FR2990327A1 - Extraits de sarments de vigne, compositions les contenant et leur utilisation comme agent anti-pathogene pour les plantes - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un extrait de sarments de vigne ne comprenant pas de resvératrol et ne comprenant pas de viniférine. Elle a également pour objet des extraits de sarments de vigne obtenus par extraction dans le méthanol de sarments de vigne suivi d'un fractionnement par extraction solide/liquide à l'aide de plusieurs éluants consistant respectivement en un mélange eau/méthanol dans une proportion 80/20, 60/40, 40/60 et en du méthanol seul. L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un extrait de sarments de vigne tel que défini ci-dessus ou d'une composition phytopharmaceutique comprenant au moins un extrait tel que défini ci-dessus, pour le traitement préventif et/ou curatif de plantes contre des maladies induites par des agents pathogènes, et en particulier pour le traitement de la vigne contre le mildiou, l'oïdium et/ou la pourriture grise.

Description

EXTRAITS DE SARMENTS DE VIGNE, COMPOSITIONS LES CONTENANT ET LEUR UTILISATION COMME AGENT ANTI-PATHOGENE POUR LES PLANTES La présente invention concerne des extraits de sarments de vigne, des compositions phytopharmaceutiques contenant lesdits extraits, et leur utilisation comme agent antipathogène pour les plantes. Attestées par des évolutions réglementaires en cours, notamment en Europe, les exigences sociétales en matière de gestion et de qualité des productions agricoles créent la nécessité de développer de nouveaux agents antiphytopathogènes à profil toxicologique neutre. Il s'agit de mettre au point et soutenir de nouvelles solutions opérationnelles à caractère inoffensif vis-à-vis de l'applicateur, du consommateur et de l'environnement. Par ailleurs, dans un souci croissant d'économie et de valorisation de toutes les productions agricoles, il est important de mettre en valeur les sous-produits de l'agriculture. Dans la publication Sierra Rayne et al. (Industrial Crops and Products, 27, (2008), 335-340), les stilbènes tels que le trans-resvératrol et la trans-e-viniférine sont extraits de déchets de sarments de raisins provenant de Vitis vinifera, et sont décrits notamment pour leurs propriétés anti-phytopathogènes, telles que par exemple leur activité contre le mildiou de la vigne (Plasmopara viticola) et contre la pourriture grise (Botrytis cinerea). De manière plus générale, il est connu de l'art antérieur que les stilbènes sont des composés phénoliques qui peuvent être trouvés dans différents organes de la vigne, et qui agissent comme composés antifongiques car ils sont synthétisés par la plante en réponse à une attaque de pathogènes. Les stilbènes provenant de la vigne comprennent plusieurs substances telles que le resvératrol (les isomères trans et cis), les glucosides de resvératrol (le polydatine picéïde), les viniférines, le ptérostilbène, l'astringine, l'astringinine (picéatanol), le pallidol et autres trimères et tétramères de resvératrol (Bavaresco L. et al, Drugs Exptl. Clin. Res. XXV (2/3) 57-63 (1999) and XXIX (5/6) 181-187 (2003)). L'un des buts de la présente invention est de proposer de nouveaux composés naturels présentant une activité antiphytopathogène et ce, en valorisant des déchets de l'agriculture. Ainsi, l'invention permet de valoriser les sarments de vigne en extrayant de ceux-ci des composés naturels ayant une activité anti-phytopathogène.

Selon un premier objet, la présente invention porte sur un extrait de sarments de vigne ne comprenant pas de resvératrol et ne comprenant pas de viniférine. Selon un autre objet, la présente invention porte sur un extrait de sarments de vigne obtenu par extraction dans le méthanol de sarments de vigne puis fractionnement par extraction solide/liquide à l'aide d'éluants successifs : eau/méthanol 80/20, eau/méthanol 60/40, eau/méthanol 40/60, et méthanol seul, les porportions étant en volume/volume, chaque fraction pouvant être isolée.

