WO2007132090A2 - Repulsifs anti-insectes et procede pour identifier d'autres molecules repulsives a l'egard des insectes - Google Patents

Repulsifs anti-insectes et procede pour identifier d'autres molecules repulsives a l'egard des insectes Download PDF

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Yves Grau
Christian Mitri
Marie-Laure Parmentier
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Centre National De La Recherche Scientifique
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    • A01N47/42—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides containing —N=CX2 groups, e.g. isothiourea
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    • A01N61/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing substances of unknown or undetermined composition, e.g. substances characterised only by the mode of action

Definitions

  • the present invention relates to the field of insect control, and more particularly the field of repellent products for insects.
  • insecticidal or insect repellent molecules are used to control pests.
  • the first problem is related to the time-limited effectiveness of these molecules, due to the great adaptability of insects. Indeed, insects quickly develop resistance to insecticidal or repellent molecules against insects, by mutations of the molecular target resulting in a decrease, or loss of affinity of these molecules for their target.
  • the second problem is related to the toxicity of these molecules to other organisms such as mammals and, in particular, humans. The toxicity of these insecticidal or insect repellent molecules is mainly due to the fact that their targets are conserved in mammals.
  • Pests are essentially crop pests, as well as vectors of certain diseases that kill millions of people a year.
  • the fight against insects is an essential tool for the prevention of vector-borne diseases.
  • some diseases for which no effective vaccine is available malaria, dengue fever, chikungunya
  • personal protection against mosquito bites can protect itself; the use of repellents coated on the exposed skin is in this context a means of protection widely used.
  • repellents coated on the exposed skin is in this context a means of protection widely used.
  • DEET N, N-diethyl-3-methylbenzamide
  • DEET N-diethyl-3-methylbenzamide
  • mX receptor is a G-protein coupled receptor, homologous to metabotropic glutamate receptors (family C of G-protein coupled receptors) (Mitri et al., 2004).
  • the mX receptor is characterized by a particular sequence of consensus residues at the (unidentified) ligand binding pocket, a consensus sequence that differs from that of metabotropic glutamate receptors (Mitri et al., 2004).
  • the inventors have identified this receptor in several insects (currently Drosophila Drosophila melanogaster, Drosophila pseudoobscura and Drosophila virilis, mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti, bee Apis mellifera and butterfly Bombyx mori), and shown that it does not exist. not in the genome of the C. elegans nematode, nor in the vertebrate genome (zebrafish fish, mouse, man). There is only one gene encoding an mX receptor in the species where it has been identified. To date, this receptor seems to be specific to insects.
  • L-Canavanine does not seem to be a directly usable repellent because of its toxicity. It is known that L-canavanine (L-2-amino-4- (guanidinooxy) butyric acid), synthesized by more than 1200 species of legumes, is a powerful insecticide. Indeed, in many insect species treated with L-canavanine, it has been described that this amino acid, which is nonprotein in the leguminous plants that synthesise it, can be incorporated into the proteins synthesized de novo by arginyl- tRNA synthetase instead of arginine (Rosenthal 1977, Rosenthal 2001).
  • the inventors have now identified the natural ligand of the mX insect receptor. They have shown that this natural ligand, L-arginine associated with calcium, is repellent to insects. In addition to the fact that arginine associated with calcium can be used as a repellent, these results show that the mX receptor is a particularly interesting target candidate for identifying new substances or molecules that are repulsive against certain insects, since it appears that other ligands mX receptors will also have a repellent effect.
  • the present invention therefore firstly relates to the use of an activator of an mX receptor as a repellent with regard to certain insects and more particularly the use of such a receptor for the preparation of a repulsive composition with respect to certain insects.
  • the inventors have so far identified the mX receptor in Drosophila Drosophila melanogaster, the Anopheles gambiae mosquito, the Apis mellifera bee and the Bombyx mori butterfly, as well as in the genome.
  • Drosophila species Drosophila pseudoobscura (chromosome 3), Drosophila virilis (scaffold 12875) and in a sequence of a pest, the mosquito Aedes aegypti (AAGE02017413.1), vector of dengue.
  • An activator of the Drosophila mX receptor is therefore likely to be repellent to any insect.
  • Dipterous pests are an essential target of the repellent compositions according to the invention, since the mX receptor is found in all currently sequenced dipteran genomes: it is particularly possible to cite sandflies, small dipterans whose female is haematophagous and transmits cutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis (emerging disease in southern Europe, particularly co-infection with leishmaniasis-HIV / AIDS), tsetse fly, vector of sleeping sickness, and mosquitoes of the genus Aedes, vectors of yellow fever, chikungunya and dengue fever.
  • the targeted insects according to the invention there may also be mentioned bees, butterflies, locusts, wasps, etc.
  • mX receptor modulator is meant, of course, any ligand capable of activating mXR (i.e., an mX receptor activator), but also any mX receptor antagonist ligand. (i.e. mX receptor inhibitor). Indeed, it has been shown that the taste response to certain amino acids studied, such as methionine and valine, may depend on the insect species studied, ranging from stimulant to repellent (Chapman 2003). Antagonists can inhibit the activation of the mX receptor if the arginine and calcium contained in the natural nutrient medium trigger an attractive behavior in some species of insects. Another category of mX receptor modulators is the allosteric regulators - positive or negative - of this receptor.
  • mGlu receptors Allosteric regulators have been described for mGlu receptors (Gasparini, Kuhn et al., 2002); Due to the high homology between these receptors and the mXRs, the same regulatory mechanism (via a linkage to the transmembrane domain) certainly exists for the mX receptors.
  • the mX receptor activator is a mixture of arginine and calcium.
  • the combination of L-arginine and calcium is in fact a natural activator of mXR, which has several advantages, among which mention may be made of the stability of the compounds and their probable absence of toxicity. These properties allow to consider all types of uses, depending on the scope (cosmetology anti ⁇ insect disinfestation of premises, agrochemicals ).
  • a composition according to the invention may therefore be in the form of a cream, lotion or spray for topical application.
  • Arginine and calcium may be provided in the mixture in various forms known to those skilled in the art.
  • arginine may be in the form of L-arginine directly and / or arginine salt; calcium can also be in the form of salt, such as chloride, carbonate or calcium fluoride.
  • the concentrations of arginine and calcium in the composition are greater than 1 mM, and preferably at least 10 mM. More preferably, the concentrations of arginine and calcium are between 15 and 100 mM, preferably between 20 and 50 mM.
  • the calcium concentration is about twice that of arginine.
  • the present invention also relates to paints or other coatings, including L-canavanine and / or arginine and calcium, to impart repellent properties to insects.
  • the present invention also relates to a method for repelling certain insects in which surfaces are treated with a mixture of arginine and calcium.
