WO2012002840A1 - Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза - Google Patents

Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза Download PDF

Info

Publication number
WO2012002840A1
WO2012002840A1 PCT/RU2011/000406 RU2011000406W WO2012002840A1 WO 2012002840 A1 WO2012002840 A1 WO 2012002840A1 RU 2011000406 W RU2011000406 W RU 2011000406W WO 2012002840 A1 WO2012002840 A1 WO 2012002840A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pharmaceutical composition
protein
animals
kda
concentration
Prior art date
Application number
PCT/RU2011/000406
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Анна Борисовна НАЗАРЕНКО
Михаил Анатольевич СОКОЛОВ
Original Assignee
Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" filed Critical Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез"
Priority to ES11801210.3T priority Critical patent/ES2671247T3/es
Priority to EP11801210.3A priority patent/EP2589390B1/en
Priority to EA201300062A priority patent/EA024732B1/ru
Publication of WO2012002840A1 publication Critical patent/WO2012002840A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system

Definitions

  • the invention relates to medicine, in particular to pharmacology, pharmaceutical industry, veterinary medicine, and is a pharmaceutical composition having a reparative-regenerative effect on nervous tissue, intended for the treatment of diseases of the central and peripheral nervous system of the vascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune genesis, and consisting of a biologically active protein-polypeptide complex, including organ-specific growth factors and nerve differentiation tissue, as well as signaling molecules in therapeutically effective ratios and concentrations, and a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the pharmaceutical composition is a biologically active protein-polypeptide complex with a molecular weight of its protein-polypeptide components ranging from 5 to 200 kDa, with a molecular weight fraction ranging from 10 to 120 kDa of at least 80%, with a total protein concentration of 0.8 - 4.2 mg / ml with a maximum absorption, the ultraviolet spectrum of the solution at a wavelength of 280 ⁇ 5 nm, the presence of a peak at a wavelength of 274-284 nm in the UV-visible region of the spectrum, and the presence of bands in the range of pi from 4.2 to 8, 4 with isoelectric focusing in 5% polyac ilamidnom gel and a pharmaceutically acceptable diluent comprising a buffer solution and a high molecular compound excipients, stabilizers, preservatives and solubilizing agents in sufficient concentrations.
  • the substance was obtained by ion exchange chromatography of a tissue homogenate filtrate in the presence of a buffer solution, detergents, proteolysis inhibitors from the brain of embryos ungulate farm animals with a gestation period from the middle of the first third to the middle of the last third of pregnancy.
  • a number of protein-peptide preparations are known from raw materials of animal origin with nootropic and neurometabolic activity, which are used to treat diseases of the nervous system.
  • the closest to the achieved effect are: Cerebrolysin - a remedy for the treatment of hemorrhagic or ischemic strokes, the company "Ebewe” (Austria) [1], which is a product of brain treatment of intact pigs; Cerebrocurin is a therapeutic agent for diseases accompanied by dysfunction of the central nervous system, the company NIR LLC (Ukraine) [2], which is a product of brain processing of animal embryos;
  • ortexin is a polypeptide preparation obtained by extraction from the cerebral cortex of cattle and pigs, Geropharm LLC ( Russia) [3], which has a nootropic, cerebroprotective, anticonvulsant and antioxidant effect; Cerebrolysate is a drug that increases the resistance of brain tissue to intoxication, hypoxia, hypoglycemia, mechanical injury, Microgen firm NPO FGUP (Immunopreparat) [4], which has a nootropic effect, which is a hydrolyzate of the cerebral cortex.
  • the composition of Cerebrolysin includes amino acids (-85%), low molecular weight peptides (-15%), trace elements, the raw material for which is the pig’s brain.
  • the neuroprotective and trophic effect of the drug is carried out due to specific peptides and amino acids, with a molecular weight of not higher than 10,000 Daltons, of which the dominant and determining properties of the drug are alanine, leucine and lysine.
  • the drug is intended for intramuscular, intravenous administration and has a low concentration of biologically active components, therefore it is introduced into the patient's body in significant doses for a long time.
  • the disadvantage of the known drug is a significant duration of the course of treatment, low activity and specificity of the drug in connection with a weak neuroprotective effect, having an extremely low regenerative, including reparative potential for nerve tissue.
  • the composition of Cerebrocurin includes water-soluble prenatal neuropeptides and cleavage products of inactive high molecular weight precursors from brain homogenizate of animal embryos, which, after being diluted with physiological saline, are reacted with an immobilized proteolytic enzyme, and the interaction mode is set based on the control sample of the obtained product, and the resulting solution is kept in within 30 days at a temperature of no higher than 10 ° C.
  • a higher (compared with Cerebrolysin) activity of the obtained product is achieved and the spectrum of its action is significantly expanded due to the higher mass of the contained peptides and low molecular weight proteins remaining after proteolysis.
  • composition of “Cortexin” includes a complex of water-soluble complex of biologically active alkaline, acidic and neutral polypeptides with mol. m. from 500 to 15,000 Yes and an isoelectric point of 3.5–9.5 obtained from crushed frozen tissue of the livestock brain by extraction a solution of acetic acid containing zinc chloride, separating the precipitate, treating the supernatant with acetone, washing the precipitate with acetone, drying, followed by purification, sterilization and lyophilization of the target product.
  • the drug is intended for intramuscular administration and has a low concentration of biologically active low molecular weight components, therefore it is introduced into the patient's body in significant doses for a long time.
  • the concentration of serotonin and dopamine exerting a GAM-positive effect, reduces the toxic effects of neurotropic substances, improves learning and memory, accelerates the restoration of brain functions after stressful effects
  • Cortexin has no high activity and specificity in connection with a weak neuroprotective effect, possessing a low regenerative, including insignificant reparative potential for nervous tissue ani, which requires a significant duration of course treatment.
  • the composition of Cerebrolysate also includes water-soluble polypeptides, as a result of hydrolysis of the cerebral cortex of cattle, with weak enzymatic activity, with a molecular weight of not more than 15,000 Da.
  • the variation in the amino acid composition of the preparation indicated in the patent allows a significant variation in the composition of the obtained peptide concentration ratios, determining the low tissue-specific activity and the stability of the pharmacological action, with a weak neurometabolic and unexpressed nootropic effect.
  • the aim of this invention was the creation of a pharmaceutical composition having a pronounced reparative-regenerative effect on the nervous tissue, for the treatment of diseases of the central and peripheral nervous system of the vascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune genesis.
  • the pharmaceutical composition intended for the treatment of diseases of the central and peripheral nervous system of the vascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune genesis is made in the form of a solution for parenteral, intranasal and subconjunctive administration and contains a biologically active protein- as an active ingredient a polypeptide complex at a concentration of 0.01 - 2.0 mg / ml, having a tissue-specific reparative effect on nerve tissue, received from the embryonic brain of agricultural ungulates with gestational age from the middle of the first to the middle of the last third of pregnancy, including negatively charged weakly acidic, neutral proteins and polypeptides related to growth factors, differentiation, signaling molecules that determine its biological and pharmacological activity, with molecular weights from 5 to 200 kDa, and at least 80% of the total protein mass has a molecular weight in the range from 10 to 120 kDa, characterized by the presence of a peak at a wavelength of 27 4-284 nm in the UV-visible
  • the pharmaceutical composition as a diluent may contain a pharmacopoeial buffer solution and excipients, including high molecular weight compounds, stabilizers, preservatives and solubilizers.
  • the goal is achieved by the described pharmaceutical composition containing, as an active ingredient, a biologically active protein-polypeptide complex consisting of negatively charged weakly acidic, neutral proteins and polypeptides with a molecular weight of 5 to 200 kDa obtained from embryonic brain tissue of ungulate farm animals with a gestation period from the middle of the first third to the middle of the last third of pregnancy, including organ-specific growth factors and differentiation of nervous tissue, as well as signaling molecules in therapeutically effective ratios and concentrations, a pharmaceutically acceptable diluent consisting of a buffer solution, for example phosphate buffer, and excipients, high mol ocular compounds, for example carmellose; stabilizers, for example mannitol, preservatives, for example nipagin, and solubilizers, for example polysorbate-80.
  • a biologically active protein-polypeptide complex consisting of negatively charged weakly acidic, neutral proteins and polypeptides with a molecular weight of 5 to 200 kD
  • the claimed pharmacological composition which is a protein-polypeptide complex and a pharmaceutically acceptable diluent, differs from the previously declared substances and compositions isolated from the brain of animals, according to the source of raw materials taken at certain gestational dates, the molecular weights of its protein-polypeptide fractions (up to 200 kDa), their qualitative composition, according to the concentration ratios of growth proteins, differentiation factors, and signal molecules evolutionarily fixed in ontogenesis, according to bu application (parenterally, intrathecally, intranasally, subkonbyuktivalno), safety of use (the absence of toxic, mutagenic, carcinogenic and allergenic properties) of biological and pharmacological activity and its specificity (tissue- and organ-specific, reparative and regenerative).
  • Example 1 A method of obtaining a biologically active complex. Obtaining a protein fraction from pig embryonic brain. 250 g quick frozen brain of pig embryos for a gestational period of 14 weeks are thawed and homogenized in 1200 ml of 0.05 M TRIS-glycine phosphate buffer pH 7.0, containing 1 mm EDTA and 0.1% maltose, for 7 minutes at 8 ° C. The homogenate is separated from the ballast substances by filtration through a dense tissue, followed by centrifugation at 18,000 g and filtration through a membrane filter with a pore diameter of 0.45 ⁇ m at 8 ° C.
  • the filtrate is applied to a pH of 7.0, balanced with 4 volumes of 0.05 M TRIS-glycine-phosphate buffer, containing 0.1 mM EDTA and 0.1 mM NaCl, a 200 ml chromatographic column with Toyopearl DEAE-650M anion exchange medium. Separation of the proteins bound to the carrier is carried out by a stepwise gradient, increasing the salt concentration in 10% increments, collecting the target fractions. The chromatographic process is carried out at a temperature of 8 ° C.
  • the target fraction is gradually subjected to ultrafiltration at the installation with a backpressure of not more than 8.0 kgf / cm through materials with a retention capacity of 5 kDa and 200 kDa, desalted, diluted with a 0.05 M solution of glycine-NaOH pH 7.4 to a protein concentration of 1.0 mg / ml
  • the solution is subjected to sterilizing filtration through a membrane filter with a pore diameter of not more than 0.22 ⁇ m.
  • methods of ultraviolet spectrophotometry, gel chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis and amino acid analysis were used.
  • the ultraviolet spectrum of the drug solution is recorded in the wavelength region from 250 to 350 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of 280 ⁇ 5 nm.
  • the molecular weight of the proteins included in the preparation is determined by the following methods: gel chromatography on Superdex 75 (GE Healthcare) and denaturing SDS-Page electrophoresis in 12% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins. To calibrate the column, protein standards are used with a molecular weight range from 13 kDa to 200 kDa.
  • the composition of the drug includes negatively charged weakly acidic, neutral proteins and polypeptides related to growth factors, differentiation, signaling molecules, with molecular weights from 5 to 200 kda, and 82% of the total protein has a molecular weight of a range from 10 to 120 kda, characterized by the presence of a peak at a wavelength of 274 nm in the UV-visible region of the spectrum and the presence of bands in the range of p! 4.2 at isoelectric focusing in 5% polyacrylamide gel and a pharmaceutically acceptable diluent.
  • Example 2 A method of obtaining a biologically active complex. Obtaining a protein fraction from the embryonic brain of piglets. 200 g of fast-frozen brain of embryos of piglets with a gestation period of 20 to 22 weeks are thawed and homogenized in 800 ml of 50 mM Tris-maleate buffer solution pH 5.8 containing 1 mM (EDTA) and 0.1% mannitol for 5 minutes at 25 ° C. The homogenate is separated from the ballast substances by filtration through a dense tissue, followed by centrifugation at 30,000 g for 30 minutes and filtration through a membrane filter with a pore diameter of 0.45 ⁇ m at 25 ° C.
  • EDTA Tris-maleate buffer solution pH 5.8 containing 1 mM
  • mannitol mannitol
  • the filtrate is applied to a pH 5.8 solution of 0.1 mM EDTA balanced with 4 volumes of maleate buffer solution, a 250 ml chromatographic column with DEAE-Sepharose anion exchange medium.
  • the proteins bound to the carrier are separated by a stepwise gradient of a maleate buffer solution of pH 5.8 containing 0.04 M NaCl, increasing the salt concentration in 0.02 M increments, starting to collect the target fractions with a salt concentration of 0.06 M.
  • the chromatographic process is carried out at a temperature 2 - 4 ° C.
  • the target fraction is gradually subjected to ultrafiltration at the facility with a backpressure of not more than 8.0 kgf / cm through materials with a retention capacity of 5 kDa and 200 kDa, desalted, diluted with 50 mM solution of aspartate-NaOH pH 7.4 to a protein concentration of 1.0 mg / ml by adding polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween-80) to a total concentration of 0.01 mg / ml.
  • the solution is subjected to sterilizing filtration through a membrane filter with a pore diameter of not more than 0.22 ⁇ m.
  • the ultraviolet spectrum of the solution is recorded in the wavelength range from 250 to 350 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of 280 ⁇ 5 nm.
  • the molecular weight of the proteins and polypeptides that make up the complex is determined by the following methods: gel chromatography on Superdex 75 (GE Healthcare) and denaturing SDS-Page electrophoresis in 12% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins .
