WO2011161999A1 - 新規ピシウム菌 - Google Patents

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WO2011161999A1
WO2011161999A1 PCT/JP2011/057639 JP2011057639W WO2011161999A1 WO 2011161999 A1 WO2011161999 A1 WO 2011161999A1 JP 2011057639 W JP2011057639 W JP 2011057639W WO 2011161999 A1 WO2011161999 A1 WO 2011161999A1
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psium
soil
plant
seedling
pythium
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PCT/JP2011/057639
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元昭 東條
咲麗 小林
眞 柿嶌
志穂美 埋橋
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公立大学法人大阪府立大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to a novel Pythium bacterium. More specifically, the present invention relates to a novel Pythium bacterium that exhibits antagonistic properties against a phytopathogenic fungus (Pythium ultimum) that causes seedling blight.
  • a phytopathogenic fungus Panethium ultimum
  • Pisium species are widely distributed in soils and water environments around the world. To date, more than 150 species have been reported worldwide, and about 50 species have been reported in Japan. Many species of the genus Psium are known as important phytopathogenic fungi that cause seedling wilt and root rot of many crops including vegetables. Examples of such plant pathogens include Pythium ultimum and Pythium aphanidermatum.
  • Patent Document 1 discloses that Streptomyces heimi and Streptomyces flaveolus have antagonistic properties against Pisium aphanidermartam and are effective in controlling turfgrass pathogens. It is shown. Further, in Patent Document 2, Psedomonas fluorescens shows antagonistic properties against Psium aphanider martam, Rhizoctonia solani, etc., and these wet cells are directly sprayed on turfgrass. Alternatively, it describes that an adsorbent obtained by adsorbing bacterial cells to vermiculite or zeolite, or compost obtained by mixing with compost raw materials can be applied to turf grass and used as a plant disease control material.
  • Non-Patent Document 1 describes that Pythium oligandrum shows antagonistic properties against tomato rhizome spoilage fungi.
  • Patent Document 3 describes that a protein derived from the cell wall of Psium origandrum is established in the rhizosphere of many crops and exhibits the ability to induce disease resistance in the crops.
  • Non-patent document 2 describes that Pythium nunn suppresses disease caused by Pythium ultimum.
  • Non-patent document 3 discloses that Pythium nunn causes disease caused by Phytophthora spp.
  • Non-Patent Document 4 describes that the same bacterium suppresses diseases caused by Rhizoctonia solani.
  • Non-Patent Document 5 describes that pathogenic fungi can be classified and identified by analyzing DNA base sequences.
  • the base sequence of the ITS region (Internal Transcribed Spacer region) of rDNA (ribosomal DNA) has 99% or more identity within the same species, and if it is less than that, it is considered to be a different species. It has been concluded that analysis of the base sequence of the D1 / D2 region in the ITS region and the rSU LSU (Large Subunit, 26-28S) is sufficient in classifying and identifying the species of the genus.
  • Non-Patent Document 6 compares the classification / identification based on the polymorphisms of the ITS region of rDNA and the mitochondrial chrome oxidase II gene with the classification based on the above-mentioned cell morphology for the genus Pisium. It is concluded that not only morphological features but also polymorphism analysis at the gene level is necessary. Furthermore, in Non-Patent Document 7, a molecular phylogenetic analysis was performed on the genus Psium from the base sequences of the ITS region and the D1 / D2 region of rDNA (ribosomal DNA), and a comparison with morphological classification was attempted. A phylogenetic group has been found.
  • the present invention provides a novel Pythium bacterium having an antagonistic property against pathogenic Pythium bacteria, and an object thereof is to control various plant diseases represented by seedling blight using the Pythium bacterium.
  • the Pisium bacterium of the present invention is a novel Psium bacterium having a nucleotide sequence of the ITS region of rDNA that is 99% or more identical to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and in the present invention, the Pisium bacterium is sprayed on the soil. In this way, plant diseases caused by these pathogenic Psium bacteria are controlled in soil contaminated with Psium Ultimum, which is the causative agent of seedling blight.
  • FIG. 1 is a microscopic image showing the morphological characteristics of the separated Psium Nan.
  • a to g are UZ041 strains, and h to k are UZ415 strains.
  • a is a spore sac having a germ tube
  • b is a vesicle having a zoospore
  • c is an empty spore sac after releasing the zoospore
  • d is a spherical bulge in the middle of the hyphae
  • e is an egg-forming egg having a protrusion
  • f is an egg laying ovary with three spermatozoa
  • g is an ovulator with a spermatozoon with a spider-like handle
  • h is the middle of the hyphae Spherical asexual breeding organ in i
  • i is a spherical asexual breeding organ at the end of
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between the growth rate and growth temperature of the separated Psium Nan UZ041 and UZ415 strains.
  • FIG. 3 is a phylogenetic tree based on the base sequence of the ITS region in Pycium Nan.
  • FIG. 4a is an image obtained by microscopic observation showing the inter-fungal parasitic between the isolated Psium Nan (UZ041 strain) and Pisium Ultimum
  • FIG. 4b is the isolated Psium Nan (UZ415 strain) and Psium Ultimum. It is the image by microscopic observation which shows the inter-fungal parasitic nature between.
  • PU stands for Psium Ultimum
  • PN stands for Psium Nan.
  • FIG. 5 is an image showing the control effect of cucumber wilt disease by the isolated Psium Nan UZ041 and UZ415 strains.
  • a shows the UZ041 strain
  • b shows the UZ415 strain
  • c shows only Psium Ultimum
  • d shows a control that does not infect Psium Ultimum.
  • FIG. 6 is a diagram showing changes in the bacterial density of Pycium Nan UZ415 strain in soil, where the solid line indicates the case where green manure is used and the broken line indicates the case where green manure is not used.
  • FIG. 7 is an image showing the disease-inhibiting effect of red burning fungus by Pycium Nan UZ041 strain and OPU640 strain.
  • FIG. 8 is a graph showing the disease-inhibiting effect (morbidity degree) of red-baked fungus by Pycium Nan UZ041 strain and OPU640 strain.
  • the Psium bacterium of the present invention is a novel Psium bacterium, and has a nucleotide sequence having an identity of 99% or more with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the ITS region of rDNA.
  • the ITS region is a region containing the 5.8S subunit of the rRNA gene, and an intron region (ITS1) and a 5.8S subunit existing between the 18S subunit and the 5.8S subunit of the rRNA gene.
  • the identity in this application is based on the result of the alignment performed by ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Res 24 (1997), p.4876-7882).
  • the Psium bacterium of the present invention has the following morphological properties.
  • the morphological characteristics are consistent with Pisium nan (Pisium nan standard bacterium) already reported in Non-Patent Document 2, and the growth optimum temperature is also approximately the same.
  • the Psium bacterium of the present invention is highly related to Pisium nan already reported in the gene system analysis.
  • the formation of zoospores that has not been reported so far has been observed, and the optimum temperature of hyphal growth is 31 ° C., which is lower than the 34 ° C. of previously reported Psium nan. ⁇ Recognized as a variant or variant within the same species of Nan standard bacteria.
