WO2012080660A1 - Nucléus recouvert de pha - Google Patents

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WO2012080660A1
WO2012080660A1 PCT/FR2011/052987 FR2011052987W WO2012080660A1 WO 2012080660 A1 WO2012080660 A1 WO 2012080660A1 FR 2011052987 W FR2011052987 W FR 2011052987W WO 2012080660 A1 WO2012080660 A1 WO 2012080660A1
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WO
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nucleus
pha
film
pearl
oyster
Prior art date
Application number
PCT/FR2011/052987
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English (en)
Inventor
Jean Guezennec
Christelle Simon-Colin
Achraf Kouzayha
Evelyne Bachere
Original Assignee
Ifremer (Institut Français De Recherche Pour L'exploitation De La Mer)
Service De La Perliculture
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K61/00—Culture of aquatic animals
    • A01K61/50—Culture of aquatic animals of shellfish
    • A01K61/54—Culture of aquatic animals of shellfish of bivalves, e.g. oysters or mussels
    • A01K61/56—Culture of aquatic animals of shellfish of bivalves, e.g. oysters or mussels for pearl production
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Definitions

  • the present invention relates to the field of coating of cores in the context of pearl farming (production of pearls by pearl oysters).
  • the subject of the present invention is therefore a nucleus coated with a homogeneous film having antibacterial properties, and making it possible to improve the quality of the pearl obtained and to reduce the mortality resulting from the insertion of said nucleus into the recipient pearl oyster and the phenomenon of nucleus rejection.
  • Pearl culture is a human activity consisting of the cultivation, in the wild, of pearl oysters Pinctada sp for the production of cultured pearls.
  • the first step is the collection and rearing of pearl oysters, which will serve as either donor oyster or recipient oyster.
  • the graft consists of the surgical procedure in which the graft, a portion of the donor oyster coat epithelium (approximately 4 mm 2 ) is inserted into the recipient's oyster pearl pocket, in combination with a mother of pearl ball, the nucleus. Once inserted into the recipient oyster, the epithelial border of the graft multiplies and lines the pearl pocket to give the pearl sac that encompasses the nucleus.
  • the pearl bag deposits layers of mother-of-pearl around the nucleus, resulting in the production of the pearl (Montagnani et al., 2009).
  • the surface of the nucleus In order to guarantee the production of a quality pearl, the surface of the nucleus must be as regular as possible, without irregularities.
  • the patent application JP05219856 describes the insertion in the recipient oyster, during the step of grafting and in parallel with the nucleus or with the nucleus, a solid material containing on its surface a water-soluble polymer associated with an antibiotic.
  • the Japanese patent application JP02308869 claims the use of a nucleus covered with a synthetic polymer associated with an antifouling agent to improve the quality of the pearls obtained, by increasing the homogeneity of the surface of the nucleus, and to reduce the phenomena of rejection and mortality, avoiding for example the colonization of the nucleus by various parasites.
  • US Pat. No. 6,514,614 describes the coating of the nucleus by a water-soluble polymer, associated with a substance having an antibacterial activity, said polymer being partially dissolved by seawater (the dissolution rate being greater than 25%) to allow an effective decrease friction and resistance to insertion of said nucleus.
  • Japanese patent application JP03183424 describes a system for coating the nucleus with a water-soluble polymer (or any other compound allowing a delayed administration), allowing the administration at a controlled rate of an antibiotic associated with said polymer.
  • the inventor has noticed that the coating of the nucleus with a polyhydroxyalkanoate (PHA) film, a natural, biodegradable and non-water-soluble polymer, makes it possible to reduce the failure rate of the grafting operations, and to improve the quality of the pearls obtained.
  • PHA polyhydroxyalkanoate
  • the inventors propose that the embedding of the nucleus by a PHA film would make it possible to homogenize the surface of the nucleus, thus limiting the presence of surface irregularities on the bead.
  • PHAs could limit the adhesion of bacteria to the nucleus, and bacterial growth.
  • This intrinsic effect of the PHA coupled with the association of said PHA film with bactericidal or bacteriostatic agents, such as for example antimicrobial peptides (PAM), would thus reduce the occurrence of microbial contaminations.
  • PHA antimicrobial peptides
  • the presence of PHA alone or in combination with a bactericidal or bacteriostatic agent would then reduce the failures of the graft stage, and in particular to reduce the mortality of recipient oysters and the rejection of nucleus by said oysters.
  • the present invention relates to a core coated or coated with a film comprising one or more polyhydroxyalkanoates (PHAs).
  • said PHA is an HB polymer (PHB), an HV (PHV) polymer or HB-HV copolymer (PHB-V).
  • the present invention also relates to a PHA, characterized in that it is of the PHB-V type, in which the HB / HV ratio is greater than or equal to 50/50 and less than 70/30.
  • the present invention further relates to a composition and a film comprising or consisting of a PHA as described above.
  • Another object of the present invention is a composition or film comprising a PHA and zosteric acid.
  • composition or film comprising a PHA and one or more bioactive molecules, chosen from cicatrizing or anti-inflammatory agents and bactericidal or bacteriostatic agents, such as, for example, chemical antibiotics and antimicrobial peptides.
  • the present invention also relates to the use of a film as described above, for covering a surface, said surface being a pearl culture nucleus or a surface brought into contact, preferably in repeated or prolonged contact, with water, such as for example seawater or fresh water, said surface being, for example, the surface of a tank, for example a plastic or metal tank, used in aquaculture , preferably in fish farming, or the supports and ropes used during the breeding of oysters.
  • Another object of the present invention is therefore a surface covered with a film as described above, said surface preferably being a nucleus.
  • the present invention also relates to a method for protecting surfaces, comprising covering, coating or coating said surface with a film as described above.
  • the present invention further relates to a method of obtaining a nucleus as described above, said method comprising a first step of immersing the nucleus in a solution comprising one or more PHA at a concentration of 0.1 to 10. % by weight relative to the volume of the solution, in trifluoroethanol, said first step possibly being followed by a second step consisting in immersing the nucleus in a solution comprising one or more bactericidal or bacteriostatic agents at a concentration of 1 to 10 CMI.
  • the present invention also relates to a second method for obtaining a nucleus as described above, said method comprising a single step consisting of immersing the nucleus in a solution comprising PHA at a concentration of 0.05 to 10% by weight. weight in relation to the total volume of the solution and a or several bactericidal or bacteriostatic agents at a concentration of 1 to 10 CMI in trifluoroethanol.
  • Another object of the invention is a third method for obtaining a nucleus as described above, said method comprising a single step consisting in the use of a spray for spraying a composition as described above using a spray on the nucleus.
  • the present invention therefore also relates to a spray comprising or consisting of a composition as described above.
  • Another object of the invention is an oyster comprising a nucleus as described above or obtained by one of the methods of the invention.
  • Yet another object of the invention is a method of grafting a recipient pearl oyster comprising inserting into the pearling pouch the recipient pearl oyster of a graft, corresponding to oyster mantle epithelium. donor, in combination with a nucleus as described above or obtained by one of the methods as described above.
  • the present invention also relates to a method of manufacturing a pearl culture pearl, comprising the grafting method described above.
  • the present invention further relates to a bead obtained by the method of manufacturing a bead as described above, or comprising the nucleus according to the invention, or comprising the film according to the invention in one or more thicknesses of nacre.
  • Another subject of the invention is a process for improving the quality of the pearl and / or reducing the failure of a recipient oyster to transplant to a nucleus, said failure corresponding to a mortality or rejection of the nucleus by the recipient pearl oyster, and said method comprising transplanting the recipient oyster with a nucleus as described above.
  • the present invention also relates to the use of the nucleus according to the invention, for reducing the failure of grafting and / or improving the quality of the pearl obtained. [Detailed description]
  • pearl production results from the deposit of nacre on a nucleus inserted into the recipient oyster during the grafting stage.
  • the nucleus transplantation stage generally has a high failure rate, due to poor healing of the recipient oyster at the incision made during the transplant, or bacterial contamination.
  • the nuclei used in pearl farming are more and more often covered with a coating making it possible to reduce the failure of the grafting step, and to guarantee the homogeneity of the surface of the nucleus, resulting in a pearl of high quality. .
  • the present invention thus relates to a nucleus coated or coated with a film comprising one or more polyhydroxyalkanoates (PHA).
  • PHA polyhydroxyalkanoates
  • the PHA film is continuous around the nucleus.
  • the PHA film has a thickness of 0.1 to 200 ⁇ , preferably from 1 to 100 ⁇ , more preferably from 5 to 50 ⁇ .
  • Bacterial PHAs are natural polyesters, 100% biodegradable and derived from renewable resources. These biopolymers are accumulated in bacterial cells in the form of granules when a nutrient necessary for bacterial growth becomes limiting in the presence of an excess of carbon substrate.
  • the physicochemical properties of PHAs depend on their chemical composition, which is itself influenced by the nature of the carbon source used for bacterial growth and PHA synthesis. These biopolymers can be produced on an industrial scale and, by a complex composition specific to each microorganism, possess rheological, physicochemical and biological properties conferring them with applications in many industrial sectors. Among these properties, one can notably note the adhesive and film-forming properties.
  • PHAs also have the advantage of not being soluble in water.
  • PHAs are polyester type polymers consisting of the repetition of the monomeric unit below: wherein R is an alkyl or alkenyl group of variable size, and m and n are integers, preferably m is 1 or 2, more preferably m is 1.
  • PHA can be divided into 3 classes: PHAscl (short chain lenght) consisting of hydroxyalkanoic acids containing up to 5 carbon atoms, PHAmcl (medium chain lenght) whose monomeric units have 6 to 12 carbon atoms, and long-chain lenght (PHAIl) whose constituent units have 12 to 16 carbons.
  • PHAscl short chain lenght
  • PHAmcl medium chain lenght
  • PHAIl long-chain lenght
  • the PHAs used in the invention are obtained by fermentation of bacteria from microbial mats.
  • said PHAs are synthesized under controlled conditions (nutritional and energy imbalance generated by the limitation of an element necessary for bacterial growth in the presence of an excess of a carbon source) during the fermentation of bacteria from microbial mats.
  • these PHAs are chosen from those synthesized by bacteria of the genus Pyrococcus sp, Vibrio sp, Alteromonas sp, Pseudomonas sp or Pseudoalteromonas sp, according to the taxonomy in force on the day of the present invention. If the taxonomy were to be modified, one skilled in the art could adapt the taxonomy modifications to deduce the PHAs used in the invention.
  • these bacteria are heterotrophic bacteria, aerobic, mesophilic.
  • the PHA producing bacteria used in the invention are cultured for 1 to 5 days, preferably for 2 to 4 days, more preferably for about 3 days on a nitrogen-depleted and enriched medium. as a carbon source under the following conditions: salinity 35 o, temperature 30 ° C, pH 7.6.
  • the culture medium of the bacteria contains one or more carbon sources of carbohydrate or fatty acid nature.
  • the carbon source (s) are selected from the group comprising glucose, glycerol, acetate, benzoate, octanoate, pyruvate, propionate, valerate, and their derivatives. mixtures.
  • the total concentration of carbon sources in the culture medium varies from 1 to 30 g / l, preferably from 5 to 20 g / l, more preferably is approximately 10 g / l. L.
  • the nature of the PHA produced by the producing bacteria varies according to the concentration of carbon source, the type of carbon source used, and, in the case of a mixture, according to the ratio of the different sources used.
  • the PHAs used in the invention are extracted from the producing bacteria by a method comprising the extraction of the bacterial pellet by using organic and / or inorganic solvents, preferably organic solvents.
  • the PHAs are recovered by extraction using a solvent selected from the group comprising chloroform and dichloromethane, followed by precipitation of the PHA polymer in ethanol.
  • the PHAs used in the invention are short-chain PHAs.
  • the short-chain PHAs consist of hydroxybutyric acid (HB) and / or hydroxyvaleric acid (HV) monomers.
  • Examples of short chain PHA are PHB (polyhydroxybutyrate), wherein R is CH 3 and m is 1 and PHB-V (poly (hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)), wherein R is CH 3 or CH 2 - CH 3 and m is 1.
  • the PHA used in the invention is chosen from the group comprising polymers of HB (PHB), polymers of HV (PHV) and co-polymers HB-HV (PHB-V ).
  • Another subject of the invention is a PHB-V type PHA, in which the HB / HV ratio is greater than or equal to 50/50 and less than 70/30.
  • Another subject of the invention is a PHB-V type PHA, in which the HB / HV ratio is greater than or equal to 50/50 and less than 65/35.
  • Another object of the invention is a PHB-V type PHA, in which the HB / HV ratio is greater than or equal to 50/50 and less than 60/40.
  • Another subject of the invention is a PHB-V type PHA, in which the HB / HV ratio is greater than or equal to 50/50 and less than 55/45.
  • Another subject of the invention is a PHB-V type PHA, in which the HB / HV ratio is equal to 50/50.
  • Another subject of the invention is PHA-PH PHA, in which the ratio HB / HV is equal to 64/36.
  • the PHB-V according to the invention has adhesive and / or filmogenic properties.
