WO2011103770A1 - 用于定量检测braf突变的试剂盒 - Google Patents

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WO2011103770A1
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braf
primer
braf gene
mutation
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许军普
陈钊
李隽�
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北京雅康博生物科技有限公司
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the BRAF gene belongs to the RAF group, which is an oncogene encoding a serine/threonine kinase and is also an important member of the RAS-RAF-MEK-ERK signal transduction pathway. It plays a role in cell proliferation, differentiation and apoptosis. Important regulatory effects (Ikenoue T, Cancer Res, 2003, 63 (23): 8132-37) 0 thus play an important role in the development and progression of tumors, and are potential diagnostic markers and therapeutic targets.
  • the BRAF gene is located at 7q34, a protein encoding 783 amino acids. Studies have shown that there are different proportions of mutations in various human malignancies such as malignant melanoma, colorectal cancer, lung cancer, squamous cell carcinoma, liver cancer, and pancreatic cancer. Davies H, et al, Nature, 2002, 417 (6892): 949-54). Among them, about 90% of BRAF mutations are located at nucleotides 1799, and T mutations are A, resulting in the 600th amino acid encoded by glutamic acid to proline (Wang L, et al, Cancer Res, 2003, 63 (17): 5209-12).
  • the present invention predicts the drug resistance of tumor drugs by detecting the mutation of the amino acid codon of the tumor-associated gene BRAF at the molecularly targeted antitumor drug by real-time quantitative PCR method (Di Nicolantonio F, et al, J Clin Oncol, 2008, 26 ( 35 ) : 5705— 12 ).
  • the detection method adopted by the invention has the following advantages: Simple operation and easy standardization. Other methods, such as allele-specific oligonucleotide probe hybridization, are very sensitive to the conditions of hybridization, and the experimental conditions need to be strictly controlled; the restriction fragment length polymorphism experiment requires considerable human operation and cannot be quantified. The experiment cycle is short and can be completed in 2 hours. No sequencing verification results are required, and direct sequencing and high resolution dissolution curve analysis require 4 days to 2 weeks. Sensitivity is high. By optimizing the experimental conditions, the sensitivity of mutation detection can reach 1%, while the sensitivity of direct sequencing is 20-50%.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a quantitative detection kit for BRAF gene mutation. Quantitative detection of BRAF gene 600 amino acid codon GTG base mutation to GAG base.
  • the present invention provides a PCR primer comprising a Taq enzyme, a 10 x Taq buffer, a MgCl 2 , a dNTP ⁇ solution and a specific amplification sequence of a BRAF gene mutation sequence, and specifically recognizes a wild type and a mutant type.
  • Quantitative detection kit for probes of sequences and detection methods :
  • the present invention designed a standard.
  • a standard curve for quantification is obtained from the test result of the standard product, and the ratio of the BRAF gene mutation of the nucleic acid to be tested to the total BRAF gene is calculated from the standard curve.
  • the step (1) further comprises: extracting, purifying and concentration determining the nucleic acid in the sample to be tested.
  • the probe used for real-time PCR detection specifically binds to the base sequence of the BRAF gene mutation site under appropriate PCR conditions.
  • the probe is linked to a fluorescent luminescent group at the 5' end, and a fluorescent quenching group is attached to the 3' end.
  • the fluorescent emitting group is selected from the group consisting of: FAM, TET, HEX, ROX; and the fluorescent quenching group is selected from the group consisting of: BHQ, TAMARA.
  • the fluorescent emitting group is FAM, and the fluorescent quenching group is BHQ.
  • the sequence of the probe is preferably SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 12.
  • the standard comprises at least one of a plasmid, genomic DNA or a chemically synthesized sequence.
  • the standard comprises a wild type plasmid and/or a mutant plasmid, wherein the wild type plasmid comprises a BRAF gene wild type sequence, and the mutant plasmid comprises a BRAF gene mutant type sequence. More preferably, the standard consists of a wild type plasmid and/or a mutant plasmid.
  • the sample to be tested includes fresh tissue, paraffin-embedded tissue, cell strain, blood, pleural effusion, ascites, saliva, digestive juice, urine, saliva, and feces.
  • the primer consists of an upstream primer and a downstream primer.
  • the primers are preferably SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.
  • the quantitative detection kit for BRAF gene mutation comprises an agent selected from the group consisting of primers, probes and standards as described above.
  • the kit preferably further comprises a mixture of Taq enzyme, lO x Taq buffer, MgCl 2 , dNTP.
  • the ratio of primer to probe is 2: 1-10:1, and the ratio between the preferred forward and reverse primers is 1:3-3:1.
  • the standard product includes the above-mentioned plasmids mixed in a certain ratio, and the ratio of the content of the wild type plasmid and the mutant plasmid is: 0% - 100%.
