WO2011082796A2 - Temperaturabhängige aktivierung von katalytischen nukleinsäuren zur kontrollierten wirkstofffreisetzung - Google Patents

Temperaturabhängige aktivierung von katalytischen nukleinsäuren zur kontrollierten wirkstofffreisetzung Download PDF

Info

Publication number
WO2011082796A2
WO2011082796A2 PCT/EP2010/007702 EP2010007702W WO2011082796A2 WO 2011082796 A2 WO2011082796 A2 WO 2011082796A2 EP 2010007702 W EP2010007702 W EP 2010007702W WO 2011082796 A2 WO2011082796 A2 WO 2011082796A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
delivery system
drug delivery
catalytically active
oligonucleotide
Prior art date
Application number
PCT/EP2010/007702
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2011082796A3 (de
Inventor
Jiang Gao
Monika Fischler
Volker A. Erdmann
Original Assignee
Magforce Nanotechnologies Ag
Freie Universität Berlin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Magforce Nanotechnologies Ag, Freie Universität Berlin filed Critical Magforce Nanotechnologies Ag
Priority to RU2012129977/10A priority Critical patent/RU2012129977A/ru
Priority to CA2784704A priority patent/CA2784704A1/en
Priority to CN201080056951.0A priority patent/CN102711727B/zh
Priority to JP2012543525A priority patent/JP2013514289A/ja
Priority to US13/515,173 priority patent/US9517272B2/en
Priority to EP10796285A priority patent/EP2512441A2/de
Priority to AU2010341118A priority patent/AU2010341118A1/en
Publication of WO2011082796A2 publication Critical patent/WO2011082796A2/de
Publication of WO2011082796A3 publication Critical patent/WO2011082796A3/de

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0028—Disruption, e.g. by heat or ultrasounds, sonophysical or sonochemical activation, e.g. thermosensitive or heat-sensitive liposomes, disruption of calculi with a medicinal preparation and ultrasounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A61K47/556—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells enzyme catalyzed therapeutic agent [ECTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0002—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy
    • A61K9/0009—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy involving or responsive to electricity, magnetism or acoustic waves; Galenical aspects of sonophoresis, iontophoresis, electroporation or electroosmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/167—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface
    • A61K9/1676—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface having a drug-free core with discrete complete coating layer containing drug
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Definitions

  • the present invention describes a drug release system which functions via a catalytically active nucleic acid.
  • the catalytically active nucleic acid is released in the first step by an external stimulus from a bound to a nanoparticle oligonucleotide inhibitor strand.
  • the released active nucleic acid in its second step binds to its substrate, a nanoparticle-drug conjugate, releasing a covalently, electrostatically, coordinatively or ionically bound drug or an intercalated drug.
  • the patent application WO2006 / 108405 is defined as the closest prior art and shows nanoparticles, wherein the nanoparticles therapeutically active substances are bound, and wherein the detachment of the therapeutically active substances from the nanoparticles caused by an alternating magnetic field or is initiated.
  • the direct thermal release of the drug from the nanoparticles has often not been effective enough to provide, at relatively low temperature increases, a therapeutically effective concentration of the drug released, e.g. in the tumor cells, to reach.
  • the object of the present invention is now to provide a method and suitable compositions with coupled active ingredients for use in this method, which allows a quantitative release of the active ingredient even at low temperature increase and thus leads to a further increase in efficiency over the method disclosed in WO2006 / 108405.
  • the present invention solves the problem by providing a drug release system comprising a composition 1 and a composition 2, wherein the composition 1 is activated by means of a temperature-induced release of a catalytically active nucleic acid, and wherein the catalytically active nucleic acid in turn catalytically releases the active ingredient from the second composition , As shown in the examples, this is achieved, for example, by means of an L-RNA as the catalytically active nucleic acid, wherein the catalytically active nucleic acid is hybridized under physiological conditions with an L-DNA in the form of an inhibitor. This complex is stable for a long time in a stability test in human serum.
  • interactions with native (eg endogenous) nucleases present in the target organism can be excluded by using L-nucleic acids.
  • the melting point of the conjugate bound to the particles is adjusted so that no dehybridization occurs at physiological conditions (shown in the context of the present invention for 38 ° C, ie for a temperature which is slightly higher as the normal body temperature).
  • the double strands are so stable that the catalytic nucleic acids are completely inhibited.
  • the catalytic nucleic acids dehybridize from the inhibitor DNA, resulting in the resolution of the duplexes, and catalytically active nucleic acids are released.
  • These may now enzymatically cleave a second composition containing a carrier which is linked to a therapeutic agent via a molecule acting as a substrate for the catalytic nucleic acid. The cleavage releases the active substance, which can thus exert its effect.
  • the present invention thus relates, in a first aspect, to a drug delivery system comprising a composition 1 comprising at least one nanoparticle linked to an oligonucleotide inhibitor strand, wherein the oligonucleotide inhibitor strand is hybridized with a catalytically active nucleic acid, and a composition 2 comprising a carrier with at least one substrate molecule, wherein the substrate molecule is connected to at least one therapeutic agent, wherein the therapeutic agent is releasable by cleavage of the substrate molecule, wherein the cleavage of the substrate molecule is carried out by the catalytically active nucleic acid.
  • the present invention relates to a drug delivery system consisting of a nanoparticle linked to an oligonucleotide inhibitor strand, wherein the oligonucleotide inhibitor strand is hybridized with a catalytically active nucleic acid, and another nanoparticle linked to a substrate oligonucleotide, wherein the Substrate oligonucleotide is connected to a therapeutic agent which is releasable by cleavage of the substrate oligonucleotide by the catalytically active nucleic acid.
  • the catalytically active nucleic acid preferably acts and cleaves only with respect to the substrate oligonucleotide and does not exhibit activity against other oligonucleotides.
  • physiological conditions is to be understood as meaning the physico-chemical conditions which are present intracellularly or extracellularly in the target organism, preferably in the human organism, in the respective target tissue.
  • the term “essentially no cleavage of the active ingredient” is to be understood as meaning that the term “physiological conditions”
  • Low release agent does not induce adverse reactions in the target tissue. This means in particular that over a period of 4 hours (h) less than 10%, more preferably less than 1%, and in particular less than 0.5% of the active ingredient used in a release experiment, such as Example 3A, is released.
  • catalytic nucleic acids or “catalytically active nucleic acids” mean nucleic acid molecules such as “DNAzymes”, ribozymes, modified nucleic acids and nucleic acid analogs which can specifically catalyze chemical reactions without the involvement of a protein component Only naturally occurring catalytic nucleic acids can be used, but also nucleic acids produced by evolutionary methods (eg SELEX) can be used Furthermore, the catalytic nucleic acids can be prepared by means of automated solid-phase synthesis.
  • the term "caused or initiated by a magnetic alternating field” is understood to mean that the magnetic alternating field or the impulses cause the release or detachment directly, or the release or detachment indirectly, for example via the activation of enzymes or the production of heat, is effected.
  • the present invention relates to a drug release system in which the oligonucleotide inhibitor strand is covalently bound to the nanoparticle, in particular via a crosslinker (linker 1).
  • the linker 1 as well as the later introduced linker 2 and linker 3, can either be formed covalently directly from two functional groups between nanoparticle (or carrier) and oligonucleotide. This may preferably consist of a peptide bond, a triazole ring or a dithiol bridge or be formed by a different dimerization, condensation, alkylation or click reactions.
  • they may consist of a homo- or heterobifunctional crosslinker inserted between a functional group of the oligonucleotide and a functional group or the reactive surface of the nanoparticle (or carrier).
  • a modified nucleotide in oligonucleotide synthesis is preferably incorporated terminally into the oligonucleotide.
  • the used crosslinker is not cleavable under physiological conditions.
  • heterobifunctional crosslinkers have two different reactive ends, which makes it possible to sequentially carry out the conjugation and thereby avoid unwanted intramolecular side reactions.
  • the group of heterobifunctional crosslinkers includes e.g.
  • Sulfo-SMCC succinimidyl-4- (N-maleimido-methyl) cyclohexane-1-carboxylate
  • sulfo-NHS -hydroxysulfosuccinimide
  • EDC 1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride
  • sulfo-LC- SPDP N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) -propionate
  • amino groups introduced on the nanoparticle surface by aminosilane modification are reacted with an SH group at the 5 'end of the inhibitor oligonucleotide with the Crossliker sulfo-SMCC or sulfo-GMBS.
  • the composition 1 contains the catalytically active nucleic acid and the oligonucleotide inhibitor strand, which is covalently bonded to the particle surface, for example covalently via a bifunctional crosslinker, for example sulfo-SMCC.
  • the base sequences of catalytic nucleic acid and inhibitor strand are completely hybridized under physiological conditions, which is achieved by a largely to completely complementary base sequence.
  • the catalytically active nucleic acid and / or the oligonucleotide inhibitor strand are selected from the group of RNA, DNA, L-RNA or L-DNA or modified nucleic acids.
  • Modified nucleic acids are, for example, those which have a lower nuclease sensitivity than the corresponding, naturally occurring nucleic acids.
  • modified nucleic acids are LNA, PNA, morpholino (Karkare and Bhatnagar, 2006) or GNA (Zhang and Chaput, 2010).