  • an action at the level of the mX receptor may, depending on the insects and depending on whether it is an activating or inhibitory action of the receptor, cause repulsion or on the contrary an attraction of the insects in question.
  • the present invention thus also relates to an attractive composition with regard to certain insects, characterized in that it comprises at least one modulator of an mX receptor.
  • the modulator is an inhibitor of an mX receptor, such as, for example, N-methyl-L-arginine (NMA), advantageously present at a concentration greater than 10 mM, preferably greater than 20 mM.
  • NMA N-methyl-L-arginine
  • the attractive compositions according to the invention may also comprise an insecticide, in addition to a modulator of an mX receptor, for example for the production of insect traps.
  • the modulators of the mX receptor, and especially inhibitors such as NMA can indeed be advantageously used in insect pest traps, in association with a non-local effect attractant (as appropriate, light, CO 2 , heat, smell, etc.) and an insecticide.
  • the action of the ligand of the mX receptor may be directly attractive, but its effect may also be related to a disinhibition of a feeding behavior in an insect species for a medium, a behavior that would be negatively regulated by a other compound (including an insecticide) contained in the medium.
  • L-canavanine and / or a mixture of arginine and calcium and / or NMA can be used as positive controls for mX receptor binding in any type of screening method to identify mX receptor agonist ligands, whether in vitro silico screening by modeling, in vitro (for example, in a test as described in the experimental section below) or in vivo
  • an insect mX receptor as a target for identifying repellent substances with respect to at least some insects.
  • substances is meant here and in the remainder of this text not only the molecules present in the molecular databases - for example, more than three million molecules can be screened in silico for their binding to the mX receptor pocket. - but also more complex substances, such as cell extracts, plant extracts, etc., which can be tested in vitro or in vivo.
  • a screening method for identifying a repellent substance with respect to at least one species of insect preferably comprises a step of selecting the substances binding to the mX receptor of said insect.
  • the search for repellent molecules for mosquitoes will preferably be carried out by searching ligands of the Anopheles gambiae AgmXR receptor.
  • the very high degree of homology of the mX receptor from one insect species to another suggests that a substance that binds to the AgmXR receptor and is repellent to mosquitoes will also have a repellent effect on other mosquito species. insects, such as wasps, locusts etc.
  • a screening method comprises a step of selecting substances that activate or inhibit the mX receptor.
  • a modulator may be a competitive ligand or an allosteric regulator.
  • the screening method according to the invention can be implemented using any insect mX receptor.
  • suitable receptors mention may be made of the DmXR receptor of Drosophila melanogaster, of Drosophila pseudoobscumra, or of Drosophila virilis, the AgmXR receptor of Anopheles gambiae, the mXR receptor of Aedes aegypti, the HBmXR receptor of Apis mellifera and the mXR receiver of Bombyx morl.
  • the key residues forming the binding pocket of L-canavanine and L-arginine are identical in the four species of insects mentioned above; Drosophila receptor activators, for example, will most likely be mX receptor activators of many insects.
  • a screening method preferably comprises at least one in vitro screening step, by bringing the substances to be tested into contact with the selected mX receptor.
  • This in vitro screening step can be carried out on cultured cells expressing the mX receptor, whether it be insect cells expressing said receptor naturally, or cells transfected with an expression vector of this receptor and which express it, either transiently or, preferably, stably.
  • An example of an in vitro test that can be used in the context of the invention is described in the article by Mitri et al., Supra, and in the experimental part below.
  • the use of a cell transformed with an mX receptor expression vector to identify repellents for at least some insects is also part of the present invention.
  • the method comprises a step of determining in vivo the repulsive effect of the substances selected in vitro.
  • This step of in vivo determination of the effect repellent can include or consist of a taste test.
  • An example of taste selection test on fruit flies is described in the experimental section below.
  • a screening method according to the invention may comprise, upstream of the in vitro screening step, a step of in silico screening of molecules to be tested.
  • an additional step is added to determine whether the repulsive action of a selected substance is exclusively related to its binding to the mX receptor.
  • This step consists of a test on at least one loss of function mX receptor mutant, for example on flies in which the mX gene was made non-functional, or its expression was inhibited.
  • Figure 1 shows the result of a pharmacological test showing the dose-response effect of L-canavanine on HEK cells transfected with G ⁇ qi / 9 expression vectors alone (Ctrl), or G ⁇ qi / 9 and DmXR (DmXR).
  • the EC 50 of L-canavanine was evaluated at 0.5mM.
  • Figure 2 shows the result of a pharmacological test showing that DmXR expressed in HEK cells is specifically activated by calcium-associated arginine but not by other naturally occurring amino acids (10mM) in the presence of calcium (10mM) (other) .
  • the "other" bar of the graph represents an average of the tests performed with each amino acid other than arginine.
  • FIG. 3 presents the result of pharmacological tests showing the dose-response effect of arginine in the presence of 10 mM of calcium (dashed curve) and of calcium in the presence of 10 mM of arginine (solid curve) on transfected HEK cells. by G ⁇ qi / 9 and DmXR.
  • Figure 4 shows a diagram of the behavioral test performed to measure the chemosensory effect DmX receptor ligands.
  • Horizontal stripes symbolize erioglaucine (blue dye), while vertical stripes symbolize suiforhodamine (red dye).
  • Figure 7 shows the results obtained in vitro and in vivo with N-methyl-L-arginine.
  • Figure 7A shows the antagonistic effect of N-methyl-L-arginine on the transfected DmX receptor in HEK293 cells.
  • Figure 8 illustrates the strategy used to find the endogenous ligands of DmXR.
  • L-glutamate, L-arginine, calcium chloride, L-canavanine (ref: C1625), N-methyl-L-arginine (ref: M-7033) were purchased from Sigma.
  • the erioglaucine dye (ref: 861146) comes from Aldrich, the dye suiforhodamine B (ref: S9012) from Sigma.
  • Agarose was purchased from Invitrogen (ref: 15510-019).
  • Sucrose (sucrose) comes from Merck (ref: 7654).
  • Pharmacology The pharmacology experiments were carried out as previously described (Mitri, Parmentier et al., 2004).
  • DmXR receptor ligand For the identification of the endogenous DmXR receptor ligand, 6 grams of Drosophila melanogaster heads, Canton S strain, were used to make hydrophilic head extracts as described by Mitri et al., Supra. The strategy used to find the endogenous ligands of DmXR is shown in Figure 8.
  • the X4 sulfonic resin is from Biorad. Behaviour
  • the test used measures the preference of food in a choice with two possibilities materialized by two dyes, erioglaucine (blue) on the one hand, and suiforhodamine (red) on the other hand.
  • Erioglaucine is used at a final concentration of 5mg / ml, dissolved in bidistilled water pH 7.5.
  • Suiforhodamine is used at a final concentration of 20 mg / ml, dissolved in bidistilled water pH 7.5.