  • FIG. 1 is a view showing the construction method of a plasmid standard used in Example 2 of the present invention.
  • Fig. 2 is a map showing the wild type plasmid of Example 2 of the present invention, and the arrow indicates the position at which the wild type PCR product sequence is inserted into the vector.
  • Figure 3 is a diagram showing the sequencing of BRAF wild type plasmid according to Example 2 of the present invention.
  • Fig. 4 is a view showing the result of sequencing of the mutant plasmid standard of Example 2 of the present invention, and the arrow indicates a base mutation site.
  • Fig. 5 is a graph showing the amplification of a standard product of Example 3 of the present invention, wherein Figure A is an amplification curve of the BRAF wild type standard standard, and Figure B is an amplification curve of the BRAF 600 codon GTG ⁇ GAG mutant plasmid standard.
  • Figure 6 is a standard curve plotted according to Figure 4, wherein Figure A is the BRAF wild type plasmid standard curve and Figure B is the BRAF 600 codon GTG ⁇ GAG mutant shield particle standard curve.
  • FIG. 7 is a fluorescence quantitative PCR amplification curve of a paraffin-embedded tissue sample BRAF 600 codon wild type ( FIG. A ) and a GTG-GAG mutant ( SB ) detected in Example 3 of the present invention, and a fresh tissue sample BRAF 600 codon wild Type (Fig. C) and GTG-GAG mutant (Fig. D) Fluorescence quantitative PCR amplification curve, whole blood sample BRAF 600 codon wild type (Fig. E) and GTG ⁇ GAG mutant (Fig. F) Fluorescence quantitative PCR amplification Increasing curve, cell line sample BRAF 600 codon wild type (panel G) and GTG-GAG mutant (panel H) fluorescence quantitative PCR amplification curve.
  • Figure 8 is a schematic illustration of the quantitative method of the present invention.
  • Example 1 Human fresh tumor tissue, 'paraffin-embedded tissue, peripheral blood, pleural effusion, human cell line genomic DNA extraction
  • the human cancer cell lines we tested included non-small cell lung cancer (NSCLC) (A549, H460, H838, and H1703), breast cancer (MCF-7, BT474, and HuLl OO), malignant multi- mesothelioma cell lines (H513, H2052). , H290, MS-1 and H28), squamous adenocarcinoma (KAT10), colon cancer cell line (SW480, S1 -M1-80), head and neck cancer cell line (U87), cervical cancer (Hela), sarcoma cell line (Mes-SA, Saos-2, and A204).
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • MCF-7 breast cancer
  • HuLl OO HuLl OO
  • malignant multi- mesothelioma cell lines H513, H2052
  • H290, MS-1 and H28 squamous adenocarcinoma
  • KAT10 squamous adenocarcinoma
  • the genomic DNA of the sample can be extracted using the DNA extraction kit of Qiagen, Promega, and Roche, and the concentration and purity of the DNA can be detected using Gene Nanodrop ND1000 nucleic acid micrometer (OD260/OD280 is about 1.8, OD260/OD230 is greater than 2.0). ).
  • the sample DNA extraction steps are described below using Promega's DNA extraction kit as an example:
  • the TA cloning vector pMD18-T was purchased from TAKARA.
  • the insert was prepared by PCR.
  • the template of the PCR was the genomic DNA of the sample extracted in step 1.
  • the reaction system and amplification conditions are as follows (Table 1, Table 2, Table 3):
  • the second step 20-30 95 ° C, 10-15 seconds; 55-65 ° C, 30-60 seconds
  • mutant plasmid The mutant primer at the mutation point was designed, and the standard containing the mutant sequence was obtained by the DPN1 method.
  • BRAF-1-F TACAGAGAAATCTCGATGGAG ( SEQ ID NO: 7 )
  • BRAF-l-R ATTTCTCTGTAGCTAGACCAA ( SEQ ID NO: 8 )
  • the target site was mutated by using the mutant primer and Pfu enzyme.
  • the amplification system and conditions are shown in Table 1, Table 4, and Table 3.
  • BRAF-1-F SEQ ID NO: 7
  • BRAF-l-R SEQ ID NO: 8
  • step 2.2 The product obtained in step 2.2 was treated with DPN1 enzyme, and the product was recovered after incubation at 37 G C for 1 hour, and subjected to extensive amplification in Escherichia coli DH5a strain, and extracted and purified.
  • Example 3 Taking a case of a squamous adenocarcinoma and a colorectal cancer: Human cell line, human fresh tumor tissue, peripheral blood, paraffin-embedded tissue genome DNABRAF mutation detection
  • the PCR reaction template was the sputum adenocarcinoma and colorectal cancer sample genomic DNA extracted in Example 1 and the standard prepared in Example 2, using double distilled water as a negative control. To make a standard curve, the standards were diluted to lng/l, 0.5 ⁇ / ⁇ 1, 0.25 ng/l, 0.125 ng/l, 0.0625 ⁇ ⁇ / ⁇ 1, 0.03125 ng/l.