  • L-ribozymes are described, for example, in Seelig et al. (2000), US 2003219422 and DE 10 2009 007929.
  • functional groups for coupling into the oligonucleotide can be introduced by means of modified nucleic acids, which are preferably incorporated terminally. In particular, an SH-modified nucleotide is inserted.
  • This is preferably introduced terminally, in particular at the 5 ' end of the oligonucleotide in the synthesis. This can then be coupled, for example with the aid of one of the crosslinker sulfo-SMCC or sulfo-GMBS, to an amino group of an aminosilane-modified nanoparticle.
  • the present invention relates to a drug release system in which the linker 1 is formed by reaction of an amino group with a crosslinker and the SH group of the SH-modified nucleotide at the 5 ' end of the oligonucleotide inhibitor strand, the amino group being modified by aminosilane modification on the nanoparticle surface and the crosslinker is preferably sulfo-SMCC or sulfo-GMBS.
  • the catalytically active nucleic acid preferably has a length of 10 to 100 nucleotides, in particular a length of 12 to 60 nucleotides.
  • Suitable catalytic nucleic acids are known in the art. These are optionally extended to their 5 'or 3' end in order to set a suitable hybridization temperature or to incorporate modified nucleic acids.
  • the catalytically active nucleic acid used is preferably an RNA or DNA.
  • catalytically active nucleic acid molecules possess sequence specificity. This sequence specificity is due to specific base pairings formed near the cleavage site between the catalytic nucleic acid and the substrate oligonucleotide.
  • catalytically active nucleic acids can be constructed such that any nucleotide sequence can be cut in a sequence-specific manner.
  • RNA molecules In addition to naturally occurring catalytic nucleic acids such as hammerhead, hairpin, ribonuclease P and hepatitis delta virus ribozymes, a number of synthetic RNA molecules have been developed whose catalytic activity has dramatically increased in recent years as a result of the development of in vitro selection techniques (Carmi et al., 1998). "DNAzymes" are a recent product of biotechnological development, and DNA molecules with catalytic activity are obtained exclusively through in vitro selection processes, which can cleave both DNA and RNA, for example, a molecule with RNAse activity. 23 DNAzyme (Santoro et al., 1997).
  • the present invention relates to a drug delivery system in which the catalytically active nucleic acid is selected from the group consisting of RNA, DNA, L-RNA, L-DNA and a modified nucleic acid, wherein the catalytically active nucleic acid in particular an SH-modified Contains nucleotide, wherein the catalytically active nucleic acid preferably has a length of 10 to 100 nucleotides and in particular a length of 12 to 60 nucleotides, wherein the catalytically active nucleic acid is preferably RNA, in particular a ribozyme, in particular a hammerhead ribozyme, and in particular containing Sequence 5 ' -GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3 ' (SEQ ID NO: 1).
  • the catalytic nucleic acids of the invention include, but are not limited to, hammerhead, hairpin, ribonuclease P, and hepatitis delta virus ribozymes, as well as ribozyme analogs derived therefrom, and other synthetic ribozymes and "DNAzymes.”
  • a particularly preferred embodiment of the present invention is hammerhead ribozymes.
  • Naturally occurring hammerhead ribozymes typically consist of a single RNA molecule that self-cleaves.
  • the sequence consists minimally of three double helices, which are connected by short linkers of conserved sequences.
  • the conserved "uridine turn” links helix 1 with helix 2.
  • Helix 2 and helix 3 are linked by the sequence GAAA, and in addition a hammerhead ribozyme contains at least one loop.
  • the catalytically active nucleic acid is an L-RNA, L-DNA and / or a modified nucleic acid.
  • Modified nucleic acids are understood, for example, as those which have a lower nuclease sensitivity.
  • modified nucleic acids can be used to introduce appropriate coupling groups into the oligonucleotide.
  • ribozymes in particular a hammerhead ribozyme.
  • a particularly preferred catalytic nucleic acid contains the sequence 5 '- GGC GAU ACU UCG GAG GCG C-3' (SEQ ID NO: 1).
  • the oligonucleotide inhibitor strand is suitable for the catalytically active nucleic acid gem. constructed of general skill. Accordingly, the oligonucleotide inhibitor strand of the
  • Drug release system also RNA or, DNA, in particular L-RNA, L- DNA and / or modified nucleic acids that have lower nuclease sensitivity.
  • the inhibitor strand preferably has a length of 10 to 100 nucleotides, in particular a length of 10 to 60 nucleotides, and in particular it contains the sequence 5 - G CCT CAT CAG TCG AGC C-3 ' (SEQ ID NO: 2) ,
  • the oligonucleotide inhibitor strand used is preferably a nucleic acid having a length of 10 to 100 nucleotides, in particular having a length of 10 to 60 nucleotides.
  • the chosen length of> 10 nucleotides is due to the hybridization stability, the preference to ⁇ 100 nucleotides is due to the high cost in the synthetic preparation of long oligonucleotides. Basically, this is selected so that it is fully hybridized under physiological conditions due to their base pairing with the catalytic nucleic acid and thus is largely complementary to the catalytic nucleic acid.
  • a particularly preferred nucleic acid contains the sequence 5 '- G CCT CAT CAG TCG AGC C-3' (SEQ ID NO: 2).
  • the invention relates to a drug delivery system in which the oligonucleotide inhibitor strand is selected from the group consisting of RNA, DNA, L-RNA, L-DNA and a modified nucleic acid, in particular containing an SH-modified nucleotide, preferably with a length of 10 to 100 nucleotides, in particular having a length of 10 to 60 nucleotides, in particular containing the sequence 5 - G CCT CAT CAG TCG AGC C-3 ' (SEQ ID NO: 2).
  • the molar ratio of oligonucleotide inhibitor strand to catalytically active nucleic acid is preferably> 1, in particular 1 to 2, in order to ensure a complete hybridization of the catalytic nucleic acid.
  • the oligonucleotide inhibitor strand containing the sequence SEQ ID NO: 2 and the catalytically active nucleic acid containing the sequence SEQ ID NO: 1 was an optimal ratio and a sufficient stability at T ⁇ 43 ° C from 1, 0 to 1, 3, in particular of about 1, 1, determined by in vitro experiments by gel electrophoresis.
  • the present invention thus relates to a drug release system in which in the composition 1, the ratio of the oligonucleotide inhibitor strand to the catalytically active nucleic acid is> 1 and in particular 1 to 2.
  • the present invention relates to a drug delivery system in which in the composition 1, the ratio of the oligonucleotide inhibitor strand having the sequence 5 '- G CCT CAT CAG TCG AGC C-3' (SEQ ID NO: 2) for the catalytically active nucleic acid having the sequence 5 - GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3 ' (SEQ ID NO: 1) is 1, 0 to 1, 3 and especially about 1.1.
  • the catalytically active nucleic acid is completely hybridized with the oligonucleotide inhibitor strand under physiological conditions, in particular even up to a body temperature of below 43 ° C.
  • at temperatures of 43 ° C. and more at least one catalytically active nucleic acid, preferably 5%, more preferably 10%, in particular 20%, of the catalytic active nucleic acids containing the total amount is then dehydrated.
  • the release of the at least one catalytic nucleic acid can be measured via the in a release assay in buffer according to Example 3.
  • Significant release of the fluorochemical dye suggests dehybridization of at least one catalytic nucleic acid.
  • the invention thus relates to a drug release system in which the catalytically active nucleic acid is fully hybridized under physiological conditions with the oligonucleotide inhibitor strand and at 43 ° C at least one catalytically active nucleic acid, preferably 5%, more preferably 10%, and especially 20% of dehybridized bound, catalytically active nucleic acids.
  • the nanoparticle of composition 1 preferably contains a core containing a para or superparamagnetic iron oxide. Suitable nanoparticles are described in the prior art. In particular, nanoparticles from WO 97/38058, WO 98/58673 and WO 2009/086824 are incorporated by reference in each case for the system according to the invention).
  • the invention relates to a drug release system in which the nanoparticle has a core containing at least one paramagnetic or superparamagnetic iron oxide.
  • These nanoparticles are preferably made of a magnetic material, preferably a ferromagnetic, antiferromagnetic, ferrimagnetic, antiferrimagnetic or superparamagnetic material, more preferably iron oxides, in particular superparamagnetic iron oxides or pure iron, which is provided with an oxide layer.
  • iron-based materials are chosen especially for their low toxicity, but in principle other metal oxides are also suitable.
  • Preferred iron oxides are magnetite (Fe 3 O 4 ), maghemite (y-Fe 2 O 3 ) or mixtures of these two oxides.
  • the preferred nanoparticles can be represented by the formula FeO x wherein X is an integer from 1 to 2.
  • magnétique materials of the formula FeOx wherein X is a number in the range of 1, 0 to 2.0
  • materials of the general formula MFe 2 Ü with M Co, Ni, Mn, Zn, Cd, Ba or other ferrites used.
  • silica or polymer particles incorporating and / or attached to magnetic materials such as the magnetic materials referred to herein.
  • the present invention relates to a drug release system in which the paramagnetic or superparamagnetic nanoparticle is heated in the alternating magnetic field.
  • the heat required for the present invention is generated by an extracorporeal magnetic alternating field which excites the preferably superparamagnetic nanoparticles, which releases, above all, hysteresis heat.
