WO2011150481A1 - Composição nanoparticulada contendo antibióticos para administração intramamária de uso animal - Google Patents

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WO2011150481A1
WO2011150481A1 PCT/BR2011/000168 BR2011000168W WO2011150481A1 WO 2011150481 A1 WO2011150481 A1 WO 2011150481A1 BR 2011000168 W BR2011000168 W BR 2011000168W WO 2011150481 A1 WO2011150481 A1 WO 2011150481A1
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nanocarriers
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cloxacillin
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Raquel Silva ARAÚJO
Humberto de Mello BRANDÃO
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Universidade Federal De Ouro Preto
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Fundação De Amparo À Pesquisa Do Estado De Minas Gerais - Fapemig
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Definitions

  • the present invention relates to the development of two polymeric nanocarrier (NC) formulations which encapsulate penicillin-derived antimicrobial drugs such as benzathine cloxacillin. More specifically, this invention relates to a novel composition for the treatment of mastitis in farm animals (cattle, goats, sheep, buffaloes, horses and camelids) in the dry season.
  • NC polymeric nanocarrier
  • the present invention describes the technique of preparing two reservoir-type nanocarrier formulations that can encapsulate different antibiotic-acting drugs, particularly the benzathine cloxacillin drug, widely used in the treatment of bovine mastitis.
  • a new therapy for mastitis in dairy cattle is aimed at circumventing the inconvenience of repeated dose administration, the use of high doses of the drug used in traditional formulations, the low retention of the drug within the roof, contributing to the improvement of the milk production. milk.
  • the efficacy of the drug may be increased due to the high adhesion of the nanocarriers mentioned herein to the glandular tissues of the upper udder portions of the animals.
  • the drug in its free form as it is administered in the marketed formulations, is available to reach blood from the site of administration and can therefore reach tissues other than those affected by mastitis causing microorganisms.
  • the nanoencapsulated drug is more restricted to the action sites in the tissue and target cells of infection by the causative agents of microbial mastitis, thanks to the specificities of the formulation components and the method of production of the nanostructured formulations presented herein.
  • the encapsulated antimicrobial drug can thus specifically target the target and be released slowly and especially at the site of action, avoiding drug loss and inactivation in other tissues. In this way the doses may be reduced and the efficacy increased.
  • Bovine mastitis remains a limiting factor for milk production in many Brazilian properties, emerging as the most frequent cause of damage to dairy farmers. Treatment is limited to emergency clinical cases when injury is already unavoidable. Antibiotics and anti-inflammatories are the most commonly used drugs for the treatment of mastitis (Gruet et al., 2001).
  • Mastitis in dairy cattle often occurs during the dry period or early lactation.
  • the main mastitis-causing bacterium, Staphylococcus aureus can form encapsulated foci in the high portions of the udder, developing a subclinical form, which hinders bacteriological cure during lactation, as the antibiotics used in this phase are short-shot (ie, short-shot). short half-life at target action) due to milk withdrawal period, not remaining at therapeutic levels long enough to determine complete elimination of bacteria in cystic form. In this case, if there is no treatment during drying, these bacteria can go through the entire dry period and return to the next lactation.
  • Streptococcus uberis Streptococcus agalactiae
  • Corynebacterium pyogenes which are also among the causative agents of microbial mastitis.
  • Treatment of animals in the dry season reduces both the number of infections during this phase and new infections at the beginning of lactation.
  • 90% of Streptococcus agalactiae infections and 70% of Staphylococcus aureus infections can be eliminated with dry-period treatment (Naztke, 1971).
  • efficacy may be increased if drug retention at infection sites also increases.
  • EP 1104233 and EP 799047 deals with film-forming compositions that can be applied to animal roofs to form a barrier to bacterial entry. Another form involves the formation of a physical barrier in the roof channel to prevent pathogens from entering as described in GB 1441747.
  • GB 2273443 describes the use of an antibacterial formulation and a barrier to treat mastitis in cows. For example, in GB 2273441 this barrier is formed of a gel and a non-toxic heavy metal salt.
  • co-administration of an oil based product with a roof channel blocking formulation containing a heavy metal salt leads to improved barrier effectiveness as set forth in GB 2296424.
  • oils such as mineral, silicone and vegetable. However, there are risks of heavy metal accumulation in the animal's body and subsequent contamination of milk during lactation.
  • the traditional formulations used do not allow the internalization of the drug in the target cells.
  • the more soluble free drug has little chance of penetrating high concentrations in the infected neutrophils, not eliminating intracellular foci of infection, causing late post-treatment relapses.
  • the proposed formulation due to its constitution, has ability of adherence and intracellular penetration into mammary gland constituent cells (phagocytes and cells of the surface of the acini, duet and glandular cisterns) penetrating phagocytosis, non-specific endocytosis and physical adsorption on the cell surface (Mosqueira et al., 1999), both by electrostatic interactions of nanocarriers with the cell membrane and by hydrophobic interactions with proteins and glycoproteins.
  • Nanoencapsulation also prevents rapid dp metabolization . drug by cells after administration and prevents rapid elimination of the drug from the site of action, which occurs when the drug is administered in its free or unencapsulated form.
  • the excipients used in the proposed formulations are harmless, biodegradable, biocompatible, of natural origin and do not compromise gland functions, producing no cell damage or cytotoxicity (Mosqueira et al., 2000 and 2001).
  • the administration of an intramammary nanoparticulate formulation is a promising alternative for effective treatment of mastitis in dairy herds. Its application has the potential to increase drug retention in cells infected by microorganisms, especially S. aureus.
  • An important property of the formulations presented herein is the ability to remain at the site of action during the animal's dry period (transition period between two lactations).
  • Such nanostructures may encapsulate drugs such as antibacterials, antimycotics, antiparasitics, vitamins, non-steroidal anti-inflammatories, steroidal anti-inflammatories, antivirals, antineoplastics, anesthetics, or combinations thereof and may be administered by different routes of application such as orally, intraarticular, parenteral, ocular, mammary, topical, nasal, otological, rectal, vaginal and / or combination of these routes.
  • drugs such as antibacterials, antimycotics, antiparasitics, vitamins, non-steroidal anti-inflammatories, steroidal anti-inflammatories, antivirals, antineoplastics, anesthetics, or combinations thereof and may be administered by different routes of application such as orally, intraarticular, parenteral, ocular, mammary, topical, nasal, otological, rectal, vaginal and / or combination of these routes.
  • the present invention aims at a novel therapy for the treatment and prophylaxis of non-human animal diseases by circumventing the drawback of repeated dose administration and the use of high doses of drug used in traditional formulations, which reduces animal stress and onset.
  • drug residues in the products of animal origin.
  • Nanoparticulate veterinary drug compositions also reduce the appearance of side effects in relation to free-form drug use, as the nanostructures proposed in this document direct the drug in the animal organism to the desired target of action, reducing erratic drug distribution. free.
  • the efficacy of the drug may be increased due to the active targeting of adhesiveness and the ability of nanocarriers to accumulate in tissues in which vascular permeability increases (passive targeting).
  • Nanoparticles may be the tissues in which nanoparticles accumulate, such as inflamed and neoplastic, as well as organs with intense phagocytic activity such as the spleen, liver, lymph nodes, lung, bone marrow, and mucous membranes.
  • drugs in their free form, as administered in commercial formulations require multiple administrations to achieve high concentrations in different tissues, causing variations in plasma levels that cause toxicity and / or development of microbial resistance.
  • Nanoencapsulated drugs have prolonged release and are more restricted to action sites and target cells, thanks to the specificities of the formulation components and their physicochemical characteristics.
  • encapsulated drugs can reach the target specifically and be released slowly and especially at the site of action, avoiding drug loss and inactivation in other tissues.
  • doses may be reduced, efficacy increased and toxicity reduced, reducing the containment, and excessive handling of animals.
  • Containment and change in management are hindering factors in proper animal therapy. These conditions are major stressors, resulting in endogenous release of adrenaline, noradrenaline and corticosteroids, which results in increased activity (escape and fight reaction) and decreased immunity. This situation worsens as drug administration needs to be more frequent. As a result of these difficulties, drug intervention may occur either late or late. Additionally, the need for multiple administrations to maintain therapeutic concentration may lead to transposition of the drug toxicity threshold, leading to adverse effects and increased drug residues in animal products (Vandamme, 2010).
  • the present invention allows the delivery of hydrophobic and amphiphilic drugs in nanodispersed form in aqueous vehicles. Therefore, this invention makes it possible . administration of insoluble drugs in water through a large number of routes of administration including the intravenous route.
  • a second strategy is to increase the concentration of active ingredient in the formula, as is the case with Ivomec®Gold, which has a 3.15-fold higher ivermectin concentration when compared to simple Ivomec®.
  • tissue necrosis may occur due to incorrect application, as well as volume limitation to be applied in the same place, in addition to the possibility that the site of drug administration may be extremely painful.
  • increased drug concentration may lead to toxicity for more sensitive individuals.
  • the nanocarriers of the present invention are capable of vectorizing poorly soluble salts in aqueous vehicles, maintaining sustained and often controlled release. Such condition also allows its intravenous application and, by using an aqueous vehicle minimizes the pain after application when compared to the oily vehicle.
  • inserts and implants are other strategies adopted to circumvent the need for multiple drug applications.
  • Baeyens et al. (2000) describe the use of inserts for the treatment of eye infections in animals, however such devices generate great discomfort for the patient in addition to the need for microsurgery and risk of infections.
  • the nanocarriers described in the claims herein pass unnoticed by animals because they have a nanometer size, and still have the advantage of remaining adhered to the ocular mucosa due to the characteristic mucus adhesive conferred by chitosan. (Illum et al., 2001) coating the nanocarrier.
  • the characteristic mucus adhesive of these nanocarriers also allows them to be used by other routes of drug administration, whose existence of mucosa support them for adhesion, citing the oral, nasal, vaginal and anal.
  • Rathbone et al. (2000) report the use of intravaginal and subcutaneous devices for the controlled release of hormones, aiming to control the estrous cycle of animals.
  • such devices require at least two containment of animals and, depending on the type / location of the implant, more invasive intervention, which is sometimes even deadly, is required. In order to promote the controlled release of drugs without, however, requiring.
  • US 4938763 describes the use of biodegradable implants for controlled release of cisplatin, however, they require a more invasive action for their administration compared to the present invention which can be done with the aid of needle and syringe. .
  • nanoemulsions produced by Vandamme and Anton to the nanoreservatories objects of this invention are more stable in protein rich physiological media, basically by the presence of rigid polymeric coating. Additionally, the described nanoemulsions are unable to target the active principle.
  • Paccal ® Vet (paclitaxel), Doxophos ® Vet nanostructured products are available for purchase.
  • micellar systems have reduced stability in biological media due to the lack of a rigid polymeric coating and the destruction of their structure after dilution in water.
  • liposomes can also be used to promote controlled release and targeting of anticarcinogenic chemotherapeutic drugs and other veterinary drugs, but they have the same limitations in biological stability as micellar systems and have high cost and difficulty in stabilizing physiologically. chemistry .
  • nanoparticles for controlled drug release, including veterinarians. Unlike the nanoparticles of this invention these particles are not biodegradable and some of the substances that are part of their composition, such as nanoparticles of
  • Silica are responsible for silicosis in animals.
  • the present invention in claim 55.
  • antineoplastic, anesthetic, and / or hormone administered by the oral, parenteral, ocular, mammary, topical, intraarticular, nasal, otological, rectal, vaginal, and / or combination routes are a promising alternative for the treatment and effective prophylaxis of the disease.
  • Nanocarriers containing one or more Antibacterials, antimycotics, antiparasitics, vitamins, non-steroidal or steroidal anti-inflammatories, antivirals, antineoplastics, anesthetics or hormones as active principle of the present invention are selected from the group of first-generation sulfonamides, nitrofurans, quinolones, fluoroquinolones, cephalosporins.
  • aminoglycosides aminoglycosides, macrolides, lincosamides, chloramphenicol, tetracyclines, polymyxins, beta-lactams, systemic antimycotics, topical antimycotics, liposoluble vitamins, reverse transcriptase inhibitors, non-glycoside reverse transcriptase inhibitors, proteases, reverse transcriptase inhibitor nucleoside analogues, benzimidazoles, imidathiazoles, tetrahydropyrimidines, organophosphates, avermectins, milbemicines, heterocyclic compounds, arsenicals, nitroscanate, benzimidazoles, rafoxamides, imidines, imidothi azoles, niclosamides, carbamates, pyrethroids, imidacloprides, antiprotozoans, salicylanilides, imidacloprides, corticosteroids, non-steroidal anti-
  • sulfamerazine sulfachinoxaline, sulfachloropyridazine, sulfadiazine, sulfanilamide, sulfathiazole, sulfisoxazole, sulfamethizole, sulfacetamide, sulfamethoxazole, sulfaphenazole, sulfamoxol, sulfametoxina, sulfametonidina, sulfadoxine, sulfametoxipirazina, sulfadimethoxine, sulfaguanidine, ftalilsulfatiazol, succinilsulfatiazol, ftalilsulfacetamida, nitrossulfatiazol, sulfacetamide, mafenide, sulfadiazine and salts thereof, sulfaclorpiridazina, s
  • melarsoprol tetramizole, Levaizole, methylcarbamates, parbendazole, mebendazole, flubendazole, flumethrin, permethrin, cypermethrin, deltamethrin, closantel, rafoxanide, tetraethiuran monosulfide (monosulfiran), chloronicotinyl nitroguanidine, fipronil, lufenuron, nitenpyram, metronidazole, pyrimetamid, nephroluren, tolprolurin diaminazene aceturate, imidocarb, diquinolylurea, primaquine, hydrocortisone, cortisone, prednisone, prednisolone, methylprednisolone, triamcinolone, paramethasone, betamethasone, dexamethasone, flumetasone, dipyr
  • folic acid analogues metalhotrexate
  • pyrimidine analogues fluorouracil, cytarabine
  • purine analogues mercaptopurine
  • cisplatin 1-asparginase, hydroxyurea, vinblastine, vincristine, doxorubicin, dactinomycin, bleomycin,.
