CN114032184A - 一株防治褐梗天牛的层生镰刀菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株防治褐梗天牛的层生镰刀菌及其应用。本发明自山东省日照五莲山采集的被真菌感染死亡的褐梗天牛上分离菌株，经浸置法筛选到对褐梗天牛致死率最高的菌株层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)CS‑03，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.23235。该菌株对褐梗天牛具有显著的杀虫活性，且易于发酵生产，与化学合成杀虫剂相比，对环境绿色友好，且能够有效降低褐梗天牛为媒介的松材线虫病传播。

Description

一株防治褐梗天牛的层生镰刀菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株防治褐梗天牛的层生镰刀菌及其应用，属于微生物农药技术领域。

背景技术

松材线虫病(Bursaphelench xylophilus)具有松树“癌症”之称，其疫情逐年扩大，在造成重大经济损失的同时，也严重威胁到我国的森林生态安全。松材线虫不能自己传播，只能依靠昆虫等媒介进行扩散。褐梗天牛(Arhopalus rusticus Linnaeus)恰恰是传播松材线虫的媒介昆虫，同时也是危害松树的主要蛀干害虫。因此，防治褐梗天牛对于降低松材线虫病传播及保护森林生态安全具有重要意义。

诱捕器诱杀、营林防治和化学防治是目前防治褐梗天牛的主要方法，这些方法费时费力、成本高或污染环境，并不是防治褐梗天牛的长久之计！与之相比，微生物农药具有易于发酵生产、对环境绿色友好且无农药残留等优势，已经成为生物防治的重要手段。截止目前，应用微生物防治褐梗天牛的研究在国内外报道较少。

专利CN109362791A公开了一种防治天牛虫害的生物杀虫剂及其制备方法，该生物杀虫剂由如下质量份数的组分制成：球孢白僵菌培养液75～85份，印楝素溶液的500倍稀释液 40～50份，乳化剂2～4份，无水乙醇1～3份。专利CN112280691A公开了一种用于防治桃红颈天牛的球孢白僵菌及其应用，菌株保藏编号为CGMCC No.20250，其对桃红颈天牛成虫和幼虫均有较好的杀虫活性。专利CN112920956A公开了一株球孢白僵菌BD01菌株及其发酵方法和应用，菌株保藏编号为CGMCC No.21463，球孢白僵菌BD01的杀虫谱广泛，对落叶松八齿小蠹、榆小蠹、松大蚜、美国白蛾、落叶松毛虫、双条杉天牛及光肩星天牛都有较显著的杀伤效果。可见，目前在防治天牛虫害方面以球孢白僵菌居多，未见防治褐梗天牛的层生镰刀菌的报道。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一株防治褐梗天牛的层生镰刀菌及其应用，该菌株为层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)CS-03，具有显著的杀虫活性，褐梗天牛的死亡率接近80％，可以开发为生物农药，与化学合成杀虫剂相比，对环境绿色友好，且能够有效降低褐梗天牛为媒介的松材线虫病传播。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的菌株为CS-03，分离自山东省日照五莲山采集的被真菌感染死亡的褐梗天牛，是经浸置法从18株菌株中筛选到的对褐梗天牛的致死率最高(90％以上)的菌株，结合形态学及基因序列测定结果，鉴定该菌株为层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)。该菌株已于2021年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.23235。该层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)CS-03在PDA平板上菌丝平均生长速度为7.5mm/d；菌落呈规则圆形，前期菌落为白色毛絮状；后期，菌落表面产生橘黄色和紫色色素，菌落背面产生紫色色素；摇瓶培养液有球形沉淀，有淡紫色色素产生，液面未见气泡。

本发明的另一个目的是提供层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)CS-03在防治褐梗天牛中的应用以及防治松材线虫病传播方面的应用。

本发明还提供了上述层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)CS-03的发酵方法，其特征是，将层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)CS-03种子液接种到发酵培养基中在25～30℃发酵培养48～96h，得到发酵液。所述种子液培养基为：马铃薯200g，葡萄糖(或蔗糖)10～20g，蛋白胨10g，水1000mL，pH自然。发酵培养基同种子液培养基。

本发明的有益效果是：

1、本发明从被真菌感染死亡的褐梗天牛上分离到一株对褐梗天牛致死率最高的菌株层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)，该菌株的发酵液(5.0×10⁸CFU·mL^-1)稀释500倍处理10d 后，褐梗天牛的死亡率接近80％，表明该菌株对褐梗天牛具有显著的杀虫活性。该菌株对其他类型的天牛如松褐天牛等也有一定的防效。