  • an extracorporeal magnetic field can be internally amplified (WO 2009/118091).
  • the alternating magnetic field can also be induced internally (WO 2009/118091). This release of heat results in the increased temperature needed to release the catalytically active nucleic acid.
  • Frequencies in the range of 10 to 500 kHz and field strengths of 0.5 to 50 kA / m, in particular 50 to 200 kHz and field strengths of 0.5 to 20 kA / m are used in particular for heating the paramagnetic or superparamagnetic nanoparticles in the alternating magnetic field. These areas are particularly tolerable and clinically proven for human treatment.
  • a heating of the tissue containing the nanoparticles to above 80 ° C, in particular to temperatures between 43 ° C and 55 ° C is possible and depending on the specific absorption rate of the particles and their concentration in the target tissue.
  • the preparation of nanoparticles, but without active ingredient and also without coating is described in detail in US 6,048,515.
  • the functionalization of the surface of the nanoparticles is known, so that amino groups, hydroxyl groups, carboxyl groups, thiol groups, epoxide groups or carbonyl groups can be generated on the surface of the nanoparticles by known methods.
  • the nanoparticles are preferably based on magnetic iron-containing cores surrounded by one or more colloidal shells or coatings.
  • the core preferably consists of magnetite or maghemite.
  • the primary function of the shells is to achieve a colloidal distribution in the aqueous medium and to protect the nanoparticles from agglomeration.
  • Multishally coated particles as described in WO 98/58673, are suitable in principle as the basis for the nanoparticle conjugates, since the biological behavior of such particles can be adjusted by overcoating with polymers.
  • an iron oxide core having a diameter of 15 nm was used, which was provided with a reactive silane shell, specifically, an aminosilane shell.
  • the nanoparticles of composition 1 according to the invention preferably comprise at least one shell, preferably a silane shell or a SiO 2 shell and a silane shell. These particles are superparamagnetic and have the advantage of an inert surface compared to the pure iron particles. Thus, the iron oxide core is protected from reactions in the physiological medium;
  • the SiO 2 surface offers the advantage that the density of functionality is increased by condensation of the reactive silane on the existing SiOH groups compared to pure iron oxide. Preference is given to nanoparticles which have been coated with the functional Silane shell with a Si0 2 layer of 1-20 nm, in particular 5 nm were coated.
  • the present invention relates to a drug release system in which the nanoparticle contains at least one shell, preferably a silane shell or a SiO 2 and a silane shell.
  • nanoparticles of a non-magnetic material such as silicon oxide (Si0 2 ) (see below) or gold (Au). If nanoparticles made of non-magnetic materials are used, the excitation and heat generation in the nanoparticle area is not effected by a magnetic alternating field but by infrared radiation, for example.
  • the nanoparticles preferably have a diameter of less than 500 nm.
  • the nanoparticles preferably have an average diameter of 15 nm or are preferably in the size range from 1 to 100 nm and particularly preferably in the range from 10 to 20 nm.
  • the substrate molecule must be cleavable by the catalytically active nucleic acid, so that is released by the cleavage of the drug from the carrier-substrate molecule-drug conjugate and can exert its effect.
  • the substrate molecule is an oligonucleotide, but it may also be a cleavable peptide or another molecule which is matched to the catalytically active nucleic acid.
  • the present invention relates to a drug delivery system in which the substrate molecule is an oligonucleotide.
  • the carrier of composition 2 may be a polymer (eg, a polylactide glycolide), especially a biopolymer, an SiO 2 particle, a metallic particle, eg, gold particles, or an oxide particle. Suitable biopolymers are, for example, sugars, dextranes, chitosans or starch. Also preferred for this purpose is a surface-modified iron oxide particle.
  • the carrier may be in the form of a gel, microparticle, microsphere or nanoparticle. According to a particularly preferred embodiment, the composition 2 is also present as an oxidic nanoparticle as described above for composition 1.
  • nanoparticle-containing medical devices as described in WO 2009/100716 (incorporated by reference).
  • the oligonucleotide inhibitor strand hybridized to the catalytically active nucleic acid and the substrate molecule-drug conjugate may be coupled to the same nanoparticle.
  • the present invention thus relates to a drug release system in which the carrier is a polymer, in particular a biopolymer, an SiO 2 particle, a metallic particle, in particular a gold particle, or an oxidic particle, preferably a surface-modified iron oxide particle as a gel, microparticles, microsphere or nanoparticles, in particular as oxidic nanoparticles, is present.
  • the carrier is a polymer, in particular a biopolymer, an SiO 2 particle, a metallic particle, in particular a gold particle, or an oxidic particle, preferably a surface-modified iron oxide particle as a gel, microparticles, microsphere or nanoparticles, in particular as oxidic nanoparticles, is present.
  • the drug release system according to the invention in one embodiment comprises two types of nanoparticles.
  • the nanoparticles which contain the active substance bound via the substrate oligonucleotide and optionally a linker to the magnetic nanoparticles and, on the other hand, the nanoparticles which hybridize the catalytically active nucleic acid to an oligonucleotide inhibitor strand.
  • a one-component system in which both components (catalytically active nucleic acid and substrate) are bound to a particle.
  • the present invention also relates to a nanoparticle associated with an oligonucleotide inhibitor strand hybridized with a catalytically active nucleic acid capable of cleaving a substrate oligonucleotide linked to another nanoparticle and a therapeutic agent.
  • the present invention relates to a nanoparticle which is associated with a therapeutic agent and with a substrate oligonucleotide, wherein the substrate oligonucleotide is cleavable by a catalytically active nucleic acid.
  • the functional principle of the drug delivery system according to the invention is as follows.
  • the catalytically active nucleic acid is hybridized to an oligonucleotide inhibitor strand and is only at elevated temperature, i. released above 38 ° C, preferably above 40 ° C. This ensures that under physiological conditions and at temperatures up to 38 ° C, no release of the catalytically active nucleic acid occurs.
  • the oligonucleotide inhibitor strand to which the catalytically active nucleic acid is hybridized is in turn bound to a magnetic nanoparticle and preferably to a superparamagnetic nanoparticle.
  • the active substance to be released which is primarily an anticancer agent, is bound to another nanoparticle via a substrate oligonucleotide and optionally a linker, but may also be bound to the same nanoparticle on which the oligonucleotide inhibitor strand with the hybridized catalytically active Nucleic acid is bound.
  • the carrier or particle-drug conjugates also offer the advantage that they accumulate in tumor cells or bacterial cells and, for example, by MRI (magnetic resonance tomography) detect not only tumors of small size but even individual tumor cells. This highly sensitive detection method can be used, for example, to detect the occurrence and extent of metastasis.
  • the nanoparticles according to the invention and the active substance release system according to the invention can be used in this detection method.
  • the active substance is bound so tightly and preferably covalently to the substrate oligonucleotide that substantially no cleavage of the active substance takes place under physiological conditions.
  • the nanoparticle, to which the substrate oligonucleotide is optionally bonded via a linker, is preferably also magnetic, and in particular preferably superparamagnetic, particles in the nanometer to micrometer range.
  • the temperature in the region of the nanoparticles can be increased in such a way that the hybridized catalytically active nucleic acid is released.
  • the catalytically active nucleic acid then binds to the substrate oligonucleotide and cleaves it, so that the active ingredient is detached from the nanoparticle and can develop its activity.
  • FIG. 2 shows an embodiment of the drug release system according to the invention.
  • the nanoparticle-drug conjugates consist of nanoparticles (eg iron oxide, gold, S1O2 or core-shell particles of different preferably superparamagnetic materials), optionally crosslinkers and substrate oligonucleotides (DNA, RNA, modified nucleic acids and nucleic acid analogs) carrying an active substance and specifically cleaved by corresponding catalytic nucleic acids.
  • substrate oligonucleotides DNA, RNA, modified nucleic acids and nucleic acid analogs
  • the catalytic nucleic acids from the first component serve as a cutting tool after thermal release to cleave the substrate oligonucleotide strand.
  • the active substance symbolized by the star in Figure 2, is subsequently released.
  • the advantage of the active substance release system according to the invention lies in the catalytic activity of the nucleic acids and the resulting increased efficiency in the enzymatic release of the active ingredient from the nanoparticle-active substance conjugate. Due to the enzymatic nature of the catalytically active nucleic acids, only low concentrations of catalytic nucleic acids are necessary to release therapeutically effective concentration of the drug from the nanoparticle-drug conjugate.
  • the temperature-dependent activation of the catalytic nucleic acids can be e.g. be varied as desired by the length of the inhibitor sequence or the hybridization ratios between inhibitor and catalytic nucleic acids.
  • the rate of drug release or the amount of the released active ingredients are dependent on the local temperature or the concentrations of the components, so that possible side effects of the active ingredient on normal cells can be minimized.
  • the substrate molecule is covalently bound to the support, preferably via a linker 2.
  • the linker 2 is selected according to general knowledge depending on the reactive groups of the carrier or the substrate molecule present. Possibly. a modified nucleic acid, in particular terminally modified nucleic acid, is used to provide, for example, an amino group on the substrate oligonucleotide side.
  • the same crosslinkers can be used as were described above for linker 1.
  • Preferred linkers are sulfo-SMCC and sulfo-GMBS.