  • estradiol cypionate estradiol cypionate, allylembolone, medroxyprogesterone acetate, megestrol acetate, progesterone, sodium cloprostenol, dinoprosdt tromethamine, altrenogest, fluprostenol, tiaprost, prostaglandin f-2-alpha, melatonin, human chorionic gonadotropin, equine chorionic gonadotropin, goninin, ghrelinin, ghrelinin, ghrelinin leuprolide, danazol, deslorelin, growth hormone, testosterone propionate, testosterone cypionate or oxytocin, not being restricted to these active principles, their derivatives, their salts and / or combinations thereof, emphasizing that the active principle to be incorporated into nanosystems may belong to any of the above groups.
  • a mastitis treatment product characterized by intramammary administration or even local parenteral injections, which do not require multiple infusions (single dose and prolonged release) and have the ability to adhere to and penetrate the infected cells of the animal's mammary gland (targeting of the active principle) came to the result that is the object of this invention, which presents a new formulation of antibiotic encapsulated in lipid and polymeric nanocarriers.
  • WO 9531180 describes a mastitis treatment comprising administering a formulation comprising ... urn. suspension here . micronized benzathine cloxacillin and then a heavy metal gel to seal the roof, which may cause heavy metal contamination of the milk during lactation. Furthermore, in this document the results regarding the antibiotic release rate are not presented 5.
  • EP 0260854 describes the microencapsulation of a mixture of benzathine cloxacillin and ampicillin trihydrate for mastitis treatment, but has a very large particle polydispersion, being difficult or
  • microcapsules have less ability to adhere to the top of the roof cells due to their higher weight, which may lead to sedimentation near the roof canal due to the difference in
  • RU 2350332 discloses a doxycycline-containing emulsion for treating mastitis in dry period cows, with the drawback of being unstable in medium
  • Emulsions are less stable in biological media due to interactions with lipoproteins, releasing the drug faster
  • Nanocarriers have a more degradation-resistant polymeric wall that controls drug release.
  • CN 101439044 describes a gel containing polyvinylpyrrolidone diode (PVP-I) for treating mastitis, but has the drawback. may cause an inflammatory reaction in the animal's udder as an adverse effect the potential to produce a chemical mastitis induced by the irritating effect of the released iodine.
  • PVP-I polyvinylpyrrolidone diode
  • KR 20080083499 and KR 20070059787 use colloidal silver nanoparticles for the treatment of mastitis, but have the inconvenience of residues in milk or even silver can cross the blood-glandular barrier reaching the systemic circulation.
  • Cloxacillin in sodium form is used for the treatment of mastitis during intramammary lactation.
  • liposome-encapsulated cloxacillin was directed to the treatment of mastitis in the lactation phase; however, the use of sustained release systems during this period increases milk discharge, since the time of drug delivery is longer.
  • Liposome has reduced stability in physiological environment when compared to polymeric nanocarriers. This treatment was performed in a murine model, which is not directly related to the present proposal. Liposomes are quite unstable, costly and difficult to stabilize and produce formulations compared to nanocapsules produced in this invention.
  • Reservoir-type polymeric nanocarriers consist of an oily core surrounded by a polymeric membrane (Legrand et al., 1999), acting as carrier of choice for the administration of low water solubility substances such as' cloxacillin benzathine as they are formed by stable polymers with low toxicity consisting of biocompatible and biodegradable materials, which are degraded in vivo to smaller easily excreted fragments such as carbon dioxide and water.
  • polymers are generally used in the range 0.2 to 2% (w / w).
  • Polyesters, polyamides, polycyanoacrylates, polycarbonates, polyurethanes, chitosans, gelatins, methacrylates, methacritic acid copolymers and acrylic esters, Polyalkylacrylates, polymethylacrylates, vinyl alcohol polymer, or combinations or mixtures of these materials may generally be employed.
  • the most suitable for their degradability are the hydroxy acid polyesters: homo or copolymers of lactic, glycolic and hydroxycaproic acid and their different combinations and proportions with molecular weight ranging from 2000 to 100000. Namely: poly (D, L - lactic acid ), poly (glycolic) acid, poly (lactic-co-glycolic acid), ⁇ - ⁇ -caprolactone, ⁇ - ⁇ -hydroxybutyrate, ⁇ - ⁇ -
  • Hydrophilic such as 20, 21, 40, 60, 61, 65, 80, 81, 85 and 120 polysorbates surfactants; ethylene-propylene polyoxide polyoxide copolymers such as poloxamers24, 188, 237, 338 and 407) and lipophilic (sorbitan esters such as sorbitan monolaurate, sorbitan trilaurate., .. sorbitan monopalmitate,.
  • sorbitan monostearate, sorbitan triestearate, sorbitan monooleate sorbitan, sorbitan trioleate; lecithins; polyglyceryl-6 dioleate) are also used, usually from 0.2 to 2% (w / w) ⁇
  • oils employed may be vegetable (soybean, corn, cotton, olive, almond, sunflower, grape) or mineral oils (liquid paraffin, light liquid paraffin) or fatty acid esters (polyglyceryl-6 dioleate, polyethylene glycol-6 of olive oil, peanut and maize) and medium chain triglycerides (such as capric / caprylic acid triglyceride) should be non-toxic, unable to degrade or solubilize the polymer and have a high ability to dissolve the drug in question (Legrand et al., 1999).
  • Nanocarriers may have their surface modified by chitosan coating.
  • the nanocarriers proposed here obtained from ⁇ - ⁇ -caprolactone, for example, concentrate the encapsulated drugs in mononuclear phagocyte system (SFM) cells.
  • SFM mononuclear phagocyte system
  • Conventional chitosan-coated nanocarriers have a bioadhesive feature that enhances retention of the drug-charged particle at the site of action, for example in the upper udder parts.
  • Chitosan is a hydrophilic polysaccharide, amino derived from the chitin deacetylation process that constitutes the insect and crustacean carapace. Because it is a natural and biodegradable polymer, chitosan has been proposed as an attractive material for various uses, especially in engineering, biotechnology and medicine (Hirano, 1999). Chitosan is insoluble in water and can be characterized as a cationic polyelectrolyte. It is soluble in weak or diluted organic acids as 3% acetic acid producing a viscous solution.
  • chitosan in salt form is used in the neutral aqueous phase.
  • Cloxacillin is a ⁇ -lactam antibiotic used in veterinary practices because of its activity against gram-positive and negative bacteria.
  • the drug is used in the treatment and prevention of bovine mastitis caused by Staphylococus (Pérez et al., 1997).
  • the advantage of this invention is in the creation of a new possibility of dry period intramammary mastitis therapy in dairy cattle by encapsulating the benzathine cloxacillin drug in nanocarriers which are avidly phagocytized by cells present in the infected regions of the interior of the mammary gland. These nanocarriers have greater penetration in regions where inflammation is present as described in PI 0605102-2A.
  • the reservoir-type nanocarrier formulations used in this invention containing benzathine cloxacillin inside were prepared by a method other than that described by Fessi et al. (1989) regarding the constituents of the formulations and the proportions of the phase solvents which were specific to the drug used.
  • the polymers used to prepare the nanocarriers proposed here were ⁇ - ⁇ -caprolactone (PCL) and chitosan (QUIT), both biocompatible and biodegradable, being easily excreted by the body. From this irrr.a, these . . nanostructures . .. are . . interesting carriers because of its stability in biological environment and low toxicity due to the use of biodegradable polymers.
  • the present invention has been prepared for use in veterinary medicine as a novel form of treatment for dry period intramammary bovine mastitis, having as main advantages the ease of handling at the time of use, the simplicity in the preparation and viability for marketing. Besides this new possibility, these nanocarriers can also be used in the treatment of these and other diseases, as long as there is affinity between the drug and the oil nucleus.
  • the present invention is based on the fact that these nanostructured carriers are captured by the mononuclear phagocyte system and those modified by the chitosan surface are bioadhesive. Therefore, both formulations have potential for success in the treatment of mastitis, due to the greater penetration in the affected tissue.
  • Reservoir-type nanocarriers were prepared by the preformed polymer interfacial deposition method followed by displacement of the water-miscible and oil-immiscible solvents and the hydrophobic polymers.
  • Example 1 Production of chitosan-coated reservoir nanocarriers (NC PCL QUIT) containing antibiotic for use. vet. Benzathine cloxacillin nanocarriers were prepared according to the following ⁇ constituents (% w / w)
  • NC-PCL-QUIT coated nanocarriers
  • PCL poly- ⁇ -caprolactone polymer
  • acetone solution containing soy lecithin (Epikuron 170) and Labrafac CC.
  • the benzathine cloxacillin drug was previously solubilized in 7 ml of methanol and added to the acetone solution. This phase remained by stirring and moderate heating (30 to 45 ° C) until complete dissolution of the components. Then the organic solution was poured into a previously prepared aqueous solution containing poloxamer 188 and 10 mg of water soluble chitosan.
  • Example 2 Production of conventional nanocarriers (NC PCL) containing veterinary antibiotic.
  • the nanocarriers. of cloxacillin. benzathine . prepared according to the following constituents (% w / w). ⁇ - ⁇ -caprolactone 0.60%
  • Table 1 Analysis of the size and zeta potential of nanocarriers containing different concentrations of benzathine cloxacillin.
  • Table 2 Efficiency and encapsulation yield of NCs containing different concentrations of benzathine cloxacillin.
  • Figure 1 shows the in vitro release profile of CLOXB at 37 ° C in PBS medium containing 1% polyethylene glycol and 1% milk from free cloxacillin and PCL NC formulations 0.5mg and NC PLC-QUIT 2, 5mg in sink conditions.
  • NC-PCL-QUIT 2.5mg containing CLOXB showed a faster release, more than 70% in 6hs in medium containing 1% milk than in medium containing 1% PEG.
  • NC-PCL with CLOXB showed faster release in medium containing 1% PEG than in medium containing 1% milk.
  • nanocapsules containing the antibiotic cloxacillin benzathine are promising for intrammary administration in dairy cattle.
  • Figure 2 shows images of NC-PCL intermittent mode MFA. Image tall.
  • A White NC
  • B NC PCL 0.5 mg / ml. Scale: 5x5 ⁇ .

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Abstract

A presente invenção se refere ao desenvolvimento de dois tipos de nanocápsulas poliméricas as quais encapsularão o fármaco antimicrobiano cloxacilina benzatina. Mais especificamente esta invenção trata de uma nova forma de tratamento para a mastite em gado leiteiro. Foram desenvolvidas duas formulações de nanocápsulas que poderão ser utilizadas para encapsular diferentes fármacos, além de encapsular o fármaco cloxacilina benzatina objetivando uma nova terapia para a mastite em vacas, contornando o inconveniente do emprego de altas doses de fármaco empregadas nas formulações tradicionais, contribuindo para a melhora da qualidade do leite.

Description

Relatório Descritivo para Patente de Invenção para: "COMPOSIÇÃO NANOPARTICULADA CONTENDO ANTIBIÓTICOS PARA ADMINISTRAÇÃO INTRAMAMÁRIA DE USO ANIMAL".
A presente invenção se refere ao desenvolvimento de duas formulações de nanocarreadores (NC) poliméricos, os quais encapsulam fármacos antimicrobianos derivados da penicilina tal como a cloxacilina benzatina. Mais especificamente esta invenção trata de uma nova composição destinada ao tratamento da mastite em animais de produção (bovinos, caprinos, ovinos, bubalinos, equídeos e camelídeos) no período seco.
A presente invenção descreve a técnica de preparo de duas formulações de nanocarreadores do tipo reservatório que podem encapsular diferentes fármacos com ação antibiótica, particularmente o fármaco cloxacilina benzatina, largamente utilizado no tratamento da mastite bovina. Objetiva-se uma nova terapia para a mastite em gado leiteiro, contornando o inconveniente da administração de doses repetidas, do emprego de altas doses de fármaco usadas nas formulações tradicionais, da baixa retenção do fármaco dentro do teto, contribuindo para a melhora da produção de leite. Utilizando-se esta formulação a eficácia do fármaco pode ser aumentada, devido à alta adesão dos nanocarreadores aqui mencionados aos tecidos glandulares das porções superiores do úbere dos animais. Além disso, o fármaco na sua forma livre, tal como é administrado nas formulações comercializadas, está disponível para atingir o sangue a partir do local de administração, podendo, portanto, atingir outros tecidos que não os afetados pelos microorganismos causadores da mastite. O fármaco na forma nanoencapsulada fica mais restrito aos sítios de ação no tecido e nas células alvo da infecção pelos agentes causadores da mastite microbiana, graças às especificidades dos componentes da formulação e do método de produção das formulações nanoestruturadas aqui apresentadas. 0 fármaco antimicrobiano encapsulado, pode assim atingir especificamente o alvo e ser liberado lentamente e, principalmente, no sitio de ação, evitando perdas e inativações do fármaco em outros tecidos. Desta maneira as doses podem ser reduzidas e a eficácia aumentada.
A mastite bovina continua sendo um fator limitante da produção leiteira em muitas propriedades no Brasil, surgindo como o mais frequente causador de prejuízos aos produtores de leite. O tratamento se limita aos casos clínicos emergenciais quando o prejuízo já é inevitável. Antibióticos e antiinflamatórios são as drogas mais utilizadas para o tratamento da mastite (Gruet et al. , 2001) .
As mastites em gado leiteiro frequentemente ocorrem durante o período seco ou no início da lactação. A principal bactéria causadora de mastite, o Staphylococcus aureus pode formar focos encapsulados nas porções altas do úbere, desenvolvendo uma forma subclínica, o que dificulta a cura bacteriológica durante a lactação, pois os antibióticos usados nesta fase são de tiro-curto (ou seja, meia-vida curta no alvo de ação) , devido ao período de retirada do leite, não permanecendo em níveis terapêuticos por tempo suficiente para determinar a eliminação completa da bactéria na forma cística. Neste caso, não havendo tratamento durante a secagem, estas bactérias podem atravessar todo o período seco e retornar na lactação seguinte. Outras bactérias têm sido isoladas durante o período seco, tais como Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae e Corynebacterium pyogenes, as quais estão também entre os agentes causadores da mastite microbiana. 0 tratamento dos animais no período seco reduz tanto o número de infecções durante esta fase quanto o de novas infecções no início da lactação. Em média, pode-se eliminar 90% de infecções por Streptococcus agalactiae e 70% por Staphylococcus aureus com o tratamento no período seco (Naztke, 1971) . Entretanto, a eficácia pode ser aumentada se a retenção dos fármacos nos sítios de infecção também aumentar .
