dessus ou obtenu par un procédé tel que décrit ci-dessus.
De préférence, l'huître appartient au genre Pinctada sp., plus préférentiellement, aux espèces Pinctada fucata, Pinctada maxima, Pinctada margaritifera.
L'invention a également pour objet un procédé de greffe d'une huître perlière receveuse comprenant l'insertion dans la poche perlière de l'huître perlière receveuse d'un greffon, correspondant à de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse, en combinaison avec un nucléus tel que décrit ci-dessus, ou obtenu par un procédé tel que décrit ci-dessus.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de greffe comprend (i) l'ouverture manuelle de l'huître perlière receveuse, (ii) la réalisation d'une incision dans les tissus de l'huître perlière receveuse pour accéder à la poche perlière et permettre, dans une troisième étape (iii) l'insertion dans la poche perlière de l'huître perlière receveuse d'un greffon, correspondant à une partie de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse (environ 4 mm2), en combinaison avec un nucléus enrobé d'un film d'EPS tel que décrit ci-dessus.
L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'une perle de perliculture, comprenant le procédé de greffe tel que décrit ci-dessus.
La présente invention concerne également un procédé d'obtention de perle comprenant l'utilisation du nucléus enrobé tel que décrit ci-dessus, ou obtenu selon un procédé d'enrobage tel que décrit ci-dessus.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé d'obtention de perle comprend la greffe d'un nucléus selon l'invention dans la poche perlière d'une huître receveuse, en combinaison avec une partie de l'épithélium du manteau d'une huître donneuse.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé de production ou d'obtention de perle comprend une première étape comprenant la collecte et l'élevage des huîtres perlières, de préférence appartenant aux genres et espèces cités ci-dessus, pour obtenir des huîtres perlières donneuses et des huîtres perlières receveuses.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres perlières donneuses et receveuses sont ensuite nettoyées pour retirer d'éventuels parasites.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé de production comprend en outre, à la suite de la greffe, une étape de culture des huîtres perlières receveuses, de préférence pendant une durée de 10 à 24 mois, de préférence de 12 à 20 mois, encore plus préférentiellement de 16 à 18 mois. Pendant la période de culture, la bordure épithéliale du greffon se multiplie et tapisse la poche perlière, pour donner un sac perlier englobant le nucléus, et qui va déposer des couches de nacre autour du nucleus, résultant ainsi en la production d'une perle.
L'invention concerne également une perle obtenue par le procédé d'obtention de perle tel que décrit ci-dessus.
L'invention concerne également une perle comprenant un nucléus revêtu selon l'invention, ou un nucléus obtenu par un procédé selon l'invention.
La présente invention concerne également une perle dont le nucléus est recouvert d'un film d'EPS, de préférence d'EPS produits par des bactéries gram positive ou gram négative, des archeae ou des algues, éventuellement en association avec une ou plusieurs molécules bioactives.
La présente invention concerne également une perle comprenant un film d'EPS, de préférence d'EPS produits par des bactéries gram positive ou gram négative, des archeae ou des algues, éventuellement en association avec une ou plusieurs molécules bioactives sous une ou plusieurs épaisseurs de nacre.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la perle a une taille, de préférence un diamètre de 2 à 20 mm, de préférence de 5 à 15 mm, encore plus préférentiellement de 6.8 à 10 mm.
Selon l'invention, la présence d'un film autour du nucléus telle que décrit dans l'invention présente plusieurs avantages : Amélioration de l'homogénéité de la surface du nucléus, et/ou
Amélioration de la qualité de la perle obtenue (limitation de l'apparition de défauts de surface), et/ou
Accélération de la cicatrisation de l'incision pratiquée pendant la greffe, et/ou - Action sur les cellules du greffon et du sac perlier améliorant l'élaboration de la perle, et/ou
Inhibition des phénomènes de contamination microbienne, et/ou
Réduction de la mortalité des huîtres receveuses par infection de l'incision. La présente invention concerne également un procédé d'amélioration de l'homogénéité d'un nucléus, comprenant l'enrobage dudit nucléus par un film tel que décrit dans la présente invention.
