FR2900794A1 - Repulsifs anti-insectes et procede pour identifier d'autres molecules repulsives a l'egard des insectes - Google Patents

Abstract

La présente invention est basée sur l'identification du rôle du récepteur mX de certains insectes, dans le comportement gustatif desdits insectes. L'invention porte donc sur l'utilisation de modulateurs du récepteur mX, tels que L-canavanine et/ou un mélange d'arginine et de calcium, et/ou de N-méthyl-L-arginine (NMA), pour la préparation d'une composition répulsive ou attractive à l'égard de certains insectes. L'invention concerne également l'utilisation d'un récepteur mX d'insecte, comme cible pour identifier des substances répulsives à l'égard d'au moins certains insectes.

Description

La présente invention concerne le domaine de la lutte contre les insectes,

et plus particulièrement le domaine des produits répulsifs pour les insectes. A l'heure actuelle, des molécules insecticides ou répulsives à l'égard des insectes sont utilisées pour lutter contre les insectes nuisibles. Cependant, deux problèmes majeurs sont apparus et se renforcent depuis quelques années. Le premier problème est lié à l'efficacité limitée dans le temps de ces molécules, du fait des grandes capacités d'adaptation des insectes. En effet, les insectes développent rapidement des résistances vis-à-vis des molécules insecticides ou répulsives à l'égard des insectes, par mutations de la cible moléculaire entraînant une baisse, voire une perte d'affinité de ces molécules pour leur cible.

Le deuxième problème est lié à la toxicité de ces molécules envers d'autres organismes tels que les mammifères et, en particulier, l'homme. La toxicité de ces molécules insecticides ou répulsives à l'égard des insectes est principalement due au fait que leurs cibles sont conservées chez les mammifères. Les insectes nuisibles sont essentiellement les ravageurs de cultures, ainsi que les vecteurs de certaines maladies qui causent la mort de plusieurs millions de personnes par an. La lutte contre les insectes est notamment un outil essentiel de la prévention des maladies à vecteurs. Par exemple, pour certaines maladies contre lesquelles aucun vaccin efficace n'est disponible (paludisme, dengue, chikungunya), la protection individuelle contre les piqûres de moustiques permet de se protéger ; l'utilisation de répulsifs enduits sur la peau exposée est dans ce cadre un moyen de protection largement utilisé. Il existe plusieurs répulsifs de synthèse et naturels sur le marché. Le DEET (N,N-diéthyl-3-méthylbenzamide) est le répulsif de synthèse de référence.