A maioria das formulações comercializadas no Brasil para o tratamento da mastite em bovinos é do tipo suspensão intramamária como no caso da Orbenin® Extra Dry Cow. Existem também associações entre antibióticos como no caso da Bovamast® (Bayer) que é uma suspensão dos antibióticos cloxacilina benzatina e ampicilina. Vários tratamentos estão disponíveis, dentre eles os que previnem a doença e os que a tratam. Sendo assim, composições para lavagem dos tetos estão apresentadas na patente norte-americana US 5,211,961, na qual é usada como ducha antibacteriana .
Outra alternativa, presente na EP 1104233 e na EP 799047 tratam de composições capazes de formar um filme que podem ser aplicadas nos tetos dos animais para formar uma barreira à entrada de bactérias. Outra forma envolve a formação de uma barreira física no canal do teto para prevenir a entrada de patógenos como descrito em GB 1441747. Já a GB 2273443 descreve o uso de uma formulação antibacteriana e de uma barreira para tratar mastite em vacas. Por exemplo, em GB 2273441 esta barreira é formada por um gel e um sal de metal pesado não tóxico. Ao contrário do esperado, a co-administração de um produto a base de óleo com uma formulação que bloqueia o canal do teto, contendo um sal de metal pesado leva à melhora na efetividade de barreira tal como apresentado em GB 2296424. São diversos os tipos de óleos utilizados tais como o mineral, o de silicone e os vegetais. Entretanto, existem os riscos de acúmulo de metais pesados no organismo do animal e posterior contaminação do leite no período da lactação.
A grande maioria das formulações supracitadas apresentam a desvantagem de não eliminar os focos císticos de bactérias, o que acarreta a recidiva da infecção nos animais. Já as formulações que atuam como barreira (GB 1441747, GB 2296424) possuem caráter preventivo não sendo eficazes em animais já infectados.
Os produtos comercializados no Brasil para tratamento da mastite bovina apresentam o inconveniente do emprego de altas doses de fármaco (geralmente 500-600 mg por teto) por via intramamária . Estes tratamento possuem o inconveniente de múltiplas infusões (1 a 4 aplicações durante a. fase seca) o que pode acarretar feridas no canal do teto do animal, devido à cânula pela qual a suspensão penetra no interior do úbere, aumentando o risco de contaminação da glândula com novos patógenos durante a administração.
As formulações tradicionais utilizadas não possibilitam a internalização do fármaco nas células alvo. 0 fármaco livre, mais solúvel, tem pouca chance de penetração em altas concentrações nos neutrófilos infectados, não eliminando os focos de infecção intracelulares, gerando recidivas tardias pós-tratamento. A formulação proposta, devido à sua constituição, tem capacidade de aderência e penetração intracelular nas células constituintes da glândula mamária (fagócitos e células da superfície do ácino, dueto e cisternas glandulares) penetrando por fagocitose, endocitose não específica e por adsorção física na superfície celular (Mosqueira et al., 1999), tanto por interações eletrostáticas dos nanocarreadores com a membrana celular quanto por interações hidrofóbicas com proteínas e glicoproteínas . Essas formulações possuem o grande diferencial devido à sua capacidade aumentada de residência e adesão no interior da glândula, o que aumenta as chances de resolução da infecção (eficácia) e reduz potencialmente as recidivas, principalmente por que a glândula mamária apresenta alta concentração de neutrófilos (Oliveira et al. , 2009) . As recidivas são frequentes com as formulações tradicionais que não possuem penetração intracelular elevada e com isso não atingindo a concentração mínima inibitória (CMI) dentro do compartimento intracelular. O fármaco livre penetra dentro das células por outros mecanismos mais lentos e dependentes de transporte unimoleculares , ao passo que, na forma nanoparticulada um número muito maior de moléculas penetra de uma só vez dentro das células, encapsuladas dentro dos nanocarreadores, agindo de forma similar a um "Cavalo de Tróia". Outra forma é a adesão não-específica de milhares de nanocápsulas na superfície das células, o que também promove a absorção de maior quantidade de fármaco pela célula alvo.
A nanoencapsulação também impede a rápidametabolização dp. fármaco pelas células após administração e impede a eliminação rápida do fármaco do local de ação, o que ocorre quando o fármaco é administrado na sua forma livre, ou não encapsulada. Os excipientes utilizados nas formulações propostas são inócuos, biodegradáveis, biocompativeis , de origem natural e não comprometem as funções da glândula, não produzindo nenhum tipo de lesão celular ou citotoxicidade (Mosqueira et al., 2000 e 2001) . Neste contexto, a administração de uma formulação nanoparticulada por via intramamária é uma alternativa promissora para tratamento efetivo da mastite em rebanhos leiteiros. Sua aplicação tem o potencial de aumentar a retenção do fármaco nas células infectadas por microorganismos, principalmente por S. aureus. Uma propriedade importante das formulações aqui apresentadas é a capacidade de permanecer no local da ação durante o período seco do animal (período de transição entre duas lactações ) .
Tais nanoestruturas podem encapsular fármacos tais como antibacterianos , antimicóticos , antiparasitários , vitaminas, anti-inflamatórios não esteróides, anti- inflamatórios esteroidais, antivirais, antineoplásicos , anestésicos, hormônios ou suas combinações e, serem administrados por diferentes vias de aplicação tais como via oral, intra articular, parenteral, ocular, mamária, tópica, nasal, otológica, retal, vaginal e/ou combinação destas vias.
A presente invenção objetiva-se uma nova terapia para o tratamento e profilaxia de enfermidades de animais não humanos contornando o inconveniente da administração de doses repetidas e do emprego de altas doses de fármaco usadas nas formulações tradicionais, o que reduz o estresse animal e o aparecimento de resíduos (de fármaco) nos produtos de origem animal. As composições nanoparticuladas de fármacos de uso veterinário também reduzem o aparecimento de efeitos colaterais em relação ao uso do fármaco na forma livre, pois as nanoestruturas propostas neste documento direcionam o fármaco no organismo animal para o alvo desejado da ação, reduzindo a distribuição errática do fármaco livre. Utilizando-se estas formulações, a eficácia do fármaco pode ser aumentada, devido ao direcionamento ativo à adesividade e à capacidade dos nanocarreadores de se acumularem em tecidos em que ocorre aumento da permeabilidade vascular (direcionamento passivo) . Esses podem ser os tecidos nos quais as nanoparticulas se acumulam, por exemplo, os inflamados e os neoplásicos, além dos órgãos com intensa atividade fagocitária como por exemplo o baço, o fígado, os linfonodos, o pulmão, a medula óssea e nas mucosas em geral.. Ademais, os fármacos na sua forma livre, tal como são administrados nas formulações comerciais, necessitam de múltiplas administrações para atingir elevadas concentrações nos diferentes tecidos, causando variações dos níveis plasmáticos que são causadores de toxicidade e/ou desenvolvimento de resistência microbiana. . Fármacos na forma nanoencapsulada apresentam liberação prolongada e ficam mais restritos aos sítios de ação e às células alvo, graças às especificidades dos componentes da formulação e das suas características físico-químicas . Desta forma os fármacos encapsulados podem atingir especificamente o alvo e serem liberados lentamente e, principalmente, no sítio de ação, evitando perdas e inativações dos fármacos em outros tecidos. Desta maneira as doses podem ser reduzidas, eficácia aumentada e a toxicidade reduzida, reduzindo a necessidade de contenção, e manipulação excessiva dos animais. A contenção e a mudança de manejo são fatores dificultadores na adequada terapia dos animais. Essas condições são grandes geradoras de estresse, acarretando em liberação endógena de adrenalina, noradrenalina e corticoides, o que resulta em aumento de atividade (reação de fuga e luta) e queda de imunidade. Tal situação, se agrava a medida em que a administração do medicamento necessita ser mais frequente. Decorrente dessas dificuldades a intervenção medicamentosa pode ocorrer de forma falha ou tardiamente. Adicionalmente, a necessidade de múltiplas administrações para a manutenção da concentração terapêutica, pode levar à transposição do limiar de toxicidade do fármaco, incorrendo em efeitos adversos e aumento de resíduos de medicamentos nos produtos de origem animal (Vandamme, 2010) .
De acordo com França-Filho e colaboradores (2006), dentre as principais perdas económicas associadas à bovinocultura de corte destacam-se o estresse de manejo, que pode gerar perdas de até um Kg de peso vivo/manejo e à formação de abscessos pela aplicação de medicamentos veterinários que utilizam veículo oleoso. Entretanto, o uso de sistemas de liberação controlada em medicina veterinária pode promover redução na frequência de administração do medicamento, redução na duração do tratamento e redução no estresse para os animais (Sautter, 2006) .
Particularmente, a presente invenção permite a veiculação de fármacos hidrofóbicos e anfifílicos na forma nanodispersa em veículos aquosos. Portanto, esta invenção torna, possível . a administração de fármacos insolúveis em água por um grande número de vias de administração incluindo a via endovenosa.
A maioria das formulações comerciais encontradas no mercado apresentam fármacos com meia vida curta e, para reduzir o número de aplicações, as indústriasutilizam seus sais pouco solúveis em meio aquoso e veículos oleosos como é o caso da Terramicina®. Uma segunda estratégia é aumentar a concentração de princípio ativo na fórmula, como é o caso do Ivomec®Gold, que possui uma concentração de ivermectina 3,15 vezes maior quando comparado ao Ivomec® simples. Em ambos os casos existem limitações. No primeiro pode ocorrer necrose tecidual pela aplicação incorreta, como também, limitação de volume a ser aplicado em um mesmo local, além da possibilidade do local da administração do fármaco ficar extremamente dolorido. No segundo caso o aumento da concentração do fármaco pode acarretar em toxicidade para indivíduos mais sensíveis. Por sua vez, os nanocarreadores da presente invenção são capazes de vetorizar sais pouco solúveis em veículo aquoso, mantendo uma liberação sustentada e muitas vezes controlada. Tal condição permite ainda sua aplicação endovenosa e, por utilizar um veículo aquoso minimisa a dor pós aplicação quando comparado ao veículo oleoso.
0 usos de insertes e implantes são outras estratégias adotadas para contornar a necessidade de múltiplas aplicações de medicamentos. Baeyens e colaboradores (2000) descrevem o usos de insertes para o tratamento de infecções oculares em animais, contudo tais dispositivos geram grande desconforto para o paciente além da necessidade de microcirurgias c o risco de infecções . Os nanocarreadores descritos nas reivindicações no presente documento passam despercebidos pelos animais por possuírem tamanho nanométrico, e ainda apresentam a vantagem de permanecerem aderidos à mucosa ocular devido à característica muco adesiva conferida pela quitosana . (Illum et al . , 2001) que reveste o nanocarreador . A característica muco adesiva desses nanocarreadores permite ainda que eles sejam utilizados por outras vias de administração medicamentosa, cuja a existência de mucosa lhes dêem suporte para adesão, a citar a via oral, nasal, vaginal e anal. Por sua vez, Rathbone et al . (2000) relatam o uso de dispositivos intravaginais e subcutâneos para a liberação controlada de hormônios, objetivando controlar o ciclo estral de animais. Contudo tais dispositivos necessitam de pelo menos duas contenções dos animais e, dependendo do tipo/local do implante se faz necessária intervenção mais invasiva, que por vezes chega a ser cruenta. Com objetivo de promover a liberação controlada de fármacos, sem contudo necessitar . da remoção do implante, o documento US 4938763, descreve o uso de implantes biodegradáveis para liberação controlada de cisplatina, todavia, estes necessitam de uma ação mais invasiva para sua administração quando comparada à presente invenção que pode ser feita com o auxílio de agulha e seringa .
Apesar de existir na literatura inúmeros artigos que citam o usos de nanopartícuias poliméricas para a liberação controlada ou o direcionamento de fármacos veterinários, nenhum define, qual grupo de fármacos podem ser encapsulados, qual via de administração do medicamento deve ser utilizada, ou mesmo qual enfermidade pode ser tratada com . tais. nanoestruturas .( Rather et al . "Nanotechnology : A Novel Tool for Aquaculture and Fisheries Development" Fisheries and Aquaculture Journal, Volume 2011: FAJ-16; Ramírez-Mella e Hernández-Mendo "Nanotechnology on Animal Production", Tropical and Subtropical Agroecosystems, 12 (2010): 423 -429; Chakravarthi e Balaji "Applications of Nanotechnology in Veterinary Medicine" Veterinary World, 2010, v. 3 (10) : 477-480; Narducci, "An Introduction to Nanotechnologies : What_s in it for Us?" Veterinary Research Communications, 31(Suppl. 1) (2007) 131-137; Scott "Nanotechnology and animal health" Rev. sei. tech. Off. int. Epiz., 2005, 24 (1), 425-432). No artigo, "Low-energy nanoemulsification to design veterinary controlled drug delivery devices" Vandamme e Anton (International Journal of Nanomedicine, 2010:5 867-873) descrevem a produção de nanoemulsões para o tratamento de gado, suínos e aves, nas quais estão encapsulados o cetoprofeno, a sulfametazina e a vitamina D, sem contudo descrever quais doenças podem ser tratadas. Quando se compara as nanoemulsões produzidas por Vandamme e Anton aos nanoreservatórios objetos desta invenção, estes são mais estáveis em meios fisiológicos ricos em proteínas, basicamente pela presença de revestimento polímérico rígido. Adicionalmente, as nanoemulsões descritas são incapazes de efetuar o direcionamento do princípio ativo.
No mercado estão disponíveis para compra os produtos nanoestruturados Paccal® Vet (paclitaxel) , Doxophos® Vet
(doxorubicin) , Carbomexx® Vet (carboplatin) , Docecal® Vet (docetaxel) , baseados na plataforma Oasmia 's de produção de micelas nanométricas a partir do XR-17, um éster acrílico com grupo funcional hidroxila. A empresa produtora relata a redução" da~~ toxicidade - dos quimioterápicos utilizados .a formulação quando aplicados em cachorros e gatos, contudo não relata direcionamento ou características de bioadesão do sistema. Complementando, ainda, os sistemas micelares possuem estabilidade reduzida em meios biológicos pela falta de um revestimento polimérico rígido e pela destruição de sua estrutura após diluição em água. Conforme descrito US 7850990 os lipossomas também podem ser utilizados para promover a liberação controlada e o direcionamento de quimioterápicos anticarcinogênicos e outros fármacos veterinários, porém apresentam as mesmas limitações de estabilidade em meio biológico que os sistemas micelares e possuem alto custo e dificuldades de estabilização físico-química .
