WO2007042557A2 - Composition pour application phytopharmaceutique pour stimuler les defenses naturelles des plantes - Google Patents

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WO2007042557A2
WO2007042557A2 PCT/EP2006/067344 EP2006067344W WO2007042557A2 WO 2007042557 A2 WO2007042557 A2 WO 2007042557A2 EP 2006067344 W EP2006067344 W EP 2006067344W WO 2007042557 A2 WO2007042557 A2 WO 2007042557A2
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vine
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Jean-Michel Merillon
Xavier Vitrac
Cassandrine Saigne-Soulard
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Universite Victor Segalen - Bordeaux 2
Conseil Interprofessionnel Des Vins De La Region De Bergerac (Civrb)
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
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    • A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom

Definitions

  • Composition for plant protection application to stimulate the natural defenses of plants
  • compositions for phytopharmaceutical application intended to stimulate the natural defenses of plants, in particular vines.
  • the subject of the invention is compositions containing oligosaccharides secreted by or obtained from a strain of pathogenic or non-pathogenic fungus plants.
  • the hypersensitivity response As soon as a plant detects a pathogen, it sets up one of the most effective natural defense systems: the hypersensitivity response. At the site of the pathogen's penetration, this rapid and violent reaction results in the death of the first infected cells and the appearance of a small necrotic zone, thus isolating the attacked cells from the rest of the plant (Dangl et al. 1996 Lamb and Dixon 1997). The triggering of this response depends on a specific recognition of the pathogen by the host plant. Indeed, the attacked plant recognizes through a protein (receptor) molecules produced by the pathogen, named elicitors.
  • the genes coding for the receptor proteins are called resistance genes (R genes), and for the pathogen, the genes coding for the elicitrices molecules are called avirulence genes (Avr gene): we speak here of a gene for gene relationship or R-Avr relationship (Hammond-Kosack, 1996).
  • R genes resistance genes
  • Avr gene avirulence genes
  • Other molecules, qualified as general elicitors, are also capable of initiating (in a less specific way than the elicitors mentioned above) a defensive reaction of the host plant. These are most often oligosaccharides released by the pathogen (exogenous elicitors) or the plant cell (endogenous elicitors) (Scheel and Parker, 1996).
  • Oligosaccharides break down into four classes: oligoglucans, oligochitins and oligochitosans of fungal origin; and oligogalacturonides of plant origin.
  • Oligoglucans are composed of 3-, 6- and 3,6- linked ⁇ -glucose residues.
  • Chitin is a linear polymer of 4-linked N-acetyl- ⁇ -glucosamine residues, which is the major constituent of the fungal mycelium wall; chitosan is formed of the same deacetylated residues.
  • Oligogalacturonides are released by the degradation of plant cell wall pectic compounds (homogalacturonans) following attack of the pathogen; they are composed of 4-linked ⁇ -galacturonic acid residues. Oligosaccharides must most often be composed of a number of residues between 4 and 15, to have an eliciting action (Côté et al., 1994).
  • PR proteins defense proteins or "Pathogenesis Related” (PR) proteins discovered in 1970 in Tobacco.
  • PR proteins are, for example, protease inhibitors (Ryan, 1992), hydrolytic enzymes, such as chitinases or ⁇ -1,3 glucanases (Derckel et al., 1996; Robinson et al., 1997, Kraeva et al, 1998; Salzman et al, 1998; Renault et al, 2000);
  • phytoalexin-type secondary metabolites Of the secondary metabolites, more than 300 phytoalexins have already been characterized. They belong to a broad spectrum of different chemical classes, including coumarins, benzofurans, terpenes, alkaloids, and some polyphenols (Smith, 1996).
  • the establishment of plant defense reactions involves a wide range of transduction signals leading to the rapid induction of defense gene expression.
  • the recognition of the pathogen by the host plant will activate a whole cascade of signals in the attacked cells such as the protein phosphorylation by protein kinases, the flow of ionic species (Ca + ), the formation of reactive oxygen species (Coté and Hahn 1994, Shibuya et al 1996, Benhamou 1996).
  • the attacked cells are capable of producing alarm signals transmitted to the neighboring cells (local reaction) as well as to the whole plant thus generating, as stated in the preceding paragraph, the systemic reaction phenomenon.
  • SAR systemic acquired resistance
  • SAR was defined by Ross in 1961. It describes the appearance of resistance of a plant following an attack by a pathogen, both in the infected parts and in the healthy parts of the plant. It develops, in general, after the appearance of necrotic lesions around the site of inoculation. This localized hypersensitivity response restricts the pathogen in and around the site of infection, and appears to make the plant more resistant to attack by various organisms (Ryals et al., 1996). It was in 1966 that Ross developed the idea of the existence of signal molecules which, at low concentrations, would be able to activate defense mechanisms in tissues distant from the infected zone. Three types of molecules can intervene in plants as an alarm signal at intracellular and intercellular levels, at short or long distance: salicylic acid, ethylene and jasmonates.
  • phytoalexins are inducible in leaves and berries. This type of induction is referred to as elicitation.
  • Elicitation factors can have different origins. It could be :
  • polyphenols and especially stilbenes such as tr ⁇ ns-resveratrol, tr ans -picéide, ⁇ -viniferine, ⁇ -viniferine and pterostilbène, can be induced in leaves and berries (Soleas et al, 1997, Jeandet et al, 2004).
  • This property of de novo biosynthesis of stilbenes in response to stress, and in particular after attack by a pathogen suggests that these molecules could play the role of natural defense of plants.
  • Document FR 2836011 discloses a method for stimulating the natural defenses of plants, which comprises the application to said plants of an elicitor or sensitizer which is capable, in contact with the plants, of preventing the activation of the genes in these cells. defense on the product's application site.
  • This method uses an effective amount of a ⁇ 1-3 glucan oligo prepared from bacteria, algae or cereals.
  • these oligosaccharides have 20 to 33 osidic units, which limits their penetration into the leaves.
  • seaweed which is an exhaustible source, and may contain residues of marine pollution.
  • they are chemically modified by sulfation.
  • the inventors have developed an innovative and controlled technology, guaranteeing the quality and authenticity of the products. This is the cultivation of mushrooms in large volumes, meeting the needs of industry, including:
  • the inventors of the present application have discovered that the culture filtrate, after autoclaving, can be directly incorporated in a plant protection composition.
  • This method has the particular advantage of providing a useful and innovative alternative to conventional solvent extraction and thus avoid producing toxic effects on the plant.
  • the disadvantages are minimal because it is a natural solvent, classically produced by yeasts from glucose and found in wine or beer.
  • the object of the present invention is to provide an alternative method to the use of chemicals and thus respecting the environment and the consumer.
  • the elicitation of the natural defenses of the plants makes it possible to limit the dose and the number of treatments.
  • Another aspect of the invention lies in the mode of action which is preventive.
  • this new class of elicitors makes it possible to simulate an attack of pathogens at the level of the cells of the plant.
  • the latter will trigger a natural defense mechanism that will cause a hypersensitivity reaction but also a systemic resistance acquired, and this at least once, which will prevent even more effectively the subsequent attack.
  • Very small amounts of elicitors are enough to raise awareness cytoplasmic membrane.
  • the threshold of detection of elicitors by plants can reach a value of 10 ⁇ 9 molar or even lower.