  • BRAF gene codon 600 Two systems need to be configured, except for the probe.
  • the other reagents used in the system are identical.
  • the BRAF gene codon wild type gene was detected, and the BRAF-W-1 (SEQ ID NO: 9) or BRAF-W-2 (SEQ ID NO: 10) probe was added to the system; the BRAF gene 600 codon GTG was detected.
  • BRAF-W-1 CCA TCG AGA TTT CAC TGT AG ( SEQ ID NO: 9 )
  • BRAF-W-2 CCATCGAGATTTCACTGTAGCTAG SEQ ID NO: 10
  • Second step 30-45 95 ° C, 10-15 seconds; 55-65 ° C (fluorescence), 30-60 seconds
  • FIG. 6 is a plot of the amplification curve of the plasmid standard.
  • the five rising curves are sequentially diluted from left to right to represent a ratio of 0.5 ng/ ⁇ , 0.25 ng/! , Amplification curve of plasmid standard of 0.125 ⁇ ⁇ / ⁇ 0.0625ng/l, 0.03125ng ⁇ l.
  • the horizontal axis refers to the number of cycles, and the vertical axis refers to the fluorescence detection value. This makes it possible to further plot the standard curve for the calculation (Fig. 6).
  • the horizontal axis represents the logarithm of the template copy number
  • the vertical axis represents the CT value.
  • template copy number mass / molecular weight X 6.02 X 10 23
  • the plasmid in this experiment consists of the pMD18-T vector and the insert, due to the insert base
  • the base length is basically the same, and the largest gap is only twenty bases in length, as opposed to
  • the length of the PMD18-T vector of 2692 bp has little effect, so the ratio of the copy number of the wild type to the mutant plasmid standard is the ratio of the mass.
  • the wild type and mutant genome of the reaction were determined from the CT values of the samples.
  • the copy number of DNA was used to determine the ratio of mutant BRAF DNA to total BRAF DNA (wild type plus all mutants at this position).
  • the wild type CT value of the BRAF 600 codon of a lung cancer paraffin-embedded tissue sample was 16.20 (Fig. 7A), and the GTG ⁇ GAG mutant type was 24.95 (Fig. 7B), respectively, by the corresponding standard curve formula ( Figure 6)
