WO2011153678A1

WO2011153678A1 - 含有环烯醚萜类化合物的组合物及其用途

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Publication number: WO2011153678A1
Application number: PCT/CN2010/002049
Authority: WO
Inventors: 李林; 尹琳琳; 张兰; 王文; 张如意
Original assignee: 首都医科大学宣武医院
Priority date: 2010-06-11
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2011-12-15
Also published as: EP2581087A4; CA2802125C; EP2581087B1; CN101843630B; US20130116205A1; CN101843630A; EP2581087A1; CA2802125A1; US9233116B2

Description

含有环烯醚萜类化合物的组合物及其用途技术领域

本发明涉及含有环烯醚萜类化合物的组合物用于预防或治疗神经系统疾病的新用途、含有所述组合物的药物合物，和用所述化合物或药物组合物治疗或预防神经系统疾病的方法。背景技术

髓鞘是包裹于有鞘神经纤维轴索外面由髓鞘细胞所构成的一层脂质细胞膜，其主要生理功能是对神经轴索起 "绝缘" 、保护作用，并有利于神经沖动的快速传导。脱髓鞘病是一组以神经纤维的髓鞘脱失为主要病理改变的疾病，既可累及中枢神经系统，也可累及周围神经系统。这类疾病的主要病理特点为：（1 )神经纤维髓鞘破坏，呈多发性小的播散性病灶，或由一个或多个病灶融合而成较大病灶；（2 )脱髓鞘病损分布于脑白质、脊髓或周围神经，沿小静脉周围炎性细胞的袖套状浸润。这类疾病包括多发性硬化、视神经脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、弥漫性硬化、同心圆硬化、脑白质营养不良、脑桥中央髓鞘溶解症、急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病等；以及由其他原因所引起的脱髓鞘病变，包括但不仅于缺血-缺氧性病引起的白质脑病、营养缺乏性疾病引起的亚急性联合变性、病毒感染引起的亚急性硬化性全脑炎或进行性多灶性白质脑病、糖尿病性神经病（该病多以脱髓鞘改变为主）、系乡克性红斑狼疮的神经病变（该病变以脱髓鞘改变为主）等。研究有效的减轻髓鞘脱失和促进髓鞘修复的药物，可以为防治各种原因导致的中枢和周围神经系统脱髓鞘疾病提供重要的手段。环烯醚萜类化合物（I r ido ids)是一类特殊的单萜化合物，其母

C-8 indoid C-9 iridoid (the 9th C on C-4) C-9 iridoid (the 9th C on C-3) oid

1. 环烯醚萜的基本骨架环烯醚萜分子中， d-OH 很活泼，易与糖结合，天然存在的环烯醚萜多为苷，且多为 D-葡萄糖苷。包含但不仅有：

(1)普通环浠醚萜苷： ① C-8环烯醚萜苷。 ② C- 9环烯醚萜苷 (笫 9个 C接在 C- 4上)。③ C- 9环烯醚萜苷（第 9个 C接在 C-8上）。 ④ C-10环烯醚萜苷。如莫诺苷、马钱素、 6， -乙酰车叶草苷、栀子苷、梓醇、黄蝉花素、黄蝉花定、车叶草苷、桃叶珊瑚苷、梓苷、去氧番木鳖苷、京尼平、鸡蛋花素、马鞭草苷、金吉苷。

(2) 裂环环烯醚萜苷：如龙胆苦苷、龙胆苦酯苷，开联番木鳖苷、獐芽菜苦素等。

(3) Va ler i ana型环烯醚萜，如 7，10， 2， -3乙酰败酱甙、和 10-乙酰败酱甙。

(4) P lumer i a型环烯醚萜：如枸桔苷 A。

(5) 3， 10位间形成氧桥的环烯醚萜，如 3， 10位间形成氧桥的环烯醚萜苷新月苷 B。

(6) 荆芥内酯相关类型环烯醚萜，有紫苷。

(7) 变形的类环烯醚萜，例如新月苷 A， B、 8位有三元氧螺环结构的枸桔苷 B。

(8)由几个环烯醚萜直接经酯键或由萜类、酚类连接而成。如缬草醚酯、去乙酰车叶草苷酸曱酯等。本发明的发明人通过对莫诺苷和马钱素等环烯醚 ^类化合物广泛而深入的研究，发现环烯醚萜类化合物具有减轻神经系统髓鞘脱失和炎性细胞侵润、促进髓鞘形成和修复等作用，因而完成了本发明。发明内容