  • a first aspect of the present invention relates to a composition for plant protection application, characterized in that it comprises as active ingredient at least one oligosaccharide secreted by or obtained from a strain of pathogenic or non-pathogenic fungus plants.
  • oligosaccharides is intended to denote, according to the present invention, substances formed from several molecules of osteos (mainly from 4 to 15) linked by osidic bonds.
  • fungus is meant according to the present invention all known fungi species.
  • the fungus is selected from Botrytis cinerea, Phomopsis viticola and Eutypa lata and mixtures thereof.
  • the active ingredients that can be used in the composition according to the invention can come from mixtures of mushroom cultures obtained from different genera.
  • the active principle can be obtained from an in vitro culture of plant pathogenic fungi by recovery of the culture medium and the mycelium, without separation.
  • the whole culture that is to say the culture medium and the mycelium, is then used to obtain the active ingredient.
  • the active ingredient according to the invention can also be obtained from an in vitro culture of plant pathogenic fungi by separation of the culture medium from the mycelium.
  • the active ingredient is then obtained either from the culture medium or from the mycelium.
  • the active ingredient consists of an acellular fraction of the culture medium.
  • acellular fraction we mean a fraction without whole cells, but may contain cell fragments as well as molecules initially present in the cell body.
  • This culture medium may be optionally purified, the purification being carried out by precipitation of an aqueous filtrate from the culture medium with a solvent, preferably alcohol.
  • the active principle is obtained by extraction and lysis of the mycelium cells.
  • a method for obtaining a mushroom extract characterized in that the mushroom extract is a culture filtrate and / or a mycelium preparation comprises the following steps: a) cultivation of the mushroom in liquid medium for 3 to 28 days b) separation of the culture filtrate and the mycelium c) recovery of the culture filtrate obtained in step b) and, optionally, autoclaving of this culture filtrate and / or d) recovery of the mycelium obtained in step b) and preparation of a mycelium preparation.
  • step d) may optionally include the following steps:
  • This step e) can be done by precipitation with ethanol.
  • step e) The polysaccharide fraction which is obtained in step e), and optionally lyophilized in step f), is redissolved in water and then optionally autoclaved to obtain a solution comprising oligosaccharide fragments.
  • the process does not include step c) and the preparation of the mycelium preparation in step d) consists of an aqueous extraction, a acid hydrolysis, enzymatic hydrolysis and / or autoclaving from the mycelium recovered in step d).
  • the process comprises steps c) and d) and optionally the optional steps mentioned.
  • the in vitro fungi cultures that can be used according to the invention can be obtained by any method known from the prior art.
  • the fungal cultures can be carried out in a liquid culture medium, in Erlenmeyer flasks or in bioreactors, in particular fermenters.
  • culture medium is meant according to the present invention any culture medium generally known to those skilled in the art. Such media can be solid, liquid or semi-solid. Preferably, the culture medium is a liquid medium.
  • 2% Malt-Agar and Potato Dextrose Agar medium may be mentioned as solid culture medium, and Czapek-Dox medium as liquid medium.
  • composition according to the present invention can be autoclaved.
  • active ingredient of the composition according to the present invention is in liquid form.
  • the composition is in the form of a solution, a concentrate, or a freeze-dried powder.
  • the composition is used for preventive or curative purposes.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the composition according to the present invention for stimulating the natural defense reactions of plants against a present or future aggression.
  • the aggression is an attack by a pathogen, preferably a fungus.
  • the fungus is Botrytis cinerea, Phomopsis viticola, Eutypa lata, Erisyphe necator (formerly called Uncinula necator), Phoma uvicola, Phomopsis viticola, Phaeoacremonium sp, Phytophthora sp. or in particular Phyhophtora infestans or Phytophtora parasitica.
  • the natural defense reactions of plants are the production by the leaves and / or the fruit of defense molecules such as phytoalexins, for example the polyphenols of the vine, particularly the stilbenes, more particularly the transgenes. and picosees, their aglycones (trans- and cis-resveratrol), pterostilbene or oligomers such as ⁇ - and ⁇ -viniferins.
  • the expression of certain genes is markedly increased, such as those encoding stilbene synthase, glucanases and chitinases.
  • the plants are selected from vine, fruit trees, vegetable crops, cereals and oilseeds, protein crops, tobacco and ornamental plants.
  • the selected plant is vine, tomato or potato.
  • Another aspect of the invention relates to a method of treating plants for stimulating natural defenses to plant pathogens, characterized in that the particular application to leaves or fruits or seeds or seeds, preferably sheets, an effective amount of a composition according to the present invention.
  • plants are treated: vine, fruit trees, vegetable crops, cereals, oilseeds, protein crops, tobacco, ornamental plants, preferably vine, tomato or tomato. potato.
  • plants are treated to control pathogens, preferably fungi, preferably Botrytis cinerea, Plasmopara viticola, Eutypa lata, Uncinula necator, Phoma uvicola, Phomopsis viticola, Phaeoacremonium sp, Phytophthora infestans or Phytophtora parasitica.
  • pathogens preferably fungi, preferably Botrytis cinerea, Plasmopara viticola, Eutypa lata, Uncinula necator, Phoma uvicola, Phomopsis viticola, Phaeoacremonium sp, Phytophthora infestans or Phytophtora parasitica.
  • pathogens preferably fungi, preferably Botrytis cinerea, Plasmo
  • the method according to the present invention makes it possible to treat vine against Uncinula necator (responsible for powdery mildew) and Plasmopara viticola (responsible for late blight), and to treat tomato and potato against Phytophthora sp. (responsible for late blight).
  • the method according to the present invention makes it possible to prevent or treat plant diseases such as gray mold, powdery mildew, downy mildew, excoriose, Black rot, Eutypiose, scab of fruit trees, peach blister, septoria, rusts, coals, cavities, anthracnose, crown rot, or Esca.
  • these diseases are gray mold, powdery mildew, mildew. Even more preferably, these diseases are downy mildew and powdery mildew or tomato and potato late blight.
  • Erysiphe necator Uncinula necator (Grapevine) Erysiphe graminis (cereals) Podosphera leucotricha (fruit trees, fruit trees) Sphaerotheca pannosa (Roses)
  • Ustaligo tritici Wheat
  • Ustaligo maydis Corn
  • Ustaligo hordei Barley
  • Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum lindemuthianum (bean)
  • 11- Gray mold Botrytis cinerea Vine
  • the plants whose natural defenses are stimulated are treated either during an attack by a pathogen or with a view to future attack, using a composition, especially a aqueous solution which must be applied to the leaves, fruits or seeds and which comprises, in addition to the conventional vehicles and constituents of this type of composition, one or more oligosaccharides of mushroom walls as defined above, present in concentrations which depend on the desired result, that is, immediate stimulation or potentiation of the defenses.
  • the treatment is generally carried out starting from the early vegetative stages of the plant, possibly in several successive applications, advantageously by spraying.
  • the precise moment of the application (s) will be chosen in particular according to the treated plant.
  • the vector vehicle is usually water. However, instead of water, it is possible to use a vector chosen from the group comprising vegetable oils, surfactants, solvents, dispersing agents and / or solid fillers.
  • FIG. 1 Stilbene content in the leaves of plants (Vine) treated by Elicitor F241.
  • Figure 2 Efficacy on the Vine Mildew of F241 tested at two doses. Contamination 2 days after treatment and observation on treated leaves.
  • Figure 3 Accumulation of mRNA genes encoding the enzymes of the pathway of stilbenes (A) and PR-proteins (B and C) in the leaves of plants (Vitis vinifera) treated by Elicitor F241.