  • the copy number can be determined, and the ratio of the mutant to the wild type is 1:50. It is estimated that about 2% of the BRAF gene in the tissue has a 600 codon GTG-GAG mutation.
  • BRAF gene mutations were detected in 80 specimens of squamous adenocarcinoma and colorectal cancer, whole blood and cell lines. A total of 8 mutations were detected, and the ratio of the mutation to the unmutated gene in the sample is shown in Table 8.

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Description

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用于定量检测 BRAF突变的试剂盒
发明背景
BRAF 基因属于 RAF 基,因家族， 是编码丝氨酸 /苏氨酸激酶的癌基 因， 也是 RAS- RAF-MEK- ERK 信号转导途径中的重要成员之一， 在细胞 增殖 、 分化及凋 亡 中 起重要调控作 用 （Ikenoue T， Cancer Res, 2003, 63 (23): 8132-37) 0 因而在肿瘤的发生、 发展过程中发挥重要 作用， 是潜在的诊断标记和治疗靶点。
BRAF 基因位于 7q34, 编码 783氨基酸的蛋白， 研究表明， 在多种 人类恶性肿瘤中， 如恶性黑色素瘤、 结直肠癌、 肺癌、 曱状腺癌、 肝癌 及胰腺癌等均存在不同比例的突变（Davies H, et al, Nature, 2002, 417 ( 6892 )： 949-54 )。 其中， 约 90%的 BRAF突变位于第 1799核苷酸 上， T突变为 A，导致其编码的第 600位氨基酸由谷氨酸变为缬氨酸（Wang L, et al, Cancer Res, 2003, 63 (17)： 5209-12)。 本发明通过实时定量 PCR 方法检测分子靶向抗肿瘤药疗效相关的肿瘤相关基因 BRAF 600 位氨基 酸密码子的突变情况， 来预测肿瘤药物的的耐药性情况 （ Di Nicolantonio F, et al, J Clin Oncol, 2008, 26 ( 35 ) : 5705— 12 ) 。
本发明采用的检测方法具有以下几个优点： 操作简单， 易于标准化。 其它方法如等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法， 对杂交的条件非常敏 感， 需要严格控制实验条件； 限制性片段长度多态性实验需投入相当的 人力操作， 且不能定量。 实验周期短， 2小时内就可以完成。 不需要测 序验证结果， 而直接测序法与高分辨溶解曲线分析需要 4天 -2周。 敏感 度高， 我们通过对实验条件迸行优化， 突变检测的敏感度可达到 1%， 而直接测序法敏感度 20-50%。特异性高，免疫组化方法假阳性与假阴性 率高， 且不能确定点突变的位置和类型； 定量准确， 这是本发明实验方 法最独特的优点， 通过绝对定量法处理数据， 从而绘制标准曲线， 精确 测定样本中野生型与突变型基因的含量，进而得到突变型基因所占比例， 辅助临床诊断和用药。 另外， 本发明安全无毒性， 其它方法如错配碱基 的化学断裂法需要用到同位素和剧毒化学试剂。 发明内容
本发明要解决的问题是提供一种 BRAF基因突变的定量检测试剂 盒。 定量检测 BRAF基因 600位氨基酸密码子 GTG碱基突变为 GAG碱基 的情况。
为解决上述问题，本发明提供包含 Taq酶、 10 x Taq緩沖液、 MgCl2、 dNTP ^合液及可特异性扩增 BRAF基因突变位点序列的 PCR引物与可 特异性识别野生型与突变型序列的探针的定量检测试剂盒及检测方法：
( 1 ) 分别在 BRAF基因 600位密码子突变位点附近设计上下游引 物， 以及根据每个突变位点的突变情况设计特异性的探针， 该探针可与 BRAF特定位点的野生型或欲检测的突变型序列特异性结合， 从而确定 该位点有无发生所检测的基因突变。
( 2 ) 为精确定量所测 BRAF突变比例， 本发明设计了标准品。
( 3 )对待测样品与标准品进行荧光定量 PCR检测。
( 4 ) 由标准品检测结果得到用于定量的标准曲线， 由标准曲线计 算得到待测样品核酸的 BRAF基因突变占总体 BRAF基因的比例。
所述步骤 （ 1 ) 之前还包括： 对待测样品中的核酸进行提取、 纯化 和浓度测定。