Dans la présente demande, l'extrait obtenu à l'issue du fractionnement à l'aide de l'éluant eau/méthanol 80/20 sera dénommé « fraction 1 » ou « fraction 80 :20 , l'extrait obtenu à l'issue du fractionnement à l'aide de l'éluant eau/méthanol 60/40 sera dénommé « fraction 2 » ou « fraction 60 :40 », celui obtenu à l'issue du fractionnement à l'aide de l'éluant eau/méthanol 40/60 sera dénommé « fraction 3 » ou « fraction 40 :60 » et celui obtenu à l'issue du fractionnement à l'aide de l'éluant méthanol sera dénommé « fraction 4 » ou fraction « 100% méthanol ». L'extrait obtenu à l'issue de l'extraction, c'est-à-dire sans procéder au fractionnement ou le mélange des 5 fractions 1, 2, 3 et 4 sera dénommé « extrait global ». La présente invention porte aussi bien sur un extrait global de sarments de vigne dépourvu de resvératrol et de viniférine que sur chacun des extraits obtenus à l'issue du fractionnement de l'extrait global, plus particulièrement 10 sur la fraction 4. L'extrait de vigne selon l'invention, c'est-à-dire l'extrait global de sarments de vigne dépourvu de resvératrol et de viniférine, ou chacun des extraits obtenus à l'issue du fractionnement de l'extrait global, à 15 l'exception de la fraction 4, comporte au moins un composé choisi dans le groupe consistant en au moins un composé de masse moléculaire 290, 454, 470, 578, 906 g.mo1-1 et leurs mélanges. L'extrait de sarments de vigne selon l'invention peut 20 comprendre différents composés présentant la même masse moléculaire, en particulier, plusieurs composés de masse - moléculaire 290 g.mo1-1 et/ou 906 g.mol1 . Chacun de ces composés peut être isolé. Au sens de la présente invention, un "sarment de vigne" 25 est le rameau de la vigne « aoûté » de l'année, c'est-à-dire lignifié et non plus herbacé, qui est coupé lors du repos hivernal, généralement de novembre à mars, pour permettre un nouveau cycle végétatif de la vigne. Ce rameau, une fois coupé est un déchet agricole. La présente 30 invention permet la valorisation de ce déchet agricole. L'extrait de l'invention provient des sarments de n'importe quel type de vigne. Selon un mode de réalisation particulier, chaque extrait est un extrait de sarments de vigne de la famille des Vitaceae, de préférence du genre Vitis, et plus préférentiellement encore de l'espèce Vitis vinifera ou Vitis labrusca. Selon un mode de réalisation particulier de 5 l'invention, l'extrait tel que défini ci-dessus, ne comprenant pas de resvératrol et ne comprenant pas de viniférine, est choisi dans le groupe comprenant un extrait dans le méthanol, l'éthanol, le propanol, l'isopropanol, le butanol, l'acétate d'éthyle, l'eau, l'acétonitrile et leurs 10 mélanges, et est de préférence un extrait de méthanol. Un tel extrait selon l'invention peut être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes : - éventuellement séchage de sarments de vigne ; - broyage de sarments de vigne éventuellement séchés, 15 - macération du broyat de sarments a l'aide d'un solvant choisi dans le groupe comprenant méthanol, éthanol, propanol, isopropanol, butanol, acétate d'éthyle, eau, acétonitrile et leurs mélanges, - filtrage afin d'obtenir d'un extrait. 20 Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le solvant choisi pour la macération est de préférence le méthanol. Dans la première étape de broyage, on peut utiliser un seul type de sarments de vignes ou un mélange de différents 25 types de sarments. Le broyage peut être conduit jusqu'à l'obtention de copeaux, ou de morceaux de très petites tailles, de préférence jusqu'à l'obtention d'une poudre. L'étape de macération peut également être remplacée par une étape de sonication et/ou traitement aux micro-ondes du 30 broyat de sarments de vigne, à l'aide d'eau comme solvant. L'extrait obtenu à l'issue de la filtration peut être séché, et ce notamment lorsqu'il est destiné à être utilisé sous forme sèche ou à entrer dans des compositions sèches.