  • protein standards are used with a molecular weight range from 13 kDa to 250 kDa.
  • the composition of the drug includes negatively charged weakly acidic, neutral proteins and polypeptides related to growth factors, differentiation, signaling molecules, with molecular weights from 5 to 200 kda, and 82% of the total protein has a molecular weight of a range from 10 to 120 kDa, characterized by the presence of a peak at a wavelength of 284 nm in the UV-visible region of the spectrum and the presence of bands in the range of pi 8.4 when isoelectric focusing in 5% polyacrylamide gel and pharmaceutically acceptable thinner.
  • Example 3 A method of obtaining a pharmaceutical composition. Obtained according to example 1. a solution of a biologically active complex from the fetal brain of pigs is diluted with 50 mm glycine-phosphate
  • the composition may contain a biologically active protein-polypeptide complex at a concentration of 0.9 mg / ml, 1 mg / ml, 1, 2 mg / ml.
  • the resulting pharmaceutical composition is subjected to sterilizing filtration, through a membrane filter with a pore diameter of not more than 0.1 ⁇ m, poured into sterile glass bottles and sealed.
  • Example 4 A method of obtaining a pharmaceutical composition.
  • a solution of a biologically active complex from the embryonic brain of pigs is diluted with 50 mm maleate buffer solution pH 5.8, with a total containing 0.3% lactic acid, 0.5% mannitol, 0.1% carmelose, to 0, 0005% polysorbate 80 with the calculation of the final concentration of total protein in the resulting solution in the range of 0.9 - 1.2 mg / ml, i.e.
  • the pharmaceutical composition may contain a biologically active protein-polypeptide complex at a concentration of 0.9 mg / ml, 1 mg / ml, 1, 2 mg / ml.
  • the resulting pharmaceutical composition is subjected to sterilizing filtration, through a membrane filter with a pore diameter of not more than 0.1 ⁇ m, poured into sterile glass bottles and sealed.
  • Toxicity studies were carried out in the acute and subchronic experiment of the original pharmaceutical composition.
  • Dosage form sterile intranasal dosage spray in a glass or polymer bottle with a capacity of 10 and 30 ml (0.1 mg / ml); injection: 5 ampoules of 1 ml (0.1 mg / ml), 5 ampoules of 2 ml (0.1 mg / ml), 1 ampoule of 2 ml (0.2 mg / ml).
  • the maximum recommended daily dose of 0.4 mg for endolumbar administration and 0.1 mg for intravenous administration.
  • the aim of the study was to determine tolerable, toxic and lethal doses of the original pharmaceutical composition.
  • the study was conducted on mice of both sexes of the BALB / C line weighing 18-20 g with intragastric and intraperitoneal routes of administration. The observation period was 14 days. Animals received from the nursery, certified. The animals were kept in standard conditions, in plastic cages of 10 individuals, the number in the group is 10. For feeding used combined feed, fresh vegetables, cottage cheese. Access to water and feed is free. Vivarium lighting is artificial. The air temperature is 18-20 ° C. The maximum possible dose of 0.2 ml of the finished dosage form for mice was 10 mg / kg, which exceeded the daily therapeutic dose by 600 times. From the experiment, the animals were taken out by ether anesthesia, were subjected to autopsy and analysis of the state of internal organs.
  • mice The mice.
  • the weight of the animals ranged from 18 to 20 g.
  • the coat is thick, white. In appearance, the animals did not differ between the groups.
  • Duration of observation 1 month of administration, 1 month observation of resorptive action.
  • Toxicity was evaluated according to the items on the observation checklist:
  • peripheral blood the number of red blood cells, white blood cells, platelets, hemoglobin level
  • biochemical parameters level of protein, urea, creatinine, glucose
  • serum enzymes aspartate and alanine aminotransferases, alkaline phosphatase, lactate dehydrogenase
  • Blood was taken for hematological studies from the tail vein. Blood cells were counted on an automatic Picoskel blood meter (Hungary). The hemoglobin level was determined by the hemiglobin cyanide method. The level of biochemical parameters was determined using an automated system. FP-901, Labsystems Finland.
  • the animals were killed using an overdose of anesthesia for pathomorphological studies of organs and tissues.
  • the autopsy of the animals was carried out immediately after their death according to the complete pathoanatomical scheme.
  • tissue samples were subjected to gelation and cryostation with obtaining sections with a thickness of up to 5 ⁇ m. Then the tissues were fixed and stained with hematoxylin-eosin. Microscopy was performed using a Opton microscope (Germany). The obtained experimental data were compared with the control data and calculated using a computer statistical program.
  • Hematological parameters hemoglobin content, the number of red blood cells, white blood cells, platelets in all groups within the physiological norm.
  • Pathomorphological data Macroscopic examination.
  • the language is clean. Mucous membranes of the mouth and esophagus without defects. Stomach and intestines without signs of irritation. The liver is not enlarged.
  • the capsule of the kidneys separates easily, the cerebral and cortical substance in the section are clearly distinguishable.
  • the thyroid gland is dense with symmetrical lobes.
  • the brain substance has a symmetrical cross-sectional pattern.
  • the weight indices of the organs of the tested animals had no significant differences from the control groups.
  • mice In all the studied groups: in the internal organs (liver, kidneys, lungs, heart, spleen, stomach, large and small intestines), endocrine glands (thyroid gland, thymus, adrenal glands, pancreas), reproductive organs (uterus, ovaries) lymph nodes, brain, skin, mucous membranes of the nose and throat - no pathomorphological changes were detected.
  • Toxicity was evaluated according to the points on the observation checklist: survival, general appearance, condition and behavior of animals, change in body weight (weighing was carried out at the beginning and at the end of the experiment). The local irritant effect during the experiment was judged by changes in the nasal mucous membranes.
  • the experimental animals studied the morphological composition of peripheral blood (the number of red blood cells, white blood cells, platelets, hemoglobin level), biochemical parameters (protein, urea, creatine, glucose, total cholesterol and triglycerides), the activity of certain serum enzymes (aspartate) before and at the end of the experiment. - and alanine aminotransferases, alkaline phosphatase, lactate dehydrogenase). To determine these indicators, blood was taken from the ear vein in a volume of 1.5-2.0 ml.
  • Blood cells were counted on an automatic Picoskel blood meter (Hungary).
  • the hemoglobin level was determined by the hemiglobin cyanide method.
  • the level of biochemical parameters determined using an automated system. FP-901, Labsystems Finland.
  • samples of fresh tissue were subjected to gelation and cryostation to obtain sections with a thickness of up to 5 ⁇ m.
  • the obtained experimental data were compared with the control and calculated using a computer statistical program.
  • Blood test hemoglobin content, the number of red blood cells, white blood cells, platelets in all groups within the physiological norm.
  • Biochemical studies blood glucose, the activity of alanine and aspartic aminotransferases in all groups within normal limits. The protein concentration in rabbits receiving the pharmaceutical composition 1 and 2 times a day did not statistically differ.
  • Toxicity was evaluated according to the points on the observation checklist: survival, general appearance, condition and behavior of animals, change in body weight (weighing was carried out at the beginning and at the end of the experiment). The local irritant effect during the experiment was judged by changes in the nasal mucous membranes.
  • the experimental animals studied the morphological composition of peripheral blood (the number of red blood cells, white blood cells, platelets, hemoglobin level), biochemical parameters (protein, urea, creatine, glucose, total cholesterol and triglycerides), the activity of certain serum enzymes (aspartate) before and at the end of the experiment. - and alanine aminotransferases, alkaline phosphatase, lactate dehydrogenase).
  • blood was taken from the ear vein in a volume of 1.5-2.0 ml. Blood cells were counted on an automatic Picoskel blood meter (Hungary). The hemoglobin level was determined by the hemiglobin cyanide method. The level of biochemical parameters was determined using an automated system. FP-901, Labsystems Finland.
  • samples of fresh tissue were subjected to gelation and cryostation to obtain sections with a thickness of up to 5 ⁇ m. Then the tissues were fixed and stained with hematoxylin-eosin. Microscopy was carried out on a microscope of the company ⁇ (Germany).
  • the obtained experimental data were compared with the control and calculated using a computer statistical program.
  • the rabbits had a sneezing reflex, which stopped after 1-2 minutes.
  • the rabbits showed a mechanical irritant effect, manifested in the reflex of sneezing, twitching of the nose, animals rubbed their nose with their paws.
  • the epithelial layer has a tightly packed structure, clearly differentiated cells. Cells are connected by gap junctions.
  • the nasal mucosa remained clean throughout the observation period: a faint pink color without discharge, no edema was observed.
  • the vessels of the mucous membrane are not changed.
  • the state of the epithelium was examined in crevice lighting. In any case, pathological changes were not detected.
  • Blood test hemoglobin content, the number of red blood cells, white blood cells, platelets in all groups within the physiological norm. Indicators, obtained in the experimental groups did not significantly differ from the control groups of intact animals and the comparison drug.
  • Example 6 Mutagenicity of the pharmaceutical composition.
  • a sample of a protein-polypeptide pharmaceutical composition was tested, which is a clear liquid sterilely packed in a dark glass vial in an amount of 20 ml, containing a substance in a concentration of 0.1 mg / ml.
  • the mutation test for Salmonella typhimurium is a bacterial test system for accounting for gene mutations to histidine prototrophy under the action of chemical compounds and (or) their metabolites, inducing mutations such as base changes or reading frame shifts in the genome of this organism.
  • Base pair mutagen inducers agents that cause base pair mutations in a DNA molecule.
  • Mutagens that induce mutations in the reading shift of the genetic code are agents that cause the addition or lack of single or multiple base pairs in a DNA molecule. This method is designed to detect the ability of pharmacological substances or their metabolites to induce gene mutations in indicator strains of Salmonella typhimurium.
  • CM + metabolic activation system
  • CM- metabolic activation
  • the number of revertant colonies of different test strains is calculated in comparison with the number of spontaneous revertants in the negative control variants (untreated cultures or cultures treated with a solvent). If the test compound and / or its metabolites have mutagenic activity, then they will induce reverse mutations from auxotrophy to histidine prototrophy in histidine-dependent Salmonella typhimurium strains.
  • Protein-polypeptide pharmaceutical composition in the form of a sterile solution with a protein content of 0.1 mg / ml investigated 1.0 and 0.3 ml of the initial solution on a cup and three 10-fold dilutions in physiological saline (0.1 ml / h).
  • the tested doses of the substance were 300; one hundred; 10; 1 and 0.1 mcg per cup.
  • the experiment was accompanied by positive controls, which were used substances that induce mutations in the corresponding tester strains in the presence or absence of activation conditions.
  • sodium azide was used in an amount of 10 ⁇ g per cup for strain TA 100 at CM-; 2,7-diamino-4,9-dioxo-5,10-dioxo-4,5,9,10-tetrahydro-4,9-diazopyrene (DIAM) - 10 ⁇ g per cup for strain TA 98 at CM-; 9-aminoacridine (9 A A) - 50 ⁇ g / cup for strain TA 97 at CM-.
  • ethidium bromide was used - 10 ⁇ g per cup on strain TA 98 with CM +. Saline (0.1 ml per cup) was used as a negative control.
  • 0.1 ml of the sample was added to the agar tubes in the required dilutions, then 0.1 ml of the bacterial suspension and 0.5 ml of the microsomal activating mixture (for the variant with metabolic activation). Then the contents of the tube were quickly mixed and poured onto a layer of lower minimal agar in Petri dishes. The duration of the introduction of the microsomal activating mixture and the pouring of semi-liquid agar onto the plate did not exceed 10-15 seconds. The plates were left at room temperature for 30-40 minutes and after complete solidification of the agar, they were transferred to a thermostat at 37 ° C. Analysis was carried out after 48 hours of incubation.
  • CM- metabolic activation system
  • CM + metabolic activation system
  • the action of promutagens that is, compounds whose effect is associated with the formation of mutagenic metabolites, can be taken into account when comparing the results obtained by analyzing the test data of the substance in variants SM- and SM +. In each control and experimental options used 2 cups. The mutagenic effect was considered significant if the average number of colonies of revertants per cup in the experimental variant exceeded that in the control version 2 or more times. The results of the experiment were taken into account in the presence of a standard response in all variants of positive and negative control. The number of colonies of revertants in the control with
  • the solvent in the SM- and CM + variants was within the spontaneous level fluctuations for these strains.
  • the response of the strains to standard mutagens was within normal levels.
  • the tested concentrations did not show a mutagenic effect on the strains TA 100, TA 98 and TA 97 in variants without and in the presence of a metabolic activation system.
  • Micronuclei - small DNA-containing formations consisting of
  • the purpose of the study is to identify and quantify
  • cytogenetic (mutagenic) activity of pharmacological agents in polychromatophilic red blood cells (PCE) of mammalian bone marrow The method is based on microscopic registration of cells with micronuclei.
  • the experiments were performed on males and females of Fl hybrid mice (CBAx C57BI6 / J) two months old weighing 18-20 g. Each group consisted of 6 individuals. The animals were kept under a 12-hour light regime under conditions of free access to water and food. Animal experiments to evaluate the mutagenic properties of the protein-polypeptide complex with single and five-fold administration were carried out in accordance with official
  • the therapeutic dose (TD) for a person, including a child can be 0.05 mg / kg / day.
  • TD therapeutic dose
  • the maximum dose of 10 mg / kg possible under the conditions of this experiment was used as subtoxic, since the substance was provided at a concentration of 0.1 mg / ml, and the generally accepted amount of the substance administered to mice was 0.1 ml per 10 g of weight. Accordingly, in terms of humans, the maximum tested dose is 1.7 mg / kg.
  • positive control used cyclophosphamide at a dose of 20 mg / kg
  • Bone marrow cell preparations for micronuclei counting were prepared in the generally accepted manner in accordance with the methodological recommendations.