荧光定量 PCR检测所用探针在适宜的 PCR条件下与 BRAF基因突 变位置的碱基序列特异性结合。 所述探针优选在 5，端连接有荧光发光基 团， 3，端连接有荧光淬灭基团。 所述的荧光发射基团选自： FAM、 TET、 HEX, ROX; 所述的荧光淬灭基团选自： BHQ、 TAMARA。 优选的， 所述荧光发射基团为 FAM, 所述的荧光淬灭基团为 BHQ。 所述探针的 序列优选为 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 1 1、 SEQ ID NO: 12。
所述标准品至少包括质粒、 基因组 DNA或化学合成序列中的一种。 优选地， 所述标准品包含野生型质粒和 /或突变型质粒， 其中野生型质粒 包含 BRAF基因野生型序列， 突变型质粒包含 BRAF基因突变型序列。 更优选地， 所述标准品由野生型质粒和 /或突变型质粒组成。
所述待检样品包括新鲜组织、 石蜡包埋组织、 细胞株、 血液、 胸腔 积液、 腹腔积液、 唾液、 消化液、 尿液、 唾液、 粪便。 所述引物由上游引物与下游引物组成。所述引物优选为 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6。
所述的 BRAF基因突变的定量检测试剂盒包括选自以下的试剂： 如 上所述的引物、探针和标准品。 所述试剂盒优选还包括 Taq酶、 lO x Taq 緩冲液、 MgCl2、 dNTP混合液。优选的引物与探针的比例为 2: 1-10: 1 , 优选的正向与反向引物之间的比例为 1 : 3-3: 1。 标准品包括以上所述 的质粒按一定比例的混合， 野生型质粒和突变型质粒的含量的比例分别 为： 0%-100%。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
图 1是本发明实施例 2所用质粒标准品构建方法示意图。
图 2是本发明实施例 2野生型质粒图谱， 箭头所指即为载体中插入 野生型 PCR产物序列的位置。
图 3是本发明实施例 2 BRAF野生型质粒测序图
图 4是本发明实施例 2突变型质粒标准品测序结果图， 箭头所指为 碱基突变位点。
图 5是本发明实施例 3的标准品扩增曲线图， 其中图 A是 BRAF野 生型^粒标准品扩增曲线， 图 B是 BRAF 600密码子 GTG→GAG突变 质粒标准品扩增曲线。
图 6是根据图 4绘制的标准曲线图， 其中图 A是 BRAF野生型质粒 标准曲线， 图 B是 BRAF 600密码子 GTG→ GAG突变盾粒标准曲线。
图 7是本发明实施例 3检测的石蜡包埋组织样本 BRAF 600密码子 野生型 （图 A ) 与 GTG— GAG突变型 （ S B ) 荧光定量 PCR扩增曲线 图， 新鲜组织样本 BRAF 600密码子野生型（图 C )与 GTG— GAG突变 型 （图 D ) 荧光定量 PCR扩增曲线图， 全血样本 BRAF 600密码子野生 型 （图 E ) 与 GTG→GAG突变型 （图 F ) 荧光定量 PCR扩增曲线图， 细胞系样本 BRAF 600密码子野生型（图 G )与 GTG— GAG突变型（图 H ) 荧光定量 PCR扩增曲线图。 图 8是本发明的定量方法示意图。
实施例 和使用本发 ^的完整披露和描 i ， 并且这些例子并 在对发明 ^"认 为的发明范围进行限制， 亦非意指下文的实验是被实施的全部实验而且 是仅可实施的实验。 实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常 规条件， 例如分子克隆实验指南第三版（Sambrook J.), 或按照厂商所建 议的条件。
实施例 1 : 人类新鲜肿瘤组织、 '石蜡包埋组织、 外周血、 胸水、 人 类细胞系基因组 DNA抽提
我们所测试的人类癌细胞系包括非小细胞肺癌 （NSCLC ) ( A549、 H460、 H838和 H1703 ) 、 乳腺癌 （MCF-7、 BT474和 HuLl OO ) 、 恶 性多间皮瘤细胞系 （H513、 H2052、 H290、 MS-1和 H28 ) 、 曱状腺 癌（KAT10 )、结肠癌细胞系（SW480、 S1 -M1-80 ) ,头颈癌细胞系（U87 )、 子宫颈癌 （Hela ) 、 肉瘤细胞系 （Mes-SA、 Saos-2和 A204 ) 。
我们所测试的人类新鲜肿瘤组织、 外周血、 石蜡包埋组织包括 NSCLC、 间皮瘤、 结肠癌、 恶性黑素瘤、 肾癌、 食道癌、 曱状腺癌、 恶 性毒瘤和卵巢癌。
标本 DNA抽提
可以使用 Qiagen公司、 Promega公司、 Roche公司的 DNA提取试 剂盒提取样本基因组 DNA,使用 Gene公司 Nanodrop ND1000型核酸微 量测量仪检测所提 DNA 浓度与纯度 （ OD260/OD280 约为 1.8， OD260/OD230大于 2.0 ) 。 下面以使用 Promega公司的 DNA提取试剂 盒为例介绍样本 DNA提取步骤：
1.新鲜组织 DNA抽提