  • the PHB-V according to the invention is not soluble in water.
  • the PHB-V of the invention is obtained by fermentation of bacteria derived from microbial mats, preferably marine bacteria derived from microbial mats.
  • the PHB-V of the invention is synthesized under controlled conditions (nutritional and energy imbalance generated by the limitation of an element necessary for bacterial growth in the presence of an excess of a carbon source) during the fermentation of microbial carpet bacteria.
  • this PHB-V is chosen from those synthesized by bacteria of the genus Pyrococcus sp, Vibrio sp, Alteromonas sp, Pseudomonas sp or Pseudoalteromonas sp according to the taxonomy in force on the day of the present invention. If the taxonomy were to be modified, one skilled in the art could adapt the taxonomy changes to deduce the PHB-Vs of the invention.
  • these bacteria are heterotrophic bacteria, aerobic, mesophilic.
  • the PHB-V producing bacteria according to the invention are cultured on a medium depleted in nitrogen and enriched in a carbon source under the following conditions: salinity 35 ° C., temperature 30 ° C., pH 7.6.
  • the PHB-V according to the invention is extracted from producing bacteria by a method comprising the extraction of the bacterial pellet by use of organic and / or inorganic solvents, preferentially organic.
  • the PHB-V is recovered by extraction with a solvent selected from the group comprising chloroform and dichloromethane, followed by precipitation of the PHA polymer in ethanol. .
  • An object of the invention is a composition comprising or consisting of a PHB-V as described above.
  • Another subject of the invention is a film comprising or consisting of a PHB-V according to the invention.
  • said PHB-V film has a thickness of 0.1 to 200 ⁇ , preferably from 1 to 100 ⁇ , more preferably from 5 to 50 ⁇ .
  • Yet another object of the invention is a film comprising or consisting of a PHB-V according to the invention for covering a surface.
  • said surface is a pearl culture nucleus.
  • said surface is a surface brought into contact, preferably in repeated or prolonged contact, with water, such as for example sea water or water. pure water.
  • said surface may be, for example, the surface of a tank, for example a plastic or metal tank, used in aquaculture, preferably in fish farming.
  • the surfaces covered with a film comprising or consisting of a PHB-V according to the invention are used in the context of pearl farming, such as, for example, the supports and ropes used during oyster farming.
  • Another object of the invention is a method of protecting the surfaces, comprising covering, coating or coating said surface with a film comprising or consisting of a PHB-V according to the invention.
  • the recovery, coating or coating of the surface to be protected would prevent the formation of a primary biofilm, and consecutively an undesirable bacterial biofilm on said surface.
  • said surfaces are chosen from those mentioned above.
  • composition or film of PHB-V according to the invention may be useful for inhibiting bacterial growth.
  • PHB and PHB-V are degraded to ⁇ -hydroxybutyric acid by the action of bacterial and fungal depolymerases, by the animal tissues or under alkaline or acid conditions.
  • hydroxybutyric acid is a short-chain volatile fatty acid with an inhibitory effect on bacterial growth (Van Immerseel, 2003 and Defoirdt, 2007).
  • Short-chain volatile fatty acids (including hydroxybutyric acid) would be able to cross the cell membrane of bacteria and dissociate in the alkaline medium of the cytoplasm, thereby increasing the intracellular proton concentration.
  • bacterial cells would use energy to maintain their intracellular pH at an optimal level. This energy could not be used for other metabolic processes, so cell growth is inhibited.
  • the inventor proposes the hypothesis according to which, once the nucleus coated with a PHB-V film according to the invention is introduced into the recipient oyster, the tissues of said oyster would degrade the PHB-V in hydroxybutyric acid, thereby inhibiting bacterial growth.
  • the PHA (s), in particular the PHB-V (s) according to the invention are native.
  • the PHA (s), in particular the PHB-V (s) according to the invention may be chemically or physically modified.
  • the PHA used in the invention is modified by addition of group (s) sulfate, sulfonate, acetate, lactate, succinate, pyruvate, or groups that modify the hydrophobic / hydrophilic balance of the resulting PHAs. preferably said groups are selected from the group consisting of epoxide, alcohol, carboxylic acid groups.
  • the PHA used in the invention is modified by depolymerization to obtain polymers of lower molecular weight.
  • the PHA used in the invention is modified by grafting a polymer, preferably an oligomer, such as for example an exopolysaccharide (EPS).
  • EPS exopolysaccharide
  • exopolysaccharides can be defined as macromolecules formed from the sequence of similar carbohydrates (commonly called sugars or dares). These exopolysaccharides can be produced at industrial scale, and possess, among other properties, adhesive properties (related to the function of these molecules in nature) and film-forming properties.
  • EPS can be produced by many microorganisms such as gram-positive or gram-negative bacteria, archaea, fungi, and some algae.
  • EPS are produced by gram-positive or gram-negative bacteria, archeae or algae.
  • EPS can be extracted from microorganism cultures by well-known physical or chemical extraction methods such as sonication, centrifugation, alkaline treatment, ethanol extraction, enzymatic extraction, etc.
  • the EPS can be chosen from those produced by marine organisms such as Bacillus, Halomonas, Planococcus, Enterobacter, Alteromonas, Pseudoalteromonas, Rhodococcus, Zoogloea, Cyanobacteria, Vibrio, as described in Satpute et al. . (Biotechnology Advances 2010, 28: 436-450). If the taxonomy were to be modified, one skilled in the art could adapt the taxonomy changes to deduce the EPS that can be used in the invention.
  • EPS can be obtained by fermentation of bacteria from deep hydrothermal ecosystems. More particularly, these EPS are those synthesized under controlled conditions (nutritional imbalance generated by a high carbon / nitrogen ratio due to a carbohydrate enriched nutritional medium) during the fermentation of bacteria from deep hydrothermal ecosystems (see for example Guezennec, J. (2002), Deep Sea Hydrothermal Winds: A Novel Source of innovative Bacterial Exopolysaccharides of Biotechnological Interest (Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 29: 204-208).
  • the EPSs are chosen from HE 800, EPS 721, M0245, GG1, HYD 657, HYD 1644, HYD 1545, GY 785, MS 907, ST 716, HYD 721, GY 772, HYD 750, GY 768, GY 788, BI746, GY 786, GY 685, GY 686, ST 719, HYD 1574, HYD 1579, HYD 1582, HYD 1584, ST 708, ST 722, ST 342, ST 349, HYD 1625, and HYD 1666, preferably MO 245, HE 800, GG1, HYD 721 and ST 716.
  • the EPSs are native.
  • the EPS can be chemically or physically modified (as for example by adding group (s) sulfate, acetate, lactate, succinate or pyruvate).
  • a nucleus covered with a PHA film decreases the mortality of recipient oysters following the graft.
  • a PHA film preferably PHB-V according to the invention
  • the inventor suggests that the presence of a PHA film on the surface of the nucleus modifies the physico-chemical properties of the surface, limiting the formation of a primary biofilm, and consequently that of unwanted biofilm.
  • the presence of an unwanted biofilm on the surface of the nucleus could result in bacterial contamination of the oyster tissue, and mortality of the oyster.
  • composition or a film comprising or consisting of one or more PHAs, preferably one or more PHB-Vs according to the invention, combined with an agent enhancing the formation inhibition of the biofilms of the PHA, preferably said agent is zosteric acid.
  • Zosteric acid is described as allowing the prevention of biofilm formation on surfaces (US5384176, US607741, incorporated by reference).
  • the association between the PHA film and the agent or agents described above results from an adsorption phenomenon or a chemical reaction between the PHAs and said agents.
  • zosteric acid is native.
  • the zosteric acid may be a chemically modified derivative, preferentially a zosteric acid derivative is a zosteric acid ester as described in US2007 / 128151, incorporated by reference.
  • the zosteric acid derivative is an acid derivative of zosteric acid.
  • zosteric acid is extracted from the seaweed Zostera marina.
  • Another subject of the invention is a film comprising or consisting of one or more PHAs, preferably one or more PHB-Vs according to the invention combined with an agent reinforcing the inhibition of formation of the biofilms of the PHA (s), preferably zosteric acid to cover a surface.
  • said surface is a nucleus
  • said surface is a surface brought into contact, preferably in repeated or prolonged contact, with water, such as for example sea water or water. pure water.
  • said surface may be, for example, the surface of a tank, for example a plastic or metal tank, used in aquaculture, preferably in fish farming.
  • the surfaces covered with a film comprising or consisting of a PHB-V according to the invention are used in the context of pearl farming, such as, for example, the supports and ropes used during oyster farming.
  • Another object of the invention is a method of protecting the surfaces, comprising covering, coating or coating said surface with a film comprising or consisting of one or more PHAs, preferably one or more PHB-Vs according to the invention. the invention, combined with an agent enhancing the formation inhibition of biofilms of the PHA or, preferably zosteric acid as described above.
  • the recovery, coating or coating of the surface to be protected would prevent the formation of a primary biofilm, and consecutively an undesirable bacterial biofilm on said surface.
  • said surfaces are chosen from those mentioned above.
  • composition or a film comprising or consisting of one or more PHAs, preferably one or more PHB-Vs according to the invention, associated with one or more bioactive molecules.
  • the association between the PHA film, preferably one or more PHB-Vs according to the invention, and the bioactive molecule (s) results from an adsorption phenomenon or a chemical reaction between PHA and said molecules.
  • these bioactive molecules are cicatrizing or anti-inflammatory agents such as collagen, fibrinogen, laminin, or growth factors.
  • a healing or anti-inflammatory agent on the nucleus could accelerate the cicatrization of the incision performed during the transplant, or limit inflammation, a phenomenon that could lead to the death of Oyster.
  • these bioactive molecules are bactericidal or bacteriostatic agents.
  • bactericidal or bacteriostatic agents In pearl farming, the addition of a bactericidal or bacteriostatic agent on the nucleus would make it possible to limit the occurrence of bacterial contamination in the recipient oyster, which could lead to a rejection of the nucleus or to the death of the oyster.
  • the bactericidal or bacteriostatic agents are chosen from chemical antibiotics such as, for example, tetracycline, kanamycin, sulfamonomethoxyne ampicillin.
  • the bactericidal or bacteriostatic agents are chosen from antimicrobial peptides (PAM).
  • PAM antimicrobial peptides
  • MAPs Antimicrobial peptides
  • WFP wide variety of WFP has been identified in recent years, revealing a great diversity in terms of structures, sizes and modes of action.
  • MAPs are generally characterized by a high representativeness in cationic and hydrophobic amino acids. These molecules are most often amphiphilic essential for their interaction with bacterial membranes (Bulet et al., 2004).
  • PAMs kill microorganisms, either by permeabilizing their membrane by a detergent-like effect or by the formation of pores, by blocking the synthesis of peptidoglycan component of the bacterial wall, or by the inhibition of bacterial metabolic pathways (Brodgen 5 et al., 2005).
  • PAM Compared to the generally used chemical antibiotics, PAM has the advantage of being completely biodegradable. They appear to be good candidates for replacing conventional chemical antibiotics because of their biological properties. Indeed, they have a broad spectrum of antimicrobial activity, little specificity, different modes of action, a safety on the environment.
  • PAM can be produced by chemical synthesis or expression in recombinant system (cloning, expression, purification) bacterial or yeast.
  • the PAMs are synthesized by chemical synthesis.
  • the PAMs are synthesized by biological synthesis in a bacterial or fungal recombinant system and preferably in a yeast system.
  • PAM may belong to the family of alpha-helical linear PAMs, to the family of PAMs with overrepresentation in one or more amino acids, to the family of hairpin PAMs (beta Hairpin) with 1 or 2 disulfide bridges to the family of beta cyclic PAM and alpha helix with 3 or more disulfide bridges (Bulet et al., Immunological reviews, 2004, 198: 169-184; Brogden, Nature Review Microbiology, 2005, 3: 238-250).
  • linear alpha-helical PAM examples include, but are not limited to, cecropin, stomoxyne, ponericin, spinigerin, oxyopinin, cupienin, clavanin, styeline, pardaxine, misgurine, pleurocidin, parasin, oncorhyncin, moronecidin, magainin, temporin, cathelicidin, indolicidin.
  • PAM enriched in one or more amino acids, proline, arginine, glycine, or tryptophan include, but are not limited to, bactenicins, PR-39, abaecins, apidaecins, drosocine, pyrrhocoricins, Cg-Prp, prophenine, indolicin .
  • hairpin PAM containing 2 to 4 cysteines include, but are not limited to, tachyplesin, protrinin, thanatin, androctonin, gomesin, polyphemusin, hepcidin, brevinin, esculentine, tigerinine or bactenecine.
  • cyclic PAMs containing 6 or more cysteine or open-cycle residues include, but are not limited to, defensins (vertebrates, invertebrates) or plants), proin, heliomicine, drosomycin, ASABF, pBD, penaeidines, ALF, big-defensins.
  • invertebrate defensins examples include Cg-Defs oyster defensins or MGD defensins.
  • the PAM is chosen from tachyplesin and oyster defensins Cg-Defs.
