FR2700542A1 - Champignons Trichoderma produisant des alkyl-6-delta-lactones capables à la fois de stimuler la croissance des plantes et d'exercer une activité antifongique. - Google Patents

Abstract

Produits nouveaux, d'origines biologique, utilisés pour la protection et la stimulation des cultures végétales. Inocula de champignons filamenteux de genre Trichoderma, utilisables en tant que biostimulants des plantes et biofongicides. Molécules produites par ce champignon, nouvellement détectées comme étant actives contre le développement de pathogènes des cultures. Structures desdits molécules, de type alkyl-6-delta-lactones

Description

La présente invention est relative des aikyl- 6 lactones aptes à la fois à stimuler la croissance et la germination des plantes et à exercer une activité anti-fongique et leurs applications comme agents de stimulation de la croissance et de la germination des plantes et comme agent anti-fongique, ainsi qu'à de nouvelles souches de Trichoderma productrices desdites alkyl-6 lactones et à leur procédé de sélection.

La présente invention est également relative à des procédés d'obtention desdites alkyl-5-8-lactones, soit par extraction à partir desdites souches de Trichoderma, soit par synthèse.

De tels agents, sous forme de compositions appropriées, trouvent également application dans l'enrobage des semences pour une meilleure protection de ces dernières.

La présente invention est également relative à un procédé de production de spores de Trichoderma, aptes à stimuler la croissance et la germination des plantes maraîchères et notamment des cucurbitacées et des solanacées et à exercer une action antifongique efficace vi s-a- vis desdites plantes.

La présente invention est également relative à un procédé de lutte contre les champignons chez lesdites plantes maraîchères.

Il est connu que de nombreuses plantes et leurs semences peuvent être attaquées, lors de la phase de germination et au couis de leur développement, par des champignons qui sont présents dans le sol (Pythium notamment) ou dans l'air (Botrytis, Sclerotinia notámment).

A titre d'exemple, lorsque des plantes sont attaquées par un complexe fongique comprenant plusieurs espèces de Eythium (VAN DER PLATTS et al., 1981,
Monograph of the genus Eythium, Centraalbureau voor schimmelcultures baarn), il en résulte généralement un dépérissement de ces dernières, par pourrissement.

Dans le cas du concombre, par exemple, l'effet pathogène majeur se manifeste par des fontes de semis et des pertes racinaires.

Les cultures, et plus particulièrement les cultures maraîchères représentent un marché économique important, pour lequel une protection efficace vis-à-vis des champignons parasites est recherchée depuis longtemps ; depuis un certain nombre d'années, les recherches se sont focalisées sur les produits d'origine naturelle, en raison de l'impact produit par les défenseurs de l'environnement ; notamment, un certain nombre de Demandes de Brevets décrivent des souches de champignons
Trichoderma aptes à être utilisées comme anti-fongiques contre les champignons parasites du sol.

La Demande de Brevet européen 124 388, au nom des PRODUITS ORGANIQUES DU SANTERRE ORSAN, décrit une souche de Trichoderma harzianum utilisée comme moyen de lutte biologique contre un certain nombre de champignons parasites et notamment Botrytis cinerea (pourriture grise de la vigne), Stereum purpureum (maladie du plomb des arbres fruitiers), Sclerotinia ou Stereum hirsutum. Toutefois, cette souche présente l'inconvénient d'être peu ou pas active vis-à-vis du genre Pythium, qui est l'un des champignons parasites majeurs des plantes maraîchères.

La Demande de Brevet européen 383 201, au nom de BASF AG, décrit une souche de champignon Trichoderma Sp. 35/84 à action fongicide vis-à-vis du Eythium de différents végétaux et notamment vis-à-vis des petits pois, par application sur la graine ou par mélange au sol cette Demande précise que Trichoderma sp. 35084 sous forme de mycélium ou de spores (notamment, en suspension de spores à 108-101 CFU/ml) peut être associé à d'autres composants et notamment à des régulateurs de croissance.

La Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à de nouvelles alkyl-6-8-lactones, notamment pro duites par de nouvelles souches de Trichoderma, qui répondent mieux aux besoins de la pratique agronomique, notamment en ce qu'elles présentent, de manière inattendue, à la fois des propriétés sur la croissance et la germination des plantes et des propriétqs anti-fongiques vis-à-vis au moins des champignons du genre Pythium, ce qui permet, en particulier, de diminuer le coût de pro tection des cultures et d ' d'obtenir de meilleurs rende- ments, tout en diminuant le nombre de manipulations.

La présente invention a pour objet des alkyl 6-3-lactones, caractérisées en ce qu'elles présentent la formule générale

dans laquelle R représente un groupe (CH2)n-CH3 dans lequel n est un nombre entier compris entre 4 et 19, et de préférence entre 5 et 11, lesquelles alkyl-6-6-lactones étant soit sous leur forme énantiomère, soit sous leur forme racémique, présentent à la fois une activité stimulatrice de la germination et de la croissance des plantes maraîchères et-une activité anti-fongique.

De manière préférée, les alkyl-6-8-lactones en
C8 (n=7), en C10 (n=9) et en C12 (n=11) présentent une activité de stimulation de la croissance et de la germination des plantes et une activité anti-Pythium intéressantes.

Lesdites alkyl-6-6-lactones sont produites soit par synthèse chimique, soit par une souche Trichoderma convenable.

Le procédé de préparation desdites alkyl-6-6- lactones par synthèse chimique, est caractérisé en ce que
- l'on fait réagir une cyclopentanone avec de la pyrrolidine, en quantités stoechiométriques, pour obtenir une énamine
- l'on fait réagir ladite énamine avec un halogénure d'alkyle pour obtenir une alkylcyclopentanone
- l'on oxyde ladite alkylcyclopentanone en présence d'un peracide ; puis
- l'on sépare l'alkyl-5-3-lactone obtenue par chromatographie, conformément au Schéma I ci-après

<tb> <SEP> R <SEP> Ro
<tb> I)-H20L <SEP> I <SEP> \ <SEP> ;
<tb> À=0
<tb> <SEP> 2) <SEP> + <SEP> R-Br <SEP> en <SEP> présence
<tb> <SEP> da <SEP> R-Br <SEP> 'n <SEP> CE3C13
<tb> <SEP> de <SEP> CH3Cl3
<tb>
Cyclopentanone Pyrolidine Alkyl Alkyl-6-delta
(0,2 mole) (0,2 mole) cyclopentanone Lactone (500 mg)
(2 g) Schéma
La présente invention a également pour objet des souches de Trichoderma à action anti-fongique, caractérisées en ce qu'elles produisent des alykl-5-#-lactones conformes à l'invention et présentent à la fois une activité de stimulation sur la croissance et la germination des plantes et une activité anti-fongique vis-a-vis dtau moins l'un des champignons suivants : Pythium ultimum
Rhizoctonia solani et Sclerotium rolfsii.

Selon un mode de réalisation avantageux desdites souches, il s'agit d'un Trichoderma harzianum, dé nommé LET 1 par les Inventeurs.

Cette souche a été déposée en date du 9/07/92J sous le n'I-1235auprès de la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.

Selon un autre mode de réalisation avantageux desdites souches, elles sont en outre résistantes vis-àvis d'au moins une substance antifongique, telle qu'un benzimidazolé.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, il s'agit d'un Trichoderma harzianum, dénommé LET 2 par les Inventeurs.

Cette souche a été déposée en date du9/07/92, sous le n'I-1236auprès de la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur.

De telles souches peuvent se présenter sous forme de spores ou de mycélium et présentent, de manière surprenante, à la fois une activité sur la croissance et la germination et une action arti-fongique vis-à-vis des plantes maraîchères, elles produisent en particulier des alkyl-6-8-lactones confor:..es à l'invention, notamment en C6-C20, qui présentent lesdites activités de stimulation de la croissance et de la germination et de protection anti-fongique ; de telles souches ont également la capacité de produire de l'acide indole-3 acétique (.IA) et de l'indole-3-éthanol, uniquement en présence d'un précurseur, tel que le tryptaphane.