  • the Psium bacteria of the present invention are isolated from various soils such as field soil in Nagano Prefecture, boxwood breeding ground in Fukuoka Prefecture, field soil in Osaka Prefecture, and among these, it was isolated from field soil in Nagano Prefecture
  • the strain is Pythium nunn UZ041 (accession number: FERM BP-11338), and the strain isolated from the soil of the boxwood breeding ground in Fukuoka Prefecture is Pythium nunn UZ415 (accession number: FERM BP-11339). Deposited at the Patent Organism Depositary (IPOD), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • the Psium bacterium of the present invention is non-pathogenic. This bacterium is antagonistic to other pathogenic bacteria belonging to the genus Psium, such as Pythium ultimum. Utilizing this property, the preparation containing the Psium bacterium of the present invention can be used as a plant disease control agent. Plant diseases targeted by this control agent include plant diseases caused by pathogenic Pythium spp. Such as Pythium ultimum and Pythium aphanidermatum, as well as pathogenicities other than Psium spp.
  • Fungi for example, Fusarium, Gaeumannomyces, Rhizoctonia, Verticillium, Phytophthora, Sclerotium, Corticium Examples of plant diseases derived from (Corticium), Plasmodiophora, Rhizopus, Trichoderma, Microdochium, and Sclerotinia Is done.
  • the plant disease control agent of the present invention is a preparation containing the aforementioned Psium bacterium, and is not limited to the microbial cell itself, and the microbial cell is added to various media (for example, a culture medium or an excipient for the preparation). Used to include composition. It does not matter whether the form of the composition is a liquid composition or a solid composition. Therefore, not only when the collected bacterial cells are used after culturing, but also when the culture medium (liquid medium or solid medium) cultured without collecting the bacteria is used as it is.
  • a composition obtained by mixing cultured cells with a solid medium such as vermiculite, perlite, culture soil, peat moss, or a liquid medium such as liquid fertilizer or a medium, with or without collection of bacteria is illustrated.
  • a solid medium such as vermiculite, perlite, culture soil, peat moss, or a liquid medium such as liquid fertilizer or a medium, with or without collection of bacteria.
  • the composition which mixed the microbial cell is illustrated.
  • it may contain microbial cells having plant disease control properties other than the present invention, and is effective for various plant diseases such as seedling blight.
  • Agents such as propamocarb hydrochloride and hydroxyisoxazole may be mixed as long as they do not reduce the antagonistic activity of the present invention Psium.
  • Plants targeted by the plant disease control agent of the present invention are not particularly limited, and examples include edible plants such as cucumber, cabbage, spinach, radish and eggplant, ornamental plants such as chrysanthemum and asters, and turfgrass. .
  • the bacterial cell concentration is appropriately adjusted according to the form of the control agent and the target plant disease, but the number of sprayed bacteria per gram of soil is 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10. It is adjusted to about 6 cfu (colony forming unit), preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 5 .
  • the soil improvement method of the present invention is a method in which the Psium bacterium according to the present invention is mixed in the soil and allowed to grow. This suppresses the growth of pathogenic filamentous fungi, especially pathogenic Pythium spp. Present in the soil, or reduces the growth of pathogenic filamentous fungi and restores healthy soil to protect plants from plant diseases To do.
  • the method of mixing is not particularly limited, and the control agent such as the collected cells or a medium containing the cells may be appropriately mixed in the soil.
  • plant diseases are controlled by growing Psium bacteria in the soil where the plants are cultivated and fixing them in the rhizosphere of the target crop.
  • fresh organic matter means organic matter that is not composted and becomes a fertilizer for the soil by scrubbing into the soil, such as green manure, and examples include okara and oil cake.
  • green manure is preferably applied. Green manure is cultivated in the target soil such as oat, clover, forsythia, rye, ebiscus, cucumber, soybean, and is not composted as soil fertilizer by plowing into the soil without harvesting after cultivation A fresh plant. As long as the green manure to be fertilized is such a plant body, any may be sufficient.
  • the time of spraying the Psium bacterium of the present invention does not matter before and after fertilization. Moreover, even when fertilizing green manure, the time of spraying the Psium bacteria of the present invention is the same as when the green fertilizer is soaked into the soil before and after the start of cultivation of the plant to be green manure. Alternatively, after the green manure has been permeated, the Psium bacterium of the present invention may be sprayed.
  • the present invention is also provided as plant-cultivating soil containing Psium bacteria after previously spreading and growing the Psium bacteria of the present invention on a field soil or the like.
  • the plant seedling of the present invention is obtained by germinating or growing a plant seed in the soil for plant cultivation.
  • the plant seedling of the present invention is also provided by germination or growth in a soil to which a plant disease control agent containing the Pycium naan cell of the present invention is added.
  • These plant seedlings may be provided as planted in the germinated or grown soil, so-called germinated or grown in a pot for cultivation containing the plant cultivation soil or soil added with the plant disease control agent. Also provided as a pot seedling.
  • the number of bacteria per 1 g of soil is about 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 6 cfu (colony forming unit), preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10.
  • the Pisium bacterium of the present invention is added to adjust to 5 , or the plant disease control agent of the present invention is added.
  • the target plant seedlings are not particularly limited, and examples thereof include edible plants such as cucumber, cabbage, spinach, radish and eggplant, ornamental plants such as chrysanthemum and aster, and turfgrass.
  • the plant seeds of the present invention are those coated with the coating agent containing the Psium naan cell of the present invention.
  • the coating agent contains pisium nan in the coating base, and various known coating bases can be used as long as the antagonistic properties of the Pycium bacteria of the present invention are not reduced.
  • As the coating base water-soluble binders (binding agents) such as PVA, CMC, MC, gelatin, starch, and pullulan, and powder materials such as diatomaceous earth, red clay, calcium carbonate, perlite, talc, clay, and carillon (Inorganic material) is exemplified.
  • the coating method is not particularly limited as long as the cells can adhere to the seeds, and the binder, the powder material, the cells, and a medium such as water are mixed, and the mixture is sprayed on the surface of the seeds.
  • Examples thereof include a method of applying and drying, and a method of immersing seeds in the mixture and attaching the mixture to the seed surface.
  • the surface of the seed does not need to be completely covered with a film (coating layer), and even if the film is partially attached, it cannot be used. This is because when the seeds to which the bacterial cells are attached are sown, the seeds that are attached grow on the seeded soil.
  • the target plant seeds are not particularly limited, and examples include edible plant seeds such as cucumber, cabbage, spinach, radish and eggplant, ornamental plant seeds such as chrysanthemum and asters, and turfgrass seeds.
  • the In the coating agent the number of bacteria per 1 g of the coating agent is adjusted to about 1 ⁇ 10 0 to 1 ⁇ 10 5 cfu (colony forming unit), preferably 1 ⁇ 10 1 to 1 ⁇ 10 3 .
  • Psium was isolated from three soils in Japan.
  • the soil used was the field soil of Ueda City, Nagano Prefecture, the soil of the boxwood breeding ground of Fukuoka City, Fukuoka Prefecture, and the field soil of Osaka Prefecture.