  • Another subject of the invention is a film comprising or consisting of one or more PHAs, preferably one or more PHB-Vs according to the invention, associated with one or more bioactive molecules, as described above for covering a surface. .
  • said surface is a nucleus
  • said surface is a surface brought into contact, preferably in repeated or prolonged contact, with water, such as for example sea water or water. pure water.
  • said surface may be, for example, the surface of a tank, for example a plastic or metal tank, used in aquaculture, preferably in fish farming.
  • the surfaces covered with a film comprising or consisting of a PHB-V according to the invention are used in the context of pearl farming, such as, for example, the supports and ropes used during oyster farming.
  • the film comprising PHA, preferably PHB-V according to the invention, optionally associated with biactive molecules or with an agent reinforcing the inhibition of formation of the biofilms of the PHA or preferably zosteric acid is resistant to washing with seawater and is stable for more than 3 weeks, preferably more than one month, more preferably more than 6 months at temperatures ranging between 4 and 30 ° C.
  • the film according to the invention does not dissolve when placed in contact with seawater for at least 3 weeks.
  • the present invention also relates to a process for obtaining a nucleus coated or coated with a film comprising one or more polyhydroxyalkanoates (PHA), preferably PHB-V according to the invention, said film being able to be associated with biactive molecules or an agent enhancing inhibition of biofilm formation of the PHA (s), preferably zosteric acid, as described above.
  • PHA polyhydroxyalkanoates
  • the method according to the invention comprises a first step consisting in coating the nucleus with the PHA film, preferably with the PHB-V film according to the invention, optionally followed by a second step of combining the PHA film formed with one or more other molecules as described above.
  • said method comprises a first step of immersing the nucleus in a solution comprising one or more PHA, preferably one or more PHB-V according to the invention, in trifluoroethanol (CF 3 CH 2 OH, TFE).
  • a solution comprising one or more PHA, preferably one or more PHB-V according to the invention, in trifluoroethanol (CF 3 CH 2 OH, TFE).
  • said PHA solution has a PHA concentration of 0.1 to 10% w / v, more preferably 0.5 to 5, still more preferably 1% by weight of PHA per volume of the PHA. TFE solution.
  • said first step of immersing the nucleus in a solution containing one or more PHAs is carried out at a constant temperature, preferably at room temperature (ie from 15 to 25 ° C.), more preferably approximately 20 ° C.
  • said first step of immersing the nucleus in a solution containing one or more PHAs is preferably carried out for 10 minutes to 3 hours, more preferably for 20 minutes to 1 hour, still more preferably about 30 minutes. minutes.
  • said first step of immersing the nucleus in a solution containing one or more PHAs is carried out at a constant temperature, preferably from 1 to 10 ° C, more preferably about 4 ° C.
  • said first step of immersing the material in a solution containing one or more PHAs is carried out preferably for 10 minutes to 3 hours, more preferably for 20 minutes to 1 hour, even more preferably for about 30 minutes.
  • the coated nucleus is then dried under vacuum.
  • the first step described above is followed by a second step of association of said molecules.
  • the second step comprises immersing the PHA film-coated nucleus in a solution comprising one or more bactericidal or bacteriostatic agents at a concentration. from 1 to 10 CMI.
  • the bactericidal or bacteriostatic agent is in solution in a biologically acceptable polar solvent such as water, ethanol, TFE or their mixture, for example water / TFE, preferably trifluoroethanol (CF 3 CH 2 OH).
  • a biologically acceptable polar solvent such as water, ethanol, TFE or their mixture, for example water / TFE, preferably trifluoroethanol (CF 3 CH 2 OH).
  • the second nucleus immersion step is carried out at a constant temperature, preferably from 1 to 10 ° C, more preferably about 4 ° C.
  • said second nucleus immersion step is preferably carried out for 1 to 120 hours, more preferably for 12 to 96 hours, even more preferably for 24 to 72 hours.
  • the coated nucleus is then dried under vacuum.
  • said method optionally comprises a step of rinsing the nucleus between the first immersion step and the second immersion step.
  • the nucleus is rinsed with a volume of 10 to 1000 ml of distilled water, preferably 100 to 300 ml of distilled water, more preferably about 200 ml of distilled water.
  • the subject of the invention is also a process for obtaining a nucleus coated with a film comprising one or more PHAs, preferably one or more PHB-Vs according to the invention, and one or more other molecules, such as for example one or more biomolecules, for example one or more bacteriostatic or bactericidal agents, said method comprising a single step of immersing the nucleus in a solution comprising PHA and bacteriostatic or bactericidal agents in TFE.
  • the PHA are present in the solution at a concentration of 0.05 to 10% by weight relative to the total volume of the solution, preferably from 0.1 to 5, more preferably at a concentration of 1%.
  • the bactericidal or bacteriostatic agents are present in the solution at a concentration of 1 to 10 CMI.
  • this immersion step is carried out at a constant temperature of 1 to 10 ° C., preferably 4 ° C., and for 1 to 128 hours, preferably for 12 to 96 hours, and more preferably for 24 to 72h.
  • the present invention also relates to a process for coating a nucleus with a film comprising one or more PHAs, preferably one or more PHB-Vs according to the invention, optionally in combination with one or more molecules selected from the group consisting of agents enhancing the action of inhibiting the formation of PHA biofilms, preferably zosteric acid and bioactive molecules, such as cicatrizing or anti-inflammatory agents, and bacteriostatic or bactericidal agents, preferably PAM, comprising the use of a spray for spraying the composition according to the invention on the surface of the nucleus.
  • the present invention relates to a spray comprising or consisting of PHA, preferably comprising or consisting of PHB-V according to the invention.
  • the present invention relates to a spray comprising or consisting of one or PHA, preferably one or more PHB-V according to the invention in combination with one or more other molecules selected from the group comprising agents enhancing the action of inhibition of the formation of biofilms PHA, preferably the acid zosteric and bioactive molecules, such as healing or anti-inflammatory agents, and bacteriostatic or bactericidal agents, preferably PAM.
  • agents enhancing the action of inhibition of the formation of biofilms PHA preferably the acid zosteric and bioactive molecules, such as healing or anti-inflammatory agents, and bacteriostatic or bactericidal agents, preferably PAM.
  • the nucleus is of natural origin, more preferably said nucleus is in Mississippi mother-of-pearl belonging to the genus Amblema sp., Preferably Amblema plicata.
  • nucleus are those sold by Aming (Standard Aming) or by Poe Import.
  • said nucleus has a diameter of 1 to 20 mm, preferably 2 to 15 mm, more preferably 2 to 4 mm, and even more preferably 2.1 to 3.5 mm.
  • said nucleus has a diameter of 2 to 2.5 BU, preferably about 2.4 BU.
  • the BU is a unit of measurement, 1BU corresponding to 3.03 mm.
  • the invention also relates to an oyster comprising a nucleus as described above or obtained by a method as described above.
  • the oyster belongs to the genus Pinctada sp., More preferably to the species Pinctada fucata, Pinctada maxima, Pinctada margaritifera.
  • the subject of the present invention is also a process for grafting a recipient pearl oyster, preferably belonging to the genera and species mentioned above, with a nucleus coated or coated with a PHA film, preferably PHB-V, optionally combined with zosteric acid or a bioactive molecule, as described above.
  • Figure 1A shows the different stages of the transplant.
  • the grafting method comprises manually opening the recipient pearl oyster, making an incision in the tissues of the recipient pearl oyster, to access the pearl pocket and allow in a third step, insertion into the pearling pocket of the recipient pearl oyster of a graft, corresponding to a portion of the mantle epithelium of the donor oyster (about 4 mm 2 ), in combination with a nucleus coated or covered with a PHA film, preferably PHB-V, as described above .
  • the present invention also relates to a method for producing or manufacturing a pearl culture bead, comprising a step of grafting a pearl oyster receiving a nucleus, according to the method described above.
  • the present invention also relates to a process for obtaining a bead comprising the use of the coated nucleus as described above, or obtained according to a coating process as described above.
  • the process for obtaining a pearl comprises the grafting of a nucleus according to the invention in the pearling pocket of a recipient oyster, in combination with a part of the epithelium of the a donor oyster.
  • said process for producing, producing or obtaining a pearl comprises a first step comprising the collection and rearing of pearl oysters, preferably belonging to the genera and species mentioned above, to obtain donor pearl oysters and recipient pearl oysters.
  • the donor and recipient pearl oysters are then cleaned to remove any parasites.
  • said process for producing, producing or obtaining a pearl further comprises, following the grafting, a step of culturing the recipient pearl oysters, preferably for a period of 10 minutes. at 24 months, preferably from 12 to 20 months, even more preferably from 16 to 18 months.
  • the epithelial border of the graft multiplies and lines the pearl pocket, to give a pearl sac encompassing the nucleus, and will deposit layers of mother of pearl around the nucleus, resulting in the production of a pearl ( Figure 1B).
  • the present invention also relates to the bead obtained by the process as described above.
  • the invention also relates to a bead comprising a core coated according to the invention, or a nucleus obtained by a process according to the invention.
  • the present invention also relates to a pearl whose nucleus is covered with a PHA film, optionally in combination with one or more molecules chosen from the group comprising the reinforcing agents for inhibiting the formation of PHA biofilms, preferably zosteric acid and bioactive molecules, such as cicatrizing or anti-inflammatory agents, and bacteriostatic or bactericidal agents, preferably PAM.
  • a pearl whose nucleus is covered with a PHA film, optionally in combination with one or more molecules chosen from the group comprising the reinforcing agents for inhibiting the formation of PHA biofilms, preferably zosteric acid and bioactive molecules, such as cicatrizing or anti-inflammatory agents, and bacteriostatic or bactericidal agents, preferably PAM.
  • the present invention also relates to a bead comprising a PHA film, preferably PHB-V film according to the invention, optionally in combination with one or more molecules chosen from the group comprising the agents that reinforce the action of inhibition of the formation of PHA biofilms, preferably zosteric acid and bioactive molecules, such as healing or anti-inflammatory agents, and bacteriostatic or bactericidal agents, preferably PAM, in one or more thicknesses of mother-of-pearl.
  • a bead comprising a PHA film, preferably PHB-V film according to the invention, optionally in combination with one or more molecules chosen from the group comprising the agents that reinforce the action of inhibition of the formation of PHA biofilms, preferably zosteric acid and bioactive molecules, such as healing or anti-inflammatory agents, and bacteriostatic or bactericidal agents, preferably PAM, in one or more thicknesses of mother-of-pearl.
  • the bead has a size, preferably a diameter of 2 to 20 mm, preferably 5 to 15 mm, even more preferably 6.8 to 10 mm.
  • the coating of the nucleus by a film of PHA, preferably of PHB-V according to the invention, optionally combined with one or more molecules chosen from the group comprising agents which enhance the action of inhibition of the formation of PHA biofilms, preferably zosteric acid and bioactive molecules, makes it possible to reduce the failure rate of grafting operations.
  • the use of a coated nucleus according to the invention decreases the mortality rate of the recipient oysters within 30 days post-transplant and increases the rate of maintenance of the nucleus in the recipient oyster (Example 3).
  • the inventors propose that embedding the nucleus with said film would make it possible to reduce bacterial contaminations within the recipient oyster.
  • PHA film with bactericidal or bacteriostatic agents, such as antimicrobial peptides (PAM), would further reduce the occurrence of microbial contamination.
  • PHA antimicrobial peptides
  • the present invention therefore also relates to a method for reducing the failure of transplantation of a recipient oyster by a nucleus, said failure corresponding to a mortality or rejection of the nucleus by the recipient pearl oyster, and said method comprising transplanting the recipient oyster with a PHA-coated or PHA coated nucleus, preferably PHB-V according to the invention, as described above.
  • the present invention also relates to the use of a PHA-coated or PHA-coated nucleus, preferably PHB-V as described above for reducing transplant failure of a recipient oyster by a nucleus, said failure corresponding to mortality or rejection of the nucleus by the recipient pearl oyster.
  • the present invention also relates to a method of inhibiting the rejection of the nucleus during the graft, said method comprising the use of a coated nucleus according to the invention during the grafting.
  • the present invention further relates to a method of reducing the mortality of recipient oysters following the grafting step, comprising using a coated nucleus according to the invention during grafting.
  • the mortality prevented by the method of the invention is due to an infection of the incision made during the graft.
  • the coating of the pearl culture nucleus with a PHA film, preferably PHB-V, optionally combined with one or more molecules selected from the group comprising the PHA biofilm formation inhibiting enhancer, preferably zosteric acid and bioactive molecules, as described above would improve the homogeneity of the nucleus surface, and thus improve the quality of the pearl obtained by limiting the appearance of surface defects.
  • the present invention also relates to a method for improving the homogeneity of a nucleus, comprising coating said nucleus with a film as described in the present invention.
  • the subject of the present invention is therefore also a process for improving the quality of the pearl obtained following the grafting of the recipient pearl oyster, said method comprising the use of a nucleus coated with or covered with PHA, preferably PHB-V, as described above.
  • the present invention also relates to the use of a PHA-coated or PHA-coated nucleus, preferably PHB-V, as described above to improve the quality of the pearl obtained.