Il présente toutefois l'inconvénient d'être en partie éliminé par évaporation mais surtout par absorption dermique. Un autre inconvénient du DEET est qu'il endommage les matières plastiques (lunettes, bracelets...). Les répulsifs d'origine naturelle (tels que la citronnelle) assurent une protection de très courte durée, souvent inférieure à une heure (Fradin et Day 2002). Aujourd'hui, il existe donc un important besoin de trouver de nouvelles molécules répulsives à l'égard des 5 insectes, qui soient stables dans le temps et non toxiques pour les mammifères, en particulier pour l'homme. Dans ce contexte, les Inventeurs ont mis en évidence un effet répulsif de l'acide aminé L-canavanine chez la drosophile. Ils ont démontré que cet effet répulsif 10 passe par un récepteur héptahélice qu'ils avaient précédemment identifié (Mitri, Parmentier et al. 2004). Ce récepteur, appelé "récepteur mX", ou "mXR", est un récepteur couplé aux protéines G, homologue aux récepteurs métabotropiques du glutamate (famille C des récepteurs 15 couplés aux protéines G) (Mitri et al., 2004). Le récepteur mX est caractérisé par une séquence particulière de résidus consensus au niveau de la poche de liaison du ligand, séquence consensus qui diffère de celle des récepteurs métabotropiques du glutamate (Mitri et al., 2004). Les 2.0 inventeurs ont identifié ce récepteur chez plusieurs insectes (actuellement les drosophiles Drosophila melanogaster, Drosophila pseudoobscura et Drosophila virilis, les moustiques Anopheles gambiae et Aedes aegyti, l'abeille Apis mellifera et le papillon Bombyx mori), et 25 montré qu'il n'existe pas dans le génome du nématode C.elegans, ni dans le génome des vertébrés (poisson zebrafish, souris, homme). Il n'existe qu'un seul gène codant pour un récepteur mX chez les espèces où il a été identifié. A ce jour, ce récepteur semble donc spécifique 30 des insectes. Malgré son effet répulsif à l'égard de la drosophile et probablement d'autres insectes, la L-canavanine ne semble pas une molécule directement utilisable comme répulsif, à cause de sa toxicité. Il est connu que la 35 L-canavanine (L-2-amino-4-(guanidinooxy)butyric acid), synthétisée par plus de 1200 espèces de légumineuses, est un puissant insecticide. En effet, chez beaucoup d'espèces d'insectes traitées à la L-canavanine , il a été décrit que cet acide aminé, non protéique chez les légumineuses qui le synthétisent, peut être incorporé dans les protéines synthétisées de novo par l'arginyl--tRNA synthetase à la place de l'arginine (Rosenthal 1977; Rosenthal 2001). Cette incorporation donne des protéines défectueuses qui présentent des structures tridimensionnelles anormales, conduisant progressivement à la stérilité ou à la mort. Ces effets toxiques de la L-canavanirne, principalement décris chez les insectes au cours du développement larvaire, ont été retrouvés chez un grand nombre d'espèces, des virus à l'homme (revue de Rosenthal, 1977). Les Inventeurs ont également identifié le ligand naturel du récepteur d'insecte mX. Ils ont montré que ce ligand naturel, à savoir la L-arginine associée au calcium, est répulsif pour les insectes. Outre le fait que l'arginine associée au calcium peut être utilisée comme répulsif, ces résultats montrent que le récepteur mX constitue un candidat cible particulièrement intéressant pour identifier de nouvelles substances ou molécules répulsives contre certains insectes, puisqu'il apparaît que d'autres ligands du récepteur mX auront eux aussi un effet répulsif. La présente invention concerne donc en premier lieu une composition répulsive à l'égard d'au moins certains insectes, qui comprend au moins un modulateur d'un récepteur mX. Comme vu plus haut, les Inventeurs ont à ce jour identifié le récepteur mX chez la drosophile Drosophila melanogaster, le moustique Anopheles gambiae, l'abeille Apis mellifera et le papillon Bombyx mori, ainsi que dans le génome d'autres espèces de drosophiles (Drosophila pseudoobscura (chromosome 3), Drosophila virilis (scaffold 12875) et dans une séquence d'un insecte nuisible, le moustique Aedes aegyti (AAGE0201'7413.1), vecteur de la dengue. Ils n'ont en outre pas identifié d'insecte dépourvu de ce récepteur, qui semble particulièrement conservé chez les insectes. Un activateur du récepteur mX de la drosophile sera donc vraisemblablement répulsif à l'égard de n'importe quel insecte. Les diptères nuisibles constituent une cible essentielle des compositions répulsives selon l'invention, puisque le récepteur mX est trouvé dans tous les génomes de diptères actuellement séquencés : on peut notamment citer les phlébotomes, petits diptères dont la femelle est hématophage et transmet la leishmaniose cutanée et la leishmaniose viscérale (maladie émergente en Europe méridionale, en particulier lors de co-infection leishmaniose--VIH/SIDA), la mouche tsé-tsé, vecteur de la maladie du sommeil, et les moustiques du genre Aedes, vecteurs de la fièvre jaune, du chikungunya et de la dengue. Parmi les insectes ciblés par les compositions répulsives selon l'invention, on peut également citer les abeilles, les papillons, les criquets, les guêpes,... Par "modulateur d'un récepteur mX", on entend bien sûr n'importe quel ligand capable d'activer mXR, mais également n'importe quel ligand antagoniste du récepteur mX. En effet, il a été montré que la réponse gustative à certains acides aminés étudiés, comme la méthionine et la valine, peut dépendre de l'espèce d'insectes étudiée, allant de stimulant à répulsif (Chapman 2003). Les antagonistes permettent d'inhiber l'activation du récepteur mX dans le cas où l'arginine et le calcium contenu dans le milieu nutritif naturel déclencheraient un comportement attractif chez certaines espèces d'insectes. Une autre catégorie de modulateurs du récepteur mX est constituée par les régulateurs allostériques positifs ou négatifs - de ce récepteur. Des régulateurs allostériques ont été décrits pour les récepteurs mGlu (Gasparini, F:uhn et al. 2002) ; du fait de la grande homologie entre ces récepteurs et les mXRs, le même mécanisme de régulation (via une liaison au domaine transmembranaire) existe certainement pour les récepteurs mX.

