WO2003073858A2 - Procede de lutte contre les maladies des vegetaux par inhibition des enzymes extracellulaires des microorganismes contaminants - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte a un procéde de lutte contre des maladies affectant des vegetaux dans lequel on traite lesdits végétaux avec au moins un agent inhibiteur d'enzymes degradatives extracellulaires sécéetées par des microorganismes contaminant lesdits végétaux.
Description
PROCEDE DE LUTTE CONTRE LES MALADIES DES VEGETAUX PAR INHIBITION DES ENZYMES EXTRACELLULAIRES DES MICROORGANISMES
CONTAMINANTS
Objet de l'invention
[0001] La présente invention concerne un procédé et une composition thérapeutiques et/ou préventifs des végétaux qui permet de réduire, d'éliminer et/ou de prévenir les maladies imputables à la macération et au pourrissement du végétal infecté par des microorganismes et plus particulièrement des' bactéries appartenant au genre- Erwinia .
Arrière-plan technologique et état de la technique
[0002] La bactérie Erwinia carotovora var carotovora cause la pourriture molle bactérienne qui se manifeste souvent en même temps que d'autres maladies comme le mildiou, la pourriture aqueuse et la jambe noire. L'infection peut envahir les tubercules soit par les pores d'aération (lenticelles) ou par les meurtrissures résultant de mauvaises manipulations. Dans le premier cas, le tissu s'affaisse autour du pore et forme des lésions déprimées de couleur brune tandis que dans le deuxième cas, l'infection envahit le tubercule entier. Les parties infectées sont d'abord de couleur crème; elles passent ensuite au brun et laissent suinter une substance visqueuse et d'odeur fétide.
[0003] La jambe noire est causée par la bactérie Erwinia carotovora var atroseptica . Elle se manifeste dans toutes les zones productrices de pommes de terre, souvent en même temps que la pourriture molle. Les symptômes de la maladie sont des touffes manquantes et le jaunissement du plant à la période de floraison. En outre, il arrive qu'une ou plusieurs tiges d'un plant flétrissent rapidement et meurent . La partie inférieure de la tige noircit sur une longueur d'environ 15 cm juste au-dessus du sol. [0004] Les bactéries du genre Erwinia les plus étudiées sont E. carotovora subsp . carotovora (Ecc) , E. carotovora subsp. atroseptica (Eca) et E. chrysanthemi
(Echr) . Alors que Eca est restreint à son seul hôte, la pomme de terre, Echr et Ecc peuvent infecter une large gamme de végétaux (Pérombelon, MC. & Kelman, A. (1980) Annu. Rev. Phytopathol . , 18, 361-387). Ces espèces se distinguent des autres bactéries du genre Erwinia par leur capacité à produire de grandes quantités d'enzymes extracellulaires degradatives qui provoquent la macération et le pourrissement de l'hôte infecté (Barras, F. (1994) Annu. Rev. Phytopathol., 32, 201-234).
[0005] Diverses tentatives ont déjà été faites pour inhiber le pourrissement des végétaux (notamment des pommes de terre par des microorganismes du type Erwinia) ou enrayer ce pourrissement, mais aucune d'entre elles n'a donné entière satisfaction jusqu'à présent.
[0006] La thermothérapie constitue un premier moyen connu qui a été imaginé pour lutter contre la prolifération des microorganismes du genre Erwinia et inhiber ainsi la pourriture des pommes de terre ( O-A-97/38873) .
[0007] Cependant, un tel traitement thermique risque d'endommager la plante.
[0008] La chimiothérapie constitue un autre moyen connu pour inhiber la prolifération des microorganismes du
genre Erwinia parmi les végétaux, spécialement les pommes de terre. Parmi les substances chimiques utilisées, on cite les micro biocides, bactéricides et antibiotiques (WO-A- 87/00006, US-A-4264604) , les bactériocines (JP-0327849) , les extraits de graines de céréales (US-A-5698200) et les agents déstabilisant la membrane externe du tubercule, de manière à rendre celui-ci davantage perméable à l'agent antimicrobien (US-A-6165997) . [0009] On observe toutefois que la chimiothérapie a pour résultat désavantageux d'augmenter la résistance des bactéries pathogènes à ces traitements .