No documento de patente US 20100150832, os autores descrevem a confecção de nanopartículas capazes de promover a liberação controlada e o direcionamento de fármacos, utilizando polímeros de policetais. Todavia estas nanopartículas não possuem capacidade mucoadesivas como as apresentadas na presente invenção, são facilmente hidrolizáveis em água e, tão pouco, o documento relata as possíveis infecções a serem tratadas com o sistema proposto. A patente US 7767656 descreve a confecção de nanopartículas a partir de blendas entre os polímeros metilcelulose e ácido hialurônico. Devido a hidrofilia desses polímeros, esses sistemas são menos eficientes em encapsular agentes hidrofóbicos, quando comparado à presente invenção. Adicionalmente, no mesmo documento não existe menção sobre a carga elétrica superficial das nanopartículas, fator que é relevante para o direcionamento e a para a mucoadesividade das mesmas devido à interação eletrostática . . _ O mecanismo de incorporação de fármacos em nanoporos e sua posterior aplicação como sistema de liberação controlada foi proposto no documento US 7713573, contudo o elevado índice de polidispersão dos nanoporos impede seu uso pela 5 via endovenosa. Ademais, a necessidade de elevação de temperatura e pressão para incorporação de fármaco ao nanoporo é restritiva para vários compostos de uso terapêutico .
No documento US 7585521 foi proposto o uso de
10 nanopartículas de cerâmicas para liberação controlada de fármacos, incluse os veterinários. Diferentemente das nanopartículas dessa invenção estas partículas não são biodegradáveis e algumas das substâncias que fazem parte de sua composição, como por exemplo as nanopartículas de
15 sílica são responsáveis por silicose nos animais.
Adicionalmente, nenhum dos documentos de patente (i.e. US 7585521; US 7713573; US 7767656; US 7767656; US 7767656; US 20100150832; US 7850990) definem as enfermidades de animais não humanos a serem tratadas, o que ocorre na
20 presente invenção na reivindicação 55.
Neste contexto, aplicação de formulações nanoparticuladas contendo antibacterianos , antimicóticos , antiparasitários , vitaminas, antiinflamatórios não esteroidais, antiinflamatórios esteroidais, antivirais,
25 antineoplásicos , anestésicos e/ou hormônios administrados pelas vias oral, parenteral, ocular, mamária, tópica, intra articular, nasal, otológica, retal, vaginal e/ou combinação destas vias são uma alternativa promissora para o tratamento e para profilaxia efetiva das enfermidades dos
_30. animais.,. não humanos..
Os Nanocarreadores contendo um ou mais antibacterianos, antimicóticos , antiparasitários , vitaminas, antiinflamatórios não esteróides ou esteroidais, antivirais, antineoplásicos, anestésicos ou hormônios como principio ativo da presente invenção são selecionados do grupo das sulfonamidas , dos nitrofuranos , das quinolonas, das fluoroquinolonas, das cefalosporinas de primeira a quinta geração, dos aminoglicosideos , dos macrolideos, das lincosamidas , do cloranfenicol , das tetraciclinas , das polimixinas, dos beta-lactâmicos , antimicóticos sistémicos, antimicóticos tópicos, vitaminas lipossolúveis , inibidores de neuraminidase, inibidores da transcriptase reversa, inibidores não glicosideos da transcriptase reversa, inibidores de proteases, análogos de nucleosideos inibidores da transcriptase reversa, benzimidazóis , imidatiazóis , tetraidropirimidinas, organofosforados , avermectinas, milbemicinas , compostos heterocíclicos, arsenicais, nitroscanato, benzimidazóis, rafoxamidas, imidinas, imidotiazóis , niclosamidas , carbamatos, piretróides, imidaclopridas , antiprotozoários , salicilanilidas , imidaclopridas, corticosteróides , antiinflamatórios não esteróides, salicilatos, derivados do ácido antranílico, benzidaminas , derivados arilcanóicos , derivados do ácido propiônico, derivados pirazolônicos , alcalóides do ergot, hormônios proteicos, análogos de hormônio liberador de gonadotrofina, hormônios esteróides agentes alquilantes, agentes antimetabólicos , antineoplásicos de origem natural óu antineoplásicos sintéticos, e/ou suas combinações com outros princípios ativos; como exemplo de princípios ativos tem-se.sulfametazina, ...... sulfamerazina, sulfaquinoxalina, sulfacloropiridazina, sulfadiazina, sulfanilamida , sulfatiazol, sulfisoxazol , sulfametizol , sulfacetamida, sulfametoxazol, sulfafenazol , sulfamoxol , sulfametoxina, sulfametonidina, sulfadoxina, sulfametoxipirazina, sulfadimetoxina, sulfaguanidina, ftalilsulfatiazol, succinilsulfatiazol, ftalilsulfacetamida, nitrossulfatiazol, sulfacetamida , mafenida, sulfadiazina e seus sais, sulfaclorpiridazina, sulfadimerazina, sulfadimidina, sulfaetoxipiridazina, sulfafurazol , sulfameter, sulfametilpiridina, sulfametina, sulfametopirazina, sulfametoxidiazina, sulfametoxidina, sulfametoxipiridazina, sulfametoxipirimidina, sulfamezatina, sulfamidina, sulfamidodimetilpirimidina, sulfamonometoxina, sulfanilacetamida, sulfanilamidopirimidina, sulfanilaminotiazol , sulfanilguanidina, sulfapiridina, sulfapirimidina, sulfassalazina, sulfatalidina, furaltadona, nitrofurantoina, furazolidona, furoxona, nitrofurazona, dapsone, ácido nalidixico, ácido oxolinico, ácido pipemidico, ciprofloxacino, enrofloxacino, lomefloxacino, norfloxacino, ofloxacino, perfloxacino, rosoxacino, levofloxacino, acrosoxacino, cinoxacino, besifloxacino, penicilina, metacilina, tameticilina, doxiciclina, benzilpenicilinas (penicilina V, fenoximetilpenicilina e penicilinas G sódica, potássica, procaina ou benzatina) , aminopenicilinas (ampicilina, amoxicilina, hetacilina e carbenicilina) , hetacilina, isoxazolilpenicilinas
(oxacilina, cloxacilina e dicloxacilina) e penicilinas anti-pseudomonas ( ticarcilina, piperacilina, azlocilina e mezlocilina) , ceftiofur, cefadroxil, cefalexina, cefaloridina,.__ cefalotina, cefapirina, cefalonium, cefazolina, cefradina, cefacetril, cefaclor, cefamandol, cefamicina, cefonicid, ceforanid, cefoxitina, cefuroxime, cefquinome , cefixima, cefoperazona, cefotaxima, ceftazidima, ceftizoxima, cefoxazole, ceftriaxona, moxalactan, vancomicina, trimetoprim, aminocidina, rifaximina, tiamulina, espectinomicina, aminosidina, estreptomicina, dihidroestreptomicina, gentamicina, neomicina, tirotricina, canamicina, dibecacina, netilmicina, tobramicina, ácido clavulânico framicetina, rifamicina, ácido fucidico, oleandomicina , penetamato, amicacina, bacitracina, clindamicina, eritromicina , espiramicina, lincomicina, novobiocina, pirlimicina, tilosina, clortetraciclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina, polimixina B ou polimixina (colistina) , nistatina, griseofulvina, anfotericina b, cetoconazol, itraconazol, terbinafina, tolciclato, tioconazol, clotrimazol , isoconazol, miconazol, ciclopirox olamina, fluconazol, mebendazol , flubendazol, fembendazol , cambendazol , albendazol, oxibendazol, oxfendazol, parbendazol, tiabendazol, tiofonato, amitraz, tetramisol, levamisol, febantel, niclosamida, praziquantel, pamoato de pirantel, pamoato de pirvinio, tartarato de morantel, triclorfon (inetrifonato) , diclórvos, clorpirifós, malation, diazinon, dimetoato, fention, abamectina, ivermectina, moxidectina, doramectina, nemadectin, milbemicina oxima d, fenotiazina, piperazina, nitroxinil, disofenol, tiacetarsamida (arsenamida) , diidrocloridrato de melarsomina , mebendazol, fembendazol, albendazol, cambendazol, tiabendazol, parbendazol, flubendazol, oxfendazol, triclambendazol, febantel, tiofanato, netobimin, óxido . arsenioso, . melarsoprol, . tetramizol, levamizol, metilcarbamatos , parbendazol, mebendazol, flubendazol , flumetrina, permetrina, cipermetrina, deltametrina, closantel, rafoxanida, monossulfeto de tetraetiuran (monossulfiran) , cloronicotinil nitroguanidina, fipronil, lufenuron, nitenpyram, metronidazol, pirimetamida, amprólio, clopidol, monenzina, nicarbazina, toltrazuril, maduramicina, narazina, nitrofurazona, aceturato de diaminazeno, imidocarb, diquinoliluréa, primaquina, hidrocortisona, cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, triamcinolona, parametasona, betametasona, dexametasona , flumetasona, dipirona, fenilbutazona, aminopirina, naproxeno, flunixina meglumina, pranoprofeno, suprofeno, flurbiprofeno, indometacina, diclofenaco sódico, ácido acetilsalicilico, ácido salicilico, paraminofenol , idoxuridina, aciclovir, ganciclovir, amantadina, rimantadina, oseltamivir , zanamivir, nevirapine, delavirdine, efavirenz, zidovudine, didanosine, zalcitabine, stavudine, lamivudine , abacavir, emtricitabine, amprenavir , fosamprenavir, indinavir, ritonavir, saquinavir, nelfinavir, tenofovir, adefovir, vitamina K, vitamina A, vitamina D, vitamina E, tetracaina, proximetacaína, lidocaina, xilasina, cetamina, maleato de ergovina, maleato de metilergometrina, bromocriptina, mecloretamina, ciclofosfamida, melfalan, clorambucil, etileneminas (trietilenotiofosforamida) , sulfonados alquilicos (bussulfano) , nitrosuréias , triazenos
(dacarbazina) , análogos do ácido fólico (metotrexato) , análogos da pirimidina ( fluorouracil , citarabina) , análogos da purina (mercaptopurina) , cisplatina, 1-asparginase, hidroxiuréia, vinblastina, vincristina, doxorrubicina, dactinomicina, bleomicina, . dietilestilbestr.oL, cipionato.de estradiol, aliltrembolona, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, progesterona, cloprostenol sódico, dinoprosdt trometamina, altrenogest, fluprostenol , tiaprost, prostaglandina f-2-alfa, melatonina, gonadotropina coriônica humana, hormônio foliculo estimulante, gonadotropina coriônica equina, hormônio luteinizante, gestrinona, gonadorrelina, goserelina, buserelina, leuprolida, danazol, deslorrelina, hormônio do crescimento, propionato de testosterona, cipionato de testosterona ou ocitocina, não se restringindo a estes princípios ativos, seus derivados, seus sais e/ou suas combinações, salientando-se que o princípio ativo a ser incorporado aos nanossistemas poderá pertencer a qualquer dos grupos supracitados.
Assim, com intuito de obter um produto para tratamento da mastite, caracterizada por uma administração intramamária, ou mesmo por injeções locais por via parenteral, que não necessite de múltiplas infusões (dose única e liberação prolongada) e que tenha capacidade de aderir e penetrar nas células infectadas da glândula mamária do animal (direcionamento do princípio ativo) chegou-se ao resultado que é o objeto desta invenção, a qual apresenta uma nova formulação de antibiótico encapsulado em nanocarreadores de natureza lipídica e polimérica .
Apesar da existência na literatura de micropartícuias contendo antibióticos para mastite nos trabalhos de: Ziv and Linder. "Encapsulated forms of slow-release dry cow products of rapidly absorbed antibiotics" . Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics 6 (2008) 33 - 40; Henry-Michelland . e cols." Attachment of . antibiotics. to, nanoparticles : preparation, drug release and antimicrobial activity in vitro". International Journal of Pharmaceutics 35 (1987) 121-127 ; Fattal E. e cols. "Ampicillin loaded liposomes and nanoparticles : comparison of drug loading, drug release and in vitro antimicrobial activity. Journal of Microencapsulation 8 (1991) 29-36; Anderson J C. e cols." The effect of incorporation of cloxacillin in liposomes on treatment of experimental staphylococcal mastitis in mice". Journal of veterinary pharmacology and therapeutics 9 (1986) 303-9 e nos documentos de patente EP0260854 e WO 9531180 (Al), a presente invenção trata do encapsulamento de antibióticos em nanocarreadores com capacidade adesiva no úbere dos animais.
Na pesquisa realizada na literatura e nos bancos de dados de patentes não foram encontrados registros que relacionassem o antibiótico cloxacilina benzatina e nanocarreadores com aumento de eficácia antibacteriana na mastite na forma nanoestruturada . Além disso, em nenhum desses documentos é feita referência ao uso de materiais que possibilitam a adesão dos nanocarreadores às células da parte superior do teto após administração intramamária o que aumenta as chances de eficácia destas novas formulações para uso veterinário em relação aos produtos comercializados e patenteados. No mesmo contexto, não existe referência de nanoparticulas poliméricas contendo cloxacilina benzatina que tenham alta possibilidade de penetrar nas células infectadas e liberar o fármaco de forma prolongada.
A patente WO 9531180 descreve um tratamento para mastite compreendendo a administração de uma formulação composta por ...urna . suspensão aquQsa__.de cloxacilina benzatina micronizada e em seguida de um gel contendo um metal pesado para selar o teto, o que pode causar no período de lactação uma eventual contaminação do leite por metais pesados. Além disso, neste documento os resultados referentes à velocidade de liberação do antibiótico não estão 5 apresentados.
A patente EP 0260854 descreve o microencapsulamento de uma mistura de cloxacilina benzatina e ampicilina trihidratada para tratamento da mastite, mas apresenta uma polidispersão das partículas muito grande, sendo difícil ou
10 impossível prever a velocidade de liberação do fármaco a partir dessas microestruturas . Entretanto, as microcápsulas possuem menor capacidade de adesão à parte superior das células do teto devido ao seu maior peso, que podem levar à sedimentação próxima ao canal do teto devido à diferença de
15 densidade, ao passo que a forma nanoparticulada não se sedimenta devido às suas características coloidais.