Selon un mode de réalisation préféré de la composition répulsive selon l'invention, cette composition comprend de 1'arginine et du calcium. L'association de la L-arginine et du calcium constitue en effet un activateur naturel du mXR, qui présente plusieurs avantages, parmi lesquels on peut citer la stabilité des composés et leur probable absence de toxicité. Ces propriétés permettent d'envisager tous les types de formulations possibles, en fonction du domaine d'application (cosmétologie antiinsectes, désinsectisation de locaux, agrochimie, ...). Une composition selon l'invention peut donc se présenter sous forme de crème, lotion ou spray pour application topique (notamment pour éviter les piqûres de moustiques), ou sous forme d'aérosol à répandre ou de particules à dissoudre dans de l'eau pour traiter des grandes surfaces, par exemple pour protéger des habitations ou des cultures. Dans une composition préférée selon l'invention, les concentrations d'arginine et de calcium sont supérieures à 1 mM, et de préférence d'au moins 10 mM. De manière encore préférée, une composition selon l'invention comprend de l'arginine et du calcium, à des concentrations comprises entre 15 et 100 mM, de préférence entre 20 et 50 mM. Avantageusement, la concentration de calcium est d'environ le double de celle de l'arginine.

La présente invention porte aussi sur des peintures ou autres revêtements, comprenant de la L-canavanine et/ou de l'arginine et du calcium, pour leur conférer des propriétés répulsives à l'égard des insectes. Un article, notamment un article textile (moustiquaire, vêtement ou autre) imbibé d'une composition telle que décrite ci-dessus, est également partie intégrante de la présente invention, ainsi que, d'une manière générale, toute utilisation d'un mélange d'arginine et de calcium, pour la préparation d'une composition répulsive à l'égard de certains insectes. Dans certains cas, il peut être intéressant non pas de repousser les insectes, mais de les attirer. Par exemple, il est utile d'attirer les insectes nuisibles dans des pièges. Il peut également être utile d'attirer sur des cultures des insectes bénéfiques, qui vont favoriser la pollinisation des plantes, ou qui vont détruire des insectes nuisibles. Pour les raisons expliquées plus haut, une action au niveau du récepteur mX peut, suivant les insectes et suivant qu'il s'agit d'une action activatrice ou inhibitrice du récepteur, entrainer une répulsion ou au contraire une attirance des insectes en question. La présente invention porte donc également sur une composition attractive à l'égard de certains insectes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un modulateur d'un récepteur mX. Dans un mode de réalisation préféré de cet aspect de l'invention, le modulateur est un inhibiteur d'un récepteur mX, tel que, par exemple, la N-méthyl-L-arginine (NMA), avantageusement présente à une concentration supérieure à 10 mM, de préférence supérieure à 20 mM. L'utilisation de N-méthyl-L-arginine (NMA), pour la préparation d'une composition insecticide attractive à l'égard de certains insectes, fait donc également partie de l'invention.