  • NPP PanE-KO Bone marrow from both femurs was washed with a syringe into a microtube. The suspension was centrifuged at 1000 rpm, for 5 minutes, the supernatant was removed, the precipitate was carefully resuspended. A smear was prepared from a drop of suspension, and it was dried in air. Fixed with methanol for 3 minutes. Stained by the method of Romanovsky-Giemsa. Analyzed on encrypted preparations for 2000 poly-chromatophilic red blood cells from each animal. When counting 500 red blood cells, the ratio of polychromatophilic and normochromic red blood cells was determined. Preparations
  • results of micronuclei counting in polychromatophilic erythrocytes of mouse bone marrow in all experimental variants, the protein-polypeptide pharmaceutical composition did not cause an increase in the frequency of cells with micronuclei in the bone marrow of mice when comparing the experimental and corresponding control series.
  • Cyclophosphamide positive control
  • Cyclophosphamide when administered intraperitoneally to male mice at a dose of 20 mg / kg caused an increase in the frequency of cells with micronuclei by 19.6 times (62.1% versus 3.16% in the control, ⁇ , ⁇ ).
  • the percentage of PCEs from the total number of bone marrow red blood cells was approximately at the same level in the groups of the experimental and control series, which indicates the absence of the toxic effect of the composition in the tested doses on blood formation.
  • the positive control cyclophosphamide
  • a shift in the ratio of polychromatophilic and normochromic red blood cells toward the latter was noted (when compared with the control, P ⁇ 0.005).
  • Protein-polypeptide pharmaceutical composition does not have mutagenic activity in the Ames Salmonella test / microsome and in the test for the induction of micronuclei in mouse bone marrow cells under the conditions of experiments conducted in accordance with the Guidelines for the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances.
  • Example 7 The effect of pharmaceutical composition on the survival of rats under conditions of ischemic brain damage during ligation of both carotid arteries (incomplete global brain ischemia).
  • Silk ligatures (Silk blk 17 x 45 CM / M3 / USP2 / Non needled / Ethicon Johnson & Johnson, cat. -N W203) were placed under the vessels, and together with the assistant, they simultaneously ligated both carotid arteries with a triple surgical unit.
  • the skin incision was sutured with surgical silk (Silk blk 100cM / M5 / Sgle armed KP-3USP2 / Non needled / Ethicon Johnson & Johnson, cat.> ° W794), with one or two surgical skin sutures, followed by 5% wound healing solution of tincture of iodine.
  • Saline or pharmaceutical composition was administered intraperitoneally. The duration of all manipulations is 8-10 minutes, then the animals are placed in a cage.
  • three groups of animals were used:
  • the survival of animals was monitored immediately after the ligation procedure and during the first day, i.e. final survival was recorded after 24 hours.
  • the biological activity of the drug in the form of brain protection in conditions of incomplete global ischemia with simultaneous ligation of the carotid arteries was evaluated as follows:
  • the pharmaceutical composition has a statistically significant increase in animal survival compared to control in conditions of incomplete global brain ischemia caused by simultaneous ligation of both carotid arteries.
  • the claimed pharmaceutical composition has a pronounced neuroprotective and neurometabolic effect, stimulating the physiological and reparative regeneration of nerve tissue in biological activity superior to the reference drug - cerebral lysine.
  • the claimed pharmaceutical composition can be used to create new drugs for treatment for the treatment of diseases of the central and peripheral nervous system of the vascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune genesis.
  • Example 8 The study of the effect of the pharmacological composition on the local cerebral blood flow in the cerebral cortex of anesthetized rats under conditions of global transient ischemia.
  • the state of cerebral blood circulation in animals was evaluated by recording local cerebral blood flow in the cerebral cortex of rats using laser Doppler flowmetry.
  • an ALF-21 flowmeter from Transonic System Inc. was used. (USA).
  • a 0.8 mm diameter flowmeter needle sensor was installed on the parietal region of the rat cerebral cortex using a micromanipulator and rocker arm.
  • changes in blood pressure were recorded through a polyethylene catheter previously inserted into the femoral artery.
  • the recording of blood flow and blood pressure was performed on a polygraph of the company "VURAC" USA and a personal computer.
  • the pharmacological composition was administered at a dose of 0.2 mg / kg (0.5 ml of a 0.1% solution) through a polyethylene catheter into the femoral vein of animals.
  • the global transient ischemia model is widely used to study both cerebral blood flow disorders and changes in various biochemical parameters of brain function that occur after ischemic damage.
  • Global transient ischemia in rats was caused by 10-minute occlusion of both common carotid arteries using special clamps while lowering blood pressure to 40-50 mm RT.
  • Art. by taking arterial blood from a previously inserted polyethylene catheter into the femoral artery. After 10 minutes, the clamps from the carotid arteries are removed, and the previously collected blood was injected back to the animal [3-5].
  • the pharmacological composition administered 30 minutes after reperfusion intravenously at a dose of 0.2 mg / kg (0.5 ml of a 0.1% solution) already 10 minutes after administration, in most experiments caused an increase in local cerebral blood flow in the cerebral cortex of rats 12 ⁇ 3.3% (in 7 out of 10 experiments).
  • a statistically significant increase in local cerebral blood flow began to appear at 50 minutes, which averaged 39 ⁇ 9.2%, and lasted up to 90 minutes of observation (table 2). It should be noted here that in control experiments with the introduction of saline, the level of local cerebral blood flow remains practically unchanged.
  • the pharmacological substance increases the survival of experimental animals under conditions of complete ligation of the carotid arteries.
  • a pharmacological substance increases local cerebral blood flow in the cerebral cortex of rats, decreased after global transient cerebral ischemia, which at the end of the experiment exceeds the control level observed prior to ischemia. It can be assumed that the increase in animal survival during ligation of the carotid arteries under the influence of a pharmacological substance may be due to its ability to increase blood supply to the cerebral cortex of experimental animals.
  • Example 9 Neuroprotective properties of the pharmaceutical composition in glutamate toxicity in vitro.
  • the study of the neuroprotective properties of a pharmaceutical composition from a biologically active protein-polypeptide complex with glutamate toxicity in vitro was performed on 7-day cultures of cerebellum grain cells obtained from the brain of 7-day-old Wistar rats using enzyme-mechanical dissociation.
  • the dissociation of brain tissue was carried out as follows: the injected cerebellum was transferred to a plastic Petri dish filled with phosphate buffer, washed with the same solution several times and ground. Tissue fragments were incubated for 15 minutes. at 37 ° C in a mixture of enzymes prepared on phosphate buffer and containing 0.05% trypsin and 0.02% EDTA.
  • the tissue was washed in two shifts of phosphate buffer and 1 time with the culture medium, then subjected to mechanical dissociation in the culture medium.
  • the nutrient medium contained: 10% fetal calf serum, 2 mm glutamine and 10 mm HEPES buffer, pH 7.2-7.4.
  • the cell suspension was centrifuged for 1 minute at 1000 rpm, the supernatant was drained, and the pellet was resuspended in a nutrient medium where the K + concentration was brought to 25 mM, which has a trophic effect on cerebellum grain cells. Cultivation was performed in 96-well plastic chambers. 0.1 ml of cell suspension was added to each well. Cultures developed in a C0 2 - incubator, at a temperature of 35.5 ° C and a relative humidity of 98%.
  • N 0 average percent neuronal death by damaging effect (in this case - glutamate) in cultures with the addition of H 2
  • N "- the mean percentage of neuronal death in the cultures supplemented with the pharmaceutical composition. This parameter allows you to compare the effectiveness of various substances on different models of ischemia.
  • Grain cells are the most numerous class of brain neurons; they are morphologically and neurochemically homogeneous. By the 7th day of cultivation, maturation of glutamate receptors occurs.
  • Glutamate at a concentration of 25, 37, 50 ⁇ M (15 min) caused a dose-dependent death of cultured rat cerebellum grain cells.
  • the second series was performed according to the same methods and experimental design as the 1st series, only the pharmaceutical composition was taken in 2 concentrations: 0.05 and 0.01 mg / ml, and cerebrolysin in the same concentrations was used as a comparison drug. From the obtained control count data, it is seen that a 3-4-hour stay in a balanced saline solution with the addition of glycine buffer, pharmaceutical composition and cerebrolysin at concentrations of 0.05 and 0.01 mg / ml did not lead to a change in the number of living neurons compared to control.
  • Glutamate at a concentration of 25, 37, 50 ⁇ M (15 min) caused a dose-dependent death of cultured rat cerebellum grain cells.
  • a concentration of glutamate of 25 ⁇ M was used for experiments to determine neuroprotective properties.
  • the observed identical dose-dependent decrease in the number of surviving neurons depending on the concentration of glutamate at 35 and 50 ⁇ M indicated saturation of the receptors.
  • the glycine buffer added in the postglutamate period even slightly (not significantly) increased the toxicity of glutamate.
  • the total protective effect of the pharmaceutical composition according to a series of experiments: It can be seen from the above results of individual experiments that the protective effect of the pharmaceutical composition after the toxic effects of glutamate is stable, reproducing from experience to experience. The drug itself did not have a toxic effect in any experiment.
  • Percentage of neuronal death and protection factors 3 hours after exposure to 25 ⁇ M glutamate, 41.49 + 4% of neurons die, but after glutamate exposure in a balanced saline solution, a pharmaceutical composition in a concentration of 0.5 and 0.1 mg / ml was present, then the percentage of death of cultured cerebellar neurons decreased to 30.88 + 4.3, and 21, 98 + 4.37, respectively.
  • the glycine buffer added in the postglutamate period even slightly (not significantly) increased the toxicity of glutamate.
  • Example 10 The study of the mechanisms of the pharmacological action of the pharmaceutical composition.
  • a study was made of the specific activity of the pharmaceutical composition on the dynamics of concentrations of excitatory and inhibitory neurotransmitters in vitro in the intercellular fluid of 7-day-old cultures of cereal granular neurons under the cytotoxic effect of glutamate. It is known that drugs that affect the release of glutamate (Lubelisil, BW619C89) are effective neuroprotective agents.
  • Methodology 50 ⁇ l of cerebellum grain cell culture medium was collected before and after toxic treatment with glutamate and pharmaceutical composition, glycine-phosphate buffer or physiological saline were added.
  • the resulting media samples were frozen at t-20 ° C, encoded and sent to the laboratory for subsequent measurement of the concentration of neurotransmitters by high performance liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC / ED).
  • An LC-4B electrochemical detector (BAS, USA) was used at an ⁇ potential of +850 mV on a glassy carbon electrode against an Ag / AgCl reference electrode.
  • the mobile phase was 0.05 M sodium phosphate buffer with 0.025 mM ED-TA and 5% acetonitrile.
  • the mobile phase in the composition KN 2 P0 4 anhydrous (“Fluka”) - 0,069 M, citric acid monohydrate (“Fluka”) - 0.27 M, sodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (“Sigma”) - 0.27 mM and sodium octyl sulfonate (ion-pair reagent) (Dia-farm) - 1, 9 mM was prepared as follows - the sample was diluted in 920 ml of deionized water, the pH was adjusted to 3.15 (pH meter pH-340, “ZIP”), then 80 was added ml, that is, 1, 528 M acetonitrile ("Megsk”).
  • the mobile phase was degassed under vacuum with simultaneous treatment in an ultrasonic bath (Earring, Russia) for 40-50 seconds.
  • results the pharmaceutical composition in concentrations of 0.05 mg and 0.1 mg significantly and dose-dependently increased the extracellular release of glutamate, glycine, gamma-aminobutyric acid and taurine and aspartate (see table).
  • the level of neurotransmitter release was 20% higher (p ⁇ 0.05), at a concentration of 0.1 mg, the increase was also significant and amounted to 28%.
  • glutamate toxicity 25 ⁇ M
  • taurine and glycine concentrations rose dose-dependently to the same level as without it
  • the levels of exciting neuromediation - aspartate and glutamate during glutamate toxicity when using the pharmaceutical composition decreased to the control level in the case of aspartate (p ⁇ 0.05) and remained unchanged in the case of glutamate, not significantly different from the control of its effect without glutamate toxicity.
  • the physiological effect of the pharmaceutical composition was manifested by an increase in the extracellular concentration of glycine, glutamate, taurine and GABA.
  • the severity of this effect depended on the concentration of the pharmaceutical composition; it was significantly higher at a concentration of 0.1 mg than 0.05 mg.
  • the pharmacological effect of the pharmaceutical composition is associated with the regulatory effect of the drug on the levels of exciting and inhibitory mediation, which provides the necessary protection of neurons from damage.
  • This amino acid being a donor of SH groups, enhances the action of the glutathione peroxidase system and thereby increases the antioxidant protection of cell membranes of neurons.
  • Glutamate Toxicity Model Used allows us to evaluate the effect of the pharmaceutical composition on the dynamics of not only the extracellular level of neurotransmitters, including the metabolic pool of amino acids, but also the synaptic pool (indirectly).
  • the neuroprotective effect of the pharmaceutical composition is explained by the stabilization of glutamate level with a tendency to decrease not only due to the activation of the inhibitory link of neurotransmission, but also due to a decrease in the spillover of exciting neurotransmitters.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической композиции, предназначенной для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза, выполненной в виде раствора для парентерального, интраназального и субъконьюктивального введения, содержащей в качестве активного инградиента биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,01 - 2,0 мг/мл, обладающий тканеспецифическим репаративным действием на нервную ткань, получаемый из эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой, до середины последней трети беременности, включающий отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений pI от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.