2、层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)的发酵方法简单，有效菌落数量大，易于发酵生产，可以开发为生物农药，与化学合成杀虫剂相比，对环境绿色友好，且能够有效降低褐梗天牛为媒介的松材线虫病传播。

附图说明：

图1为被真菌感染死亡的天牛上分离到的菌株CS-01～CS-18的菌落形态；

图2为层生镰刀菌CS-03在培养3d、6d、12d的菌落形态；

图3为层生镰刀菌CS-03摇瓶培养形态；

图4为3.2×10⁸CFU·mL^-1层生镰刀菌CS-03发酵液处理褐梗天牛72h后菌丝寄生的褐梗天牛。

具体实施方式：

下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：菌株的分离及鉴定

1.菌株CS-03分离

在山东省日照五莲山、九仙山、青岛崂山、泰安泰山采集到被真菌感染死亡的不同种类天牛，利用稀释涂布法在孟加拉红培养基上进行真菌分离。具体方法如下：

(1)灭菌：所用培养皿、枪头、无菌水等实验用品在0.1MPa，121℃条件下高压灭菌25min，备用；

(2)消毒：将天牛成虫体表以75％乙醇漂洗3次，每次2min，再用无菌水漂洗3次，自然晾干后研磨；

(3)研磨：称取5g消毒的天牛放入无菌离心管中，加入5mL无菌水，用研磨棒充分研磨。

(4)梯度稀释：将研磨后的汁液全部转移至含有95mL无菌水的三角瓶中，从三角瓶中吸取1mL菌液放入盛有9mL无菌水的试管中，即为10^-1稀释度；再从10^-1稀释度的菌液中取1mL放入盛有9mL无菌水的试管中，即为10^-2稀释度的菌液；运用相同的方法依次制成 10^-3、10^-4、10^-5稀释度的菌液。

(5)培养基制备

分离用培养基，即孟加拉红培养基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，无水硫酸镁0.5g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g，琼脂20g，水1000mL。上述各成分(孟加拉红和氯霉素除外)加入蒸馏水中溶解后，再将孟加拉红溶液加入培养基中，分装后，121℃灭菌25min。倾注平板前，另用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基。

纯化培养基：马铃薯200g，葡萄糖(或蔗糖)10～20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH自然。分装，121℃灭菌25min。倒平板，每个培养皿倒大约20mL的培养基，平放静置，待冷却备用。

(6)涂布：将稀释菌液10^-2、10^-3、10^-4、10^-5分别涂布于分离培养基平板上，每个梯度3皿，并在皿底做上标记。

(7)培养：涂布完成后，于30℃条件下恒温倒置培养3d左右，观察。

(8)菌株纯化：利用接种钩挑取单菌落，在含有纯化培养基的平板上30℃条件下恒温倒置培养。

结果显示，共计分离得到18株真菌(参照图1)，并分别编号。

2.菌株CS-03筛选

将分离得到的菌株进行编号(参照表1)，利用摇瓶培养的方法(参见实施例2)摇瓶培养72h分别制备各个菌株摇瓶培养液，以活力、大小均一的褐梗天牛(成虫、体长20mm左右、饲养条件一致保证活力大小基本一致)为试验对象，利用浸置法探究了不同菌株摇瓶培养液对褐梗天牛的杀灭情况，筛选得到对褐梗天牛有防治效果的菌株CS-03。试验结果如表1 所示，CS-03、CS-08和CS-12对褐梗天牛有杀虫活性，且CS-03对褐梗天牛的致死率在90％以上。

表1不同菌株对褐梗天牛防治情况汇总表

判断活性级别的标准为：致死率＞90％为“+++”级，70％＜致死率＜90％为“++”级，致死率＜70％为“+”级，致死率＝0为“－”级。

3.菌株CS-03鉴定

(1)菌株CS-03培养特征的鉴定

将分离得到的菌株CS-03接种于PDA平板上，于30℃恒温培养箱倒置培养，分别在3d、 6d、12d观察菌落特征。结果表明，该菌株在PDA平板上菌丝平均生长速度为7.5mm/d；菌落呈规则圆形，前期菌落为白色毛絮状；后期，菌落表面产生橘黄色和紫色色素，菌落背面产生紫色色素(参照图2)；摇瓶培养液有球形沉淀，有淡紫色色素产生，液面未见气泡(参照图3)。