Les compositions selon l'invention peuvent également comprendre un insecticide, en plus d'un modulateur d'un récepteur mX, par exemple pour la réalisation de pièges à insectes. Les modulateurs du récepteur mX, et notamment les inhibiteurs tels que la NMA, peuvent en effet être avantageusement utilisés dans des pièges à insectes nuisibles, en association avec un attractant à effet non-local (selon le cas, lumière, CO2, chaleur, odeur, etc.) et un insecticide. L'action du ligand du récepteur mX peut être directement attractive, mais son effet peut également être lié à une désinhibition d'un comportement nourricier chez une espèce d'insecte pour un milieu, comportement qui serait régulé négativement par un autre composé (notamment, un insecticide) contenu dans le milieu. Un autre aspect de la présente invention concerne l'utilisation de la L-canavanine et/ou d'un mélange d'arginine et: de calcium et/ou de la NMA, comme contrôle (s) dans un test de criblage pour identifier des ligands d'un récepteur mX. La L-canavanine et/ou un mélange d'arginine et de calcium peuvent être utilisés comme contrôles positifs de la liaison au récepteur mX dans n'importe quel type de procédé de criblage pour identifier des ligands agonistes du récepteur mX, qu'il s'agisse de criblage in silico par modélisation, in vitro (par exemple, dans un test tel que décrit dans la partie expérimentale ci-dessous) ou in vivo (par exemple, dans un test de choix gustatif, comme décrit également dans la partie expérimentale). Un autre aspect particulièrement important de l'invention est l'utilisation d'un récepteur mX d'insecte, comme cible pour identifier des substances répulsives à l'égard d'au moins certains insectes. Par "substances", on entend ici et dans la suite de ce texte non seulement les molécules présentes dans les bases de données moléculaires -par exemple, plus de trois millions de molécules peuvent être criblées in silico pour leur liaison à la poche du récepteur mX - mais également des substances plus complexes, telles que des extraits cellulaires, des extraits de plantes, etc., qui peuvent être testés in vitro ou in vivo. Dans le cadre de la présente invention, un procédé de criblage pour identifier une substance répulsive à l'égard d'au moins une espèce d'insecte comprend de préférence une étape de sélection des substances se liant au récepteur mX dudit insecte. Ainsi, la recherche de molécules répulsives pour les moustiques se fera de préférence en recherchant des ligands du récepteur AgmXR d'Anopheles gambiae. Toutefois, le très fort degré d'homologie du récepteur mX d'une espèce d'insecte à l'autre permet de supposer qu'une substance se liant au récepteur AgmXR et répulsive pour les moustiques, aura également un effet répulsif sur d'autres insectes, tels que le guêpes, les criquets etc. Selon un mode de réalisation préféré, un procédé de criblage selon l'invention comprend une étape de sélection des substances activant ou inhibant le récepteur mX. Comme vu plus haut, plusieurs modes d'activation des mXR peuvent exister, et un modulateur peut être un ligand compétitif ou un régulateur allostérique. Le procédé de criblage selon l'invention peut être mis en œuvre en utilisant n'importe quel récepteur mX d'insecte. A titre d'exemples de récepteurs utilisables, on peut citer le récepteur DmXR de Drosophila melanogaster, de Drosophila pseudoobscura, ou de Drosophila virilis, le récepteur AgmXR d'Anopheles gambiae, le récepteur mXR de Aedes aegyti, le récepteur HBmXR d'Apis mellifera et le récepteur mXR, de Bombyx mori. Les résidus-clés formant la poche de liaison de la L-canavanine et de la L-arginine sont identiques chez les quatre espèces d'insectes citées ci-dessus ; les activateurs du récepteur de drosophile, par exemple, seront donc très probablement des activateurs du récepteur mX de beaucoup d'insectes. Un procédé de criblage selon l'invention comprend de préférence au moins une étape de criblage in vitro, par mise en contact des substances à tester avec le récepteur mX choisi. Cette étape de criblage in vitro peut être effectuée sur des cellules en culture exprimant le récepteur mX, qu'il s'agisse de cellules d'insecte exprimant naturellement ledit récepteur, ou de cellules transfectées par un vecteur d'expression de ce récepteur et qui l'expriment, soit de façon transitoire, soit, de préférence, de façon stable. Un exemple de test in vitro utilisable dans le cadre de l'invention est décrit dans l'article de Mitri et a1., supra, et dans la partie expérimentale ci-dessous.

L'utilisation d'une cellule transformée par un vecteur d'expression du récepteur mX, pour identifier des substances répulsives à l'égard d'au moins certains insectes, fait également partie de la présente invention. Selon une mise en oeuvre préférée du procédé de l'invention, le procédé comprend une étape de détermination in vivo de l'effet répulsif des substances sélectionnées in vitro. Cette étape de détermination in vivo de l'effet répulsif peut comprendre ou consister en un test de choix gustatif. Un exemple de test de choix gustatif, sur des drosophiles, est décrit dans la partie expérimentale ci-dessous. En outre, un procédé de criblage selon l'invention peut comprendre, en amont de l'étape de criblage in vitro, une étape de criblage in silico de molécules à tester. Selon une réalisation particulière du procédé de criblage ci-dessus, une étape supplémentaire est ajoutée pour déterminer si l'action répulsive d'une substance sélectionnée est exclusivement liée à sa liaison au récepteur mX. Cette étape consiste en un test sur au moins un mutant de perte de fonction du récepteur mX, par exemple sur des mouches chez lesquelles le gène de mX a été rendu non fonctionnel, ou son expression e été inhibée.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront des exemples expérimentaux ci-dessous, qui se réfèrent aux figures annexées, dans lesquelles : La figure 1 montre le résultat d'un test pharmacologique montrant l'effet dose-réponse de la L-canavanine sur des cellules HEK transfectées par des vecteurs d'expression de Gaqi/9 seul (Ctrl), ou de Gaqi/9 et DmXR (DmXR). L'EC50 de la L-canavanine a été évalué à 0,5mM.