  • the 2 dye solutions also contain sucrose (final 5mM sucrose).
  • these various compounds are added to a solution of molten agarose (0.3% final, 45 ° C.) and deposited in a 96-well cell culture plate (Corning Incorporated, ref. so that the wells alternately contain 200 ⁇ l of blue dye and then 200 ⁇ l of red dye (see Fig. 4).
  • the plates are left at room temperature for 2 hours in order for the agarose to solidify and then are used for a food preference test.
  • % blue number of blue digestive tract flies, divided by the number of flies that ate (sum of blue, purple or red digestive tract flies), multiplied by 100. At least 8 independent tests were performed for each indicated point in the figures, and the test results were counted blind for most points. Only tests in which more than 25% of the flies had eaten were included in the results and in the statistical tests (T test and ANOVA).
  • the wild type strain used is Canton S.
  • the DmXR function loss mutants were generated by insertion of piggyBac elements (Thibault, Singer et al., 2004).
  • the mutant Pox-Neuro 70 is available from Dr. C. Dambly-Chaudière, University of adjoin II (Dambly-Cdefault, Jamet et al., 1992).
  • the absence of mX receptor-encoding mRNA has been shown by RT-PCR.
  • Example 1 In vitro activation of DmXR
  • the mX receptor is a G protein-coupled receptor, homologous to metabotropic glutamate receptors (family C of G-protein coupled receptors)
  • the mX receptor is characterized by a particular sequence of consensus residues at the ligand binding pocket, a consensus sequence that differs from that of metabotropic glutamate receptors (Mitri et al., 2004).
  • the coding sequence of the DmX receptor was cloned into an expression vector for the mammals, which was then transfected into heterologous cells commonly used in pharmacology laboratories (HEK cells), as described by Mitri et al.
  • the DmX receptor is activated by L-canavanine (L-2-amino-4- (guanidinooxy) butyric acid), an amino acid of structure similar to arginine and synthesized by certain legumes (fig.l ).
  • L-Canavanine is not the endogenous ligand of the receptor.
  • test solutions 60 flies having fasted (24h) are placed in the dark on a 96-well plate for 2 hours at 25 ° C.
  • the wells alternately contain the test solutions in agarose (0.3%) with eroglaucine (blue) or suiforhodamine (red).
  • Flies are counted according to the color of the contents of their digestive tract.
  • results are expressed as a percentage of flies that ate a given environment, compared to the total number of flies that ate.
  • DmXR cloned Drosophila receptor
  • DmXR activators identified in vitro are tested in Drosophila for their repellent properties by a very fast taste test, L-canavanine again serving as a positive control.
  • the repellent properties of the Drosophila receptor activators are then tested on other insects, by taste behavior tests appropriate to the species studied.
  • new DmXR ligands are identified, and new DmXR activators, more affine than arginine and calcium or non-toxic such as L-canavanine, are selected.
  • FIG. 7A shows the antagonistic effect of N-methyl-L-arginine on the transfected DmX receptor in HEK293 cells. The figure

Abstract

La présente invention est basée sur l' identification du rôle du récepteur mX de certains insectes, dans le comportement gustatif desdits insectes. L'invention porte donc sur l'utilisation de modulateurs du récepteur mX, tels que L-canavanine et/ou un mélange d' arginine et de calcium, et/ou de N-méthyl-L-arginine (NMA) , pour la préparation d'une composition répulsive ou attractive à l'égard de certains insectes. L'invention concerne également l'utilisation d'un récepteur mX d'insecte, comme cible pour identifier des substances répulsives à l'égard d'au moins certains insectes.

Description

REPULSIFS ANTI-INSECTES ET PROCEDE POUR IDENTIFIER D'AUTRES MOLECULES REPULSIVES A L'EGARD DES INSECTES .
La présente invention concerne le domaine de la lutte contre les insectes, et plus particulièrement le domaine des produits répulsifs pour les insectes.
A l'heure actuelle, des molécules insecticides ou répulsives à l'égard des insectes sont utilisées pour lutter contre les insectes nuisibles. Cependant, deux problèmes majeurs sont apparus et se renforcent depuis quelques années. Le premier problème est lié à l'efficacité limitée dans le temps de ces molécules, du fait des grandes capacités d'adaptation des insectes. En effet, les insectes développent rapidement des résistances vis-à-vis des molécules insecticides ou répulsives à l'égard des insectes, par mutations de la cible moléculaire entraînant une baisse, voire une perte d'affinité de ces molécules pour leur cible. Le deuxième problème est lié à la toxicité de ces molécules envers d'autres organismes tels que les mammifères et, en particulier, l'homme. La toxicité de ces molécules insecticides ou répulsives à l'égard des insectes est principalement due au fait que leurs cibles sont conservées chez les mammifères.
Les insectes nuisibles sont essentiellement les ravageurs de cultures, ainsi que les vecteurs de certaines maladies qui causent la mort de plusieurs millions de personnes par an. La lutte contre les insectes est notamment un outil essentiel de la prévention des maladies à vecteurs. Par exemple, pour certaines maladies contre lesquelles aucun vaccin efficace n'est disponible (paludisme, dengue, chikungunya) , la protection individuelle contre les piqûres de moustiques permet de se protéger ; l'utilisation de répulsifs enduits sur la peau exposée est dans ce cadre un moyen de protection largement utilisé. II existe plusieurs répulsifs de synthèse et naturels sur le marché. Le DEET (N,N-diéthyl-3- méthylbenzamide) est le répulsif de synthèse de référence. Il présente toutefois l'inconvénient d'être en partie éliminé par évaporation mais surtout par absorption dermique. Un autre inconvénient du DEET est qu'il endommage les matières plastiques (lunettes, bracelets...) . Les répulsifs d'origine naturelle (tels que la citronnelle) assurent une protection de très courte durée, souvent inférieure à une heure (Fradin et Day 2002) .
Aujourd'hui, il existe donc un important besoin de trouver de nouvelles molécules répulsives à l'égard des insectes, qui soient stables dans le temps et non toxiques pour les mammifères, en particulier pour l'homme. Dans ce contexte, les Inventeurs ont mis en évidence un effet répulsif de l'acide aminé L-canavanine chez la drosophile. Ils ont démontré que cet effet répulsif passe par un récepteur héptahélice qu' ils avaient précédemment identifié (Mitri, Parmentier et al. 2004) . Ce récepteur, appelé "récepteur mX", ou "mXR", est un récepteur couplé aux protéines G, homologue aux récepteurs métabotropiques du glutamate (famille C des récepteurs couplés aux protéines G) (Mitri et al., 2004). Le récepteur mX est caractérisé par une séquence particulière de résidus consensus au niveau de la poche de liaison du ligand (non identifié) , séquence consensus qui diffère de celle des récepteurs métabotropiques du glutamate (Mitri et al., 2004) . Les inventeurs ont identifié ce récepteur chez plusieurs insectes (actuellement les drosophiles Drosophila melanogaster, Drosophila pseudoobscura et Drosophila virilis, les moustiques Anophèles gambiae et Aedes aegypti, l'abeille Apis mellifera et le papillon Bombyx mori) , et montré qu' il n' existe pas dans le génome du nématode C. elegans, ni dans le génome des vertébrés (poisson zebrafish, souris, homme). Il n'existe qu'un seul gène codant pour un récepteur mX chez les espèces où il a été identifié. A ce jour, ce récepteur semble donc spécifique des insectes.