A patente RU 2350332 descreve uma emulsão contendo doxiciclina para tratamento da mastite em vacas no período seco, apresentando o inconveniente de ser instável em meio
20 fisiológico, principalmente no leite o qual apresenta caseína. Além disso, não possui liberação controlada, nem direcionamento do fármaco. As emulsões são menos estáveis em meios biológicos devido às interações com as lipoproteínas , liberando o fármaco mais rapidamente
25 (Mosqueira et al., 2007). Já os nanocarreadores possuem uma parede polimérica mais resistente à degradação e que controla a liberação do fármaco.
A patente CN 101439044 descreve um gel contendo polivinilpirrolidonaiodo (PVP-I) para tratamento da —30—mastite , mas - apresenta o incoveniente . de poder- -causar uma reação inflamatória no úbere do animal como efeito adverso do tratamento, tendo o potencial de produzir uma mastite química induzida pelo efeito irritante do iodo liberado.
As patentes KR 20080083499 e KR 20070059787 utilizam nanopartículas de prata coloidal para tratamento da mastite, mas apresentam o inconveniente de resíduos no leite ou até mesmo a prata pode atravessar a barreira hemato-glandular atingindo a circulação sistémica.
A cloxacilina na forma sódica é utilizada para tratamento da mastite durante a lactação por via intramamária . De acordo com Anderson et al. (1986) a cloxacilina encapsulada em lipossomas foi direcionada para o tratamento da mastite na fase de lactação entretanto, o uso de sistemas de liberação sustentada durante este período aumenta o descarte de leite, visto que o tempo de cedência do fármaco é maior. O lipossoma tem estabilidade reduzida em meio fisiológico quando comparada aos nanocarreadores poliméricos. Este tratamento foi realizado em modelo murino, o que não está relacionado diretamente com a presente proposta. Os lipossomas são formulações bastante instáveis, onerosas e de difícil estabilização e produção comparativamente as nanocápsulas produzidas nesta invenção .
Sistemas carreadores modernos de fármacos tem sido alvo de numerosos estudos na área farmacêutica com intuito de controlar a velocidade de liberação dos fármacos no organismo, diminuindo a dose necessária e aumentando a seletividade em relação ao alvo (Schaffazick et al.,2003; Chacon et al.,1999; De Chasteigner et al., 1996; Santos- agalhães et al . , 2000).
Os ..nanocarreadores poliméricos do tipo reservatório são constituídos de um núcleo oleoso envolto por uma membrana polimérica (Legrand et al., 1999), funcionando como carreadores de escolha para a administração de substâncias de baixa solubilidade em água como a ' cloxacilina benzatina, pois são formadas por polímeros estáveis, com baixa toxicidade que consistem de materiais biocompatíveis e biodegradáveis, os quais são degradados in vivo em fragmentos menores facilmente excretados, como o dióxido de carbono e água.
Para a preparação dos nanocarradores são utilizados polímeros geralmente na faixa de 0,2 a 2% (p/p) · Poliésteres, poliamidas, policianoacrilatos , policarbonatos, poliuretanos , quitosanas, quitinas, gelatinas, metacrilatos , copolímeros do ácido metacritalo e ésteres acrílicos, polialquilacrilatos , polimetilacrilatos , polímero do álcool vinílico, ou combinações ou misturas destes materiais podem ser empregados, de forma geral. Entretanto os mais indicados pela sua degradabilidade são os poliésteres hidroxiácidos : homo ou co-polímeros do ácido lático, glicólico e hidroxicapróico e suas diferentes combinações e proporções com peso molecular variando de 2000 a 100000. A saber: ácido poli (D, L - lático), ácido poli (glicólico) , ácido poli (lático-co-glicólico) , ροΐί-ε- caprolactona , ροΐί-β-hidroxibutirato, ροΐί-β-
(hidroxibutirato-co-valerato) e poli (hidroxialcanoatos ) . Surfactantes hidrofílicos (tais como polisorbatos 20, 21, 40, 60, 61, 65, 80, 81, 85 e 120; copolímeros de polióxido de etileno-polióxido de propileno tais como os poloxamersl24 , 188, 237, 338 e 407) e lipofílicos (ésteres do sorbitano tais como monolaurato de sorbitano, trilaurato de sorbitano., ..monopalmitato de sorbitano, . monoestearato de sorbitano, triestearato de sorbitano, monooleato de sorbitano, trioleato de sorbitano; lecitinas; poligliceril- 6 dioleato) também são utilizados, usualmente de 0,2 a 2% (p/p) ·
Os óleos empregados podem ser vegetais (óleo de soja, milho, algodão, oliva, amêndoa, girassol, uva) ou minerais (parafina liquida, parafina liquida "light") ou ésteres de ácido graxo (poligliceril-6 dioleato, polietilenoglicol-6 do óleo de oliva, amendoim e milho) e triglicerideos de cadeia média (tal como triglicerideo do ácido cáprico/caprilico) devendo apresentar ausência de toxicidade, não serem capazes de degradar ou solubilizar o polímero e alta capacidade de dissolver a droga em questão (Legrand et al. , 1999) .
Os nanocarreadores podem ter a superfície modificada por revestimento com quitosana. Os nanocarreadores aqui propostos obtidos de ροΐί-ε-caprolactona, por exemplo, concentram os fármacos encapsulados em células do sistema fagocitário mononuclear (SFM) . As nanocarreadores convencionais revestidos com quitosana possuem uma característica de bioadesividade que aumenta a retenção da partícula carregada de fármaco no local de ação, por exemplo nas partes superiores do úbere.
Neste contexto, estudos recentes com nanocarreadores do tipo reservatório têm mostrado que estas estruturas possuem vantagens específicas sobre lipossomas, pois possuem maior estabilidade física em meio biológico, baixa toxicidade inerente, elevada encapsulação de substâncias lipofílicas em seu núcleo oleoso (Legrand et al . , 1999, Mosqueira et al., 2001 e 2006). Além disto, eles podem serproduzidos_.por .método simples, rápido, eficiente e de baixo custo. De forma similar aos lipossomas, as nanopartícuias poliméricas de mesmo tamanho também podem ser captadas pelos focos inflamatórios devido ao aumento da permeabilidade vascular no local (Barratt, 2000) , conforme consta das patentes US 6,171,796; US 6,632,671 e US 7,060,689 e PI0605102-2A.
A quitosana é um polissacarideo hidrofilico, amino derivado do processo de desacetilação da quitina que constitui a carapaça de insetos e crustáceos. Por ser um polímero natural e biodegradável a quitosana tem sido proposta como um material atraente para usos diversos, principalmente em engenharia, biotecnologia e medicina (Hirano, 1999) . A quitosana é insolúvel em água, podendo ser caracterizada como um polieletrólito catiônico. É solúvel em ácidos orgânicos fracos ou diluídos como ácido acético 3% produzindo uma solução viscosa. Para se contornar o problema da insolubilidade em água, que limita sua aplicação em vetores de fármacos, principalmente para veicular peptídeos e genes, trabalhos têm sido publicados trazendo diferentes metodologias de obtenção de quitosanas solúveis em água (Signini e Campana, 2001; Garcia-Fuentes et al., 2005) desde incubação até a incorporação da quitosana em métodos de produção de nanopartícuias pré- preparadas. Como exemplo, o revestimento de nanopartículas lipídicas com carga de superfície negativa tem sua carga invertida quando a quitosana é incubada no meio (Garcia- Fuentes et al., 2005). Assim, as partículas resultantes possuem propriedades de superfície e estabilidade diferentes das originais. A adaptação de metodologias de produção existentes para incorporação da quitosana pode ser avaliada no trabalho_ de . Calvo .et al . ( 1997 ).._ onde a adição da quitosana na fase aquosa acidificada permitiu obter nanoemulsões e nanocápsulas com quitosana adsorvida aos fosfolipides da parede de acordo com patente US 5,843,509. Na presente invenção a quitosana na forma de sal é utilizada na fase aquosa neutra.
A cloxacilina é um antibiótico β-lactâmico usado em práticas veterinárias por causa de sua atividade contra bactérias gram-positivas e negativas. O fármaco é utilizado no tratamento e prevenção de mastite bovina causada por Staphylococus (Pérez et ai., 1997).
A vantagem desta invenção está na criação de uma nova possibilidade de terapia da mastite em gado leiteiro pela via intramamária no período seco através do encapsulamento do fármaco cloxacilina benzatina em nanocarreadores que são avidamente fagocitados pelas células presentes nas regiões infectadas do interior da glândula mamária. Estes nanocarreadores possuem maior penetração em regiões onde a inflamação está presente como descrito na patente PI 0605102-2A.
As formulações de nanocarreadores do tipo reservatório utilizadas nesta invenção contendo a cloxacilina benzatina em seu interior foram preparadas por um método diferente do descrito por Fessi et al. (1989) no que se refere aos constituintes das formulações e nas proporções dos solventes das fases, as quais foram específicas para o fármaco utilizado.
Os polímeros utilizados na preparação dos nanocarreadores aqui propostos foram o ροΐί-ε-caprolactona (PCL) e a quitosana (QUIT) , ambos biocompatíveis e biodegradáveis, sendo facilmente excretados pelo organismo. Dessa íorrr.a, essas. . nanoestruturas . .. são . .interessantes carreadores devido a sua estabilidade em meio biológico e baixa toxicidade em função da utilização de polímeros biodegradáveis. Considerando todos estes aspectos, a presente invenção foi preparada para utilização em medicina veterinária como uma nova forma de tratamento de mastite bovina por via intramamária , no período seco, tendo como vantagens principais a facilidade de manuseio no momento do uso, a simplicidade na preparação e a viabilidade para a comercialização. Além desta nova possibilidade, esses nanocarreadores também podem ser utilizados no tratamento dessas e de outras enfermidades, desde que exista afinidade entre o fármaco e o núcleo oleoso.
A presente invenção está baseada no fato de que esses carreadores nanoestruturados são captados pelo sistema fagocitário mononuclear e os de superfície modificada pela quitosana são bioadesivos. Portanto, ambas as formulações possuem potencial de sucesso no tratamento da mastite, pela maior penetração no tecido afetado.
Os nanocarreadores do tipo reservatório foram preparados pelo método de deposição interfacial do polímero pré-formado seguida do deslocamento dos solventes miscíveis com a água e imiscíveis com o óleo e com os polímeros hidrofóbicos .
Estudos clínicos preliminares indicam a eficácia melhorada com as formulações propostas.
Exemplos :
Os exemplos experimentais ilustram esta invenção, sem no entanto limitar sua aplicação.
Exemplo 1: Produção de nanocarreadores do tipo reservatório revestidos com quitosana (NC PCL QUIT) contendo antibiótico de uso. veterinário. Os nanocarreadores de cloxacilina benzatina foram preparados de acordo ■ com os seguintes constituintes (% p/p)
Ροϋ-ε-caprolactona 0, 80%
Lecitina de soja 0,40%
Labrafac CC 0,25%
Poloxamer 188 0, 60%
Quitosana 0, 10%
Cloxacilina benzatina 0,25%
Água qsp . 100%
Para o preparo das nanocarreadores revestidos (NC-PCL- QUIT) contendo cloxacilina benzatina, o polímero poli-ε- caprolactona (PCL) foi dissolvido em 23 ml de uma solução de acetona contendo lecitina de soja (Epikuron 170) e Labrafac CC . O fármaco cloxacilina benzatina foi previamente solubilizado em 7 ml de metanol e adicionado à solução de acetona. Esta fase permaneceu por agitação e aquecimento moderado (30 a 45°C) até completa dissolução dos componentes. Em seguida, a solução orgânica foi vertida em solução aquosa previamente preparada contendo poloxamer 188 e 10 mg de quitosana solúvel em água. Seguiu-se agitação em velocidade moderada, a temperatura ambiente, com o auxílio de agitador magnético por dez minutos. Posteriormente esta suspensão foi levada ao evaporador rotativo, mantendo-se a temperatura do banho em 40-45°C para evaporação dos solventes orgânicos à pressão reduzida. 0 tamanho e o potencial zeta das nanocápsulas obtidas foram 291 nm e +16 mV respectivamente. A eficiência de encapsulação foi de 87%.
Exemplo 2: Produção de nanocarreadores convencionais (NC PCL) contendo antibiótico de uso veterinário. Os nanocarreadores . de cloxacilina. benzatina __foram . preparados de acordo com os seguintes constituintes (% p/p) . Ροΐί-ε-caprolactona 0, 60%
Monoleato de sorbitano 0,40%
Plurol oleique 0, 25%
Poloxamer 188 0,75%
Cloxacilina benzatina 0, 05%
Água qsp 100%
Para o preparo de nanocarreadores convencionais contendo cloxacilina benzatina foram dissolvidos em 7 ml de uma solução de acetona: o polímero poli- -caprolactona (PCL) , monooleato de sorbitano e plurol oleique. O fármaco (cloxacilina benzatina) previamente solubilizado em 3 ml de metanol foi adicionado à solução de acetona. Em seguida, a solução orgânica foi vertida em uma solução aquosa contendo poloxamer 188. Seguiu-se agitação com auxilio de agitador magnético por dez minutos. A evaporação dos solventes orgânicos foi feita de acordo com a metodologia acima. O tamanho foi determinado por espectroscopia de correlação de fótons e o potencial zeta por anemometria do laser dopler. Os valores obtidos foram 322 nm e -28 mV respectivamente. A eficiência de encapsulação foi de 37%. Através da microscopia de força atómica ( FA) imagens das nanocápsulas foram obtidas, evidenciando-se o caráter esférico e homogéneo das partículas.
Tabela 1: Análise do tamanho e potencial zeta dos nanocarreadores contendo diferentes concentrações de cloxacilina benzatina.
% % Concentraç Tamanho Potencial
(p/v) (p/v) ão de médio ± DP1 zeta3 ± PCL QUIT CLOXB (nm) DP2 (mV)
(mg/mL) .
NC- PCL 0, 6 — 0 308, 9 ± 8,2 -30, 47± 2,01
0, 6 -28,20 ±
0,5 322,4 ± 3,9
0, 62
0,8 0,1 +21,00 ±
0 214,3 ±1,5
NC- PCL- 0, 53
QUIT 0,8 0,1 +16,53 ±
2,5 291 ± 5,6*
2,75
0,8 0,1 +14 ±
5 242,9 ± 5,7*
2,75*
1 DP = Desvio padrão (n = 3); 2 I.P = índice de polidispersão (n=3); 3Largura do pico igual a 1,6 em todas as amostras. A análise estatística foi realizada através do teste t student entre as diferentes formulações, em relação às NC brancas. P<0,05 para os parâmetros mostrados tabela em relação à formulação branca, exceto identificados com *.