  • the present invention relates to a drug release system in which the substrate molecule is covalently, in particular via a linker 2 covalently connected to the carrier, wherein the linker is preferably sulfo-SMCC or sulfo-GMBS.
  • the substrate oligonucleotide is preferably selected from DNA, RNA, L-DNA, L-RNA and modified nucleic acids.
  • modified nucleic acids those which have lower nuclease sensitivity are preferred To prevent or reduce spontaneous release by the activity of naturally occurring nucleases.
  • modified nucleotides can be incorporated which contain an additional reactive group, a coupling functionalization. These are preferably installed terminally.
  • Preferred functions are in particular amino, thiol, or Corboxyl, alkyne or azide function.
  • the present invention thus relates to a drug delivery system in which the substrate oligonucleotide is selected from the group consisting of DNA, RNA, L-DNA, L-RNA and a modified nucleic acid, wherein the modified nucleic acid preferably a particular terminal coupling functionalization, in particular a Amino, thiol, or Corboxyl, alkyne or azide function.
  • the substrate oligonucleotide is selected from the group consisting of DNA, RNA, L-DNA, L-RNA and a modified nucleic acid, wherein the modified nucleic acid preferably a particular terminal coupling functionalization, in particular a Amino, thiol, or Corboxyl, alkyne or azide function.
  • any molecule which can be cleaved by catalytically active nucleic acid selected for composition 1 can be used as substrate molecule.
  • this cleavage is specific.
  • Corresponding pairs of catalytic nucleic acids and their substrates are well known in the art.
  • Substrate oligonucleotides preferably have a length of 10 to 100 nt, more preferably 15-60 nt, in particular 20-30 nt. Again, oligonucleotides greater than 100 nt are usually too expensive. Detection sequences of substrates are usually at least 10 nt in length.
  • catalytically active nucleic acid is a substrate oligonucleotide is in particular comprising the sequence 5 '- GCG CCG AAA CAC GUC CGU UCG AGC-3' (SEQ ID NO: 3) is preferred.
  • the present invention relates to a drug delivery system in which the substrate oligonucleotide is from 10 to 100 nucleotides in length, preferably from 15 to 60 nucleotides in length, more preferably from 20 to 30 nucleotides in length, especially containing Sequence 5 - GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3 ' (SEQ ID NO: 3).
  • the active substance release system according to the invention comprises at least one therapeutic agent which is selected from the group comprising nucleic acids, siRNAs, antisense RNAs, amino acids, aptamers, peptides, proteins, glycoproteins, carbohydrates, glycans, lipids, lipoproteins and low molecular weight active substances. Particularly preferred are low molecular weight drugs.
  • anti-proliferative, cytostatic, cytotoxic, anti-migratory, anti-angiogenic, anti-thrombotic, anti-inflammatory, anti-inflammatory, anti-coagulative, anti-bacterial, anti-viral and / or antifungal active ingredients in particular cytostatic or cytotoxic effect
  • antiproliferative, anti-migratory, anti-angiogenic, cytostatic and / or cytotoxic agents and nucleic acids in particular inhibitory nucleic acids (eg siRNA), amino acids, peptides, proteins, carbohydrates, lipids, glycoproteins, glycans or lipoproteins with anti-proliferative, anti-migrative, anti-angiogenic, anti-thrombotic, anti-inflammatory, anti-inflammatory, cytostatic, cytotoxic, anti-coagulative, anti-bacterial, anti-viral and / or anti-mycotic properties are preferred.
  • these substances may also be radiosensitizers or sensitizers or enhancers of other substances.
  • the present invention thus relates to a drug delivery system in which the therapeutic agent is selected from the group comprising nucleic acids, siRNAs, antisense RNAs, amino acids, aptamers, peptides, proteins, glycoproteins, carbohydrates, glycans, lipids, lipoproteins and low molecular weight drugs, the is a therapeutic agent, in particular a small molecule, and preferably an anti-proliferative, cytostatic, cytotoxic, anti-migratory, anti-angiogenic, anti-thrombotic, anti-inflammatory, anti-phlogistic, anti-coagulative, anti-bacterial, anti- viral and / or antifungal activity, in particular has a cytostatic or cytotoxic effect, in particular wherein the therapeutic agent is doxorubicin or methotrexate.
  • the therapeutic agent is selected from the group comprising nucleic acids, siRNAs, antisense RNAs, amino acids, aptamers, peptides, proteins, glycoproteins, carbohydrates, gly
  • cytotoxic and / or cytostatic compounds ie chemical compounds with cytotoxic and / or cytostatic properties can include alkylating agents, antibiotics with cytostatic properties, antimetabolites, microtubule inhibitors and topoisomerase inhibitors, platinum-containing compounds and other cytotoxic agents such as asparaginase, tretinoin, alkaloids , Podophyllotoxins, taxanes and Miltefosin ® , hormones, immunomodulators, monoclonal antibodies, signal transducers (signal transduction molecules) and cytokines.
  • alkylating agents such as asparaginase, tretinoin, alkaloids , Podophyllotoxins, taxanes and Miltefosin ® , hormones, immunomodulators, monoclonal antibodies, signal transducers (signal transduction molecules) and cytokines.
  • alkylating agents there may be mentioned, among others, chloroethamine, cyclophosphamide, trofosfamide, ifosfamide, melphalan, chlorambucil, busulfan, thiotepa, carmustine, lomustine, dacarbazine, procarbazine, temozolomide, treosulfan, estramustine and nimustine.
  • antibiotics with cytostatic properties are daunorubicin as well as liposomal daunorubicin, doxorubicin (adriamycin), dactinomycin, mitomycin C, bleomycin, epirubicin (4-epi-adriamycin), idarubicin, dactinomycin, mitoxantrone, amsacrine and actinomycin D.
  • Methotrexate, 5-fluorouracil, 6-thioguanine, 6-mercaptopurine, fludarabine, cladribine, pentostatin, gemcitabine, cytarabine, azathioprine, raltitrexed, capecitabine, cytosine arabinoside, tioguanine and mercaptopurine may be cited as examples of antimetabolites (antimetabolic agents).
  • the class of alkaloids and podophyllotoxins include, but are not limited to, vincristine, vinblastine, vindesine, etoposide, and teniposide.
  • platinum-containing compounds can be used according to the invention.
  • platinum containing compounds may be mentioned, for example, cisplatin, carboplatin and oxaliplatin.
  • To the microtubule inhibitors include, for example alkaloids, such as vinca alkaloids (vincristine, vinblastine, vindesine, Venorelbin) and paclitaxel (Taxol ®), as well as derivatives of paclitaxel.
  • topoisomerase inhibitors include etoposide, teniposide, camptothecin, topotecan and irinotecan.
  • Paclitaxel and docetaxel are examples of the compound class of taxanes and among the other cytostatic agents (other cytostatics) include, for example hydroxycarbamide (hydroxyurea), imatinib, miltefosine ®, amsacrine, topotecan (topoisomerase I inhibitor), pentostatin, bexarotene, tretinoin and asparaginase ,
  • cytostatic agents include, for example hydroxycarbamide (hydroxyurea), imatinib, miltefosine ®, amsacrine, topotecan (topoisomerase I inhibitor), pentostatin, bexarotene, tretinoin and asparaginase
  • Representatives of the compound class of monoclonal antibodies include trastuzumab (Herceptin ®), alemtuzumab (Campath ®) and rituximab (MabThera ®).
  • Hormones such as glucocorticoids (prednisone), estrogens (Fosfestrol, estramustine), LHRH (buserelin, goserelin, leuprorelin, triptorelin), flutamide, cyproterone acetate, tamoxifen, toremifene, aminoglutethimide, formestane, exemestane, letrozole and anastrozole can also be used.
  • prednisone prednisone
  • estrogens Frasfestrol, estramustine
  • LHRH buserelin, goserelin, leuprorelin, triptorelin
  • flutamide cyproterone acetate
  • tamoxifen toremifene
  • aminoglutethimide aminoglutethimide
  • formestane exemestane
  • letrozole and anastrozole can also be used.
  • cytokines cytokines, antibodies and signal interleukin-2, interferon- ⁇ , erythropoietin, G-CSF, trastuzumab, rituximab, Efitinib count (Iressa ®), Ibritumomab (Zevalin ®), levamisole, as well as retinoids.
  • the drug to be released may also be an opioid agonist, a nonopioid analgesic, a non-steroidal anti-inflammatory (NSAID) drug, an anti-migraine drug, a Cox-II inhibitor, a ⁇ -adrenergic blocker, an anticonvulsant, antidepressant, Ca 2+ channel blocker or drug for the treatment of neuronal or neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, anxiety, epilepsy, stroke, psychosis, cognitive disorders or depression.
  • NSAID non-steroidal anti-inflammatory
  • the drug release system and pharmaceutical compositions of the present invention are used for the treatment as well as the prophylaxis of diseases in which the controlled drug release properties can be exploited to control the drug, in therapeutically relevant concentrations, only in the cells of the target tissue.
  • Another significant advantage of the present invention is the possibility of controlled time-dependent drug release of an agent from the particles by applying an external alternating magnetic field in magnetic particles or by irradiation with infrared waves in non-magnetic particles. As a result, at a certain point in time, for example during a migraine attack or when severe pain occurs, targeted and timely controlled release of active ingredient to treat the disorder, pain or other diseases.