  • nucleus an element, generally spherical, formed of a natural compound (for example in Mississipi mold nacre, Amblema plicata) or synthetic (for example Bironite) introduced into the recipient oyster during the graft stage, and serving as a support for the nacre deposit by the recipient pearl oyster.
  • Said nucleus may be coated with particular substances to improve the quality of the pearl obtained.
  • pearl culture human activity for pearl oyster culture pearl production generally belonging to the genus Pinctada sp.
  • bactericidal agent is meant a substance having a bactericidal action, i.e. resulting in the death of bacteria.
  • bacteriostatic agent is meant a substance having a bacteriostatic action, i.e. blocking the development, growth and / or division of bacteria.
  • primary film is meant a conditioning film composed of proteins or protein fragments, carbohydrates, lipids, mineral materials such as mineral salts, from the surrounding environment. This primary film stimulates bacterial adhesion.
  • unwanted biofilm is meant a film of microorganisms, usually bacteria, which cling to the primary film, in a first reversible and then irreversible adhesion step.
  • MIC is meant the minimum concentration from which an agent inhibits the visible growth of a microorganism after overnight incubation.
  • the methods for determining the MIC of an agent are well known in the state of the art.
  • aquaculture all human activities of animal or plant production in the aquatic environment, particularly in marine, river or water.
  • Aquaculture concerns in particular the production of fish (we speak of fish farming), shellfish (shellfish or pearl farming in particular), crustaceans (astaciculture and peneticulture in particular), or even seaweed (seaweed farming).
  • mother-of-pearl is meant a biomineralized structure formed of aragonite crystals (constituting nearly 90% of the nacre) and conchyoline; aragonite being a chemical compound of formula CaCO 3 + traces of Sr; Pb; Zn.
  • Figure 1 is a diagram showing the different stages of grafting and pearl formation.
  • A Registry.
  • B Formation of pearl bag and pearl within the pearl pocket (Illustration C. Montagnani).
  • Figure 2 is an assembly of photos obtained by scanning microscopy, uncoated (a) and coated (b and c) nuclei.
  • the marks correspond to voluntary tearing to reinforce the presence of the film.
  • Nuclei were coated with a film comprising bacterial PHB-V FAK1402.
  • FAK1402 is a PHB-V PHA in which the HB / HV ratio is 64/36. These nuclei were obtained by immersing for 10 min at a constant temperature of 20 ° C in a TFE solvent supplemented with FAK1402 resulting from biotechnological fermentation processes at a concentration of 1% w / v, followed by vacuum drying.
  • Figure 2 obtained by scanning microscopy unambiguously shows the presence of a film.
  • Figure a shows an uncoated nucleus.
  • Figures b and c show the presence of the film after a tear, respectively without washing and after washing with water.
  • Standard diameter nuclei were used for studies of the influence of pretreatment of surfaces with bacterial PHA film.
  • the nuclei are coated with a film comprising PHB-V FAK1402 alone or in combination with tachyplesin (PAM).
  • PAM tachyplesin
  • a conventional bacterial growth inhibition test was performed on these nuclei: the nuclei were brought into contact with a bacterial solution in the exponential phase of growth of the Vibrio strain isolated from Pinctada margaritifera during a transplant in Tahiti for 18 hours at 30 ° C. The bacterial solution is then spread on petri dish (Zobell Agar medium) and the colonies developed are then counted. Uncoated nuclei are used as negative controls.
  • nucleus uncoated or coated with polyhydroxyalkanoate film FAK1402 alone showed no inhibitory effect on bacterial growth.
  • nuclei coated with an antimicrobial peptide associated with a polyhydroxyalkanoate film FAK1402 showed a bactericidal activity.
  • Uncoated or PHA-coated nuclei of the invention (PHB-V in which the HB / HV ratio is 64/36), alone or in combination with a PAM (tachyplesin) were grafted to oysters recipients in combination with part of the mantle epithelium of a recipient oyster (graft). 64 donor oysters were used for this experiment. 8 transplant experiments were performed by nucleus type and donor.
  • PHA or PHA + PAM film inhibits oyster mortality by almost 20% and 30%, respectively.
  • Uncoated or PHA-coated nuclei of the invention (PHB-V in which the HB / HV ratio is 64/36) alone or in combination with a PAM (tachyplesin) have been used in experiments. graft as described above.
  • the presence of the PHA or PHA + PAM film increases the maintenance of nuclei in the recipient oyster by more than 6.5%.

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Abstract

La présente invention concerne un nucléus revêtu ou enrobé par un film comprenant un ou plusieurs PHA. L'invention concerne également un PHA caractérisé en ce qu'il est de type PHB-V, un film et une composition comprenant ledit PHA. Un autre objet de l'invention est un film ou une composition comprenant un PHA et de l'acide zostérique ou une molécule bioactive. L'invention a également pour objet une surface, préférentiellement un nucléus, recouvert du film de PHA, son procédé de production, et des procédés de greffe d'une huître perlière et de fabrication d'une perle utilisant ce nucléus. Enfin, la présente invention concerne un procédé de réduction de l'échec de greffe et/ou d'amélioration de la qualité de la perle utilisant le nucléus selon l'invention.

Description

NUCLÉUS RECOUVERT DE PHA
[Domaine de l'invention]
La présente invention concerne le domaine de l'enrobage de nucléus dans le cadre de la perliculture (production de perles par des huîtres perlières). La présente invention a donc pour objet un nucléus revêtu d'un film homogène présentant des propriétés antibactériennes, et permettant d'améliorer la qualité de la perle obtenue et de réduire la mortalité consécutive à l'insertion dudit nucléus dans l'huître perlière receveuse et le phénomène de rejet de nucléus.
[État technique antérieur à l'invention]
La perliculture est une activité humaine consistant en la culture, en milieu naturel, d'huîtres perlières Pinctada sp en vue de la production de perles de culture. La première étape concerne la collecte et l'élevage des huîtres perlières qui serviront soit d'huître donneuse soit d'huître receveuse. La greffe consiste en l'opération chirurgicale au cours de laquelle le greffon, une partie de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse (environ 4 mm2) est inséré dans la poche perlière de l'huître receveuse, en combinaison avec une bille de nacre, le nucléus. Une fois insérée dans l'huître receveuse, la bordure épithéliale du greffon se multiplie et tapisse la poche perlière pour donner le sac perlier qui englobe le nucléus. Ledit sac perlier dépose des couches de nacre autour du nucléus, résultant en la production de la perle (Montagnani et al., 2009). Afin de garantir la production d'une perle de qualité, la surface du nucléus doit être la plus régulière possible, sans irrégularités.
Des mortalités et des rejets de nucléus se produisent pendant environ 45 jours après la greffe, à des taux variables. Ces phénomènes, qui touchent de 40 à 50% des huîtres dans les trois semaines suivant l'intervention, semblent résulter de pathologies infectieuses, ou d'une pratique de greffe inadaptée. Le développement d'une réaction inflammatoire suite à l'insertion du nucléus et la contamination par des bactéries pathogènes, combinées à l'absence de cicatrisation rapide des tissus incisés lors de la greffe sont probablement les causes principales de rejet de nucléus (Cochennec et al., 2010).
Il existe donc un besoin de procédés ayant pour résultat la diminution du taux d'échec des opérations de greffe, se traduisant notamment par la diminution de la mortalité et du rejet de nucléus, tout en garantissant la production de perles de première qualité.
La demande de brevet JP05219856 décrit l'insertion dans l'huître receveuse, pendant l'étape de greffe et en parallèle du nucléus ou au moyen du nucléus, d'un matériau solide contenant à sa surface un polymère hydrosoluble associé à un antibiotique.
La demande de brevet japonais JP02308869 revendique l'utilisation d'un nucléus recouvert d'un polymère synthétique associé à un agent antisalissure pour améliorer notamment la qualité des perles obtenues, en augmentant l'homogénéité de la surface du nucléus, et pour diminuer les phénomènes de rejet et de mortalité, en évitant par exemple la colonisation du nucléus par divers parasites.
Le brevet US6514614 décrit l'enrobage du nucléus par un polymère hydrosoluble, associé à une substance ayant une activité antibactérienne, ledit polymère étant partiellement dissous par l'eau de mer (le taux de dissolution étant supérieur à 25%) pour permettre une diminution effective des frictions et de la résistance à l'insertion dudit nucléus.
Enfin, la demande de brevet japonais JP03183424 décrit un système d'enrobage du nucléus par un polymère hydrosoluble (ou par tout autre composé permettant une administration différée), permettant l'administration à un taux contrôlé d'un antibiotique associé audit polymère.
Cependant, les solutions proposées dans les publications citées ci-dessus posent un problème environnemental, du fait de la biodégradabilité nulle ou incomplète des éléments utilisés, qu'il s'agisse des agents d'enrobage synthétiques ou des antibiotiques. D'autre part, l'utilisation d'antibiotiques pose également un problème de santé publique, par le biais du développement de résistances bactériennes. Enfin, l'emploi de polymères hydrosolubles entraîne une limitation de l'action de ces composés dans le temps, avec une disparition progressive du composé d'enrobage lors de l'immersion des huîtres dans le milieu aqueux.
De façon surprenante, l'Inventeur a remarqué que l'enrobage du nucléus par un film de polyhydroxyalcanoate (PHA), un polymère naturel, biodégradable et non hydrosoluble, permet de réduire le taux d'échec des opérations de greffe, et d'améliorer la qualité des perles obtenues.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les Inventeurs proposent que l'enrobage du nucléus par un film de PHA permettrait d'homogénéiser la surface du nucléus, limitant ainsi la présence d'irrégularités de surface sur la perle. D'autre part, les PHA pourraient limiter l'adhésion de bactéries sur le nucléus, et la croissance bactérienne. Cet effet intrinsèque des PHA, couplé à l'association dudit film de PHA avec des agents bactéricides ou bactériostatiques, comme par exemple les peptides antimicrobiens (PAM), permettrait ainsi de diminuer l'occurrence de contaminations microbiennes. La présence des PHA seuls ou en combinaison avec un agent bactéricide ou bactériostatique permettrait alors de diminuer les échecs de l'étape de greffe, et notamment de diminuer la mortalité des huîtres receveuses et le rejet de nucléus par lesdites huîtres.
[Résumé]
La présente invention concerne un nucléus revêtu ou enrobé d'un film comprenant un ou plusieurs polyhydroxyalcanoates (PHA). Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit PHA est un polymère de HB (PHB), un polymère de HV (PHV) ou copolymère HB-HV (PHB-V).
La présente invention concerne également un PHA, caractérisé en ce qu'il est de type PHB-V, dans lequel le ratio HB/HV est supérieur ou égal à 50/50 et inférieur à 70/30.
La présente invention concerne en outre une composition et un film comprenant ou consistant en un PHA tel que décrit ci-dessus. Un autre objet de la présente invention est une composition ou un film comprenant un PHA et de l'acide zostérique.
Un autre objet de la présente invention est une composition ou film comprenant un PHA et une ou plusieurs molécules bioactives, choisies parmi les agents cicatrisants ou anti-inflammatoires et les agents bactéricides ou bactériostatiques, tels que par exemple les antibiotiques chimiques et les peptides antimicrobiens.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un film tel que décrit ci-dessus, pour recouvrir une surface, ladite surface étant un nucléus de perliculture ou une surface amenée à être en contact, de préférence en contact répété ou prolongé, avec de l'eau, telle que par exemple de l'eau de mer ou de l'eau douce, ladite surface étant, par exemple, la surface d'un bac, par exemple d'un bac en matière plastique ou métallique, utilisé en aquaculture, de préférence en pisciculture, ou les supports et cordages utilisés lors de l'élevage des huîtres.
Un autre objet de la présente invention est donc une surface recouverte d'un film tel que décrit ci-dessus, ladite surface étant de préférence un nucléus.
La présente invention concerne également un procédé de protection des surfaces, comprenant le recouvrement, l'enrobage ou le revêtement de ladite surface par un film tel que décrit ci-dessus.
La présente invention concerne en outre un procédé d'obtention d'un nucléus tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant une première étape consistant en l'immersion du nucléus dans une solution comprenant un ou plusieurs PHA à une concentration de 0.1 à 10% en poids par rapport au volume de la solution, dans du trifluoroéthanol, ladite première étape étant éventuellement suivie d'une seconde étape consistant en l'immersion du nucléus dans une solution comprenant un ou plusieurs agents bactéricides ou bactériostatiques à une concentration de 1 à 10 CMI.
La présente invention concerne également un deuxième procédé d'obtention d'un nucléus tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant une seule étape consistant en l'immersion du nucléus dans une solution comprenant des PHA à une concentration de 0.05 à 10% en poids par rapport au volume total de la solution et un ou plusieurs agents bactéricides ou bactériostatiques à une concentration de 1 à 10 CMI dans du trifluoroéthanol.
Un autre objet de l'invention est un troisième procédé d'obtention d'un nucléus tel que décrit ci-dessus, ledit procédé comprenant une seule étape consistant en l'utilisation d'un spray pour pulvériser une composition telle que décrite ci-dessus à l'aide d'un spray sur le nucléus.