  • Figure 4 Efficacy on the Mildew of Tomato and Potato of the product F241 at the 25% dose. Contamination 2 days after treatment and observation of infestation on treated leaves 7 days after contamination.
  • Example 1 Process for producing new elicitors
  • Step 1 Preparation of mushroom cultures The first step for the development of fungal cultures in vitro is to select the species producing the desired substances. It is now admitted that within the same species, there is a variability in the production capacities of a given metabolite, partly of genetic origin. Where possible, this variability will need to be exploited by selecting the best genotype, ie the most productive for the desired metabolite.
  • the selected fungus strain (Botrytis cinerea for example) is cultured on a solid medium (2% Malt-agar) for 10 days at 23 ⁇ 2 ° C with a photoperiod (16h day / 8h darkness) until the obtaining conidia. The conidia are then suspended in water at 0.05% tween 20.
  • Step 2 Preparation of oligosaccharides After separation of the mycelium and the culture medium by filtration on fabric to blut (50 .mu.m) or centrifugation, the filtrate is recovered and subjected to autoclaving at 115-120 0 C for a period of 40 to 60 minutes depending on the volume treated . After this treatment, the filtrate, called F241, can be used in this form to treat the plants or can be lyophilized and then re-dissolved just before use.
  • Step 3 Drying or atomizing or lyophilizing the extracts This stage is advantageously carried out at a temperature below 60 ° C., for example between -60 ° C. and 50 ° C., using a lyophilizer. In the latter case, about 1 to 5 grams of dry powder per liter of culture are obtained after lyophilization. The powder obtained is then milled using a mill, preferably with a mortar-type grinder, ball or knife.
  • Step 4 mixing and / or incorporation in one or more excipients and / or other active ingredients for the preparation of the composition for plant protection use
  • the isolated oligosaccharides are colorimetrically determined by the phenol-sulfuric acid reaction (Dubois et al., 1956), and are then diluted in distilled water or adjuvants.
  • Example 2 Stimulation of natural defenses of Vine plants treated with an elicitor from the culture filtrate (F241).
  • a conventional spray delivery mode using a jet spray jet and constant pressure is used.
  • the application is carried out on the whole plant.
  • the pressure at which spraying is practiced depends on the volume to be supplied.
  • a spray carriage, equipped with 5 nozzles (1 upper central, 2 right side, 2 side left) moves on a guide rail at a constant speed.
  • the plants of the same batch are treated simultaneously and in a perfectly controlled way.
  • the application volume of the selected elicitor is 600 1 / ha.
  • the cartridges are conditioned by successive washings with MeOH (2 ml), 50% MeOH (2 ml) and distilled water (6 ml). After depositing the sample, the stilbenes are eluted with 5 ml of MeOH / H 2 O (80/20, v / v). The eluate obtained is directly injected by reverse phase (C 18) silica column HPLC. The stilbenes are detected by fluorescence, at an excitation wavelength of 300 nm and an emission wavelength of 390 nm, which correspond to the optimum wavelengths for the stilbenes. The stilbene contents of the leaves are calculated with respect to calibration curves made with pure compounds. The results obtained are shown in FIG.
  • Example 3 Study of the Resistance of Vine Plants Treated by Elicitor F241 to Infection with Plasmopara viticola A batch of plants treated by the elicitor are dried at room temperature and then returned to the greenhouse until they are contaminated 48 hours later.
  • the fungal material consists of a set of sporocysts of good viability from a strain of downy mildew or powdery mildew, sensitive to the main fungicide families used at present.
  • the sporocyst suspension is prepared in depressed water maintained at low temperature in order to block the release of the zoospores until the time of inoculation.
  • sporulations of the fungus are recovered and suspended in deionized water.
  • a titration of the concentration of the inoculum is performed using a Malassez cell.
  • the desired optimal concentration is 50,000 sp / ml.
  • sporocyst suspension For a plant, about 10 ml of sporocyst suspension is sprayed. The preparation of the inoculum takes place just before the contamination. Each plant is handled in isolation and contaminated on all leaf levels. Plants of the same condition are then incubated in isolation chambers. A water misting inside these individual enclosures will allow permanent moisture saturation very favorable to the development of the disease. All plants are incubated after contamination in an air-conditioned room at 21 ⁇ 2 ° C and lit 14 hours a day. The plants remain in these conditions for 8 days. At the end of this period, a notation of the damage of the fungus is carried out on each plant and for each leaf stage.
  • the notation is based on a visual observation of the damage intensity of the decomposed fungus in two parts: the surface colonized by the fungus and the intensity of sporulation. We use a scale from 0 to 100% (in steps of 5%).
  • leaf stages noted in the case of plants are those corresponding to the fourth leaf level at the time of treatment and following (F4, F3, F2, Fl, Nl, N2, N3 ).
  • a colored link placed under the third leaf spread at the time of treatment makes it easy to spot different sheet levels without any ambiguity.
  • T the average attack score on untreated plants
  • D the average attack score on plants treated with dose d.
  • FIG. 2 shows the attack intensities as well as the efficiencies noted on the various batches of plants (Vine) treated or not by the elicitor F241.

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Abstract

La présente invention a pour objet des compositions pour application phytopharmaceutique dest inées à stimuler les défenses naturelles des plantes, notamment de la Vigne, la tomate et la pomme de terre, permettant de lutter contre les maladies des plantes, notamment les oïdiums et les mildious. En particulier, l'invention a pour objet des composit ions contenant des oligosaccharides secrétés par ou obtenu à partir d'une souche de champignon pathogène ou non pathogène des plantes.

Description

Composition pour application phvtopharmaceutique pour stimuler les défenses naturelles des plantes
La présente invention a pour objet des compositions pour application phytopharmaceutique destinées à stimuler les défenses naturelles des plantes, notamment de la Vigne. En particulier, l'invention a pour objet des compositions contenant des oligosaccharides sécrétés par ou obtenu à partir d'une souche de champignon pathogène ou non pathogène des plantes.
Tout au long de leur développement, les plantes sont soumises à des agressions continuelles de la part de leur environnement. Cependant, elles se montrent souvent capables de résister naturellement à ces agressions extérieures grâce à la présence ou à l'activation de mécanismes de défense (Hammond- Kosack et Jones, 1996). Ainsi, bien que certains de ces mécanismes soient constitutifs et fournissent une barrière physique et chimique à une agression, d'autres ne sont induits qu'après une attaque par un nuisible.
Dès qu'une plante détecte un pathogène, elle met en place un des systèmes de défense naturelle les plus efficaces : la réponse d'hypersensibilité. Au niveau du site de pénétration du pathogène, cette réaction, rapide et violente, se traduit par la mort des premières cellules infectées et l'apparition d'une petite zone nécrotique, isolant ainsi les cellules attaquées du reste de la plante (Dangl et al., 1996 ; Lamb et Dixon, 1997). Le déclenchement de cette réponse dépend d'une reconnaissance spécifique de l'agent pathogène par la plante hôte. En effet, la plante attaquée reconnaît par l'intermédiaire d'une protéine (récepteur) des molécules produites par le pathogène, nommées éliciteurs. Chez la plante, les gènes codant pour les protéines réceptrices sont appelés gènes de résistance (gènes R), et pour le pathogène, les gènes codant pour les molécules élicitrices sont nommés gènes d'avirulence (gène Avr) : on parle alors ici d'une relation gène pour gène ou relation R-Avr (Hammond-Kosack, 1996). D'autres molécules, qualifiées d'éliciteurs généraux, sont également capables d'initier (de façon moins spécifique que les éliciteurs cités précédemment) une réaction de défense de la plante hôte. Celles-ci sont le plus souvent des oligosaccharides libérés par le pathogène (éliciteurs exogènes) ou la cellule végétale (éliciteurs endogènes) (Scheel et Parker, 1996).