Les méthodes de séchages sont celles classiquement utilisées qui permettent l'élimination du solvant sans dénaturation des molécules actives présentes. Lorsque l'extrait obtenu selon le procédé précédemment 5 décrit est séché, il peut en outre être soumis au traitement suivant: - une re-solubilisation, de préférence dans de l'eau, puis - une lyophilisation afin d'obtenir un extrait sec. Selon un autre mode de réalisation avantageux, le 10 procédé comprend : - éventuellement séchage de sarments de vigne ; - broyage de sarments de vigne éventuellement séchés, - macération du broyat de sarments à l'aide de méthanol ou sonication et/ou traitement aux micro-ondes du broyat de 15 sarments de vigne à l'aide d'eau comme solvant, - filtrage afin d'obtenir un extrait, - fractionnement par extraction solide/liquide à l'aide des diluants suivants eau/méthanol 80/20 (v/v), eau/méthanol 60/40 (v/v), eau/méthanol 40/60 (v/v), et 20 méthanol seul, - récupération des fractions séparées. Après l'étape de filtrage de l'extrait et avant l'étape de fractionnement, le procédé peut comprendre les étapes suivantes de séchage de l'extrait, re-solubilisation de 25 l'extrait sec, puis lyophilisation afin d'obtenir un extrait sec. Chacune des fractions séparées peut ensuite être séchée et éventuellement lyophilisée. Selon un autre objet, la présente invention porte sur 30 une composition phytopharmaceutique comprenant au moins un extrait tel que décrit précédemment et au moins un agent de formulation compatible.

Cette composition phytopharmaceutique peut être sous forme sèche, par exemple sous forme de poudre ou sous forme de granules, ou bien sous forme liquide, par exemple sous forme de suspension, de dispersion concentrée ou non, de gel, etc. L'agent de formulation est un agent naturel ou issu de la chimie de synthèse, et classiquement utilisé dans des compositions phytopharmaceutiques. De façon avantageuse, l'agent de formulation sera compatible avec une utilisation en agriculture biologique. A titre d'exemple d'agent de formulation pouvant être mis en oeuvre dans une composition selon l'invention, on peut citer les dispersants, les stabilisants, les tensioactifs, les conservateurs, les agents mouillants, les agents d'adhésion, les tampons, les régulateurs de pH, etc. Ils peuvent être utilisés seuls ou en mélanges. Selon un mode réalisation particulier de l'invention, la composition phytopharmaceutique telle que décrite ci-dessus peut comprendre en outre un agent anti- phytopathogène choisi dans le groupe comprenant un agent fongicide, un agent antibactérien, un agent biopesticide, un agent de biocontrôle et leurs mélanges, en vue de son application simultanée, séquentielle ou en alternance. L'agent fongicide peut être un agent multi-sites ou à 25 site d'action unique. Ledit agent fongicide, antibactérien, biopesticide et/ou de biocontrôle peut être d'origine naturelle ou synthétique et peut être choisi dans le groupe comprenant : - celui (ou ceux) contenu(s) au sein de préparations 30 phytopharmaceutiques commercialisées, - un (ou plusieurs) autre(s) extrait(s) de sarment de vigne, différent(s) de ceux de l'invention, - un (ou plusieurs) composé(s) isolé(s) d'au moins un extrait selon l'invention, tel(s) que défini(s) ci- dessus, - un extrait de rhubarbe palmée (Rheum palmatum), un extrait de bourdaine (Frangula alnus), un extrait d'artémisia (Artemisia annua), un extrait d'Epilobes (Epilobium sp.), un extrait de Millepertuis (Hypericum sp.), un extrait d'Aloé (Aloe vera), un extrait de Citronnier épineux (Poncirus sp.), et leurs mélanges. L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un extrait de sarment de vigne tel que décrit ci-dessus ou d'une composition phytopharmaceutique telle que décrite ci-dessus, pour le traitement préventif et/ou curatif de plantes vis-à-vis d'agents pathogènes, notamment fongiques ou bactériens. L'invention porte également sur un procédé de traitement préventif et/ou curatif de plantes contre les agents pathogènes, notamment fongiques ou bactériens, comprenant l'application sur au moins une partie de la plante d'au moins un extrait de sarment de vigne tel que décrit ci-dessus ou d'une composition phytopharmaceutique telle que décrite ci-dessus. L'utilisation telle que décrite ci-dessus et le procédé de traitement préventif et/ou curatif de plantes tel que décrit ci-dessus sont destinés à tous les types de plantes, notamment aux plantes cultivées pour leur utilisation directe ou après transformation dans l'industrie alimentaire. A titre d'exemple de plantes, on pourra citer les plantes ornementales, maraîchères, les arbres fruitiers, les petits fruits, les grandes cultures, les baies et leurs mélanges, et de préférence la vigne ou les céréales.

