JP2012005426A - 新規ピシウム菌 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】rDNAの5.8Sを含むITS領域に特定の塩基配列を有する、ピシウム・ナン。ピシウム・ウルティマムのような病原性を有するピシウム属菌に対して拮抗性を有する、ピシウム・ナン。該菌をピシウム・ウルティマムなどの病原性菌が生息する土壌に散布して、立枯病などの植物病害を防除する。
【選択図】図5
Description
胞子嚢 球形又はほぼ球形に近い
胞子嚢の位置 頂生又は中間生
菌糸の隆起形状 球形又は卵形若しくはレモン形状
球状無性器官の位置 頂生又は中間生
卵胞子の位置 頂生又は中間生
造精器の充満性 充満性
造精器の柄の形状 鈎状又は膨状
造精器の雌雄同菌糸性 雌雄同菌糸又は雌雄別菌糸
造卵器への着生数 1〜4個
菌糸の生育温度 10〜40℃(最適温度 31℃)
日本国内3カ所の土壌からピシウム菌を分離した。使用した土壌は、長野県上田市の畑土壌、福岡県福岡市のツゲ繁殖地の土壌及び大阪府の畑土壌である。これらの土壌から、菌を捕捉するための基質(捕捉基質)としてピーマンの種子、キュウリの種子及びジャガイモ(芋)を用いた捕捉法(Watanabe 1981)によりそれぞれピシウム菌を分離した。各土壌中に捕捉基質を埋め込み、20〜30℃で24〜48時間培養した後、土壌から捕捉基質を取り出し流水で洗浄し、乾燥させた。この捕捉基質を水寒天培地上で培養し、増殖した菌糸を分離した。分離した菌は、コーンミール寒天培地(CMA培地:Tojoら 1998)で培養した。長野県の土壌から分離された株はピシウム・ナン(Pythium nunn)UZ041株(受領番号:FERM AP−21976)として、福岡県の土壌から分離された株はピシウム・ナン(Pythium nunn)UZ415株(受領番号:FERM AP−21977)として、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託された。また、分離した菌は、potato-carrot-agar培地(PCA培地:van der Plaats-Niterink AJ, Stud. Mycol. 21(1981), p.1-242)にて培養・保存し、これを下記試験の供試菌とした。
分離したピシウム・ナンの形態観察を、van der Plaats-Niterink(van der Plaats-Niterink AJ, Stud. Mycol. 21(1981), p.1-242)に記載の項目について行った。芝葉片水培地(grass-leaf water culture:van der Plaats-Niterink AJ, Stud. Mycol. 21(1981), p.1-242)上で約25℃で1〜10日間培養後、胞子嚢、造卵器、造精器の大きさを測定した。その結果を表1に、その顕微鏡観察による画像を図1に示す。また、芝葉片水培地上で4〜40℃の3℃間隔で培養して成長速度を測定したところ、図2に示す結果が得られた。なお、大阪府の畑土壌から分離されたピシウム菌も同様な結果を示した。
長野県、福岡県、大阪府の土壌から分離された3つの菌株についてそれぞれ遺伝子解析を行った。遺伝子解析は5.8SrDNAを含むITS領域及びLSU(Large Subunit:25〜28s)rDNAのD1/D2領域について行った。ITS領域の増幅には、配列番号2で示される塩基配列を有するプライマーITS5及び配列番号3で示される塩基配列を有するプライマーITS4(いずれもWhite et al., Academic Press, 1990, p.315-322 参照)を、D1/D2領域の増幅には、配列番号4で示される塩基配列を有するプライマーNL1及び配列番号5で示される塩基配列を有するプライマーNL4(いずれもO'Donnell CAB International, 1993 p.225-233)を用いた。また、DNAの抽出及びPCRは、Uzuhashiらの方法(Uzuhashi et al., Mycoscience 49(2008), p.276-279)に従った。
分離されたピシウム・ナンUZ415株について植物病原性について調べた。供試植物としてキュウリ(品種:地這)、キャベツ(品種:キャベツ)およびバミューダグラス(品種:サンデビル)を用いた。各供試菌の培養菌叢(微生物叢)を市販の育苗用土(愛菜1号:片倉チッカリン株式会社製)に混和し、組織培養用プレートに入れて、プレートの各ウェルに供試植物種子を播種した。二重ポリエチレン製のバックに入れた後、28℃の植物育成器内に静置して5日後に苗立枯率を調べた。キュウリ及びキャベツについての結果を表2に示す。これによると、分離されたピシウム・ナンUZ415株は供試植物に対して苗立枯れや生育阻害を起こさなかった。しかし、これらの菌は供試植物の根に感染し、その表皮細胞中に卵胞子を形成した。また、バミューダグラスに対しても病原性を示さなかった。
非病原菌としてピシウム・ナンUZ415株を、病原菌としてピシウム・ウルティマムのOPU774株(Kida et al., Plant Pathol, 56(2007),p1042)を用いた。菌糸の接触を観察しやすくするためCMA寒天培地の表面をセロファンで覆い、その上に非病原菌と病原菌を対峙させて接種した。25℃で3日間培養後、両菌の菌叢の接触部分を顕微鏡で観察した結果を図4a、bに示す。双方の画像に示されるように非病原菌P.nunnの菌糸がP. ultimumの菌糸内に侵入し、宿主菌糸の原形質を消失させる現象が観察された。