[0010] Un autre moyen connu pour inhiber la prolifération des microorganismes du genre Erwinia consiste à utiliser des souches antagonistes aux souches pathogènes. Ainsi, selon une première technique connue, on disperse sur le plant à traiter (en présence de cuivre) une souche non pathogène d' Erwinia carotovora capable de résister au cuivre (JP-A-11290065) . Selon une autre technique apparentée, on immerge le plant dans une suspension de bactéries Erwinia carotovora non pathogènes, avant la plantation.
[0011] Selon une technique alternative, on traite la plante ou le tubercule avec une souche mutante de la souche Erwinia carotovora, dont le caractère pathogène a au préalable été inhibé (JP-A-3101606) et une souche de Pseudomas antagoniste (Xu, G & Gross, DC (1986) Phytopathology, 76, pge 423-430) .
[0012] Cependant, l'usage de souches antagonistes vise à générer la croissance de ces souches, au détriment des souches pathogênes, qui, à la longue, disparaissent.
Néanmoins, le développement d'une autre variété de bactéries sur les tubercules engendre d'autres inconvénients et ne constitue pas un dispositif permettant
une éradication des contaminations bactériennes des plantes .
Buts de 1 ' invention [0013] La présente invention vise à remédier aux inconvénients susmentionnés et en particulier à proposer un procédé et une composition destinés à réduire ou supprimer de manière écologique un grand nombre de maladies affectant des végétaux ou induites par différents microorganismes, telles que la pourriture molle, la jambe noire, le feu bactérien, ... affectant les végétaux tels que les pommes de terre, les betteraves, les endives, le céleri-rave, les carottes, les arbres fruitiers, les conifères, la tomate, ... sans affecter les caractéristiques des plantes traitées.
Eléments caractéristiques de lf invention
[0014] La présente invention est relative à un procédé de lutte contre les maladies des végétaux, c'est-à- dire un procédé de traitement curatif et/ou préventif des végétaux à l' encontre desdites maladies provoquées par une grande variété de microorganismes, en particulier des bactéries ou des champignons.
[0015] Le procédé consiste à traiter lesdits végétaux par au moins un agent inhibant les enzymes degradatives extracellulaires sécrétées par lesdits microorganismes contaminant ces végétaux.
[0016] Les maladies affectant les végétaux comprennent la pourriture molle, la jambe noire ou le feu bactérien, affectant une variété de végétaux tels que les pommes de terre, les betteraves, les endives, le céleri- rave, les carottes, les arbres fruitiers, les conifères, la tomate, .... Ces maladies sont dues à la prolifération de microorganismes phytopathogènes qui sécrètent des enzymes degradatives extracellulaires ; c'est-à-dire des
champignons ou des bactéries, en particulier les bactéries du genre Erwinia comme Erwinia carotovora subsp. caratovora, Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi , Erwinia amylovora ou des bactéries du genre Bacillus, en particulier Bacillus subtilis, Bacillus polymixa, ou du genre Pseudomonas, en particulier Pseudomonas marginalis .
[0017] Selon l'invention, l'agent inhibiteur est sélectionné parmi ceux susceptibles d'inhiber l'activité d'enzymes depolymerisant les composants de la paroi cellulaire des végétaux, en particulier ceux susceptibles d'inhiber l'activité d'enzymes dégradant la pectine. [0018] De préférence l'agent inhibiteur est sélectionné parmi le groupe constitué par l'acide borique, l'acide éthylène diamine tétra acétique EDTA, le sulfate d'ammonium et le glutathion.
[0019] Selon l'invention, l'agent inhibiteur est mis en œuvre à l'état d'une poudre que l'on disperse sur les végétaux ou est mis en œuvre à l'état d'une solution ou d'une suspension aqueuse, que l'on pulvérise sur les végétaux ou dans laquelle on immerge lesdits végétaux.
[0020] De préférence, la solution ou suspension aqueuse contient de environ 0,1 à environ 500 M d'acide borique par litre et/ou contient de environ 0,1 à environ 2 M d'acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA) par litre et/ou contient de environ 0,1 à environ ImM de glutathion par litre et/ou contient de environ 10 à environ 100 mM de sulfate d'ammonium par litre.