本发明一方面提供了环烯醚萜类化合物例如莫诺苷和 /或马钱素在制备防治神经系统脱髓鞘疾病的药物中的用途。本发明另一方面也提供了含有环烯醚萜类化合物的药物组合物以及用所述化合物或组合物治疗神经系统脱髓鞘疾病的方法。

更具体地说，按照本发明的一种实施方式，本发明提供了

1. 含有环烯醚萜类化合物的组合物在制备减轻或修复神经系统髓鞘病损相关疾病的药物中的用途。

2. 按照本发明另一种实施方式，其中所述环烯醚萜类化合物为莫诺苷或其同系物或类似物，和 /或马钱素或其同系物或类似物。

3. 按照本发明另一种实施方式，其中所述莫诺苷占组合物的 25-50%w/w，马钱素占组合物的 25-40% w/w。

4. 按照本发明另一种实施方式，其中所述组合物为山茱萸提取物，其中莫诺苷占所述提取物总重量的 25-50wt%，马钱素占所述提取物总重量的 25-40wt%。

5.按照本发明另一种实施方式，其中所述减轻神经系统髓鞘病损用于治疗各种原因导致的出现髓鞘病损的疾病，或用于治疗神经系统脱髓鞘疾病。

6. 按照本发明另一种实施方式，其中所述疾病为多发性硬化、视神经脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、弥漫性硬化、同心圆硬化、脑白质营养不良、脑桥中央髓鞘溶解症、急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病或慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病，或者所述疾病为缺血-缺氧性病引起的白质脑病、营养缺乏性疾病引起的亚急性联合变性、病毒感染引起的亚急性硬化性全脑炎或进行性多灶性白质脑病。

7. 按照本发明另一种实施方式，其中所述疾病为糖尿病性神经病或系统性红斑良疮。

按照本发明另一种实施方式，本发明也提供了

8. 一种治疗或预防神经系统脱髓鞘疾病的药物组合物，其特征在于其含有实施方式 1-4任一项中所述的组合物和任选的可药用栽体。

按照本发明另一种实施方式，本发明还提供了

9. 一种治疗或预防神经系统脱髓鞘疾病的方法，包括向需要的患者施用治疗有效量的实施方式 1-4 任一项中所述的组合物，或含有所述组合物的药物组合物。

10. 按照实施方式 8所述的药物组合物或按照实施方式 9所述的方法，其中所述疾病为实施方式 5-7任一项中所述的任一疾病 o

本发明所述莫诺苷、马钱素，均具有环烯醚萜的基本骨架，可

马钱素 ( loganin )

例如，本发明釆用下述的提取方法所得到的山茱萸提取物，经分析，以提取物总重量计，含莫诺苷 25- 50wt%、马钱素 25-40 wt%, 二者总含量占总提取物的 50-90 wt%₀

本发明的山茱萸提取物的制备方法包括以下步骤：

( A ) 水提或水提醇沉；

( B ) 大孔吸附树脂分离；和

( C )精制。

所迷水提优选包括山茱萸药材用水煎煮 2- 4遍，加水量 3-14 倍，时间 1-4小时，合并煎煮液，过滤后减压浓缩。

所述水提醇沉优选包括山茱萸药材用水煎煮 2- 4遍，加水量 3-14倍，时间 1-4小时，合并煎煮液，过滤后减压浓缩，加乙醇调至醇浓度为 50%- 90%，冷藏 12-48 小时，过滤，滤液减压回收乙醇。

所述大孔吸附树脂分离优选包括以下步骤：取浓缩的山茱萸水提取或水提醇沉提取液，上大孔吸附树脂柱，使药液流过全柱，依次用去离子水、 5%- 95%乙醇进行梯度洗脱，减压浓缩成流浸膏。

所述精制优选包括将大孔吸附树脂分离的流浸膏上 A1₂0₃层析柱，用乙醇洗脱，冻干获得固体产物。

有效成分的测定方法：对上述提取物制品应用薄层层析进行定性分析。并且对上述提取物制品应用高效液相色谱仪进行定量分析，色谱条件： L i chros pher-C18色谱柱，流动相甲醇-水（30: 70 ) ，检测波长 240mn，流速 1. Oml /分钟。检测分析結果：莫诺苷含量占 25-50%、马钱素含量占 25-40%，二者总含量占 50-90°/。。

本发明的化合物也可按照本领域技术人员已知的方法加以合成。

本发明除了上列化合物以外，还打算涵盖这类化合物的同系物和类似物。在这种情况下，同系物是具有上述化合物的实质性结构相似性的分子，类似物是具有与结构相似性无关的实质性生物相似性的分子。