Description

Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и
аутоиммунного генеза
Область техники
Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, фармацевтической промышленности, ветеринарии, и представляет собой фармацевтическую композицию, обладающую репаративно-регенеративным действием на нервную ткань, предназначенную для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза, и состоящую из биологически активного белково-полипептидного комплекса, включающего органоспецифические факторы роста и дифференцировки нервной ткани, а так же сигнальные молекулы в терапевтически эффективных соотношениях и концентрациях, и фармацевтически приемлемый разбавитель.
Фармкомпозиция представляет собой биологически активный белково- полипептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него белково- полипептидных компонентов в пределах от 5 до 200 кДа, с содержанием среднемолекулярной фракции в пределах от 10 до 120 кДа не менее 80%, с общей концентрацией белка 0,8 - 4,2 мг/мл с максимумом поглощения ультрафиолетовый спектр раствора при длине волны 280±5 нм, наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений pi от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель включающий буферный раствор и вспомогательные вещества высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы в достаточных концентрациях. Субстанция получена путем ионообменной хроматографии фильтрата гомогената ткани, в присутствии буферного раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза из мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности.
Предшествующий уровень техники
Известен целый ряд препаратов белково-пептидной природы из сырья животного происхождения, обладающие ноотропной и нейрометаболической активностью, которые используются для лечения заболеваний нервной системы. Наиболее близким по достигаемому эффекту относятся: Церебролизин - средство для лечения геморрагического или ишемического инсультов, фирмы «Ebewe» (Австрия) [1], который является продуктом обработки мозга интактных свиней; Цереброкурин - лечебное средство при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы, фирмы ООО «НИР» (Украина) [2], который является продуктом обработки мозга эмбрионов животных;
ортексин - препарат полипептидной природы, получаемый путем экстракции из коры головного мозга крупного рогатого скота и свиней, фирмы ООО «Герофарм» (Россия) [3], обладающий ноотропным, церебропротекторным, противосудорожным и антиоксидантным действием; Церебролизат - препарат, повышающий устойчивость ткани головного мозга к интоксикации, гипоксии, гипогликемии, механической травме, фирмы «Микроген» НПО ФГУП (Иммунопрепарат) [4], обладающий ноотропным действием, представляющий собой гидролизат коры головного мозга крупного рогатого скота.
В состав "Церебролизина" входят аминокислоты (-85%), низкомолекулярные пептиды (-15%), микроэлементы, сырьем для получения которых служит мозг свиней. Нейропротективное и трофическое действие препарата осуществляется за счет специфических пептидов и аминокислот, молекулярной массы не выше 10000 Дальтон, из которых доминирующими и определяющими свойства препарата являются аланин, лейцин и лизин. Препарат предназначен для внутримышечного, внутривенного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Недостатком известного препарата является значительная продолжительность курса лечения, низкая активность и специфичность препарата в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и крайне низким регенеративным, в том числе и репаративным потенциалом для нервной ткани.
В состав «Цереброкурина» входят водорастворимые пренатальные нейропептиды и продукты расщепления неактивных высокомолекулярных предшественников из гомогенизата мозга эмбрионов животных, который после разбавления физиологическим раствором подвергают взаимодействию с иммобилизованным протеолитическим ферментом, причем режим взаимодействия устанавливают, исходя из контрольной пробы получаемого средства, и полученный раствор выдерживают в течение 30 суток при температуре не выше 10°С. С помощью данной технологии достигается более высокая (по сравнению с Церебролизином) активность получаемого средства и значительно расширяется спектр его действия, за счет более высокой массы содержащихся пептидов и низкомолекулярных белков, оставшихся после протеолиза. Однако, несмотря на длительное формирование раствора до окончания процессов агрегации и протеолиза, данная технология не позволяет получить фракцию необходимой степени очистки для применении препарата внутривенно, что значительно затрудняет его биодоступность. Водная экстракция без буферизации раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза и солюбилизаторов на этапах получения Цереброкурина, а так же неопределенные сроки гестации эмбрионального мозга животных не позволяют обеспечить необходимую степень стандартизации, что допускает значительный разброс по составу полученных эволюционно закрепленных белково-пептидных концентрационных соотношений, снижая его тканеспецифическую нейрорегенеративную активность и стабильность фармакологического действия, ограничиваясь биологическим действием по типу обратной связи за счет сигнальной функции продуктов протеолиза ткани.
В состав «Кортексина» входит комплекс водорастворимых комплекс биологически активных щелочных, кислых и нейтральных полипептидов с мол. м. от 500 до 15000 Да и изоэлектрической точкой 3,5-9,5, получаемых из измельченной замороженной ткани головного мозга скота, путем экстракции раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк, отделения осадка, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывки образовавшегося осадка ацетоном, высушивании с последующей очисткой, стерилизации и лиофилизации целевого продукта.
Препарат предназначен для внутримышечного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных низкомолекулярных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Несмотря на то, что препарат участвует в регуляции соотношений тормозных и возбуждающих аминокислот, концентрации серотонина и дофамина, оказывая ГАМ -позитивное влияние, снижает токсические эффекты нейротропных веществ, улучшает процессы обучения и памяти, ускоряет восстановление функций головного мозга после стрессорных воздействий, Кортексин имеет не высокую активность и специфичность в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и низким регенеративным, в том числе незначительным репаративным потенциалом для нервной ткани, что требует значительной продолжительности курсового лечения.
В состав «Церебролизата» также входят водорастворимые полипептиды, как результат гидролиза коры головного мозга крупного рогатого скота, обладающие слабой ферментативной активностью, с молекулярной массой не более 15000 Да. Обозначенная в патенте вариация аминокислотного состава препарата допускает значительный разброс по составу полученных пептидных концентрационных соотношений, определяя низкую тканеспецифическую активность и стабильность фармакологического действия - со слабым нейрометаболическим и невыраженным ноотропным эффектом.
Неуклонный рост сосудистых заболеваний центральной нервной системы, а так же увеличение количества случаев травматического, токсического и гипоксического поражения головного и спинного мозга (ДТП, техногенные катастрофы, природные катаклизмы...) побуждает фармакологов к поиску новых, более эффективных препаратов для успешного лечения больных неврологического и нейрохирургического профиля, реабилитации этих пациентов и снижения уровня инвалидизации населения. Раскрытие изобретения
Целью данного изобретения явилось создание фармацевтической композиции, обладающей выраженным репаративно-регенеративным действием на нервную ткань, для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза.
Поставленная цель достигается тем, что фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза, выполнена в виде раствора для парентерального, интраназального и субъконьюктивального введения и содержит в качестве активного инградиента биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,01 - 2,0 мг/мл, обладающий тканеспецифическим репаративным действием на нервную ткань, получаемый из эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой, до середины последней трети беременности, включающий отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений pi от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.
При этом, фармацевтическая композиция в качестве разбавителя, предпочтительно, может содержать фармакопейный буферный раствор и вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы.
Итак, поставленная цель достигается описываемой фармкомпозицией, содержащей в качестве активного инградиента биологически активный белково- полипептидный комплекс, состоящий из отрицательно заряженных слабо кислых, нейтральных белков и полипептидов с молекулярной массой от 5 до 200 кДа, полученных из эмбриональной ткани мозга копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности, включающий органоспецифические факторы роста и дифференцировки нервной ткани, а так же сигнальные молекулы в терапевтически эффективных соотношениях и концентрациях, фармацевтически приемлемый разбавитель состоящий из буферного раствора, например фосфатный буфер, и вспомогательных веществ - высокомолекулярные соединения, например кармелоза; стабилизаторы, например маннитол, консерванты, например нипагин, и солюбилизаторы, например полисорбат-80.
Заявляемая фармакологическая композиция, представляющая собой белково- полипептидный комплекс и фармацевтически приемлемый разбавитель, отличается от заявленных ранее субстанций и композиций, выделенных из головного мозга животных, по источнику сырья, взятого на определенных сроках гестации, молекулярным массам входящих в него белково-полипептидных фракций (до 200 кДа), их качественному составу, по эволюционно закрепленным в онтогенезе концентрационным соотношениям белков роста, факторов дифференцировки и сигнальных молекул, по способу применения (парентерально, интратекально, интраназально, субъконбюктивально), по безопасности применения (отсутствие токсических, мутагенных, канцерогенных и аллергизирующих свойств), по биологической и фармакологической активности и ее специфичности (ткане- и органоспецифичная, репаративно-регенеративная).
Лучший вариант осуществления изобретения
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Способ получения биологически активного комплекса. Получение белковой фракции из эмбрионального мозга свиней. 250 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов свиней сроком гестации 14 недель размораживают и гомогенизируют в 1200 мл 0,05 М ТРИС-глициново- фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 1 мМ ЭДТА и 0,1% мальтозы, в течение 7 минут при 8°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 18 000 g и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 8°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами 0,05 М ТРИС-глициново- фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 0,1 мМ ЭДТА и 0,1 мМ NaCl, хроматографическую колонку объемом 200 мл с анионообменным носителем Toyopearl DEAE-650M. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом, повышая концентрацию соли с шагом 10%, собирая целевые фракции. Хроматографический процесс производят при температуре 8°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см через материалы с задерживающей способностью 5 кДа и 200 кДа, обессоливают, разводят 0,05 М раствором глицин- NaOH рН 7,4 до концентрации белка 1,0 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белковой фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют следующими методами: - гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare») и методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 200 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, с молекулярными массами от 5 до 200 кда, причем 82% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кда, характеризующийся наличием пика при длине волны 274 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значении р! 4,2 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакри-ламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.
Аминокислотный анализ (%): Asp - 10,82 ± 2,8; Thr - 5,4 ± 1 ,6; Ser - 5,2 ± 1,8; Glu -16,2 ± 3,4; Pro - 7,045 ± 2,5; Gly - 5,2 ± 2,4; Ala - 5,4 ± 1,8; Val - 7,08 ± 2,9; Met - 2,65 ± 1,4; Не - 4,45 ± 1,8; Leu -9,4 ± 2,6; Туг - 4,02 ± 1 ,2; Phe - 4,8 ± 1,9; Огп- 0,48 ± 0,2; Lys - 8,48 ± 2,4; His - 2,8 ± 0,9; Arg - 6,52 ± 2,2.
Пример 2. Способ получения биологически активного комплекса. Получение белковой фракции из эмбрионального мозга поросят. 200 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов поросят сроком гестации от 20 до 22-х недель размораживают и гомогенизируют в 800 мл 50 мМ Трис- малеатного буферного раствора рН 5,8,содержащего 1 мМ (ЭДТА) и 0,1% маннит, в течение 5 минут при 25°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 30 000 g в течении 30 минут и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 25 °С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, хроматографическую колонку объемом 250 мл с анионообменным носителем DEAE-Сефароза. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,04 М NaCl, повышая концентрацию соли с шагом 0,02 М, начиная сбор целевых фракции с концентрации соли 0,06 М. Хроматографический процесс производят при температуре 2 - 4°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см через материалы с задерживающей способностью 5 кДа и 200 кДа, обессоливают, разводят 50 мМ раствором аспартата-NaOH рН 7,4 до концентрации белка 1,0 мг/мл, добавляя моноолеат полиоксиэтиленсорбита (Твин-80) до общей концентрации 0,01 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белково-полипептидной фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют следующими методами: - гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare») и методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 250 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, с молекулярными массами от 5 до 200 кда, причем 82% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кда, характеризующийся наличием пика при длине волны 284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений pi 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.
Аминокислотный анализ полученного комплекса (%): Asp - 10,82 ± 1 ,3; Thr - 5,4 ± 0,9; Ser - 5,2 ± 1,1 ; Glu -16,2 ± 1,9; Pro - 7,045 ± 1,7; Gly - 5,2 ± 0,8; Ala - 5,4 ± 1,1 ; Val - 7,08 ± 2,3; Met - 2,65 ± 0,6; Не - 4,45 ± 0,8; Leu -9,4 ± 2,5; Туг - 4,02 ± 0,6; Phe - 4,8 ± 1 ,1 ; Огп- 0,48 ± 0,1 ; Lys - 8,48 ± 2,3; His - 2,8 ± 0,7; Arg - 6,52 ± 2,1.
Пример 3. Способ получения фармкомпозиции. Полученный по примеру 1. раствор биологически-активного комплекса из эмбрионального мозга свиней разбавляют 50 мМ глициново-фосфатным
буферным раствором, с общим содержащим, 0,5% маннитола, 0,1% кармелозы, 0,0005% полисорбата 80 и двузамещенного фосфорнокислого натрия до рН 8,0, с расчетом конечной концентрации общего белка в полученном растворе в пределах 0,9 - 1,2 мг/мл. То есть композиция может содержать биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,9 мг/мл, 1 мг/мл, 1 ,2 мг/мл. Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.
Свойства полученной фармкомпозиции были изучены с помощью общепринятых методик по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ [5].
Пример 4. Способ получения фармкомпозиции.
Полученный по примеру 2. раствор биологически-активного комплекса из эмбрионального мозга свиней разбавляют 50 мМ малеатным буферным раствором рН 5,8, с общим содержащим 0,3% молочной кислоты, 0,5% маннита, 0,1% кармелозы, до 0,0005% полисорбата 80 с расчетом конечной концентрации общего белка в полученном растворе в пределах 0,9 - 1,2 мг/мл, т.е.
фармкомпозиция может содержать биологически активный белково- полипептидный комплекс в концентрации 0,9 мг/мл, 1 мг/мл, 1 ,2 мг/мл.
Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.
Пример 5. Исследование токсичности
Проведены исследования токсичности в остром и субхроническом эксперименте оригинальной фармкомпозиции. Лекарственная форма: стерильный интраназальный дозированный спрей в стеклянном или полимерном флаконе емкостью 10 и 30 мл (0,1 мг/мл); раствор для инъекций: 5 ампул по 1 мл (0,1 мг/мл), 5 ампул по 2 мл (0,1 мг/мл), 1 ампула по 2 мл (0,2 мг/мл). Максимальная рекомендуемая суточная доза 0,4мг при эндолюмбальном введении и 0,1 мг при внутривенном введении.
Условия проведения эксперимента и методы исследований