La présente invention concerne également un procédé d'amélioration de la qualité de la perle obtenue lors de la greffe d'une huître receveuse, comprenant l'utilisation d'un nucléus selon l'invention. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'utilisation du nucléus selon l'invention pendant l'étape de greffe limite l'apparition de défauts de surface sur la perle.
La présente invention concerne également un procédé de réduction de l'échec de greffe d'une huître receveuse par un nucléus, ledit échec correspondant à une mortalité ou à un rejet du nucleus par l'huître perlière receveuse, et ledit procédé comprenant la greffe de l'huître receveuse par un nucléus selon l'invention ou obtenu par le procédé d'obtention d'un nucléus selon l'invention.
La présente invention concerne également un procédé d'inhibition du rejet du nucléus lors de la greffe, ledit procédé comprenant l'utilisation d'un nucléus enrobé selon l'invention lors de la greffe.
La présente invention concerne en outre un procédé de réduction de la mortalité des huîtres receveuses consécutive à l'étape de greffe, comprenant l'utilisation d'un nucléus enrobé selon l'invention lors de la greffe. Selon un mode de réalisation de l'invention, la mortalité prévenue par le procédé de l'invention est due à une infection de l'incision réalisée lors de la greffe. La présente invention concerne également l'utilisation du nucléus selon l'invention ou obtenu par le procédé d'obtention d'un nucléus selon l'invention pour réduire l'échec de greffe d'une huître receveuse par un nucléus, ledit échec consistant en une mortalité ou un rejet du nucléus par l'huître perlière receveuse et/ou pour améliorer la qualité de la perle obtenue.
La présente invention concerne par ailleurs un procédé d'accélération de la cicatrisation de l'incision pratiquée pendant la greffe, comprenant l'utilisation d'un nucléus enrobé selon l'invention.
La présente invention concerne également un procédé d'inhibition des phénomènes de contamination microbienne survenant lors de la greffe, ledit procédé comprenant l'utilisation d'un nucléus enrobé selon l'invention lors de la greffe.
D'autre part, l'utilisation des PAM en tant qu'agent bactériostatiques ou bactéricides permet un meilleur respect de l'environnement par rapport à l'utilisation d'antibiotiques chimiques classiques, et de la santé, le muscle de l'huitre perlière pouvant être consommé cru.
BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 est un assemblage de photos obtenues par microscopie à balayage, des nucléi non enrobé (a) et enrobés (b, c et d). Les marques correspondent à des déchirements volontaires afin de conforter la présence du film.
La figure 2 est un assemblage de photos de boites de Pétri après la culture réalisée par des solutions bactériennes incubés avec des nucléus. (a) nucléus non enrobé ou enrobé avec EPS seul, (b) nucléus enrobé avec une combinaison EPS/PAM sans rinçage, (c) nucléus enrobé avec une combinaison EPS/PAM et rincé à l'eau de mer ou à l'eau MilliQ.
EXEMPLES
La présente invention sera mieux comprise et interprétée au vu des exemples ci-dessous. Exemple 1 : présence du film d'EPS Des nucléi ont été revêtus d'un film comprenant l'EPS M0245 et optionnellement de la tachyplesine. Ces nucléi ont été obtenus par un procédé en deux étapes :
1) immersion dans une solution comprenant 1% de M0245 pendant 2h à 4°C,
2) immersion dans une solution de TFE comprenant 70 mg/1 de tachyplésine (soit 10 CMI) pendant 72h à 4°C.
La figure 1 obtenue par microscopie à balayage montre sans ambiguïté la présence d'un film. Les figures b et c montrent la présence du film suite à une déchirure et la figure d montre que le film reste stable après lavage à l'eau et/ou au TFE.
Exemple 2 : Activité antimicrobienne
Expérimentations :
Des nucléi de diamètre standard ont été utilisés pour les études portant sur l'influence d'un prétraitement des surfaces par des biopolymères issus de fermentation bactérienne.