本发明还涵盖药物组合物，所述组合物包括环烯醚萜类化合物与有机和无机酸的药学上可接受的盐。

本发明化合物及其衍生物（氧化和 /或脱羧、开环和 /或氧化环合）、类似物、同系物、药学上可接受的盐或水合物可以与药学上可接受的载体或赋形剂一起制成适合于口服给药的药物组合物。这类组合物通常包含治疗有效量的任意上述化合物和药学上可接受的载体。优选地，有效量是有效地促进神经细胞增殖和 / 或分化的量并且小于导致患者毒性的量。

在本发明制剂中可以使用任意普遍用作载体或稀释剂的惰性赋形剂，例如树胶、淀粉、糖、纤维素材料、丙烯酸酯或其混合物。优选的稀释剂是微晶纤维素。组合物可以进一步包含崩解剂 (例如交联羧曱基纤维素钠）和润滑剂（例如硬脂酸镁），另外可以包含一种或多种添加剂，选自粘合剂、緩沖剂、蛋白酶抑制剂、表面活性剂、增溶剂、增塑剂、乳化剂、稳定剂、粘度增加剂、甜味剂、成膜剂或其任意组合。此外，本发明组合物可以是控释制剂或即时释放制剂的形式。在一种实施方式中，药物组合物是口服给药的，因而被配制成适合于口服给药的形式，也就是固体或液体制剂。适合的固体口服制剂包括片剂、胶嚢剂、丸剂、颗粒剂、小丸等。适合的液体口服制剂包括溶液、悬液、分散体、乳剂、油剂等。

本文所用的 "药学上可接受的载体" 打算包括任意和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等，它们与药学给药是可相容的，例如无菌无热原的水。

固体载体 /稀释剂包括但不限于树胶、淀粉（例如玉米淀粉、预胶凝淀粉）、糖（例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖、葡萄糖）、纤维素材料（例如微晶纤维素）、丙烯酸酯（例如聚甲基丙烯酸酯）、碳酸钙、氧化镁、滑石或其混合物。

就液体制剂而言，药学上可接受的载体可以是水性或非水性溶液、悬液、乳剂或油。非水性溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇 /水溶液、乳液或悬液，包括盐水和经过緩沖的介质。油的实例有石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、橄榄油、葵花油和鱼肝油。溶液或悬液还可以包括下列组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯曱醇或对羟基苯曱酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸（EDTA) ; 緩沖剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和调节张性的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。 pH可以用酸或碱来调节，例如盐酸或氢氧化钠。

另外，组合物可以进一步包含粘合剂（例如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基曱基纤维素、聚维酮）、崩解剂（例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、二氧化硅、交联羧曱基纤维素钠、交联聚维酮、瓜尔胶、淀粉羟乙酸钠、 Pr imogel )、不同 pH和离子强度的緩沖剂（例如 Tr i s-HCl、乙酸盐、磷酸盐）、防止表面吸收的添加剂（例如白蛋白或明胶）、洗涤剂（例如吐温 20、吐温 80、 Pluronic F68、胆汁酸盐）、蛋白酶抑制剂、表面活性剂（例如月桂基硫酸钠）、渗透增强剂、增溶剂（例如甘油、聚乙烯甘油）、助流剂（例如胶体二氧化硅）、抗氧化剂（例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠、丁基化羟基茴香醚）、稳定剂（例如羟丙基纤维素、羟丙基曱基纤维素）、增粘剂（例如卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶）、甜味剂（例如蔗糖、阿斯巴甜、柠檬酸）、矫味剂（例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调料）、防腐剂（例如硫汞撒、苯曱醇、对羟基苯曱酸酯）、润滑剂（例如硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、月桂基硫酸钠）、流动助剂（例如胶体二氧化硅）、增塑剂（例如邻苯二甲酸二乙酯、拧檬酸三乙酯）、乳化剂（例如卡波姆、羟丙基纤维素、月桂基硫酸钠）、聚合物包衣（例如泊洛沙姆或 poloxamine ) 、包衣与成膜剂（例如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚曱基丙烯酸酯）和 /或助剂。

本发明化合物或组合物可以连续地重复每日给药达数天至数年。口服治疗可以持续一周至患者寿命。优选地，给药达连续五天，然后可以评价患者以确定是否需要进一步的给药。给药可以是连续的或间歇的，也就是连续几天治疗继之以休息期。