[0021] De préférence, la solution ou suspension aqueuse est mise en œuvre à une quantité de environ 0,5 à environ 10 litres par 1000 kilos de végétaux. [0022] De préférence, l'agent inhibiteur est présent sous forme de composition comprenant un mélange de deux agents inhibiteurs, de préférence un mélange d'acide
borique et d'acide éthylène diamine tétra acétique, plus particulièrement un mélange contenant de 1 à 5 kilos d'acide borique et de 100 à 500 grammes d'acide éthylène diamine tétra acétique pour 1000 kilos de végétaux. [0023] Un autre aspect de la présente invention concerne les végétaux ayant subi un traitement curatif ou préventif à 1 ' encontre de maladies causant des pourritures humides et obtenus par le procédé de traitement de 1 ' invention. [0024] Un dernier aspect de la présente invention concerne lesdites compositions phytosanitaires constituées d'un mélange d'acide borique et d'acide éthylène diamine tétra acétique, en particulier d'une solution aqueuse comprenant par litre de solution de environ 0,1 à environ 500 mM, de préférence de environ 1 à environ lOOmM d'acide borique et de environ 0,1 à environ 2 mM, de préférence de environ 0,9 à environ 1,9 mM d'acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA) .
Brève description des figures
[0025] La figure 1 représente la croissance de E. carotovora var atroseptica dans un milieu constitué de pelures de pommes de terre en présence de différentes concentrations en inhibiteurs d'enzymes extracellulaires. [0026] La figure 2 représente la croissance de E. carotovora var atroseptica dans un milieu constitué de pelures de pommes de terre en présence de différents inhibiteurs ou mélange d'inhibiteurs d'enzymes extracellulaires . [0027] La figure 3 représente la croissance de E. carotovora var atroseptica dans un milieu constitué de pelures de pommes de terre avec une optimisation des concentrations en acide borique et en EDTA.
Exemples
Exemple 1: Essai d'un mélange de différents inhibiteurs d'enzymes extracellulaires à deux concentrations
[0028] L'expérience consiste à inoculer un milieu composé de pelures de pommes de terre broyées et d'eau
(témoin), d'une solution d'inhibiteurs à une faible concentration (concentration inhibitrice "minimum") et à une concentration plus élevée (concentration inhibitrice
"maximum") par la souche Erwinia carotovora var atroseptica UPB 065 issue d'une préculture. La croissance d' E. carotovora var atroseptica effectuée à 20 °C dans le milieu composé de pelures de pommes de terre broyées est suivie par la mesure de la consommation d'oxygène au cours du temps (figure 1) . [0029] La nature ainsi que les concentrations en agents décrits comme ayant une action inhibitrice sur une ou plusieurs des activités enzymatiques décrites plus haut sont reprises ci-dessous:
Concentration inhibitrice "minimum" testée : - Acide borique environ 0,15 mM
- EDTA (Dissolvine NA-2-P) environ 0 , ImM
- Glutathion environ 0,3 mM
- Sulfate d'ammonium environ 33 mM Concentration inhibitrice "maximum" testée : - Acide borique environ 480 mM
- EDTA environ ImM
- Glutathion environ 0,8 mM
Sulfate d'ammonium environ 33 mM
[0030] Le milieu de préculture, stérilisé 15 minutes à 121°C, utilisé pour produire E. carotovora var atroseptica est composé de:
- Dextrose: 0,5 g
- Extrait de levure: 1,25 g
- caséine : 2 , 5 g
- H20 distillée: 500 ml
[0031] Le milieu "pelures de pommes de terre" contient 20g de pelures de pommes de terre broyées au mixeur pour un volume total de 200 ml d'eau distillée.
[0032] On constate que la croissance de E. carotovora var atroseptica au détriment des matières organiques constituant les pelures de pommes de terre est quelque peu ralentie en présence de la concentration en inhibiteurs d'enzymes extracellulaires la plus faible; ce ralentissement se traduit par une phase de latence plus longue d'environ 4 heures. L'inhibition de la croissance est totale pour la concentration en inhibiteurs d'enzymes extracellulaires la plus élevée. Exemple 2: Identification des agents inhibiteurs d'enzymes responsables de l'inhibition de la croissance de Erwinia .