  • the drug delivery system and the pharmaceutical compositions containing it also for the prophylaxis and treatment of pain, neurodegenerative diseases and cardiovascular diseases.
  • Examples of useful opioid agonists include: alfentanil, allylprodin, alphaprodine, anileridine, benzylmorphine, bezitramide, bubrenorphine, butorphanol, clonitazene, codeine, desomorphine, dextromoramide, decocin, diampromide, diamorphone, dihydrocodeine, dihydromorphine, dimenoxadol, dimepheptanol, dimethylthiambutene , Ethylmorphine, etonitazene fentanyl, heroin, hydrocodone.hydromorphone, hydroxypethidine, isomethadone, ketobemidone, levorphanol, levophenacylmorphan, lofentanil, meperidine, meptazinol, metazocine, methadone, metopon, morphine, myrophin, nalbuphine, narcein, nicomorphine,
  • non-steroidal anti-inflammatory (NSAID) agents examples include aspirin, ibuprofen, diclofenac, naproxen, benoxaprofen, flurbiprofen, fenoprofen, flubufen, ketoprofen, indoprofen, piroprofen, carprofen, oxaprozin, pramoprofen, muroprofen , Trioxaprofen, suprofen, aminoprofen, tiaprofenoic acid, fluprofen, bucloxinic acid, indomethacin, sulindac, tolmetin, zomepirac, tiopinac, zidometacin, acemetacin, fentiazac, clidanac, oxpinac, mefenamic acid, meclofenamic acid, flufenamic acid, niflumic acid, to
  • nonopioid analgesics include the following chemical classes of analgesic, antipyretic, non-steroidal anti-inflammatory (NSAID) agents: salicylic acid derivatives including aspirin, sodium salicylate, choline-magnesium trisalicylate, salsalate, diflunisal, salicylic acid bicylic acid, sulfasalazine, and olsalazine; para-aminophenol derivatives, including acetaminophen and phenacetin; Indole and indenoacetic acid, including indomethacin, sulindac and etodolac; Heteroarylacetic acids, including tolmetin, diclofenac and ketorolac; Anthranilic acid (fenamate), including mefenamic acid and meclofenamic acid; Enolic acids, including oxicams (piroxicam, tenoxicam) and pyrazolidinediones (phenylbutazone, oxy
  • Cox-II inhibitors and 5-lipoxygenase inhibitors are: celecoxib, etoricoxib, rofecoxib, parecoxib and valdecoxib.
  • useful anti-migraine agents include: Alpiropride, Bromocriptine, Dihydroergotamine, Dolasetron, Ergocornine, Ergocorninine, Ergocryptine, Ergonovine, Ergot, Ergotamine, Flumedroxone acetate, Fonazine, Ketanserin, Lisurid, Lomerizine, Methylergonovine, Methysergide, Metoprolol, Naratriptan, oxetoron, pizotylin, propranolol, risperidone, rizatriptan, sumatriptan, timolol, trazodone, zolmitriptan and mixtures thereof.
  • ⁇ -adrenergic blocking agents are: acebutolol, alprenolol, amosulabol, arotinolol, atenolol, befunolol, betaxolol, bevantolol, bisoprolol, bopindolol, bucumolol, bufetolol, bufuralol, bunitrolol, bupranolol, butidrine hydrochloride, butofilolol, carazolol, Carteolol, Carvedilol, Celiprolol, Cetamolol, Chloranolol, Dilevalol, Epanolol, Esmolol, Indenolol, Labetalol, Levobunolol, Mepindolol, Metipranolol, Metoprolol, Moprolol, Nadolol,
  • Examples of useful anticonvulsants include: acetylpheneturides, albutoin, aloxidone, aminoglutethimides, 4-amino-3-hydroxybutyric acid, atrolactamide, beclamid, buramate, calcium bromide, carbamazepine, cinromide, clomethiazole, clonazepam, decimemide, diethadione, dimethadione, doxenitroin, etterobarb , Ethadione, ethosuximide, ethotoin, felbamate, fluoreson, gabapentin, 5-hydroxytryptophan, lamotrigine, magnesium bromide, magnesium sulfate, mephenytoin, mephobarbital, metharbital, methetoin, methsimide, 5-methyl-5- (3-phenanthryl) -hydantoin, 3-methyl 5-phenylhydantoin, narcobarbital,
  • Phenylmethylbarbituric acid Phenylmethylbarbituric acid, phenytoin, phethenylate sodium, potassium bromide, pregabalin, primidone, progabide, sodium bromide, solanum, strontium bromide, suclofenide, sulthiam, tetrantoin, tiagabine, topiramate, trimethadione, valproic acid, valpromide, vigabatrin and zonisamide.
  • Examples of useful antidepressants are: Binedalin, Caroxazone, Citalopram, (S) -citalopram, Dimethazan.Fencamine, Indalphin, Indeloxazine Hydrochloride, Nefopam, Nomifensine, Oxitriptan, Oxypertin, Paroxetine, Setralin, Thiazesim, Trazodone, Benmoxin, Iprociozide , Iproniazid, isocarboxazid, nialamide, octamoxine, phenelzine, cotinine, rolicyprin, rolipram, maprotiline, metralindole, mianserin, mirtazepine, adinazolam, amitriptyline, amitriptyline, amoxapine, butriptyline, clomipramine, demexiptiline, desipramine, dibenzepine, dimet
  • Ca 2+ channel blockers examples include bepridil, clentiazem, diltiazem, fendiline, gallopamil, mibefradil, prenylamine, semiotiadil, terdiline, verapamil, amlodipine, aranidipine, barnidipine, benidipine, cilnidipine, efonidipine, elgodipine, felodipine, isradipine , Lacidipine, Lercanidipine, Manidipine, Nicardipine, Nifedipine, Nilvadipine, Nimodipine, Nisoldipine, Nitrendipine, Cinnarizine, Flunarizine, Lidoflazine, Lomerizine, Bencyclan, Etafenone, Fantofarone and Perhexiline.
  • Examples of useful agents in the treatment of neuronal or neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, anxiety, epilepsy, stroke, psychosis, cognitive disorders or depression include: L-dopa, anticholinergics, COMT inhibitors, serotonin reuptake inhibitors , Buspirone, Tricyclic Antidepressants, Monoamine Oxidase Inhibitors, Valproic Acid, Carbamazepine, Selective Serotonin Reuptake inhibitors, serotonin norepinephrine reuptake inhibitors, noradrenaline serotonin-selective antidepressants and trimipramine.
  • Parkinson's disease Carbidopa / levodopa, pergolide, bromocriptine, ropinirole, pramipexole, entacapone, tolcapone, selegiline, amantadine and trihexyphenidyl hydrochloride.
  • benzodiazepines e.g. Alprazolam, Breadizolam, Chlordiazepoxide, Clobazam, Clonazepam, Clorazepate, Demoxepam, Diazepam, Estazolam, Flumazenil, Flurazepam, Halazepam, Lorazepam, Midazolam, Nitrazepam, Nordazepam, Oxazepam, Prazepam, Quazepam, Temazepam and Triazolam;
  • Non-benzodiazepine drugs such as e.g.
  • Buspirone Gepirone, Ipsapirone, Tiospirone, Zolpicon, Zolpidem and Zaleplon; Tranquillizers from the group of barbiturates, e.g. Amobarbital, Aprobarbital, Butabarbital, Butalbital, Mephobarbital, Methohexital, Pentobarbital, Phenobarbital, Secobarbital and Thiopental; and propanediol carbamate, such as meprobamate and tybamate.
  • carbamazepine ethosuximide, gabapentin, lamotrigine, phenobarbital, phenytoin, primidone, valproic acid, trimethadione, benzodiazepines, ⁇ -vinyl GABA, acetazolamide and felbamate.
  • Anticoagulant agents e.g. Heparin
  • drugs that can dissolve clotted blood clots such as streptokinase or tissue-specific plasminogen activators and drugs that reduce swelling, such as mannitol, corticosteroids or acetylsalicylic acid.
  • phentothiazines such as chlorpromazine hydrochloride, mesoridazine besylate and thoridazine hydrochloride;
  • Thioxanthenes such as chloroprothixene and thiothixene hydrochloride, clozapine, risperidone, olanzapine, quetiapine, quetiapine fumarate, haloperidol, haloperidol decanoate, loxapine succinate, molindone hydrochloride, primocid and ziprasidone.
  • agents for the treatment of dementia e.g. tacrine; Donepezil, ibuprofen and antipsychotic agents such as thioridazine and haloperidol.
  • amitryptyline amoxapine, bupropion, clomiopramine, desipramine, doxepin, imipramine, maprotiline, nefazadone, nortriptyline, protriptyline, trazodone, trimipramine, venlafaxine, citalopram, (S) -citalopram, fluoxetine, fluvoxamine, paroxetine, Setralin, isocarboazide, pargyline, phenelzine, tranylcypromine, dextroamphetamine and methylphenidate.
  • the aforementioned active ingredients are preferably covalently bound to the substrate oligonucleotide.
  • the binding of the active ingredients can be carried out, for example, via hydroxyl groups, amino groups, carbonyl groups, thiol groups or carboxyl groups, depending on which functional groups the respective active ingredient carries.