Tabela 2: Eficiência e rendimento de encapsulação das NC contendo diferentes concentrações de cloxacilina benzatina.
Nanocarreadores EE (%) Rendimento
NC PCL cloxacilina benzatina 0,5 34% 23%
mg/ml
NC PCL cloxacilina benzatina 2,5 instável ND
mg/ml
NC PCL-QUIT cloxacilina benzatina 87% 76%
2 , 5 mg/ml
NC PCL-QUIT cloxacilina benzatina instável ND
5 , 0 mg/ml
ND - não determinado
No caso das nanoestruturas de PCL-QUIT, há a presença de quitosana na superfície dessas partículas, um polímero carregado positivamente que interage com o ânion cloxacilina, aumentando sua adsorção na superfície.
A Figura 1 mostra o Perfil de liberação da CLOXB in vitro a 37 °C em meio PBS contendo 1% de polietilenoglicol e 1% leite a partir de cloxacilina livre e das formulações de NC de PCL 0,5mg e NC PLC-QUIT 2 , 5mg em condições sink. (
A avaliação do perfil de liberação in vitro da cloxacilina benzatina a partir dos nanocarreadores do tipo reservatório foi realizado de acordo com a técnica de diálise direta em dois diferentes meios de liberação. Sacos de diálise foram inseridos em recipientes contendo solução salina tamponada e 1% polietilenoglicol 300 (PBS:PEG) ou salina tamponada contendo 1% leite desnatado (PBS: leite) a 37°C com agitação moderada. Em sacos de diálise distintos com poros de 12.000-14.000 (cut off) foram inseridos: CLOXB livre, suspensão de NC-PCL 0,5 mg/ml e suspensão de NC-PCL- QUIT 2,5 mg/ml nos meios PBS:PEG e PBS: leite. Em intervalos de tempo pré-definidos foram retiradas alíquotas e o meio foi readicionado com o mesmo volume retirado. Logo após, as amostras foram preparadas e o sobrenadante dosado.
De acordo com a figura 1, observa-se um perfil de liberação mais lento com as NC de 0,5 de CLOXB, uma vez que provavelmente a quantidade de fármaco adsorvida na superfície e pronta para desorção é menor que nas NC de 2,5 de CLOXB. Essas últimas apresentam um perfil com plateau, provavelmente devido ao maior teor de fármaco adsorvido na superfície das NC contendo quitosana. Nas duas formulações de NC a liberação apresenta um perfil quase linear, o que indica liberação controlada, nas primeiras 6h, seguido do aparecimento de um plateau, com retenção do restante da ■ CLOXB,- -· provavelmente- relativo à quantidade localizada■ no interior do núcleo oleoso das NC. Irwin et al. (1984) observaram que a CLOXB possui sua dissolução dependente do valor de pH. Seu grupo realizou um estudo de dissolução da CLOXB em meios com diferentes valores de pH: 2, 6 e 9, onde foi observado que em pH 2 e 9 a cloxacilina se degrada e em pH 6 a sua dissolução é dependente da solubilidade até 300 minutos de ensaio. Neste trabalho, a dissolução foi realizada em pH 7,4 pois trata-se do pH do leite de animais com mastite (Gruet et al . , 2001). Não se observou degradação do fármaco até 540 minutos de ensaio por CLAE nessas condições experimentais.
Já em relação à liberação do fármaco das nanocápsulas nos diferentes meios, observa-se que seus perfis são diferentes. As NC-PCL-QUIT 2,5mg contendo CLOXB apresentaram uma liberação mais rápida, mais de 70% em 6hs em meio contendo 1% de leite do que no meio contendo 1% de PEG. Ao contrário, as NC-PCL com CLOXB apresentaram liberação mais rápida em meio contendo 1% de PEG do que em meio contendo 1% de leite. Entre os três gráficos nota-se semelhança no perfil de liberação da CLOXB livre e da encapsulada em NC-PCL. A liberação .foi maior em meio contendo 1% de PEG, diferentemente da NC-PCL-QUIT que possuiu maior liberação em leite. Sendo assim, nanocápsulas contendo o antibiótico cloxacilina benzatina apresentam-se promissoras para administração intramámaria em gado leiteiro .
Como pode ser observado na figura 1, a retenção da cloxacilina benzatina nos nanocarreadores é maior com o polímero PCL (Figura IA) . Mesmo em meio contendo leite (Figura 1B) a retenção do fármaco e a menor velocidade de.liberação são . evidentes comparadas com ...a . cloxacilina benzatina não carreada. Esses dados atestam da eficácia das formulações para liberação lenta de CLOXB no teto do animal .
A Figura 2 mostra imagens de MFA modo intermitente de NC-PCL. Imagem de altura. (A) NC branca (B) NC PCL 0,5 mg/ml. Escala: 5x5 μπι.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Processo de preparação de suspensões coloidais de uso veterinário com tamanhos variando entre 100 e 800 nra, as quais estão aptas a carrear a cloxacilina benzatina com aplicação no tratamento ou profilaxia da mastite em animais no período seco por administração intramamária caracterizado pelo fato de que o referido processo compreende nanocarreadores contendo um núcleo oleoso ou pastoso de dimensões submicrométricas recoberto por uma membrana polimérica que origina nanoreservatórios, nanoenvoltórios e nanocarreadores dispersos em um meio aquoso externo. O processo é composto por:
uma solução contendo um polímero hidrofóbico insolúvel em água, óleo e tensoativo dissolvidos solventes orgânicos miscíveis em água;
- uma solução aquosa neutra podendo conter tensoativo e/ou polímero catiônico na forma de sal solúvel em água;
- a combinação simultânea da fase aquosa e da oleosa forma as nanogotas que são revestidas de um filme polimérico. Para os nanoreservatórios revestidos, a adsorção do polímero catiônico à partícula ocorre por atração eletrostática entre o polímero hidrofóbico e o polímero catiônico para fornecer partículas com carga de superfície positiva.
2. Nanoreservatórios convencionais constituídos de um núcleo oleoso envolto por uma membrana polimérica, conforme definido pela reivindicação 1 caracterizados por constituirem-se em carreadores de agentes antibacterianos , preferencialmente cloxacilina benzatina, para tratamento e prevenção de focos inflamatórios, e. infecciosos na glândula mamária de animais no período seco.
3. Nanoreservatório convencional revestido com quitosana, seus sais ou derivados neutros solúveis em água, de acordo com reivindicação 1, constituído de um núcleo oleoso envolto por uma membrana polimérica, caracterizado por capacidade de bioadesão às células do interior do úbere animal, assim como por constituírem-se em carreadores de agentes antibacterianos , preferencialmente cloxacilina benzatina, para tratamento e prevenção de focos inflamatórios e infecciosos na glândula mamária de animais no período seco.
4. Preparação de nanoreservatórios de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o núcleo oleoso pode ser líquido, semi-sólido ou sólido a temperatura ambiente, contendo antimicrobianos beta- lactâmicos, envolto por uma membrana polimérica.
5. Processo de acordo com reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a % de óleo varia de 0,25 a 5% p/v em relação ao volume final do meio aquoso.
6. Composição de acordo com reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o núcleo oleoso é composto por triglicerídeo de cadeia média, tal como triglicerídeo do ácido cáprico/caprílico, ou ésteres de ácido graxo de 6 a 18 átomos de carbono ou óleos de origem vegetal, tais como óleo de soja, milho, algodão, oliva, amêndoa, girassol, uva, ou óleo mineral tal como parafina líquida, ou poligliceril- 6 dioleato ou polietilenoglicol-6 do óleo de oliva ou de amendoim ou de milho.
7. Nanocarreadores de acordo com reivindicação 1, caracterizados por conterem em■ sua composição polímeros hidrofóbicos estáveis, no interior - da.. glândula, mamária, serem biocompatíveis e biodegradáveis, tais como: poliésteres dos ácidos láctico, glicólico e seus co- polimeros e suas diferentes combinações e proporções com peso molecular variando de 2000 a 100000 a saber: ροϋ-ε- caprolactona (PCL), polímeros dibloco e multibloco derivados dos polímeros ácido poli(lático) (PLA), poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) , ácido poliglicólico (PGA) , Polihidroxialcanoatos (PHA) , poli-β- hidroxibutirato, poli-β- (hidroxibutirato-co-valerato) .
8. Processo, de acordo com reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a % de polímero hidrofóbico varia de 0,1 a 3% p/v em relação ao volume final do meio aquoso .
9. Processo, de acordo com reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a % de quitosana de baixo peso molecular varia de 0,05 a 2% p/v em relação ao volume final do meio aquoso.
10. Composição, de acordo com reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que a % de tensoativo hidrofílico varia de 0 a 2% p/v em relação ao volume final do meio aquoso que pode ser o polisorbato 20 ou 21 ou 40 ou 60 ou 61 ou 65 ou 80 ou 81 ou 85 ou 120; ou pode ser um derivado do copolimero de polióxido de etileno-polióxido de propileno tal como o poloxamer 124 ou 188 ou 237 ou 338 ou 407.
11. Composição, de acordo com reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que a % de tensotivo lipofílico varia de 0,2 a 2% p/v em relação ao volume final do meio aquoso, que pode ser um derivado dos ésteres do sorbitano tais como o monolaurato de sorbitano, o trilaurato de sorbitano, o monopâlmitato de .sorbitano, .o monoestearato de sorbitano, o triestearato de sorbitano, o monooleato de sorbitano, o trioleato de sorbitano; ou um derivado da lecitina, tal como a lecitina de soja.
12. Nanoreservatórios poliméricos, de acordo com reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que contem antibiótico cloxacilina benzatina (e/ou derivados) os quais podem ser administrados por via oral, parenteral, ocular e/ou combinação destas vias.
13. Nanocarreadores, de acordo com reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que contem um ou mais antibióticos como principio ativo selecionados do grupo dos beta-lactâmicos e/ou suas combinações com outros antibióticos. Como exemplo de antibióticos tem-se os do grupo da penicilina e seus derivados como penicilina, penicilina benzatina, cloxacilina, dicloxacilina , flucloxacilina, cloxacilina benzatina, ampicilina, amoxicilina, hetacilina; do grupo das cefalosporinas e derivados da primeira à quinta geração e suas combinações, saliantando-se que o antibiótico a ser incorporado aos nanossistemas poderá pertencer a estes dois grupos.
14. Processo, de acordo com reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que os nanocarreadores hidrofóbicos possuem carga superficial negativa podendo variar de -45 a -25 mV, e positiva para os nanocarreadores revestidos com quitosana podendo sua carga variar de +30 a +10 mV.
15. Nanoreservatórios, de acordo com reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que são capazes de liberar o fármaco com velocidade controlada.
16. Suspensão coloidal de nanocarreadores, de acordo com - reivindicações 1 a 15, -caracterizado pelo.. fato_...de..que pode ser administrada em veiculo farmaceuticamente aceitável aquoso que pode ser um tampão, um gel, ou um spray .
17. Processo, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição veterinária é uma dose única contendo de 5 a 50 % (p/p) de antibiótico em relação aos polímeros totais para uma dose total menor ou igual a 1000 mg de cloxacilina benzatina na formulação.
18. Método, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os nanocarreadores são preparados por um método utilizando dois solventes orgânicos miscíveis com água onde está presente o antibiótico de uso veterinário.
19. Método, de acordo com reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a fase orgânica é misturada com uma fase aquosa neutra podendo conter tensoativos, sendo que os solventes totais são evaporados para menos de um terço do volume total da mistura ao final do processo.
20. Método, de acordo com reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a fase aquosa pode conter também um sal polimérico de reação neutra que é capaz de adsorver ou reagir com o ânion da cloxacilina, podendo este ser um sal de aminopolissacarídeo do grupo das quitosanas, com variados pesos moleculares.
21. Processo de preparação de suspensões coloidais de uso veterinário, de acordo com reivindicações 7, 8, 9 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20, caracterizado pelo fato de que tamanhos variando entre 50 e 800 nm, as quais estão aptas a carrear a cloxacilina benzatina para o tratamento ou profilaxia da mastite em animais no período
■ seco por- administração intramamária , este processo compreende uma matriz polimérica de dimensões submicrométricas podendo ser revestido de tensoativos e/ou por polímeros catiônicos, dentre eles a quitosana originando nanoesferas. Esta formulação é composta por:
uma solução contendo um polímero hidrofóbico insolúvel em água dissolvido em uma solução orgânica, de dois solventes, miscíveis em água;
- uma solução aquosa neutra podendo conter tensoativo e/ou polímero catiônico na forma de sal solúvel em água, o qual foi obtido a partir de quitosana;
- a combinação simultânea da fase aquosa e da oleosa forma nanoesferas. Para as nanoesferas revestidas, a adsorção do polímero catiônico à partícula ocorre por atração eletrostática entre o polímero hidrofóbico e o polímero catiônico para formar partículas com carga de superfície positiva.
22. Método, de acordo com reivindicações 1, 2, 3 e 21 caracterizado pelo fato de que as nanopartículas contendo cloxacilina benzatina ou outro antibiótico são esterilizadas por passagem em filtros estéreis de diâmetros de 0,2 a 0,8 pm.
23. Sistema liofilizado caracterizado pelo fato de que é conforme definido pelas reivindicações 1 a 21.
24. Método, de acordo com reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que diferentes temperaturas são empregadas para congelamento da amostra, preferencialmente de -20 a -196°C.
25. Método, de acordo com reivindicações 23 e 24, caracterizado pelo fato de que diferentes tipos de crioprotetores são empregados, como exemplo glicose, sacarose, _ trealose, _ lactose, frutose, .maltose.,. polidextrose, glicerol, sorbitol, quitosana e seus derivados, gelatina, dióxido de silício coloidal e/ou mistura dos componentes acima citados.
26. Método, de acordo com reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que concentrações de crioprotetores de até 80% (p/p) são adicionadas à preparação a ser liofilizada para obtenção de uma ressuspensão adequada com manutenção das características físico-químicas .
27. Misturas em quaisquer proporções entre as formulações de nanocarreadores conforme descritas nas reivindicações de 1 a 26, entre si, e com a cloxacilina benzatina caracterizado pelo fato de que estão na forma não estruturada, para administração intramamária .