[0033] La paroi cellulaire végétale est formée d'un réseau de microfibrilles de cellulose inclues dans une matrice de substances pectiques, d' hémicellulose et de lignine. Cette paroi peut être subdivisée en plusieurs zones (de l'intérieur vers l'extérieur) :
1. La paroi secondaire est entre la membrane plasmique et la paroi primaire. Elle est plus épaisse que la paroi primaire. Elle est constituée de cellulose et d' hémicellulose et est enrichie en composés phénoliques;
2. La paroi primaire est externe à la paroi secondaire, de nature pecto-cellulosique, elle est mince et flexible;
3. La lamelle moyenne est une couche principalement d'un polysaccharide adhésif (la pectine) à l'extérieur de la paroi primaire. Elle est commune à deux cellules contiguës et aide à faire adhérer les cellules végétales ensembles .
[0034] Les substances pectiques sont des polymères d'acide alpha-D-galacturonique liés par des liaisons alpha-
1,4 glycosidiques (O'Neill, M., Albersheim, P. & Darvill, A. (1990) Methods in Plant Biochemistry, 2, 415-441) . Trois types de polymères sont connus : les homogalacturonanes et les rhamnogalacturonanes I et II. Classiquement, la pectine végétale est assimilée à des molécules d'homogalacturonanes estérifiées par du méthanol sur 40 à 60% des atomes de carbone en position 6 des résidus galacturonate . [0035] A côté des hydrates de carbone, la paroi cellulaire des végétaux contient une variété de protéines ou de glycoprotéines . Les protéines structurales se retrouvent dans toutes les couches de la paroi mais se retrouvent de façon plus abondante dans la couche primaire . L'extensine est une structure protéique dans laquelle les polypeptides forment des liaisons covalentes entre elles via les résidus tyrosine.
[0036] La première étape de l'infection d'une plante par des micro-organismes phytopathogènes consiste en l'attaque des systèmes pariétaux nécessitant plusieurs activités enzymatiques différentes. La connaissance de la structure de la paroi végétale permet de comprendre les mécanismes d'infection de la plante.
[0037] La pectine peut être dégradée par différentes enzymes produites notamment par Erwinia . Les différentes enzymes nécessaires à cette dégradation sont les suivantes: - la pectine méthylestérase qui diminue le degré d' estérification de la pectine en enlevant les groupements méthyl , libérant ainsi du polygalacturonate et du méthanol ;
— la pectate lyase qui dépolymérise le polygalacturonate par β-élimination;
- la pectine lyase qui dépolymérise la pectine par fielimination;
- la polygalacturonase qui dépolymérise le polygalacturonate par hydrolyse.
[0038] Erwinia produit aussi d'autres enzymes extracellulaires notamment des cellulases (ex: cellobiases) , des protéases et des glucuronate isomerases nécessaires à la dégradation des autres composants de la paroi végétale (Chatterjee, A., et al. (1995) Appl .
Environ. Microbiol . , 61, 1959-1967; Mukherjee, A., et al.
(2000) Environ. Microbiol., 2, 203-215). [0039] Ces enzymes dépolymérisantes liquéfient les composants majeurs de la paroi cellulaire du plant
(Collmer, A. & Keen, NT. (1986) Annu. Rev. Phytopathol. 24,
383-409) .
[0040] L'expérience vise à déterminer, parmi les inhibiteurs testés dans l'exemple 1, ceux qui présentent l'effet inhibiteur sur la croissance d' E. carotovora var atroseptica le plus important.
[0041] La croissance d'E. carotovora var atroseptica effectuée à 20°C dans le milieu composé de pelures de pommes de terre broyées est suivie par la mesure de la consommation d'oxygène en présence de différents inhibiteurs d'enzymes extracellulaires ou mélange d'inhibiteurs (figure 2). Les différentes conditions testées sont : - témoin: 20g de pelures de pommes de terre broyées au mixeur pour un volume total de 200 ml d'eau distillée.