La présente invention concerne donc également un spray comprenant ou consistant en une composition telle que décrite ci-dessus.
Un autre objet de l'invention est une huître comprenant un nucléus tel que décrit ci-dessus ou obtenu par l'un des procédés de l'invention.
Encore un autre objet de l'invention est un procédé de greffe d'une huître perlière receveuse comprenant l'insertion dans la poche perlière de l'huître perlière receveuse d'un greffon, correspondant à de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse, en combinaison avec un nucléus tel que décrit ci-dessus ou obtenu par l'un des procédés tel que décrit ci-dessus.
La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'une perle de perliculture, comprenant le procédé de greffe décrit ci-avant.
La présente invention concerne en outre une perle obtenue par le procédé de fabrication d'une perle tel que décrit ci-dessus, ou comprenant le nucléus selon l'invention, ou comprenant le film selon l'invention sous une ou plusieurs épaisseurs de nacre.
Un autre objet de l'invention est un procédé d'amélioration de la qualité de la perle et/ou de réduction de l'échec de greffe d'une huître receveuse par un nucléus, ledit échec correspondant à une mortalité ou à un rejet du nucléus par l'huître perlière receveuse, et ledit procédé comprenant la greffe de l'huître receveuse par un nucléus tel que décrit ci-dessus.
La présente invention concerne également l'utilisation du nucléus selon l'invention, pour réduire l'échec de greffe et/ou améliorer la qualité de la perle obtenue. [Description détaillée]
En perliculture, la production de la perle résulte du dépôt de nacre sur un nucléus inséré dans l'huître receveuse lors de l'étape de greffe. L'étape de greffe du nucléus présente généralement un taux d'échec élevé, du fait d'une faible cicatrisation de l'huître receveuse au niveau de l'incision pratiquée lors de la greffe, ou de contaminations bactériennes. Ainsi, les nucléi utilisés en perliculture sont de plus en plus souvent recouverts d'un revêtement permettant de diminuer l'échec de l'étape de greffe, et de garantir l'homogénéité de la surface du nucléus, résultant en une perle de haute qualité.
La présente invention concerne donc un nucléus revêtu ou enrobé d'un film comprenant un ou plusieurs polyhydroxyalcanoates (PHA). Suivant un mode de réalisation de l'invention, le film de PHA est continu autour du nucléus. Suivant un mode de réalisation de l'invention, le film de PHA présente une épaisseur de 0.1 à 200 μιη, de préférence de 1 à 100 μιη, plus préférentiellement de 5 à 50 μιη.
Il a été clairement démontré que certaines bactéries avaient la capacité de synthétiser, dans des conditions contrôlées, des polymères dont les PHA (polyhydroxyalcanoates) en réponse à des conditions de déséquilibre nutritionnel.
Les PHA bactériens sont des polyesters naturels, 100 % biodégradables et issus de ressources renouvelables. Ces biopolymères sont accumulés au sein des cellules bactériennes sous forme de granules lorsqu'un nutriment nécessaire à la croissance bactérienne devient limitant en présence d'un excès de substrat carboné. Les propriétés physico-chimiques des PHA dépendent de leur composition chimique, elle-même influencée par la nature de la source carbonée utilisée pour la croissance des bactéries et la synthèse de PHA. Ces biopolymères peuvent être produits à l'échelle industrielle et, de par une composition complexe et propre à chaque microorganisme, possèdent des propriétés rhéologiques, physico-chimiques et biologiques leur conférant des applications dans de nombreux secteurs industriels. Au rang de ces propriétés, on peut notamment relever les propriétés adhésives et filmogènes. Les PHA présentent également l'avantage de ne pas être solubles dans l'eau. Les PHA sont des polymères de type polyester constitués de la répétition de l'unité monomérique ci-dessous :
Figure imgf000008_0001
dans laquelle R est un groupe alkyl ou alkényl de taille variable, et m et n sont des entiers, de préférence m est égal à 1 ou 2, plus préférentiellement m est égal à 1.
Les PHA peuvent être divisés en 3 classes : les PHAscl (short chain lenght) constitués d'acides hydroxyalcanoïques comptant jusqu'à 5 atomes de carbone, les PHAmcl (médium chain lenght) dont les unités monomériques comptent 6 à 12 atomes de carbone, et les PHAlcl (long chain lenght) dont les unités constitutives comptent de 12 à 16 carbones. Les premiers (sel) sont rigides et cassants tandis que les seconds (mcl et Ici) entrent dans la catégorie des élastomères et adhésifs.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les PHA utilisés dans l'invention sont obtenus par fermentation de bactéries issues de tapis microbiens.
Selon un mode de réalisation, lesdits PHA sont synthétisés dans des conditions contrôlées (déséquilibre nutritionnel et énergétique généré par la limitation d'un élément nécessaire à la croissance bactérienne en présence d'un excès d'une source de carbone) lors de la fermentation de bactéries issues de tapis microbiens. Suivant un mode de réalisation, ces PHA sont choisis parmi ceux synthétisés par des bactéries du genre Pyrococcus sp, Vibrio sp, Alteromonas sp, Pseudomonas sp ou Pseudoalteromonas sp, conformément à la taxonomie en vigueur au jour de la présente invention. Si la taxonomie devait être modifiée, l'homme du métier pourrait adapter les modifications de taxonomie pour en déduire les PHA utilisés dans l'invention. Avantageusement, ces bactéries sont des bactéries hétéro trophes, aérobies, mésophiles.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les bactéries productrices des PHA utilisés dans l'invention sont cultivées pendant 1 à 5 jours, de préférence pendant 2 à 4 jours, plus préférentiellement pendant environ 3 jours sur un milieu appauvri en azote et enrichi en source de carbone dans des conditions suivantes : salinité 35 o, température 30°C, pH 7.6. Selon un mode de réalisation de l'invention, le milieu de culture des bactéries contient une ou plusieurs sources de carbone, de nature carbohydrate ou acide gras. Selon un mode de réalisation de l'invention, la ou les sources de carbone sont sélectionnées parmi le groupe comprenant le glucose, le glycérol, l'acétate, le benzoate, l'octanoate, le pyruvate, le propionate, le valérate, et leurs mélanges. Selon un mode de réalisation de l'invention, la concentration totale en sources de carbone dans le milieu de culture varie de 1 à 30 g/L, de préférence de 5 à 20 g/L, plus préférentiellement est d'environ 10 g/L. Selon un mode de réalisation, la nature du PHA produit par les bactéries productrices varie selon la concentration en source carbonée, le type de source de carbone utilisée, et, dans le cas d'un mélange, selon le ratio des différentes sources utilisées.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les PHA utilisés dans l'invention sont extraits des bactéries productrices par une méthode comprenant l'extraction du culot bactérien par utilisation de solvants organiques et/ou inorganiques, préférentiellement organiques. Selon un mode de réalisation de l'invention, les PHA sont récupérés par une extraction à l'aide d'un solvant sélectionné dans le groupe comprenant le chloroforme et le dichlorométhane, suivie d'une précipitation du polymère PHA dans l'éthanol.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les PHA utilisés dans l'invention sont des PHA à chaîne courte. Les PHA à courte chaîne sont constitués de monomères d'acide hydroxybutyrique (HB) et/ou d'acide hydroxyvalérique (HV). Des exemples de PHA à courte chaîne sont le PHB (polyhydroxybutyrate), dans lequel R est CH3 et m est 1 et le PHB-V (poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)), dans lequel R est CH3 ou CH2-CH3 et m est 1.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le PHA utilisé dans l'invention est choisi parmi le groupe comprenant des polymères de HB (PHB), des polymères de HV (PHV) et des co-polymères HB-HV (PHB-V).
Un autre objet de l'invention est un PHA de type PHB-V, dans lequel le ratio HB/HV est supérieur ou égal à 50/50 et inférieur à 70/30. Un autre objet de l'invention est un PHA de type PHB-V, dans lequel le ratio HB/HV est supérieur ou égal à 50/50 et inférieur à 65/35. Un autre objet de l'invention est un PHA de type PHB-V, dans lequel le ratio HB/HV est supérieur ou égal à 50/50 et inférieur à 60/40. Un autre objet de l'invention est un PHA de type PHB-V, dans lequel le ratio HB/HV est supérieur ou égal à 50/50 et inférieur à 55/45. Un autre objet de l'invention est un PHA de type PHB- V, dans lequel le ratio HB/HV est égal à 50/50. Un autre objet de l'invention est un PHA de type PHB-V, dans lequel le ratio HB/HV est égal à 64/36.
Selon un mode de réalisation, le PHB-V selon l'invention possède des propriétés adhésives et/ou filmo gènes.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le PHB-V selon l'invention n'est pas soluble dans l'eau.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le PHB-V de l'invention est obtenu par fermentation de bactéries issues de tapis microbiens, de préférence de bactéries marines issues de tapis microbiens.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le PHB-V de l'invention est synthétisé dans des conditions contrôlées (déséquilibre nutritionnel et énergétique généré par la limitation d'un élément nécessaire à la croissance bactérienne en présence d'un excès d'une source de carbone) lors de la fermentation de bactéries issues de tapis microbiens.
Suivant un mode de réalisation, ce PHB-V est choisi parmi ceux synthétisés par des bactéries du genre Pyrococcus sp, Vibrio sp, Alteromonas sp, Pseudomonas sp ou Pseudoalteromonas sp conformément à la taxonomie en vigueur au jour de la présente invention. Si la taxonomie devait être modifiée, l'homme du métier pourrait adapter les modifications de taxonomie pour en déduire les PHB-V de l'invention. Avantageusement, ces bactéries sont des bactéries hétéro trophes, aérobies, mésophiles.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les bactéries productrices du PHB- V selon l'invention sont cultivées sur un milieu appauvri en azote et enrichi en source de carbone dans des conditions suivantes : salinité 35 o, température 30°C, pH 7.6.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le PHB-V selon l'invention est extrait de bactéries productrices par une méthode comprenant l'extraction du culot bactérien par utilisation de solvants organiques et/ou inorganiques, préférentiellement organiques. Selon un mode de réalisation de l'invention, le PHB-V est récupéré par une extraction à l'aide d'un solvant sélectionné dans le groupe comprenant le chloroforme et le dichlorométhane, suivie d'une précipitation du polymère PHA dans l'éthanol.
Un objet de l'invention est une composition comprenant ou consistant en un PHB-V tel que décrit ci-dessus.
Un autre objet de l'invention est un film comprenant ou consistant en un PHB- V selon l'invention. Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit film de PHB-V présente une épaisseur de 0.1 à 200 μιη, de préférence de 1 à 100 μιη, plus préférentiellement de 5 à 50 μιη.
Encore un autre objet de l'invention est un film comprenant ou consistant en un PHB-V selon l'invention pour recouvrir une surface. Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite surface est un nucléus de perliculture. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ladite surface est une surface amenée à être en contact, de préférence en contact répété ou prolongé, avec de l'eau, telle que par exemple de l'eau de mer ou de l'eau douce. Selon ce mode de réalisation, ladite surface peut être, par exemple, la surface d'un bac, par exemple d'un bac en matière plastique ou métallique, utilisé en aquaculture, de préférence en pisciculture. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les surfaces recouvertes par un film comprenant ou consistant en un PHB-V selon l'invention sont utilisées dans le cadre de la perliculture, telles que, par exemple, les supports et cordages utilisés lors de l'élevage des huîtres.
Un autre objet de l'invention est un procédé de protection des surfaces, comprenant le recouvrement, l'enrobage ou le revêtement de ladite surface par un film comprenant ou consistant en un PHB-V selon l'invention. Le recouvrement, l'enrobage ou le revêtement de la surface à protéger permettrait de prévenir la formation d'un biofilm primaire, et consécutivement d'un biofilm bactérien indésirable sur ladite surface. Selon un mode de réalisation, lesdites surfaces sont choisies parmi celles citées ci-dessus.
La composition ou le film de PHB-V selon l'invention peuvent être utiles pour inhiber la croissance bactérienne. En effet, le PHB et le PHB-V sont dégradés en acide β-hydroxybutyrique par l'action de dépolymérases bactériennes et fongiques, par les tissus animaux ou sous conditions alcalines ou acides. Différentes études ont montré que l'acide hydroxybutyrique est un acide gras volatile à courte chaîne, possédant une action inhibitrice sur la croissance bactérienne (Van Immerseel, 2003 et Defoirdt, 2007). Les acides gras volatiles à courte chaîne (dont l'acide hydroxybutyrique) seraient capables de franchir la membrane cellulaire des bactéries et de se dissocier dans le milieu alcalin du cytoplasme, augmentant ainsi la concentration intracellulaire en proton. En conséquence, les cellules bactériennes utiliseraient de l'énergie pour maintenir leur pH intracellulaire à un niveau optimal. Cette énergie ne pourrait pas être utilisée pour d'autres processus métaboliques, la croissance des cellules est donc inhibée. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, l'Inventeur propose l'hypothèse selon laquelle, une fois le nucléus enrobé d'un film de PHB-V selon l'invention introduit dans l'huître receveuse, les tissus de ladite huître dégraderaient les PHB-V en acide hydroxybutyrique, inhibant ainsi la croissance bactérienne.