A titre d'exemples de plantes ornementales on pourra citer les rosiers, les tuya, le gazon, les graminées et les oeillets. A titre d'exemples de plantes maraîchères on pourra 5 citer les pomme-de-terres, les tomates, les concombres, le melon, les asperges et la salade. A titre d'exemples d'arbres fruitiers on pourra citer les pommiers, les poiriers, les cerisiers, les pêchers, les abricotiers et les pruniers. 10 A titre d'exemples de petits fruits et baies on pourra citer la vigne, les fraisiers, les framboisiers, les mûriers, les cassissiers et les groseillers. A titre d'exemples de grandes cultures on pourra citer les céréales, le colza, le tournesol, le soja et les 15 betteraves. L'utilisation telle que décrite ci-dessus ou le procédé de traitement de l'invention tel que décrit ci-dessus permettent le traitement préventif et/ou curatif des plantes contre une maladie choisie dans le groupe 20 comprenant les maladies de la vigne, de la salade et des céréales. A titre d'exemples de maladies de la vigne, on pourra citer le mildiou (Plasmopara viticola), l'oïdium (Erysiphe necator) et/ou la pourriture grise (Botrytis cinerea). 25 A titre d'exemples de maladies de la salade, on pourra citer le bremia de la laitue. A titre d'exemples de maladie de céréales, on pourra citer la fusariose du blé, de l'orge ou de l'avoine, ou la septoriose du blé. 30 Un extrait ou la composition selon l'invention peut être appliqué selon différents protocoles ou programmes de traitement. Dans un mode de réalisation préféré, l'extrait ou la composition selon l'invention est appliqué par pulvérisation, notamment pulvérisation foliaire ou par absorption racinaire. Lorsque la composition comprend un second agent anti-phytopathogène, les deux agents peuvent être appliqués en combinaison c'est-à-dire simultanément, ou bien peuvent être appliqués successivement OU séquentiellement, c'est-à-dire selon des programmes particuliers d'application en extemporané. L'invention sera mieux comprise à la lumière des exemples non limitatifs et purement illustratifs suivants.