Целью исследования явилось определение переносимых, токсических и летальных доз оригинальной фармкомпозиции. Исследование проводили на мышах обоего пола линии BALB/C массой 18-20г при внутрижелудочном и внутрибрюшинном способах введения. Срок наблюдения составил 14 дней. Животные получены из питомника, паспортизированы. Животных содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 10 особей, количество в группе - 10. Для кормления использовали комбинированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20° С. Максимально возможная для введения мышам доза готовой лекарственной формы 0,2 мл и составила 10 мг/кг, что превысило суточную терапевтическую дозу в 600 раз. Из эксперимента животных выводили эфирным наркозом, подвергали вскрытию и анализу состояния внутренних органов.
Результаты исследования острой токсичности.
Мыши. Масса животных составила от 18 до 20 г. Вводимая доза 0,2мл, что составило 10 мг/кг. Количество животных в группе 10 голов. Всего две группы: внутрижелудочное и внутрибрюшинное введение. Срок наблюдения 14 суток.
Внешний вид. К концу эксперимента все животные выглядели здоровыми.
Шерстяной покров густой, белого цвета. По внешнему виду животные между группами не отличались.
Поведение. Не отличалось между группами и от нормы.
Смертность. Во всех трех группах летальных исходов зафиксировано не было. Масса животных. В течение всего срока наблюдения произведено шесть контрольных взвешиваний. Резкой потери или увеличения не выявлено.
Внутренние органы. По состоянию внутренних органов группы не отличались между собой. Изменения или увеличения внутренних органов не наблюдалось.
Исследование подострой (субхронической) токсичности Условия проведения эксперимента и методы исследований
Исследования токсичности оригинальной фармкомпозиции в субхроническом эксперименте проводили на самцах и самках крыс линии Вистар массой от 200 до 250г. Животные получены из питомника. Крыс содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 5 особей. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20° С. До начала эксперимента животных выдерживали в карантине в течение 10 дней. В группе 10 животных (5 самцов и 5 самок). Группы разделены следующим образом: 1 группа (контроль) интактные животные
2 группа- оригинальная фармкомпозиция т.д. подкожное введение (п/к)
3 группа - оригинальная фармкомпозиция х 10 п/к
4 группа - оригинальная фармкомпозиция внутривенное введение (в/в) т.д.;
5 группа - оригинальная фармкомпозиция в/в х10.
Срок наблюдения: 1 месяц введения, 1 месяц наблюдение резорбтивного действия.
Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения:
по выживаемости и общему виду: (шерстяной покров, глаза, уши, конечности, зубы);
состоянию и поведению животных (активность, походка, темперамент, питание); изменению массы тела (взвешивание крыс проводили до начала и в конце эксперимента);
физиологическим функциям (дыхание, слюноотделение, мочеиспускание, экскрет).
Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали кровь:
морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина); биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатинина, глюкозы), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Забор крови для гематологических исследований производили из хвостовой вены. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901, «Labsystems» Финляндия. После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза для патоморфологических исследований органов и тканей. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме. Для патоморфологических исследований образцы ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия). Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными данными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.
Результаты исследования. Макроскопические исследования
Выживаемость: Все подопытные животные перенесли все способы введения. Гибели не наблюдалось ни в экспериментальных, ни в контрольных группах животных.
Поведение: Каких-либо существенных отклонений в поведении (повышенной или пониженной активности) и состоянии подопытных животных по сравнению с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью.
Внешний вид: все животные были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали. Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких- либо патологических признаков не отмечено. Ушные раковины розового цвета без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.
Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы.
Клинические исследования: Динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная. Достоверных различий между опытными и контрольными животными нет.
Гематологические показатели: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.
Биохимические исследования: пептидный комплекс в испытуемой дозе не влиял на уровень содержания общего белка сыворотки крови подопытных животных, что свидетельствует об отсутствии повреждающего действия изучаемого препарата на белок-образующую функцию печени. Для выявления возможного повреждающего воздействия на печень в сыворотке крови животных во время хронического эксперимента определяли активность щелочной фосфатазы, аспартат и аланинаминотрансферазы.
Анализ полученных данных показал отсутствие достоверных изменений активности указанных ферментов сыворотки крови.
Патоморфологические данные: Макроскопическое исследование.
У животных во всех группах при вскрытии кожа чистая, подкожно-жировой слой развит умеренно. Расположение внутренних органов правильное, свободной жидкости ни в плевральной и ни в брюшной полостях нет. Просвет трахеи и бронхов свободен, слизистая их чистая, влажная блестящая. Ткань легких опытных групп более интенсивно окрашена, чем у животных интактного контроля, однако без признаков отека.
Миокард на разрезе без патологических изменений.
Язык чистый. Слизистая полости рта и пищевода без дефектов. Желудок и кишечник без следов раздражения. Печень не увеличена.
Капсула почек отделяется легко, мозговое и корковое вещество на разрезе хорошо различимы.
Селезенка с гладкой капсулой, на разрезе серовато-бурого цвета, пульпа без соскоба.
Семенники и яичники без особенностей.
Тимус сероватого цвета, без кровоизлияний.
Щитовидная железа плотная с симметричными долями.
Оболочки головного мозга умеренного кровенаполнения, влажные, блестящие. Мозговое вещество имеет симметричный рисунок на разрезе.
Весовые индексы органов испытуемых животных не имели достоверных отличий от контрольных групп.
Микроскопическое исследование: Во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла - патоморфологических изменений не выявлено.
Исследование субхронической токсичности при интраназальном введении.
На половозрелых животных.
Исследования проводили на половозрелых кроликах самках породы Шиншилла весом 2500г. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20° С. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 1 раз в день; 2 группа - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 2 раз в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 1 месяц.
Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям слизистых оболочек носа.
Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1,5-2,0 мл.
Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901, «Labsystems» Финляндия.
После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме.
Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы «Sartorius» (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.
Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм.
Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Ορίοη» (Германия).
Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.
Результаты исследования
/. Визуальные наблюдения:
Выживаемость: Все подопытные животные перенесли введение фармкомпозиции в исследуемых дозах. Гибели не наблюдалось.
Поведение: повышенной или пониженной активности у подопытных животных сравнительно с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус у подопытных животных и контрольных не отличался повышенной возбудимостью.
Замечено, что введение препарата не вызывает у животных чувство дискомфорта.
Внешний вид: все животные независимо от применяемой дозы были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали. Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков не отмечено.
Ушные раковины розового цвета без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.
Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы; экскрет по цвету и оформленное™ не отличался от контроля. 2. Клинические исследования:
Динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная, и достоверно не отличалась от интактного контроля.
Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.
Биохимические исследования: глюкоза крови, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах нормы. Концентрация белка у кроликов, получавших фармкомпозицию 1 и 2 раза в день статистически не различалась.
3. Патоморфологические данные:
Во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла - патоморфологических изменений не выявлено.
Таким образом, проведены исследования субхронической токсичности назальной формы фармкомпозиции. При субхроническом исследовании спрея не было выявлено значимых изменений внутренних органов испытуемых животных, не обнаружено местнораздражающего действия. При изучении субхронической токсичности использовали клинические методы исследования, общепринятые методы исследования гематологических, биохимических показателей крови, а также гистологических исследований внутренних органов и слизистых носа. Исследование субхронической токсичности на неполовозрелых кроликах при интраназальном введении на неполовозрелых животных.
Исследования проводили на 3 недельных крольчатах породы Шиншилла весом от 300 до 500г. Нанесение препарата производили ежедневно 1 и 2 раза в день по 1 впрыску в течение 2 недель. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20° С. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 1 раз в день; 2 группа - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 2 раз в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 2 недели.
Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям слизистых оболочек носа.
Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1,5-2,0 мл. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901 , «Labsystems» Финляндия.
После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме.
Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы «Sartorius» (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.
Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Ορΐοη» (Германия).
Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.
Результаты исследования
Оценка раздражающего действия на слизистую оболочку носа.
Прижизненные биомикроскопические исследования
На протяжении всего срока наблюдения у животных сохранялось нормальное поведение, выделений из носовых ходов и образования корок не замечено. При использовании капель у кроликов возникал рефлекс чихания, который прекращался через 1-2 минуты. При закапывании капель как в терапевтической группе, так и в группе превышенной дозы у крольчат отмечалось механическое раздражающее действие, выразившееся в рефлексе чихания, подергивания носом, животные терли лапами нос.
Контрольная интактная группа. Слизистая оболочка бледно-розового цвета, без отеков и выделений. Во время наблюдение с отоларингологическим зеркалом изъянов на эпителии не обнаруживались. Слизистое отделяемое носа прозрачного водянистого вида. Рефлексы соответствовали физиологической норме.
При конфокальной микроскопии: эпителиальный слой имеет плотно упакованную структуру, четко дифференцированных клеток. Клетки связаны щелевыми контактами.
В группе терапевтической дозы слизистые носа оставались чистыми на протяжении всего срока наблюдения: слабо-розового цвета без выделений, отеков не наблюдалось. Сосуды слизистой оболочки не изменены. Состояние эпителия исследовали на щелевом освещение. Ни в одном случае патологических изменений не выявлено.
В группе х10. Ни в одном случае патологических изменений слизистой не выявлено.
Клинические и биохимические исследования
Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы. Показатели, полученные в опытных группах, достоверно не отличались от контрольных групп интактных животных и препарата сравнения.
Биохимические исследования: глюкоза крови, активность аланиновой и
аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах номы.
Заключение. Проведены исследования токсичности в субхроническом
эксперименте на неполовозрелых животных оригинальной фармкомпозиции.
Введение препарата интраназально как в терапевтической дозе, так и в десяти кратно превышающих в течение 2 недель не вызывало изменений внутренних органов, не оказывало токсического действия на систему крови. Не оказывал местнораздражающего действия.
Пример 6. Мутагенность фармкомпозиции.
Для оценки мутагенных свойств заявляемого белково-полипептидной фармкомпозиции применили набор следующих тестов: - учет генных мутаций в тесте Эймса Salmonella /микросомы с использованием в качестве тест-объектов штаммов Salmonella typhimurium
ТА 97, ТА 98 и ТА 100; - учет микроядер в клетках костного мозга мышей.
Испытан образец белково-полипептидной фармкомпозиции, представляющий собой прозрачную жидкость, стерильно упакованную во флакон темного стекла в количестве 20 мл, содержащую субстанцию в концентрации 0,1 мг/мл.
Оценка мутагенных свойств белково-полипептидной фармкомпозиции в тесте Эймса.
Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест- системой для учета генных мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма. Мутагены, индуцирующие замены пар оснований - агенты, вы- зывающие мутации замены пар оснований в молекуле ДНК. Мутагены, индуцирующие мутации сдвига считывания генетического кода (фреймшифт мутации), - агенты, вызывающие добавление или нехватку одиночных или множественных пар оснований в молекуле ДНК. Данный метод предназначен для выявления способности фарма- кологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium. Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации (СМ+) или без метаболической активации (СМ-). После инкубации в течение определенного периода времени под-считывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертантов в вариан- тах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, об- работанные растворителем). Если тестируемое соединение и (или) его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium.
Для тестирования использовали набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium, позволяющий регистрировать мутации типа сдвига рамки
считывания генетического кода (ТА 98 и ТА 97) и замены пар оснований (ТА 100). Штаммы получены из Всероссийской Коллекции Промышленных
Микроорганизмов ФГУП ГосН И И Генетика.
Регламент работы с бактериальными культурами, проверка генотипов штаммов, правила их музейного хранения, необходимые для проведения экспериментов оборудование, посуда, реактивы и питательные среды и растворы, проведение работ по получению гомогената печени крыс и составление активирующей смеси, а также методы статистического анализа полученных результатов
соответствовали стандартным, подробно описанным в соответствующей литературе.
Для метаболической активации использовали фракцию S9 печени самцов крыс Wistar, которым за 5 дней до забоя вводили индуктор микросомальных ферментов - совол (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно). Для контроля активности системы метаболической активации использовали бромид этидия (10 мкг/чашку) на штамме ТА 98 при СМ+.
Белково-полипептидная фармкомпозиция в виде стерильного раствора с содержанием белка 0,1 мг/мл исследовали 1,0 и 0,3 мл исходного раствора на чашку и три 10-кратных разведения в физиологическом растворе (по 0,1 мл/ч). Тестируемые дозы субстанции составили 300; 100; 10; 1 и 0,1 мкг на чашку.
Эксперимент сопровождали положительными контролями, в качестве которых использовали вещества, индуцирующие мутации у соответствующих штаммов-тестеров при наличии или отсутствии условий активации. Для вариантов без активации использовали азид натрия в количестве 10 мкг на чашку для штамма ТА 100 при СМ-; 2,7-диамино-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10- тетрагидро-4,9-диазопирен (ДИАМ) - 10 мкг на чашку для штамма ТА 98 при СМ- ; 9-аминоакридин (9 А А) - 50 мкг/чашку для штамма ТА 97 при СМ-. Для контроля активности системы метаболической активации использовали этидиум бромид - 10 мкг на чашку на штамме ТА 98 при СМ+. В качестве негативного контроля использовали физиологический раствор (0,1 мл на чашку).
Селективный полуобогащенный агар (0,7%) в пробирках плавили в водяной бане при 100° С и помещали в термостатируемую водяную баню с температурой 45-46° С.