  • Psium bacteria were isolated by a trapping method (Watanabe 1981) using pepper seeds, cucumber seeds, and potatoes (cocoons) as a substrate for capturing the bacteria (capture substrate).
  • the capture substrate was embedded in each soil and cultured at 20-30 ° C. for 24-48 hours. Then, the capture substrate was taken out of the soil, washed with running water, and dried.
  • This capture substrate was cultured on a water agar medium, and the grown mycelium was separated.
  • the isolated bacteria were cultured on corn meal agar medium (CMA medium: Tojo et al. 1998).
  • the strain isolated from the soil in Nagano Prefecture is Pythium nunn UZ041 (Accession Number: FERM BP-11338), and the strain isolated from the soil in Fukuoka Prefecture is Pythium nunn UZ415 ( Deposit numbers: FERM BP-11339) were deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • the isolated bacteria were cultured and stored in a potato-carrot-agar medium (PCA medium: van der Plaats-Niterink AJ, Stud. Mycol. 21 (1981), p.1-242). The test bacteria.
  • the separated Psium Nan was different from the Psium Nan reported in Non-Patent Document 4 in that formation of zoospores was observed, but there were no other morphological differences.
  • the optimum temperature for growth of the mycelium of the isolated strain was 31 ° C., which was lower by about 3 ° C. than the optimum temperature for the reported Pythium naan standard bacterium.
  • primer NL1 having the base sequence shown by SEQ ID NO: 4 and primer NL4 having the base sequence shown by SEQ ID NO: 5 (both O'Donnell CAB International, 1993 p. 225-233) was used.
  • DNA extraction and PCR were performed according to the method of Uzuhashi et al. (Uzuhashi et al., Mycoscience 49 (2008), p.276-279).
  • the base sequence (875 bp) of the ITS region including the 5.8S rDNA region is shown as SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequences of the ITS regions of the three strains analyzed were exactly the same.
  • the base sequence of this 5.8SrITS region was 98.6% identical to the previously reported base sequence of Pythium nan standard bacteria (GenBank gene accession number AY598709).
  • the base sequences of the D1 / D2 regions of the three strains analyzed were exactly the same, and were exactly the same as those of the Pycium Nan standard bacterium. The identity depends on the result of alignment performed by ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Res 24 (1997), p.4876-7882).
  • FIG. 3 is a phylogenetic tree based on the DNA of the ITS region of various genus Pycium including isolated Psium nanan. This phylogenetic tree was created by the RAxML program (Stamatakis, Bioinfomatucs (22 (2006), p2688-2690). As can be seen from this phylogenetic tree, the three isolated strains of Pysium Nan are the nucleotide sequence of the ITS region. It is positioned separately from other Psium Nan, and belongs to a different group from other Psium Nan.
  • the isolated Psium Nan UZ415 strain was examined for phytopathogenicity. Cucumber (variety: ground), cabbage (variety: cabbage) and Bermudagrass (variety: Sun Devil) were used as test plants.
  • the cultured bacterial flora (microflora) of each test bacterium is mixed with commercially available soil for raising seedlings (Aina No. 1: manufactured by Katakura Chikkarin Co., Ltd.), placed in a tissue culture plate, and the test plant seeds are placed in each well of the plate. Sowing. After putting it in a double polyethylene bag, it was allowed to stand in a plant cultivator at 28 ° C., and the seedling mortality rate was examined after 5 days.
  • Pixium Nan UZ415 strain was mixed with commercially available seedling-grown soil (Aina 1; manufactured by Katakura Chikkarin Co., Ltd.), mixed in a double polyethylene bag, and placed in a plant grower at 25 ° C. .
  • the bacterial density was measured by a dilution plate method using a Psium spp.
  • an increase in bacterial density was observed from 1 day to 21 days after mixing, and a tendency to decrease thereafter was observed.
  • cucumber seeds were sown on each mixed soil, and the fungus density in the soil was measured by the same method. The result is shown in FIG.
  • the fungus density was significantly higher than in soil without plant bodies.
  • the density of bacteria in the soil is increased as compared with the case where there is no green manure and the increase in pathogenic fungi is suppressed.
  • the plants were further grown within the plant growing season, and after about 3 weeks after seeding, the plants were trimmed with scissors sterilized with 70% ethanol to a plant height of about 10 mm. After sucking with a vacuum cleaner in which 70% ethanol was sprayed on the mouth so that the chips were not left on the surface of the leaves, it was returned to the plastic container again and grown for about one week.
  • CMA CMA medium
  • sweet corn 50 g, warp 2 g, powder agar 17 g, ion-exchanged water 1,000 ml sweet corn 50 g, warp 2 g, powder agar 17 g, ion-exchanged water 1,000 ml.
  • Red clover (Trifolum pratense) was collected in the Osaka Prefectural University Educational Research Field, spread on newspaper, and air-dried for about a month. After that, it was pulverized with a miller (IFM-650D / 655D, Iwatani, Tokyo, Japan) and powdered by passing through a 2 mm square sieve. The powdered red clover was stored at ⁇ 20 ° C. until 0.5 gram each before wrapping in medicine-wrapped paper.
  • IFM-650D / 655D Iwatani, Tokyo, Japan
  • strains Two types of strains (OCU650 strain, UZ041 strain) which are inoculation sources of Pythium nunn cultured in the dark at 28 ° C. for 1 week and non-inoculation comparison medium were suspended in beakers and hand-mixed (Household Blending) Mixing was performed using a mixer model: Ha-3058). 30 ml of the inoculum was sprayed on the top of the plant body per clay pot, and each clay pot was sealed with a plastic bag. The sealed pots were placed in a plant breeder (day temperature 30 ° C., light period 12 hours, night temperature 25 ° C., dark period 12 hours, light period illuminance 38.4 ⁇ mol / m 2 / s).
  • the affected area of the plant body in which symptom such as fading and decay of creeping bentgrass was observed was measured using software (Motic Images Plus 2.2ML, Motic, Hong Kong). The test was conducted using 10 pots per test section. In addition, statistical processing of the diseased area measured was carried out a significant difference test using Tukey-Kramer's HSD test (p ⁇ 0.05). The result is shown in FIG. As shown in this result, the Psium bacterium of the present invention exhibits an excellent disease-causing effect against infection caused by red-burning fungus.
  • a novel Pythium bacterium having an antagonistic property against a phytopathogenic fungus such as Psium Ultimum is provided.
  • Use of this bacterium provides a plant disease control agent for Psium bacterium such as seedling blight and red burning.