28. Processo de preparação de suspensões coloidais de uso veterinário com tamanhos variando entre 100 e 800 nm, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as quais estão aptas a carrear antibacterianos , antimicóticos, antiparasitários , vitaminas, antiinflamatórios não esteroidais, antiinflamatórios esteroidais, antivirais, antineoplásicos , anestésicos e hormônios para o tratamento ou profilaxia de enfermidades de animais não humanos por administração pelas vias oral, parenteral, ocular, mamária, tópica, nasal, otológica, retal, vaginal e/ou combinação destas vias; este sistema compreende nanocarreadores contendo um núcleo oleoso ou pastoso de dimensões submicrométricas recoberto por uma membrana polimérica que origina nanoreservatórios , nanoenvoltórios e nanocarreadores dispersos em um meio aquoso externo e o processo é composto por: uma solução contendo um polímero hidrofóbico insolúvel em água, óleo e tensoativo dissolvidos solventes orgânicos miscíveis em água;
- uma solução aquosa neutra podendo conter tensoativo e/ou polímero catiônico na forma de sal solúvel em água;
- a combinação simultânea da fase aquosa e da oleosa forma as nanogotas que são revestidas de um filme polimérico e para os nanoreservatórios revestidos, a adsorção do polímero catiônico à partícula ocorre por atração eletrostática entre o polímero hidrofóbico e o polímero catiônico para fornecer partículas com carga de superfície positiva.
29. Nanoreservatórios convencionais constituídos de um núcleo oleoso envolto por uma membrana polimérica, de acordo com reivindicação 1, 2 e 28, caracterizados por constituírem-se em carreadores de agentes antibacterianos , antimicóticos , antiparasitários , vitaminas, antiinflamatórios não esteroidais, antiinflamatórios esteroidais, antivirais, antineoplásicos , anestésicos e hormônios para o tratamento ou profilaxia de enfermidades de animais não humanos.
30. Nanoreservatório convencional revestido com quitosana, seus sais ou derivados neutros solúveis em água, de acordo com as reivindicações 1, 3 e 28, caracterizado pelo fato de que é constituído de um núcleo oleoso envolto por uma membrana polimérica, caracterizado por capacidade de bioadesão às células que possuam proteoglicanos negativamente carregados em sua superfície, assim como por constituírem-se em carreadores.de agentes antibacterianos, antimicóticos, antiparasitários, vitaminas, antiinflamatórios não esteroidais, antiinflamatórios esteroidais , antivirais, antineoplásicos , anestésicos e hormônios para o tratamento ou profilaxia de enfermidades de animais não humanos.
31. Preparação de nanoreservatórios , de acordo com reivindicação 1, 4 e 28, caracterizado pelo fato de que o núcleo oleoso pode ser liquido, semi-sólido ou sólido a temperatura ambiente, contendo antimicrobianos beta- lactâmicos, envolto por uma membrana polimérica.
32. Processo de acordo com reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 28, 29, 30 e 31, caracterizado pelo fato de que a % de óleo varia de 0,25 a 5% p/v, em relação ao volume final do meio aquoso.
33. Composição, de acordo com reivindicação 5, 6 e 32, caracterizado pelo fato de que o núcleo oleoso é composto por triglicerideo de cadeia média, tal como triglicerideo do ácido cáprico/caprilico, ou ésteres de ácido graxo de 6 a 18 átomos de carbono ou óleos de origem vegetal, tais como óleo de soja, milho, algodão, oliva, amêndoa, girassol, uva, ou óleo mineral tal como parafina liquida, ou poligliceril-6 dioleato ou polietilenoglicol-6 do óleo de oliva ou de amendoim ou de milho.
34. Nanocarreadores , de acordo com reivindicação 1, 7 e 28 caracterizados por conterem em sua composição polímeros hidrofóbicos estáveis no interior da glândula mamária, serem biocompatíveis e biodegradáveis, tais como: poliésteres dos ácidos láctico, glicólico e seus co- polímeros e suas diferentes combinações e proporções com peso molecular variando de 2000 a 100000 a saber: ροϋ-ε- caprolactona (PCL), polímeros dibloco e multibloco derivados dos polímeros ácido poli(lático) (PLA), poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) , ácido poliglicólico (PGA) , Polihidroxialcanoatos (PHA), poli-β- hidroxibutirato, poli-β- (hidroxibutirato-co-valerato) .
35. Processo, de acordo com reivindicação 7, 8 e 34, caracterizado pelo fato de que a % de polímero hidrofóbico varia de 0,1 a 3% p/v em relação ao volume final do meio aquoso .
36. Processo, de acordo com reivindicação 3, 9 e 30, caracterizado pelo fato de que a % de quitosana de baixo peso molecular varia de 0,05 a 2% p/v em relação ao volume final do meio aquoso.
37. Composição, de acordo com reivindicações 1, 2, 3,
10, 28, 29 e 30, caracterizado pelo fato de que a % de tensoativo hidrofílico varia de 0 a 2% p/v em relação ao volume final do meio aquoso que pode ser o polisorbato 20 ou 21 ou 40 ou 60 ou 61 ou 65 ou 80 ou 81 ou 85 ou 120; ou pode ser um derivado do copolímero de polioxido de etileno- polióxido de propileno tal como o poloxamer 124 ou 188 ou 237 ou 338 ou 407.
38. Composição, de acordo com reivindicações 1, 2, 3,
11, 28, 29 e 30, caracterizado pelo fato de que a % de tensotivo lipofílico varia de 0,2 a 2% p/v em relação ao volume final do meio aquoso, que pode ser um derivado dos ésteres do sorbitano tais como o monolaurato de sorbitano, o trilaurato de sorbitano, o monopalmitato de sorbitano, o monoestearato de sorbitano, o triestearato de sorbitano, o monooleato de sorbitano, o trioleato de sorbitano; ou um derivado da lecitina, tal como a lecitina de soja.
39. Nanoreservatórios poliméricos, de acordo com
-reivindicações--!- a---12 -e 28 -a- 38,- caracterizado.- pelo... fato ..de que contém antibacterianos , antimicóticos , antiparasitários, vitaminas, antiinflamatórios não esteróides ou esteroidais, antivirais, antineoplásicos, anestésicos e hormônios os quais podem ser administrados por via oral, parenteral, ocular, mamária, tópica, nasal, otológica, retal, vaginal e/ou combinação destas vias.
40. Nanocarreadores , de acordo com reivindicação 12, 13 e 39, caracterizado pelo fato de que um ou mais antibacterianos , antimicóticos , antiparasitários, vitaminas, antiinflamatórios não esteróides ou esteroidais, antivirais, antineoplásicos, anestésicos ou hormônios como principio ativo selecionados do grupo das sulfonamidas , dos nitrofuranos, das quinolonas, das fluoroquinolonas , das cefalosporinas de primeira a quinta geração, dos aminoglicosideos , dos macrolideos, das lincosamidas , do cloranfenicol , das tetraciclinas , das polimixinas, dos beta^lactâmicos, antimicóticos sistémicos, antimicóticos tópicos, vitaminas lipossolúveis , inibidores de neuraminidase, inibidores da transcriptase reversa, inibidores não glicosideos da transcriptase reversa, inibidores de proteases, análogos de nucleosideos inibidores da transcriptase reversa, benzimidazóis , imidatiazóis , tetraidropirimidinas , organofosforados , avermectinas , milbemicinas , compostos heterocíclicos, arsenicais, nitroscanato, benzimidazóis, rafoxamidas, imidinas, imidotiazóis , niclosamidas , carbamatos, piretróides, imidaclopridas , antiprotozoários , salicilanilidas , imidaclopridas, corticosteróides , antiinflamatórios não esteróides, salicilatos, derivados do ácido antranílico, benzidaminas , derivados arilcanóicos , - derivados - do ácido propiônico, derivados pirazolônicos , alcalóides do ergot, hormônios proteicos, análogos de hormônio liberador de gonadotrofina, hormônios esteróides agentes alquilantes, agentes antimetabólicos , antineoplásicos de origem natural ou antineoplásicos sintéticos, e/ou suas combinações com outros princípios ativos; como exemplo de princípios ativos tem-se sulfametazina, sulfamerazina, sulfaquinoxalina, sulfacloropiridazina, sulfadiazina, sulfanllamida, sulfatiazol, sulfisoxazol , sulfametizol , sulfacetamida , sulfametoxazol , sulfafenazol , sulfamoxol, sulfametoxina, sulfametonidina, sulfadoxina, sulfametoxipirazina, sulfadimetoxina, sulfaguanidina, ftalilsulfatiazol, succinilsulfatiazol, ftalilsulfacetamida, nitrossulfatiazol, sulfacetamida, mafenida, sulfadiazina e seus sais, sulfaclorpiridazina , sulfadimerazina, sulfadimidina, sulfaetoxipiridazina , sulfafurazol , sulfameter, sulfametilpiridina, sulfametina, sulfametopirazina, sulfametoxidiazina, sulfametoxidina, sulfametoxipiridazina, sulfametoxipirimidina , sulfamezatina, sulfamidina, sulfamidodimetilpirimidina, sulfamonometoxina, sulfanilacetamida , sulfanilamidopirimidina, sulfanilaminotia zol , sulfanilguanidina, sulfapiridina , sulfapirimidina , sulfassalazina, sulfatalidina, furaltadona, nitrofurantoína, furazolidona , furoxona, nitrofurazona , dapsone, ácido nalidíxico, ácido oxolínico, ácido pipemídico, ciprofloxacino, enrofloxacino, lomefloxacino, norfloxacino, ofloxacino, perfloxacino, rosoxacino, levofloxacino, acrosoxacino, cinoxacino, besifloxacino, penicilina, metacilina, tameticilina, doxiciclina, benzilpenicilinas ... (penicilina V, . fenoximetilpeniçilina _ _e penicilinas G sódica, potássica, procaína ou benzatina) , aminopenicilínas (ampicilina, amoxicilina, hetacilina e carbenicilina) , hetacilina, isoxazolilpenicilinas
(oxacilina, cloxacilina e dicloxacilina) e penicilinas anti-pseudomonas ( ticarcilina, piperacilina, azlocilina e mezlocilina) , ceftiofur, cefadroxil, cefalexina, cefaloridina, cefalotina, cefapirina, cefalonium, cefazolina, cefradina, cefacetril, cefaclor, cefamandol , cefamicina, cefonicid, ceforanid, cefoxitina, cefuroxime, cefquinome, cefixima, cefoperazona, cefotaxima, ceftazidima, ceftizoxima, cefoxazole, ceftriaxona, moxalactan, vancomicina, trimetoprim, aminocidina , rifaximina, tiamulina, espectinomicina, aminosidina , estreptomicina, dihidroestreptomicina, gentamicina, neomicina, tirotricina., canamicina, dibecacina, netilmicina , tobramicina, ácido clavulânico framicetina, rifamicina, ácido fucidico, oleandomicina , penetamato, amicacina, bacitracina, clindamicina, eritromicina, espiramicina, lincomicina, novobiocina, pirlimicina, tilosina, clortetraciclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina, polimixina B ou polimixina (colistina) , nistatina, griseofulvina , anfotericina b, cetoconazol, itraconazol, terbinafina, tolciclato, tioconazol, clotrimazol, isoconazol, miconazol, ciclopirox olamina, fluconazol, mebendazol, flubendazol, fembendazol , cambendazol, albendazol, oxibendazol, oxfendazol, parbendazol, tiabendazol, tiofonato, amitraz, tetramisol, levamisol, febantel, niclosamida, praziquantel , pamoato de pirantel, pamoato de pirvinio, tartarato de morantel, triclorfon (metrifonato ) , diclórvos, clorpirifós, malation, ■diazinon,- ■ dimetoato, fention,.. abamectina, . àverme.ctina, moxidectina, ' doramectina , nemadectin, milbemicina oxima d, fenotiazina, piperazina, nitroxinil, disofenol, tiacetarsamida (arsenamida) , diidrocloridrato de melarsomina, mebendazol, fembendazol , albendazol, cambendazol , tiabendazol, parbendazol, flubendazol, oxfendazol, triclambendazol , febantel, tiofanato, netobimin, óxido arsenioso, melarsoprol, tetramizol, levamizol, metilcarbamatos , parbendazol, mebendazol, flubendazol, flumetrina, permetrina, cipermetrina, deltametrina, closantel, rafoxanida, monossulfeto de tetraetiuran (monossulfiran) , cloronicotinil nitroguanidina, fipronil, lufenuron, nitenpyram, metronidazol , pirimetamida, amprólio, clopidol, monenzina, nicarbazina, toltrazuril, maduramicina, narazina, nitrofurazona, aceturato de diaminazeno, imidocarb, diquinoliluréa, primaguina, hidrocortisona , cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, triamcinolona, parametasona, betametasona, dexametasona, flumetasona, dipirona, fenilbutazona, aminopirina, naproxeno, flunixina meglumina, pranoprofeno, suprofeno, flurbiprofeno, indometacina, diclofenaco sódico, ácido acetilsalicilico, ácido salicilico, paraminofenol , idoxuridina, aciclovir, ganciclovir, amantadina, rimantadina, oseltamivir, zanamivir, nevirapine, delavirdine, efavirenz, zidovudine, didanosine, zalcitabine, stavudine, lamivudine, abacavir, emtricitabine , amprenavir, fosamprenavir , indinavir, ritonavir, saquinavir, nelfinavir, tenofovir, adefovir, vitamina K, vitamina A, vitamina D, vitamina E, tetracaina, proximetacaina , lidocaina, xilasina, cetamina, maleato de ergovina, maleato de metilergometrina, bromocriptina , mecloretamina, ciclofosfamida, melfalan, clorambucil etileneminas (trietilenotiofosforamida) , sulfonados alquílicos (bussulfano) , nitrosuréias , triazenos
(dacarbazina) , análogos do ácido fólico (metotrexato) , análogos da pirimidina ( fluorouracil , citarabina) , análogos da purina (mercaptopurina ) , cisplatina, 1-asparginase, hidroxiuréia, vinblastina, vincristina, doxorrubicina, dactinomicina, bleomicina, dietilestilbestrol , cipionato de estradiol, aliltrembolona, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, progesterona, cloprostenol sódico, dinoprosdt trometamina, altrenogest, fluprostenol , tiaprost, prostaglandina f-2-alfa, melatonina, gonadotropina coriônica humana, hormônio foliculo estimulante, gonadotropina coriônica equina, hormônio luteinizante, gestrinona, gonadorrelina, goserelina, buserelina, leuprolida, danazol, deslorrelina , hormônio do crescimento, propionato de testosterona , cipionato de testosterona ou ocitocina, não se restringindo a estes princípios ativos, seus derivados, seus sais e/ou suas combinações, salientando-se que o princípio ativo a ser incorporado aos nanossistemas poderá pertencer a qualquer dos grupos supracitados.