(1)用剪刀切取约黄豆粒大小的组织， 置于研钵中， 将组织剪碎， 加 液氮研成粉末。 (2)加入 600μ1预冷的裂解液于研钵中， 用 1ml大枪头吹打 6次， 尽 量使组织粉末与裂解液混匀， 转移混合物到 1.5ml EP管中， 上下颠倒 6 次混勾后 65 °C水浴 20分钟。
(3)加 3μ1的 RNA酶， 上下颠倒 6次混匀， 37°C水浴 20分钟。
(4)冷却到室温， 加 200μ1蛋白沉淀剂，上下颠倒 6次混匀， 冰上放置
5分钟后 13,000*g, 室温离心 4分钟。
(5)转移上清至事先加 600μ1异丙醇（室温）的新 ΕΡ管中， 轻柔混匀 6次后 13，000*g， 室温离心 1分钟。
(6)弃上清， 加 600μ1 70%乙醇 （室温） 至沉淀中， 上下颠倒 6次混 匀后 13，000*g, 室温离心 1分钟。
(7)吸干乙醇， 空气干燥 15分钟。
(8)沉淀加入 40μ1 ϋΝΑ溶解液， 65 °C 1小时或 4°C过夜。
2.石蜡包埋组织 DNA抽提
(1)将 lmg或少于 lmg的组织放入 1.5ml离心管内。
(2)加入新鲜制备的 ΙΟΟμΙ温育緩冲液 /蛋白酶 K溶液。根据样品的类 型， 56°C温育过夜。
(3)取出温育的样品管， 加入两倍体积的裂解緩冲液。
(4)高速涡旋振荡树脂 10秒钟至树脂完全悬浮，加入 7μ1完全悬浮的 树脂。 高速涡旋振荡 3秒钟后室温温育 5分钟。
(5)高速涡旋振荡 2秒钟， 将管子放在 MagneSphere®磁分离架上。 磁分离立刻进行。
(6)小心去除所有溶液， 不要触碰管壁上的树脂。
(7)加入 ΙΟΟμΙ裂解緩冲夜， 从磁分离架上取下管子， 并高速涡旋振 荡 2秒钟。
(8)将管子放回到磁分离架上, 并去除所有的裂解液。
(9)加入 ΙΟΟμΙ配制的 lx洗涤液， 从磁分离架上取下管子， 并高速涡 旋振荡 2秒钟。
(10)将管子放回到磁分离架上， 去掉所有洗涤液。 (11)重复步骤 9和 10两次， 共 3次洗涤， 并确保在最后一次洗涤后， 除去所有的液体。
(12)打开盖子， 将管子放在磁分离架上， 空气中干燥 5分钟。
(13)加入 25μ1洗脱液。
(14)盖上管盖并高速涡旋振荡 2秒钟。 65 °C温育 5分钟。
(15)取出温育的管子， 高速涡旋振荡 2秒钟。 立即放到磁分离架上。
(16)将 DNA溶液小心地转移到选定的容器中。
3.全血 DNA抽提
(1)收集抗凝全血 300μ1 , 加入 900μ1细胞裂解液， 用 1ml枪头吹打 混匀 6次， 尽量使全血与细胞裂解液混勾， 室温放置 10分钟， 期间用 lml枪头吹打混匀 3次。
(2) 13,000*g, 室温离心 20秒后弃上清， 剧烈震荡， 加入 300μ1预冷 的裂解液， 用 l ml枪头吹打混匀至沉淀完全溶解。
(3)加 1.5μ1的 RNA酶， 上下颠倒 6次混匀， 37 °C水浴 20分钟。
(4)冷却到室温， 加 Ι ΟΟμΙ蛋白沉淀剂， 上下颠倒 6次混勾， 水上放. 置 5分钟后 13，000*g， 室温离心 4分钟。
(5)转移上清至事先加 300μ1异丙醇（室温）的新 ΕΡ管中， 轻柔混匀 6次后 13，000*g， 室温离心 1分钟。
(6)弃上清， 加 lml 70%乙醇 （室温） 至沉淀中， 上下颠倒 6次混匀 13，000*g, 室温离心 1分钟。
(7)吸干乙醇， 空气干燥 15分钟。
(8)沉淀加入 40μ1 ϋΝΑ溶解液， 65 °C 1小时或 4 °C过夜。
4.胸水 DNA抽提
(1)收集胸水 5ml , 2000 rpm室温离心 10分钟， 取上清加入 l ml细胞 裂解液， 颠倒混勾 6次， 室温放置 10分钟。
(2) 13,000*g, 室温离心 20秒后弃上清， 剧烈震荡， 加入 l ml预冷的 裂解液， 混勾至沉淀完全溶解。
(3)加 3 μ1的 RNA酶， 上下颠倒 6次混匀， 37 °C水浴 20分钟。 (4)冷却到室温， 加 200μ1蛋白沉淀剂， 上下颠倒 6次混勾， 冰上放 置 5分钟后 13，000*g, 室温离心 4分钟。
(5)转移上清至事先加 5ml异丙醇（室温）的新 EP管中， 轻柔混匀 6 次后 13，000*g, 室温离心 1分钟。
(6)弃上清， 加 1ml 70%乙醇 （室温） 至沉淀中， 上下颠倒 6次混匀
13,000*g, 室温离心 1分钟。
(7)吸干乙醇， 空气干燥 15分钟。
(8)沉淀加入 40μ1 ϋΝΑ溶解液， 65 °C l小时或 4°C过夜。
5.细月包系 DNA抽提
(1)收集至少约 1 X 106的细胞并转移至 1.5ml的 EP管中， 13，000*g， 室温离心 10秒， 如果是贴壁细胞， 收集细胞前要用胰酶消化。
(2)弃上清， 加 200 μΐ PBS洗细胞， 13，000*g， 室温离心 10秒后， 弃上清， 剧烈震荡至沉淀混悬。
(3)加入 600μ1预冷的裂解液， 用 1ml大枪头吹打混匀至没有肉眼可 见的细胞块。
(4)加 3μ1的 RNA酶， 上下颠倒 6次混匀， 37°C水浴 20分钟。