De manière avantageuse, le procédé de sélection desdites souches est caractérisé en ce qu'il comprend
A-l'insolement des souches de Trichoderma par:
1. prélèvement de sol, dans un terrain convenable
2. mise en suspension dudit prélèvement dans un milieu aqueux approprié, suivie de dilutions succes sives de ladite suspension
3. croissance des populations de champignons présents dans les différentes dilutions sur un milieu de culture gélosé complémenté, sélectif des Trichoderma à 24 C, pendant 1 à 10 jours et à l'obscurité et sélection des populations homogènes ; puis
4. sélection des souches monosporales issues de la culture réalisée en 3. par une nouvelle série de dilutions successives et isolement par observation au microscope
B - la sélection des souches présentant à la fois une activité de stimulation sur la croissance et la germination des plantes maraîchères et notamment des cucurbitacées et des solanacées et une activité antifongique vis-à-vis d'au moins l'un des champignons parasites suivants :: Eythium ultimum, Rhizoctonia solani et
Sclerotium rolfsii, par l'association des étapes suivantes
5. la croissance d'une souche isolée à l'étape t en milieu liquide (milieu Trichoderma) de type milieu "S", comprenant au moins un sucre, une source d'azote et des éléments minéraux
6. la réalisation d'un test de stimulation comprenant
a. l'ensemencement du filtrat de culture issu de la culture en milieu liquide, obtenu en 5., sur un milieu de culture solide
b. l'ensemencement du milieu obtenu en 6.a.

avec des semences appropriées
c. l'appréciation de la germination et de la croissance desdites semences, sur une période comprise entre 2 et 7 jours
7. la réalisation d'un test anti-Pythium comprenant
a. l'ensemencement du filtrat de culture issu de la culture en milieu liquide, obtenu en 5., sur un milieu de culture solide gélosé enrichi
b. l'ensemencement du milieu obtenu en 7.a.

avec un champignon parasite choisi parmi Eythium ultimum,
Rhizoctonia solani et Sclerotium rolfsii
c. l'appréciation de l'inhibition du développement du champignon parasite sur une période comprise entre 2 et 4 jours
8. la sélection de la souche présentant le meilleur résultat à l'étape 6.c. et à l'étape 7.c..

Conformément à ce procédé, avant l'étape 5.

ci-dessus, ladite souche de Trichoderma est irradiée, aux rayons ultra-violet, pour ltobtention d'une souche résistante aux anti-fongiques de type benzimidazolé.

L'appréciation de l'inhibition du développement du champignon parasite comprend notamment la confrontation directe, l'étude de l'antibiose et le rapport des surfaces entre Trichoderma et Eythium.

De manière inattendue, un tel traitement permet d'obtenir des souches qui présentent à la fois une activité de stimulation de la croissance et de la germination des plantes maraîchères et une activité antifongique, nettement améliorées.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, le milieu de culture gélosé et complémenté de l'étape 2. est un milieu Trichoderma de type milieu "S", comprenant au moins un sucre, une source d'azote et des éléments minéraux et comprenant en outre au moins un antibiotique et un antifongique.

Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé le milieu liquide de l'étape 5. est à un pH inférieur à 7 et comprend avantageusement au moins du saccharose, de l'acide citrique, du Ca (NO3)2, du KNO3, du MgSO4, du KH2P04, du K2HP04. Une telle culture est notamment réalisée à 24 C, à l'obscurité et de préférence sous agitation.

Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta geux de ce procédé, le milieu de culture solide de l'étape 6.a. est à base d'agar.

Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, l'appréciation de la germination et de la croissance desdites semences, à l'étape 6.c. est obtenue par le calcul de l'indice de germination et de l'indice de production de matière sèche, après culture pendant 7 jours à 24 C.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, on sélectionne les souches de Trichoderma qui présentent un indice de germination supérieur à 1 ec un indice de production de matière sèche supérieur à 1, à la fois chez la tomate et le concombre.

Au sens de la présente invention, on entend par
- indice de germination, le rapport pourcentage de germination avec la souche de Trichoderma sélectionnée (dans les conditions précisées ci-dessus)/pourcentage de germination d'un témoin (milieu Trichoderma non ensemencé, par exemple)
- indice de production de matière sèche, le rapport poids sec des plantules produites en présence de la souche de Trichoderma sélectionnée (dans les conditions précisées ci-dessus)/poids de matière sèche des plantules produites en présence du témoin.

La présente invention a également pour objet un procédé de production de spores de Trichoderma d'une souche conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'elles sont obtenues par prélèvement à partir d'une culture réalisée pendant 5 à 10 jours,, à une température comprise entre 20'C et 25 C et à l'obscurité, sur un support solide enrichi en solutions nutritives.

Les solutions nutritives choisies dépendent à la fois du support et de la souche.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé de production de spores, ledit support est un support organique issu de sous-produits agricoles ou industriels.

On peut citer, comme supports organiques particulièrement intéressants, la bagasse, la pulpe de betterave, les organiques de brasserie, les tourteaux déshuilés (cacao, ricin, pépins de raisins) et la rafle de raisin ou de mais.

Lesdites spores, éventuellement lyophilisées, pour une meilleure conservation, peuvent directement être utilisées comme agent de stimulation de la croissance et de la germination des plantes maraîchères et comme inhibiteur du développement des champignons parasites desdites plantes maraîchères, notamment à des concentrations comprises entre 107 et 109 spores par gramme de support de culture desdites plantes maraîchères (substrat).

La présente invention a également pour objet un procédé de production des alkyl-6-8-îactones conformes à l'invention à partir desdites souches de Trichoderma, caractérisé en ce que
- l'on recueille le filtrat de la culture desdites souches en milieu liquide (milieu Trichoderma) de type milieu "S", comprenant au moins un sucre, une source d'azote et des éléments minéraux (tel que défini ci-dessus, à l'étape 5. du procédé de sélection de souches) puis
- en ce que l'on extrait lesdites alkyl-6-6- lactones à partir dudit filtrat par
acidification dudit filtrat à un pH inférieur à 2,3,
extraction par un solvant organique inso luble dans l'eau (chloroforme, acétate d'éthyle, hexane...), puis
évaporation jusqu'à l'obtention d'un résidu contenant lesdites alkyl-6-8-lactones.

En variante, on obtient lesdites alkyl-6-8 lactones conformes à l'invention à partir desdites souches de Trichoderma, cultivées sur un support solide enrichi en solutions nutritives, tel que défini ci-dessus pour le procédé de production de spores, puis
- on prélève un inoculum de spores obtenu à partir de ladite culture et traité par un solvant fragilisant les spores
- on fait subir à la suspension de spores ainsi obtenue, un traitement mécanique approprié, (séchage, broyage..), puis
- on évapore jusqu'à l'obtention d'un extrait sec, contenant lesdites alkyl-6-6-lactones.

On obtient plus particulièrement des C8 et des
C10 alkyi-5-8-lactones, qui se révèlent particulièrement actives.

La présente invention a également pour objet un procédé de lutte contre les champignons parasites, caractérisé en ce que l'on inocule un support de culture de plantes maraîchères approprié avec une composition choisie dans le groupe qui comprend soit 107 à 109 spores d'une souche de Trichoderma conforme à l'invention/g dudit support, soit une composition à base d'alkyl-6-6lactones conformes à l'invention.

De manière avantageuse, ces concentrations en spores vivantes favorisent la germination et la croissance des plantes présentes dans ledit support de culture et permettent une éradication supérieure à 50 % du
Pythium ultimum.

Les concentrations en alkyl-6-8-lactones varient entre 10 et 1 000 ppm, et sont de préférence de l'ordre de 100 ppm.

La présente invention a également pour objet une composition stimulante de la croissance et de la germination des plantes et anti-fongique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une alkyl-6-8-lactone conforme à l'invention, éventuellement associée à tout véhicule ap proprié.

Une telle composition peut être constituée soit d'un filtrat issu d'une culture de Trichoderma en milieu liquide (milieu Trichoderma) de type milieu 'fS", comprenant au moins un sucre, une source d'azote et des éléments minéraux telle que définie ci-dessus, soit d'un extrait de ce filtrat, soit d'alkyl-6-6-lactones obtenus par synthèse, conformément au procédé décrit ci-dessus.

De telles compositions peuvent avantageusement être lyophilisées, pour une utilisation agronomique.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui.va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.

I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Sélection des souches de Trichodelma conformes à l'invention.

I - Isolement des souches
A) Isolement de populations
des prélèvements de sols, de préférence humide, ou de végétaux en décomposition sont réalisés.

Ces prélèvements sont immergés dans de l'eau complémentée de quelques gouttes de surfactant et on agite l'ensemble pendant 20 minutes. On réalise ensuite des dilutions successives de 10 en 10 de ce milieu aqueux de départ.

Chaque dilution est étalée à raison de 5 ml par boîte de
Pétri, sur un milieu gélosé sélectif des Trichoderma (milieu complémenté) préalablement coulé, comprenant notamment 2 g de saccharose, 50 mg d'acide citrique, ainsi que 10 ml de solutions A et B et 5 ml de solutions
C et D ci-après . solution A : Ca(NO3)2 .... 100 g
KNO3 ............... 25 g
H2O 1 000 ml solution B : MgSO4, 7H2O .... 25 g
H2O ............... 1 000 ml . solution C : KH2PO4 ............... 25 g
H2O ............... 1 000 ml solution D : K2HPO4 ............... 25 g
H2O ............... 1 000 ml.