含有活性成分的药物组合物的制备是本领域熟知的，例如混合、造粒或压片过程。经常将活性治疗成分与药学上可接受的并且可与活性成分相容的赋形剂混合。就口服给药而言，将活性试剂与惯用于此目的的添加剂混合，例如载体、稳定剂或惰性稀释剂，再借助惯用方法转化为适合于给药的剂型，例如片剂、包衣片、硬或软明胶胶嚢剂、水、醇或油溶液等，如上所述。

一种实施方式是口服给药用药物组合物，包含环烯醚萜类化合物或其药学上可接受的盐或水合物、微晶纤维素、交联羧曱基纤维素钠和硬脂酸镁。另一种实施方式包含 50 - 70重量％的环烯醚萜类化合物或其药学上可接受的盐或水合物、 20 - 40 重量％的微晶纤维素、 5 - 15重量％的交联羧甲基纤维素钠和 0. 1 - 5重量％的硬脂酸镁。另一种实施方式组合物包含约 50 - 200mg的环烯醚萜类化合物。

在当前优选的本发明实施方式中，药物组合物包含普通环烯醚萜苷; 微晶纤维素作为载体或稀释剂；交联羧甲基纤维素钠作为崩解剂；和硬脂酸镁作为润滑剂。在特别优选的实施方式中，环烯醚萜类化合物是莫诺苷和 /或马钱素。

本发明所述的组合物可以按药剂学方法，加入辅料制备成多种临床药物剂型，包括口服制剂或非肠道给药的剂型。所说的口服制剂选自于片剂、胶嚢剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂中的任何一种；所说的非肠道给剂型选自于注射剂、气雾剂、栓剂或皮下给药剂型当中的一种。

所述辅料是指药剂学上可接受的赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂等。

本发明环烯醚萜类化合物例如莫诺苷和 /或马钱素可用于减轻神经系统髓鞘脱失和炎性细胞浸润的病理变化，促进髓鞘的形成和修复，减少炎性细胞因子含量，减轻神经功能损伤等；特别用于治疗各种原因导致的中枢和周围神经系统脱髓鞘疾病，包含但不仅于多发性硬化、视神经脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、弥漫性硬化、同心圆硬化、脑白质营养不良、脑桥中央髓鞘溶解症、急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、缺血-缺氧性病引起的白质脑病、营养缺乏性疾病引起的亚急性联合变性、病毒感染引起的亚急性硬化性全脑炎或进行性多灶性白质脑病、糖尿病性神经病、系统性红斑狼疮的神经病变等。本发明也可用于预防上述疾病。以下实施例和实验例进一步说明本发明，但并不构成对本发明所要求保护范围的限定。实施例 1 山茱萸提取物的制备

山茱萸药材用水煎煮 3遍，加水量 6倍，时间 2小时。合并 3 次煎煮液，过滤后减压浓缩，过滤后冷藏备用；取浓缩的山茱萸水提取，上 HP20大孔吸附树脂柱，使药液流过全柱，依次用离子水、 30%、 50%乙醇进行梯度洗脱，收集 50%乙醇的洗脱液，减压浓缩成浸膏；将大孔吸附树脂分离的产物浸膏用乙醇萃取，脱除有机溶剂，浓缩，干燥，获得固体产物。得率 2. 5%。

实施例 2 山茱萸提取物的制备

山茱萸药材用水煎煮 3遍，加水量 6倍，时间 2小时。合并 3 次煎煮液，过滤后减压浓缩，加醇调至醇浓度为 70%, 冷藏 24小时，过滤，滤液减压回收乙醇后，冷藏备用。

取上述山茱萸水提醇沉提取液，上 HP2G大孔吸附树脂柱，使药液流过全柱，依次用去离子水、 30%、 50%乙醇进行梯度洗脱， . 收集 50%乙醇的洗脱液，减压浓缩成浸膏。

将大孔吸附树脂分离的流浸膏上 A1₂0₃层析柱，用乙醇洗脱进行精制，冻干获得固体产物, 得率 2. 3%。

经高效液相色谱仪分析，所述产物中莫诺苷含量占 25-50%、马钱素含量占 25-40%，二者总含量占 50-90%。实施例 3 胶嚢剂

本发明山茱萸提取物 300g药用淀粉 1000g，混合均匀，装入 1号胶嚢，每粒 0.35g，每次口服 1-2粒，每日两次。

实施例 4 片剂

本发明山茱萸提取物 300g, 羧曱基纤维素 40g，乳糖 50g，硬脂酸镁 4g。将上述组分粉碎，混合，压片，制成片剂，每片 0.4g, 每次 3片，每日 3次。