Malgré son effet répulsif à l'égard de la drosophile et probablement d'autres insectes, la L- canavanine ne semble pas une molécule directement utilisable comme répulsif, à cause de sa toxicité. Il est connu que la L-canavanine (acide L-2-amino-4- (guanidinooxy) butyrique) , synthétisée par plus de 1200 espèces de légumineuses, est un puissant insecticide. En effet, chez beaucoup d'espèces d' insectes traitées à la L-canavanine, il a été décrit que cet acide aminé, non protéique chez les légumineuses qui le synthétisent, peut être incorporé dans les protéines synthétisées de novo par l' arginyl-tRNA synthétase à la place de l'arginine (Rosenthal 1977; Rosenthal 2001). Cette incorporation donne des protéines défectueuses qui présentent des structures tridimensionnelles anormales, conduisant progressivement à la stérilité ou à la mort. Ces effets toxiques de la L-canavanine, principalement décrits chez les insectes au cours du développement larvaire, ont été retrouvés chez un grand nombre d'espèces, des virus à l'homme (revue de Rosenthal, 1977).
Les Inventeurs ont maintenant identifié le ligand naturel du récepteur d'insecte mX. Ils ont montré que ce ligand naturel, à savoir la L-arginine associée au calcium, est répulsif pour les insectes. Outre le fait que l'arginine associée au calcium peut être utilisée comme répulsif, ces résultats montrent que le récepteur mX constitue un candidat cible particulièrement intéressant pour identifier de nouvelles substances ou molécules répulsives contre certains insectes, puisqu'il apparaît que d' autres ligands du récepteur mX auront eux aussi un effet répulsif. La présente invention concerne donc en premier lieu l'utilisation d'un activateur d'un récepteur mX comme répulsif à l'égard de certains insectes et plus particulièrement l'utilisation d'un tel récepteur pour la préparation d'une composition répulsive à l'égard d'au moins certains insectes Comme vu plus haut, les Inventeurs ont à ce jour identifié le récepteur mX chez la drosophile Drosophila melanogaster, le moustique Anophèles gambiae, l'abeille Apis mellifera et le papillon Bombyx mori, ainsi que dans le génome d' autres espèces de drosophiles (Drosophila pseudoobscura (chromosome 3) , Drosophila virilis (scaffold 12875) et dans une séquence d'un insecte nuisible, le moustique Aedes aegypti (AAGE02017413.1) , vecteur de la dengue. Ils n'ont en outre pas identifié d'insecte dépourvu de ce récepteur, qui semble particulièrement conservé chez les insectes. Un activateur du récepteur mX de la drosophile est donc vraisemblablement répulsif à l'égard de n'importe quel insecte. Les diptères nuisibles constituent une cible essentielle des compositions répulsives selon l'invention, puisque le récepteur mX est trouvé dans tous les génomes de diptères actuellement séquences : on peut notamment citer les phlébotomes, petits diptères dont la femelle est hématophage et transmet la leishmaniose cutanée et la leishmaniose viscérale (maladie émergente en Europe méridionale, en particulier lors de co-infection leishmaniose-VTH/SIDA) , la mouche tsé-tsé, vecteur de la maladie du sommeil, et les moustiques du genre Aedes, vecteurs de la fièvre jaune, du chikungunya et de la dengue. Parmi les insectes ciblés selon l'invention, on peut également citer les abeilles, les papillons, les criquets, les guêpes, etc.
Par "modulateur d'un récepteur mX", on entend bien sûr n'importe quel ligand capable d'activer mXR (c'est- à-dire un activateur du récepteur mX) , mais également n'importe quel ligand antagoniste du récepteur mX (c'est-à- dire un inhibiteur du récepteur mX) . En effet, il a été montré que la réponse gustative à certains acides aminés étudiés, comme la méthionine et la valine, peut dépendre de l'espèce d'insectes étudiée, allant de stimulant à répulsif (Chapman 2003). Les antagonistes permettent d'inhiber l'activation du récepteur mX dans le cas où l'arginine et le calcium contenu dans le milieu nutritif naturel déclencheraient un comportement attractif chez certaines espèces d'insectes. Une autre catégorie de modulateurs du récepteur mX est constituée par les régulateurs allostériques - positifs ou négatifs - de ce récepteur. Des régulateurs allostériques ont été décrits pour les récepteurs mGlu (Gasparini, Kuhn et al. 2002) ; du fait de la grande homologie entre ces récepteurs et les mXRs, le même mécanisme de régulation {via une liaison au domaine transmembranaire) existe certainement pour les récepteurs mX.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, l' activateur du récepteur mX est un mélange d'arginine et de calcium. L'association de la L- arginine et du calcium constitue en effet un activateur naturel du mXR, qui présente plusieurs avantages, parmi lesquels on peut citer la stabilité des composés et leur probable absence de toxicité. Ces propriétés permettent d'envisager tous les types d'utilisations possibles, en fonction du domaine d'application (cosmétologie anti¬ insectes, désinsectisation de locaux, agrochimie, ...) . Une composition selon l'invention peut donc se présenter sous forme de crème, lotion ou spray pour application topique
(notamment pour éviter les piqûres de moustiques) , ou sous forme d'aérosol à répandre ou de particules à dissoudre dans de l'eau pour traiter des grandes surfaces, par exemple pour protéger des habitations ou des cultures. L'arginine et le calcium peuvent être apportés dans le mélange sous différentes formes connues de l'homme du métier. Par exemple, l'arginine peut se présenter sous forme de L- arginine directement et/ou de sel d' arginine ; le calcium peut aussi se présenter sous forme de sel, tel que les chlorure, carbonate ou fluorure de calcium.
Dans une utilisation préférée selon l'invention, les concentrations d' arginine et de calcium dans la composition sont supérieures à 1 mM, et de préférence d' au moins 10 mM. De manière encore préférée, les concentrations d'arginine et de calcium sont comprises entre 15 et 100 mM, de préférence entre 20 et 50 mM. Avantageusement, la concentration de calcium est d'environ le double de celle de l' arginine.