Les figures 1 à 5 permettent d'illustrer lesdits exemples ci-dessous. La figure la) représente le chromatogramme HPLC d'un extrait méthanolique global de sarments de Vitis vinifera (selon un gradient 10% à 100% de méthanol durant 60 min) 15 tel qu'obtenu à l'exemple 1 et caractérisé selon l'exemple 2. La figure lb) représente les spectres d'absorption de chacun des 10 composés majoritaires de l'extrait méthanolique global de sarments de Vitis vinifera. La figure 2 est une comparaison entre le chromatogramme 20 HPLC de l'extrait méthanolique global de sarments de Vitis vinifera et celui de chacune des fractions 1 à 4 telles qu'obtenues à l'exemple 3. La figure 3 représente le nombre de zoospores mobiles de Plasmopara viticola (mildiou de la vigne) en présence de 25 solutions comprenant 1 mg.m1-1 : - de l'extrait méthanolique global de sarments de Vitis vinifera tel qu'obtenu à l'exemple 1, - des 4 fractions de cet extrait telles qu'obtenues à l'exemple 3 et, 30 - de produits phytosanitaires de référence, à différents temps d'incubation. La figure 4 représente le taux de germination des conidies de Erysiphe necator (oïdium de la vigne) après 48 h d'incubation en présence de solutions comprenant 1 mg.m1-1 : - de l'extrait méthanolique global de sarments de Vitis vinifera tel qu'obtenu à l'exemple 1, - des 4 fractions de cet extrait telles qu'obtenues à l'exemple 3 et, - de produits phytosanitaires de référence. - La figure 5 représente le développement mycélien des conidies de Botrytis cinerea (pourriture grise de la vigne) après 5 jours d'incubation : - de l'extrait méthanolique global de sarments de Vitis vinifera tel qu'obtenu à l'exemple 1, - des 4 fractions de cet extrait telles qu'obtenues à l'exemple 3 - de produits phytosanitaires de référence, à différentes concentrations. Exemple 1 Préparation d'un extrait méthanolique global de 20 sarments de Vitis vinifera Le matériel végétal de départ consiste en un fagot de sarments (rameaux aoutés) de Vitis vinifera (cv. Pinot Noir, Gamaret, Gamay, IRAC 2091 (croisement Gamaret x 25 Bronner)). Les sarments ont été placés dans une étuve à 35°C durant 48 h. Une fois séchés, environ 2 à 3 kg de sarments ont été coupés en section de 2 à 3 cm de long puis moulus finement 30 jusqu'à l'obtention d'une poudre dont le diamètre des grains est inférieur à 1 mm. La poudre de sarments de Vitis vinifera ainsi obtenue est macérée pendant 3 h dans du méthanol sous agitation constante. La solution ainsi obtenue est ensuite filtrée sous vide (papier filtre Schleichel n°604) et l'extrait obtenu est séché dans un évaporateur sous vide. L'extrait sec a été resolubilisé dans de l'eau 5 distillée puis lyophilisé et stocké à température ambiante dans l'obscurité. Exemple 2 Caractérisation chimique de l'extrait méthanolique 10 global préparé selon l'exemple 1 mg de l'extrait méthanolique sec lyophilisé obtenu selon l'exemple 1 ont été mis en solution dans 1 ml d'eau ultrapure contenant 0,002% d'acide formique. La solution a 15 été agitée puis filtrée (0,45 pm) avant d'être injectée (injection 10 iig) dans un système HPLC-MS (chromatographie liquide haute performance couplée à une spectroscopie de masse) dans les conditions suivantes: - solvants de migration : eau ultrapure (0.002% acide 20 formique) et méthanol (0.002% acide formique) ; - colonne : X-Bridges (C18), flux 1 ml min-1 dans un gradient 10 à 60% de méthanol entre l'injection et 50 min, puis 60 à 100% de méthanol. La détection de masse a été réalisée par ionisation par 25 électronébulisateur en mode négatif (détection UV 217 nm + ESI neg (figure 1)). Dix composés ou mélange de composés majoritaires sont obtenus dont les temps de rétention et les masses moléculaires sont représentées dans le tableau 1 ci-30 dessous.

Tableau 1 N° pic Temps de Masse rétention moléculaire 1 10.065 non définie 2 11.099 578 3 14.272 290 4 20.480 290 23.555 470 6 26.479 906 7 28.244 906 8 34.370 906 9 41.719 454 47.354 906 Ainsi, parmi les 10 composés majoritaires quantitativement, la masse moléculaire d'un de ces composés 5 n'a pu être définie, deux composés différents présentent une masse moléculaire de 290 g.mo1-1, un composé présente une masse moléculaire de 454 g.mo1-1, un composé présente une masse moléculaire de 470 g.mo1-1, un composé présente une masse moléculaire de 578 g.mo1-1, et quatre composés 10 différents présentent une masse moléculaire de 906 g.mo1-1. Exemple 3 : Préparation de 4 fractions à partir de l'extrait méthanolique global L'extrait obtenu à l'exemple 1, est mis en solution 15 dans l'eau pure à une concentration de 1 mg.m1-1. L'extrait global est fractionné en quatre fractions selon polarité croissante par une extraction solide/liquide sur colonne de silice (Zeochem Silicagel Ze0 prep60 C18 1525 micromètres). Les éluants sont un mélange en différentes 20 proportions d'eau et de méthanol ou uniquement du méthanol, à savoir : - H20:méthanol = 80:20 (v/v), pour la fraction 1 - H20:méthanol = 60:40 (v/v), pour la fraction 2 - H20:méthanol = 40:60 (v/v), pour la fraction 3 - 100% méthanol pour la fraction 4.