Ces oligosaccharides se décomposent en 4 classes : oligoglucanes, oligochitine et oligochitosane d'origine fongique ; et oligogalacturonides d'origine végétale. Les oligoglucanes sont composés de résidus β-glucose liés en 3-, 6- et 3,6-. La chitine est un polymère linéaire de résidus N-acétyl- β - glucosamine liés en 4-, qui représente le constituant majeur de la paroi du mycélium des champignons ; le chitosane est formé des mêmes résidus désacétylés. Les oligogalacturonides sont libérés par la dégradation des composés pectiques de la paroi des cellules végétales (homogalacturonanes) suite à l'attaque du pathogène ; ils sont composés de résidus d'acide α-galacturonique liés en 4-. Les oligosaccharides doivent le plus souvent être composés d'un nombre de résidus compris entre 4 et 15, pour avoir une action élicitrice (Côté et al., 1994).
Cette réaction de défense intense est ensuite suivie par la mise en place de mécanismes de défense dans les cellules voisines de la zone infectée, impliquant la diffusion d'un signal, c'est la réaction locale. Enfin, il y a émission de divers signaux d'alerte vers tous les autres organes de la plante, ce qui permet à la plante de réagir plus rapidement et plus efficacement lors d'une nouvelle agression, on parle alors de réaction systémique.
Lors de ces réactions, trois catégories de systèmes de défense peuvent être activés : - la formation d'un épiderme de cicatrisation et le renforcement des parois
(lignification...) (Dai et al, 1995) ;
- la synthèse de protéines de défense ou «Pathogenesis Related» (PR) protéines découvertes en 1970 chez le Tabac. Parmi ces protéines PR on trouve, par exemple, des inhibiteurs de protéase (Ryan, 1992), des enzymes hydrolytiques, comme les chitinases ou les β-1,3 glucanases (Derckel et al., 1996 ; Robinson et al., 1997, Kraeva et al, 1998 ; Salzman et al, 1998 ; Renault et al, 2000) ;
- et la synthèse de métabolites secondaires de type phytoalexines. Parmi les métabolites secondaires, plus de 300 phytoalexines ont déjà été caractérisées. Elles appartiennent à un large spectre de classes chimiques différentes parmi lesquelles on pourra citer les coumarines, les benzofuranes, les terpènes, les alcaloïdes, et certains polyphénols (Smith, 1996).
La mise en place des réactions de défense des plantes implique toute une panoplie de signaux de transduction conduisant à l'induction rapide de l'expression de gènes de défense. Ainsi, la reconnaissance du pathogène par la plante hôte va activer toute une cascade de signaux dans les cellules attaquées tels que la phosphorylation de protéines par des protéines kinases, les flux d'espèces ioniques (Ca +), la formation d'espèces oxygénées réactives (Coté et Hahn, 1994 ; Shibuya et al, 1996 ; Benhamou, 1996). De plus, les cellules attaquées sont capables de produire des signaux d'alarme transmis aux cellules voisines (réaction locale) ainsi qu'à toute la plante engendrant ainsi, comme énoncé dans le paragraphe précédent, le phénomène de réaction systémique.
Le mécanisme de résistance systémique le plus étudié est le phénomène de SAR ou «systemic acquired résistance». Le terme de SAR a été défini par Ross en 1961. Il décrit l'apparition de résistance d'une plante consécutive à une attaque par un pathogène, aussi bien dans les parties infectées que dans les parties saines de la plante. Elle se développe, en général, après l'apparition de lésions nécrotiques autour du site d'inoculation. Cette réponse d'hypersensibilité localisée restreint le pathogène dans, et autour du site d'infection, et semble rendre la plante plus résistante aux agressions par divers organismes (Ryals et al., 1996). C'est en 1966 que Ross a développé l'idée de l'existence de molécules signal qui, à de faibles concentrations, seraient capables d'activer des mécanismes de défense dans les tissus distants de la zone infectée. Trois types de molécules peuvent intervenir chez les plantes comme signal d'alarme aux niveaux intra et intercellulaire, à courte ou longue distance : l'acide salicylique, l'éthylène et les jasmonates.
Chez la Vigne, les mécanismes de signalisation impliqués dans l'expression des réactions de défense ne sont pas encore bien connus. Cependant, on retrouve la synthèse des trois types de molécules de défense (lignine, protéines de défense et phytoalexines). En particulier, le rôle de phytoalexines est notamment tenu par une famille de composés originaux : les polyphénols (Deloire et al, 2000).
Présents en plus ou moins grandes quantités dans tous les organes de la plante, les phytoalexines sont inductibles au niveau des feuilles et des baies. Ce type d'induction est désigné sous le terme d'élicitation.
Les facteurs d'élicitation (ou éliciteurs) peuvent avoir des origines différentes. Il peut s'agir :
- d'élicitation biotique, par exemple lors d'une agression par un pathogène comme Botrytis cinerea, agent de la Pourriture grise (Jeandet et al, 1995 ;
Bavaresco et al., 1997), Plasmopara viticola, agent du Mildiou (Dercks et Creasy, 1989) ou Phomopsis viticola, responsable de l'Excoriose (Hoos et Blaich, 1990).
- d'élicitation abiotique par les facteurs environnementaux tels que U.V., température, lumière, asphyxie (Jeandet et al, 1997 ; Langcake et Pryce, 1977b ; Douillet-Breuil et al, 1999), le chlorure d'aluminium (Adrian et al., 1996) ou l'ozone (Sarig et al, 1996).
Lors d'une élicitation, des polyphénols et notamment des stilbènes comme le trαns-resvératrol, le tr ans -picéide, l'ε-viniférine, la δ-viniferine et le ptérostilbène, peuvent être induits au niveau des feuilles et des baies (Soleas et al, 1997 ; Jeandet et al, 2004). Cette propriété de biosynthèse de novo de stilbènes en réponse à un stress, et en particulier après attaque par un pathogène, suggère que ces molécules pourraient jouer le rôle de moyen de défense naturelle des plantes.
Ce rôle de molécules de défense est corroboré par certaines études qui semblent indiquer une corrélation étroite entre le niveau de résistance naturelle de la plante et son aptitude à synthétiser ces molécules. Par exemple, Langcake et Mc Carthy (1979) ont mis en évidence une relation entre la résistance de certaines espèces du genre Vitis à Botrytis cinerea ou Plasmopara viticola et leur capacité de biosynthèse de stilbènes (resvératrol et viniférines). De plus, Dercks et Creasy (1989) ont montré que les espèces résistantes à Plasmopara viticola produisent cinq fois plus de phytoalexines que les espèces sensibles. De même, à l'intérieur de l'espèce vinifera, on trouve des cépages plus ou moins tolérants à l'attaque par des champignons selon leur capacité de production de phytoalexines.