Après autoclavage de l'ensemble, le milieu obtenu est supplémenté en streptomycine (50 mg/1) et en alcool allylique (0,5 ml/1.

Chacun des étalements ainsi constitué est incubé pendant 24 heures à 24 C à l'étuve. Les populations homogènes sont collectées sur les boîtes dont les dilutions permettent d'obtenir 4 à 5 populations au maximum.

Chaque prélèvement est observé au microscope afin de confirmer l'homogénéité morphologique de la population. On repique alors celles-ci sur milieu Trichoderma en tubes à essais et on met ceux-ci en collection.

B) Isolement des clones
on prépare une suspension du matériel à tester à une concentration de 100 spores/ml d'eau distillée stérile.

1 ml de cette suspension est transféré sur un milieu PDA (pomme de terre, dextrose, agar) préparé quelques heures avant. On incube à 24 C pendant 24 heures. On prélève grâce à une observation à la loupe, sous lumière irisée, les premières spores en germination que l'on transfère dans des boîtes de Pétri contenant du milieu PDA à raison d'un prélèvement par boîte. Le procédé est répété 5 à 6 fois à partir de nouvelles suspensions de chaque prélèvement. A la fin de cette procédure, on compare tous les prélèvements uniques en mesurant entre eux : a) leurs vitesses de croissance, b) le temps entre la germination et la sporulation de chacune d'entre eux, c) le temps nécessaire à la germination des spores, d) leurs activités enzymatiques.Chacune de ces données permettent de déterminer des clones différents que l'on répertorie et que l'on met en collection.

C) Mutation des clones
a) des aliquotes de 2 à 3 ml de 105 spores/ml d'eau distillée, de chaque clone sauvage sont étalées de façon homogène sur un milieu V8 de jus de tomate agarisé (200 ml de jus V8, 800 ml d'eau, 1 g de saccharose, 20 g d'agar, 6 ml de NaOH îN). Dix ensemencements sont ainsi préparés. Les boîtes sont ensuite exposées aux ultra-violets pendant 2 heures, la lampe étant placée à 30 cm de la surface de l'agar (lampe U.V. germinative d'intensité de 3200 W/cm2). Après ce traitement, les colonies se développant (de l'ordre d'une dizaine au maximum) sont isolées et mises en culture sur de nouvelles boîtes de
Pétri contenant le milieu V8 agarifié.

b) on recommence ensuite 2 fois la même manipulation qu'en a).

Parmi la vingtaine de colonies ayant subies les 3 séries d'irradiations, une dizaine sont tolérantes à de fortes concentrations de bénomyl (100 à 500 mg/ml) incorporées dans un milieu agar, et conservent l'aptitude au développement. On repique donc ces 10 clones sur le milieu Trichoderma de conservation et on distingue les différents clones en comparant leurs aptitudes physiologiques comme dans B) a), b), c) et d) (isolement des clones).

- Caractéristicues morpholoaiaues de deux clones isolés

<tb> Nom <SEP> de <SEP> souche <SEP> T. <SEP> harzianum <SEP> T. <SEP> harzianum
<tb> <SEP> résistant <SEP> au
<tb> <SEP> bénoyl
<tb> Code <SEP> LET <SEP> 1 <SEP> LET <SEP> 2
<tb> Provenances <SEP> Berres <SEP> l'etang <SEP> Berres <SEP> l'etang
<tb> Aspect <SEP> thalle <SEP> Dense, <SEP> lisse <SEP> Dense, <SEP> lisse
<tb> <SEP> puis <SEP> floconneux <SEP> puis <SEP> floconneux
<tb> Couleur <SEP> conidies <SEP> Vertes <SEP> Blanches <SEP> puis
<tb> <SEP> vertes
<tb> Exsudat <SEP> Vert <SEP> Liquide <SEP> jaune <SEP> d'or
<tb> Couleur <SEP> revers <SEP> Blanche <SEP> Blanche
<tb> Mycélium <SEP> Fragmenté, <SEP> dense <SEP> Fragmenté, <SEP> dense
<tb> Conidies <SEP> Ovoldes <SEP> globu- <SEP> Globuleuses,
<tb> <SEP> leuses <SEP> en <SEP> chaîne <SEP> elliptiques,
<tb> <SEP> ou <SEP> solitaires <SEP> lisses, <SEP> vertes,
<tb> <SEP> groupées
<tb> <SEP> Diamètre <SEP> : <SEP> pin <SEP> Diamètre <SEP> : <SEP> 2 <SEP> pin <SEP>
<tb> Conidiophore <SEP> Ramifié <SEP> à <SEP> 90 <SEP> Ramifié <SEP> à <SEP> 90
<tb> <SEP> Diamètre <SEP> : <SEP> 7-8 <SEP> pin <SEP> Diamètre <SEP> :<SEP> 7-8 <SEP> pin <SEP>
<tb> Têtes <SEP> Incurvées, <SEP> Ampouliformes
<tb> <SEP> ampouliformes
<tb> Pinceaux <SEP> Amas <SEP> de <SEP> spores <SEP> Parois <SEP> épaisses
<tb> Forme <SEP> de
<tb> résistance <SEP> Chlamydospores <SEP> Chlamydospores
<tb>
- Caractéristiques chvsioloaiaues
A) Vitesse de croissance (en mm/h à 24'C) mesurée sur 4 jours

<tb> Milieu <SEP> gélosé <SEP> Trichoderma <SEP> PDA <SEP> MA
<tb> <SEP> LET <SEP> 1 <SEP> 1,27 <SEP> 1,28 <SEP> 1,27
<tb> <SEP> LET <SEP> 2 <SEP> 0,31 <SEP> 0,35 <SEP> 0,36
<tb>
B) Milieu liquide de sporulation optimisé (les concentrations des éléments sont exprimées en g/l)

<SEP> LET <SEP> 1 <SEP> LET <SEP> 2
<tb> <SEP> CaCl2 <SEP> 0,2 <SEP> 0,5
<tb> KH2PO4 <SEP> 2,3 <SEP> 1,7
<tb> SO4(NH4)2 <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> <SEP> Uree <SEP> 0,5 <SEP> 0,5 <SEP> 0,3
<tb> <SEP> Amidon <SEP> 60 <SEP> 43
<tb> <SEP> Température <SEP> 30 <SEP> 23,5
<tb> <SEP> pH <SEP> 5 <SEP> 4
<tb>
II - Stimulation de la croissance des cucurbitacées et des solanacées
A) Matériel et méthode
- Pour l'ensemble des expériences, une gamme de souches ou isolats d'une mycothèque de 1'INRA de
Montpellier ainsi que les deux clones LET 1 et LET 2 tels que définis ci-dessus, ont été cultivés, pendant 10 10 jours, en milieu liquide " Trichoderma" qui correspond à un milieu "S" comprenant 2 g de saccharose, 50 mg d'acide citrique, ainsi que 10 ml de solutions A et B et 5 ml de solutions C et D ci-après - solution A : Ca(NO3)2 ...... 100 g
KNO3 ............... 25 g
H2O .............. 1 000 ml . solution B :MgSO4, 7H2O ... 25 g
H2O ............. 1 000 ml . solution C : KH2PO4 .......... 25 g
H2O ......... 1 000 ml . solution D : K2HPO4 .............. 25 g
H2O ............. 1 000 ml
Le milieu peut, en outre, être supplémenté en CaC12 (1 g), pour favoriser la sporulation.

On autoclave l'ensemble, deux fois à 120C pendant 30 minutes.

On prend comme témoin, un milieu "Trichoderma" liquide, tel que défini ci-dessus, non ensemencé et de l'eau distillée.

Des semences de tomates et de concombres sont stérilisées par trempage dans une solution d'hypochlorite de sodium 0,5. %, rincées deux fois à l'eau distillée, puis séchées.

Cinq millilitres de filtrat de culture (filtre de 0,45 micromètre) de chaque souche ou isolat, ou témoin, sont préalablement déposés sur un milieu agar 2 % solidifié, en boîte de Pétri. On répète 4 fois les essais. On note après 7 jours de culture à l'étuve à 24 C, et à l'obscurité, pour chaque essai et chaque espèce
- le pourcentage de germination,
- le poids sec final des plantules, obtenu par séchage à l'étuve à 50'C pendant 3 jours.

B) Résultats
Les résultats sont présentés dans le Tableau I ci-dessous, dans lequel les clones LET 1 et LET 2 sont comparés aux souches ou isolats de la mycothèque INRA.