Exemple 4 Action fongicide contre le mildiou de la vigne (Plasmopara viticola) Une suspension aqueuse de sporanges de Plasmopara viticola est incubée durant une heure à température ambiante sous agitation, afin de permettre la libération des zoospores. La concentration de sporanges est ajustée à 1x105 m1-1.

Une fois la mobilité des zoospores confirmée par observation microscopique, la suspension est répartie à raison de 1 ml, dans des tubes eppendorf de 2 ml, contenant 1 mg de l'extrait méthanolique brut de Vitis vinifera sec lyophilisé obtenu selon l'exemple 1, et incubée dans un agitateur orbital à 20°C et 60 tpm. La mobilité des zoospores est évaluée 30 min, 1h, 1h30 et 3h00 après mise en contact avec l'extrait de Vitis vinifera (figure 3). Pour cela, 10 pl de la suspension sont prélevés et déposés dans un hémacytomètre Kova (Hycor), dans lequel trois lectures de mobilité de zoospores sont réalisées, à savoir le nombre de zoospores mobiles dans 0,3 pl de suspension. Ce nombre de zoospores mobiles est comparé à deux types 30 de témoins : - un témoin positif (eau distillée sans extrait) et deux témoins négatifs (fongicides de référence : le produit Melody Combi de Bayer [56,25% de folpet et 9 % d'iprovalicarbe] et le Cuivre 50 d'Intertoresa [50% d'oxychlorure de cuivre]). Afin de valider les résultats d'activité obtenus sur la mobilité des zoospores, 10 gouttes de 20 pl de suspension 5 restante de zoospores sont déposées sur des feuilles détachées de Vitis vinifera cv. Chasselas (feuilles n° 3 et 4 à partir de l'apex de boutures élevées en serre, disposées dans une boîte de Pétri de 24 x 24 cm contenant un papier filtre humide, à raison de 4 feuilles par boîte 10 et par traitement). Les boîtes sont incubées durant 24h à l'obscurité puis aux conditions de température, d'hygrométrie et de photopériode optimales pour le développement du champignon pathogène. La sporulation est évaluée 7 jours après inoculation, 15 en quantifiant le nombre de dépôts sporulants. On procède de même en utilisant chacune des fractions 1 à 4 obtenues à l'exemple 3, à la place de l'extrait de l'exemple 1. Résultats 20 L'extrait méthanolique de sarment de vigne V. Vinifera tel qu'obtenu à l'exemple 1 permet une inhibition de la mobilité des zoospores identique à celle de fongicides de référence, qui apparaît dès la mise en contact de l'extrait avec la suspension de zoospores (figure 3). 25 Cette activité se confirme par l'absence de développement du pathogène, lorsque la suspension de zoospores, mise en contact avec l'extrait de l'invention, est déposée sur des jeunes feuilles de Vitis vinifera cv. Chasselas, réceptives à l'infection. Aucune sporulation 30 n'est observée lorsque la suspension de zoospores a été mise en présence de l'extrait étudié, tandis que toutes les zones de dépôt de la suspension de zoospores sans traitement présentent une sporulation abondante.