实施例 5 胶嚢剂

莫诺苷 140g，马钱素 120g，药用淀粉 1000g，混合均匀，装入 1号胶嚢，每粒 0.35g，每次口服 1-2粒，每日两次。

实施例 ό 片剂

莫诺苷 140g，马钱素 120g，羧曱基纤维素 40g，微晶纤维素 50g，硬脂酸镁 4g。将上述组分粉碎，混合，压片，制成片剂，每片 0.4g，每次 3片，每日 3次。

实施例 7 胶嚢剂

莫诺苷 300g，马钱素 200g，药用淀粉 800g，混合均匀，装入 1号胶嚢，每粒 0.20g, 每次口服 1-2粒，每日两次。

实施例 8 胶嚢剂

莫诺苷 400g，马钱素 200g, 药用淀粉 800g，混合均匀, 装入 1号胶嚢。

实施例 9 胶嚢剂

莫诺苷 300g，马钱素 500g，药用淀粉 800g, 混合均匀，装入 1号胶嚢。

采用上述实施例 6中所述的片剂组合物进行如下实验。实验例 1、莫诺苷与马钱素组合物对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE ) 小鼠模型神经功能评分的影响

小鼠模型制备及给药：实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE )模型是研究人类多种神经系统脱髓鞘疾病的重要工具。本实验中 EAE小鼠模型的制备是应用髓鞘少突胶质细胞表面糖蛋白 MOG₃₅— ₅₅ 免疫雌性 C57BL/ 6 J小鼠。即小鼠脊柱背侧部皮下注射 0. 2 mL 的 MOG₃₅-₅₅抗原配剂，分别于免疫注射的即刻和 48 小时后腹腔注射 0. 2 mL百日咳杆菌液。莫诺苷与马钱素组合物于最后一次注射百日咳杆菌后开始灌胃给药，连续 3周。

神经功能检测方法：每日釆用盲法由两名实验人员观察小鼠行为学变化。评分标准： 0分，无症状； 1分，尾部张力降低，可见轻度步态笨拙； 2 分，尾部张力消失，中度步态异常，姿态维持缺乏； 3分，肢体力弱； 4分，肢体麻痹； 5分，濒死状态或死亡₀

实验结果： EAE模型小鼠于免疫后第 8天开始出现运动功能障碍，于第 15天左右达到高峰。莫诺苷与马钱素组合物具有显著降低模型动物神经功能损伤评分的作用（表 1 ) ，表明环烯醚萜类有利于改善疾病所致肢体麻木、平衡失调、瘫痪等临床症状。表 1、莫诺苷与马钱素组合物对 EAE小鼠模型发病高峰期神经功能损伤的影响

组别动物数神经功能损伤评分正常对照 1 0 0. 00 ± 0. 00

EAE模型 9 2. 51土 0. 32"

EAE+醋酸泼尼松（阳性对照药） 8 1. 36 ± 0. 62 * *

EAE+莫诺苷与马钱素组合物. 1 0 mg/kg 8 2. 17 ± 0. 87

EAE+莫诺苷与马钱素组合物 30 rag/kg 8 1. 75 ± 0. 40*

EAE+莫诺苷与马钱素组合物 90 mg/kg 8 1. 55 ± 0. 43 * *

Mean土 SD; ^##P< 0. 01，模型组与正常对照組相比； *P< 0. 05 **P<0.01, 用药组与模型组相比。实验例 2、莫诺苷与马钱素组合物对 EAE小鼠模型体重降低的影响

实验目的：体重降低反映机体免疫平衡状态被打破。本实验研究环烯醚萜类对 EAE小鼠模型体重降低的影响。

实驗方法：造模和给药方法同实验例 1。每日记录小鼠体重变化。

实验结果： EAE模型小鼠于免疫后第 10天左右开始出现体重下降，于第 15天左右达到高峰。莫诺苷与马钱素组合物具有对抗模型动物体重降低的作用（表 2 ) ，表明环烯醚萜类可调节机体免疫状态，对抗因免疫反应所致的体重下降。

表 4、莫诺苷与马钱素組合物对 EAE小鼠模型发病高峰期体重降低的影响

组别动物数体重 (g) 正常对照 10 20.32 ± 0. 42

EAE模型 9 18.78 ± 0. 93"