- concentration inhibitrice "maximum" : milieu "pelures de pommes de terre" avec acide borique 480 mM, EDTA ImM, glutathion 0 , 8 mM et sulfate d'ammonium 33 mM. - milieu "EDTA ImM" : milieu "pelures de pommes de terre" avec EDTA ImM.
- milieu "Borate 480mM" : milieu "pelures de pommes de terre" avec acide borique 480mM
- milieu "EDTA ImM + Borate 480mM" : milieu "pelures de pommes de terre" avec EDTA ImM, acide borique 480mM.
- milieu "EDTA 0,5mM + Borate 240mM" : milieu "pelures de pommes de terre" avec EDTA 0,5mM, acide borique 240mM. [0042] Le milieu de préculture, stérilisé 15 minutes à 121°C, utilisé pour produire E. carotovora var atroseptica est composé de:
- Dextrose : 0,5 g
- Extrait de levure: 1,25 g - caséine: 2,5 g
- H20 distillée: 500 ml
[0043] On constate que la croissance d'JE?. carotovora var atroseptica au détriment des matières organiques constituant les pelures de pommes de terre est totalement inhibée en présence du mélange des quatre inhibiteurs d'enzymes extracellulaires. Ce résultat confirme le résultat obtenu dans l'exemple 1. La croissance d' E. carotovora var atroseptica est ralentie en présence d'EDTA ImM; ce ralentissement se traduit par une phase de latence plus longue d'environ 8 heures. L'inhibition de la croissance est par contre totale en présence d' acide borique 480mM ainsi qu'en présence du mélange d'EDTA et d'acide borique aux deux concentrations testées.
[0044] Ce résultat montre que le mélange d'EDTA et d'acide borique présente un effet inhibiteur sur la croissance d' E. carotovora var atroseptica identique à celui observé pour le mélange des quatre inhibiteurs d'enzymes extracellulaires. Exemple 3 : Optimisation des concentrations en acide borique et en EDTA.
[0045] L'expérience vise à déterminer les concentrations en acide borique et en EDTA nécessaires pour que, ensembles, elles assurent un effet inhibiteur sur la croissance d' E. carotovora var atroseptica .
[0046] La croissance d'E. carotovora var atroseptica effectuée à 20°C dans le milieu composé de pelures de pommes de terre broyées est suivie par la mesure de la consommation d'oxygène en présence de différentes concentrations en acide borique, en présence d'EDTA ainsi qu'en présence des deux inhibiteurs d'enzymes extracellulaires (figure 3) . Les différentes conditions testées sont :
- témoin: 20g de pelures de pommes de terre broyées au mixeur pour un volume total de 200 ml d'eau distillée.
- milieu "Borate 7,5mM": milieu "pelures de pommes de terre" avec acide borique 7,5mM.
- milieu "Borate 22,5mM": milieu "pelures de pommes de terre" avec acide borique 22,5mM. - milieu "Borate 75mM" : milieu "pelures de pommes de terre" avec acide borique 75mM.
- milieu "EDTA l,35mM": milieu "pelures de pommes de terre" avec EDTA l,35mM.
- milieu "Borate 75mM + EDTA l,35mM": milieu "pelures de pommes de terre" avec acide borique 75mM et EDTA l,35mM. [0047] Le milieu de préculture, stérilisé 15 minutes à 121°C, utilisé pour produire E. carotovora var atroseptica est composé de: - Dextrose: 0,5 g
- Extrait de levure: 1,25 g
- caséine : 2,5 g
- H20 distillée: 500 ml
[0048] On constate que l'augmentation de la concentration en acide borique (de 7,5 à 75 mM) s'accompagne d'un effet inhibiteur de plus en plus marqué sur la croissance d'E. carotovora var atroseptica . Dans les conditions testées, une concentration de l,35mM en EDTA provoque un phénomène d'inhibition plus important que celui
observé avec la concentration de 75mM en acide borique; comparativement au témoin, la phase de latence se trouve en effet augmentée de 15 et 6 heures respectivement . Une inhibition totale de la croissance d'E. carotovora var atroseptica a été observée durant les 40 premières heures de culture suite à l'addition dans le milieu du mélange avantageux des deux inhibiteurs d'enzymes extracellulaires (acide borique 75mM et EDTA l,35mM) .