Il est également intéressant de noter chez d'autres plantes, l'acquisition de résistance à certaines maladies fongiques rendue possible après introduction du gène codant pour la stilbène synthase. Ainsi, des plants de Luzerne (Medicago sativa L.) transformés avec le gène de la stilbène synthase d'Arachide (Arachis hypogae) présentent une résistance à l'infection par Phoma medicaginis qui est corrélée à l'apparition de picéides au niveau des feuilles (Hipskind et Palva, 2000). De même, des plants de Tabac, de Tomate ou de Riz transgéniques ayant incorporé un gène codant pour la stilbène synthase de Vigne sont moins sensibles à l'infection par Botrytis cinerea, Phytophtora infestans et Pyricularia oryza, respectivement (Thomzick et al., 1997; Stark-Lorenzen et al., 1997; Hain et al., 1993 ).
Plus récemment, Coutos-Thévenot et al. (2002) ont obtenu des plants de Vigne transformés par le gène de la stilbène synthase (Vstl) placé sous l'influence d'un promoteur inductible. Dans ces plantes, l'accumulation de trans-rQsvératrol est très nettement augmentée (d'un facteur 200) et ces Vignes transgéniques présentent une très grande résistance à Botrytis cinerea.
On connaît par le document FR 2836011 un procédé pour la stimulation des défenses naturelles des plantes qui comprend l'application auxdites plantes d'un agent éliciteur ou sensibilisateur qui est capable au contact des plantes de provoquer préventivement dans celles-ci l'activation des gènes de défense sur le site d'application du produit. Ce procédé utilise une quantité efficace d'un oligo β 1-3 glucane, préparée à partir de bactéries, d'algues ou de céréales. Cependant ces oligosaccharides possèdent 20 à 33 unités osidiques, ce qui limite leur pénétration au niveau des feuilles. D'autre part, ils sont extraits à partir d'algues marines, ce qui est une source épuisable, et pouvant contenir des résidus de pollution marine. De plus, ils sont modifiés chimiquement par sulfatation.
Les inventeurs ont développé une technologie innovante et maîtrisée, garantissant la qualité et l'authenticité des produits. Il s'agit de la mise en culture de champignons en grands volumes, répondant aux besoins de l'industrie, notamment :
L'absence de solvant et de résidus, - L'homogénéité des substrats, La production continue, - L'absence totale de polluants,
La production standardisée et reproductible quant à la qualité et la concentration des métabolites.
De manière tout à fait surprenante, les inventeurs de la présente demande ont découvert que l'on pouvait directement incorporer le filtrat de culture, après autoclavage, dans une composition phytopharmaceutique. Ce procédé présente notamment l'avantage d'apporter une alternative utile et innovante aux extractions conventionnelles par solvants et d'éviter ainsi de produire des effets toxiques sur la plante. Dans le cas d'une extraction à l'éthanol, comme présenté à l'exemple 1, les inconvénients sont minimes car il s'agit d'un solvant naturel, produit classiquement par des levures à partir du glucose et que l'on retrouve dans le vin ou la bière. Le but de la présente invention est de proposer un procédé alternatif à l'emploi de produits chimiques et respectant ainsi l'environnement et le consommateur. De plus, l'élicitation des défenses naturelles des plantes permet de limiter la dose et le nombre de traitements Un autre aspect de l'invention se situe au niveau du mode d'action qui est préventif. En effet, cette nouvelle classe d'éliciteurs permet de simuler une attaque de pathogènes au niveau des cellules de la plante. Ces dernières vont enclencher un mécanisme naturel de défense qui va provoquer une réaction d'hypersensibilité mais aussi une résistance systémique acquise, et ce au moins une fois, ce qui permettra de prévenir encore plus efficacement l'attaque ultérieure. De très faibles quantités d'éliciteurs suffisent pour sensibiliser la membrane cytoplasmique. Ainsi, le seuil de détection des éliciteurs par les plantes peut atteindre une valeur de 10~9 Molaire ou même inférieure.
Un premier aspect de la présente invention concerne une composition pour application phytopharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif au moins un oligosaccharide sécrété par ou obtenu à partir d'une souche de champignon pathogène ou non pathogène des plantes.
Par composition phytopharmaceutique on entend désigner selon la présente invention toute composition qui a trait à la protection des plantes ou des produits récoltés. Par oligosaccharides on entend désigner selon la présente invention des substances formées de plusieurs molécules d'osés (majoritairement de 4 à 15) liées par des liaisons osidiques.
Par champignon, on entend désigner selon la présente invention toutes les espèces de champignons connues. De manière préférée, le champignon est choisi parmi Botrytis cinerea, Phomopsis viticola et Eutypa lata et leurs mélanges
Bien entendu les principes actifs utilisables dans la composition selon l'invention peuvent provenir de mélanges de cultures de champignons obtenus à partir de genres différents.
Selon la présente invention, le principe actif peut être obtenu à partir d'une culture in vitro de champignons pathogènes des plantes par récupération du milieu de culture et du mycélium, sans séparation. Toute la culture, c'est-à-dire le milieu de culture et le mycélium, est alors utilisé pour obtenir le principe actif.
En outre, le principe actif selon l'invention peut également être obtenu à partir d'une culture in vitro de champignons pathogènes des plantes par séparation du milieu de culture d'avec le mycélium.
Le principe actif est alors obtenu soit à partir du milieu de culture, soit à partir du mycélium.
Dans le premier cas, le plus simple pour une exploitation industrielle, le principe actif est constitué d'une fraction acellulaire du milieu de culture. Par fraction acellulaire, on entend désigner une fraction sans cellules entières, mais pouvant contenir des fragments de cellules ainsi que des molécules initialement présentes dans le corps cellulaire.
Ce milieu de culture peut être éventuellement purifié, la purification étant effectuée par précipitation d'un filtrat aqueux du milieu de culture par un solvant, de préférence de l'alcool.
Dans le deuxième cas, le principe actif est obtenu par extraction et lyse des cellules du mycélium.
Ainsi, par exemple, un procédé d'obtention d'un extrait de champignon caractérisé en ce que l'extrait de champignon est un filtrat de culture et/ou une préparation de mycélium comprend les étapes suivantes : a) mise en culture du champignon en milieu liquide pendant 3 à 28 jours b) séparation du filtrat de culture et du mycélium c) récupération du filtrat de culture obtenu à l'étape b) et, optionnellement, autoclavage de ce filtrat de culture et/ou d) récupération du mycélium obtenu à l'étape b) et élaboration d'une préparation de mycélium.
Dans le cas où le principe actif n'est obtenu qu'à partir du milieu de culture, le procédé ne comprend pas l'étape d) mais peut comprendre de manière optionnelle les étapes suivantes :
• après l'étape c), une étape e) d'isolement d'une fraction polysaccharidique à partir du filtrat de culture obtenu à l'étape c). Cette étape e) peut se faire par précipitation à l'éthanol.
• une étape f) de lyophilisation de la fraction polysaccharidique isolée à l'étape e).
• la fraction polysaccharidique qui est obtenue à l'étape e), et éventuellement lyophilisée à l'étape f), est redissoute dans de l'eau puis optionnellement autoclavée afin d'obtenir une solution comprenant des fragments oligosaccharidiques. Dans le cas où le principe actif n'est obtenu qu'à partir du mycélium, le procédé ne comprend pas l'étape c) et l'élaboration de la préparation de mycélium à l'étape d) consiste en une extraction aqueuse, une hydrolyse acide, une hydrolyse enzymatique et/ou un autoclavage à partir du mycélium récupéré à l'étape d).