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Abstract

【課題】ピシウム・ウルティマムのような病原性を有するピシウム属菌に対して拮抗性を有する新規なピシウム・ナンを提供する。 【解決手段】本発明のピシウム・ナンは、ｒＤＮＡの５.８Ｓを含むＩＴＳ領域に配列番号１に示される塩基配列を有する。このピシウム・ナンは、ピシウム・ウルティマムのような病原性を有するピシウム属菌に対して拮抗性を有する。この菌をピシウム・ウルティマムなどの病原性菌が生息する土壌に散布して、立枯病などの植物病害を防除する。

Description

新規ピシウム菌
　本発明は新規ピシウム菌に関する。より具体的には苗立枯病を引き起こす植物病原菌（Pythium ultimum）に対して拮抗性を示す新規ピシウム菌に関する。
　ピシウム属菌は世界各地の土壌や水域環境に広く分布し、これまで世界で１５０種以上、日本では約５０種が報告されている。ピシウム属菌の多くの種は、野菜をはじめ多くの作物の苗立枯れや根腐れを引き起こす重要な植物病原菌として知られている。このような植物病原菌として、ピシウム・ウルティマム（Pythium ultimum）やピシウム・アファニデルマータム（Pythium aphanidermatum）が挙げられる。
　上記植物病原性のピシウム属菌に対して拮抗性を示す細菌又は放線菌を利用して植物病の発生を抑制しようとすることが試みられている。例えば、特許文献１には、ストレプトミセス・ヘイミ(Streptomyces heimi)やストレプトミセス・フラベオラス(Streptomyces flaveolus)がピシウム・アファニデルマータムに対して拮抗性を示し、芝草病原菌の防除に有効であることが示されている。また、特許文献２には、シュードモナス・フルオレッセンス(Psedomonas fluorescens)がピシウム・アファニデルマータムやリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）などに対し拮抗性を示し、これらの湿菌体を芝草に直接散布するか、あるいは菌体をバーミキュライトやゼオライトなどに吸着させた吸着剤や堆肥原料に混ぜて得られた堆肥などを芝草に施し、植物病害防除材として使用できる旨が記載されている。
　上記の病原性ピシウム属菌に対して拮抗性を有するピシウム属菌の存在も知られている。例えば、非特許文献１には、ピシウム・オリガンドラム（Pythium oligandrum）がトマト根茎の腐敗病菌に対して拮抗性を示すことが記載されている。また、特許文献３には、ピシウム・オリガンドラムの細胞壁由来のタンパク質が多くの作物の根圏に定着して、作物に耐病性を誘導する能力を発揮することが記載されている。また、非特許文献２には、ピシウム・ナン(Pythium nunn)がピシウム・ウルティマムによる病害を抑制することが、非特許文献３には、ピシウム・ナンがフィトフトラ属菌（Phytophthora spp.）による病害を、非特許文献４には同菌がリゾクトニア属菌（Rhizoctonia solani）による病害をそれぞれ抑制することが記載されている。
　ところで、ピシウム属菌をはじめとする真菌類は、細胞の形態で分類されることが多い。例えば、ピシウム属菌が属する卵菌類においては、蔵卵器、卵胞子、造精器、遊走子嚢等の有無やそれらの形態によって分類されていた。しかしながら、こうした形態による分類には豊富な知識と熟練した技術が必要で、菌種の分類・同定に必要な特徴的な形質が現れない場合には分類・同定ができないし、培養に日数がかかるために分類・同定に長期間要することなどの理由により、近年では遺伝子解析により分類・同定することが試みられている。例えば、非特許文献５にはＤＮＡ塩基配列の解析により病原性真菌の分類・同定ができることが記載されている。これによると、ｒＤＮＡ（リボソーマルＤＮＡ）のＩＴＳ領域（Internal Transcribed Spacer領域）の塩基配列は、同一種内では９９％以上の同一性があり、それ未満であれば別種であるとされるので、ピシウム属菌の種の分類・同定においてはＩＴＳ領域及びｒＤＮＡのＬＳＵ（Large Subunit、２６～２８Ｓ）にあるＤ１／Ｄ２領域の塩基配列の解析で十分であると結論づけられている。また、非特許文献６には、ピシウム属菌について、ｒＤＮＡのＩＴＳ領域とミトコンドリアのクロームオキシダーゼII遺伝子の多型性に基づく分類・同定と上記細胞の形態に基づく分類が比較され、分類・同定には形態学的特徴だけでなく、遺伝子レベルの多型性分析が必要であると結論づけられている。さらに、非特許文献７では、ピシウム属菌について、ｒＤＮＡ（リボソーマルＤＮＡ）のＩＴＳ領域とＤ１／Ｄ２領域の塩基配列から分子系統解析を行い、形態学的分類との対比が試みられ結果、新たな系統群が見いだされている。
特開平６－１０７５１２号公報 特開平８－３２２５５６号公報 特開２００３－８１９９８号
Takenaka S et al., Phytopathology, 98(2008), p.187-195 Paulitz TC et al., Phytopathology, 77(1987), p.335-340 Fang JG et al., Phytopathology, 85(1995), p.29-36 Lifshitz et l.,  Phytopathology, 74(1984), p.1054-1061 杉田ら，Jpn. J. Med. Mycol., 45(2004), p55-58 Kajihara Y et al., Jpn. J. Phytopathol., 69(1), 2003, p.63 埋橋ら，日本菌学会大会公演要旨集，２００８，１３３頁
　本発明者らは、国内土壌中から分離した非病原性ピシウム菌について研究を進める中で、当該ピシウム菌が病原性のピシウム菌に対して拮抗作用を示すと共に、当該ピシウム菌が形態学的にはピシウム・ナンと同定されるにもかかわらず、詳細な遺伝子解析の結果からピシウム・ナンの標準菌とは異なる変種であることを見出した。
　すなわち、本発明は病原性ピシウム菌に対して拮抗性を有する新規なピシウム菌を提供し、当該ピシウム菌を用いて苗立枯病に代表される各種植物病害を防除することを目的としている。
　本発明のピシウム菌はｒＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列が配列番号１に示す塩基配列と同一性が９９％以上である新規なピシウム菌であり、本発明においては当該ピシウム菌を土壌に散布する等の方法により、苗立枯病の原因菌であるピシウム・ウルティマムなどで汚染された土壌中でこれらの病原性ピシウム菌による植物病害の防除を図る。
　本発明によると農薬などの化学物質による防除が困難な苗立枯病など植物病害の防除が図られる。