Le Tableau I illustre l'action stimulante de différentes souches de Trichoderma sur des semis de tomates et concombres (moyenne de deux indices de germination)
TABLEAU I
Clones moyenne des indices
ABT 1,18
Jîl 1,16
LET 2 1,159
BR105 1,15
QJ 1,07
AGI 1, 07
LET 1 1,06
RL 1,06
RF 1,
LR 1,04
ABI 1
ABJ -1 * moyenne de 10 répétitions.

III - activité anti-Pvthium ul timum des souches ci-dessus sélectionnées
A) Matériel et méthodes
La méthode utilisée est similaire aux différents travaux antérieurs (BELL et al., Physiopathol., 1982, 72, 4, 379-382 ; LYNCH, Current Microbiol., 1987, 16, 49-53)). On utilise le milieu PDA -comprenant 200 g de bouillon de pomme de terre, 20 g de glucose, 15 g de gélose ; 39 g de ce mélange est dilué dans un litre d'eau distillée et autoclavé à 120-C pendant 30 min.-, comme support de culture dont on utilise 10 ml solidifié, en boîte de Pétri. On dépose deux implants séparés de cinq centimètres l'un étant le pathogène et l'autre le Trichoderma sélectionné. Quatre répétitions sont effectuées pour chaque souche ou isolat de Trichoderma.Le pathogène en plus de sa confrontation au Trichoderma est testé seul afin de connaître la vitesse de croissance témoin. La culture se fait à 20'C à l'étuve et dans l'obscurité. La durée de la manipulation est de 4 jours. On mesure la croissance en mm, des deux champignons, chaque jour en notant la surface respective de chacun. Un système de caméra couplée à un ordinateur permet aisément de mesurer par contraste de phase la surface occupée par chaque pathogène à un temps t. On en retire un rapport de surface : Trichoderma/pathogène, traduisant l'efficacité de l'antagoniste. On note la présence de forte ou de faible antibiose.

B) Résultats
1) vis-à-vis de Eythium ultimum
Le Tableau II fournit le classement du potentiel anti-Eythium ultimum de la même collection des souches ou isolats de Trichoderma en boîte de Pétri sur le milieu PDA et montre bien l'intérêt des souches présélectionnées en II ci-dessus (LET 1 et LET 2), par leur action sur la stimulation de la croissance et de la germination
TABLEAU II
Rapport des surfaces Trichoderma/mycélium P. ultimum
BR105 AF 2,35
BR107 AF 2,025
KZ AM 1,92
LET 1 AF 1,76
LET 2 AF 1,75
B11 AL 1,6
AGI AF 1,30
AGH AM 1,25
AF ; AM ; AL : antibiose forte, moyenne, légère.

2) vis-à-vis d'autres pathogènes (Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii)
Le Tableau III illustre les résultats obtenus et montre que LET 2 est très efficace contre ?ythium ultimum, Rhizoctonia solani et Sclerotium rolfsii et que
LET 1 est aussi efficace que LET 2 alors que les autres souches (ORSAN et ABW) sont inefficaces.

TABLEAU III

<tb> Pythium <SEP> ultimum <SEP> LET <SEP> 2 <SEP> ORSAN <SEP> ABW <SEP> LET <SEP> 1
<tb> Antagonisme <SEP> AF <SEP> I <SEP> I <SEP> AF
<tb> Rapport <SEP> surface
<tb> Tricho/tythium <SEP> 1,75 <SEP> 0,85 <SEP> 0,5 <SEP> 1,76
<tb> Rhizoctonia <SEP> solani
<tb> Antagonisme <SEP> AF <SEP> F <SEP> I <SEP> AF
<tb> Rapport <SEP> surface
<tb> Tricho/Rhizoctonia <SEP> 1,86 <SEP> 0,2 <SEP> 0,51 <SEP> 2,5
<tb> Sclerotium <SEP> rolfsii
<tb> Antagonisme <SEP> AF <SEP> AL <SEP> I <SEP> <SEP> AF
<tb> Rapport <SEP> surface
<tb> Tricho/Sclerotium <SEP> 1,75 <SEP> 1,1 <SEP> 0,8 <SEP> 1,53
<tb>
AF = Antibiose forte ; AL = Antibiose légère
I = Interaction.

EXEMPLE 2 : Production des métabolites (alkyl-6-# lactones) à partir des souches sélectionnées.

1) Conditions d'obtention des filtrats de culture
A partir d'une souche Trichoderma harzianum
LET 2. La culture des souches en milieu liquide (milieu Trichoderma) tel que défini ci-dessus (exemple 1, Il) permet la production desdits métabolites.

De préférence, la culture est réalisée en milieu liquide à pH acide pendant 5 à 7 jours à une température comprise entre 20 C et 30 C, de préférence 24 C, et comprend, comme source d'azote, un acide organique tel que du L-tryptophane ou un azote ammoniacal (pour une bonne production mycélienne), en présence d'un sucre à chaîne de forme pyranosique ou à longue chaîne tel que le saccharose, le lactose ou le mannitol, avec une oxygénation réduite du milieu.

Chaque filtrat est récupéré et filtré sur du papier Whatmann n 1 puis les alkyl-6-6-lactones sont extraites comme suit : on acidifie le milieu liquide à pH 2,5 et on utilise de l'acétate d'éthyle 1/1 (V/V) comme solvant d'extraction ; on chasse le solvant à l'évaporateur rotatif et on récupère un résidu huileux jaunâtre. Si l'on utilise des spores ou des mycélia comme matériel de base, on fragilise ceux-ci avec de l'acétone ; un résidu est obtenu après évaporation de l'acétone. Celui-ci est repris par de l'éther. Après chas sage, le résidu contient les métabolites actifs (alkyl-6-#-lactones).

Il ressort que ce métabolite inhibiteur est produit de façon notable et intense par le Trichoderma en présence de saccharose et de nitrate. De plus, l'oxygénation réduite s'avère plus efficace que l'aérobiose, pour cette production.

2) Caractérisation
Les alkyl-6-6-lactones sont mises en évidence par CCM préparative et analytique à partir des extraits obtenus
Pour la CCM analytique, on utilisera comme éluant l'éther de pétrole/éther éthylique 25/75 (V/V).

Une fois séchée, la plaque sera révélée à l'iode.

Les données de l'analyse spectrale confirment qu'il s'agit de molécules du type alkyl-6-6-lactone l'extrait sec est constitué uniquement de la molécule active alkyl-6-6-lactone ; on a donc une concentration moyenne de métabolite de 200 mg/l. On utilise ces concentrations de produits pour observer.la réponse sur la germination et la stimulation de croissance des plantes ainsi que l'effet contre le Pythium ultimum.

Pour les spectres IR, on utilise du tétrachlorure de carbone "spécial spectrographie comme solvant. La concentration de l'échantillon introduit dans la cuve IR est réglée à poids sec/poids moléculaire pour 0,5 ml de ce solvant.

* Spectres IR
Extraits de LET 1 : 2940 (90 %); 2930 (94 %), 2830 (82 %), 1730 (74 %), 1470 (58 %), 1380 (63 %), 1210 (99 %), 1050 (68 %).

Extraits de LET 2 : 2940 (89 %), 2930 (88 %), 2830 (68 %), 1730 (99 %), 1470 (54 %), 1380 (63 %), 1280 (91 %), 1210 (73 %), 1130 (73 %), 1050 (78 %).

Pou les spectres RMN (figures 1 et 2) et spectres de masse (MS), on assèche complètement les extraits. 10 mg minimum sont nécessaires pour la RMN ainsi que le MS.

* Spectres de Masse (EI : Impact électronique donc valeurs m) ; (FAB ; Fast Atom Bonbardment donc valeurs m+1) :
Extraits de LET 1 (en EI) : m = 52 (75 %), 71 (50 %), 83 (30 %), 98 (100 %), 111 (10 %), 124 (5 %), 133 (5 %), 151 (4 %), 176 (8 %), 194 (15 %), 213/ (35 %), 226 (5 %), 240 (40 %), 296 (3 %).

Extraits de LET 2 (en FAB) : m+1 = 5 (5 %), 72 (95 %), 99 (99 %), 115 (10 %), 165 (10 %), 199 (100 %), 214 (15 %).

Ceci permet d'obtenir à chaque fois, trois produits à des Rf de 0,2, 0,4, 0,6 que l'on récupère pour être testés biologiquement.