Dans le cas où le principe actif est obtenu à partir du mycélium et du milieu de culture, le procédé comprend les étapes c) et d) ainsi qu'éventuellement les étapes optionnelles mentionnées.
Les cultures de champignons in vitro utilisables selon l'invention peuvent être obtenues par toute méthode connue de l'art antérieur. Notamment les cultures de champignons peuvent être réalisées dans un milieu de culture liquide, dans des fioles Erlenmeyer ou en bioréacteurs, en particulier en fermenteurs.
Par milieu de culture on entend désigner selon la présente invention tout milieu de culture généralement connu de l'homme du métier. De tels milieux peuvent être solides, liquides ou semi-solides. De manière préférée, le milieu de culture est un milieu liquide.
On peut citer comme milieu de culture solide le Malt-Agar à 2% et le milieu Potato Dextrose Agar, et comme milieu de culture liquide le milieu Czapek-Dox
De plus, la composition selon la présente invention peut être autoclavée. De manière préférée, le principe actif de la composition selon la présente invention est sous forme liquide.
Selon la présente invention, la composition se présente sous la forme d'une solution, d'un concentré, ou d'une poudre lyophilisée.
Selon la présente invention, la composition est utilisée à titre préventif ou curatif.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de la composition selon la présente invention pour stimuler les réactions de défense naturelle des plantes vis-à-vis d'une agression présente ou à venir.
Selon la présente invention, l'agression est une attaque par un pathogène, de préférence un champignon. De manière préférée, le champignon est Botrytis cinerea, Phomopsis viticola, Eutypa lata, Erisyphe necator (anciennement dénommée Uncinula necator), Phoma uvicola, Phomopsis viticola, Phaeoacremonium sp, Phytophtora sp. ou en particulier Phyhophtora infestans ou Phytophtora parasitica .
Selon la présente invention, les réactions de défense naturelle des plantes sont la production par les feuilles et/ou les fruits de molécules de défense telles que les phytoalexines, comme par exemple les polyphénols de la Vigne, particulièrement les stilbènes, plus particulièrement les trans- et czs-picéides, leurs aglycones (les trans- et czs-resvératrol), le ptérostilbène ou les oligomères comme les ε- et δ- viniférines. De plus, l'expression de certains gènes est nettement augmentée, comme ceux codant la stilbène synthase, des glucanases et chitinases.
Selon la présente invention, les plantes sont choisies parmi la Vigne, les arbres fruitiers, les cultures maraîchères, les céréales et les oléagineux, les protéagineux, le tabac et les plantes ornementales. De manière préférée la plante choisie est la Vigne, la tomate ou la pomme de terre.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de traitement des plantes pour la stimulation des défenses naturelles aux agents pathogènes des plantes, caractérisé en ce que l'on applique notamment aux feuilles ou aux fruits ou aux semences ou aux graines, de préférence les feuilles, une quantité efficace d'une composition selon la présente invention.
Dans le procédé selon la présente invention, les plantes suivantes sont traitées: la Vigne, les arbres fruitiers, les cultures maraîchères, les céréales, les oléagineux, les protéagineux, le tabac, les plantes ornementales, de préférence la Vigne, la tomate ou la pomme de terre. Dans le procédé selon la présente invention, on traite des plantes pour lutter contre des pathogènes, de préférence des champignons, de préférence encore Botrytis cinerea, Plasmopara viticola, Eutypa lata, Uncinula necator, Phoma uvicola, Phomopsis viticola, Phaeoacremonium sp, Phytophtora infestans ou Phytophtora parasitica . De préférence on traite des plantes pour lutter contre les mildious et les oïdiums. De manière encore préférée, le procédé selon la présente invention permet de traiter la Vigne contre Uncinula necator (responsable de l'oïdium) et Plasmopara viticola (responsable du mildiou), et de traiter la tomate et la pomme de terre contre Phytophtora sp. (responsable du mildiou). Le procédé selon la présente invention permet de prévenir ou traiter des maladies de plantes telles que la pourriture grise, les oïdiums, les mildious, l'excoriose, Black-rot, l'Eutypiose, les tavelures des arbres fruitiers, la cloque du pêcher, les septorioses, les rouilles, les charbons, les caries, l'anthracnose, la pourriture du collet ou l'Esca. De manière préférée ces maladies sont la pourriture grise, les oïdiums, les mildious. De manière encore plus préférée ces maladies sont le mildiou et l'oïdium de la Vigne ou le mildiou de la tomate et de la pomme de terre.
La liste ci-dessous reprend les principales maladies (numérotées de 1 à 11), ainsi que les champignons responsables (en italique) et les plantes touchées (entre parenthèses), pour lesquelles le procédé selon la présente invention permettrait un traitement ou une prévention :
1 - Oïdiums
Erysiphe necator = Uncinula necator (Vigne) Erysiphe graminis (céréales) Podosphera leucotricha (arboriculture, fruitiers) Sphaerotheca pannosa (Rosiers)
2 - Mildious
Plasmopara viticola (Vigne) Plasmopara helianthi (Tournesol)
Phytophthora infestans (Pomme de terre) Phytophthora parasitica (Tomate)
3- Tavelures des arbres fruitiers Venturia inaequalis (pommier) Venturia pirina (poirier) 4- Cloque du pêcher
Taphrina deformans
5- Septorioses
Septoria nodorum et Septoria tritici (Céréales) Septoria sp. (colza)
6- Rouilles Puccinia graminis , Puccinia recondita et Puccinia striiformis (Céréales)
7- Charbons
Ustaligo tritici (Blé) Ustaligo maydis (Maïs) Ustaligo hordei (Orge)
8- Caries
Tilletia tritici, Tilletia caries et Tilletia foetida (Céréales)
9- Pourriture du collet
Phoma lingam (Crucifères, Colza) Rhizoetonia solani (Pomme de terre) Sclerotinia sclerotiorum (tomate)
10- Anthracnose
Colletotrichum gloeosporioides (Pois) Colletotrichum lindemuthianum (haricot)
11- Pourriture grise Botrytis cinerea (Vigne) Dans la pratique, on traite les plantes dont il s'agit de stimuler les défenses naturelles soit lors d'une attaque par un agent pathogène soit en vue d'une attaque future, à l'aide d'une composition, notamment d'une solution aqueuse qui doit être appliquée sur les feuilles, les fruits ou sur les semences et qui comprend, outre les véhicules et constituants classiques de ce genre de composition, un ou plusieurs oligosaccharides de parois de champignons tels que définis plus haut, présents à des concentrations qui dépendent du résultat recherché, c'est-à-dire une stimulation immédiate ou une potentialisation des défenses. Le traitement est généralement réalisé à partir des premiers stades végétatifs de la plante éventuellement en plusieurs applications successives avantageusement par pulvérisation.
Le moment précis de la ou des applications sera choisi notamment en fonction de la plante traitée. Le véhicule vecteur est généralement l'eau. Il est toutefois possible d'avoir recours, en lieu et place de l'eau, à un vecteur choisi dans le groupe comprenant les huiles végétales, les agents tensio-actifs, les solvants, des agents dispersants et/ou des charges solides.
La présente invention sera maintenant décrite plus en détail à l'aide des exemples et compositions suivants, qui illustrent l'invention sans en limiter aucunement le cadre.
Légende des figures
Figure 1 : Teneur en stilbènes dans les feuilles de plantes (Vigne) traitées par l'éliciteur F241.