La figure 2 montre le résultat d'un test pharmacologique montrant que DmXR exprimé dans des cellules HEK est spécifiquement activé par l'arginine associée au calcium mais pas par les autres acides aminés naturels (10mM) en présence de calcium (:LOmM:) (autres). La barre "autres" du graphe représente une moyenne des tests réalisés avec chaque acide aminé autre que l'arginine. La figure 3 présente le résultat de tests pharmacologiques montrant l'effet dose-réponse de l'arginine en présence de 10mM de calcium (courbe en pointillés) et du calcium en présence de 10mM d'arginine (courbe pleine) sur des cellules HEK transfectées par Gaqi/9 et DmXR. La figure 4 présente un schéma du test de comportement effectué pour mesurer l'effet chémosensoriel des ligands du récepteur DmX. Les rayures horizontales symbolisent l'érioglaucine (colorant bleu), tandis que les rayures verticales symbolisent la sulforhodamine (colorant rouge). Lorsque les mouches ont ingéré des deux solutions, le contenu de leur tube digestif est violet, ce qui est ici schématisé par un quadrillage.

La figure 5 montre le résultat des tests de comportement effectués. Chaque situation est représentée par le pourcentage de mouches ayant mangé du milieu bleu (% bleu = nombre d'abdomen bleu / (nombre d'abdomen bleu + nombre d'abdomen bicolore + nombre d'abdomen rouge) xlOO). * = P < 0,01. La figure 5A montre le résultat des tests de comportement réalisés sur des drosophiles sauvages (CS) et sur des drosophiles mutantes (pox-neuro70 (n=10). La figure 5B présente le résultat des tests de comportement réalisés sur des drosophiles sauvages (n=6).

La figure 6 présente le résultat de tests de comportement effectués sur des drosophiles sauvages (CS) et sur deux mutants perte de fonction mXR (ml et m2 = deux mutants DmXR-) (n=10).

La figure 7 montre les résultats obtenus in vitro et in vivo avec de la N-methyl-L-arginine. La figure 7A montre l'effet antagoniste du N-methyl-L-arginine sur le récepteur DmX transfecté dans des cellules HEK293. La figure 7B montre la courbe d'inhibition du N-methyl-L-arginine (IC50= 0,2 mM). La figure 7C montre le résultat de tests de comportement gustatif effectués sur des drosophiles sauvages (CS) (n=10). La figure 8 illustre la stratégie utilisée pour trouver les ligands endogènes de DmXR.

EXEMPLES Les exemples expérimentaux décrits ci-dessous ont été obtenus en utilisant les matériels et méthodes suivants.

Réactifs Le L-glutamate, la L-arginine, le chlorure de calcium, la L-canavanine (ref C1625), le N-methyl-L-arginine (ref : M-7033) ont été acheté à Sigma. Le colorant erioglaucine (ref : 861146) provient d'Aldrich, le colorant sulforhodamine B (ref : S9012) de Sigma. L'agarose a été acheté à Invitrogen (ref 15510-019). Le sucrose (saccharose) provient de Merck (ref : 7654). Pharmacologie Les expériences de pharmacologie ont été réalisées comme décrit précédemment (Mitri, Parmentier et al. 2004). Pour l'identification du ligand endogène du récepteur DmXR, 6 grammes de têtes de Drosophila melanogaster, souche Canton S, ont été utilisés pour 35 réaliser des extraits hydrophiliques de têtes comme décrit par Mitri et al., supra. La stratégie utilisée pour trouver les ligands endogènes de DmXR est illustrée à la figure 8. La résine sulfonique X4 provient de Biorad.

Comportement L'essai utilisé mesure la préférence de nourriture dans un choix à 2 possibilités matérialisées par deux colorants, l'erioglaucine (bleu) d'une part, la sulforhodamine (rouge) d'autre part. L'erioglaucine est utilisée à une concentration finale de 5mg/ml, dissoute dans de l'eau bidistillée pH 7,5. La sulforhodamine est utilisée à une concentration finale de 20mg/ml, dissoute dans de l'eau bidistillée pH 7,5. Les 2 solutions de colorants contiennent aussi du saccharose (sucrose à 5mM final). Les agonistes (pH=7,5) utilisés sont rajoutés aux concentrations finales indiquées sur les figures dans la solution contenant de l'erioglaucine. Pour réaliser un milieu solide, ces différents composés sont: rajoutés à une solution d'agarose fondue (0,3% final, 45 C) et déposés dans une plaque de culture de cellules à 96 puits (Corning Incorporated, ref 3599) de telle manière à ce que les puits contiennent alternativement 200pl de colorant bleu puis 200p1 de colorant rouge (voir fig. 4). Les plaques sont laissées à température ambiante pendant 2 heures afin que l'agarose se solidifie, puis sont utilisées pour un test de préférence de nourriture. Pour chaque test de comportement, 60 drosophiles âgées de 2 à 5 jours sont mises à jeûner pendant 24 heures sur du coton imbibé d'eau distillée avant le test puis sont déposés dans une boîte contenant une plaque de 96 puits préparée comme indiqué ci-dessus. Les drosophiles sont laissées dans l'obscurité pendant 2 heures, à 25 C, humidité de 30 à 5C%. Les drosophiles sont ensuite rapidement collectées par anesthésation au CO2 puis congelées à -20 C pendant 20 minutes. Pour déterminer la prise de nourriture, les mouches sont comptées d'après la couleur du contenu de leur tube digestif. Les résultats sont exprimés en % de mouches qui ont mangé un milieu donné par rapport au nombre total de mouches qui ont mangé suivant la formule : %bleu= nombre de mouches à tube digestif bleu, divisé par le nombre de mouches qui ont mangé (somme des mouches à tube digestif bleu, violet ou rouge), multiplié par 100.