3) Activité biologique
A) Test anti-svthium ultimum
- Protocole
on réalise le test sur un milieu PDA tel que défini à l'exemple 1, II. Des concentrations connues (1, 10, 100 et 1 000 ppm) d'extrait biologique sont obtenues en reprenant l'extrait brut au méthanol, par dilutions successives. Après évaporation du méthanol, on teste leur activité anti-fongique
Lesdits extraits biologiques sont solubilisés, et repris dans un milieu "S" tel que défini ci-dessus à l'exemple 1, maintenu au bain-marie à 55 C, puis transvasés à l'aide de pipettes stériles dans le milieu hôte en boîte de Pétri.Une agitation et homogénéisation est pratiquée avant d'ensemencer. 24 heures plus tard, l'ensemble des boîtes est ensemencé d'une pastille de
PDA, défini à l'exemple 1, comprenant le champignon pathogène (?ythiwn ultimum) (on considère ici que les quantités en nombre de propagules sont identiques pour chaque boîte et chaque pathogène).

Une fois inoculées (avec les deux germes
Trichoderma et Pythium ultimum), les boîtes de Pétri sont mises à incuber à 20'C dans une étuve et à l'obscurité pendant 4 jours. Toutes les 24 heures, on mesure la surface des mycélia afin d'en déduire le pourcentage d'inhibition que provoque les extraits par rapport à un témoin. Un système de caméra couplée à un ordinateur permet aisément de mesurer, par contraste de phase, la sur face occupée par chaque pathogène à un temps t, comme précisé à l'exemple 1 ci-dessus.

- Résultats
On répertorie l'ensemble des inhibitions provoquées.

Le Tableau IV montre le pourcentage d'inhibition sur ?ythiuin ultimuin provoqué par trois concentrations d'extraits secs biologiques, chromatographiés en CCM analytique.

TABLEAU IV

<tb> <SEP> Rapport <SEP> frontal= <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0,4 <SEP> Rf <SEP> = <SEP> 0,2
<tb> <SEP> 0,6 <SEP> (C8) <SEP> (C10)
<tb> <SEP> LET <SEP> 1
<tb> 10 <SEP> ppm <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 10 <SEP> % <SEP> 3 <SEP> %
<tb> 100 <SEP> ppm <SEP> 15 <SEP> % <SEP> 20 <SEP> % <SEP> 18 <SEP> %
<tb> 1 <SEP> 000 <SEP> ppm <SEP> 40 <SEP> % <SEP> 100 <SEP> %(1) <SEP> 60 <SEP> %
<tb> <SEP> LET <SEP> 2
<tb> 10 <SEP> ppm <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 0 <SEP> % <SEP> - <SEP> <SEP> 0 <SEP> %
<tb> 100 <SEP> ppm <SEP> 14 <SEP> % <SEP> 21 <SEP> % <SEP> 0 <SEP> %
<tb> 1 <SEP> 000 <SEP> ppm <SEP> 30 <SEP> % <SEP> 100 <SEP> %(2) <SEP> 10 <SEP> %
<tb> (1) seuil à 140 ppm (2) seuil à 150 ppm
B) Tests de stimulation de croissance
- Protocole
Les différentes concentrations d'extrait biologique sont telles qu'obtenues ci-dessus en A.

Les différents extraits ainsi obtenus sont repris dans 5 ml d'eau que l'on additionne d'une goutte de méthanol. Ces 5 ml seront ensuite injectés après filtration sur des milieux agar à 2 % déjà solidifiés dans des boîtes de Pétri, dans les conditions de l'exemple 1, puis on réalise un semis de semences préalablement désinfectées. On note le pourcentage de germination et la production de matière sèche 6 jours après l'ensemencement.

- Résultats
Le Tableau V montre la moyenne de l'indice de germination de semis de tomate et de concombre provoqué par différentes concentrations en composés d'origine biologique.

TABLEAU V

<tb> <SEP> Extraits <SEP> de <SEP> milieu <SEP> Tomates <SEP> Concombres
<tb> <SEP> liquide
<tb> Concentration <SEP> (en <SEP> PPmj <SEP> 1000 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 1000 <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Trichoderma <SEP> LET <SEP> 2 <SEP> lnh <SEP> <SEP> +18 <SEP> <SEP> +5 <SEP> tnn <SEP> +20 <SEP> +8
<tb> Trichoderma <SEP> LET <SEP> 1 <SEP> Inh <SEP> +14 <SEP> o <SEP> Inh <SEP> +18 <SEP> +3
<tb> (3) maximum à 80 ppm
Chaque résultat est la moyenne de quatre tests. L'erreur relative sur chaque mesure est de 5 %.

C'est -entre 80-100 ppm (selon les cultures) que l'on observe la meilleure influence sur la germination. Les extraits de la souche LET 2 sont ici encore, meilleurs que ceux de la souche LET 1. Le maximum d'augmentation de germination est de 15 % et les effets sont similaires sur la tomate et le concombre.

EXEMPLE 3 : Action de Trichoderma : test agronomique.

Ce test correspond à une culture sous serre expérimentale, à petite échelle, avec comme modèles végétaux, la tomate (Solanum lycopersicon, variété Saint
Pierre) et le concombre (Cucumis sativu, variété Le
Généreux) et permet de montrer l'effet bénéfique sur la germination et la croissance des plantes ainsi que l'effet anti-fongique des souches de Trichoderma sélectionnées sur le champignon pathogène pythium ultimum.

Pour l'ensemble des tests, on choisit un substrat organique constitué de tourbe blonde tamisée, mélangée à de la vermiculite. Les proportions sont de 50/50 en (V/V). On autoclave deux fois à 120'C pendant 30 minutes à 24 heures d'intervalle, dans des sacs plastiques prévus à cet effet.

a. Précaration d'un inoculum de spores de Tri choderma à 108 spores/g de substrat sec
L'inoculum de Trichoderma est réalisé en fiole de Roux, milieu comprenant 6 g de farine d'avoine, 30 ml d'eau distillée, 200 g de sable puis autoclavé à 120-C pendant 30 min (2 fois à 48 h d'intervalle). Deux implants de chaque souche, conservés en tube incliné, à 5 C, sur du milieu PDA (exposé à l'exemple 1), sont déposés de manière stérile dans chaque fiole. On récupère l'inoculum 15 jours après culture à l'étuve régulée à 24 C et à l'obscurité.

Pour obtenir la concentration voulue en spores viables (108) par gramme de support de culture, on mélange une quantité adéquate du milieu de fiole de Roux.

On prépare ainsi des pots de culture de 15x15x15 cm.

Cette inoculation interviendra 15 jours avant le semis pour permettre une bonne installation du Trichoderma.

On peut également préparer, à grande échelle, une culture de spores, comme spécifié ci-dessus, sur un support organique enrichi en substances nutritives.

b. Effet sur la croissance :
Le dispositif expérimental comprend seize blocs de quatre pots, pour chaque type d'essai. Chaque bloc est constitué de : 1 pot sans inoculum constituant le témoin, 1 pot inoculé avec une souche choisie pour ses qualités médiocres et deux pots contenant chacun les souches conformes à l'invention. On régule la température (à 26 C), l'hygrométrie ainsi que l'éclairage de la serre. Une solution fertilisante convenable est apportée tous les deux jours en début, et tous les jours, en fin de culture.

Résultats
Le Tableau VI montre l'influence des traitements de substrats organiques sur le pourcentage de germination de tomates (Moyenne de deux essais en 1990 et 1991).

TABLEAU VI

<tb> <SEP> Tomates <SEP> 1991 <SEP> Tomates <SEP> 1990 <SEP> Moyenne <SEP> %
<tb> Témoin <SEP> 71,9 <SEP> b <SEP> 68,8 <SEP> b <SEP> 70,35
<tb> LET <SEP> 2 <SEP> 81,1 <SEP> ab <SEP> 81 <SEP> a <SEP> 82,05 <SEP> +16,63
<tb> LET <SEP> 1 <SEP> 87 <SEP> a <SEP> 89 <SEP> a <SEP> 88 <SEP> +25,08
<tb> a, b et ab définissent des groupes homogènes ou intermédiaires selon un test statistique de Newman Keuls au seuil de 5 %, dans des conditions d'inoculation de supports : tourbe/vermiculite 50/50 (V/V), à la concentration de 108 spores viables par gramme de support, comme précisé ci-dessus.

Le Tableau VII illustre l'influence de traitements de substrats organiques sur le pourcentage de germination de concombres-essai réalisé en 1991.

TABLEAU VII

<tb> Traitement <SEP> Concombres <SEP> 1991
<tb> Témoin <SEP> 75 <SEP> b
<tb> LET <SEP> 2 <SEP> 94,5 <SEP> a <SEP> + <SEP> 26
<tb> LET <SEP> 1 <SEP> 96 <SEP> a <SEP> + <SEP> 28
<tb>
Le Tableau VIII montre l'influence de traitements de substrats organiques sur le poids sec (en mg), par plante au démariage à (J+21) (Essais de 1991 - tomates et concombres. Parties aériennes et racinaires).