  • Hydroxy groups are preferably bonded as ester, acetal or ketal, thio groups preferably as thioester, thioacetal or thioketal, amino groups preferably as amides and partly also as imines (Schiff bases), carboxyl groups preferably as esters or amides and carbonyl groups preferably as ketals.
  • the active ingredients doxorubicin and methotrexate are preferred.
  • Methotrexate can be covalently linked by means of a peptide bond via an amino group, which in the substrate oligonucleotide preferably terminally coupled via a carboxy group of the methotrexate.
  • doxorubicin could be coupled as a prodrug via a linker to the amino function as described for albumin-doxorubicin conjugates in the art (Abu Ajaj et al., 2009, Boga et al., 2009, Calderon et al., 2009 , Kratz et al., 2008).
  • the attachment of the at least one therapeutically active substance to the substrate oligonucleotide i.
  • the molecules of at least one therapeutically active substance class or of a specific active ingredient are preferably covalently or by a predominantly covalent bond and / or by a sufficiently strong ionic bond, insertion compound, complex binding or by intercalation, so that an uncontrolled release of therapeutically active substance is largely omitted.
  • Uncontrolled release is understood to mean the detachment of therapeutically active substance in healthy tissue, in particular the detachment without cleavage of the substrate oligonucleotide by the catalytic nucleic acid of the first component.
  • the catalytic nucleic acid is separated from its oligonucleotide inhibitor strand, for example by means of an alternating magnetic field, in particular an external or externally applied alternating magnetic field (pulse) or by IR radiation for gold nanoparticles.
  • the free catalytic nucleic acid then binds the substrate oligonucleotide in the nanoparticle-drug conjugate and releases by cleavage of the substrate, the drug together with the attached oligonucleotide.
  • the single-stranded oligonucleotide is rapidly degraded inside the cell, so that then the drug is completely free.
  • the therapeutic agent is covalently linked, in particular via a linker 3, to the substrate oligonucleotide.
  • a linker 3 This can be done as described above for linkers 1 and 2 by direct attachment, in particular formation of a peptide bond between the active substance and substrate molecule, but also by a homo- or heterobifunctional crosslinker.
  • the present invention thus relates to a drug delivery system in which the therapeutic agent is covalently, in particular via a linker 3 covalently connected to the substrate molecule.
  • the linker 3 is a peptide bond or a hydrazone, the latter having the advantage that it is in the acidic environment of the lysosome or the tumor of the substrate residue, i. the part that is still present after cleavage on the active ingredient, split off and thus the original structure of the drug is restored.
  • Methotrexate can be covalently coupled via a peptide bond via an amino group, which has preferably been terminally incorporated into the substrate oligonucleotide via a carboxy group of the methotrexate.
  • Doxorubicin can be coupled as a prodrug via the amino group (Abu Ajaj et al., 2009, Boga et al., 2009, Calderon et al., 2009, Kratz et al., 2008).
  • the present invention relates to a drug delivery system in which the linker 3 is selected from the group consisting of an amino group and hydrazone, in particular wherein methotrexate is coupled via a peptide bond between the amino group with a carboxy group of the methotrexate.
  • the therapeutic agent is inactive as long as it is bound to the substrate molecule and / or the linker 3. With release of the substrate oligonucleotide or linker 3 by the cleavage of the substrate molecule or after subsequent uptake by a cell, the active ingredient is then activated.
  • the cleaved agent may still contain a portion of the now cleaved substrate molecule and linker 3 and thus be deactivated.
  • cleavable, in particular enzymatically cleavable or acid-labile crosslinkers can be used in the cell, in particular hydrazones, which are split upon entry into the lysosome and release the active ingredient.
  • the present invention relates to a drug delivery system in which the therapeutic agent is inactive while bound to the substrate molecule and / or the linker 3, and in which the therapeutic agent is released from the substrate molecule or released from the linker, respectively 3 or after subsequent uptake by a cell is activated.
  • a short nucleotide strand may remain in the cleavage still on the active ingredient, which, however, degraded under physiological conditions and does not or not significantly affect the effectiveness of the drug.
  • a protective sheath or barrier coating may be therapeutic Prevent active substances until the nanoparticles have reached their destination.
  • this protective cover or barrier coating or as a further layer on this protective cover or Barrier coating can be applied to an outer layer carrying cell-specific functionalities.
  • This cell-specific coating increases the affinity of the nanoparticles for certain cells, for example to specific bacterial cells or to specific tumor cells and thus serves for cell discrimination.
  • Such cell-specific nanoparticles preferentially accumulate in such cells to which they have an increased affinity on their surface due to the functionality and are thus tumor-specific.
  • this technology allows the development of tumor-specific nanoparticles for certain cancers.
  • the nanoparticles can be stabilized by a colloidal protective sheath, which protect the nanoparticles from agglomeration. It is preferred if such protective sheaths or coatings have amino groups or carboxy groups.
  • a colloidal protective sheath which protect the nanoparticles from agglomeration.
  • Such protective sheaths or coatings have amino groups or carboxy groups.
  • biological, synthetic or semisynthetic polymers can be used.
  • biostable i. extensively resistant polymers are used against biodegradation.
  • biodegradable polymers are preferably used for the production of cell-specific casings or coatings.
  • biostable polymers may be used: polyacrylic acid and polyacrylates such as polymethylmethacrylate, polybutylmethacrylate, polyacrylamide, polyacrylonitriles, polyamides, polyetheramides, polyethyleneamine, polyimides, polycarbonates, polycarbourethanes, polyvinyl ketones, polyvinyl halides, polyvinylidene halides, polyvinyl ethers, polyisobutylenes, polyvinylaromatics, polyvinyl esters, polyvinylpyrollidones, polyoxymethylenes, polytetramethylene oxide , Polyethylene, polypropylene, polytetrafluoroethylene, polyurethanes, polyether urethanes, silicone polyether urethanes, silicone polyurethanes, silicone-polycarbonate urethanes, polyolefin elastomers, polyisobutylenes, EPDM rubbers, fluorosilicones, carboxy- methyl chi
  • biodegradable polymers it is possible to use: polyvalerolactones, poly- ⁇ -decalactones, polylactic acid, polyglycolic acid polylactides, polyglycolides, copolymers of polylactides and polyglycolides, poly-s-caprolactone, polyhydroxybutyric acid, polyhydroxybutyrates, polyhydroxyvalerates, polyhydroxybutyrate-co-valerates, poly ( 1, 4-dioxane-2,3-diones), poly (1,3-dioxan-2-ones), poly-para-dioxanones, polyanhydrides such as polymaleic anhydrides, polyhydroxymethacrylates, fibrin, polycyanoacrylates, polycaprolactone-dimethylacrylates, poly- ⁇ - Maleic acid polycaprolactone butyl acrylates,
  • Multiblock polymers such as oligocaprolactone diols and oligodioxanonediols, polyether ester multiblock polymers such as PEG and poly (butylene terephthalate), polypivotolactones, polyglycolic acid trimethylcarbonates, polycaprolactone glycolides, poly (D-ethylglutamate), poly (DTH-iminocarbonate), poly (DTE-co-DT-carbonate), Poly (bisphenol A-iminocarbonate), polyorthoesters, polyglycolic acid trimethylcarbonates, polytrimethylcarbonates, polyiminocarbonates, poly (N-vinyl) -pyrrolidone, polyvinyl alcohols, polyesteramides, glycolated polyesters, polyphosphoesters, polyphosphazenes, poly [(p-carboxyphenoxy) propane] polyhydroxypentanoic acid, polyanhydrides, Polyethylene oxide-propylene oxide, polyurethanes, polyure
  • monoclonal antibodies and / or aptamers can be coupled on the surface of the nanoparticles or on the outer layer or shell of the nanoparticles.
  • the monoclonal antibodies and aptamers are designed in such a way that they recognize certain cells, for example tumor cells, and further increase the cell discrimination of the nanoparticles.
  • the catalytically active nucleic acid if it is dissociated from the oligonucleotide inhibitor strand, can cleave the substrate molecule.
  • the concentration of the substrate molecule is> K M , where k cat is preferably> 0.05 / min, more preferably> 0.5 / min, more preferably 1 / min, and especially ⁇ 5 / min.
  • composition 1 The ratio of composition 1 to composition 2 is preferably ⁇ 2, in particular 1.
  • the oligonucleotide inhibitor strand, the catalytically active nucleic acid and the substrate oligonucleotide are each a mirrored nucleic acid.
  • the oligonucleotide inhibitor strand is a L-DNA, in particular comprising the sequence 5 '- G CCT CAT CAG TCG AGC C-3' (SEQ ID NO: 2), wherein the catalytically active nucleic acid is a L-RNA is, in particular comprising the sequence 5 '- GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3' (SEQ ID NO: 1), and that the substrate oligonucleotide is an L-RNA, in particular comprising the sequence 5 - GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3 '(SEQ ID NO: 3).
  • a particularly suitable drug release system could be implemented according to the examples.
  • Another object of this invention is a composition 1 as defined in this invention.
  • a composition 1 can be sold as a single product, e.g. a patient had previously had a composition 2 implanted earlier, for example, during a previous surgery.