(キュウリ苗立枯病の抑制効果)
病原性ピシウム属菌への拮抗性としてキュウリ苗立枯病の抑制効果を調べた。非病原菌としてピシウム・ナンUZ041株とUZ415株を用いた。病原菌としてピシウム・ウルティマムのOPU774株を用いた。各菌株を市販の育苗用土(愛菜1号:片倉チッカリン株式会社製)に混和した混和土壌を作製し、素焼鉢に病原菌混和土壌、非病原菌混和土壌、病原菌混和土壌の順に土壌を入れた。キュウリ種子7粒を非病原菌混和土壌の層に播種し、二重ポリエチレン製のバッグに入れて25℃の植物育成器内で育成し、播種の4日後に健全な植物個体の数を調べた。その結果を表3及び図5に示す。ピシウム・ナン処理区の播種4日後では、健全個体数がピシウム・ウルティマムのみの接種区と比べて有意に(P<0.05)多かった。しかし、播種10日後にはピシウム・ウルティマムのみの接種区との間で有意な差が見られなくなった。
ピシウム・ナンUZ415株を市販の育苗用土(愛菜1号:片倉チッカリン株式会社製)に混和した混和土壌を作製し、二重ポリエチレン製のバッグに入れて25℃の植物育成器内に静置した。混和1日後から11日目、21日目、31日目にピシウム属菌選択培地を用いた希釈平板法で菌密度を測定した。その結果、混和の1日後から21日にかけて菌密度の増加が見られ、その後減少する傾向が観察された。さらに、それぞれの混和土壌にキュウリ種子を播種し、同様の方法で土壌中の菌密度を測定した。その結果を図6に示す。植物体の存在しない土壌中よりも格段に菌密度が高くなった。このように、緑肥となりえる植物体と共に培養することにより、緑肥がない場合に比べて土壌中の菌密度が高まり、病原性菌類の増加を抑えることが期待される。
胞子嚢 球形又はほぼ球形に近い
胞子嚢の位置 頂生又は中間生
菌糸の隆起形状 球形又は卵形若しくはレモン形状
球状無性器官の位置 頂生又は中間生
卵胞子の位置 頂生又は中間生
卵胞子の充満性 非充満性
造精器の柄の形状 鈎状又は膨状
造精器の雌雄同菌糸性 雌雄同菌糸又は雌雄別菌糸
造卵器への着生数 1〜4個
菌糸の生育温度 10〜40℃(最適温度 31℃)
日本国内3カ所の土壌からピシウム菌を分離した。使用した土壌は、長野県上田市の畑土壌、福岡県福岡市のツゲ繁殖地の土壌及び大阪府の畑土壌である。これらの土壌から、菌を捕捉するための基質(捕捉基質)としてピーマンの種子、キュウリの種子及びジャガイモ(芋)を用いた捕捉法(Watanabe 1981)によりそれぞれピシウム菌を分離した。各土壌中に捕捉基質を埋め込み、20〜30℃で24〜48時間培養した後、土壌から捕捉基質を取り出し流水で洗浄し、乾燥させた。この捕捉基質を水寒天培地上で培養し、増殖した菌糸を分離した。分離した菌は、コーンミール寒天培地(CMA培地:Tojoら 1998)で培養した。長野県の土壌から分離された株はピシウム・ナン(Pythium nunn)UZ041株(受託番号:FERM BP−11338)として、福岡県の土壌から分離された株はピシウム・ナン(Pythium nunn)UZ415株(受託番号:FERM BP−11339)として、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託された。また、分離した菌は、potato-carrot-agar培地(PCA培地:van der Plaats-Niterink AJ, Stud. Mycol. 21(1981), p.1-242)にて培養・保存し、これを下記試験の供試菌とした。
Claims (15)
- rDNAのITS領域に配列番号1に示された塩基配列と99%以上の同一性がある塩基配列を有するピシウム・ナン。
- ピシウム・ウルティマムに対して拮抗性を有する請求項1に記載のピシウム・ナン。
- 財団法人産業技術創業研究所特許生物寄託センター受領番号FERM AP−21976又は受領番号FERM AP−21977で寄託されたピシウム・ナン。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載のピシウム・ナンの菌体を含有する植物病害防除剤。
- 苗立枯病に対する請求項4に記載の植物病害防除剤。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載のピシウム・ナンを増殖させた栽培用土壌。
- 請求項4又は請求項5に記載の植物病害防除剤を添加した栽培用土壌。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載のピシウム・ナンを土壌中で増殖させる土壌改良方法。
- 併せて新鮮有機物を施肥する請求項8に記載の土壌改良方法。
- 前記新鮮有機物は緑肥である請求項9に記載の土壌改良方法。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載のピシウム・ナンの菌体を含むコーティング剤でコーティングされた植物種子。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載のピシウム・ナンを含む土壌で発芽又は生育させた植物苗。
- 請求項4又は5に記載の植物病害防除剤を含む土壌で発芽又は生育させた植物苗。
- 請求項6又は7に記載の土壌と植物苗とで構成されるポット苗。
- 前記植物苗がキュウリ苗、トマト苗、クローバ苗、エンバク苗の何れかである請求項12又は13に記載の植物苗若しくは請求項14に記載のポット苗。
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