TABLEAU VIII

<tb> <SEP> Tomates <SEP> Concombres
<tb> <SEP> Parties <SEP> Racines <SEP> Parties <SEP> Racines
<tb> <SEP> aériennes <SEP> aériennes
<tb> <SEP> (%: <SEP> (%', <SEP> (%)
<tb> Témoin <SEP> 230 <SEP> b <SEP> 60 <SEP> b <SEP> 160 <SEP> b <SEP> 30 <SEP> b
<tb> LET <SEP> 2 <SEP> 370 <SEP> a <SEP> (+61) <SEP> 100a <SEP> (+67) <SEP> 260 <SEP> a <SEP> (+62) <SEP> 73 <SEP> a <SEP> (+143)
<tb> LET <SEP> 1 <SEP> 376 <SEP> a <SEP> (+64) <SEP> 95ab <SEP> (+58) <SEP> 271 <SEP> a <SEP> (+69) <SEP> 62ab <SEP> (+106)
<tb>
Le Tableau IX montre l'influence de traitements de substrats organiques sur le nombre de fleurs produites par plante en fin de culture (J+54) (Moyenne de deux essais en 1990 et 1991. Tomates et concombres).

TABLEAU IX

<tb> <SEP> Tomates <SEP> (%) <SEP> Concombres <SEP> (%)
<tb> Témoin <SEP> 3,14 <SEP> b <SEP> 1,13 <SEP> b
<tb> LET <SEP> 2 <SEP> 5,06 <SEP> a <SEP> (+ <SEP> 69) <SEP> 3,82 <SEP> a <SEP> (+ <SEP> 238)
<tb> LET <SEP> 1 <SEP> 4,39 <SEP> ab <SEP> (+ <SEP> 39) <SEP> 3,19 <SEP> a <SEP> (+ <SEP> 182)
<tb>
* Pour les essais "tomate" :
On a un effet statistiquement significatif du traitement avec LET 1 et LET 2
de façon importante
- sur le pourcentage de germination (Tableau
VI)
- sur le poids frais et sec au démariage (Tableau VIII) ;
- sur la production en nombre de fleurs par plante (Tableau IX)
- de façon moyenne sur la production en matière sèche des parties aériennes en fin de culture.

* Pour les essais concombres
Le pourcentage de germination est influencé positivement par la présence d'inoculum de Trichoderma.

La souche LET 1 donne les résultats les plus significatifs.

Le poids sec au démariage est stimulé nettement par LET 2 et LET 1. Ceci est très net sur l'élongation racinaire. On peut constater que sur cette réponse, le résultat est meilleur que sur les semences de tomates.

c. Activité anti-nvthium :
On prend pour tous les tests, un Pythium ul timum (code 159) de la mycothèque de 1'I.N.R.A.

Montpellier. Celui-ci est cultivé sur un milieu spécifique à base de farine de mais en boîte de Pétri.

On désire une concentration de 250 propagules par gramme de substrat, on inocule par enfouissement, à 2 cm de la surface du substrat de chaque pot. Le semis est réalisé avec des graines commerciales (Variété Long pour les concombres uniquement). Le semis se fait dans les mêmes conditions que pour la stimulation de croissance.

Le dispositif expérimental comprend seize blocs de cinq pots, pour chaque type d'essai. Chaque bloc est constitué de : un pot sans inoculum constituant le témoin, 1 pot inoculé de P. ultimum uniquement, un pot inoculé avec une souche choisie pour ses qualités médiocres et deux pots contenant chacun les souches conformes à l'invention. Ces trois derniers pots sont coinoculés avec du P. ultimum Résultats
Le Tableau X montre l'influence de traitements de substrats organiques pré-inoculés par P. ultimum sur le pourcentage de germination et le nombre de fleurs produites par plante de concombre, en fin de culture à (J+54) (Essais en 1991).

TABLEAU X

<tb> <SEP> p <SEP> centage <SEP> de <SEP> germination <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> fleurs <SEP> par <SEP> plante
<tb> <SEP> (% <SEP> N 1) <SEP> (%N 2) <SEP> (% <SEP> N 1) <SEP> (%N 2)
<tb> émoin <SEP> 75 <SEP> a <SEP> 1,05 <SEP> a
<tb> lithium <SEP> ultimum <SEP> 18,4 <SEP> d <SEP> (24.5) <SEP> lii <SEP> a
<tb> ABW <SEP> + <SEP> P. <SEP> ultimum <SEP> 18,8 <SEP> dc <SEP> (25) <SEP> 1,40 <SEP> ab <SEP> (+27) <SEP> (+33)
<tb> LET2 <SEP> + <SEP> P. <SEP> ult. <SEP> 17,6 <SEP> b <SEP> (+159) <SEP> (63,4) <SEP> 2,81 <SEP> bc <SEP> (+155) <SEP> (+168)
<tb>
Le pourcentage n 1 de la colonne "p centage de germination11, exprime l'augmentation de ce dernier, provoqué par les co-inoculations par rapport à l'inoculation de P. ultimum seul.Le pourcentage n 2 représente le taux de germination induit par chaque traitement, rapporté aux résultats du témoin.

Le pourcentage n 1 et 2 de la colonne "Nbe de fleurs" exprime l'augmentation de ce dernier, provoqué par les co-inoculations, par rapport, dans l'ordre, à l'inoculation de P; ultimum seul et au témoin.

* Pour les essais "concombres" (Tableau X)
Le Tableau X montre un effet très significatif des traitements, concernant le pourcentage de germination et le nombre de fleurs produites par plante saine, en fin de culture.

EXEMPLE 4 : Autre exemple de tests agronomiques.

A) Essai de germination sur poivrons
* Matériel
Matériel hôte : graines de poivrons semées dans des bacs à germination sur un substrat à base de terreau.

* Produits
Deux produits sont testés :
le carbamate à une dose de matière active (m.a.) égale à 10,11 g/m2 utilisée contre les champignons telluriques,
LET 2 tel que défini ci-dessus.

* Méthode
Les graines de poivrons sont semées dans les bacs et reçoivent au moment du semis, le traitement prévu selon 4 types d'essai. Elles sont ensuite placées dans des étuves à 30'C.

* Dispositif
On dispose de 4 types d'essai comprenant 50 graines chacun. Les semis sont réalisés dans deux bacs différents. Chaque bac comprend deux types d'essai différents, les terreaux étant bien isolés les uns des autres.

Les 4 types d'essai sont
(1) LET 2 à 5.109 spores/m2
(2) Prévicure (à 10,11 g de m.a./m2)
(3) LET 2 + Prévicure (5.109 spores/m2 +
10,11 g/m2)
(4) Témoin.

Les produits sont appliqués à l'aide d'un pulvérisateur à main et bien mélangés au terreau.

* Notation
- pourcentage de levée des semences : depuis le semis jusqu'à J+20) et à 20 jours (après le semis),
- mesure des longueurs racinaires (moyenne par modalité),
- poids moyen de matière fraîche pour chaque plante,
- poids moyen de matière sèche pour chaque plante.

B) Essai stimulateur de la croissance des tomates
* Matériel
Matériel hôte : plants de tomates conduits sur substrats à base d'un mélange de pouzzolane (9/10) et de tourbe (1/10) localisé dans la rhizosphère. Le reste du sac sera composé de 25 % de tourbe et de 75 % de pouzzolane. Le substrat est conditionné en sacs de 35 litres sur lesquels sont disposés à distance égale, 3 plants de tomates. L'essai est conduit sous serres de verre.

* Inoculum
Le matériel de départ est constitué par un produit sous numéro comprenant ces deux souches (LET 1 et
LET 2).

* Méthode
Principe : le substrat de base est inoculé par les deux souches, à raison de 108 spores/g de tourbe, juste avant la mise en place des plants.

* Dispositif
5 sacs de substrats seront inoculés par la souche LET 1, 5 sacs par la souche LET 2, et 5 sacs non inoculés constitueront les témoins.

La répartition des sacs se fera au hasard de la parcelle et en milieu contrôlé.

* Notation
Une observation par semaine jusqu'à la fin de la récolte. De la plantation jusqu'à la nouaison
- pourcentage de perte à la plantation,
- hauteur de la plante,
- mesure des entrenoeuds,
- précocité de la sortie des bouquets,
- nombre de bouquets sortis,
- nombre de fleurs écloses,
- nombre de jours écoulés entre la première fleur et la nouaison,
- pourcentage de réussite de nouaison (fleurs fécondées, fleurs coulées),
- couleur de la plante (aspect externe carence, chlorose...) de la nouaison aux premiers fruits ramassés,
- précocité du ramassage,
- poids de matière fraîche,
- calibre à l'arrachage du plant,
- poids de matière sèche.

Ces deux essais confirment les résultats obtenus à l'exemple 3.

EXEMPLE 5 : Synthèse de la décyl-5-8-lactone.