Suivant un mode de réalisation, le ou les PHA, notamment le ou les PHB-V selon l'invention sont natifs. Suivant un autre mode de réalisation, le ou les PHA, notamment le ou les PHB-V selon l'invention peuvent être chimiquement ou physiquement modifiés. Suivant un mode de réalisation de l'invention, le PHA utilisé dans l'invention est modifié par ajout de groupement(s) sulfate, sulfonate, acétate, lactate, succinate, pyruvate, ou de groupements modifiant la balance hydrophobe/hydrophile des PHA résultant, de préférence lesdits groupements sont sélectionnés parmi le groupe comprenant les groupements époxyde, alcool, acide carboxylique. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le PHA utilisé dans l'invention est modifié par dépolymérisation afin d'obtenir des polymères de plus bas poids moléculaire. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le PHA utilisé dans l'invention est modifié par greffage d'un polymère, de préférence d'un oligomère, telle que par exemple un exopolysaccharide (EPS).
Il a été démontré que certaines bactéries ont la capacité de synthétiser, dans des conditions contrôlées, des exopolymères dont les exopolysaccharides (EPS), en réponse à des conditions de déséquilibre nutritionnel. Les exopolysaccharides peuvent être définis comme des macromolécules formées de l'enchaînement de glucides similaires (appelés couramment sucres ou oses). Ces exopolysaccharides peuvent être produits à l'échelle industrielle, et possèdent, entre autres propriétés, des propriétés adhésives (liées à la fonction de ces molécules dans la nature) et filmogènes.
Les EPS peuvent être produits par de nombreux microorganismes tels que des bactéries gram positive ou gram négative, des archeae, des champignons, et quelques algues. Avantageusement, les EPS sont produits par des bactéries gram positives ou gram négatives, des archeae ou des algues.
Les EPS peuvent être extraits à partir de cultures de microorganismes par des méthodes d'extraction physiques ou chimiques bien connues comme par exemple sonication, centrifugation, traitement alcalin, extraction à l'éthanol, extraction enzymatique...
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS peuvent être choisis parmi ceux produits par des organismes marins tels que Bacillus, Halomonas, Planococcus, Enterobacter, Alteromonas, Pseudoalteromonas, Rhodococcus, Zoogloea, Cyanobactéries, Vibrio, comme décrit dans Satpute et al. (Biotechnology Advances 2010, 28 :436-450). Si la taxonomie devait être modifiée, l'homme du métier pourrait adapter les modifications de taxonomie pour en déduire les EPS pouvant être utilisés dans l'invention.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS peuvent être obtenus par fermentation de bactéries issues d'écosystèmes hydrothermaux profonds. Plus particulièrement, ces EPS sont ceux synthétisés dans des conditions contrôlées (déséquilibre nutritionnel généré par un rapport Carbone/ Azote élevé dû à un milieu nutritionnel enrichi en carbohydrates) lors de la fermentation de bactéries issues d'écosystèmes hydrothermaux profonds (voir par exemple Guezennec, J. (2002). Deep- sea hydrothermal vents: A new source of innovative bacterial exopolysaccharides of biotechnological interest? Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 29: 204- 208).
Selon un mode de réalisation de l'invention, les EPS sont choisis parmi HE 800, EPS 721, M0245, GG1, HYD 657, HYD 1644, HYD 1545, GY 785, MS 907, ST 716, HYD 721, GY 772, HYD 750, GY 768, GY 788, BI746, GY 786, GY 685, GY 686, ST 719, HYD 1574, HYD 1579, HYD 1582, HYD 1584, ST 708, ST 722, ST 342, ST 349, HYD 1625, et HYD 1666, de préférence MO 245, HE 800, GG1, HYD 721 et ST 716.
Suivant un mode de réalisation, les EPS sont natifs. Suivant un autre mode de réalisation, les EPS peuvent être chimiquement ou physiquement modifiés (comme par exemple par ajout de groupement(s) sulfate, acétate, lactate, succinate ou pyruvate).
De façon tout à fait inattendue, les Inventeurs ont remarqué que l'utilisation d'un nucléus recouvert d'un film de PHA, préférentiellement de PHB-V selon l'invention diminue la mortalité des huîtres receveuses consécutivement à la greffe. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, l'Inventeur suggère que la présence d'un film de PHA à la surface du nucléus modifie les propriétés physico-chimiques de la surface, limitant la formation d'un biofilm primaire, et consécutivement celle du biofilm indésirable. La présence d'un biofilm indésirable à la surface du nucléus pourrait résulter en une contamination bactérienne des tissus de l'huître, et en une mortalité de ladite huître.
Un autre objet de l'invention est une composition ou un film comprenant ou consistant en un ou plusieurs PHA, préférentiellement en un ou plusieurs PHB-V selon l'invention, associé à un agent renforçant l'inhibition de formation des biofilms du ou des PHA, de préférence ledit agent est l'acide zostérique. L'acide zostérique est décrit comme permettant la prévention de la formation de biofilms sur des surfaces (US5384176, US607741, incorporés par référence).
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'association entre le film de PHA et le ou les agents décrits ci-dessus résulte d'un phénomène d'adsorption ou d'une réaction chimique entre les PHA et lesdits agents.
Suivant un mode de réalisation, l'acide zostérique est natif. Suivant un autre mode de réalisation, l'acide zostérique peut être un dérivé modifié chimiquement, préférentiellement un dérivé de l'acide zostérique est un ester d'acide zostérique tel que décrit dans US2007/128151, incorporée par référence. Suivant un mode de réalisation préféré, le dérivé de l'acide zostérique est un dérivé acide de l'acide zostérique.
Suivant un mode de réalisation, l'acide zostérique est extrait de l'algue Zostera marina. Un autre objet de l'invention est un film comprenant ou consistant en un ou plusieurs PHA, de préférence un ou plusieurs PHB-V selon l'invention associé à un agent renforçant l'inhibition de formation des biofilms du ou des PHA, de préférence l'acide zostérique pour recouvrir une surface.
Selon un mode de réalisation, ladite surface est un nucléus.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ladite surface est une surface amenée à être en contact, de préférence en contact répété ou prolongé, avec de l'eau, telle que par exemple de l'eau de mer ou de l'eau douce. Selon ce mode de réalisation, ladite surface peut être, par exemple, la surface d'un bac, par exemple d'un bac en matière plastique ou métallique, utilisé en aquaculture, de préférence en pisciculture. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les surfaces recouvertes par un film comprenant ou consistant en un PHB-V selon l'invention sont utilisées dans le cadre de la perliculture, telles que, par exemple, les supports et cordages utilisés lors de l'élevage des huîtres.
Un autre objet de l'invention est un procédé de protection des surfaces, comprenant le recouvrement, l'enrobage ou le revêtement de ladite surface par un film comprenant ou consistant en un ou plusieurs PHA, de préférence un ou plusieurs PHB- V selon l'invention, associé à un agent renforçant l'inhibition de formation des biofilms du ou des PHA, de préférence l'acide zostérique tel que décrit ci-dessus. Le recouvrement, l'enrobage ou le revêtement de la surface à protéger permettrait de prévenir la formation d'un biofilm primaire, et consécutivement d'un biofilm bactérien indésirable sur ladite surface. Selon un mode de réalisation, lesdites surfaces sont choisies parmi celles citées ci-dessus.
Un autre objet de l'invention est une composition ou un film comprenant ou consistant en un ou plusieurs PHA, de préférence un ou plusieurs PHB-V selon l'invention, associé à une ou plusieurs molécules bioactives.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'association entre le film de PHA, de préférence un ou plusieurs PHB-V selon l'invention, et la ou les molécules bioactives résulte d'un phénomène d'adsorption ou d'une réaction chimique entre les PHA et lesdites molécules. Suivant un mode de réalisation, ces molécules bioactives sont des agents cicatrisants ou anti-inflammatoires tels que collagène, fibrinogène, laminine, ou facteurs de croissance. En perliculture, l'ajout d'un agent cicatrisant ou anti-inflammatoire sur le nucléus pourrait permettre d'accélérer la cicatrisation de l'incision réalisée pendant la greffe, ou d'en limiter l'inflammation, phénomène pouvant conduire à la mort de l'huître.
Suivant un autre mode de réalisation, ces molécules bioactives sont des agents bactéricides ou bactériostatiques. En perliculture, l'ajout d'un agent bactéricide ou bactério statique sur le nucléus permettrait de limiter l'occurrence de contaminations bactériennes chez l'huître receveuse, pouvant conduire à un rejet du nucléus ou à la mort de ladite huître.
Suivant un mode de réalisation de l'invention, les agents bactéricides ou bactériostatiques sont choisis parmi les antibiotiques chimiques comme par exemple la tétracycline, kanamycine, sulfamonométhoxyne, ampicilline.
Suivant un autre mode de réalisation de l'invention, les agents bactéricides ou bactériostatiques sont choisis parmi les peptides antimicrobiens (PAM). Les peptides antimicrobiens (PAM) sont des molécules effectrices de l'immunité innée, conservées au cours de l'évolution et répandues dans tout le règne vivant. Une grande variété de PAM a été identifiée au cours des dernières années, révélant une grande diversité en termes de structures, tailles et modes d'action. Les PAM sont généralement caractérisés par une forte représentativité en acides aminés cationiques et hydrophobes. Ces molécules ont le plus souvent un caractère amphiphile essentiel pour leur interaction avec les membranes bactériennes (Bulet et al. 2004). Les PAM tuent les microorganismes, soit en perméabilisant leur membrane par un effet de type détergent ou par la formation de pores, soit par le blocage de la synthèse de peptidoglycane composant la paroi bactérienne, soit encore par l'inhibition des voies métaboliques bactériennes (Brodgen 5 et al., 2005).
Par rapport aux antibiotiques chimiques généralement utilisés, les PAM présentent l'avantage d'être totalement biodégradables. Ils apparaissent comme de bons candidats en substitution aux antibiotiques chimiques conventionnels, du fait de leurs propriétés biologiques. En effet, ils présentent un large spectre d'activité antimicrobienne, peu de spécificité, différents modes d'action, une innocuité sur le milieu.
Les PAM peuvent être produits par synthèse chimique ou par l'expression en système recombinant (clonage, expression, purification) bactérien ou levure. Selon un mode de réalisation de l'invention, les PAM sont synthétisés par synthèse chimique. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les PAM sont synthétisés par synthèse biologique en système recombinant bactérien ou fongique et de préférence, en système levure.
Suivant un mode de réalisation de l'invention, les PAM peuvent appartenir à la famille des PAM linéaires à hélice alpha, à la famille des PAM présentant une surreprésentation en un ou plusieurs acides aminés, à la famille des PAM à épingles à cheveux (bêta Hairpin) avec 1 ou 2 ponts disulfures, à la famille des PAM cycliques à feuillet bêta et hélice alpha avec 3 ponts disulfure ou plus (Bulet et al., Immunological reviews, 2004, 198 : 169-184 ; Brogden, Nature Review Microbiology, 2005, 3 :238- 250).
Des exemples de PAM linéaires à hélice alpha incluent, mais ne sont pas limités à, cécropine, stomoxyne, ponéricine, spinigérine, l'oxyopinine, la cupiennine, clavanine, styeline, pardaxine, misgurine, pleurocidine, parasine, oncorhyncine, moronécidine, magainine, temporine, cathelicidine, indolicidine.
Des exemples de PAM enrichis en un ou plusieurs acides aminés, proline, arginine, glycine, ou tryptophane, incluent, mais ne sont pas limités aux bacténicines, PR-39, abaecines, apidaecines, drosocine, pyrrhocoricines, Cg-Prp, prophenine, indolicine.
Des exemples de PAM en épingles à cheveux contenant 2 à 4 cysteines incluent, mais ne sont pas limités à, la tachyplesine, la protégrine, la thanatine, l'androctonine, la gomesine, la polyphemusine, l'hepcidine, la brevinine, l'esculentine, la tigerinine ou la bactenecine.
Des exemples de PAM cycliques contenant 6 ou plus résidus de cystéines ou à cycle ouvert incluent, mais ne sont pas limités à, défensines (de vertébrés, d'invertébrés ou de plantes), termicine, héliomicine, drosomycine, ASABF, pBD, pénaeidines, ALF, big-défensines.
Des exemples de défensines d'invertébrés sont les défensines d'huître Cg-Defs ou les défensines de moules MGD.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le PAM est choisi parmi la tachyplesine et les défensines d'huître Cg-Defs.
Un autre objet de l'invention est un film comprenant ou consistant en un ou plusieurs PHA, de préférence un ou plusieurs PHB-V selon l'invention, associé à une ou plusieurs molécules bioactives, tel que décrit ci-dessus pour recouvrir une surface.