La présente invention porte aussi sur des peintures ou autres revêtements, comprenant de la L- canavanine et/ou de l'arginine et du calcium, pour leur conférer des propriétés répulsives à l'égard des insectes. Un article, notamment un article textile (moustiquaire, vêtement ou autre) imbibé d'une composition telle que décrite ci-dessus, est également partie intégrante de la présente invention.
La présente invention porte également sur une méthode pour repousser certains insectes dans laquelle des surfaces sont traitées avec un mélange d' arginine et de calcium.
Dans certains cas, il peut être intéressant non pas de repousser les insectes, mais de les attirer. Par exemple, il est utile d'attirer les insectes nuisibles dans des pièges. Il peut également être utile d'attirer sur des cultures des insectes bénéfiques, qui vont favoriser la pollinisation des plantes, ou qui vont détruire des insectes nuisibles. Pour les raisons expliquées plus haut, une action au niveau du récepteur mX peut, suivant les insectes et suivant qu'il s'agit d'une action activatrice ou inhibitrice du récepteur, entrainer une répulsion ou au contraire une attirance des insectes en question.
La présente invention porte donc également sur une composition attractive à l'égard de certains insectes, caractérisée en ce qu' elle comprend au moins un modulateur d'un récepteur mX. Dans un mode de réalisation préféré de cet aspect de l'invention, le modulateur est un inhibiteur d'un récepteur mX, tel que, par exemple, la N-méthyl-L- arginine (NMA) , avantageusement présente à une concentration supérieure à 10 mM, de préférence supérieure à 20 mM. L'utilisation de N-méthyl-L-arginine (NMA), pour la préparation d'une composition insecticide attractive à l'égard de certains insectes, fait donc également partie de l'invention.
Les compositions attractives selon l'invention peuvent également comprendre un insecticide, en plus d'un modulateur d'un récepteur mX, par exemple pour la réalisation de pièges à insectes. Les modulateurs du récepteur mX, et notamment les inhibiteurs tels que la NMA, peuvent en effet être avantageusement utilisés dans des pièges à insectes nuisibles, en association avec un attractant à effet non-local (selon le cas, lumière, CO2, chaleur, odeur, etc.) et un insecticide. L'action du ligand du récepteur mX peut être directement attractive, mais son effet peut également être lié à une désinhibition d'un comportement nourricier chez une espèce d' insecte pour un milieu, comportement qui serait régulé négativement par un autre composé (notamment, un insecticide) contenu dans le milieu.
Un autre aspect de la présente invention concerne l'utilisation de la L-canavanine et/ou d'un mélange d' arginine et de calcium et/ou de la NMA, comme contrôle (s) dans un test de criblage pour identifier des ligands d' un récepteur mX. La L-canavanine et/ou un mélange d' arginine et de calcium peuvent être utilisés comme contrôles positifs de la liaison au récepteur mX dans n' importe quel type de procédé de criblage pour identifier des ligands agonistes du récepteur mX, qu'il s'agisse de criblage in silico par modélisation, in vitro (par exemple, dans un test tel que décrit dans la partie expérimentale ci-dessous) ou in vivo
(par exemple, dans un test de choix gustatif, comme décrit également dans la partie expérimentale) .
Un autre aspect particulièrement important de l'invention est l'utilisation d'un récepteur mX d'insecte, comme cible pour identifier des substances répulsives à l'égard d'au moins certains insectes. Par "substances", on entend ici et dans la suite de ce texte non seulement les molécules présentes dans les bases de données moléculaires - par exemple, plus de trois millions de molécules peuvent être criblées in silico pour leur liaison à la poche du récepteur mX - mais également des substances plus complexes, telles que des extraits cellulaires, des extraits de plantes, etc., qui peuvent être testés in vitro ou in vivo.
Dans le cadre de la présente invention, un procédé de criblage pour identifier une substance répulsive à l'égard d'au moins une espèce d'insecte comprend de préférence une étape de sélection des substances se liant au récepteur mX dudit insecte. Ainsi, la recherche de molécules répulsives pour les moustiques se fera de préférence en recherchant des ligands du récepteur AgmXR d'Anophèles gambiae. Toutefois, le très fort degré d' homologie du récepteur mX d'une espèce d'insecte à l'autre permet de supposer qu'une substance se liant au récepteur AgmXR et répulsive pour les moustiques, aura également un effet répulsif sur d'autres insectes, tels que le guêpes, les criquets etc. Selon un mode de réalisation préféré, un procédé de criblage selon l'invention comprend une étape de sélection des substances activant ou inhibant le récepteur mX. Comme vu plus haut, plusieurs modes d' activation des mXR peuvent exister, et un modulateur peut être un ligand compétitif ou un régulateur allostérique .
Le procédé de criblage selon l'invention peut être mis en œuvre en utilisant n' importe quel récepteur mX d'insecte. A titre d'exemples de récepteurs utilisables, on peut citer le récepteur DmXR de Drosophila melanogaster, de Drosophila pseudoobscυra, ou de Drosophila virilis, le récepteur AgmXR d' Anophèles gambiae, le récepteur mXR de Aedes aegypti, le récepteur HBmXR d'Apis mellifera et le récepteur mXR de Bombyx morl. Les résidus-clés formant la poche de liaison de la L-canavanine et de la L-arginine sont identiques chez les quatre espèces d' insectes citées ci- dessus ; les activateurs du récepteur de drosophile, par exemple, seront donc très probablement des activateurs du récepteur mX de beaucoup d'insectes. Un procédé de criblage selon l'invention comprend de préférence au moins une étape de criblage in vitro, par mise en contact des substances à tester avec le récepteur mX choisi. Cette étape de criblage in vitro peut être effectuée sur des cellules en culture exprimant le récepteur mX, qu'il s'agisse de cellules d'insecte exprimant naturellement ledit récepteur, ou de cellules transfectées par un vecteur d' expression de ce récepteur et qui l'expriment, soit de façon transitoire, soit, de préférence, de façon stable. Un exemple de test In vitro utilisable dans le cadre de l'invention est décrit dans l'article de Mitri eb al., supra, et dans la partie expérimentale ci-dessous. L'utilisation d'une cellule transformée par un vecteur d'expression du récepteur mX, pour identifier des substances répulsives à l'égard d'au moins certains insectes, fait également partie de la présente invention.
Selon une mise en œuvre préférée du procédé de l'invention, le procédé comprend une étape de détermination in vivo de l'effet répulsif des substances sélectionnées in vitro. Cette étape de détermination in vivo de l'effet répulsif peut comprendre ou consister en un test de choix gustatif. Un exemple de test de choix gustatif, sur des drosophiles, est décrit dans la partie expérimentale ci- dessous . En outre, un procédé de criblage selon l'invention peut comprendre, en amont de l'étape de criblage in vitro, une étape de criblage in silico de molécules à tester .