De la même façon, les 4 fractions sont chacune active contre le mildiou (figure 3). Exemple 5 Action fongicide contre l'oïdium de la vigne (Erysipàe necator) L'objectif de ce biotest est d'incorporer l'extrait méthanolique de Vitis vinifera obtenu selon l'exemple 1 dans un milieu gélose, sur lequel des conidies d'oïdium vont être déposées et leur taux de germination évalué (figure 4). En conditions axéniques, une quantité d'extrait selon l'invention est pesée, tenant compte d'un facteur de 15 dilution inhérent à la préparation du milieu de culture, afin d'obtenir une concentration finale de 1 mg.m1-1. L'extrait est placé dans un tube Falcon stérile de 15 ml, dans lequel sont ajoutés successivement du milieu de culture Potato Dextrose Broth, puis du Potato Dextrose 20 Agar, à raison d'un ratio quantitatif 7:3. La solution est fortement agitée entre chaque étape pour assurer une bonne solubilité de l'extrait. La solution est distribuée dans trois boîtes de Petri (diamètre 3.5 cm) et solidifiée. 25 Deux témoins sont préparés selon la même méthode : un témoin positif (milieu sans extrait) et un témoin négatif (fongicide de référence : Thiovit Jet de Syngenta [80% de soufre]). L'inoculum est constitué de conidies récoltées sur des 30 feuilles préalablement infectées. Les boîtes de Petri contenant les différents traitements sont réparties aléatoirement dans une tour d'inoculation. Les feuilles présentant des sporulations sont soufflées par une pompe à air, afin que les conidies se déposent de manière homogène dans les boîtes de Petri. Les boîtes sont ensuite scellées par du Parafilm et incubées aux conditions de température, d'hygrométrie et de photopériodes optimales pour le développement du champignon pathogène. La lecture du taux de germination s'effectue 48h après l'inoculation des boîtes de Petri, par comptage de 200 conidies par traitement. On procède de même en utilisant chacune des fractions 1 10 à 4 obtenues à l'exemple 3, à la place de l'extrait de l'exemple 1. Résultats L'extrait méthanolique de sarment de vigne permet d'inhiber significativement la germination et le 15 développement de l'oïdium (figure 4). Seule la fraction 4 est également active contre l'oïdium (figure 4). Exemple 6 20 Action fongicide contre la pourriture grise de la vigne (Botrytis cinerea) L'objectif de ce biotest est d'incorporer l'extrait méthanolique de Vitis vinifera obtenu selon l'exemple 1 25 dans un milieu gélose dans une microplaque, sur lequel une suspension de conidies de Botrytis va être déposée et le développement du champignon évalué (figure 5). En conditions axéniques, une quantité d'extrait est pesée, tenant compte d'un facteur de dilution inhérent à la 30 préparation du milieu de culture, afin d'obtenir une concentration finale de 10 mg m1-1. L'extrait méthanolique est placé dans un tube eppendorf stérile de 2 ml, dans lequel est ajouté du milieu de culture Potato Dextrose Broth. La solution est fortement agitée entre chaque étape pour assurer une bonne solubilité de l'extrait. Des séries de dilution sont réalisées à partir de la solution mère, allant de 10 mg.m1-1 à 10-4 mg.m1-1. Chaque concentration de l'extrait est déposé individuellement dans un puits de la microplaque, auquel est ajouté un milieu de Potato Dextrose Agar, enfin d'obtenir un ratio quantitatif 7:3 (PDB:PDA).

Deux témoins sont préparés selon la même méthode : un témoin positif (milieu sans extrait) et un témoin négatif (fongicide de référence : Switch de Syngenta [37,5 % de cyprodinil et 25 % de fludioxonil]. L'inoculum est constitué de conidies issues de culture sporulante de B. cinerea cultivée sur milieu PDA, récoltées et conservées à -80°C. Ces conidies sont mises en solution dans 1 ml d'eau déminéralisée stérile dans un tube Eppendorf stérile. La densité de conidies est évaluée microscopiquement par l'utilisation d'un hémacytomètre Kova (Hycor) et ajustée à 1x105 conidies m1-1. Dix microlitres de suspension sont distribués dans chaque puits. La plaque est scellée par du Parafilm et incubée aux conditions de température, d'hygrométrie et de photopériodes optimales pour le développement du champignon pathogène.