Les nucléi sont revêtu d'un film comprenant l'EPS M0245 seul ou en combinaison avec la tachyplésine.
Ces nucléi sont obtenus par un procédé en une seule étape : immersion des nucléi dans une solution comprenant 0.1% de M0245 et optionnellement 70 mg/1 (soit 10 CMI) de tachyplésine pendant 48h à 4°C.
Certains nucléi ont été rincés avec 200 ml d'eau de mer ou d'eau MilliQ avant d'être séchés. Tous les nucléi ont ensuite été séchés sous vide.
Un test classique d'inhibition de croissance bactérienne a été réalisé sur ces nucléi : les nucléi ont été mis en contact avec une solution bactérienne en phase exponentielle de croissance de la souche Vibrio (Vibrio Pmar02-149) isolée de Pinctada margaritifera lors d'un greffe à Tahiti pendant 18h à 30°C. La croissance bactérienne est alors mesurée au spectrophotomètre à une densité optique de 630 nm. La solution bactérienne est ensuite étalée sur boite de pétri (milieu Zobell Agar) et les colonies développées sont ensuite comptées. La figure 2a montre que la présence de nucléi non enrobés n'inhibe pas la croissance bactérienne. Des résultats similaires ont été obtenus avec des nucléi revêtu uniquement par un film comprenant des EPS.
La figure 2b montre que la présence de nucléi revêtu par un film comprenant une combinaison EPS+PAM inhibe la croissance bactérienne.
La figure 2c montre que l'activité antibactérienne des nucléi revêtus par un film comprenant une combinaison EPS+PAM est conservée après lavage des nucléi.
D'autre part, la stabilité de l'activité antimicrobienne a été étudiée dans le temps et contre le traitement par l'eau de mer (élément essentiel dans la cavité perlière de l'huître). Les résultats montrent que l'activité antimicrobienne d'un nucléus revêtu par un film comprenant une combinaison EPS+PAM est stable pendant au moins deux semaines à température ambiante (18 à 21°C).
La même expérience a ensuite été réalisée sur des nucléi recouverts de l'EPS M0245 ou de l'EPS GG1 en combinaison avec la tachyplésine.
L'activité antimicrobienne des nucléi est mesurée par le pourcentage d'inhibition de la croissance bactérienne au bout de 18 heures de contact par rapport au témoin (culture bactérienne sans nucléi). Les pourcentages d'inhibition mesurés sont présentés dans le tableau ci-dessous.
Figure imgf000020_0001
Les nucléi recouverts par les EPS en combinaison avec le PAM (tachyplésine) inhibent fortement la croissance bactérienne (97 et 95% pour les EPS M0245 et GG1 respectivement).
Exemple 3 : Efficacité des nucléi de l'invention dans des expériences de greffe
1- Mortalité Des nucléus non enrobés, ou enrobés par l'EPS GG1, seul ou en combinaison avec un PAM (la tachyplésine) ont été greffés à des huîtres receveuses en combinaison avec une partie de l'épithélium du manteau d'une huître receveuse (greffon). 67 huîtres donneuses ont été utilisées pour cette expérience. 8 expériences de greffe ont été réalisées par type de nucléus et par donneuse.
La mortalité des huîtres receveuses a été évaluée 40 jours après la greffe. La mortalité est évaluée en pourcentage par rapport aux huîtres ayant reçu un nucléus non enrobé. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous :
Figure imgf000021_0001
La présence du film d'EPS ou d'EPS + PAM sur le nucléus inhibe la mortalité des huîtres de près de 25%.
2- Rejet de greffe
Des nucléi non enrobés, ou enrobés de l'EPS M0245 et d'un PAM
(tachyplésine), ont été utilisés dans des expériences de greffe telles que décrites ci- dessus.
Le rejet des nucléi 40 jours post-greffe a été mesuré. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous, et sont exprimés par rapport aux huîtres ayant reçu un nucléus non enrobé.