図１は分離されたピシウム・ナンの形態学的特性を示す顕微鏡観察による画像である。ａ～ｇはＵＺ０４１株を、ｈ～ｋはＵＺ４１５株を示す。ａは発芽管を有する胞子嚢、ｂは遊走子を持つ小胞、ｃは遊走子を放出した後の空の胞子嚢、ｄは菌糸の中間にある球状の隆起、ｅは突起を有する造卵器と膨らんだ柄を持つ造精器、ｆは３個の造精器を有する頂生の造卵器、ｇは鈎状の柄を持つ造精器を有する造卵器、ｈは菌糸の中間にある球状の無性繁殖器官、ｉは菌糸の終端にある球状の無性繁殖器官、ｊは膨らんだ柄を持つ造精器を持った頂生の造卵器、ｋは一つの突起を有し、鈎状の柄を持つ雌雄同株性の造精器と造卵器である。 図２は分離されたピシウム・ナンＵＺ０４１株及ＵＺ４１５株の生育速度と生育温度との関係を示す図である。 図３はピシウム・ナンにおけるＩＴＳ領域の塩基配列に基づく系統樹である。 図４ａは分離されたピシウム・ナン（ＵＺ０４１株）とピシウム・ウルティマムの間における菌間寄生性を示す顕微鏡観察による画像、図４ｂは分離されたピシウム・ナン（ＵＺ４１５株）とピシウム・ウルティマムの間における菌間寄生性を示す顕微鏡観察による画像である。ＰＵはピシウム・ウルティマムを、ＰＮはピシウム・ナンを示す。 図５は分離されたピシウム・ナンＵＺ０４１株及びＵＺ４１５株によるキュウリ立枯病の防除効果を示す画像である。ａはＵＺ０４１株を、ｂはＵＺ４１５株を、ｃはピシウム・ウルティマムのみを、ｄはピシウム・ウルティマムを感染させないコントロールを示す。 図６は土壌におけるピシウム・ナンＵＺ４１５株の菌密度変化を示す図であって、実線は緑肥を用いた場合を、破線は緑肥を用いない場合を示す。 図７はピシウム・ナンＵＺ０４１株及びＯＰＵ６４０株による赤焼病菌の発病抑制効果を示す画像である。各日におけるバーはそれぞれ左からP.nunn ＯＰＵ６４０株＋アカクローバ＋赤焼病菌、P.nunn ＵＺ０４１株＋アカクローバ＋赤焼病菌、P.nunn ＯＰＵ６４０株＋アカクローバ、P.nunn ＵＺ０４１株＋アカクローバ、無接種、無線種＋アカクローバ、アカクローバ＋赤焼菌を示す。 図８はピシウム・ナンＵＺ０４１株及びＯＰＵ６４０株による赤焼病菌の発病抑制効果（発病度）を示すグラフである。
　本発明のピシウム菌は新規のピシウム菌であって、ｒＤＮＡのＩＴＳ領域に配列番号１で示される塩基配列と同一性が９９％以上である塩基配列を有する。ここにおいて、ＩＴＳ領域とは、ｒＲＮＡ遺伝子の５.８Ｓサブユニットを含む領域であり、ｒＲＮＡ遺伝子の１８Ｓサブユニットと５.８Ｓサブユニットの間に存在するイントロン領域（ＩＴＳ１）と５.８Ｓサブユニットと２６Ｓサブユニットの間に存在するイントロン領域（ＩＴＳ２）及び５.８Ｓサブユニットを合わせた塩基配列（ＤＮＡ）を意味する。なお、本願における同一性は、ClustalW（Thompson et al., Nucleic Acids Res 24(1997), p.4876-7882）によって行ったアラインメントの結果による。
　本発明のピシウム菌は下記の形態学的性質を有する。既に非特許文献２において報告されているピシウム・ナン（ピシウム・ナン標準菌）と形態学的特徴が一致し、その生育適温もほぼ一致する。また、本発明のピシウム菌は、遺伝子系統解析においても既報のピシウム・ナンとの近縁性が高い。その一方、これまでに報告のない遊走子形成が認められ、菌糸の生育最適温度が３１℃と、既報のピシウム・ナンの３４℃に比べて低いという特徴を有することから、当該ピシウム菌はピシウム・ナン標準菌の同種内異型ないし変種であると認められた。本発明のピシウム菌は、長野県の畑土壌、福岡県のツゲ繁殖地の土壌、大阪府の畑土壌など各地の土壌から分離されたものであり、このうち長野県の畑土壌から分離された株はPythium nunn ＵＺ０４１株（受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１３３８）として、また、福岡県のツゲ繁殖地の土壌から分離された株はPythium nunn ＵＺ４１５株（受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１３３９）として、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（IPOD）に寄託された。これら３つの株は、形態学的特徴からピシウム・ナンと同定され、ＩＴＳ領域の塩基配列も同一であり、いずれも非病原性で病原性ピシウム菌に対する拮抗性も備えている。これらのことから、これら３つの菌株は同一の異型ないし変種であるといえる。
　〔形態学的性質〕
　　胞子嚢　　　　　　　　　球形又はほぼ球形に近い
　　胞子嚢の位置　　　　　　頂生又は中間生
　　菌糸の隆起形状　　　　　球形又は卵形若しくはレモン形状
　　球状無性器官の位置　　　頂生又は中間生
　　卵胞子の位置　　　　　　頂生又は中間生
　　卵胞子の充満性　　　　　非充満性
　　造精器の柄の形状　　　　鈎状又は膨状
　　造精器の雌雄同菌糸性　　雌雄同菌糸又は雌雄別菌糸
　　造卵器への着生数　　　　１～４個
　　菌糸の生育温度　　　　　１０～４０℃（最適温度　３１℃）
　本発明のピシウム菌は非病原性である。この菌は病原性を有する他のピシウム属菌、例えば、ピシウム・ウルティマム（Pythium ultimum）に拮抗性を有する。この性質を利用して、本発明のピシウム菌を含む製剤を植物病害の防除剤として利用できる。この防除剤の対象となる植物病害は、前記ピシウム・ウルティマムやピシウム・アファニデルマータム（Pythium aphanidermatum）などの病原性ピシウム属菌に起因する植物病害の他、ピシウム属菌以外の病原性を有する菌、例えばフザリウム（Fusarium）属菌、ゴイマノマイセス（Gaeumannomyces）属菌、リゾクトニア（Rhizoctonia）属菌、バーティシリウム（Verticillium）属菌、フィトフトラ（Phytophthora）属菌、スクレロチウム（Sclerotium）属菌、コルティシウム（Corticium）属菌、プラスモディオフォラ（Plasmodiophora）属菌、リゾプス属（Rhizopus）菌、トリコデルマ（Trichoderma）属菌、ミクロドチウム（Microdochium）属菌、スクレロチニア（Sclerotinia）属菌に由来する植物病害が例示される。
　本発明の植物病害防除剤は、上記ピシウム属菌を含有した製剤であって、菌体そのものに限らず、各種の媒体（例えば培養用培地や製剤用の賦形剤）に菌体を加えた組成物を含む意味で用いられる。組成物の形態も液状組成物であるか固形状組成物であるか問わない。従って、培養後、集菌した菌体を利用する場合のみならず、集菌せずに培養した培地（液体培地、固体培地を問わない）をそのまま利用する場合でもよい。本発明の防除剤として、集菌の有無を問わず、培養した菌体をバーミキュライトやパーライト、培養土、ピートモスなどの固形状の媒体と混合した組成物、液肥や培地のような液状の媒体に菌体を混合した組成物が例示される。さらに、本発明のピシウム菌の拮抗性を減じない限りにおいて、本発明以外の植物病害防除性を有する微生物菌体を含有してもよく、苗立枯病などの各種植物病害に効果があるとされる薬剤、例えば、プロパモカルブ塩酸塩やヒドロキシイソキサゾールなどを、やはり本発明のピシウム菌の拮抗性を減じない限りにおいて、混合してもよい。