Selon un mode de réalisation, ladite surface est un nucléus.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ladite surface est une surface amenée à être en contact, de préférence en contact répété ou prolongé, avec de l'eau, telle que par exemple de l'eau de mer ou de l'eau douce. Selon ce mode de réalisation, ladite surface peut être, par exemple, la surface d'un bac, par exemple d'un bac en matière plastique ou métallique, utilisé en aquaculture, de préférence en pisciculture. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les surfaces recouvertes par un film comprenant ou consistant en un PHB-V selon l'invention sont utilisées dans le cadre de la perliculture, telles que, par exemple, les supports et cordages utilisés lors de l'élevage des huîtres.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le film comprenant des PHA, préférentiellement des PHB-V selon l'invention, optionnellement associé à des molécules biactives ou à un agent renforçant l'inhibition de formation des biofilms du ou des PHA, de préférence l'acide zostérique résiste au lavage par l'eau de mer et est stable pendant plus de 3 semaines, préférentiellement plus d'un mois, encore plus préférentiellement plus de 6 mois à des températures variant entre 4 et 30°C. Ainsi, le film selon l'invention ne se dissout pas lors de la mise en contact avec l'eau de mer et ce, pendant au moins 3 semaines. La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'un nucléus revêtu ou enrobé d'un film comprenant un ou plusieurs polyhydroxyalcanoates (PHA), de préférence le PHB-V selon l'invention, ledit film pouvant être associé à des molécules biactives ou à un agent renforçant l'inhibition de formation des biofilms du ou des PHA, de préférence l'acide zostérique, tel que décrit ci-dessus.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé selon l'invention comprend une première étape consistant en l'enrobage du nucléus par le film de PHA, de préférence par le film de PHB-V selon l'invention, éventuellement suivi d'une seconde étape consistant en l'association au film de PHA formé d'une ou plusieurs autres molécules, telles que décrites ci-dessus.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé comprend une première étape d'immersion du nucléus dans une solution comprenant un ou plusieurs PHA, de préférence un ou plusieurs PHB-V selon l'invention, dans du trifluoroéthanol (CF3CH2OH, TFE). Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ladite solution de PHA possède une concentration en PHA de 0.1 à 10 % poids/volume, plus préférentiellement de 0.5 à 5 , encore plus préférentiellement de 1 % en poids de PHA par volume de la solution de TFE.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite première étape d'immersion du nucléus dans une solution contenant un ou plusieurs PHA est réalisée à une température constante, préférentiellement à température ambiante (i.e. de 15 à 25 °C), plus préférentiellement environ 20°C. Selon ce mode de réalisation de l'invention, ladite première étape d'immersion du nucléus dans une solution contenant un ou plusieurs PHA est réalisée préférentiellement pendant 10 minutes à 3 heures, plus préférentiellement pendant 20 minutes à 1 heure, encore plus préférentiellement environ 30 minutes.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ladite première étape d'immersion du nucléus dans une solution contenant un ou plusieurs PHA est réalisée à une température constante, préférentiellement de 1 à 10°C, plus préférentiellement environ 4°C. Selon ce mode de réalisation de l'invention, ladite première étape d'immersion du matériau dans une solution contenant un ou plusieurs PHA est réalisée préférentiellement pendant 10 minutes à 3 heures, plus préférentiellement pendant 20 minutes à 1 heure, encore plus préférentiellement pendant environ 30 minutes.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le nucléus enrobé est ensuite séché sous vide.
Lorsque le film enrobant le nucléus comprend également une ou plusieurs autres molécules, tels de l'acide zostérique, ou une molécule bioactive, telle que, par exemple, un agent bactéricide ou bactériostatique, la première étape décrite ci-dessus est suivie d'une seconde étape d'association desdites molécules. Selon un mode de réalisation de l'invention, lorsque lesdites molécules sont des agents bactéricides ou bactériostatiques, la seconde étape comprend l'immersion du nucléus enrobé d'un film de PHA dans une solution comprenant un ou plusieurs agents bactéricides ou bactériostatiques à une concentration de 1 à 10 CMI.
Selon l'invention, l'agent bactéricide ou bactériostatique est en solution dans un solvant polaire biologiquement acceptable tel que l'eau, l'éthanol, le TFE ou leur mélange comme par exemple eau/TFE, de préférence le trifluoroéthanol (CF3CH2OH).
Selon un mode de réalisation de l'invention, la seconde étape d'immersion du nucléus est réalisée à une température constante, préférentiellement de 1 à 10°C, plus préférentiellement environ 4°C.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite seconde étape d'immersion du nucléus est réalisée préférentiellement pendant 1 à 120 heures, plus préférentiellement pendant 12 à 96 heures, encore plus préférentiellement pendant 24 à 72 heures.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le nucléus enrobé est ensuite séché sous vide.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé comporte optionnellement une étape de rinçage du nucléus entre la première étape d'immersion et la seconde étape d'immersion. Selon ce mode de réalisation, le nucléus est rincé par un volume de 10 à 1000 mL d'eau distillée, préférentiellement 100 à 300 mL d'eau distillée, plus préférentiellement environ 200 mL d'eau distillée. L'invention a également pour objet un procédé d'obtention d'un nucléus revêtu d'un film comprenant un ou plusieurs PHA, de préférence par un ou plusieurs PHB-V selon l'invention, et un ou plusieurs autres molécules, telles que par exemple une ou plusieurs biomolécules, par exemple un ou plusieurs agents bactériostatiques ou bactéricides, ledit procédé comprenant une seule étape d'immersion du nucléus dans une solution comprenant des PHA et des agents bactériostatiques ou bactéricides, dans du TFE.
Selon un mode de réalisation, les PHA sont présents dans la solution à une concentration de 0.05 à 10 % en poids par rapport au volume total de la solution, préférentiellement de 0.1 à 5 , plus préférentiellement à une concentration de 1 %.
Selon un mode de réalisation, les agents bactéricides ou bactériostatiques sont présents dans la solution à une concentration de 1 à 10 CMI.
Selon un mode de réalisation, cette étape d'immersion est réalisée à une température constante, de 1 à 10°C, préférentiellement 4°C, et pendant 1 à 128 h, préférentiellement pendant 12 à 96 heures, et plus préférentiellement pendant 24 à 72h.
La présente invention concerne également un procédé d'enrobage d'un nucléus par un film comprenant un ou plusieurs PHA, de préférence un ou plusieurs PHB-V selon l'invention, éventuellement en association avec une ou plusieurs molécules choisies parmi le groupe comprenant les agents renforçant l'action d'inhibition de la formation des biofilms des PHA, de préférence l'acide zostérique et les molécules bioactives, telles que les agents cicatrisants ou anti-inflammatoires, et les agents bactériostatiques ou bactéricides, de préférence les PAM, comprenant l'utilisation d'un spray pour pulvériser la composition selon l'invention sur la surface du nucléus.
La présente invention concerne un spray comprenant ou consistant en des PHA, de préférence comprenant ou consistant en des PHB-V selon l'invention.
La présente invention concerne un spray comprenant ou consistant en un ou des PHA, de préférence un ou des PHB-V selon l'invention en association avec une ou plusieurs autres molécules choisies parmi le groupe comprenant les agents renforçant l'action d'inhibition de la formation des biofilms des PHA, de préférence l'acide zostérique et les molécules bioactives, telles que les agents cicatrisants ou antiinflammatoires, et les agents bactériostatiques ou bactéricides, de préférence les PAM.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le nucléus est d'origine naturelle, plus préférentiellement ledit nucléus est en nacre de moule du Mississipi appartenant au genre Amblema sp., de préférence Amblema plicata. Des exemples de nucléus sont ceux vendus par Aming (Standard Aming) ou par Poe Import.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit nucléus a un diamètre de 1 à 20 mm, préférentiellement de 2 à 15 mm, plus préférentiellement de 2 à 4 mm, et encore plus préférentiellement de 2,1 à 3.5 mm.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit nucléus a un diamètre de 2 à 2.5 BU, de préférence d'environ 2.4 BU. Le BU est une unité de mesure, 1BU correspondant à 3,03 mm.
L'invention a également pour objet une huître comprenant un nucléus tel que décrit ci-dessus ou obtenu par un procédé tel que décrit ci-dessus. De préférence, l'huître appartient au genre Pinctada sp., plus préférentiellement, aux espèces Pinctada fucata, Pinctada maxima, Pinctada margaritifera.
La présente invention a également pour objet un procédé de greffe d'une huître perlière receveuse, de préférence appartenant aux genres et espèces cités ci-dessus, par un nucléus revêtu ou enrobé d'un film de PHA, de préférence de PHB-V, éventuellement associé à de l'acide zostérique ou à une molécule bioactive, tel que décrit ci-dessus. La figure 1A présente les différentes étapes de la greffe. Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de greffe comprend l'ouverture manuelle de l'huître perlière receveuse, la réalisation d'une incision dans les tissus de l'huître perlière receveuse, pour accéder à la poche perlière et permettre, dans une troisième étape, l'insertion dans la poche perlière de l'huître perlière receveuse d'un greffon, correspondant à une partie de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse (environ 4 mm2), en combinaison avec un nucléus enrobé ou recouvert d'un film de PHA, de préférence de PHB-V, tel que décrit ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un procédé de production ou de fabrication d'une perle de perliculture, comprenant une étape de greffe d'une huître perlière receveuse pas un nucléus, selon le procédé décrit ci-dessus.
La présente invention concerne également un procédé d'obtention de perle comprenant l'utilisation du nucléus enrobé tel que décrit ci-dessus, ou obtenu selon un procédé d'enrobage tel que décrit ci-dessus.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé d'obtention de perle comprend la greffe d'un nucléus selon l'invention dans la poche perlière d'une huître receveuse, en combinaison avec une partie de l'épithélium du manteau d'une huître donneuse.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé de production, de fabrication ou d'obtention de perle comprend une première étape comprenant la collecte et l'élevage des huîtres perlières, de préférence appartenant aux genres et espèces cités ci-dessus, pour obtenir des huîtres perlières donneuses et des huîtres perlières receveuses.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les huîtres perlières donneuses et receveuses sont ensuite nettoyées pour retirer d'éventuels parasites.
Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé de production, de fabrication ou d'obtention de perle comprend en outre, à la suite de la greffe, une étape de culture des huîtres perlières receveuse, de préférence pendant une durée de 10 à 24 mois, de préférence de 12 à 20 mois, encore plus préférentiellement de 16 à 18 mois. Pendant la période de culture, la bordure épithéliale du greffon se multiplie et tapisse la poche perlière, pour donner un sac perlier englobant le nucléus, et qui va déposer des couches de nacre autour du nucléus, résultant ainsi en la production d'une perle (figure 1B). La présente invention concerne également la perle obtenue par le procédé tel que décrit ci-dessus.
L'invention concerne également une perle comprenant un nucléus revêtu selon l'invention, ou un nucléus obtenu par un procédé selon l'invention.
La présente invention concerne également une perle dont le nucléus est recouvert d'un film de PHA, éventuellement en association avec une ou plusieurs molécules choisies parmi le groupe comprenant les agents renforçant action d'inhibition de la formation des biofilms des PHA, de préférence l'acide zostérique et les molécules bioactives, telles que les agents cicatrisants ou anti-inflammatoires, et les agents bactériostatiques ou bactéricides, de préférence les PAM.
La présente invention concerne également une perle comprenant un film de PHA, de préférence de PHB-V selon l'invention, éventuellement en association avec une ou plusieurs molécules choisies parmi le groupe comprenant les agents renforçant l'action d'inhibition de la formation des biofilms des PHA, de préférence l'acide zostérique et les molécules bioactives, telles que les agents cicatrisants ou antiinflammatoires, et les agents bactériostatiques ou bactéricides, de préférence les PAM, sous une ou plusieurs épaisseurs de nacre.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la perle a une taille, de préférence un diamètre de 2 à 20 mm, de préférence de 5 à 15 mm, encore plus préférentiellement de 6.8 à 10 mm.
De façon surprenante, le déposant a remarqué que l'enrobage du nucléus par un film de PHA, de préférence de PHB-V selon l'invention, éventuellement associé avec une ou plusieurs molécules choisies parmi le groupe comprenant les agents renforçant l'action d'inhibition de la formation des biofilms des PHA, de préférence l'acide zostérique et les molécules bioactives, permet de réduire le taux d'échec des opérations de greffe. Ainsi, l'utilisation d'un nucléus enrobé selon l'invention diminue le taux de mortalité des huîtres receveuses dans les 30 jours post-greffe et augmente le taux de maintien du nucléus dans l'huître receveuse (Exemple 3). Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les Inventeurs proposent que l'enrobage du nucléus par ledit film permettrait de diminuer les contaminations bactériennes au sein de l'huître receveuse. De plus, l'association dudit film de PHA avec des agents bactéricides ou bactériostatiques, comme par exemple les peptides antimicrobiens (PAM), permettrait de diminuer encore l'occurrence de contaminations microbiennes. La présence des PHA, de préférence de PHB-V selon l'invention, seuls ou en combinaison avec un agent bactéricide ou bactériostatique permettrait ainsi de diminuer les échecs de l'étape de greffe, et notamment de diminuer la mortalité des huîtres receveuses et le rejet de nucléus par lesdites huîtres.