La voie de synthèse conforme à l'invention et illustrée dans le schéma I ci-dessus, comprend de manière plus précise :
-Protocole :
1) Synthèse de l'énamine
16,8 g de cyclopentanone/15,0 g de pyrrolidine/300 ml de benzène.

Après trois heures de distillation azéotropique et piégeage de l'eau formée, on récupère 3,5 ml d'eau. On chasse alors le benzène et on distille l'énamine formée, sous pression réduite.

On récupère 15,7 g d'énamine que l'on fait réagir pendant une nuit sur 25,3 g de bromodécane dans 100 ml de diméthyl formamide.

On hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique concentré. On extrait à l'acétate d'éthyle. On lave ensuite la phase organique à l'eau jusqu'à neutralité. On purifie le produit formé par distillation. On recueille trois fractions première fraction : 10,8 g et Eb = 20 = 120-125-C deuxième fraction : 1,9 g et Ebl = 70'C troisième fraction : 2,2 g et Ebl = 100-105-C.

On réalise un spectre infrarouge de la troisième fraction. Ce produit est le produit attendu.

LARDELLI (1967i donne les points d'ébullition des alkyls cyclopentanones.

2) Réaction de Baeyer-Villiger
On mélange 1 g de didécyl-2-pentanone à 1 g d'acide 3-chloroperbenzolque dans 25 ml de chloroforme, et on laisse réagir pendant 48 heures. On rajoute alors au milieu réactionnel trois spatules de NaHCO3 solide de manière à rendre le milieu réactionnel basique. On rajoute alors 100 ml d'eau et 500 ml d'acétate d'éthyle.

On décante et on lave la phase organique à l'eau jusqu'à pH neutre. On effectue ensuite une chromatographie sur colonne de silice pour séparer le produit obtenu. On isole ainsi la décyl-6-8-lactone.

- Caractérisation des produits et comnaraison avec les produits biologiques obtenus à 1'exemple 2
Caractérisation des produits de synthèse (dans les mêmes conditions que pour les produits obtenus par extraction)
* Spectres IR
C8-6-6-lactone : 2940 (74 %), 2930 (87 %), 2830 (67 %), 1730 (83 %), 1470 (42 %), 1380 (52 %), 1210 (96 in;).

C10-6-6-lactone : 2940 (94 %), 2930 (97 %), 2830 (89 %), 1730 (96 %), 1470 (65 %), 1380 (56 %), 1350 (51 %), 1210 (99 %), 1050 (68 %).

* Spectres de Masse (El : Impact électronique donc valeurs m) ; (FAB : Fast Atom Bonbardment donc valeurs m+l)
C8-6-o-lactone (en EI) : m = 52 (75 %), 71 (50 %), 83 (30 %), 98 (100 %), 111 (10 %), 124 (5 %), 151 (4 96), 176 (8 %), 194 (10 %), 216 (35 %), 296 (3 %).

C10-6-6-lactone (en EI) : m = 52 (60 %), 71 (45 %), 83 (23 %), 98 (70 %), 177 (5 %), 204 (10 %), 222 (28 %), 240 (100 %), 263 (20 %).

Les spectres RMN sont représentés aux figures 3 et 4.

* Comparaison des spectres infra-rouge
Pour l'ensemble des quatre spectres (LET 1,
LET 2, C8, C10, on peut obtenir un classement comme suit des molécules en fonction de leur longueur de chaîne aliphatique : LET 1 > C10 > C8 > LET 2.

* Spectres résonance magnétique nucléaire:
Ces spectres sont représentés aux figures 1, 2, 3 et 4.

Le pic des CH2 (en 1,2) indique, après calcul des intégrations, des longueurs de chaînes plus ou moins longues en fonction de la molécule.

A -la lumière des résultats obtenus, on peut affirmer que la souche LET 2 produit un seul métabolite dans la famille étudiée : une 6-b-lactone à chaîne courte (C6). La souche LET 1, elle, produit plusieurs métabolites : des 6 lactones à chaîne plus longue C10-C8. Les produits chimiques de synthèse sont bien identifiés et presque purs surtout la C10 6-8-lactone. On pense avoir, parfois, des réactions secondaires durant cette synthèse de produits, par une double incorporation de chaînes alkyle sur la 6-8-lactone.

- Activité biologique des composés de synthèse et comsaraison avec les produits bioloaiaues:
Les produits testés sont les C5, C7, C8, C9,
C10, C12, C15 et C20 6-6-lactones.

A) Test anti-pythium ultimum
Le protocole est réalisé comme décrit cidessus à l'exemple 2.

Résultats
Les résultats sont illustrés au Tableau XI.

En ce qui concerne l'activité anti-Rythium ultimum, le Tableau XI illustre le pourcentage d'inhibition sur Pythium ultimum par divers produits de synthèse à deux concentrations différentes.

TABLEAU XI

<tb> Concentration <SEP> (en <SEP> ppm) <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> ppm <SEP> 10 <SEP> ppm
<tb> Cyclopentanone <SEP> o <SEP>
<tb> Pentenone <SEP> alkylé <SEP> 0
<tb> Dérivé <SEP> alkyl <SEP> O <SEP>
<tb> Pyrrolidine <SEP> O <SEP>
<tb> C8 <SEP> 6-6-lactone <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> C9 <SEP> 6 <SEP> lactone <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> C10 <SEP> 6-8-lactone <SEP> 95 <SEP> 3
<tb> C12 <SEP> 6-6-lactone <SEP> 92 <SEP> 0
<tb> C15 <SEP> 6-6-lactone <SEP> 95 <SEP> 5
<tb> C20 <SEP> 6-8-lactone <SEP> 75 <SEP> 0
<tb> C7 <SEP> 6-6-lactone <SEP> 77 <SEP> 0
<tb> C5 <SEP> 6-3-lactone <SEP> 50 <SEP> 0
<tb>
Il faut noter que l'on s'est assuré au préalable que les produits intermédiaires (cyclopentanone, pentanone alkylée, dérivé alkylé, pyrrolidine) de la synthèse étaient inefficaces contre le Pythium ultimum.

C'est bien le produit final qui provoque l'inhibition. La souche LET 1 est plus puissante inhibitrice que LET 2. De plus, cette dernière ne donne qu'une seule fraction efficace alors que LET 1 en donne deux.

B) Test de stimulation de croissance
Le protocole est réalisé comme décrit cidessus à l'exemple 2.

. Résultats
Le Tableau XII illustre la moyenne de l'indice de germination de semis de tomate et de concombre provoqué par différentes concentrations en composés d'origine chimique.

TABLEAU XII

<tb> <SEP> Extraits <SEP> de <SEP> milieu <SEP> Tomates <SEP> Concombres
<tb> <SEP> liauide
<tb> Concentration <SEP> en <SEP> ooml <SEP> 1000 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 1000 <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Cyclopentanone <SEP> Inhibiteur <SEP> Inhibiteur
<tb> Pentanone <SEP> alkylé <SEP> 0
<tb> Dérive <SEP> alk <SEP> I <SEP> o
<tb> Pyrrolidine <SEP> Inhibituer <SEP> 0
<tb> C <SEP> 8 <SEP> 6-#-lactone <SEP> <SEP> Inh <SEP> +15 <SEP> +10 <SEP> Inh <SEP> -8 <SEP> +5
<tb> C9 <SEP> 6-#-lactone <SEP> Inh <SEP> <SEP> +2 <SEP> +12 <SEP> Inh <SEP> 0 <SEP> +5
<tb> C <SEP> 105-#-lactone <SEP> Inn <SEP> Inh <SEP> +1 <SEP> Inn <SEP> Inn <SEP> +8
<tb> C12 <SEP> Inh <SEP> 0 <SEP> +8 <SEP> Inh <SEP> Inh <SEP> ,1 <SEP>
<tb> C15 <SEP> Inh <SEP> 0 <SEP> +3 <SEP> Inh <SEP> 2 <SEP> o
<tb> C20 <SEP> Inh <SEP> Inh <SEP> Inh <SEP> Inh <SEP> +3 <SEP> Infl <SEP>
<tb> C7 <SEP> Inh <SEP> Inh <SEP> +5 <SEP> Inh <SEP> Inn <SEP> +2
<tb> C5 <SEP> Inh <SEP> Inh <SEP> Inh <SEP> Inh <SEP> 0 <SEP> Inh
<tb>
Chaque résultat est la moyenne de trois tests. L'erreur relative sur chaque mesure est de 5 %.

Le maximum d'effet sur l'augmentation de germination se trouve être pour la C8 5-#-lactone, ceci pour les deux types d'espèce, et pour des concentrations proches de 100 ppm plutôt que 10 ou 1 000 ppm. Pour les autres alkyl-6-8-lactones de synthèse, c'est en moyenne à 10 ppm que se trouve le maximum d'efficacité.