　本発明の植物病害防除剤の対象となる植物も特に限定されるものではなく、キュウリ・キャベツ・ホウレンソウ・ダイコン・ナスなどの食用植物、キク、アスターなどの観賞用植物、芝草などが例示される。
　植物病害防除剤として利用する場合、その菌体濃度は、防除剤の形態や目的とする植物病害に応じて適宜調整されるが、土壌１ｇ当たりの散布菌数が１×１０２～１×１０６ｃｆｕ（コロニー形成単位）程度、好ましくは１×１０３～１×１０５となるように調整される。
　本発明の土壌改良方法は本発明に係るピシウム菌を土壌に混入し、増殖させる方法である。これにより、土壌中に存在する病原性の糸状菌、特に病原性ピシウム属菌の増殖を抑制し、あるいは増殖した病原性糸状菌を減少させ、健全な土壌に回復して植物病害から植物を保護する。混入させる方法も特に限定されるものではなく、集菌した菌体や菌体を含む培地など前記防除剤を適宜土壌中に混入させればよい。また、植物が栽培されている土壌においてピシウム菌を増殖させ、対象作物の根圏に定着せしめることにより、植物病害を防除する。
　土壌中で本発明のピシウム菌を増殖させるために対象土壌に新鮮有機物を施肥するのが好ましい。本願において新鮮有機物とは、緑肥のように土壌にすき込むことによって土壌の肥料となる堆肥化していない有機物を意味し、緑肥の他には例えばおからや油かすなどが例示される。この中でも緑肥が好ましく施肥される。緑肥とは、エンバクやクローバ、レンゲソウ、ライ麦、エビスクサ、キュウリ、大豆のように対象となる土壌にて栽培され、栽培後収穫することなく土壌にすき込むことによって土壌の肥料となる堆肥化していない新鮮な植物体をいう。施肥する緑肥はこのような植物体であればいずれであってもよい。新鮮有機物を施肥する場合、本発明のピシウム菌を散布する時期は施肥の前後を問わない。また、緑肥を施肥する場合も、本発明のピシウム菌を散布する時期は、緑肥となる植物の栽培開始前、栽培途中を問わず、また、緑肥として土壌へすき込みするのと同時であってもよく、緑肥のすき込みをした後に本発明のピシウム菌を散布してもよい。
　本発明は、田畑の土壌などに本発明のピシウム菌を予め散布、増殖させた上で、ピシウム菌を含有した植物栽培用土壌としても提供される。本発明の植物苗は、当該植物栽培用土壌において、植物種子を発芽させ、または生育させたものである。また、本発明の植物苗は本発明のピシウム・ナンの菌体を含む植物病害防除剤を添加した土壌で発芽又は生育させることによっても提供される。これらの植物苗は発芽又は生育させた土壌に植え込んだまま提供されることもあり、前記植物栽培用土壌若しくは前記植物病害防除剤を添加した土壌を入れた栽培用ポットにおいて発芽又は生育させたいわゆるポット苗としても提供される。
　これら本発明の植物苗を発芽又は生育させる土壌中には、土壌１ｇ当たりの菌数が１×１０２～１×１０６ｃｆｕ（コロニー形成単位）程度、好ましくは１×１０３～１×１０５に調整されるように、本発明のピシウム菌を添加するか、本発明の植物病害防除剤を添加する。また、対象となる植物苗は特に限定されるものではなく、キュウリ・キャベツ・ホウレンソウ・ダイコン・ナスなどの食用植物、キク、アスターなどの観賞用植物、芝草などが例示される。
　本発明の植物種子は、本発明のピシウム・ナンの菌体を含むコーティング剤によってコーティングされたものである。当該コーティング剤はコーティング用基剤にピシウム・ナンを含ませたものであり、本発明のピシウム菌の拮抗性を減じない限りにおいて、公知である種々のコーティング基剤を用いることができる。当該コーティング用基剤として、ＰＶＡ、ＣＭＣ、ＭＣ、ゼラチン、デンプン、プルランなどの水溶性バインダー（結合剤）や、けいそう土、赤土、炭酸カルシウム、パーライト、タルク、クレー、カリオンなどの粉体材料（無機物）が例示される。コーティング方法は種子に菌体が付着できる方法であれば特に限定されるものでなく、前記バインダーや前記粉体材料と菌体並びに水などの媒体を混合し、当該混合物を種子の表面にスプレーや塗布した後乾燥させる方法、前記混合物中に種子を浸漬して種子表面に混合物を付着させる方法が例示される。このとき、種子の表面が皮膜（コーティング層）で完全に覆われる必要もなく、部分的に皮膜が付着した状態であっても差し使えない。菌体が付着した種子が播種されることにより、付着した菌体が播種された土壌にて増殖するからである。また、対象となる植物種子は特に限定されるものではなく、キュウリ・キャベツ・ホウレンソウ・ダイコン・ナスなどの食用植物の種子、キク、アスターなどの観賞用植物の種子、芝草の種子などが例示される。コーティング剤中には、コーティング剤１ｇ当たりの菌数が１×１００～１×１０５ｃｆｕ（コロニー形成単位）程度、好ましくは１×１０１～１×１０３に調整される。
　〔ピシウム菌の分離〕
　日本国内３カ所の土壌からピシウム菌を分離した。使用した土壌は、長野県上田市の畑土壌、福岡県福岡市のツゲ繁殖地の土壌及び大阪府の畑土壌である。これらの土壌から、菌を捕捉するための基質（捕捉基質）としてピーマンの種子、キュウリの種子及びジャガイモ（芋）を用いた捕捉法（Watanabe 1981）によりそれぞれピシウム菌を分離した。各土壌中に捕捉基質を埋め込み、２０～３０℃で２４～４８時間培養した後、土壌から捕捉基質を取り出し流水で洗浄し、乾燥させた。この捕捉基質を水寒天培地上で培養し、増殖した菌糸を分離した。分離した菌は、コーンミール寒天培地（ＣＭＡ培地：Tojoら 1998）で培養した。長野県の土壌から分離された株はピシウム・ナン（Pythium nunn）ＵＺ０４１株（受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１３３８）として、福岡県の土壌から分離された株はピシウム・ナン（Pythium nunn）ＵＺ４１５株（受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１３３９）として、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託された。また、分離した菌は、potato-carrot-agar培地（ＰＣＡ培地：van der Plaats-Niterink AJ, Stud. Mycol. 21(1981), p.1-242）にて培養・保存し、これを下記試験の供試菌とした。
　〔ピシウム属菌の形態観察〕
　分離したピシウム・ナンの形態観察を、van der Plaats-Niterink(van der Plaats-Niterink AJ, Stud. Mycol. 21(1981), p.1-242)に記載の項目について行った。芝葉片水培地（grass-leaf water culture：van der Plaats-Niterink AJ, Stud. Mycol. 21(1981), p.1-242）上で約２５℃で１～１０日間培養後、胞子嚢、造卵器、造精器の大きさを測定した。その結果を表１に、その顕微鏡観察による画像を図１に示す。また、芝葉片水培地上で４～４０℃の３℃間隔で培養して成長速度を測定したところ、図２に示す結果が得られた。なお、大阪府の畑土壌から分離されたピシウム菌も同様な結果を示した。