EAE+醋酸泼尼松（阳性对照药） 8 20.52土 1. 19**

EAE+莫诺苷与马钱素组合物 10 mg/kg 8 19.48 ± 1. 36

EAE+莫诺苷与马钱素组合物 30 mg/kg 8 20.00 ± 0. 70*

EAE+莫诺苷与马钱素组合物 90 mg/kg 8 20.33 ±2. 48**

Mean± SD; "P<0.01，模型组与正常对照组相比； *P<0.05 **P<0.01, 用药组与模型组相比。实验例 3、莫诺苷与马钱素组合物对 EAE小鼠模型神经系统髓鞘脱失的影响

实验目的：本实验通过 Luxol Fast Blue (LFB)染色观察 EAE 模型小鼠脊髓髓鞘结构的病理变化，并研究环烯醚萜类对这种病理改变的干预作用。

实验方法：小鼠于实验第 29天经 10%水合氯醛麻醉， 4%多聚甲醛灌注固定，取脊髓组织行石蜡切片，片厚 5 μ ιη。 LFB染色，镜下观察，根据如下标准进行评分： Q分，无髓鞘脱失； 1分，一个小范围髓鞘脱失； 2分， 2或 3个小范围髓鞘脱失； 3分， 1到 2个大范围髓鞘脱失； 4分，大范围髓鞘脱失累及 20%以上白质区域。

实验结果： ΕΑΕ 模型小鼠脊髓髓鞘脱失现象明显，而莫诺苷与马钱素组合物组髓鞘脱失显著减轻（表 3 ) ，表明环烯醚萜类可明显减轻髓鞘病损，有利于防治各种原因导致的神经系统脱髓鞘病变。

表 3、莫诺苷与马钱素组合物对 ΕΑΕ小鼠模型脊髓髓鞘脱失的影响

髓鞘脱失动物数

( LFB染色评分）正常对照 3 0. 00 ± 0. 00

ΕΑΕ模型 3 1. 78 ± 0. 29'

ΕΑΕ+醋酸泼尼松（阳性对照药） 3 0. 81 ± 0. 21

ΕΑΕ+莫诺苷与马钱素組合物 10 mg/kg 3 0. 89 ± 0. 20* *

EAE+莫诺苷与马钱素组合物 30 mg/kg 3 0, 76 ± 0. 17* *

EAE+莫诺苷与马钱素組合物 90 rag/kg 3 0. 68 ± 0. 23* *

Mean土 SD; ^##P<0. 01，模型组与正常对照组相比； **P<0. 01 用药组与模型组相比。实验例 4、莫诺苷与马钱素组合物对 EAE小鼠模型神经系统炎性细胞浸润的影响

实验目的：本实检通过苏木精-伊红（HE)染色观察 EAE模型小鼠脊髓组织的病理变化，尤其炎性细胞浸润情况，并研究环烯醚萜类对该病理改变的干预作用。

实验方法：小鼠于实验第 29天经 10%水合氯醛麻醉， 4%多聚甲醛灌注固定，取脊髓组织行石蜡切片，片厚 5 μπι。 HE染色，镜下观察，根据如下标准进行评分： G分，无细胞浸润； 1分，脊膜细胞浸润； 2分， 1到 4个血管周围小范围细胞浸润； 3分， 5个以上血管周围小范围细胞浸润，或 1个以上累及实质的大范围细胞浸润； 4分，大量细胞浸润累及 20%以上白质区域。

实验结果： EAE模型小鼠脊髓组织出现明显的炎性细胞浸润，而给予莫诺苷与马钱素组合物的模型小鼠炎性细胞浸润明显减轻 (表 4 ) ，表明环烯醚萜类可减轻神经炎性损伤，可用于防治神经系统炎性脱髓鞘疾病。

表 4、莫诺苷与马钱素組合物对 EAE小鼠模型脊髓组织炎性细胞浸润的影响

炎性细胞浸润组别动物蘇

( HE染色评分) 正常对照 3 0.00土 0.00

EAE模型 3 2.08 ± 0.08 **

EAE+醋酸泼尼松（阳性对照药） 3 1.16 ± 0.12**

EAE+莫诺苷与马钱素组合物 10 mg/kg 3 2.11 ±'0.11

EAE+莫诺苷与马钱素组合物 30 mg/kg 3 1.44土 ().17 **

EAE+莫诺苷与马钱素组合物 90 mg/kg 3 1.15土 0.18 **

Mean士 SD; "P<0.01，模型组与正常对照组相比； **P<0.01 用药组与模型组相比。实验例 5、莫诺苷与马钱素组合物对 EAE小鼠模型炎性细胞因子含量的影响

实验目的：白细胞介素 1 (IL- 1)和 IL- 6是重要的炎性细胞因子，对炎症反应有促进作用。本实验应用酶联免疫法（ELISA) 检测 EAE小鼠模型血清中 IL- 1和 IL- 6含量，并观察环烯醚萜类对其含量的影响。