Selon une réalisation particulière du procédé de criblage ci-dessus, une étape supplémentaire est ajoutée pour déterminer si l'action répulsive d'une substance sélectionnée est exclusivement liée à sa liaison au récepteur mX. Cette étape consiste en un test sur au moins un mutant de perte de fonction du récepteur mX, par exemple sur des mouches chez lesquelles le gène de mX a été rendu non fonctionnel, ou son expression a été inhibée.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront des exemples expérimentaux ci-dessous, qui se réfèrent aux figures annexées, dans lesquelles :
La figure 1 montre le résultat d'un test pharmacologique montrant l'effet dose-réponse de la L- canavanine sur des cellules HEK transfectées par des vecteurs d'expression de Gαqi/9 seul (Ctrl), ou de Gαqi/9 et DmXR (DmXR). L'EC50 de la L-canavanine a été évalué à 0,5mM.
La figure 2 montre le résultat d'un test pharmacologique montrant que DmXR exprimé dans des cellules HEK est spécifiquement activé par l'arginine associée au calcium mais pas par les autres acides aminés naturels (1OmM) en présence de calcium (1OmM) (autres) . La barre "autres" du graphe représente une moyenne des tests réalisés avec chaque acide aminé autre que l'arginine.
La figure 3 présente le résultat de tests pharmacologiques montrant l'effet dose-réponse de l'arginine en présence de 1OmM de calcium (courbe en pointillés) et du calcium en présence de 1OmM d' arginine (courbe pleine) sur des cellules HEK transfectées par Gαqi/9 et DmXR.
La figure 4 présente un schéma du test de comportement effectué pour mesurer l'effet chémosensoriel des ligands du récepteur DmX. Les rayures horizontales symbolisent l' érioglaucine (colorant bleu), tandis que les rayures verticales symbolisent la suiforhodamine (colorant rouge) . Lorsque les mouches ont ingéré des deux solutions, le contenu de leur tube digestif est violet, ce qui est ici schématisé par un quadrillage.
La figure 5 montre le résultat des tests de comportement effectués. Chaque situation est représentée par le pourcentage de mouches ayant mangé du milieu bleu (% bleu = nombre d'abdomen bleu / (nombre d'abdomen bleu + nombre d'abdomen bicolore + nombre d'abdomen rouge) xlOO) . * = P < 0,01. La figure 5A montre le résultat des tests de comportement réalisés sur des drosophiles sauvages (CS) et sur des drosophiles mutantes (pox-neuro70 (n=10). La figure 5B présente le résultat des tests de comportement réalisés sur des drosophiles sauvages (n=6) .
La figure 6 présente le résultat de tests de comportement effectués sur des drosophiles sauvages (CS) et sur deux mutants perte de fonction mXR (ml et m2 = deux mutants DmXR") (n=10) .
La figure 7 montre les résultats obtenus in vitro et in vivo avec de la N-methyl-L-arginine . La figure 7A montre l'effet antagoniste du N-methyl-L-arginine sur le récepteur DmX transfecté dans des cellules HEK293. La figure 7B montre la courbe d' inhibition du N-methyl-L-arginine (IC5O= 0,2 inM) . La figure 7C montre le résultat de tests de comportement gustatif effectués sur des drosophiles sauvages (CS) (n=10) .
La figure 8 illustre la stratégie utilisée pour trouver les ligands endogènes de DmXR.
EXEMPLES
Les exemples expérimentaux décrits ci-dessous ont été obtenus en utilisant les matériels et méthodes suivants . Réactifs
Le L-glutamate, la L-arginine, le chlorure de calcium, la L-canavanine (ref : C1625) , le N-methyl-L- arginine (ref : M-7033) ont été acheté à Sigma. Le colorant érioglaucine (ref : 861146) provient d'Aldrich, le colorant suiforhodamine B (ref : S9012) de Sigma. L' agarose a été acheté à Invitrogen (ref : 15510-019) . Le sucrose (saccharose) provient de Merck (ref : 7654) . Pharmacologie Les expériences de pharmacologie ont été réalisées comme décrit précédemment (Mitri, Parmentier et al. 2004) .
Pour l' identification du ligand endogène du récepteur DmXR, 6 grammes de têtes de Drosophila melanogaster, souche Canton S, ont été utilisés pour réaliser des extraits hydrophiliques de têtes comme décrit par Mitri et al., supra. La stratégie utilisée pour trouver les ligands endogènes de DmXR est illustrée à la figure 8. La résine sulfonique X4 provient de Biorad. Comportement
L'essai utilisé mesure la préférence de nourriture dans un choix à 2 possibilités matérialisées par deux colorants, l' erioglaucine (bleu) d'une part, la suiforhodamine (rouge) d'autre part. L' erioglaucine est utilisée à une concentration finale de 5mg/ml, dissoute dans de l'eau bidistillée pH 7,5. La suiforhodamine est utilisée à une concentration finale de 20mg/ml, dissoute dans de l'eau bidistillée pH 7,5. Les 2 solutions de colorants contiennent aussi du saccharose (sucrose à 5mM final). Les agonistes (pH=7,5) utilisés sont rajoutés aux concentrations finales indiquées sur les figures dans la solution contenant de l' erioglaucine .
Pour réaliser un milieu solide, ces différents composés sont rajoutés à une solution d' agarose fondue (0,3% final, 45°C) et déposés dans une plaque de culture de cellules à 96 puits (Corning Incorporated, ref 3599) de telle manière à ce que les puits contiennent alternativement 200μl de colorant bleu puis 200μl de colorant rouge (voir fig. 4) . Les plaques sont laissées à température ambiante pendant 2 heures afin que l' agarose se solidifie, puis sont utilisées pour un test de préférence de nourriture.
Pour chaque test de comportement, 60 drosophiles âgées de 2 à 5 jours sont mises à jeûner pendant 24 heures sur du coton imbibé d'eau distillée avant le test puis sont déposés dans une boîte contenant une plaque de 96 puits préparée comme indiqué ci-dessus. Les drosophiles sont laissées dans l'obscurité pendant 2 heures, à 25°C, humidité de 30 à 50%. Les drosophiles sont ensuite rapidement collectées par anesthésation au CO2 puis congelées à -2O0C pendant 20 minutes. Pour déterminer la prise de nourriture, les mouches sont comptées d'après la couleur du contenu de leur tube digestif. Les résultats sont exprimés en % de mouches qui ont mangé un milieu donné par rapport au nombre total de mouches qui ont mangé suivant la formule :
%bleu= nombre de mouches à tube digestif bleu, divisé par le nombre de mouches qui ont mangé (somme des mouches à tube digestif bleu, violet ou rouge) , multiplié par 100. Au moins 8 tests indépendants ont été réalisés pour chaque point indiqué sur les figures, et les résultats des tests ont été comptés en aveugle pour la majorité des points. Seulement les tests dans lesquels plus de 25% des mouches avaient mangé ont été inclus dans les résultats et dans les tests statistiques (T test et ANOVA) .