(2)菌株CS-03分子生物学鉴定

将菌株CS-03活化后，挑取菌盘接种到PDB培养基中，30℃摇瓶发酵72h，收集上层菌丝体，用滤纸压干后，液氮研磨成粉末，用CTAB法提取真菌基因组DNA，将提取基因组送至测序公司进行测序。所述菌株的rDNA基因序列测定结果(ITS1区)如下(SEQ No.1)：

TTCAGCGGGTATTTCCTACCTGATCCGAGGTCAACATTCAGAAGTTGGGGGTTTAAC GGCTTGGCCGCGCCGCGTACCAGTTGCGAGGGTTTTACTACTACGCAATGGAAGCTGCA GCGAGACCGCCACTAGATTTCGGGGCCGGCTTGCCGCAAGGGCTCGCCGATCCCCAAC ACCAAACCCGGGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAAT ACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAA AGTTTTGATTTATTTATGGTTTTACTCAGAAGTTACATATAGAAACAGAGTTTAGGGGTCC TCTGGCGGGCCGTCCCGTTTTACCGGGAGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACAATTGGTA TGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCC

结合形态学及基因序列测定结果，菌株CS-03鉴定为层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)，该菌株已保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2021年9月18 日，保藏编号为CGMCC NO.23235。

实施例2：层生镰刀菌CS-03发酵液制备

(1)将层生镰刀菌CS-03活化接种于PDA平板表面，28℃恒温培养72h；

(2)打孔器打取上述活化菌株的菌饼，接种于种子液培养基中，28℃、120r/min摇瓶培养72h，得到层生镰刀菌CS-03的种子液；

所述种子液培养基为：马铃薯200g，葡萄糖(或蔗糖)10～20g，蛋白胨10g，水1000mL， pH自然。

(3)将步骤(2)制备的种子液接种到发酵培养基中，接种量为1:100，发酵条件同步骤 (2)，得到层生镰刀菌CS-03的发酵液，并调至5.0×10⁸CFU·mL^-1浓度(用于实施例4)。

发酵培养基同种子液培养基。

实施例3：层生镰刀菌CS-03抗虫活性测定

(1)实验方法

首先制备含不同浓度CS-03的发酵液：将实施例2制备的层生镰刀菌CS-03发酵液浓度分别调整为0.2×10⁸CFU·mL^-1、0.4×10⁸CFU·mL^-1、0.8×10⁸CFU·mL^-1、1.6×10⁸CFU·mL^-1和3.2×10⁸CFU·mL^-1。

将采集到的褐梗天牛(成虫、体长20mm左右、饲养条件一致保证活力大小基本一致) 在含不同浓度孢子的CS-03发酵液中浸泡5s，然后转移至装有当年生黑松针叶的洁净饲育盒内观察，每个处理接种15只成虫，各处理重复3次，用灭菌的发酵培养基作对照。完成接种后，所有饲育盒转移至26℃、通风且光条件好的培养箱中，并每隔1d更换一次新鲜枝段和洁净饲育盒。在72h统计褐梗天牛死亡状况，计算死亡率，观察死亡褐梗天牛真菌寄生情况。

(2)实验结果

在处理72h后，统计了各处理褐梗天牛死亡数目，并计算了死亡率。结果显示，在处理时间一定的情况下，随着CS-03的浓度不断增加，其杀虫能力不断增强；当CS-03的浓度为3.2×10⁸CFU·mL^-1时，褐梗天牛死亡率达86.67％(如表2所示)；并且能清晰观察到死亡褐梗天牛寄生大量CS-03菌株(如图4所示)。

根据浓度对数-死亡率机率值得到毒力回归方程为y＝2.2231x+4.9664，并计算得到CS-03 发酵液的致死中浓度LC₅₀值为1.04×10⁸CFU·mL^-1。