　分離されたピシウム・ナンは、遊走子の形成が見られた点において、非特許文献４において報告されているピシウム・ナンと異なっていたが、形態学的にはその他に異なる点はなかった。また、分離された菌株の菌糸の生育至適温度は３１℃であり、報告されているピシウム・ナン標準菌の至適温度に比べて３℃ほど低かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　〔ピシウム菌の遺伝子解析〕
　長野県、福岡県、大阪府の土壌から分離された３つの菌株についてそれぞれ遺伝子解析を行った。遺伝子解析は５.８ＳｒＤＮＡを含むＩＴＳ領域及びＬＳＵ（Large Subunit：２５～２８ｓ）ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域について行った。ＩＴＳ領域の増幅には、配列番号２で示される塩基配列を有するプライマーＩＴＳ５及び配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーＩＴＳ４（いずれもWhite et al., Academic Press, 1990, p.315-322　参照）を、Ｄ１／Ｄ２領域の増幅には、配列番号４で示される塩基配列を有するプライマーＮＬ１及び配列番号５で示される塩基配列を有するプライマーＮＬ４（いずれもO'Donnell CAB International, 1993 p.225-233）を用いた。また、ＤＮＡの抽出及びＰＣＲは、Uzuhashiらの方法（Uzuhashi et al., Mycoscience 49(2008), p.276-279）に従った。
　５.８ＳｒＤＮＡ領域を含むＩＴＳ領域の塩基配列（８７５ｂｐ）を配列番号１として示した。解析を行った３つの菌株のＩＴＳ領域の塩基配列は全く同じであった。この５.８ＳｒＩＴＳ領域の塩基配列について、既に報告されているピシウム・ナン標準菌の塩基配列（GenBank 遺伝子登録番号ＡＹ598709）と比較すると９８.６％の同一性があった。また、解析を行った３つの菌株のＤ１／Ｄ２領域の塩基配列は全く同じであり、ピシウム・ナン標準菌のそれとも全く同じであった。なお、同一性はClustalW（Thompson et al., Nucleic Acids Res 24(1997), p.4876-7882）によって行ったアラインメントの結果による。
　図３は分離されたピシウム・ナンを含む各種ピシウム属菌のＩＴＳ領域のＤＮＡに基づく系統樹である。この系統樹はＲＡｘＭＬプログラム（Stamatakis, Bioinfomatucs 22(2006), p2688-2690）によって作成された、この系統樹からもわかるように、分離された３株のピシウム・ナンは、前記ＩＴＳ領域の塩基配列に基づけば他のピシウム・ナンから分離して位置づけられ、他のピシウム・ナンとは異なるグループに属する。
　〔ピシウム属菌の病原性〕
　分離されたピシウム・ナンＵＺ４１５株について植物病原性について調べた。供試植物としてキュウリ（品種:地這）、キャベツ（品種：キャベツ）およびバミューダグラス（品種：サンデビル）を用いた。各供試菌の培養菌叢（微生物叢）を市販の育苗用土（愛菜１号：片倉チッカリン株式会社製）に混和し、組織培養用プレートに入れて、プレートの各ウェルに供試植物種子を播種した。二重ポリエチレン製のバックに入れた後、２８℃の植物育成器内に静置して５日後に苗立枯率を調べた。キュウリ及びキャベツについての結果を表２に示す。これによると、分離されたピシウム・ナンＵＺ４１５株は供試植物に対して苗立枯れや生育阻害を起こさなかった。しかし、これらの菌は供試植物の根に感染し、その表皮細胞中に卵胞子を形成した。また、バミューダグラスに対しても病原性を示さなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　〔ピシウム・ウルティマムに対する菌種間寄生性〕
　非病原菌としてピシウム・ナンＵＺ４１５株を、病原菌としてピシウム・ウルティマムのＯＰＵ７７４株（Kida et al., Plant Pathol, 56(2007),p1042）を用いた。菌糸の接触を観察しやすくするためＣＭＡ寒天培地の表面をセロファンで覆い、その上に非病原菌と病原菌を対峙させて接種した。２５℃で３日間培養後、両菌の菌叢の接触部分を顕微鏡で観察した結果を図４ａ、ｂに示す。双方の画像に示されるように非病原菌P.nunnの菌糸がP. ultimumの菌糸内に侵入し、宿主菌糸の原形質を消失させる現象が観察された。
　〔病原性ピシウム属菌への拮抗作用〕
　　（キュウリ苗立枯病の抑制効果）
　　病原性ピシウム属菌への拮抗性としてキュウリ苗立枯病の抑制効果を調べた。非病原菌としてピシウム・ナンＵＺ０４１株とＵＺ４１５株を用いた。病原菌としてピシウム・ウルティマムのＯＰＵ７７４株を用いた。各菌株を市販の育苗用土（愛菜１号：片倉チッカリン株式会社製）に混和した混和土壌を作製し、素焼鉢に病原菌混和土壌、非病原菌混和土壌、病原菌混和土壌の順に土壌を入れた。キュウリ種子７粒を非病原菌混和土壌の層に播種し、二重ポリエチレン製のバッグに入れて２５℃の植物育成器内で育成し、播種の４日後に健全な植物個体の数を調べた。その結果を表３及び図５に示す。ピシウム・ナン処理区の播種４日後では、健全個体数がピシウム・ウルティマムのみの接種区と比べて有意に(P<0.05)多かった。しかし、播種１０日後にはピシウム・ウルティマムのみの接種区との間で有意な差が見られなくなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　　（土壌中での密度変化）
　　ピシウム・ナンＵＺ４１５株を市販の育苗用土（愛菜１号：片倉チッカリン株式会社製）に混和した混和土壌を作製し、二重ポリエチレン製のバッグに入れて２５℃の植物育成器内に静置した。混和１日後から１１日目、２１日目、３１日目にピシウム属菌選択培地を用いた希釈平板法で菌密度を測定した。その結果、混和の１日後から２１日にかけて菌密度の増加が見られ、その後減少する傾向が観察された。さらに、それぞれの混和土壌にキュウリ種子を播種し、同様の方法で土壌中の菌密度を測定した。その結果を図６に示す。植物体の存在しない土壌中よりも格段に菌密度が高くなった。このように、緑肥となりえる植物体と共に培養することにより、緑肥がない場合に比べて土壌中の菌密度が高まり、病原性菌類の増加を抑えることが期待される。
　〔ピシウム・ナンのクリーピングベントグラス赤焼病に対する抑制効果の評価〕
　（供試植物の作製）