L'augmentation maximale est de 15 % et l'influence est plus significative sur la tomate que sur le concombre. I1 faut noter que les produits intermédiaires sont tous inhibiteurs (cyclopentanone, dérivé alkylé, pyrrolidine).

Compte-tenu des données de caractérisation moléculaire, les alkyl-6-6-lactones sont responsables de la double action concernant l'augmentation de germination et l'activité anti-Pythium ultimum. La différence d'efficacité entre les deux produits bien qu'aux mêmes concentrations est sans doute dû au fait que les extraits biologiques sont un mélange de plusieurs produits relargués dans les milieux de culture.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims (18)

1. REVENDICATIONS

   dans laquelle R représente un groupe (CH2)n-CH3 dans lequel n est un nombre entier compris entre 4 et 19, et de préférence entre 5 et 11, lesquelles alkyl-5-#-lactones étant soit sous leur forme enantiomère, soit sous leur forme racémique, présentent à la fois une activité stimulatrice de la gemination et de la croissance des plantes et une activité anti-fongique.

   

   1-) Alkyl-6-#-lactones, caractérisées en ce qu'elles présentent la formule générale
2. 2 ) Souches de Trichoderma à action antifongique, caractérisées en ce qu'elles produisent des alkyl-6-#-lactones selon la revendication 1

   et présentent à la fois une activité de stimulation sur la croissance et. la germination des plantes, et une activité anti-fongique vis-a-vis d'au moins Itun des champignons suivants : Pythium ultimum

   Rhizoctonia solani et Sclerotium rolfsii.
3. 3 ) Souches de Trichoderma selon la revendica

   ion 2, caractérisées en ce qu'il s'agit d'un Trichoderma harzianum, dénomme LET 1.
4. 4 ) Souche de Trichoderma selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle a été déposée en date du 9/07/92, sous le n I-1235 auprès de la Collection Nationale tes Cultures de Microorganismes tenue par l'institut Pasteur.
5. 5 ) Souches de Trichoderma selon la revendication 2, caractérisées en ce qu'elles sont en outre résis- tantes vis-à-vis d'au moins une substance antifongique.
6. 6 ) Souches de Trichoderma selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un Trichoderma harzianum. cénommé LET 2.
7. 7 ) Souche de Trichoderma selon la revendica tion G , caractérisée en ce au'elle a été déposée en date du9/07/921 sous le n r-1236 auprès de la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes tenue par l'Institut

   Pasteur.

   b. l'ensemencement du milieu obtenu en 7.a.

   a. l'ensemencement du filtrat ae culture issu de la culture en milieu liquide, obtenu en 5., sur un milieu de culture solide gélosé enrichi

   7. la réalisation d'un test anti-pathogène comprenant

   c. l'appréciation de la germination et de la croissance desdites semences, sur une période comprise entre 2 et 7 jours ;;

   b. l'ensemencement du milieu obtenu avec des semences appropriées

   a. l'ensemencement du filtrat de culture issu de la culture en milieu liquide, obtenu en 5., sur un milieu de culture solide

   6. la réalisation d'un test de stimulation comprenant

   5. la croissance d'une souche isolée à l'étape 4 en milieu liquide (milieu Trichoderma) de type milieu "S", comprenant au-moins un sucre, une source d'azote et des éléments minéraux

   Sclerotium rolfsii, par l'association des étapes suivantes

   B - la sélection des souches présentant à la fois une activité de stimulation sur la croissance et la germination des plantes maraîchères et notamment des cucurbitacées et des solanacées et une activité antifongique vis-à-vis d'au moins l'un des champignons parasites suivants :Pythium ultimum, Rhizoctonia solani et

   sélection des souches monosporales issues de la culture réalisée en 3. par une nouvelle série de dilutions successives et isolement par observation au microscope ;

   3. croissance des populations de champignons présents dans les différentes dilutions sur un milieu de culture gélosé complémenté, sélectif des Trichoderma à 24 C, pendant 1 à 10 jours et à l'obscurité et sélection des populations homogènes ; puis

   2. mise en suspension dudit prélèvement dans un milieu aqueux approprié, suivie de dilutions successives de ladite suspension ;

   1. prélèvement de sol, dans un terrain convenable ;

   A - l'isolement des souches de Trichoderma par :
8. :8'). Procédé de sélection d'une souche selon lune quelconque des revendications # à 7, caractérisé en ce qu'il comprend

   8. la sélection de la souche présentant le meilleur résultat à l'étape 6.c. et à l'étape 7.c..

   c. l'appréciation de l'inhibition du développement du champignon parasite sur une péri ode comprise entre 2 et 4 jours

   Rhizoctonia solani et Sclerotium rolfsii;

   avec un champignon parasite choisi parmi Pythium u 7 timum,
9. 9 ) Procédé de sélection selon la revendication 8, caractérisé en ce que avant l'étape 5. cidessus1 ladite souche de Trichoderma est irradiée aux rayons ultra-violets, pour l'obtention d'une souche résistante aux anti-fongiques.

   KH2PO4, du K2HPO4.
10. 10') Procédé de sélection selon lune quelconque des revendications 8 à 9. caractérisé en ce que le milieu liquide de l'étape 5. est à un pH inférieur a 7 et comprend avantageusement au moins du saccharose, de l'acide citrique, du Ca (NO3)21 du KNO3, du MgSO4, du
11. 11 ) Procédé de sélection selon l'une quel-l conque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce que le milieu de culture solide de l'étape 6.a. est à base d'agar.
12. 12 ). Procédé de sélection selon l'une quelconque des revendications s à 11, caractérisé en ce que l'appréciation de la germination et de la croissance desdites semences, à l'étape 6.c. est obtenue par le calcul de l'indice de germination et de l'indice de production de matière sèche, après culture pendant 7 jours à 24 C.
13. 13 ) Procédé selon la revendication 12. carac térise en ce qu'on sélectionne les souches de Trichoderma qui présentent un indice ae germination supérieur à 1 et un inaice de production de matière sèche supérieur à 1, à la fois chez la tomate et le concombre.

    Trichoderma d'une souche selon l'une quelconque des revendications 2 à .7, caractérisé en ce qu'elles sont obtenues par prélèvement à partir d'une culture réalisée pendant 5 à 10 jours, à une température comprise entre 20 C et 25 C et à l'obscurité, sur un support solide enrichi en solutions nutritives.
14. 14') Procédé de production de spores de
15. 15 ) Procédé de production des alkyl-6-#- lactones selon la revendication 1, caractérisé en ce que à partir des souches de Tricho- derma, selon 1 lune quelconque des revendications 2 à .7

    - l'on recueille le filtrat de la culture desdites souches en milieu liquide (milieu Trichoderma) de type milieu "S", comprenant au moins un sucre, une source d'azote et des éléments minéraux (tel que défini ci-dessus, à l'étape 5. du procédé de sélection de souches) selon la revendication 8, puis

    -. en ce que l'on extrait lesdites alkyl-5-#- lactones a partir dudit filtrat par

    . acidification dudit filtrat à un pH inférieur à 2,3,

    extraction par un solvant organique inso luble dans l'eau (chloroforme, acétate d'éthyle hexcne...), puis

    évaporation jusqu'à l'obtention d'un résidu contenant lesdites alkyl-5-#-lactones.
16. 16 ) Procédé de production des alkyl-6-#- lactones selon la revendication 1, caractérisé en ce que à partir des souches de Tricho- derma, selon l'une quelconque des revendications 2 à 7 cultivées sur un support soliae enrichi en solutions nutritives, tel que défini ci-dessus pour le procédé ce production de spores, selon la revendication 1 14

    - on prélève un inoculum de spores obtenu à partir de ladite culture et traité par un solvant fragi- lisant les spores

    - on fait suDir a la suspension de spores ainsi obtenue, un traitement mécaniquef approprié, puis

    - on évapore jusqu'à l'obtention a'un extrait sec, contenant lesdites alkyl-5-#-lactones.
17. 17 ) Procédé de lutte contre les champignons parasites, caractérisé en ce que l'on inocule un support de culture de plantes approprié avec une composition choisie dans le groupe qui comprend soit 107 à 109 spores d'une souche de Trichoderma selon l'une quelconque des revendi- cations 2 à 7/g dudit support.
18. 18 ) Composition stimulante de la croissance et de la germination des plantes et anti-fongique.

    caractérisé en ce que l'on inocule un support de culture de plantes approprié avec une composition Shoi- sie dans le groupe qui comprend soit 107 à 109 spores double souche de Trichoderma selon l'une quelconque ses revendi- cations 2 à 7 (g dudit support