表2不同浓度CS-03发酵液处理后褐梗天牛死亡率统计及回归方程指标

实施例4：层生镰刀菌CS-03田间药效试验

(1)试验地点

试验地选取日照五莲山和泰安泰山松树苗木生产基地。试验区设在松树苗圃地内，地势平坦，易于观察与调查。试验区内栽培条件一致，褐梗天牛为害程度相当，符合试验要求。

(2)试验药剂

供试药剂：浓度为5.0×10⁸CFU·mL^-1的层生镰刀菌CS-03发酵液，稀释500倍；

对照：发酵培养基，稀释500倍。

(3)试验方法

本试验共设1个施药处理：5.0×10⁸CFU·mL^-1的层生镰刀菌CS-03发酵液稀释500倍。另设培养基对照。每个处理4次重复(日照五莲山和泰安泰山松树苗木各2个重复)，以4株马尾松幼树为1个小区，共计8个小区，小区间设保护行，随机区组排列。使用手动背负式喷雾器均匀喷雾，用药量1.5L/株。除试验设计施药外，试验期间未使用其他杀虫剂。

根据褐梗天牛在日照五莲和泰安发生规律，于2021年7月15日分别施药1次，即在褐梗天牛成虫期施药1次，并在处理区松树上接入诱捕到的褐梗天牛成虫45头/株。分别于药后3、5、10d调查纱网内的活虫数。每次调查后清除纱网内天牛。参照以下公式计算各处理的防治效果。

防治效果(％)＝[1－(对照区药前活虫数×处理区药后活虫数)/(对照区药后活虫数×处理区药前活虫数)]×100。

(4)实验结果

喷施层生镰刀菌CS-03 500倍稀释菌液3d后两地点均表现出对褐梗天牛有一定防效，防效分别为50.35％(日照)和52.24％(泰安)；10d后，防效达到最大值，分别为79.69％(日照)和78.52％(泰安)。结果说明，层生镰刀菌CS-03 500倍稀释菌液防治褐梗天牛较为稳定，且防效能接近80％，可开发为防治褐梗天牛的微生物农药。本试验仅观察至用药10d后，后续还可持续观察一段时间，监测褐梗天牛的数量变化。

表3层生镰刀菌CS-03 500倍稀释菌液对马尾松上褐梗天牛的防效

SEQUENCE LISTING

<110> 济南栖圣农林科技有限公司

<120> 一株防治褐梗天牛的层生镰刀菌及其应用

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 层生镰刀菌（Fusarium proliferatum）CS-03的基因序列测定结果(ITS1区)

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ttcagcgggt atttcctacc tgatccgagg tcaacattca gaagttgggg gtttaacggc 60

ttggccgcgc cgcgtaccag ttgcgagggt tttactacta cgcaatggaa gctgcagcga 120

gaccgccact agatttcggg gccggcttgc cgcaagggct cgccgatccc caacaccaaa 180

cccgggggct tgagggttga aatgacgctc gaacaggcat gcccgccaga atactggcgg 240

gcgcaatgtg cgttcaaaga ttcgatgatt cactgaattc tgcaattcac attacttatc 300

gcattttgct gcgttcttca tcgatgccag aaccaagaga tccgttgttg aaagttttga 360

tttatttatg gttttactca gaagttacat atagaaacag agtttagggg tcctctggcg 420

ggccgtcccg ttttaccggg agcgggctga tccgccgagg caacaattgg tatgttcaca 480

ggggtttggg agttgtaaac tcggtaatga tcc 513

Claims (8)

1.一株防治褐梗天牛的层生镰刀菌，该菌株为层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)CS-03，其保藏编号为CGMCC NO.23235。

2.如权利要求1所述的层生镰刀菌CS-03，其特征是，在PDA平板上菌丝平均生长速度为7.5mm/d；菌落呈规则圆形，前期菌落为白色毛絮状；后期，菌落表面产生橘黄色和紫色色素，菌落背面产生紫色色素。

3.如权利要求1所述的层生镰刀菌CS-03，其特征是，摇瓶培养液有球形沉淀，有淡紫色色素产生，液面未见气泡。

4.权利要求1所述的层生镰刀菌CS-03在防治褐梗天牛方面的应用。

5.权利要求1所述的层生镰刀菌CS-03在防治松材线虫病传播方面的应用。

6.权利要求1所述的层生镰刀菌CS-03的发酵方法，其特征是，将层生镰刀菌CS-03种子液接种到发酵培养基中在25～30℃发酵培养48～96h，得到发酵液，所述发酵培养基为：按下述比例配置：马铃薯200g，葡萄糖或蔗糖10～20g，蛋白胨10g，水1000mL，pH自然。

7.权利要求6所述发酵方法制备的发酵液。

8.一种防治褐梗天牛的方法，其特征是，将权利要求7所述的发酵液稀释后对天牛进行喷施。

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