加圧滅菌（２気圧、１８０℃）した素焼鉢（直径約８０ｍｍ，高さ約８０ｍｍ）の底にネットを敷き、オートクレーブ（１２１℃、２０分）によって滅菌した砂土を上縁部まで入れた。素焼鉢１ポットあたり１つまみ程度の石灰を砂土に混ぜ込んだ。この素焼鉢をプラスチック製に並べ、容器内に水道水を注いで完全に吸水させた。その後、低温乾燥下で保存していたクリーピングベントグラス（Agrostis palustris）の種子を均一になるように砂土に振りかけ、上から霧吹きで水を種子に十分吹き付けた。素焼鉢を８～１０個並べたプラスチック製の容器に水を底から１ｃｍ程度まで入れ、容器に蓋をして容器内を過湿状態にした。蓋をした状態でプラスチック製の容器を植物育生器内（２４時間明期、２５℃）に置き、種子が発芽して草丈が約１０ｍｍに生えそろう６～１０日後に蓋を外した。その後、植物育成期内でさらに育生し、種子を播種してから約３週間後に７０％エタノールで滅菌したハサミで、草丈が１０ｍｍ程度になるように刈り込んだ。切りかすが葉の表面等に残らないように、吸い口に７０％エタノールを吹きかけた掃除機で吸った後、再びプラスチック容器内に戻してさらに約１週間育生した。
　（接種源の作製）
　クリーピングベントグラスの種子を播種してから約３週間後に刈り込んだ際に得られた葉片２ｇとイオン交換水５０ｍｌを５００ｍｌ容の亀の甲ビンに入れてオートクレーブ処理（１２１℃、２０分）した。供試菌であるPythium nunn（ＵＺ０４１株）、前記大阪府で採取されたPythium nunn（ＯＰＵ６４０株）と赤焼病菌P. aphanidermatum（中部地方のベントグラスから分離された株：ＯＰＵ３４４株）をコーンミール寒天（ＣＭＡ）培地（スイートコーン５０ｇ、ニボシ２ｇ、粉末寒天１７ｇ、イオン交換水１,０００ｍｌ）を使用して２８℃で約３日間前培養した。このようにして前培養により伸びてきた３種類の菌株の菌糸をそれぞれ約１ｃｍ四方に３つずつ切り取った。５００ｍｌ容の亀の甲ビンに入れたクリーピングベントグラスの葉片上に、３つずつ切り取った培地片を菌株ごとに置いて接種した。無接種の比較対象として、供試菌の代わりに無菌のＣＭＡ培地片を置いたものを設けた。その後、２８℃の暗黒下で約１週間培養した。
　（緑肥の調製）
　大阪府立大学教育研究フィールド内でアカクローバ（Trifolum pratense）を採取し、新聞紙の上に広げて約１か月間風乾した。その後、ミルサー（IFM-650D/655D、Iwatani、Tokyo、Japan）で粉砕し、２ｍｍ四方のふるいにかけて粉末状にした。粉末状にしたアカクローバは施用直前に０.５ｇずつ薬包紙に包んで供試するまで－２０℃で保存した。
　（ポットレベルでのPythium nunnのクリーピングベントグラス赤焼病に対する抑制効果の評価）
　接種の直前に上記と同様にして草丈が１０ｍｍ程度になるように刈り込んだ。上記方法で作製した粉末状のアカクローバを供試植物の根元に１ポット（素焼鉢）あたり０.５gずつ均等に撒いた。あらかじめオートクレーブ（１２０℃、２０分）で滅菌した０.１％の素寒天ゲル（イオン交換水１,０００ｍｌ、粉末寒天１ｇ）を１,０００ｍｌビーカーに５００ｍｌずつ入れた。２８℃の暗黒下で１週間培養したPythium nunnの接種源である２種類の菌株（ＯＣＵ６５０株、ＵＺ０４１株）及び無接種比較用の培地をそれぞれビーカーに入れて懸濁させてハンドミキサー（Household Blending mixer model:Ha-3058）を使って攪拌した。その接種源を素焼鉢１つあたり３０ｍｌずつ植物体の上面に散布して、素焼鉢１つずつをポリ袋で密封した。密封した素鉢は植物育生器（昼温３０℃、明期１２時間、夜温２５℃、暗期１２時間、明期時の照度３８.４μmol／ｍ2／s）内に置いた。その５日後に０.１％素寒天ゲル（イオン交換水１,０００ｍｌ、粉末寒天１ｇ）と懸濁したP. aphanidermatum（ＯＰＵ３４４株）及び無接種比較用の培地を素焼鉢１つあたり３０ｍｌずつ植物体の上面に散布し、再びポリ袋をかけて密封し、植物育生器内に戻した。赤焼病菌の接種の３、５及び７日後に、カメラ（D80, Nikon, Tokyo, Japan）でポットの真上から写真を撮影した。その画像を図７に示す。また、写真画像をソフトウェア（Motic Images Plus 2.2ML, Motic, Hong Kong）を使用してクリーピングベントグラスの退色や腐敗といった病徴が見られた植物体の罹病面積を測定した。試験は１試験区につき１０ポットを用いて行った。また、測定した罹病面積の統計処理はTukey-KramerのHSD test（p <０.０５）を用いて有意差検定を行った。その結果を図８に示す。この結果のとおり、本発明のピシウム菌は赤焼病菌による感染に対しても優れた発病効果を示す。
　本発明によると、ピシウム・ウルティマムのような植物病原性を有する糸状菌に対して拮抗性を有する新規なピシウム菌が提供される。この菌の利用により、苗立枯病や赤焼病などピシウム菌に対する植物病害防除剤が提供される。
[規則26に基づく補充 11.04.2011]　
Figure WO-DOC-RO134a
[規則26に基づく補充 11.04.2011]　
Figure WO-DOC-RO134b

Claims (15)

  1. 　ｒＤＮＡのＩＴＳ領域に配列番号１に示された塩基配列と９９％以上の同一性がある塩基配列を有するピシウム・ナン。
  2. 　ピシウム・ウルティマムに対して拮抗性を有する請求項１に記載のピシウム・ナン。
  3. 　財団法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１３３８又は受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１３３９で寄託されたピシウム・ナン。
  4. 　請求項１～３の何れか１項に記載のピシウム・ナンの菌体を含有する植物病害防除剤。
  5. 　ピシウム菌による病害に対する請求項４に記載の植物病害防除剤。
  6. 　請求項１～３の何れか１項に記載のピシウム・ナンを増殖させた栽培用土壌。
  7. 　請求項４又は請求項５に記載の植物病害防除剤を添加した栽培用土壌。
  8. 　請求項１～３の何れか１項に記載のピシウム・ナンを土壌中で増殖させる土壌改良方法。
  9. 　併せて新鮮有機物を施肥する請求項８に記載の土壌改良方法。
  10. 　前記新鮮有機物は緑肥である請求項９に記載の土壌改良方法。
  11. 　請求項１～３の何れか１項に記載のピシウム・ナンの菌体を含むコーティング剤でコーティングされた植物種子。
  12. 　請求項１～３の何れか１項に記載のピシウム・ナンを含む土壌で発芽又は生育させた植物苗。
  13. 　請求項４又は５に記載の植物病害防除剤を含む土壌で発芽又は生育させた植物苗。
  14. 　請求項６又は７に記載の土壌と植物苗とで構成されるポット苗。
  15. 　前記植物苗がキュウリ苗、トマト苗、クローバ苗、エンバク苗の何れかである請求項１２又は１３に記載の植物苗若しくは請求項１４に記載のポット苗。
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