实验方法: 小鼠戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，室温静置 2小时， 3000 转 /分钟离心 20分钟，取上清， - 80。 C保存备用。操作方法严格按照 ELISA 试剂盒说明书中步骤。酶标仪 450 nm 测其吸光度。根据测得的 0D值在标准曲线上计算出相应 IL- 1和 IL-6含量。

实猃结果： EAE模型组小鼠血清 IL- 1和 IL-6含量明显高于正常对照组；而莫诺苷与马钱素组合物能减少模型小鼠血清中 IL-1和 IL- 6含量（表 5) ，表明环烯醚萜苷类可抑制炎症反应。

表 5、莫诺苷与马钱素组合物对 EAE小鼠模型血清中 o IL-1和 IL-6含量的影响

IL-1 IL-6

动物数

(pg/ml) (pg/ml)

正常对照 3 0. 113 ±0. 003 0.127 ±0. 002

EAE模型 3 0. 128 ±0. 005' 0.142 ±0. 001"

EAP+醋酸 (阳' 照药） 3 0. 114 ±0. 001* 0.124 ±0.

EAE+莫 i若苦与马^ ^ 10 rag/kg 3 0. 128 ±0. 009 0.140 ±0. 001

EAE+莫诺苷与马钱素 30 rag/kg 3 0. 113 ±0. 003* 0.131 ±0. 003**

EAE+莫诺苷与马^ J: 90 mg/kg 3 0. 109土 0· 003** 0.123 ± 0. 002** Mean± SD; ^#P<0.05, ^##P<0.01, 模型组与正常对照组相比； *P<0.05, **P<0.01, 用药组与模型组相比。实验例 6、莫诺苷与马钱素组合物对 EAE小鼠模型神经系统少突胶质细胞含量的影响

实验目的：髓鞘是由少突胶质细胞的突起形成。 CNPase (环核苷酸 -3'磷酸水解酶）是成熟少突胶质细胞的标志蛋白。本实验通过 Western blot法检测 EAE模型小鼠脊髓中 CNPase含量，并研究环烯醚萜类对其表达的影响。

实验方法：小鼠麻醉后处死，水上取新鲜脊髓，水上裂解提取总蛋白，制备 Western blot样品，加 CNPase—抗孵育，加相应二抗， ECL显色， Kodak胶片曝光。用 Image： [软件对图片进行分析并经肌动蛋白标化。

实验结果：与正常对照组相比， EAE模型小鼠脊髓 CNPase条带明显变细，整合灰度明显降低，提示少突胶质细胞数量减少；而莫诺苷与马钱素组合物用药组小鼠 CNPase条带变粗，整合灰度明显增加（表 6 ) 。表明环烯醚萜类可明显增加成熟少突胶质细胞数量，有利于髓鞘的形成。

表 6、莫诺苷与马钱素组合物对 EAE小鼠模型脊髓少突胶质细胞的影响

^ 少突股质细胞组别

( CNPase/actin整合灰度）正常对照 3 1.20士 0.05

EAE模型 3 1.00 ± 0.12*

EAE+醋酸泼尼松（阳性对照药） 3 1.18士 0.02*

EAE+莫诺苷与马钱素组合物 10 mg/kg 3 1.05 ± 0.03

EAE+莫诺苷与马钱素组合物 30 rag/kg 3 1.08 ± 0.05

EAE+莫诺苷与马钱素组合物 90 mg/kg 3 1.19 ± 0.03* Mean土 SD; ^#P<0. 05, 模型组与正常对照组相比； *P<0. 05, 用药组与模型组相比。实验例 7、莫诺苷与马钱素组合物对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE ) 大鼠模型神经功能损伤的影响

大鼠模型制备及给药：本实验中 EAE大鼠模型的制备是使用豚鼠脊髓和大脑灰质勾浆液与完全弗氏佐剂乳化后于尾根部皮下多点免疫雌性 Lewi s大鼠。莫诺苷与马钱素组合物灌胃给药 3周。

神经功能检测方法：每日采用盲法由两名实验人员观察大鼠行为学变化。评分标准： 0分，无症状； 1分，尾部张力消失，可见轻度步态笨拙； 2分，双后肢无力，步行困难； 3分，双后肢瘫痪； 4分，双后肢瘫痪及前肢无力； 5分，四肢瘫痪； 6分，濒死状态或死亡。