Сначала в пробирки с агаром вносили 0,1 мл образца в необходимых разведениях, затем - 0,1 мл суспензии бактерий и 0,5 мл микросо-мальной активирующей смеси (для варианта с метаболической активацией). Затем содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара в чашки Петри. Продолжительность времени внесения микросомальной активирующей смеси и розлива полужидкого агара на чашку не превышала 10-15 секунд. Чашки ос- тавляли при комнатной температуре на 30-40 минут и после полного застывания агара переносили в термостат при 37°С. Учет результатов проводили через 48 часов инкубации.
Параллельно в опыт включали варианты без системы метаболической активации (СМ-) и в присутствии системы метаболической активации (СМ+). В варианте СМ- может быть зарегистрировано действие прямых мутагенов, то есть
препаратов, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие же промутагенов, то есть соединений, эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, может быть учтено при сравнении результатов, полученных при анализе данных испытаний вещества в вариантах СМ- и СМ+. В каждом контрольном и опытном вариантах использовали по 2 чашки. Мутагенный эффект считали значимым, если среднее количество колоний ревертантов на чашку в опытном варианте превышало таковое в контрольном варианте в 2 и более раз. Результаты эксперимента учитывали при наличии стандартного ответа во всех вариантах позитивного и негативного контроля. Количество колоний ревертантов в контроле с
растворителем в вариантах СМ- и СМ+ было в пределах колебаний спонтанного уровня для данных штаммов. Ответ штаммов на стандартные мутагены был в пределах обычных уровней.
Исследованный белково-полипептидная фармкомпозиция во всех
тестируемых концентрациях не показал мутагенного эффекта на штаммах ТА 100, ТА 98 и ТА 97 в вариантах без- и в присутствии системы метаболической активации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: белково-полипептидная фармкомпозиция не обладает
способностью индуцировать генные мутации на тестерных штаммах Salmonella typhimurium во всем диапазоне испытанных концентраций.
Оценка мутагенных свойств белково-полипептидной композиции микроядерным методом в клетках млекопитающих. Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать
структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и
зародышевых клетках.
Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из
ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии анна-телофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в
цитоплазме.
Цель исследования - выявление и количественная оценка
цитогенетической (мутагенной) активности фармакологических средств в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами. Эксперименты проводили на самцах и самках мышей -гибридов Fl(CBAx C57BI6/J) двухмесячного возраста массой 18-20 г. В состав каждой группы входило по 6 особей. Животных содержали при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Эксперименты на животных по оценке мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса при однократном и пятикратном введении осуществляли в соответствии с официальными
протоколами. Проведено 3 серии экспериментов с соответствующими
контролями: терапевтическая доза испытана на самцах при однократном введении; субтоксическая доза испытана на самцах при однократном введении; терапевтическая доза испытана на самцах и самках при пятикратном введении. Учитывая, что возможным предполагаемым способом применения белково- полипептидной фармкомпозиции в клинике - внутривенный или эндолюмбальный, в данном исследовании использовали внутрибрюшинное введение субстанции мышам. Дозу белково-полипептидного комплекса для оценки мутагенной активности рассчитывали, исходя из наибольшей рекомендованной суточной терапевтической дозы (ТД) для человека. Рекомендовано внутривенное введение белково-полипептидной фармкомпозиции в количестве 2 мл при концентрации 0,1 мг/мл. При этом терапевтическая доза (ТД) для человека, в том числе для ребенка может составить 0,05 мг/кг/сутки. Для расчета дозы в экспериментах на мышах рекомендуется использовать коэффициент пересчета, учитывающий соотношение площади поверхности тела и массы тела человека и мыши. В нашем исследовании он составил 8,33. Поэтому в качестве ТД для мышей использовали дозу, приблизительно равную 8,33 ТД для человека (0,42 мг/кг).
В качестве субтоксической использовали максимально возможную в условиях данного эксперимента дозу 10 мг/кг, поскольку вещество было предоставлено в концентрации 0,1 мг/мл, а общепринятое количество вещества, вводимое мышам, составляет 0,1 мл на 10 г веса. Соответственно в пересчете для человека максимальная испытанная доза составляет 1 ,7 мг/кг.
Было сформировано 7 групп животных: четыре опытных и три соответствующих контрольных. Субстанцию в дозе 0,1 мг/кг вводили пятикратно с интервалом 24 часа самцам и самкам. Забой во всех группах проводили через 6 часов после последнего введения белково-полипептидного комплекса. В двух других опытных группах белково-полипептидный комплекс вводили однократно самцам в дозах 0,2 мг/кг и 0,5 мг/кг.
В качестве негативного контроля использовали растворитель - физраствор. Его вводили внутрибрюшинно самцам и самкам двух контрольных групп в те же сроки и в тех же объемах, что и животным опытных серий. В качестве
позитивного контроля использовали циклофосфамид в дозе 20 мг/кг,
растворенный ex tempore в физрастворе при однократном внутрибрюшинном введении за 24 часа до забоя.
Препараты клеток костного мозга для учета микроядер готовили общепринятым способом в соответствии с методическими рекомендациями
«Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом». Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации через 6 часов после последнего введения препарата. Выделяли обе бедренные кости и очищали их от мышц. Для
вымывания костного мозга использовали эмбриональную телячью сыворотку
(НПП ПанЭ-КО). Костный мозг из обеих бедренных костей вымывали шприцем в микропробирку. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин, в течение 5 минут, супернатант удаляли, осадок осторожно ресуспенди-ровали. Из капли суспензии готовили мазок, высушивали его на воздухе. Фиксировали метанолом 3 минуты. Окрашивали по методу Рома-новского-Гимза. Анализировали на зашифрованных препаратах по 2000 поли-хроматофильных эритроцитов от каждого животного. При подсчете 500 эритроцитов определяли соотношение полихроматофильных и нормохромных эритроцитов. Препараты
расшифровывали по окончании анализа.
Критерием позитивного результата является воспроизводимое и
статистически значимое увеличение числа полихроматофильных
эритроцитов с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по сравнению с контрольной. Полученный положительный результат
свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.
Статистическую обработку результатов по учету микроядер проводили путем сравнения опытных серий с контрольными по критерию Х2; межгрупповое сравнение доли полихроматофильных эритроцитов проводили с помощью критерия Манна-Уитни.
Результаты учета микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей: во всех вариантах опыта белково-полипептидная фармкомпозиция не вызывала увеличения частоты клеток с микроядрами в костном мозге мышей при сравнении опытных и соответствующих контрольных серий. Циклофосфамид (позитивный контроль) при внутри-брюшинном введении самцам мышей в дозе 20 мг/кг вызывал повышение частоты клеток с микроядрами в 19,6 раза (62,1 %о против 3,16%о в контроле, ΡΟ,ΟΟΙ). Доля ПХЭ от общего числа эритроцитов костного мозга была приблизительно на одном уровне в группах опытных и контрольных серий, что свидетельствует об отсутствии токсического действия композиции в испытанных дозах на кроветворение. При действии позитивного контроля (циклофосфамида) отмечен сдвиг соотношения полихроматофильных и нормохромных эритроцитов в сторону последних (при сравнении с контролем Р<0,005).
Таким образом, мутагенная активность белково-полипептидной
фармкомпозиции не выявлена в тесте на индукцию микроядер в полихрома- тофильных эритроцитах костного мозга мышей при условии однократного и пятикратного введения самцам и самкам внутрибрюшинно в дозе 0,42 мг/кг массы тела, что в пересчете соответствует суточной терапевтической дозе для человека. Мутагенная активность не выявлена также в условиях однократного введения белково-полипептидной фармкомпозиции самцам в максимально возможной дозе - 10 мг/кг. Белково-полипептидный комплекс не проявил токсического действия по показателю «доля полихроматофильных эритроцитов». Заключение по оценки мутагенных свойств белково-полипептидной фармкомпозиции.
Белково-полипептидная фармкомпозиция не обладает мутагенной активностью в тесте Эймса Salmonella /микросомы и в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга мышей в условиях экспериментов, проведенных в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Пример 7. Влияние фармкомпозиции на выживаемость крыс в условиях ишемического поражения мозга при перевязке обеих сонных артерий (неполная глобальная ишемия мозга).
Исследование проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 180-250 г в условиях необратимой двусторонней окклюзии общих сонных артерий [3-5]. Полученных из питомника лабораторных животных подвергали карантину в течение 5 дней. Все ветеринарные манипуляции проводились в асептических условиях, позволяющие сохранить статус экспериментальных животных. Для содержания экспериментальных животных использовали стандартные условия [6]. У крыс под эфирным наркозом (эфир диэтиловый х/ч, ОАО «Медхимпром») в области шеи по средней линии делали небольшой разрез кожи длиной 8- 10мм, для обеспечения доступа к сонным артериям. Выделяли обе сонные артерии, отделяя блуждающий и симпатический нервы, проходящие вместе с артериями. Под сосуды подводили шелковые лигатуры (Silk blk 17 х 45 CM/M3/USP2/ Non needled/ «Ethicon Johnson & Johnson», кат.-N W203) и вместе с ассистентом производили одномоментную перевязку обеих сонных артерий тройным хирургическим узлом. Кожный разрез зашивали хирургическим шелком (Silk blk 100cM/M5/Sgle armed KP-3USP2/ Non needled/ «Ethicon Johnson & Johnson», кат.>Г° W794), накладывая один или два хирургических кожных шва, с последующей обработкой раны 5% раствором настойки йода. Физиологический раствор или фармкомпозицию вводили внутрибрюшинно. Продолжительность всех манипуляций составляет 8-10 минут, затем животных помещают в клетку. Для исследования использовали три группы животных:
- группа 1 - контрольные животные после перевязки сонных артерий, получавшие физиологический раствор стерильным одноразовым инсулиновым шприцем 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов после перевязки сонных артерий;
- группа 2 - ложнооперированные животные, у которых проводились те же манипуляции, что и у контрольных, только без перевязки сонных артерий, которым вводили физиологический раствор 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов; - группа 3 - животные после перевязки сонных артерий, которым вводили фармкомпозицию в дозе 0,5 мл 0,1% раствора (0,2мг/кг) на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов.
Выживаемость животных отслеживали сразу после проведения процедуры перевязки и в течение первых суток, т.е. конечную выживаемость фиксировали через 24 часа. Биологическая активность препарата в виде защиты головного мозга в условиях неполной глобальной ишемии при одномоментной перевязке сонных артерий оценивалась следующим образом:
- выраженная - при выживании более 80% крыс
- средневыраженная - при выживании 70-80% крыс
- невыраженная - при выживании менее 70% крыс
Статистическую обработку данных проводили с использованием точного критерия Фишера с учетом множественности сравнений.
Проведенные опыты показали, что в контрольных опытах после перевязки обеих сонных артерий в первый час погибает наибольшее количество животных, т.е. 1 1 из 24, а через сутки еще 4 животных, всего погибло 15 крыс из 24 (63%, табл.1). Среди ложнооперированных животных погибло 2 крысы сразу после операции (17%). Фармкомпозиция при введении крысам через 1 час и 5 часов по 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1%) раствора) внутрибрюшинно вызывала гибель только двух животных, а 34 из 36 крыс выжило. Увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем составляет 95%. Полученные данные представлены в таблице 1.
Таблица 1. Влияние фармкомпозиции на выживаемость крыс в условиях перевязки обеих сонных артерий.
Выраженная
Группы
биоактивность
животных
выжившие умершие
1 группа 9 из 24 15 из 24
Контроль-24 крысы (37%) 63%
2 группа
10 из 12* 2 из 12
Ложно оперированные
(83%) (17)%
12 крыс 3 группа 34 из 36* 2 из 36
Фармкомпозиция 0,2 мг/кг (95%) (5%)
36 крыс
*-Р<0,01 по сравнению с контролем.
Таким образом фармкомпозиция оказывает статистически значимое увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем в условиях неполной глобальной ишемии мозга, вызываемой одномоментной перевязки обеих сонных артерий.
В результате проведенных исследований установлено, что заявленная фармкомпозиция обладает выраженным нейропротекторным и нейрометаболическим действием, стимулирующим физиологическую и репаративную регенерацию нервной ткани превосходит по биологической активности препарат сравнения - церебро лизин.
Заявленная фармкомпозиция может найти применение при создании новых лекарственных препаратов для лечения для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза.
Пример 8. Изучение влияния фармакологической композиции на локальный мозговой кровоток в коре головного мозга наркотизированных крыс в условиях глобальной преходящей ишемии.
Опыты проводили на наркотизированных крысах-самцах линии Вистар массой 220-25 Ог при естественном дыхании. Крыс наркотизировали уретаном (фирма Sigma Aldrich Chemie GmbH, Germany) в дозе 1400 мг/кг внутрибрюшинно .
Методика. Состояние мозгового кровообращения у животных оценивали по регистрации локального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс с помощью метода лазерной Допплеровской флоуметрии. Для регистрации локального мозгового кровотока в теменной области коры головного мозга крыс использовали флоуметр ALF-21 фирмы "Transonic System Inc." (США). Для этой цели игольчатый датчик флоуметра диаметром 0,8мм устанавливали на теменной области коры большого мозга крысы с помощью микроманипулятора и коромысла. Одновременно регистрировали изменения артериального давления через предварительно введенный в бедренную артерию полиэтиленовый катетер. Запись показателей кровотока и артериального давления производили на полиграфе фирмы «ВЮРАК» США и персональном компьютере. Фармакологическую композицию вводили в дозе 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) через полиэтиленовый катетер в бедренную вену животных.
Модель глобальной преходящей ишемии широко используется для изучения, как нарушений мозгового кровотока, так и изменений различных биохимических показателей функции мозга, происходящих после ишемического поражения. Глобальную преходящую ишемию у крыс вызывали 10-минутной окклюзией обеих общих сонных артерий с помощью специальных зажимов с одновременным снижением артериального давления до 40-50 мм рт. ст. путем забора артериальной крови из предварительно вставленного полиэтиленового катетера в бедренную артерию. Через 10 минут зажимы с сонных артерий снимают, а забранную ранее кровь вводили обратно животному [3-5].
Результаты исследования обрабатывали методом вариационной статистики с помощью дисперсионного анализа для повторных измерений и критерия множественных сравнений по Даннету с использованием программы Biostat.
Результаты исследования
Проведенные опыты показали, что в результате глобальной преходящей ишемии в коре головного мозга крыс наблюдается резкое снижение локального мозгового кровотока, которое в среднем составляет 6,1±1 ,0 усл.ед или 82±2,2% от исходного уровня. После снятия зажимов с сонных артерий и последующей реинфузии крови наблюдается резкое увеличение локального кровотока, которое постепенно снижается и через 30 минут после реперфузии составляет в среднем 25±2,8 усл.ед или 23±2,4% от исходного уровня (р<0,05).
Фармакологическая композиция, введенная через 30 минут после реперфузии внутривенно в дозе 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) уже через 10 минут после введения в большинстве опытов вызывал увеличение локального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс в среднем на 12 ±3,3% (в 7 из 10 опытов). Статистически значимое увеличение локального мозгового кровотока начинало проявляться на 50 минуте, которое составляло в среднем 39±9,2%, и продолжалось до 90 минуты наблюдения (табл.2). Здесь следует отметить, что в контрольных опытах с введением физиологического раствора уровень локального мозгового кровотока практически не изменяется.