Figure imgf000021_0002
La présence d'un film selon l'invention, comprenant un EPS et un PAM, permet de réduire le rejet du nucléus de plus de 20%.

Claims

REVENDICATIONS
1. Un nucléus revêtu d'un film comprenant un ou plusieurs exopolysaccharides (EPS) produits par des bactéries gram positive ou gram négative, des archeae ou des algues.
2. Le nucléus selon la revendication 1, caractérisé en ce que le film comprend en outre une ou plusieurs molécules bioactives.
3. Le nucléus selon la revendication 2, caractérisé en ce que la ou les molécules bioactives sont choisies parmi des agents bactéricides ou bactériostatiques, des agents cicatrisants et/ou des agents anti-inflammatoires.
4. Le nucléus selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les EPS sont choisis parmi HE 800, EPS 721, M0245, GG1, HYD 657, HYD 1644, HYD 1545, GY 785, MS 907, ST 716, HYD 721, GY 772, HYD 750, GY 768, GY 788, BI746, GY 786, GY 685, GY 686, ST 719, HYD 1574, HYD 1579, HYD 1582, HYD 1584, ST 708, ST 722, ST 342, ST 349, HYD 1625, et HYD 1666, de préférence MO 245, HE 8OO, GG1, HYD 721 et ST 716.
5. Le nucléus selon l'une quelconque des revendications 3 à 4, caractérisé en ce que le ou les agents bactéricides ou bactériostatiques sont choisis parmi les peptides antimicrobiens (PAM), de préférence parmi la tachyplésine ou les défensines d'huitre Cg-Defs.
6. Un procédé d'obtention du nucléus selon la revendication 1, ledit procédé comprenant une étape d'enrobage du nucléus par les EPS par immersion dans une solution contenant 0.1 à 10 % en poids d'EPS par rapport au volume de la solution. Un procédé d'obtention du nucléus selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend :
une première étape selon la revendication 6, et
une seconde étape d'association d'un ou plusieurs agents bactéricides ou bactériostatiques avec le film d'EPS préalablement formé, par immersion dans une solution comprenant 1 à 10 CMI dudit ou desdits agents bactéricides ou bactériostatiques.
Un procédé d'obtention du nucléus selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'enrobage du nucléus par les EPS et les agents bactéricides ou bactériostatiques, par immersion dans une solution comprenant 0.05 à 10 % en poids d'EPS par rapport au volume de la solution et 1 à 10 CMI dudit ou desdits agents bactéricides ou bactériostatiques.
Huître perlière comprenant un nucléus selon l'une quelconque des revendications l à 5.
Procédé de greffe d'une huître perlière receveuse comprenant l'insertion dans la poche perlière de l'huître perlière receveuse d'un greffon, correspondant à de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse, en combinaison avec un nucléus selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou avec un nucléus obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8.
Un procédé de fabrication d'une perle de perliculture, comprenant le procédé selon la revendication 11.
Perle obtenue par le procédé selon la revendication 11, ou comprenant le nucléus selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou le nucléus obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, ou comprenant un film comprenant un ou plusieurs exopolysaccharides (EPS) produits par des bactéries gram positive ou gram négative, des archeae ou des algues sous une ou plusieurs épaisseurs de nacre. Procédé d'amélioration de la qualité de la perle et/ou de réduction de l'échec de greffe d'une huître receveuse par un nucléus, ledit échec correspondant à une mortalité ou à un rejet du nucleus par l'huître perlière receveuse, et ledit procédé comprenant la greffe de l'huître receveuse par un nucléus selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou par un nucléus obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8.
Utilisation du nucléus selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou du procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 pour réduire l'échec de greffe d'une huître receveuse par un nucléus, ledit échec consistant en une mortalité ou un rejet du nucléus par l'huître perlière receveuse et/ou pour améliorer la qualité de la perle obtenue.
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