Le développement du champignon est évalué 5 jours après inoculation, par présence ou absence de mycelium au sein du puits (figure 5). On procède de même en utilisant chacune des fractions 1 4 obtenues à l'exemple 3, à la place de l'extrait de l'exemple 1. Résultats Une concentration de 10 mg m1-1 ou de 5 mg m1-1 de l'extrait méthanolique global de sarments de Vitis vinifera permet une inhibition du développement de B. cinerea. Les concentrations inférieures (1 mg à 10-3 mg m1-1-) présentent un développement mycélien (figure 5). Ceci est également le cas pour les fractions 2 à 4.

5 Concernant la fraction 1, seule une concentration de 10 mg m1-1- permet une inhibition du développement de B. cinerea (figure 5).

Claims (12)

1. REVENDICATIONS1. Extrait de sarments de vigne ne comprenant pas de resvératrol et ne comprenant pas de viniférine. 5
2. 2. Extrait de sarments de vigne obtenus par extraction dans le méthanol de sarments de vigne puis fractionnement par extraction solide/liquide à l'aide d'éluants successifs : eau/méthanol 80/20, eau/méthanol 60/40 eau/méthanol 40/60, 10 et méthanol seul, les proportions étant exprimées en volume/volume, chaque fraction pouvant être isolée.
3. 3. Extrait de sarments de vigne selon la revendication 2, qui correspond à la fraction dans le méthanol pur. 15
4. 4. Extrait de sarments de vigne selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un composé choisi dans le groupe consistant en au moins un composé de masse moléculaire 290, 454, 470, 578, 906 g.mo1-1 et leurs 20 mélanges.
5. 5. Extrait selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, qui est un extrait de sarments de vigne de la famille des Vitaceae, de préférence du genre Viti, et plus 25 préférentiellement encore de l'espèce Vitis vinifera ou Vitis labrusca.
6. 6. Composition phytopharmaceutique comprenant : - au moins un extrait tel que défini à l'une quelconque des 30 revendications 1 à 5, - au moins un agent de formulation compatible.
7. 7. Composition selon la revendication 6, comprenant en outre un agent anti-phytopathogène choisi dans le groupecomprenant un agent fongicide, un agent antibactérien, un agent biopesticide, un agent de biocontrôle et leurs mélanges, en vue de son application simultanée, séquentielle ou en alternance.
8. 8. Utilisation d'au moins un extrait tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou d'une composition selon la revendication 6 ou 7, pour le traitement préventif et/ou curatif de plantes vis-à-vis d'agents pathogènes, notamment fongiques ou bactériens.
9. 9. Procédé de traitement préventif et/ou curatif de plantes contre les agents pathogènes, notamment fongiques ou bactériens, comprenant l'application sur au moins une partie de la plante d'au moins un extrait tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou d'une composition selon la revendication 6 ou 7.
10. 10. Utilisation selon la revendication 8 ou procédé de traitement préventif et/ou curatif selon la revendication 9, dans laquelle ou lequel la plante est choisie parmi les plantes ornementales, maraîchères, les arbres fruitiers, les petits fruits, les grandes cultures, les baies et leurs mélanges, et est de préférence la vigne, la salade ou les céréales.
11. 11. Utilisation selon la revendication 8 ou procédé de traitement préventif et/ou curatif selon la revendication 9, pour le traitement préventif et/ou curatif contre une maladie choisie dans le groupe comprenant les maladies de la vigne, de la salade et des céréales, et de préférence contre le mildiou (Plasmopara viticola), l'oïdium (Erysiphenecator) et/ou la pourriture grise (Botrytis cinerea) de la vigne.
12. 12. Utilisation de l'extrait selon la revendication 3 pour 5 le traitement préventif et/ou curatif de l'oïdium (Erysiphe necator).