Au moins 8 tests indépendants ont été réalisés pour chaque point indiqué sur les figures, et les résultats des tests ont été comptés en aveugle pour la majorité des points. Seulement les tests dans lesquels plus de 25% des mouches avaient mangé ont été inclus dans les résultats et dans les tests statistiques (T test et ANOVA). Génétique La souche sauvage utilisée est Canton S. Les mutants perte de fonction DmXR ont été générés par insertion d'éléments piggyBac (Thibault, Singer et al. 2004). Le mutant Pox-Neuro 70 est disponible auprès du Dr. C. Dambly-Chaudière, Université de Montpellier II (Dambly-Chaudiere, Jamet et al. 1992). L'absence d'ARNm codant pour le récepteur mX a été montrée par RT-PCR.

Exemple 1 : Activation in vitro du DmXR Le récepteur mX est un récepteur couplé aux protéines G, homologue aux récepteurs métabotropiques du glutamate (famille C des récepteurs couplés aux protéines G) (Mitri et al., 2004). Le récepteur mX est caractérisé par une séquence particulière de résidus consensus au niveau de la poche de liaison du ligand, séquence consensus qui diffère de celle des récepteurs métabotropiques du glutamate (Mitri et al., 2004). La séquence codante du récepteur DmX a été clonée dans un vecteur d'expression pour les cellules de mammifères, qui a été ensuite transfecté dans des cellules hétérologues couramment utilisés dans les laboratoires de pharmacologie (cellules HEK), comme décrit par Mitri et al. (2004). L'activation du récepteur est mesurée par l'accumulation d'inositol triphosphate. Les résultats, présentés aux figures 1 à 3, montrent que : 1) in vitro, le récepteur DmX est activé par la L-canavanine (L-2-amino-4-(guanidinooxy)butyric acide), un acide aminé de structure analogue à l'arginine et synthétisé par certaines légumineuses (fig.1). La L-canavanine n'est cependant pas le ligand endogène du récepteur. 2) le ligand endogène du récepteur DmX est l'acide aminé L-arginine associé à l'ion calcium (fig.2, fig.3).

Exemple 2 : Activation in vivo du DmXR La fonction du récepteur DmX et l'effet chemosensoriel des ligands identifiés ont été étudiés in vivo par un test de comportement permettant de mesurer le choix alimentaire entre deux solutions sucrées colorées avec des colorants alimentaires différents (érioglaucine = bleu, sulforhodamine = rouge (Thorne, Chrorney et al. 2004)), en présence ou en absence des deux agonistes identifiés. La figure 4 illustre ce test de comportement.

Pour chaque essai, 60 mouches ayant jeûné (24h) sont placées dans l'obscurité sur une plaque à 96 puits pendant 2h à 25 C. Les puits contiennent alternativement les solutions à tester dans de l'agarose (0,3%) avec de l'erioglaucine (bleu) ou de la sulforhodamine (rouge).

Les mouches sont comptées d'après la couleur du contenu de leur tube digestif. Les résultats sont exprimés en pourcentage de mouches qui ont mangé un milieu donné, par rapport au nombre total de mouches qui ont mangé. bleu = N bleu / (N bleu + N violet + N rouge) X 100 Le nombre d'expériences (n) réalisées est ?8 pour chaque situation. En l'absence de tout ligand du récepteur mX, les mouches absorbent systématiquement davantage de solution colorée avec de l'erioglaucine (bleu) que de solution colorée avec de la sulforhodamine (rouge). Ceci est lié soit à un effet attractif du colorant bleu, soit à un effet répulsif du colorant rouge, soit à une combinaison des deux effets.