Параллельно изменениям мозгового кровотока проводили регистрацию артериального давления. Опыты показали, что через 10 минут после введения фармакологической субстанции крысам наблюдалось постепенное снижение уровня артериального давления, которое через 50 минут снижалось в среднем на 15±3,4% и оставалось пониженным до конца эксперимента (табл.).
Следует отметить, что в контрольных опытах с введением физиологического раствора также наблюдается небольшое снижение уровня артериального давления в среднем на 18%, поэтому можно сказать, что фармакологическая субстанция не оказывает существенного влияния на уровень артериального давления.
Заключение
Таким образом, в результате проведенного исследования показано, что фармакологическая субстанция увеличивает выживаемость экспериментальных животных в условиях полной перевязки сонных артерий. Вместе с тем, фармакологическая субстанция увеличивает локальный мозговой кровоток в коре головного мозга крыс, сниженный после глобальной преходящей ишемии головного мозга, который к концу эксперимента по величине превосходит контрольный уровень, наблюдаемый до ишемии. Можно полагать, что повышение выживаемости животных при перевязке сонных артерий под влиянием фармакологической субстанции может быть обусловлено его способностью усиливать кровоснабжение коры головного мозга экспериментальных животных.
Пример 9. Нейропротекторные свойства фармкомпозиции при глутаматной токсичности in vitro.
Исследование нейропротекторных свойств фармкомпозиции из биологически активного белково-полипептидного комплекса при глутаматной токсичности ш vitro выполнено на 7-дневных культурах клеток-зерен мозжечка, полученных из мозга 7-суточных крыс линии Вистар методом ферментно-механической диссоциации. Диссоциацию ткани мозга проводили следующим образом: вьщеленные мозжечки переносили в пластиковую чашку Петри, заполненную фосфатным буфером, промывали этим же раствором несколько раз и измельчали. Фрагменты ткани инкубировали 15 мин. при 37° С в смеси ферментов, приготовленной на фосфатном буфере и содержащей 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. После инкубации ткань промывали в двух сменах фосфатного буфера и 1 раз средой культивирования, далее подвергали механической диссоциации в среде культивирования. Питательная среда содержала: 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 10 мМ буфера HEPES, рН 7,2-7,4. Суспензию клеток центрифугировали 1 минуту при 1000 об/мин, супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в питательной среде, где концентрация К+ была доведена до 25 мМ, что оказывает трофическое действие на клетки-зерна мозжечка. Культивирование производили в 96-луночных пластиковых камерах. В каждую ячейку добавляли 0,1 мл суспензии клеток. Культуры развивались в С02 - инкубаторе, при температуре 35,5° С и относительной влажности 98%.
К 7 дню культивирования, при созревании глутаматных рецепторов, проводили токсическую обработку глутаматом (25, 37, 50 мкМ, 15 мин) в сбалансированном солевом растворе следующего состава (в мМ): 154 NaCl, 25 КС1, 2,3 СаС12, 1 MgCl2 3,6 NaHC03, 0,35 Na2HP04, 10 HEPES (рН 7,6), в течение 15 минут, затем промывали дважды в третью смену раствора вносили фармкомпозицию (0,05 и 0,1 мг/мл), в качестве контроля в том же объеме - Н20, глициновый буфер и бычий сывороточный альбумин (0,15 мг/мл), оставляли на 4 часа в С02-инкубаторе для развития нейро дегенерации. Затем фиксировали 20 минут смесью формалин-спирт-уксуснной кислоты (ФУ С) в пропорции 2:7: 1, окрашивали трипановым синим и заливали глицерином, съемку проводили цифровой камерой.
Оценку жизнеспособности нейронов проводили с помощью подсчета нейронов с нормальной морфологией на фиксированных препаратах, окрашенных трипановым синими заключенных в глицерин. На каждую точку было использовано по 3 сестринских культуры, клетки считали в 5 полях зрения с культуры при объективе х40. Выживаемость вычисляли как процент от контроля. Защитный эффект нагляднее видно, если вычислить коэффициент эффективности защиты (КЭЗ) по формуле:
K33=(N0-NB)/N0x 100%,
Где N0- средний процент гибели нейронов от повреждающего воздействия (в данном случае - глутамата) в культурах с добавлением Н20, N„ - средний процент гибели нейронов в культурах с добавлением фармкомпозиции. Этот параметр позволяет сравнивать эффективность действия различных веществ на разных моделях ишемии.
Результаты исследования
1 серия. Диссоциированные культуры мозжечка состоят из нейронов и
глиальных. Нейрональная популяция представлена клетками-зернами, поскольку остальные типы нейронов мозжечка более крупные и к моменту диссоциации уже дифференцированы, следовательно, не переживают эту процедуру. Клетки-зерна - самый многочисленный класс нейронов головного мозга, они морфологически и нейрохимически однородны. К 7 дню культивирования происходит созревание глутаматных рецепторов.
3-4-часовое пребывание в сбалансированном солевом растворе с добавлением глицинового буфера (GB) и бычьего сывороточного альбумина (BSA), а также 0,05 и 0,1 мг/мл фармкомпозици не приводило к изменению количества живых нейронов по сравнению с контролем.
Глутамат в концентрации 25, 37, 50 мкМ (15 мин) вызывал дозозависимую гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс.
Для выявления защитных эффектов различных веществ необходимо, чтобы глутаматиндуцированная гибель не превышала 70%. Следовательно, для экспериментов по определению нейропротекторных свойств была использована концентрация глутамата 25 мкМ. Как 0,1, так и 0,05 мг/мл фармкомпозиции оказывают защитный эффект, повышая выживаемость зернистых нейронов мозжечка с 54,97+6,5% до 72,76+9,7%), соответственно. Однако, он был более выражен при более низкой концентрации.
В данном случае для 0,05 мг/мл фармкомпозиции КЭЗ =(45,03-
27,24)/45,03х 100%=39,51%; для дозы 0,1 мг/мл КЭЗ =(45,03-37,85)/45,03х 100%=15,94% Глициновый буфер и бычий сывороточный альбумин, добавленные в постглутаматном периоде, не изменяли токсичности глутамата. Всего в первой серии экспериментов было просчитано около 2 тысяч клеток из 60 сестринских культур.
2 серия. Вторая серия выполнена по тем же методикам и схеме эксперимента, что и 1 серия, лишь фармкомпозиция была взята в 2 концентрациях: 0,05 и 0,01 мг/мл и в качестве препарата сравнения был использован церебролизин в таких же концентрациях . Из полученных данных обсчета контролей видно, что 3-4-х- часовое пребывание в сбалансированном солевом растворе с добавлением глицинового буфера, фармкомпозиции и церебролизина в концентрациях 0,05 и 0,01 мг/мл не приводило к изменению количества живых нейронов по сравнению с контролем.
Глутамат в концентрации 25, 37, 50 мкМ (15 мин) вызывал дозозависимую гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс. Для выявления защитных эффектов различных веществ необходимо, чтобы глутаматиндуцированная гибель нейронов не превышала 70% от контроля. Следовательно, для экспериментов по определению нейропротекторных свойств была использована концентрация глутамата 25 мкМ. Наблюдаемое одинаковое дозозависимое снижение количества выживших нейронов в зависимости от концентрации глутамата при 35 и 50 мкМ свидетельствовало о насыщении рецепторов. Фармкомпозиция оказывала достоверный защитный эффект, повышая выживаемость зернистых нейронов мозжечка. Этот эффект носит дозозависимый характер, с максимальной защитой при максимальной концентрации биологически активного белково-полипептидного комплекса в фармкомпозиции (0,05 мг/мл). В данном случае КЭЗ=(45-20)/45х 100%=55,6%.
Для 0,01 мг/мл КЭЗ =(45-36)/45х 100%=20%
Церебролизин в исследованных дозах не оказывал достоверного защитного эффекта (КЭЗ =(45-38)/45х 100%=15,6%, для дозы 0,05мг/мл и КЭЗ=(45-42)/45х 100%=6,7%, для 0,01 мг/мл).
Глициновый буфер, добавленный в постглутаматном периоде, даже несколько (не достоверно) усилил токсичность глутамата.
Суммарно защитный эффект фармкомпозици по сериям экспериментов: Из приведенных выше результатов отдельных экспериментов видно, что защитный эффект фармкомпозици после токсического воздействия глутамата носит стабильный характер, воспроизводясь из опыта в опыт. Сам препарат не оказывал токсического влияния ни в одном опыте. Процент гибели нейронов и коэффициенты защиты: спустя 3 ч после воздействия 25 мкМ глутамата, погибает 41,49+4 % нейронов, если же после глутаматного воздействия в сбалансированном солевом растворе присутствовала фармкомпозиция в концентрации 0,5 и 0,1 мг/мл, то процент гибели культивированных нейронов мозжечка снижался до 30,88+4,3, и 21 ,98+4,37, соответственно. Причем, это уменьшение токсичности глутамата при введении фармкомпозици в концентрации 0,05 и 0,01 мг/мл после повреждения было достоверно (п = 45, Р<0,05, Anova tow-way тест с посттестом Benferroni), а в концентрации 0,1 мг/мл носил характер выраженной тенденции.
Коэффициенты эффективности защиты (КЭЗ) при действии фармкомпозици в различных концентрациях были:
КЭЗ (0,1 мг/мл) =(41 ,49-30,88)/41,49х 100%=25,57%
КЭЗ (0,05 мг/мл) =(41 ,49-21,23)/41,49х 100%=48,83%
КЭЗ (0,01 мг/мл) =( 1,49-21 ,98)/41,49х 100%=47,02%
Следует отметить, что результаты опытов, где токсичность глутамата превышала 80% или не достигала 30% в расчет не брались.
Церебролизин в исследованных дозах не оказывал достоверного защитного эффекта (КЭЗ =(45-38)/45х 100%=15,6%, для дозы 0,05мг/мл и КЭЗ=(45-42)/45х 100%=6,7%, для 0,01 мг/мл).
Глициновый буфер, добавленный в постглутаматном периоде, даже несколько (не достоверно) усилил токсичность глутамата.
Пример 10. Исследование механизмов фармакологического действия фармкомпозиции. Проводилось исследование специфической активности фармкомпозиции на динамику концентраций возбуждающих и тормозных нейротрансмиттеров in vitro в межклеточной жидкости 7-дневных культур зернистых нейронов мозжечка при цитотоксическом воздействии глутамата. Известно, что препараты, влияющие на высвобождение глутамата (любелизил, BW619C89), являются эффективными нейропротекторами.
Методика. Производился забор 50 мкл среды культивирования клеток-зерен мозжечка до и после токсической обработки глутаматом и внесения фармкомпозиции, глициново-фосфатного буфера или физиологического раствора. Полученные образцы сред замораживались при t- 20°С, кодировались и направлялись в лабораторию для последующего измерения концентрации нейротрансмиттеров методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД). Использовали электрохимический детектор LC-4B (BAS, США) при Λ потенциале +850 мВ на стеклоуглеродном электроде против электрода сравнения Ag/AgCl. Подвижной фазой служил 0.05 М натрийфосфатный буфер с 0.025 мМ ЭД-ТА и 5% ацетонитрила. К 25 мкл перфузата добавляли 25 мкл 0.01 мг/мл внутреннего стандарта L-гомосерина в 0.2 н NaOH и 10 мкл #-фтальаль- дегидсульфитного реактива в 0.1 М боратном буфере (рН 9.5) для дериватизации аминокислот. В качестве стандарта использовали раствор, содер- жащий смесь аминокислот в концентрации 0,01 ммоль/л в 0,1 н НС104 глутамат в концентрации 0.2 мг/мл в 0.1 н. НС104. После 15 мин инкубации при температуре 37°С 25 мкл смеси наносили на колонку Agilent Hypersil ODS 5 мкм, 4.6 х 250 (объем петли 5 мкл) хроматографа Agilent 1 100 (США). Концентрацию аминокислот вычисляли при помощи програм-ного обеспечения "Chemstation Agilent" (США); конечный результат выражали в нМ/мг ткани за 2 мин.
Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью компьютерной программы Biostat с использованием непараметрических критериев (U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).
Подвижную фазу в составе: КН2Р04 безводный («Fluka») - 0,069 М, лимонной кислоты моногидрата («Fluka») - 0,27 М, натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты («Sigma») - 0,27 mM и октилсульфонат натрия (ионпарный реагент) («Диа-фарм») - 1 ,9 mM готовили следующим образом - навеску разбавляли в 920 мл деионизированной воды, доводили рН до 3,15 (рН- метр рН-340, «ЗИП»), затем добавляли 80 мл, то есть 1 ,528 М ацетонитрила («Мегск»). Раствор фильтровали под вакуумом (микрофильтр 0,2 мкм) при Р = 20- 40 м Hg столба. Перед началом биохимических экспериментов подвижную фазу дегазировали под вакуумом с одновременной обработкой на ультразвуковой бане («Серьга», Россия) в течение 40-50 секунд.
Результаты: фармкомпозиция в концентрациях 0,05 мг и 0,1 мг достоверно и дозозависимо повышала экстрацеллюлярное высвобождение глутамата, глицина, гамма-аминомаслянной кислоты и таурина и аспартата (см. табл.).
Figure imgf000039_0001
При концентрации фармкомпозиции 0,05 мг уровень высвобождения нейротрансмиттеров был выше на 20% (р < 0.05), при концентрации 0,1 мг повышение было также достоверным и составляло 28%. После глутаматной токсичности 25 мкМ, при применении фармкомпозиции в концентрациях 0,05 мг и 0,1 мг, отмечалось дозозависимое повышение уровня ГАМК, как тормозного нейротрансмиттера и составило 90% и 160% соответственно, по отношению к контрольному р< 0.01); концентрации таурина и глицина при глутаматной токсичности дозозависимо повышались до того же уровня, что и без таковой; уровни возбуждающей нейромедиации - аспартата и глутамата при глутаматной токсичности при применении фармкомпозиции снижались к контрольному уровню в случае аспартата {р< 0.05) и оставались неизменными в случае глутамата, достоверно не отличаясь от контроля его воздействия без глутаматной токсичности.
Таким образом, физиологическое действие фармкомпозиции проявлялось повышением экстрацеллюлярной концентрации глицина, глутамата, таурина и ГАМК. Выраженность этого эффекта зависела от концентрации фармкомпозиции, он был достоверно выше при концентрации 0,1мг, чем 0,05 мг.
Источники информации, принятые во внимание 1. Энциклопедия лекарств. 2006, с.970 г.
2. Патент РФ N° 212851 1(1999)
3. Патент РФ Ns 2104702( 1999)
4. Патент РФ 2049472( 1999)
5. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У. Хабриева.- 2 изд., перераб. и доп. -М, ОАО Издательство «Медицина» - 2005., с.131-170.
6. Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У. Хабриева.- 2 изд., перераб. и доп. -М, ОАО Издательство «Медицина» - 2005., с.100-122.
7. Методические указания по оценке канцерогенности свойств фармакологических
средств и вспомогательных веществ в краткосрочных тестах.//
Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У. Хабриева.- 2 изд., перераб. и доп. -М, ОАО Издательство «Медицина» - 2005., с.131-170.
8. И.В.Силкина, Т.С.Ганыиина, С.Б.Серединин, Р.С.Мирзоян, Усилиние кровоснабжения ишемизированного мозга под влиянием афобазола,
Ж.Эксперимен. и клин. Фармакология, 2004, т.67, N°5, с.9-13.
9. Smith M.L., Bendek G., Dahlgen N. at all, Models for studing, long-term recovery following forebrain ischemia in the rat. A 2-vessell occlusion model.// Neurol.Scan., 1984, v.69, p.385 - 400.
10. Ф Y.Wang-Fisher. Manual of Stroke Models in rats. CRC press, 2008, p.3-4
11. Программа по уходу и содержанию лабораторных животных НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН от ноября 2005 г.
Промышленная применимость
Действие фармкомпозиции на фоне модели глутаматной токсичности по сравнению с физиологическим действием без таковой, проявлялось в:
- снижении экстрацеллюлярного уровня аспартата;
- значительном, дозозависимым повышением уровня ГАМК;
- стабилизации концентраций глицина и таурина;
- тенденции к снижению уровня глутамата.
Фармакологический эффект фармкомпозиции (повышение выживаемости зернистых нейронов в культуре клеток мозжечка при цитотоксическом воздействии глутамата) связан с регуляторным воздействием препарата на уровни возбуждающей и тормозной медиации, что обеспечивает необходимую защиту нейронов от повреждения. Наиболее интересным эффектом влияния фармкомпозиции на изменение экстрацеллюлярного пула аминокислот, помимо повышения концентрации ГАМК, является увеличение уровня таурина. Эта аминокислота, являясь донатором SH-групп, усиливает действие глутатион- пероксидазной системы и тем самым повышает антиоксидантную защиту клеточных мембран нейронов. Использованная модель глутаматной токсичности позволяет оценить влияние фармкомпозиции на динамику не только экстрацеллюлярного уровня нейротрансмиттеров, включающий метаболический пул аминокислот, но и синаптического пула (косвенно). Иными словами, нейропротективный эффект фармкомпозиции объясняется стабилизацией уровня глутамата с тенденцией к снижению не только за счет активации тормозного звена нейротрансмиссии, но и за счет уменьшения спиловера возбуждающих нейромедиаторов.