Génétique
La souche sauvage utilisée est Canton S. Les mutants perte de fonction DmXR ont été générés par insertion d'éléments piggyBac (Thibault, Singer et al. 2004). Le mutant Pox-Neuro 70 est disponible auprès du Dr. C. Dambly- Chaudière, Université de Montpellier II (Dambly-Chaudiere, Jamet et al. 1992). L'absence d'ARNm codant pour le récepteur mX a été montrée par RT-PCR.
Exemple 1 : Activation in vitro du DmXR Le récepteur mX est un récepteur couplé aux protéines G, homologue aux récepteurs métabotropiques du glutamate (famille C des récepteurs couplés aux protéines G)
(Mitri et al., 2004). Le récepteur mX est caractérisé par une séquence particulière de résidus consensus au niveau de la poche de liaison du ligand, séquence consensus qui diffère de celle des récepteurs métabotropiques du glutamate (Mitri et al. , 2004) .
La séquence codante du récepteur DmX a été clonée dans un vecteur d'expression pour les cellules de mammifères, qui a été ensuite transfecté dans des cellules hétérologues couramment utilisés dans les laboratoires de pharmacologie (cellules HEK), comme décrit par Mitri et al.
(2004). L'activation du récepteur est mesurée par l'accumulation d' inositol triphosphate . Les résultats, présentés aux figures 1 à 3, montrent que :
1) in vitro, le récepteur DmX est activé par la L-canavanine (acide L-2-amino-4- (guanidinooxy) butyrique) , un acide aminé de structure analogue à l'arginine et synthétisé par certaines légumineuses (fig.l). La L-canavanine n'est cependant pas le ligand endogène du récepteur.
2) le ligand endogène du récepteur DmX est l'acide aminé L-arginine associé à l'ion calcium (fig.2, fig.3) . Exemple 2 : Activation In vivo du DmXR
La fonction du récepteur DmX et l'effet chemosensoriel des ligands identifiés ont été étudiés in vivo par un test de comportement permettant de mesurer le choix alimentaire entre deux solutions sucrées colorées avec des colorants alimentaires différents (érioglaucine = bleu, suiforhodamine = rouge (Thorne, Chromey et al. 2004)), en présence ou en absence des deux agonistes identifiés. La figure 4 illustre ce test de comportement.
Pour chaque essai, 60 mouches ayant jeûné (24h) sont placées dans l'obscurité sur une plaque à 96 puits pendant 2h à 250C. Les puits contiennent alternativement les solutions à tester dans de l'agarose (0,3%) avec de 1' érioglaucine (bleu) ou de la suiforhodamine (rouge).
Les mouches sont comptées d'après la couleur du contenu de leur tube digestif.
Les résultats sont exprimés en pourcentage de mouches qui ont mangé un milieu donné, par rapport au nombre total de mouches qui ont mangé.
% bleu = N bleu / (N bleu + N violet + N rouge) X 100 Le nombre d' expériences (n) réalisées est ≥8 pour chaque situation.
En l'absence de tout ligand du récepteur mX, les mouches absorbent systématiquement davantage de solution colorée avec de l' érioglaucine (bleu) que de solution colorée avec de la suiforhodamiήe (rouge) . Ceci est lié soit à un effet attractif du colorant bleu, soit à un effet répulsif du colorant rouge, soit à une combinaison des deux effets . Les résultats présentés à la figure 5 montrent qu' in vivo, la L-canavanine d'une part et la L-arginine associée au calcium d'autre part sont fortement répulsifs dans un test comportement chémosensoriel chez la drosophile. Une solution sucrée (5mM sucrose) est attractive pour la drosophile. En présence d'un des ligands de DmXR (2OmM), la solution sucrée devient répulsive (fig.5A, fig.5B). A forte concentration de L-canavanine (4OmM), la solution sucrée est très fortement répulsive (fig.5A).
Des expériences complémentaires montrent qu'un plateau est atteint vers 30 mM.
En outre, les tests effectués avec des drosophiles mutantes (pox-neuro 70) , dépourvues de neurones chémosensoriels, montrent que cette répulsion passe par les organes chémosensoriels de la mouche (fig.5A). Exemple 3 : l'effet répulsif de la L-canavanine nécessite le récepteur DmX
Afin de vérifier que l'effet répulsif de la L- canavanine nécessite le récepteur DmX, les Inventeurs ont identifié deux mutants perte de fonction du récepteur DmX. Pour chacun de ces mutants ml et m2, l'absence d'ARNm codant pour le récepteur mX a été montrée par RT-PCR. Les résultats présentés à la figure 6 montrent que ces mutants ont perdu la capacité de détecter la L-canavanine dans le milieu. En effet, les drosophiles mutantes n'ont plus de répulsion à la L-canavanine.
Ces résultats confirment que les activateurs du récepteur mX sont des répulsifs lorsqu'ils sont ajoutés dans une solution sucrée.
Exemple 4 : Identification de nouvelles molécules à propriété répulsive
Les résultats présentés aux exemples 1 à 3 ci- dessus permettent de concevoir un procédé permettant de rechercher rapidement des nouvelles molécules à propriété répulsive, qui utilise le récepteur DmX comme cible. Par exemple, un tel procédé se compose de deux phases :
1) in vitro, le récepteur clone de drosophile (DmXR) est exprimé dans des cellules de mammifère en culture. De nouveaux modulateurs du récepteur DmX (ligands agonistes, antagonistes, et régulateurs allostériques) sont identifiés par crible in vitro, la L-canavanine servant de contrôle positif.
2) in vivo, les activateurs de DmXR identifiés in vitro sont testés chez la drosophile pour leurs propriétés répulsives par un test de choix gustatif très rapide, la L-canavanine servant à nouveau de contrôle positif. Les propriétés répulsives des activateurs du récepteur de drosophile sont ensuite testées sur d'autres insectes, par des tests de comportement gustatifs appropriés aux espèces étudiées.
Ainsi, des nouveaux ligands de DmXR sont identifiés, et des nouveaux activateurs de DmXR, plus affins que l'arginine et le calcium ou pas toxique comme la L- canavanine, sont sélectionnés.
Exemple 5 : Identification de nouveaux ligands par criblage In s±l±σo
Une structure 3D de la poche de liaison théorique a été déterminée et publiée (Mitri, Parmentier et al. 2004) .
Pour rechercher de nouveaux ligands compétitifs, un criblage virtuel de ce modèle 3D du site de liaison est effectué, permettant de cribler une base de plus de 2 millions de molécules commerciales. Les molécules sélectionnées virtuellement sont ensuite testées in vitro sur le récepteur. Les meilleurs candidats sont optimisés en synthétisant différentes séries de dérivés dont l'effet in vitro est évalué.