Les résultats présentés à la figure 5 montrent qu'in vivo, la L-canavanine d'une part et la L-arginine associée au calcium d'autre part sont fortement répulsifs dans un test comportement chémosensoriel chez la drosophile. Une solution sucrée (5mM sucrose) est attractive pour la drosophile. En présence d'un des ligands de DmXR (20mM), la solution sucrée devient répulsive (fig.5A, fig.5B). A forte concentration de L-canavanine (40mM), la solution sucrée est très fortement répulsive (fig.5A).

Des expériences complémentaires montrent qu'un plateau est atteint vers 30 mM. En outre, les tests effectués avec des drosophiles mutantes (pox-neuro 70), dépourvues de neurones 5 chémosensoriels, montrent que cette répulsion passe par les organes chemosensoriels de la mouche (fig.5A). Exemple 3 : l'effet répulsif de la L-canavanine nécessite le récepteur Dm>: Afin de vérifier que l'effet répulsif de la L- 10 canavanine nécessite le récepteur DmX, les Inventeurs ont identifié deux mutants perte de fonction du récepteur DmX. Pour chacun de ces mutants ml et m2, l'absence d'ARNm codant pour le récepteur mX a été montrée par RT-PCR. Les résultats présentés à la figure 6 montrent que ces mutants ont perdu 15 la capacité de détecter la L-canavanine dans le milieu. En effet, les drosophiles mutantes n'ont plus de répulsion à la L-canavanine. Ces résultats confirment que les activateurs du récepteur mX sont desrépulsifs lorsqu'ils sont ajoutés dans 20 une solution sucrée. Exemple 4: Identification de nouvelles molécules à propriété répulsive Les résultats présentés aux exemples 1 à 3 ci-dessus permettent de concevoir un procédé permettant de 25 rechercher rapidement des nouvelles molécules à propriété répulsive, qui utilise le récepteur DmX comme cible. Par exemple, un tel procédé se compose de deux phases : 1) in vitro, le récepteur cloné de drosophile 30 (DmXR) est exprimé dans des cellules de mammifère en culture. De nouveaux modulateurs du récepteur DmX (ligands agonistes, antagonistes, et régulateurs allostériques) sont identifiés par crible in vitro, la L-canavanine servant de contrôle positif. 35 2) in vivo, les activateurs de DmXR identifiés in vitro sont testés chez la drosophile pour leurs propriétés répulsives par un test de choix gustatif très rapide, la L-canavanine servant à nouveau de contrôle positif. Les propriétés répulsives des activateurs du récepteur de drosophile sont ensuite testées sur d'autres insectes, par des tests de comportement gustatifs appropriés aux espèces étudiées. Ainsi, des nouveaux ligands de DmXR sont 5 identifiés, et des nouveaux activateurs de DmXR, plus affins que l'arginine et le calcium ou pas toxique comme la L- canavanine, sont sélectionnés. Exemple 5: Identification de nouveaux ligands par criblage in silico 10 Une structure 3D de la poche de liaison théorique a été déterminée et publiée (Mitri, Parmentier et al. 2004). Pour rechercher de nouveaux ligands compétitifs, un criblage virtuel de ce modèle 3D du site de liaison est 15 effectué, permettant de cribler une base de plus de 2 millions de molécules commerciales. Les molécules sélectionnées virtuellement sont ensuite testées in vitro sur le récepteur. Les meilleurs candidats sont optimisés en synthétisant différentes séries 20 de dérivés dont l'effet in vitro est évalué. Les ligands identifiés après optimisation chimique, sont alors synthétisés en quantité suffisante pour déterminer leurs effets in vivo. Exemple 6: Identification d'un inhibiteur du récepteur DmX 25 Il a été montré que la réponse gustative à certains acides aminés étudiés comme la méthionine et la valine semble dépendre de l'espèce d'insectes étudiée, allant de stimulant à répulsif (Chapman 2003). Les inventeurs ont donc identifié un antagoniste du récepteur 30 DmX, appelé N-methyl-L-arginine (NMA). La figure 7A montre l'effet antagoniste de la N-methyl-L-arginine sur le récepteur DmX transfecté dans des cellules HEK293. La figure 7B montre la courbe d'inhibition de la N-methyl-L-arginine (IC50= 0,2 mM). Dans le test de comportement gustatif utilisé 35 pour montrer l'effet répulsif des agonistes de DmXR, la NMA à une concentration de 30mM est sans effet sur le comportement gustatif de la drosophile (figure 7C). Si de la NMA (30mM) est ajoutée au milieu contenant de la L-canavanine à une concentration de 20mM, la répulsion est significativement moins élevée que celle observée dans un milieu contenant de la L-canavanine seule (figure 7C). Cette expérience confirme l'action répulsive de la L-canavanine au travers du récepteur DmX.