(5)冷却到室温， 加 200μ1蛋白沉淀剂， 上下颠倒 6次混勾， 冰上放 置 5分钟后 13，000*g， 室温离心 4分钟。
(6)转移上清至事先加 600μ1异丙醇（室温）的新 ΕΡ管中， 轻柔混匀 6次后 13,000*g, 室温离心 1分钟。
(7)弃上清， 加 600μ1 70%乙醇 （室温） 至沉淀中， 上下颠倒 6次混 匀后 13,000*g, 室温离心 1分钟。
(8)吸干乙醇， 空气干燥 15分钟。
(9)沉淀加入 40μ1 ϋΝΑ溶解液， 65 °C 1小时或 4°C过夜。
实施例 2: 含突变型与野生型检测序列的盾粒标准品的准备
1.野生型盾粒构建 （图 1， 图 2 )
1.1载体的准备 TA克隆载体 pMD18-T购自 TAKARA公司。
1.2插入片段的准备
使用 PCR方法制备插入片段， PCR的模板为经步骤 1提取的样本基 因组 DNA, 反应体系与扩增条件如下表（表 1、 表 2、 表 3 ) ：
表 1: PCR反应体系 （50μ1) 试剂名称 用量 （μΐ/管） 双蒸水 29.75
10 X緩冲液（不含 Mg2+) 5
MgCl2 ( 25mM ) 7.5
dNTP(lOmM) 1.25
上游引物 (25μΜ) 1.25
下游引物 （25μΜ) 1.25
Taq酶 1
DNA模板 3
总体积 50
表 2: PCR引物 名称 序列
Figure imgf000009_0001
BRAF- -F2 TTCTTCATGAAGACCTCACAGTAA ( SEQ ID N0:4 )
GGATCCAGACAACTGTTCAAACT
BRAF- Ri (SEQ ID N0:5)
GA
BRAF- - R2 CCAGACAACTGTTCAAACTGATG ( SEQ ID N0:6 )
表 3: PCR扩增条件 步骤 循环数 温度及时间 第一步 1 95 °C, 1-5分钟
第二步 20-30 95°C, 10-15秒; 55-65 °C, 30-60秒
1.3使用 QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后， 通过 TA克隆将 其连接入 pMD18-T载体 （购自 TAKARA公司） 。
1.4新构建的质粒在大肠軒菌 DH5a菌株中进行大量扩增， 并通过 抽提纯化获得（具体方法见《分子克隆实验指南》 第三版第 96-99、 103 页） 。
1.5利用 BamHl与 Hindi 11对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为含野生型序列 的标准品 （图 3 ) 。 2.突变型质粒构建： 设计突变点处的突变引物， 利用 DPN1法得到 含突变型序列的标准品。
2.1根据希望得到的突变序列， 设计突变点处的突变引物 （表 4) 。 表 4: 突变引物 名称 序列
BRAF-1-F: TACAGAGAAATCTCGATGGAG ( SEQ ID NO:7 )
BRAF-l-R: ATTTCTCTGTAGCTAGACCAA ( SEQ ID NO:8 )
2.2以 5ng野生型质粒为模板， 利用突变引物以及 Pfu酶， 突变目标 位点。 扩增体系与条件如表 1、 表 4、 表 3。
在制备含 BRAF基因 600密码子 GTG GAG突变序列的质粒过程 中，扩增体系中需要加入 BRAF-1-F ( SEQ ID NO:7 )与 BRAF-l-R ( SEQ ID NO:8 ) 引物。
2.3利用 DPN1酶对步骤 2.2得到的产物进行处理，37GC温育 1小时 后产物回收， 在大肠杆菌 DH5a菌株中进行大量扩增， 并抽提純化。
2.4利用 BamHl与 Hinc^l 11 其进行双酶切鉴定。 2.5 将酶切结果呈阳性的菌种送测序， 测序正确后作为含突变型序 列的标准品 （图 4) 。
实施例 3: 以曱状腺癌与大肠癌样本为例： 人类细胞系、 人类新鲜 肿瘤组织、 外周血、 石蜡包埋组织基因组 DNABRAF突变检测
1.荧光定量 PCR反应模板为实施例 1提取的曱状腺癌与大肠癌样本 基因组 DNA与实施例 2制备的标准品， 以双蒸水为阴性对照。 为制作 标准曲线， 标准品倍比稀释为 lng/ l、 0.5ι^/μ1、 0.25ng/ l、 0.125ng/ l、 0.0625ι^/μ1、 0.03125ng/ l。
2.反应体系及反应条件 （表 2、 表 5、 表 6、 表 7) , 其中标记探针 荧光发射基团选自： FAM、 TET, HEX, ROX; 荧光淬灭基团选自： BHQ、 TAMARA。
表 5: 荧光定量 PCR反应体系 （ 20μ1/管） 试剂名称 用量 ( μΐ/f ) 双蒸水 9.9
10 X緩冲液 （不含 Mg2+) 2
MgCl2 ( 25mM ) 3
dNTP(lOmM) 0.5
上游引物 （25μΜ) 0.5
下游引物 （25μΜ) 0.5