Claims

Формула изобретения
1. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза, выполненная в виде раствора для парентерального, интраназального и субъконьюктивального введения, содержащей в качестве активного инградиента биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,01 - 2,0 мг/мл, обладающий тканеспецифическим репаративным действием на нервную ткань, получаемый из эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой, до середины последней трети беременности, включающий отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ- видимой области спектра и наличием полос в интервале значений pi от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, которая в качестве разбавителя содержит фармакопейный буферный раствор и вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы.
PCT/RU2011/000406 2010-07-01 2011-06-09 Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза WO2012002840A1 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES11801210.3T ES2671247T3 (es) 2010-07-01 2011-06-09 Composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central y periférico de origen vascular, traumático, tóxico, hipóxico y autoinmune
EP11801210.3A EP2589390B1 (en) 2010-07-01 2011-06-09 Pharmaceutical composition for treating central and peripheral nervous system diseases of vascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune origin
EA201300062A EA024732B1 (ru) 2010-07-01 2011-06-09 Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010126868 2010-07-01
RU2010126868/15A RU2445106C1 (ru) 2010-07-01 2010-07-01 Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012002840A1 true WO2012002840A1 (ru) 2012-01-05

Family

ID=45402330

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2011/000406 WO2012002840A1 (ru) 2010-07-01 2011-06-09 Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP2589390B1 (ru)
EA (1) EA024732B1 (ru)
ES (1) ES2671247T3 (ru)
RU (1) RU2445106C1 (ru)
WO (1) WO2012002840A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2726854C1 (ru) * 2019-09-17 2020-07-16 Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" Композиция полипептидов, обладающая свойством нормализовать функции головного мозга
RU2828886C1 (ru) * 2024-04-11 2024-10-21 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" Способ получения биогенного стимулятора из тканей кожи

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2477637C2 (ru) * 2010-12-24 2013-03-20 Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" Способ лечения острого нарушения мозгового кровообращения ишемического и геморрагического характера
RU2586286C2 (ru) * 2014-10-16 2016-06-10 ДИАМОНДЗЛИТЕ ЛИМИТЕД Тридент Чамберс Применение для лечения и профилактики атеросклероза белково-пептидного комплекса (далее-бпк), полученного из эмбриональной нервной ткани или из быстрозамороженного эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных, влияющего на обратный транспорт холестерина из сосудистой стенки и профиль активации моноцитов у пациентов с выраженным атеросклерозом магистральных сосудов или с предрасположенностью к сердечно-сосудистым заболеваниям и способ профилактики и лечения пациентов с атеросклерозом артериальных сосудов и с заболеваниями, вызванными атеросклерозом магистральных и периферических сосудов головного мозга, сердца, сосудов нижних конечностей и аорты (два варианта)
RU2713655C2 (ru) * 2018-03-29 2020-02-06 Александр Александрович Сидякин Лекарственный препарат для лечения нарушений мозгового кровообращения и восстановления утраченных функций мозга
RU2690498C1 (ru) * 2018-05-17 2019-06-04 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр" Способ получения ноотропной композиции на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека
RU2690846C1 (ru) * 2018-05-17 2019-06-06 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр" Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека
RU2727586C1 (ru) * 2019-09-17 2020-07-22 Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" Композиция полипептидов, обладающая свойством нормализовать функции головного мозга
RU2751331C1 (ru) * 2020-01-30 2021-07-13 Александр Александрович Сидякин Лекарственный препарат для лечения нарушений мозгового кровообращения и восстановления утраченных функций мозга

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0249563A1 (fr) * 1986-06-12 1987-12-16 Gérard Laumond Extraits tissulaires embryonnaires d'organes animaux, utiles comme stimulants des fonctions métaboliques organiques humaines
RU2049472C1 (ru) 1992-12-21 1995-12-10 Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" Способ получения гидролизата мозговой ткани "церебролизат"
RU2104702C1 (ru) 1996-10-16 1998-02-20 Общество с ограниченной ответственностью "Клиника Института биорегуляции и геронтологии" Способ получения из животного сырья комплекса биологически активных полипептидов, нормализующих функции головного мозга, фармакологическая композиция и ее применение
RU2128511C1 (ru) 1997-02-28 1999-04-10 Общество с ограниченной ответственностью "НИР" Способ получения лечебного средства при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы
EA003301B1 (ru) * 2000-04-28 2003-04-24 Научно-Производственное Республиканское Унитарное Предприятие "Диалек" Способ получения лекарственного средства из ткани мозга эмбрионов животного и фармакологическая композиция на его основе
WO2010007620A1 (en) * 2008-07-13 2010-01-21 Delapharm Ltd. Pharmaceutical composition comprising porcine brain extract

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6046092B2 (ja) * 1974-07-01 1985-10-14 中外製薬株式会社 脳機能障害の改善および予防成分の抽出法
RU2090194C1 (ru) * 1994-09-30 1997-09-20 Игорь Арнольдович Скворцов Способ получения препарата для лечения координаторных нарушений из мозжечково-стволового отдела головного мозга
UA35631C2 (ru) * 1996-07-25 2001-04-16 Дмитро Бориславович ШОРОХ Способ изготовления биологично активних препаратов из эмбриональных тканей
EP1367899A4 (en) * 2001-02-14 2004-07-28 Leo T Furcht TOTIPOTENT ADULT STEM CELLS, SOURCES OF SUCH CELLS, METHODS FOR OBTAINING AND MAINTAINING SAME, METHODS FOR DIFFERENTIATING THESE CELLS, METHODS OF USING SAME, AND CELLS DERIVED FROM THE ABOVE-MENTIONED CELLS
WO2009088314A1 (ru) * 2007-12-29 2009-07-16 Zakritoe Aktcionernoe Obschestvo "Pharm-Sintez" Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0249563A1 (fr) * 1986-06-12 1987-12-16 Gérard Laumond Extraits tissulaires embryonnaires d'organes animaux, utiles comme stimulants des fonctions métaboliques organiques humaines
RU2049472C1 (ru) 1992-12-21 1995-12-10 Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" Способ получения гидролизата мозговой ткани "церебролизат"
RU2104702C1 (ru) 1996-10-16 1998-02-20 Общество с ограниченной ответственностью "Клиника Института биорегуляции и геронтологии" Способ получения из животного сырья комплекса биологически активных полипептидов, нормализующих функции головного мозга, фармакологическая композиция и ее применение
RU2128511C1 (ru) 1997-02-28 1999-04-10 Общество с ограниченной ответственностью "НИР" Способ получения лечебного средства при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы
EA003301B1 (ru) * 2000-04-28 2003-04-24 Научно-Производственное Республиканское Унитарное Предприятие "Диалек" Способ получения лекарственного средства из ткани мозга эмбрионов животного и фармакологическая композиция на его основе
WO2010007620A1 (en) * 2008-07-13 2010-01-21 Delapharm Ltd. Pharmaceutical composition comprising porcine brain extract

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Guidelines for Experimental (Preclinical) Study of New Pharmacological Substances", 2005, PUBLISHING HOUSE, article "Methodological Guidelines. Carcinogenicity Assessment of Pharmacological Drugs and Excipients in Short-Term Tests", pages: 131 - 170
"Guidelines for Experimental (Preclinical) Study of New Pharmacological Substances", 2005, PUBLISHING HOUSE, article "Methodological Guidelines. Carcinogenicity Assessment of Pharmacological Drugs", pages: 100 - 122
"Guidelines for Experimental (Preclinical) Study of New Pharmacological Substances", 2005, PUBLISHING HOUSE, pages: 131 - 170
"Laboratory Animals Care and Keeping Program", NURSERY FOR LABORATORY ANIMALS UNDER FEDERAL INSTITUTE OF BIOORGANIC CHEMISTRY, November 2005 (2005-11-01)
0 Y.WANG-FISHER: "Manual of Stroke Models in rats", 2008, CRC PRESS, pages: 3 - 4
ENCYCLOPEDIA OF DRUGS, 2006, pages 970
I.V. SILKINA; T.S. GAN'SHINA; S.B. SEREDININ; P.S. MIRZOYAN: "Enhancement of Blood Supply to Ischemic Brain Under Effect of Afobazol", J. EXP. AND CLIN. PHARMACOLOGY, vol. 67, no. 5, 2004, pages 9 - 13
See also references of EP2589390A4 *
SMITH M.L.; BENDEK G.; DAHLGEN N.: "Models for studing, long-term recovery following forebrain ischemia in the rat. A 2-vessell occlusion model", NEUROI.SCAN., vol. 69, 1984, pages 385 - 400

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2726854C1 (ru) * 2019-09-17 2020-07-16 Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" Композиция полипептидов, обладающая свойством нормализовать функции головного мозга
RU2828886C1 (ru) * 2024-04-11 2024-10-21 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" Способ получения биогенного стимулятора из тканей кожи

Also Published As

Publication number Publication date
EP2589390A4 (en) 2014-01-01
RU2445106C1 (ru) 2012-03-20
EP2589390A1 (en) 2013-05-08
EA201300062A1 (ru) 2014-11-28
EA024732B1 (ru) 2016-10-31
EP2589390B1 (en) 2018-03-07
RU2010126868A (ru) 2012-01-10
ES2671247T3 (es) 2018-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2445106C1 (ru) Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза
JP3818322B2 (ja) コラーゲン分解促進剤
RU2428196C1 (ru) Способ получения биологически активного комплекса и биологически активный белково-полипептидный комплекс
RU2477637C2 (ru) Способ лечения острого нарушения мозгового кровообращения ишемического и геморрагического характера
RU2485133C2 (ru) Белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе
JP2021520351A (ja) 皮膚を治療するための組成物
EA039314B1 (ru) Фармацевтически приемлемые соли полипептидов и их применение
WO2009088314A1 (ru) Способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротекторным действием
RU2485132C2 (ru) Белково-полипептидный комплекс, обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе
RU2460736C1 (ru) Белково-полипептидный комплекс (бпк), обладающий тканеспецифическим репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ получения белково-полипептидного комплекса, обладающего тканеспецифическим репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, и фармацевтическая композиция на основе бпк, обладающая антигипоксическим, иммуномодулирующим, тканеспецифическим репаративным действием на кожную ткань и слизистые оболочки, с омолаживающим эффектом
RU2275924C2 (ru) Способ получения комплекса биологически активных полипептидов для нормализации функций головного мозга и фармацевтическое средство на его основе
WO2022014681A1 (ja) 運動ニューロン疾患（ｍｎｄ）の治療に有効な多能性幹細胞
EP2647386B1 (en) Lissencephaly therapeutic agent
EA009521B1 (ru) Композиция, обладающая гепатопротекторной активностью и нормализующая обменные процессы
RU2771678C1 (ru) Биологически активная субстанция и фармацевтическая композиция в виде стерильной водной дисперсии для конъюнктивального в виде капель и субъюнктивального, пара-, ретробульбарного инъекционного введения при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний
CN113730554A (zh) Cart作为制备缺血性脑损伤神经保护剂药物的应用
RU2405558C2 (ru) Лекарственный препарат для лечения гипоксических и токсических митохондриальных нарушений и способ его получения
RU2787479C1 (ru) Набор фармакологического средства, предназначенного для улучшения кровотока в коре головного мозга и восстановления двигательных и когнитивных функций организма
EA003301B1 (ru) Способ получения лекарственного средства из ткани мозга эмбрионов животного и фармакологическая композиция на его основе
CN112569338B (zh) Tdfa在制备预防和/或治疗眼表炎症疾病的药物中的应用
RU2716819C1 (ru) Белково-пептидный комплекс и средство для приготовления лекарственного препарата, представляющее собой белково-пептидный комплекс
EA010427B1 (ru) Средство для лечения заболеваний предстательной железы
RU2269825C1 (ru) Способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных
RU2140283C1 (ru) Фармацевтический препарат на основе интерлейкина-2 (варианты)
Ganieva et al. EXPERIMENTAL STUDY OF THE CHRONIC TOXICITY OF THE TRIBULEPIL COLLECTION

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11801210

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011801210

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201300062

Country of ref document: EA