References Chapman, R. F. (2003). "Contact chemoreception in feeding by phytophagous insects." Annu Rev Entomol 48: 5 455-84. Dambly-Chaudiere, C., E. Jamet, et al. (1992). "The paired box gene pox neuro: a determinant of poly- innervated sense organs in Drosophila." Cell 69(1): 159-72. Fradin, M. S. and J. F. Day (2002). "Comparative 10 efficacy of insect repellents against mosquito bites." N Engl J Med 347(1): 13-8. Gasparini, F., R. Kuhn, et al. (2002). "Allosteric modulators of group I metabotropic glutamate receptors: novel subtype-selective ligands and therapeutic 15 perspectives." Curr Opin Pharmacol 2(1): 43-9. Mitri, C., M. L. Parmentier, et al. (2004). "Divergent evolution in metabotropic glutamate receptors. A new receptor activated by an endogenous ligand different from glutamate in insects." J Biol Chem 279(10): 9313-20.

20 Rosenthal, G. A. (1977). "The biological effects and mode of action of L-canavanine, a structural analogue of L-arginine." Q Rev Biol 52(2): 155-78. Rosenthal, G. A. (2001). "L-Canavanine: a higher plant insecticidal allelochemical." Amino Acids 21(3): 319-25 30. Thibault, S. T., M. A. Singer, et al. (2004). "A complementary transposon tool kit for Drosophila melanogaster using P and piggyBac." Nat Genet 36(3): 283-7. Thorne, N., C. Chromey, et al. (2004). "Taste 30 perception and coding in Drosophila." Curr Biol 14(12): 1065-79. 17

Claims (18)

REVENDICATIONS

1. Composition répulsive à l'égard de certains insectes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un activateur d'un récepteur mX.

2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend de l'arginine et du calcium.

3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que les concentrations d'arginine et de calcium sont supérieures à 10 mM, de préférence supérieures à 20 mM.

4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend de l'arginine et du calcium, à des concentrations comprises entre 15 et 100 mM, de préférence entre 20 et 50 mM.

5. Article textile caractérisé en ce qu'il est imbibé d'une composition revendications 1 à 4.

6. Utilisation calcium, pour la préparation d'une composition l'égard de certains insectes.

7. Utilisation de L-canavanine d'arginine et de calcium, et/ou de (NMA), comme contrôles dans un test selon l'une quelconque des d'un mélange d'arginine et de mélange arginine répulsive à et/ou d'un N-méthyl-L-de criblage pour identifier des substances répulsives moins certains insectes.

8. Utilisation d'un récepteurà l'égard d'au mX d'insecte, 35 comme cible pour identifier des substances répulsives à l'égard d'au moins certains insectes.

9. Procédé de criblage pour identifier une substance répulsive à l'égard d'au moins une espèce d'insecte, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de sélection des substances se liant au récepteur mX dudit insecte.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de sélection des substances activant le récepteur mX.

11. Procédé selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce que le récepteur mX estsélectionné parmi le récepteur DmXR de Drosophila melanogaster, de Drosophila pseudoobscura, ou de Drosophila virilis, le récepteur AgmXR d'Anopheles gambiae, le récepteur mXR de Aedes aegyti, le récepteur HBmXR d'Apis mellifera et le récepteur mXR de Bombyx mori.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de criblage in vitro, par mise en contact des substances à tester avec le récepteur mX.

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le criblage in vitro est effectué sur des cellules en culture exprimant le récepteur mX.

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de détermination in vivo de l'effet répulsif des substances sélectionnées in vitro.

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'étape de détermination in vivo de l'effet répulsif comprend un test de choix gustatif.

16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend également, avant l'étape de criblage in vitro, un étape de criblage in silico de molécules à tester.

17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend également une étape de test sur au moins un mutant de perte de fonction du récepteur mX, pour déterminer si l'action répulsive d'une substance sélectionnée est exclusivement liée à sa liaison au récepteur mX.

18. Utilisation d'une cellule transformée par un vecteur d'expression du récepteur mX, pour identifier des substances répulsives à l'égard d'au moins certains insectes.