  • the active ingredient coupled to such an implant could thus be split off at a later time by separate addition of the composition 1 and thus activated.
  • the composition can be injected into the implant (eg sponge-like polymers), to the implant (in feeding (blood) vessels or in close proximity) or administered systemically (zBi V.), especially if the composition 1 via a targeting mechanism accumulates in the target tissue.
  • composition 2 as defined in the context of the present invention. As described above, this can be implanted at an earlier point in time, for example during an operation, at specific locations in the body in order to release the coupled active substance at a later point in time.
  • the present invention relates to pharmaceutical compositions or medicaments containing the drug release system according to the invention or one of the inventive compositions 1 or 2, as well as the use of the drug delivery system according to the invention for the preparation of such pharmaceutical compositions.
  • These pharmaceutical compositions are, in particular, infusion or injection solutions.
  • Such solutions of the nanoparticles, in, for example, physiological saline, are suitable for interstitial or intratumoral application.
  • Intra-arterial or intravenous administration also allows a systemic, whole-body therapeutic option for non-solid and / or metastatic tumor types.
  • the pharmaceutical compositions or medicaments are formulated according to skill in the art, i. if necessary, suitable buffers and auxiliaries are added.
  • the present invention relates to a medicament containing a drug delivery system as defined in the context of the present invention.
  • the drug release system and pharmaceutical compositions of the invention are used for the treatment as well as the prophylaxis of diseases characterized by degenerate cell species or foreign cells and in which the controlled drug release properties can be exploited to control the drug at therapeutically relevant concentrations, only in the degenerate cells release.
  • Degenerate cells are especially cancer cells or in their proliferation disordered cells as well as stenotic or restenotic tissue. In particular, bacteria can be mentioned as foreign cells.
  • the drug delivery system and the pharmaceutical compositions or medicament containing it are used for the prophylaxis and / or treatment of proliferative diseases, tumors, carcinomas, cancer, inflammatory diseases, especially autoimmune diseases, and bacterial infections.
  • the invention relates to a medicament containing an inventive drug delivery system for the treatment and / or prophylaxis of proliferative diseases, cancer, inflammatory diseases, in particular autoimmune diseases, and bacterial infections.
  • Examples of types of cancer and tumors where the nanoparticles according to the invention can be used are: adenocarcinomas, choroidal melanoma, acute leukemia, acoustic neuroma, ampoule carcinoma, anal carcinoma, astrocytomas, basalioma, pancreatic cancer, connective tissue tumor, bladder cancer, bronchial carcinoma, non-small cell Bronchial carcinoma, breast cancer, Burkitt's lymphoma, corpus carcinoma, CUP syndrome, colon cancer, small bowel cancer, small intestine tumors, ovarian cancer, endometrial carcinoma, ependymoma, epithelial cancers, Ewing tumors, gastrointestinal tumors, gall bladder cancer, bile carcinomas, uterine cancer, cervical cancer, glioblastomas, gynecological tumors, Ear, nose and throat tumors, hematological neoplasias, hairy cell leukemia, urethral cancer, skin cancer, brain tumors
  • osteoplastic carcinoma osteosarcoma, ovarian carcinoma, pancreatic carcinoma, penile cancer, plasmocytoma, squamous cell carcinoma of the head and neck, prostate cancer, pharyngeal cancer, rectal carcinoma, retinoblastoma, vaginal cancer, thyroid carcinoma, Schneeberger disease, esophageal cancer, spinal, T-cell lymphoma (Mycosis fungoides), Thymoma, tubal carcinoma, tumors of the eye, urethral cancer, urological tumors, urothelial carcinoma, vulvar cancer, wart involvement, soft tissue tumors, soft tissue sarcoma, Wilms tumor, cervical carcinoma and tongue cancer.
  • Especially solid tumors are preferred. Also preferred are prostatic carcinomas, brain tumors, sarcomas, cervical carcinomas, ovarian cancers, breast cancers, bronchial carcinomas, melanomas, head and neck tumors, esophageal carcinomas, rectal cancers, pancreatic, bladder and renal carcinomas, metastases of the liver, brain, and lymph nodes.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to a medicament in which the compositions 1 and 2 are introduced into the patient simultaneously or successively.
  • the medicament according to the invention can be embodied such that the compositions 1 and 2 are introduced simultaneously or in succession, ie in the form of a kit as separate products, in particular by intratumoral, interstitial or intraperitoneal injection into the patient.
  • both sequences are possible.
  • the composition 2 containing the active ingredient can be introduced, which is split off by subsequent injection of the composition 1 and subsequent heating (as described above) and thus activated.
  • the medicament according to the invention comprising the compositions 1 and / or the composition 2 are introduced into the tumor bed or the resection cavity when a tumor is removed.
  • the present invention relates to a medicament in which compositions 1 and 2 are introduced into the tumor bed upon removal of a tumor.
  • a further subject of the present invention is furthermore a process for the release of an active ingredient of composition 2 as described above comprising the steps:
  • composition 1 as described above in close proximity to composition 2 under conditions which allow the diffusion of the released, catalytically active nucleic acid to the substrate oligonucleotide and its cleavage, and
  • Figure 1 shows the cleavage of the fluorescent dye Alexa-647, which serves as a model substance for any drug, by means of the drug delivery system of the invention.
  • the middle curve (- ⁇ -) shows the increase in fluorescence in the reaction supernatant by free Alexa-647, which is released from the nanoparticle-drug conjugate after activation of the catalytically active RNA sequence by dehybridization at 49 ° C.
  • the second curve from the bottom shows that dehybridization does not take place at 37 ° C. because no increase in the fluorescence intensity in the supernatant can be detected.
  • the lowest curve (- ⁇ -) shows the negative control in the absence of a catalytic nucleic acid.
  • the top curve (- ⁇ -) shows the positive control where the nanoparticle drug conjugate was incubated with the uninhibited catalytically active RNA single strand.
  • Figure 2 shows an embodiment of the drug delivery system according to the invention, in which the catalytically active nucleic acid and the substrate oligonucleotide to be cleaved with the active ingredient are bound to two different nanoparticles.
  • the nanoparticles with his Silicon oxide coating is shown on the left as a sphere.
  • the oligonucleotide inhibitor strand is bound to the nanoparticle, and the catalytically active nucleic acid is hybridized to the oligonucleotide inhibitor strand.
  • the substrate oligonucleotide is bound, which is linked at the other end with the active ingredient (shown as a star).
  • the annealing of the released catalytically active nucleic acid is shown to the substrate oligonucleotide and finally the cleaved substrate oligonucleotide is shown, which has released the drug.
  • Figure 3 Schematic representation of the drug delivery system.
  • the system consists of compositions 1 and 2, wherein heating leads to dehybridization of oligonucleotide inhibitor strand and catalytically active nucleic acid, which is now released and can enzymatically cleave its substrate molecule. In turn, this cleavage releases the therapeutic agent from composition 2 and thus activates it.
  • Figure 4 Temperature-dependent release of the fluorescent dye Alexa-647 coupled to the substrate oligonucleotide from nanoparticles / (L) - substrate-oligonucleotide conjugates in the presence of a nanoparticle / (L) - oligonucleotide inhibitor strand / ribozyme conjugate in buffer.
  • the RFU in the supernatant was measured after 1, 2, 3 and 4 h incubation at 37 ° C and 49 ° C, respectively.
  • nanoparticles / (L) -substrate oligonucleotide conjugates with free L-ribozyme as negative control only nanoparticles / (L) -substrate oligonucleotide conjugates with reaction buffer were used.
  • Figure 5 Temperature-dependent release of the fluorescent dye Alexa-647 coupled to the substrate oligonucleotide from nanoparticles / (L) - substrate oligonucleotide conjugates in the presence of a nanoparticle / (L) - oligonucleotide inhibitor strand / ribozyme conjugates in human serum.
  • the RFU in the supernatant was measured after 1, 2, 3 and 4 h incubation at 37 ° C and 49 ° C, respectively.
  • nanoparticle / (L) substrate oligonucleotide Conjugates with free L-ribozyme used as negative control only nanoparticles / (L) - substrate-oligonucleotide conjugates with reaction buffer.
  • Figure 6 Stability of L and R ribozyme in serum. 30 pmol aliquots of the respective 19 bp ribozyme were analyzed for their degradation after incubation in human serum at 37 ° C. and given time. The degradation of the 19 bp RNA was visualized in a 15% denaturing polyacrylamide gel after EtBr staining in UV light. Part A shows the degradation within 0 - 48 h for the L-ribozyme, part B within 0 - 180 sec for the R-ribozyme.
  • Example 1 Temperature-dependent cleavage of the fluorescent dye Alexa-647 by catalytic nucleic acids
  • Example 1 shows the temperature-dependent cleavage of the fluorescent dye Alexa-647 (serves as a model substance for any drug) by means of the described system.
  • the catalytic nucleic acid is a ribozyme having the sequence: 5 '- GGC GAU ACU UCG GAG GCG C-3' (SEQ ID NO: 1) with an inhibitor having the sequence: 5 '- CCT CAT CAG G TCG AGC C -3 ' (SEQ ID NO: 2), wherein the 5 ' terminal nucleotide carries an SH group.