[0049] Ce résultat montre l'intérêt d'utiliser un mélange de différents inhibiteurs d'enzymes extracellulaires, leur effet étant synergique. Exemple 4
[0050] Les compositions décrites dans les exemples 1 à 3 ont été également testées pour caractériser leurs effets inhibiteurs sur la croissance des souches de champignons possédant des enzymes extracellulaires s 'attaquant aux tomates.
[0051] Les sondes de champignons testées sont les suivants : - Phytophtora infestans
Alternaria douci
Botrytis cinerea
Sclerotinia sclerotiorum
Pythium - Phytophtora
Rhizoctonia solani
Pseudomonas syringae
Pseudomonas corrugata Le mode d'application du produit: pulvérisation du plant 1 fois par semaine. Produit pulvérisé: mélange d'acide borique 480mM et EDTA (Dissolvine NA-2-P) 2mM . [0052] Des résultats positifs similaires ont été obtenus pour bloquer la croissance de ces microorganismes .
Claims
1. Un procédé de lutte contre les maladies affectant des végétaux, dans lequel on traite lesdits végétaux avec au moins un agent inhibiteur des enzymes degradatives extracellulaires sécrétées par des bactéries contaminant lesdits végétaux.
2. Le procédé selon la revendication 1, dans lequel les microorganismes contaminant les végétaux sont des champignons .
3, Le procédé selon la revendication 1, dans lequel les microorganismes contaminant les végétaux sont choisis parmi le groupe constitué par les bactéries du genre Erwinia, les bactéries du genre Bacillus et/ou les bactéries du genre Pseudomonas .
4. Le procédé selon la revendication 3, dans lequel les bactéries du genre Erwinia sont choisies parmi le groupe constitué par E. carotovora subsp. carotovora, E. carotovora subsp. atroseptica, E. chrysanthemi et/ou E. amylovora .
5. Le procédé selon la revendication 3, dans lequel les bactéries du genre Bacillus sont choisies parmi le groupe constitué par Bacillus subtilis et Bacillus polymixa .
6. Le procédé selon la revendication 3, dans lequel la bactérie du genre Pseudomonas est P. marginalis .
7. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'agent inhibiteur est sélectionné parmi ceux susceptibles d'inhiber l'activité d'enzymes depolymerisant les composants de la paroi cellulaire des végétaux, en particulier la pectine.
8. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'agent inhibiteur est sélectionné parmi le groupe constitué par l'acide borique, l'acide éthylène diamine tétra acétique, le sulfate d'ammonium, le glutathion et/ ou un mélange d'entre eux.
9. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les maladies affectant les végétaux sont choisies parmi le groupe constitué par la pourriture molle, la pourriture aqueuse et la jambe noire et/ou le feu bactérien.
10. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les végétaux sont choisis parmi le groupe constitué par la pomme de terre, la betterave, l'endive, le céleri-rave, la carotte, les arbres fruitiers et/ou les conifères.
11. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'agent inhibiteur est mis en œuvre à l'état d'une poudre que l'on disperse sur les végétaux ou est mis en œuvre à l'état d'une solution ou d'une suspension aqueuse que l'on pulvérise sur lesdits végétaux ou dans laquelle on immerge lesdits végétaux.
12. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la solution ou suspension aqueuse contient de 0,1 à 500mM d'acide borique par litre, de 0,1 à 2 mM d'acide éthylène diamine tétra acétique par litre, de 0,1 à ImM de glutathion par litre et/ou de 10 à 100 mM de sulfate d'ammonium par litre.
13. Une composition phytosanitaire de lutte contre les maladies affectant des végétaux, en particulier les maladies induites par les bactéries, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange d'acide borique et d'acide éthylène diamine tétra acétique.
14. La composition selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle consiste en une solution aqueuse comprenant par litre de solution de 0,1 à 500 mM d'acide borique et de 0 , 1 à 2 mM d'acide éthylène diamine tétra acétique .
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