荧光探针 （25μΜ) 0.2
Taq酶 0.4
DNA模板 3 总体积 20
检测 BRAF基因 600密码子突变情况， 需要配置 2个体系， 除探针 不同外， 体系中所用的其他试剂是相同的。 检测 BRAF基因 600密码子 野生型基因，体系中需要加入 BRAF-W-1 ( SEQ ID NO:9 )或 BRAF -W-2 (SEQ ID NO:10)探针； 检测 BRAF基因 600密码子 GTG— GAG突变 型基因，体系中需要加入 BRAF-M- SEQ ID NO: 11 )或 BRAF-M-2( SEQ ID NO:12)探针。
表 6: 探针 名称 序列
BRAF-W-1 CCA TCG AGA TTT CAC TGT AG ( SEQ ID NO:9 ) BRAF-W-2 CCATCGAGATTTCACTGTAGCTAG (SEQ ID NO:10)
ACCA
BRAF-M-1 CCA TCG AGA TTT CTC TGT AG (SEQ ID NO:ll )
BRAF-M-2 CCATCGAGATTTCTCTGTAGCTAGA ( SEQ ID NO:12)
CCA
表 7: 扩增条件 步骤 循环数 温度及时间
第一步 1 95°C， 1-5分钟
第二步 30-45 95°C, 10-15秒； 55-65°C (采集荧光） , 30-60秒
3.绘制标准曲线
根据步骤 3中标准品所得 CT值结果绘制绘制标准曲线。 图 5为质 粒标准品扩增曲线， 在图中, 上升的 5条曲线自左到右依次分别代表倍 比稀释为 0.5ng/^、 0.25ng/ ！、 0.125η§/μΚ 0.0625ng/ l、 0.03125ng^l 的质粒标准品的扩增曲线。 横轴指循环数， 纵轴指荧光检测值。 由此可 进一步绘制用于计算的标准曲线 （图 6) 。 在图 6中， 横轴为模板拷贝 数的对数值，纵轴为 CT值。其中模板拷贝数=质量 /分子量 X 6.02 X 1023, 本实验中质粒由 pMD18-T载体与插入片段共同组成， 由于插入片段碱 基长度基本一致， 最大的差距仅有二十几个碱基的长度， 相对于
PMD18-T载体 2692bp的长度影响不大， 所以野生型与突变型质粒标准 品的拷贝数之比 质量之比。
4.标本 BRAF基因特定突变型比例计算
根据标准曲线， 由样本的 CT值求出反应的野生型与突变型基因组
DNA的拷贝数， 从而求得突变型 BRAF DNA与 BRAF DNA总量（该位 点野生型加所有突变型） 的比值。 如图 7所示测得某肺癌石蜡包埋组织 样本 BRAF 600密码子野生型 CT值为 16.20 (图 7A ) , GTG→GAG突 变型为 24.95 (图 7B ) , 则分别由对应的标准曲线公式 （图 6 ) 可以求 得各自的拷贝数， 由此可知突变型与野生型的含量之比为 1 : 50, 推测 组织中有约 2%的 BRAF基因发生 600密码子 GTG— GAG突变。
5.检测结果
本实施例对 80例曱状腺癌与大肠癌的组织、全血与细胞系标本进行 了 BRAF基因突变的检测。 共检测到 8例发生突变， 突变比例即该样本 中突变基因与未突变基因的比值见表 8。
表 8: BRAF突变比例 突变样本类型 突变例数 突变比例
AT细胞系 1 40%
曱状腺癌新鲜组织 2 15%、 25%
大肠癌石蜡包埋组织 4 20%、 25%、 50%、 55%
大肠癌全血 1 30%

Claims

权 利 要 求 书
1.一种聚合酶^ 式反应引物，其在适宜的 PCR条件下与 BRAF基因 突变位置的上下游 200个以内的核苷酸结合。
2.如权利要求 1所述的引物， 其特征在于， 所述引物由上游引物与 下游引物组成。
3.一种荧光定量 PCR探针， 其在适宜的 PCR条件下与 BRAF基因 突变位置的碱基序列特异性结合。
4.如权利要求 3所述的探针， 其特征在于， 所述探针 5，端连接有荧 光发光基团， 3，端连接有荧光淬灭基团。
5.—种质粒， 该质粒包含待检测的 BRAF基因野生型序列。
6.如权利要求 5所述的质粒， 其特征在于， 所述质粒包含的 BRAF 基因野生型序列为 SEQ ID NO: 13。
7.—种质粒， 该质粒包含待检测的 BRAF基因突变型序列。
8.如权利要求 7所述的质粒， 其特征在于， 所述质粒包含的 BRAF 基因突变型序列为 SEQ ID NO: 14。
9.一种 BRAF基因突变的定量检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括选自以下的试剂： 如权利要求 1或 2所述的引物、 权利要求 3或 4所述的探针、 以及权利要求 5和 /或 7所述的质粒。
10.如权利要求 9所述的试剂盒， 其特征在于， 引物与探针的比例
2:1-10: 1 , 正向与反向引物之间的比例为 1 :3-3: 1。
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