Les ligands identifiés après optimisation chimique, sont alors synthétisés en quantité suffisante pour déterminer leurs effets in vivo. Exemple 6 : Identification d' un inhibiteur du récepteur DmX
II a été montré que la réponse gustative à certains acides aminés étudiés comme la méthionine et la valine semble dépendre de l'espèce d'insectes étudiée, allant de stimulant à répulsif (Chapman 2003) . Les inventeurs ont donc identifié un antagoniste du récepteur
DmX, appelé N-methyl-L-arginine (NMA) . La figure 7A montre l'effet antagoniste de la N-methyl-L-arginine sur le récepteur DmX transfecté dans des cellules HEK293. La figure
7B montre la courbe d'inhibition de la N-methyl-L-arginine
(IC50= 0,2 mM) . Dans le test de comportement gustatif utilisé pour montrer l'effet répulsif des agonistes de DmXR, la NMA à une concentration de 3OmM est sans effet sur le comportement gustatif de la drosophile (figure 7C) . Si de la NMA (3OmM) est ajoutée au milieu contenant de la L- canavanine à une concentration de 2OmM, la répulsion est significativement moins élevée que celle observée dans un milieu contenant de la L-canavanine seule (figure 7C) . Cette expérience confirme l'action répulsive de la L-canavanine au travers du récepteur DmX.
Références
Chapman, R. F. (2003) . "Contact chemoreception in feeding by phytophagous insects." Annu Rev Entomol 48: 455-84. Dambly-Chaudiere, C, E. Jamet, et al. (1992).
"The paired box gène pox neuro : a déterminant of poly- innervated sensé organs in Drosophila." CeIl 69(1): 159-72.
Fradin, M. S. and J. F. Day (2002) . "Comparative efficacy of insect repellents against mosquito bites." N Engl J Med 347(1): 13-8.
Gasparini, F., R. Kuhn, et al. (2002). "Allosteric modulators of group I metabotropic glutamate receptors: novel subtype-selective ligands and therapeutic perspectives." Curr Opin Pharmacol 2(1): 43-9. Mitri, C, M. L. Parmentier, et al. (2004).
"Divergent évolution in metabotropic glutamate receptors. A new receptor activated by an endogenous ligand différent from glutamate in insects." J Biol Chem 279(10): 9313-20.
Rosenthal, G. A. (1977) . "The biological effects and mode of action of L-canavanine, a structural analogue of L-arginine." Q Rev Biol 52(2): 155-78.
Rosenthal, G. A. (2001) . "L-Canavanine : a higher plant insecticidal allelochemical . " Amino Acids 21(3): 319- 30. Thibault, S. T., M. A. Singer, et al. (2004). "A complementary transposon tool kit for Drosophila melanogaster using P and piggyBac." Nat Genêt 36(3): 283-7.
Thorne, N., C. Chromey, et al. (2004). "Taste perception and coding in Drosophila." Curr Biol 14(12): 1065-79.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un mélange d' arginine et de calcium comme répulsif à l'égard de certains insectes.
2. Utilisation d'un mélange d' arginine et de calcium pour la préparation d'une composition répulsive à l'égard de certains insectes
3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que les concentrations d' arginine et de calcium sont supérieures à 10 mM, de préférence supérieures à 20 mM.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce les concentrations d' arginine et de calcium sont comprises entre 15 et 100 mM, de préférence entre 20 et 50 mM.
5. Utilisation de L-canavanine et/ou d'un mélange d' arginine et de calcium, et/ou de N-méthyl-L- arginine (NMA) , comme contrôles dans un test de criblage pour identifier des substances répulsives à l'égard d'au moins certains insectes.
6. Utilisation d'un récepteur mX d'insecte, comme cible pour identifier des substances répulsives à l'égard d'au moins certains insectes.
7. Utilisation d'une cellule transformée par un vecteur d'expression du récepteur mX, pour identifier des substances répulsives à l'égard d'au moins certains insectes .
8. Procédé de criblage pour identifier une substance répulsive à l'égard d'au moins une espèce d'insecte, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de sélection des substances se liant au récepteur mX dudit insecte .
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu' il comprend une étape de sélection des substances activant le récepteur mX.
10. Procédé selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisé en ce que le récepteur mX est sélectionné parmi le récepteur DmXR de Drosophila melanogaster, de Drosophila pseudoobscura, ou de Drosophila virilis, le récepteur AgmXR d'Anophèles gambiae, le récepteur mXR de Aedes aegyti, le récepteur HBmXR d'Apis mellifera et le récepteur mXR de Bombyx mori.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de criblage in vitro, par mise en contact des substances à tester avec le récepteur mX.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le criblage in vitro est effectué sur des cellules en culture exprimant le récepteur mX. .
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de détermination in vivo de l'effet répulsif des substances sélectionnées in vitro.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'étape de détermination in vivo de l'effet répulsif comprend un test de choix gustatif.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend également, avant l'étape de criblage in vitro, un étape de criblage in silico de molécules à tester.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend également une étape de test sur au moins un mutant de perte de fonction du récepteur mX, pour déterminer si l'action répulsive d'une substance sélectionnée est exclusivement liée à sa liaison au récepteur mX.
17. Article textile caractérisé en ce qu'il est imbibé d'une composition comprenant au moins un activateur d'un récepteur mX constitué de l'arginine et du calcium, les concentrations d' arginine et de calcium étant supérieures à 10 mM, de préférence supérieures à 20 mM.
18. Article textile selon la revendication 17, caractérisé en ce que les concentrations d' arginine et de calcium sont comprises entre 15 et 100 mM, de préférence entre 20 et 50 mM.
19. Méthode pour repousser certains insectes, caractérisée en ce que des surfaces sont traitées avec un mélange d' arginine et de calcium.
20. Composition attractive à l'égard de certains insectes, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un modulateur d'un récepteur mX.
21. Composition selon la revendication 20, caractérisée en ce que ledit modulateur est un inhibiteur d'un récepteur mX.
22. Composition selon la revendication 20 ou la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle comprend de la N-méthyl-L-arginine (NMA) .
23. Composition selon la revendication 22, caractérisée en ce que la concentration de N-méthyl-L- arginine est supérieure à 10 mM, de préférence supérieure à 20 mM.
24. Composition selon l'une quelconque des revendications 20 à 23, comprenant en outre un insecticide.
25. Piège à insectes, comprenant une composition selon l'une quelconque des revendications 20 à 24.
26. Utilisation de N-méthyl-L-arginine (NMA), pour la préparation d'une composition insecticide attractive à l'égard de certains insectes.
PCT/FR2007/000813 2006-05-15 2007-05-14 Repulsifs anti-insectes et procede pour identifier d'autres molecules repulsives a l'egard des insectes WO2007132090A2 (fr)

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