41. Processo, de acordo com reivindicações 1, 2, 3, 14, 28, 29. e 30, caracterizado pelo fato de que os nanocarreadores hidrofóbicos possuem carga superficial negativa podendo variar de -45 a -25 mV, e positiva para os nanocarreadores revestidos com quitosana podendo sua carga variar de +30 a +10 mV.
42. Nanoreservatórios , de acordo com reivindicações 1 a 15 e 28 a 41, caracterizado pelo fato de que são capazes de liberar o fármaco com velocidade controlada.
·■- 43. Suspensão coloidal --de -nanocarreadores,.■ de acordo - com reivindicações 1 a 16 e 28 a 42, caracterizado pelo fato de que pode ser administrada em veiculo farmaceuticamente aceitável aquoso que pode ser um tampão, um gel, ou um spray.
44. Processo, de acordo com reivindicação 1, 17 e 28 caracterizado pelo fato de que a composição veterinária é uma dose única contendo de 5 a 50 % (p/p) de principio ativo em relação aos polímeros totais para uma dose total menor ou igual a 20.000 mg de antibacterianos , antimicóticos , antiparasitários , vitaminas, antiinflamatórios não esteróides ou esteroidais, antivirais, antineoplásicos , anestésicos ou hormônios na formulação, combinados ou não.
45. Método, de acordo com reivindicação 1, 28 e 18 caracterizado pelo fato de que os nanocarreadores são preparados por um método utilizando dois solventes orgânicos miscíveis com água onde está presente o princípio ativo de uso veterinário.
46. Método, de acordo com reivindicação 18, 19 e 45, caracterizado pelo fato de que a fase orgânica é misturada com uma fase aquosa neutra podendo conter tensoativos, sendo que os solventes totais são evaporados para menos de um terço do volume total da mistura ao final do processo.
47. Método, de acordo com as reivindicações 19, 20 e 46, caracterizado pelo fato de que a fase aquosa pode conter também um sal polimérico de reação neutra que é capaz de adsorver ou reagir com o ânion da cloxacilina, podendo este ser um sal de aminopolissacarídeo do grupo das quitosanas, com variados pesos moleculares.
48. Processo de preparação de suspensões coloidais de -uso veterinário . de acordo., com. reivindicações- 7 , 8 , 9 , 10,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 e 47, caracterizado pelo fato de que tamanhos variando entre 50 e 800 nm, as quais estão aptas a carrear antibacterianos , antimicóticos , antiparasitários , vitaminas, antiinflamatórios não esteróides ou esteroidais, antivirais, antineoplásicos , anestésicos e hormônios para o tratamento ou profilaxia de enfermidades de animais não humanos por administração pelas vias oral, parenteral, ocular, mamária, tópica, nasal, otológica, retal, vaginal e/ou combinação destas vias; este sistema compreende uma matriz polimérica de dimensões submicrométricas podendo ser revestido de tensoativos e/ou por polímeros catiônicos, dentre eles a quitosana originando nanoesferas. Esta formulação é composta por:
uma solução contendo um polímero hidrofóbico insolúvel em água dissolvido em uma solução orgânica, de dois solventes, miscíveis em água;
- uma solução aquosa neutra podendo conter tensoativo e/ou polímero catiônico na forma de sal solúvel em água, o qual foi obtido a partir de quitosana;
- a combinação simultânea da fase aquosa e da oleosa forma nanoesferas; para as nanoesferas revestidas, a adsorção do polímero catiônico à partícula ocorre por atração eletrostática entre o polímero hidrofóbico e o polímero catiônico para formar partículas com carga de superfície positiva.
49. Método, de acordo com reivindicações 1, 2, 3, 21, 22, 28, 29, 30 e 48, caracterizado pelo fato de que as nanopartícuias contendo cloxacilina benzatina ou outro antibiótico são esterilizadas por passagem -em filtros estéreis-- de diâmetros de 0,2 a 0,8 ym. - ..
50. Sistema liofilizado, caracterizado pelo fato de que é conforme definido pelas reivindicações 1 a 49.
51. Método, de acordo com reivindicação 23, 24 e 50 caracterizado pelo fato de que diferentes temperaturas são empregadas para congelamento da amostra, preferencialmente de -20 a -196°C.
52. Método, de acordo com reivindicações 23, 24, 25, 50 e 51, caracterizado pelo fato de que diferentes tipos de crioprotetores são empregados, como exemplo glicose, sacarose, trealose, lactose, frutose, maltose, polidextrose, glicerol, sorbitol, quitosana e seus derivados, gelatina, dióxido de silício coloidal e/ou mistura dos componentes acima citados.
53. Método de acordo com reivindicação 25, 26 e 52 caracterizado pelo fato de que concentrações de crioprotetores de até 80% (p/p) são adicionadas à preparação a ser liofilizada para obtenção de uma ressuspensão adequada com manutenção das características físico-químicas .
54. Misturas em quaisquer proporções entre as formulações de nanocarreadores conforme descritas nas reivindicações de 1 a 53, entre si e com um princípio ativo caracterizado pelo fato de que (ele mesmo ou qualquer outro) na forma não estruturada, para administração pelas vias oral, parenteral, ocular, mamária, tópica, nasal, otológica, retal, vaginal e/ou combinação destas vias em animais não humanos.
55. Aplicação de suspensões coloidais de uso veterinário e nanoreservatórios de acordo com reivindicações .1, .2,.__3, 7 , 8 , 9 , 10,. 11, 12.,..13,. 14, .15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 29, 30, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 e 54 caracterizado pelo fato de que é para o tratamento e profilaxia de enfermidades de animais não humanos, bem como em suporte farmacológico de manejos zootécnicos. Como exemplo de enfermidades e manejos zootécnicos tem-se abortamento bacteriano, abortamento enzoótico dos ovinos e dos caprinos, abortamento bovino epizoótico, doença de bang, abricó, abscedação do saco lacrimal, abscedação pulmonar em potros por rhodococcus equi, abscessos, abscedação causados por pasteurella, acantose nigricante, acaríase, acidose metabólica, acidose respiratória, acidose ruminai, acinetobacteriose , corynebacteriose, actinobacilose, actinomicose, doença de addison, adenocarcinomas , adenomas, adenomatose pulmonar, adenovíroses , aerobacteriose, aflatoxicose , castração, descorna, intervenções cirúrgicas, agalactia contagiosa, agranulocitose felina, doença de akabane, alcalose metabólica, dermatofitose , amebíase, amiloidose, anaplasmose, ancilostomíase, anemias, anemia infecciosa equina, anemia infecciosa felina, anestro, angiossarcomas , angiostrongilose, anorexia, arterite virai equina, artrite, artrite e encefalite caprinas a vírus, micoplasmoses , artropatias, ascaríase, ascaridose, aspergilose, atoxoplasmose , doença de aujeszky, babesioses, balanopostites , bartonelose, basidiobolomicose , infestações por berne, besnoitiose, bicheiras, blastomicoses , blefarite, infestações por carrapatos, timpanismo, bordeteloses , sarnas, borreliose, bouba aviária, branquiomicose , bronquiolite, bronquite, brucelose, calicivíroses , campilobacteriose , candidíase, capilariose, carbúnculo, hemático,. carcinomas, carpite, podridão., dos cascos, caudriose, artrite virai equina, dermatite necrótica, cenurose, ceratoconj untivites , cestoidiase, cetose, cinomose, cisticercose, cistite, pielonefrite, cistos ovarianos, citazoonose, citrobacteriose , clamidiose, claudicação, clavibacteriose , clostridiose , coccidioidomicose, coccidiose, sarcocistose, toxoplasmose , infestações por cochliomyia, cólera aviária, cólera suina, colibacilose, cólica em equinos, colissepticemia, colite, mastite, metrite, agalactia, conidiobolomicose , conjuntivite, infecção por cooperia, coriomeningite linfocitica, coriorretinite, coriza dos perus, coriza gangrenosa, coriza infecciosa, corinebacterioses , costiase, coxite, criptococose , criptosporidiose, cromomicose, criptococose, criptosporidiose, doença de cushing, cisticercose, demidicose, dermatite , infestações por dermatobia hominis, dermatofibrose nodular, dermatofilose, dermatomicose , dermatofitose, filariose, diarréias bacterianas, diarréias virais, difteria, infestações por dipylidium caninum, dirofilariose , doença de glãsser, doença de gumboro, doença de johne, doença de krabbe, doença de lobo, doença de lyme, doença de marek, doença doença de newcastle, doença velogênica viscerotrópica, ricketsiose, tripanossomiases , faringite, esofagite, reações auto imune, duodenite, jejunite, ectoparasitoses , éctima contagioso, equinococose , eclâmpsia, ectromelia, eczema, lúpus eritematoso, edema, egiptianelose , ehrlichiose, eimeria, emése, empiema, encefalite, encefalomielite , encefalomiocardite virai, endocardites , infecções por entamoeba, enterites, êntero- hepatite infecciosa, enterobacteriose, enterotoxemia , enteroviroses , entomoftoromicose , - eperitrozoonose, epidermite exsudativa, epididimite, epiteliomas, ergotismo, erisipela, erliquiose, escabiose, esofagite, espiroquetose , esporotricose , esquistossomiase , estafilococose, esteatite, estefanofilariose, estefanurose, estomatites , estreptococose, estreptotricose, vulvovaginite, estrongiloidose, eubacteriniose, exantema, fasciolose, hipertermia , febre hemorrágica da criméia- congo, febre maculosa, febre q, febre tifóide, ferimentos, fibrossarcomas , filariose, flavobacteriose , fotossensibilização, fusariose, furunculose, fusobacteriose, infecção por gaigeria, garrotilho, gastrite, gastroenterite , gastroenterite catarral epizoótica, gastroenterite hemorrágica, geotricose, giardiase, glomerulonefrite, glossite, gripe suina, doença de gumboro, habronemiase cutânea, infestações por haematobia irritans, pediculose, infestações por haemonchus, infecções por haemophilus, helmintiase, hemobartonelose, hemofilose, hemorragias, hepatite, herpesvirose, hexamitiase, hidatidose, hipoparatireoidismo, hipotireoidismo, hirsutismo, histomoníase, histoplasmose, hog flu, sincronização de ciclo estral, indução de ovulação, icterícia infecciosa, iersiniose, ascaridiose, infestações por ácaros, infestações por piolho, influenza equina, doença de johne, klebsielose, laminite, laringite, leishmaniose, leptospirose, leucemia, leucose, linfadenite, linfangite, linfoma, linfossarcoma, língua azul, lipossarcomas , listeriose, lupinose micotóxica, doença de lyme, maedi-visna, mamilite ulcerativa bovina, doença de marek, mastocitomas , meningite bacteriana, meningite virai, meningoencefalite, metarhiziose, metastrongil .se, . metrite, . .micobacterio.se, .. micoplasmose, micoses, micrococose, microfilariose , micronemose, microsporidiose, mielite por protozoário, miíase, miroteciotoxicose, mixomatose infecciosa, monilíase, infecções por moraxella, mormo, infestações por mosca do chifre, mucormicose, necrobacilose, necrose bulbar infecciosa, necrose hematopoiética infecciosa, necrose pancreática infecciosa, nefrite intersticial, neisseriose, infecções nematóideos , neosporose, nocardiose, nosematose, oestrose, oftalmia infecciosa, oncocerciase, onfalite, oomicose, osteite, osteoartrite, osteomielite , infestações por ostertagia, otite parasitária, otite bacterianas, otite fúngicas, otoacariase, oxiurose, palatite, pancreatite, papilomatose , parafilariose, paragonimíase, parainfluenziose, paramixovirose , parasitose, parelafostrongilose , paresia enzoótica benigna dos suínos, parvovirose, pasteurelose, pecilomicose , pediculose, peptococose, peptostreptococose, periarterite nodosa, periodontite, periostite, peritonite, peste aviária, peste bovina, peste dos patos, peste dos pequenos ruminantes, pielonefrite, piometra, pitiríase rósea dos suínos, pitomicotoxicose , plasmocitose, infecções por plasmodium, pleurite, peritonite infecciosa felina, pleuropneumonia, pneumoencefalite aviária, pneumomicose , pneumonias bacterinas, pneumonias virais, pneumonias verminóticas , pneumostrongilose, pododermatite , poliartrite, polioencefalomielite felina, poliomielite, postite, encefalite, poxivirose, prostatite, pseudomonose , pseudotuberculose, pseudovaríola bovina, psitacose, pulorose, queilite, quilodonelíase, rabdovirose, cestoidíase, reticuloperitonite, retrovirose, infestações por rhabditis,' rhodococose, rickettsioses , rinite, rinite atrófica dos suínos, rinopneumonite virai equina, rinosporidiose , rinossinusite micótica, rinotraqueíte dos perus, rinotraqueíte infecciosa em bovinos, rinotraqueíte por bordetella, rinotraqueíte por . herpesvírus felino, rotavirose, salmonelose, candidíase, sarcocistose, sarcomas, sarcosporidiose, sarna, septicemia bacteriana, serosite infecciosa, infecções por serratia, setariose, infecções por shigella, sífilis equina, sinovite infecciosa, esporotricose, estachibotriotoxicose, estefanurose , esternostomose, infestação por stomoxys calcitrans, estrongilose , surra, infestações por tênia, teileríases, teileriose, telazíase, tendinite, tétano, theileriose, tifo canino, tifo equino, tinha, togavírose, toxascaríase, toxocaríase, toxoplasmose, traqueobronquite infecciosa dos cães, trematodíase, treponematose, tricuríase, triquinelose, tricostrongilose, tricomoníase bovina, tripanossomíase, tuberculose, tularemia, tumor venéreo canino transmissível, doença de tyzzer, edema, congestão, úlcerações, uretrocistite, uveíte, vaginite, vulvite, varicela, varíola bovina, vasculite, vibriose, diarréia virai bovina, hepatite, virose de akabane, virose de wesselsbron, febre do vale do rif, virose do aborto equino, virose respiratória bovina sincicial, enterite, vulvovaginite, yersiniose, não se restringindo a estas enfermidades e manejos zootécnicos.
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