Figure 2 : Efficacité sur le Mildiou de la Vigne du produit F241 testé à deux doses. Contamination 2 jours après le traitement et observation sur les feuilles traitées.
Figure 3 : Accumulation des ARNm des gènes codant pour les enzymes de la voie de biosynthèse des stilbènes (A) et des PR-protéines (B et C) dans les feuilles des plantes (Vitis vinifera) traitées par l'éliciteur F241. Figure 4 : Efficacité sur le Mildiou de la Tomate et de la Pomme de Terre du produit F241 à la dose 25%. Contamination 2 jours après le traitement et observation de l'infestation sur les feuilles traitées 7 jours après la contamination.
EXEMPLES
Exemple 1 : Procédé de production de nouveaux éliciteurs.
Etape 1 : Préparation des cultures de champignons La première étape pour le développement de cultures de champignons in vitro consiste à sélectionner l'espèce produisant les substances recherchées. On admet aujourd'hui qu'au sein d'une même espèce, il existe une variabilité des capacités de production d'un métabolite donné, en partie d'origine génétique. Lorsque cela est possible, il faudra donc exploiter cette variabilité en sélectionnant le meilleur génotype, c'est-à-dire le plus productif pour le métabolite recherché.
La souche de champignon sélectionnée (Botrytis cinerea par exemple) est cultivée sur milieu solide (Malt-agar à 2%) pendant 10 jours à 23 ± 2°C avec une photopériode (16h jour/8h d'obscurité) jusqu'à l'obtention de conidies. Les conidies sont ensuite mises en suspension dans de l'eau à 0,05% de tween 20. Des aliquots de cette suspension conidienne sont ajoutés au milieu de culture Czapek- Dox modifié (3 g/L NaNO3, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L KCl, 0,5 g/L MgSO4, 0,01 g/L FeSO4, 5 g/L d'acide tartrique, 20 à 50 g/L de D-glucose ou de saccharose, pH ajusté à 3,2 par KOH) préalablement stérilisé par autoclavage, à la concentration finale de 2, 5.104 conidies/ml de milieu. Les cultures sont alors placées dans un bioréacteur de 5 à 20 litres, à 23 ± 2°C avec une vitesse de rotation au maximum de l'agitateur de 300 tr/min. et un débit d'air au maximum de 5 wm, pendant une durée au maximum de 35 jours.
Etape 2 : Préparation des oligosaccharides Après séparation du mycélium et du milieu de culture par fïltration sur toile à blutter (50μm) ou centrifugation, le filtrat est récupéré et soumis à un autoclavage à 115-1200C d'une durée de 40 à 60 minutes en fonction du volume traité. Après ce traitement, le filtrat, appelé F241, peut être utilisé sous cette forme pour traiter les plantes ou peut être lyophilisé puis remis en solution juste avant utilisation.
Etape 3 : Séchage ou atomisation ou lyophilisation des extraits Cette étape est avantageusement opérée à une température inférieure à 60° C, par exemple entre -60° C et 500C, à l'aide d'un lyophilisateur. Dans ce dernier cas, on obtient après lyophilisation environ 1 à 5 grammes de poudre sèche par litre de culture. La poudre obtenue est ensuite broyée à l'aide d'un broyeur, préférentiellement à l'aide d'un broyeur de type Mortier, à bille ou à couteaux.
Etape 4 : mélange et / ou incorporation à un ou des excipients et/ ou à d'autres principes actifs pour la préparation de la composition à usage phvtopharmaceutique
Les oligosaccharides isolés sont dosés par colorimétrie grâce à la réaction phénol-acide sulfurique (Dubois et al, 1956), puis sont dilués dans de l'eau distillée ou des adjuvants.
Exemple 2 : Stimulation des défenses naturelles de plants de Vigne traités par un éliciteur provenant du filtrat de culture (F241).
Les essais ont été réalisés sur de jeunes plants de Vigne du cépage Cabernet
Sauvignon (CS) et produits en serre à partir de boutures à un œil. Des lots de 6 plantes ont été constitués pour l'étude de chaque modalité d'un essai. Les niveaux foliaires ont été identifiés au moment des traitements et contaminations à l'aide d'un repère de couleur placé sous la troisième feuille étalée. On a tout d'abord traité des plantes entières des variétés CS par des compositions aqueuses contenant 0,1% de Triton, et comportant l'éliciteur F241 à la concentration de 20% (v/v) qui est la dose optimale pour l'activité élicitrice.
Un mode d'apport classique par pulvérisation au moyen d'un banc de pulvérisation à jets projetés et à pression constante est utilisé. L'application est réalisée sur l'ensemble du végétal. La pression à laquelle la pulvérisation est pratiquée est fonction du volume à apporter. Un chariot de pulvérisation, équipé de 5 buses (1 supérieure centrale, 2 latérales droites, 2 latérales gauches) se déplace sur un rail de guidage à une vitesse constante. Les plantes d'un même lot sont traitées simultanément et de façon parfaitement contrôlée. Le volume d'application de l'éliciteur retenu est de 600 1/ha.
48 heures après traitement des plants, un lot est sélectionné et les feuilles sont récoltées. Elles sont ensuite séchées à l'aide d'un lyophilisateur (Virtis Uni- Trap 10-100). La poudre obtenue après broyage à l'aide d'un broyeur type Mortier, est extraite par du méthanol, à raison de 10 ml pour 200 mg de matière sèche à 4°C. Après centrifugation (10 min., 3500 rpm), 8 ml d'extrait méthanolique de feuilles sont évaporés au Speed Vac. L'échantillon est repris dans 1 ml de MeOHZH2O (30/70 , v/v) puis chromatographié sur mini-colonne de silice greffée Cl 8 (SPE). Le conditionnement des cartouches est réalisé par lavages successifs au MeOH (2 ml), au MeOH 50% (2 ml), et à l'eau distillée (6 ml). Après dépôt de l'échantillon, les stilbènes sont élues avec 5 ml de MeOH/H20 (80/20, v/v). L'éluat obtenu est directement injecté en HPLC sur colonne de silice en phase inverse (C 18). Les stilbènes sont détectés par fluorescence, à une longueur d'onde d'excitation de 300 nm et une longueur d'onde d'émission de 390 nm, qui correspondent aux longueurs d'onde optimales pour les stilbènes. Les teneurs en stilbènes des feuilles sont calculées par rapport à des courbes d'étalonnage réalisées avec des composés purs. Les résultats obtenus sont réunis sur la figure 1.
Exemple 3 : Etude de la résistance de plants de Vigne traités par l'éliciteur F241 à une infection par Plasmopara viticola. Un lot de plantes traitées par l'éliciteur sont séchées à température ambiante puis remises en serre jusqu'au moment de leur contamination 48 heures plus tard.
Le matériel fongique est constitué d'un ensemble de sporocystes de bonne viabilité issu d'une souche de mildiou ou d'oïdium de référence, sensibles aux principales familles fongicides utilisées à l'heure actuelle.
La suspension de sporocystes est préparée dans une eau permutée maintenue à basse température afin de bloquer la libération des zoospores jusqu'au moment de l'inoculation. Par un lavage des feuilles infectées, les sporulations du champignon sont récupérées et mises en suspension dans de l'eau permutée. Une titration de la concentration de l'inoculum est opérée à l'aide d'une cellule de Malassez. La concentration optimale recherchée est de 50 000 sp/ml.