实验结果： EAE模型大鼠于免疫后第 8天开始出现运动功能障碍，于第 12天达到高峰。莫诺苷与马钱素组合物具有显著降低模型动物神经功能损伤评分的作用（表 7 ) , 表明环烯醚萜类有利于改善疾病所致肢体麻木、平衡失调、瘫痪等临床症状。

表 7、莫诺苷与马钱素组合物对 EAE大鼠模型 : 病高峰期神经功能损伤的影响

神经功能损伤评分正常对照

EAE模型

EAE+醋酸泼尼松（阳性对照药）

EAE+莫诺苷与马钱素組合物 20 mg/kg

EAE+莫诺苷与马钱素组合物 60 rag/kg

Mean士 SD; ^##P<0. 01，模型组与正常对照组相比； *P<0, 05 * *P<0. 01, 用药组与模型组相比。实验例 8、莫诺苷与马钱素组合物对 EAE大鼠模型体重降低的影响

实验目的：体重降低反映机体免疫平衡状态被打破。本实验应用大鼠 EAE模型研究环烯醚萜类对模型动物体重降低的影响。

实验方法：造模和给药方法同实猃例 7。每日观察大鼠体重的变化。

实验结果: EAE 模型大鼠于免疫后一周左右开始出现体重下降，于第 12天达到高峰。莫诺苷与马钱素组合物具有显著对抗模型动物体重降低的作用（表 8 ) , 表明环烯醚萜类有利于对抗模型动物因免疫反应所致的体重降低。

表 8、莫诺苷与马钱素组合物对 EAE大鼠模型发病高峰期体重降低的影响

組别动物数体重（g ) 正常对照 7 225.1 ± 5.6

EAE模型 8 182.4 ± 6.1"

EA.E+醋酸泼尼松（阳性对照药） 6 198.5士 7.1**

EAE+莫诺苷与马钱素组合物 20 rag/kg 6 196.8士 4.7**

EAE+莫诺苷与马钱素組合物 60 mg/kg 6 203.8土 2.8**

Mean士 SD; "Ρ<0· 01，模型组与正常对照组相比； **Ρ<0· 01 用药组与模型组相比。综上所述，环烯醚萜类化合物例如莫诺苷和 /或马钱素在多种实验性自身免疫性脑脊髓炎（ ΕΑΕ )动物模型上表现出明显的减轻神经系统髓鞘脱失和炎性细胞浸润的病理变化，螬高少突胶质细胞数量从而促进髓鞘的形成和修复，减少炎性细胞因子含量，降低神经功能损伤评分，抑制因免疫反应所致的体重降低等作用，表明环烯醚萜类化合物具有防治各种原因导致的神经系统脱髓鞘疾病的用途。

Claims

权利要求

2. 按照权利要求 1的用途，其中所述环烯醚萜类化合物为莫诺苷或其同系物或类似物，和 /或马钱素或其同系物或类似物。

3. 按照权利要求 2 的用途，其中所述莫诺苷占组合物的 25-50%w/w, 马钱素占組合物的 25-40% w/w。

4. 按照权利要求 1的用途，其中所述组合物为山茱萸提取物，其中莫诺苷占所述提取物总重量的 25-50wt°/。，马钱素占所述提取物总重量的 25-40wt%。

5. 按照权利要求 1-4任一项的用途，其中所述减轻神经系统髓鞘病损用于治疗各种原因导致的出现髓鞘病损的疾病，或用于治疗神经系统脱髓鞘疾病。

6. 按照权利要求 5的用途，其中所述疾病为多发性硬化、视神经脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、弥漫性硬化、同心圆硬化、脑白质营养不良、脑桥中央髓鞘溶解症、急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病或慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病，或者所述疾病为缺血 -缺氧性病引起的白质脑病、营养缺乏性疾病引起的亚急性联合变性、病毒感染引起的亚急性硬化性全脑炎或进行性多灶性白质脑病。

7. 按照权利要求 5或 6的用途，其中所述疾病为糖尿病性神经病或系统性红斑狼疮。

8. 一种治疗或预防神经系统脱髓鞘疾病的药物组合物，其特征在于其含有权利要求 1-4 任一项中所述的组合物和任选的可药用载体。

9. 一种治疗或预防神经系统脱髓鞘疾病的方法，包括向需要的患者施用治疗有效量的权利要求 1-4任一项中所述的组合物，或含有所述组合物的药物组合物。

10. 按照权利要求 8所述的药物组合物或按照权利要求 9所述的方法，其中所述疾病为权利要求 5- 7任一项中所述的任一疾病