La présente invention a donc également pour objet un procédé de réduction de l'échec de greffe d'une huître receveuse par un nucléus, ledit échec correspondant à une mortalité ou à un rejet du nucléus par l'huître perlière receveuse, et ledit procédé comprenant la greffe de l'huître receveuse par un nucléus enrobé ou recouvert de PHA, de préférence de PHB-V selon l'invention, tel que décrit ci-dessus.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un nucléus enrobé ou recouvert de PHA, de préférence de PHB-V tel que décrit ci-dessus pour réduire l'échec de greffe d'une huître receveuse par un nucléus, ledit échec correspondant à une mortalité ou à un rejet du nucléus par l'huître perlière receveuse.
La présente invention concerne également un procédé d'inhibition du rejet du nucléus lors de la greffe, ledit procédé comprenant l'utilisation d'un nucléus enrobé selon l'invention lors de la greffe.
La présente invention concerne en outre un procédé de réduction de la mortalité des huîtres receveuses consécutive à l'étape de greffe, comprenant l'utilisation d'un nucléus enrobé selon l'invention lors de la greffe. Selon un mode de réalisation de l'invention, la mortalité prévenue par le procédé de l'invention est due à une infection de l'incision réalisée lors de la greffe.
L'enrobage des nucléus de perliculture par un film de PHA, de préférence de PHB-V, éventuellement associé avec une ou plusieurs molécules choisies parmi le groupe comprenant les agents renforçant action d'inhibition de la formation des biofilms des PHA, de préférence l'acide zostérique et les molécules bioactives, tel que décrit ci-dessus permettrait d'améliorer l'homogénéité de la surface du nucléus, et ainsi d'améliorer la qualité de la perle obtenue par limitation de l'apparition de défauts de surface.
La présente invention concerne également un procédé d'amélioration de l'homogénéité d'un nucléus, comprenant l'enrobage dudit nucléus par un film tel que décrit dans la présente invention.
La présente invention a donc également pour objet un procédé d'amélioration de la qualité de la perle obtenue à la suite de la greffe de l'huître perlière receveuse, ledit procédé comprenant l'utilisation d'un nucléus enrobé ou recouvert de PHA, de préférence de PHB-V, tel que décrit ci-dessus.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un nucléus enrobé ou recouvert de PHA, de préférence de PHB-V, tel que décrit ci-dessus pour améliorer la qualité de la perle obtenue.
[Définitions]
Par « nucléus », on entend un élément, généralement sphérique, formé d'un composé naturel (par exemple en nacre de moule du Mississipi, Amblema plicata) ou synthétique (par exemple en Bironite) introduit dans l'huître receveuse lors de l'étape de greffe, et servant de support au dépôt de nacre par l'huître perlière receveuse. Ledit nucléus peut-être enrobé de substances particulières pour améliorer la qualité de la perle obtenue.
Par « perliculture », on entend une activité humaine ayant pour but la production de perle de cultures par des huîtres perlières, appartenant généralement au genre Pinctada sp.
Par « agent bactéricide », on entend une substance ayant une action bactéricide, i.e. entraînant la mort des bactéries.
Par « agent bactériostatique », on entend une substance ayant une action bactériostatique, i.e. bloquant le développement, la croissance et/ou la division des bactéries.
Par « film primaire », on entend un film conditionnant composé de protéines ou de fragments protéiques, de glucides, de lipides, de matières minérales comme par exemple des sels minéraux, issus du milieu environnant. Ce film primaire stimule l'adhésion bactérienne.
Par « biofilm indésirable », on entend un film de microorganismes, généralement des bactéries, qui viennent s'accrocher au film primaire, dans une première étape d'adhésion réversible puis irréversible.
Par « CMI », on entend la concentration minimale à partir de laquelle un agent inhibe la croissance visible d'un microorganisme après incubation sur la nuit. Les méthodes de détermination de la CMI d'un agent sont bien connues dans l'état de l'art.
Par « aquaculture », on entend l'ensemble des activités humaines de production animale ou végétale en milieu aquatique, notamment en milieu aquatique marin, de rivière ou d'étant. L'aquaculture concerne notamment la production de poissons (on parle alors de pisciculture), de coquillages (conchyliculture ou perliculture notamment), de crustacés (astaciculture et pénéiculture notamment), ou encore d'algues (algoculture).
Par « nacre », on entend une structure biominéralisée formée de cristaux d'aragonite (constituant près de 90% de la nacre) et de conchyoline ; l'aragonite étant un composé chimique de formule CaC03 + traces de Sr ; Pb ; Zn.
[Description succincte des figures]
La figure 1 est un schéma présentant les différentes étapes de la greffe et de la formation de la perle. A : Greffe. B : Formation du sac perlier et de la perle au sein de la poche perlière (Illustration C. Montagnani).
La figure 2 est un assemblage de photos obtenues par microscopie à balayage, des nucléi non enrobé (a) et enrobés (b et c). Les marques correspondent à des déchirements volontaires afin de conforter la présence du film.
Les exemples qui suivent montrent des modes de réalisation particuliers de l'invention, qui illustrent non limitativement l'invention. [Exemples]
Exemple 1 : Présence du film de PHA
Des nucléi ont été revêtus d'un film comprenant le PHB-V bactérien FAK1402. FAK1402 est un PHA de type PHB-V dans lequel le ratio HB/HV est égal à 64/36. Ces nucléi ont été obtenus par immersion pendant 10 min à une température constante de 20°C dans un solvant TFE additionné de FAK1402 résultant de procédés biotechnologiques de fermentation à une concentration de 1% poids/volume, suivie d'un séchage sous-vide.
La figure 2 obtenue par microscopie à balayage montre sans ambiguïté la présence d'un film. La figure a montre un nucléus non enrobé. Les figures b et c montrent la présence du film suite à une déchirure, respectivement sans lavage et après un lavage à l'eau.
Exemple 2 : Activité antimicrobienne
Expérimentations :
Des nucléi de diamètre standard ont été utilisés pour les études portant sur l'influence d'un prétraitement des surfaces par un film de PHA d'origine bactérienne.
Les nucléi sont revêtu d'un film comprenant le PHB-V FAK1402 seul ou en combinaison avec de la tachyplesine (PAM).
Ces nucléi sont obtenus par un procédé en deux étapes :
immersion pendant 10 min à une température constante de 20°C dans un solvant TFE additionné de FAK1402 résultant de procédés biotechnologiques de fermentation à une concentration de 1% poids/volume, suivie d'un séchage sous-vide ;
(optionnellement) immersion des nucléi enrobés du film de PHA dans une solution comprenant 10 CMI (soit, 70 mg/L) de tachyplesine, suivie d'un séchage sous-vide.
Un test classique d'inhibition de croissance bactérienne a été réalisé sur ces nucléi : les nucléi ont été mis en contact avec une solution bactérienne en phase exponentielle de croissance de la souche Vibrio isolée de Pinctada margaritifera lors d'un greffe à Tahiti pendant 18h à 30°C. La solution bactérienne est ensuite étalée sur boite de pétri (milieu Zobell Agar) et les colonies développées sont ensuite comptées. Des nucléi non enrobés sont utilisés comme contrôles négatifs.
Résultats :
Les nucléus non enrobés ou enrobés avec un film de polyhydroxyalcanoate FAK1402 seul n'ont pas montré d'effet inhibiteur de la croissance bactérienne. Par contre, les nucléus enrobés par un peptide antimicrobien associé à un film de polyhydroxyalcanoate FAK1402 ont montré une activité bactéricide.
Exemple 3 : Efficacité des nucléi de l'invention dans des expériences de greffe
1. Mortalité
Des nucléus non enrobés, ou enrobés par un PHA de l'invention (PHB-V dans lequel le ratio HB/HV est égal à 64/36), seul ou en combinaison avec un PAM (la tachyplésine) ont été greffés à des huîtres receveuses en combinaison avec une partie de l'épithélium du manteau d'une huître receveuse (greffon). 64 huîtres donneuses ont été utilisées pour cette expérience. 8 expériences de greffe ont été réalisées par type de nucléus et par donneuse.
La mortalité des huîtres receveuses a été évaluée 30 jours post-greffe en pourcentage par rapport aux huîtres ayant reçu un nucléus non enrobé. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous :
Figure imgf000029_0001
La présence du film de PHA ou de PHA + PAM inhibe la mortalité des huîtres de près de 20% et 30%, respectivement.
2. Maintien de greffe
Des nucléus non enrobés, ou enrobés par un PHA de l'invention (PHB-V dans lequel le ratio HB/HV est égal à 64/36), seul ou en combinaison avec un PAM (la tachyplésine) ont été utilisés dans des expériences de greffe telles que décrites ci-dessus.
Le maintien des nucléi 30 jours post-greffe a été mesuré. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous, et sont exprimés par rapport aux huîtres ayant reçu un nucléus non enrobé.
Figure imgf000030_0001
La présence du film de PHA ou de PHA + PAM augmente le maintien des nucléi dans l'huître receveuse de plus de 6.5%.

Claims

REVENDICATIONS
1. Un nucléus revêtu ou enrobé d'un film comprenant un ou plusieurs polyhydroxyalcanoates (PHA).
2. Le nucléus selon la revendication 1, dans lequel ledit PHA est un polymère de HB (PHB), un polymère de HV (PHV) ou copolymère HB-HV (PHB-V).
3. Un PHA, caractérisé en ce qu'il est de type PHB-V, dans lequel le ratio HB/HV est supérieur ou égal à 50/50 et inférieur à 70/30.
4. Une composition comprenant ou consistant en un PHA selon la revendication 3.
5. Un film comprenant ou consistant en un PHA selon la revendication 3.
6. Une composition ou un film comprenant un PHA et de l'acide zostérique.
7. Une composition ou un film comprenant un PHA et une ou plusieurs molécules bioactives, choisies parmi les agents cicatrisants ou anti-inflammatoires et les agents bactéricides ou bactériostatiques, tels que par exemple les antibiotiques chimiques et les peptides antimicrobiens.
8. Utilisation du film selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, pour recouvrir une surface, ladite surface étant un nucléus de perliculture ou une surface amenée à être en contact, de préférence en contact répété ou prolongé, avec de l'eau, telle que par exemple de l'eau de mer ou de l'eau douce, ladite surface étant, par exemple, la surface d'un bac, par exemple d'un bac en matière plastique ou métallique, utilisé en aquaculture, de préférence en pisciculture, ou les supports et cordages utilisés lors de l'élevage des huîtres.
9. Une surface recouverte d'un film selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, ladite surface étant de préférence un nucléus.
10. Un procédé de protection des surfaces, comprenant le recouvrement, l'enrobage ou le revêtement de ladite surface par un film selon l'une quelconque des revendications 5 à 7.
11. Un procédé d'obtention d'un nucléus selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 9, ledit procédé comprenant une première étape consistant en l'immersion du nucléus dans une solution comprenant un ou plusieurs PHA à une concentration de 0.1 à 10% en poids par rapport au volume de la solution, dans du trifluoroéthanol, ladite première étape étant éventuellement suivie d'une seconde étape consistant en l'immersion du nucléus dans une solution comprenant un ou plusieurs agents bactéricides ou bactériostatiques à une concentration de 1 à 10 CMI.
12. Un procédé d'obtention d'un nucléus selon la revendication 9, ledit procédé comprenant une seule étape consistant en l'immersion du nucléus dans une solution comprenant des PHA à une concentration de 0.05 à 10% en poids par rapport au volume total de la solution et un ou plusieurs agents bactéricides ou bactériostatiques à une concentration de 1 à 10 CMI dans du trifluoroéthanol.
13. Un procédé d'obtention d'un nucléus selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 9, ledit procédé comprenant une seule étape consistant en l'utilisation d'un spray pour pulvériser une composition selon l'une quelconque des revendications 4, 6 ou 7 à l'aide d'un spray sur le nucléus.
14. Un spray comprenant ou consistant en une composition selon l'une quelconque des revendications 4, 6 ou 7.
15. Une huître comprenant un nucléus selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 8 ou obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13.
16. Un procédé de greffe d'une huître perlière receveuse comprenant l'insertion dans la poche perlière de l'huître perlière receveuse d'un greffon, correspondant à de l'épithélium du manteau de l'huître donneuse, en combinaison avec un nucléus selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 9 ou obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13.
17. Un procédé de fabrication d'une perle de perliculture, comprenant le procédé selon la revendication 16.
18. Une perle obtenue par le procédé selon la revendication 17, ou comprenant le nucléus selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 9, ou comprenant le film selon la revendication 5 à 7 sous une ou plusieurs épaisseurs de nacre.
19. Un procédé d'amélioration de la qualité de la perle et/ou de réduction de l'échec de greffe d'une huître receveuse par un nucléus, ledit échec correspondant à une mortalité ou à un rejet du nucléus par l'huître perlière receveuse, et ledit procédé comprenant la greffe de l'huître receveuse par un nucléus selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 9.
20. Utilisation du nucléus selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ou 9 pour réduire l'échec de greffe et/ou améliorer la qualité de la perle obtenue.
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