Pour une plante, environ 10 ml de suspension de sporocystes sont pulvérisés. La préparation de l'inoculum se déroule juste avant la contamination. Chaque plante est manipulée isolément et contaminée sur tous les niveaux de feuilles. Les plantes d'une même condition sont alors placées en incubation dans des enceintes d'isolement. Une brumisation d'eau à l'intérieur de ces enceintes individuelles permettra une saturation en humidité permanente très favorable au développement de la maladie. Toutes les plantes sont mises en incubation après leur contamination dans une salle climatisée à 21±2°C et éclairée 14 heures par jour. Les plantes restent dans ces conditions pendant 8 jours. Au terme de cette période, une notation des dégâts du champignon est réalisée sur chaque plante et pour chaque étage foliaire.
La notation est basée sur une observation visuelle de l'intensité des dégâts du champignon décomposée en deux éléments : la surface colonisée par le champignon et l'intensité de la sporulation. Nous utilisons une échelle allant de 0 à 100% (par pas de 5%).
Chaque feuille est observée de façon individuelle. Les étages foliaires notés dans le cas de plantes sont ceux correspondant au quatrième niveau de feuille au moment du traitement et des suivants (F4 ; F3 ; F2 ; Fl, Nl, N2, N3...). Un lien de couleur disposé sous la troisième feuille étalée au moment du traitement nous permet de repérer aisément les différents niveaux de feuille sans aucune équivoque.
La moyenne des dégâts notés sur les 6 plantes d'un même lot est dans un premier temps calculée. La plante dont les dégâts sont les plus éloignés de cette moyenne (forte ou faible attaque) est écartée. La moyenne des 5 plantes les plus homogènes sera alors calculée et donnera le taux de dégâts pour chaque condition de l'essai. L'efficacité (E) de chaque modalité de l'essai est ensuite être calculée en référence au lot de plantes non traitées de l'essai selon la formule :
E = {[(T-D)/T]*100} où, T est la note moyenne d'attaque sur les plantes non traitées, et D celle observée sur les plantes traitées à la dose d.
Une analyse de variance permet la comparaison des résultats et de donner, le cas échéant, les différences entre les conditions étudiées.
Les résultats sont présentés sur la figure 2. La figure 2 présente les intensités d'attaque ainsi que les efficacités notées sur les différents lots de plantes (Vigne) traitées ou non par l'éliciteur F241.
Près de 43% de surface végétale est attaquée par le mildiou après traitement avec l'éliciteur à la dose 2%. Par contre, les dégâts sont très faibles sur les plantes traitées avec ce même produit à la dose 20% (moins de 1% de dégâts). Parallèlement, le taux d'expression des ARNm de différents gènes codant pour des enzymes impliquée dans les réactions de défense des plantes a été mesuré par le PCR quantitative en temps réel, grâce à l'utilisation d'amorces spécifiques.
Les résultats présentés sur la Figure 3 montrent que l'éliciteur F241 induit dans les feuilles de plantes {Vitis vinifera), dès les premières heures suivant le traitement, une nette augmentation du taux d'expression des gènes codant pour les enzymes de la voie de biosynthèse des stilbènes, telles que la phénylalanine amonia-lyase (PAL) et la stilbène synthase (STS) d'un facteur 300 à 600, de même que ceux codant pour des protéines PR (Pathogenesis-Related) telles que les chitinases (CHIT), la protéine inhibitrice de polygalacturonases (PGIP) et l'inhibiteur de la serine protéinase (PIN) d'un facteur 5 à 60. Exemple 4 : Etude de la résistance de plants de Tomate et de Pomme de Terre traités par l'éliciteur F241 à une infection par Phytophtora sp.
Les résultats présentés sur la figure 4 montrent que les taux d'infestation sont très faibles sur les plantes traitées avec l'éliciteur F241 (intensité d'infestation inférieure à 3% pour les deux plantes), avec une fréquence d'attaque de seulement 29% pour la Tomate.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition pour application phytopharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif au moins un oligosaccharide sécrété par ou obtenu à partir d'une souche de champignon pathogène ou non pathogène des plantes.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le principe actif est obtenu à partir d'une culture in vitro de champignons pathogènes des plantes par récupération du milieu de culture et du mycélium, sans séparation, et éventuellement purification du milieu de culture et du mycélium.
3. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le principe actif est obtenu à partir d'une culture in vitro de champignons pathogènes des plantes par séparation du milieu de culture d'avec le mycélium.
4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le principe actif est constitué d'une fraction acellulaire du milieu de culture.
5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que le milieu de culture est purifié par précipitation d'un filtrat aqueux du milieu de culture par de l'alcool.
6. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le principe actif est obtenu après extraction et lyse des cellules du mycélium.
7. Composition selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisée en ce que le milieu de culture est un milieu liquide.
8. Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle est autoclavée.
9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le principe actif est sous forme lyophilisée ou atomisée.
10. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le champignon est choisi parmi Botrytis cinerea, Phomopsis viticola et Eutypa lata et leurs mélanges.
11. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'une solution, d'un concentré, ou d'une poudre lyophilisée.
12. Composition selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle est utilisée à titre préventif ou curatif.
13. Utilisation de la composition selon la revendication 12 pour stimuler les réactions de défense naturelle des plantes vis-à-vis d'une agression présente ou à venir.
14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'agression est une attaque par un pathogène, de préférence un champignon.
15. Utilisation selon la revendication 14 caractérisée en ce que le champignon est Botrytis cinerea, Phomopsis viticola, Eutypa lata ou Phytophtora sp..
16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que les réactions de défense naturelle des plantes sont la production par les feuilles et/ou les baies des plantes de molécules de défense telles que les polyphénols, particulièrement les stilbènes, plus particulièrement les trans et cis picéides, leurs aglycones, les trans et cis resveratrol, les pterostilbènes ou les ε et δ viniferine et/ou la production de protéines PR.
17. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisée en ce que les plantes sont choisies parmi la Vigne, les arbres fruitiers, les cultures maraîchères, les céréales et les oléagineux, les protéagineux, le tabac et les plantes ornementales, de préférence la Vigne, la tomate et la pomme de terre.
18. Procédé de traitement des plantes pour la stimulation des défenses naturelles aux agents pathogènes des plantes, caractérisé en ce que l'on applique notamment aux feuilles ou aux fruits ou aux semences ou aux graines, de préférence les feuilles, une quantité efficace d'une composition selon l'une des revendications 1 à 12.
19. Procédé de traitement des plantes selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'on traite les plantes suivantes : la Vigne, les arbres fruitiers, les cultures maraîchères, les céréales, les oléagineux, les protéagineux, le tabac, les plantes ornementales, de préférence la Vigne, la tomate et la pomme de terre.
20. Procédé de traitement des plantes selon l'une quelconque des revendications 18 ou 19, caractérisé en ce que l'on traite des plantes pour lutter contre des pathogènes, de préférence des champignons, de préférence encore Botrytis cinerea, Plasmopara viticola, Eutypa lata, Uncinula necator, Phoma uvicola, Phomopsis viticola, Phaeoacremonium sp, ou Phytophtora sp.
21. Procédé de traitement des plantes selon l'une quelconque des revendications 18 à 20 caractérisé en ce qu'il permet de prévenir ou traiter des maladies de plantes telles que la pourriture grise, l'oïdium, le mildiou, l'excoriose, Black-rot, PEutypiose, ou l'Esca.
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