  • the double-stranded RNA is linked via the SH group and a sulfo-SMCC crosslinker to an amino group of the iron oxide nanoparticle with iron oxide core, SiO 2 shell, and DIAMO surface functionalization.
  • the nanoparticle-drug conjugate composed of the substrate oligonucleotide and covalently bound Alexa-647 as (model substance, already coupled purchased from IBA, Göttingen) with the sequence: 5 '- GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3' (SEQ ID NO: 3), wherein the 5 ' -terminal nucleotide carries an SH group which has the SH group and a sulfo-SMCC crosslinker with an amino group of the iron oxide nanoparticle with iron oxide core, Si0 2 shell and DIAMO surface functionalization is connected.
  • the heating periods during the experiment are shown in FIG. 1 as bars.
  • the middle curve (- ⁇ -) shows the increase in fluorescence in the reaction supernatant by free Alexa-647, which is released from the nanoparticle-drug conjugate after activation of the catalytically active RNA sequence by dehybridization at 49 ° C.
  • the dehybridization does not take place and the ribozyme remains inhibited, therefore no increase of the fluorescence intensity in the supernatant is detected.
  • the nanoparticle-drug conjugate (NP cross-linker substrate strand with Alexa-647) was used in the absence of a catalytic nucleic acid.
  • the nanoparticle-drug conjugate was incubated with the non-inhibited catalytically active RNA single strand.
  • Example 2 Nanoparticle-nucleic acid coupling with sulfo-SMCC
  • sulfo-SMCC was used as linker for coupling between 5-terminal thiol group-modified oligonucleotides in L-form and iron oxide nanoparticles. This was done for the substrate oligonucleotides and the oligonucleotide inhibitor strand / ribozyme duplexes that were hybridized before coupling in the molar ratio 1.1: 1 in PBS (pH 6.7).
  • SEQ ID NO: 3 i is the site in the substrate oligonucleotide (Ruffner and Uhlenbeck, 1990).
  • the 15 nm iron oxide nanoparticles contain about 550 amine groups per particle.
  • the oligonucleotides were first reduced with 1 mM TCEP (Sigma).
  • TCEP 1 mM TCEP
  • sulfo-SMCC Sigma
  • the iron oxide nanoparticles with sulfo-SMCC with a concentration of 2.2 mM in PBS (pH 7.4) were incubated for 1 h at room temperature at 1000 rpm (revolutions per minute) in a thermomixer Reaction brought. The excess of linker was separated by centrifugation. Subsequently, the nanoparticles were distilled twice with dist. washed.
  • the reduced oligonucleotides were then added in a molar ratio of oligonucleotides to nanoparticles of 65: 1 and incubated in PBS (pH 6.7) at 4 ° C rotating overnight. Unconjugated oligonucleotides were separated by centrifugation.
  • Nanoparticles / (L) -substrate oligonucleotide * conjugates and nanoparticles / (L) - oligonucleotide inhibitor strand / ribozyme conjugates were prepared as described in Example 2. The release experiments were performed in reaction buffer and human serum.
  • reaction buffer A. In reaction buffer:
  • the conjugates prepared in Example 2 were resuspended in reaction buffer (Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, with 10 mM MgC) and mixed in the ratio 1: 1 in 1.5 ml reaction vessels (two batches, for 37 ° C and 49 ° C).
  • reaction buffer Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, with 10 mM MgC
  • nanoparticles / (L) -substrate oligonucleotide conjugates with 0.625 ⁇ of the free L-ribozyme with identical sequence from Table 1 in reaction buffer were prepared. Accordingly, it was used as a negative control Nanoparticles / (L) substrate oligonucleotide conjugates mixed with reaction buffer. All four reactions had the same final concentration of the nanoparticle / (L) -substrate oligonucleotide conjugate.
  • the fluorescence signal at 49 ° C showed a clear, time-dependent release of the fluorescent dye, which almost reached the level of positive control with increasing incubation.
  • the negative control as in the case of 37 ° C, even after 4 h hardly any release took place (see FIG. 4).
  • the stability assays were performed essentially as described by Klussmann (1996).
  • Human serum S7023 was purchased from Sigma (USA).
  • the L-ribozyme (see Table 1) and its corresponding R-form (19 bp each) were incubated at 10 ⁇ in 90% human serum in an incubator at 37 ° C, 94.5% humidity and 5% C0 2 incubated (0 to 6 h for the L-ribozyme, 0 to 180 sec for the R-ribozyme). Aliquots were mixed 1: 1 with stop solution (8 M urea, 50 mM EDTA, 2% SDS) and immediately frozen in liquid nitrogen.
  • RNA samples were filtered through Microcon YM-30 (Millipore) filters and each 30 pmol of RNA was size fractionated in a 15% denaturing polyacrylamide gel (7M urea). The gel was stained in EtBr solution (1 pg / ml) for 15 min and photographed under UV light (302 nm).
  • CARMI N., BALKHI, S.R., BREAKER, R.R., SUN, L.Q., CAIRNS, M.J.,
  • KLUSSMANN S., NOLTE, A., BALD, R., ERDMANN, V.A., FURSTE, J.P., RUFFNER, D.E. & UHLENBECK, O.C. 1996.
  • RNA cleaving DNA enzymes Cleaving DNA with DNA; Catalytic nucleic acids: from lab to applications. Proc Natl Acad Be U S A., 94, 4262-6.
  • SEELIG B., KEIPER, S., STUHLMANN, F. & JASCHKE, A. 2000.
  • a drug delivery system consisting of a nanoparticle
  • Nanoparticles associated with a substrate oligonucleotide, which is connected to a therapeutic agent, which is releasable by cleavage of the substrate oligonucleotide by the catalytically active nucleic acid.
  • a drug delivery system according to 1 or 2 wherein the substrate oligonucleotide is linked to the nanoparticle via a crosslinker.
  • a drug delivery system comprising anti-proliferative, anti-migratory, anti-angiogenic, antithrombotic, anti-inflammatory, anti-inflammatory, cytostatic, cytotoxic, anti-coagulative, anti- bacterial, anti-viral and / or antifungal agents, opioid agonists, nonopioid analgesics, non-steroidal anti-inflammatory (NSAID), anti-migraine agents, Cox-II inhibitors, ⁇ -adrenergic blocking agents, anticonvulsants, antidepressants, Ca2 + channel blockers or agents for the treatment of neuronal or neurodegenerative diseases.
  • the at least one therapeutically active substance is selected from the group comprising anti-proliferative, anti-migratory, anti-angiogenic, antithrombotic, anti-inflammatory, anti-inflammatory, cytostatic, cytotoxic, anti-coagulative, anti- bacterial, anti-viral and / or antifungal agents, opioid agonists, nonopioid analgesics, non-steroidal
  • therapeutically active substance is selected from the group comprising actinomycin D, aminoglutethimide, amsacrine, anastrozole, antagonists of purine and pyrimidine bases, anthracyclines,
  • Aromatase inhibitors asparaginase, anti-estrogens, bexarotene, bleomycin, buselerin, busulfan, camptothecin derivatives, capecitabine, carboplatin, carmustine, chlorambucil, cisplatin, cladribine, cyclophosphamide, cytarabine, cytosine arabinoside, alkylating cytostatics, dacarbazine, dactinomycin, daunorubicin, docetaxel, doxorubicin (adriamycin ), Doxorubicin lipo, Epirubicin, estramustine, etoposide, exemestane, fludarabine, fluorouracil, folic acid antagonists, formestan, gemcitabine, glucocorticoids, goselerin, hormones and hormone antagonists, hycamtin, hydroxyurea, idarubicin, ifo
  • a drug delivery system wherein the at least one therapeutically active substance is selected from the group comprising nucleic acids, siRNA, amino acids, peptides, proteins,
  • Nanoparticles which is associated with a therapeutic agent and with a substrate oligonucleotide, wherein the substrate oligonucleotide is cleavable by a catalytically active nucleic acid.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Wirkstofffreisetzungssystem enthaltend zwei Zusammensetzungen. Die erste Zusammensetzung umfasst ein Nanopartikel, verbunden mit einem Oligonukleotid-Inhibitorstrang, der mit einer katalytisch aktiven Nukleinsäure hybridisiert ist. Die zweite Zusammensetzung umfasst einen Träger, verbunden mit einem Substratmolekül, welches an einen therapeutischen Wirkstoff gekoppelt ist. Durch einen externen Stimulus wird die katalytisch aktive Nukleinsäure der ersten Zusammensetzung freigesetzt und bindet spezifisch an das Substratmolekül der zweiten Zusammensetzung. Dies führt zur Spaltung des Substratmoleküls, wodurch der daran gebundene Wirkstoff freigesetzt wird.

Description

Temperaturabhängige Aktivierung von katalytischen Nukleinsäuren
kontrollierten Wirkstofffreisetzung
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Wirkstofffreisetzungssystem, welches über eine katalytisch aktive Nukleinsäure funktioniert. Die katalytisch aktive Nukleinsäure wird im ersten Schritt durch einen externen Stimulus von einem an ein Nanopartikel gebundenen Oligonukleotid-Inhibitorstrang freigesetzt. Die freigesetzte aktive Nukleinsäure bindet im zweiten Schritt an ihr Substrat, ein Nanopartikel-Wirkstoff-Konjugat, wodurch ein kovalent, elektrostatisch, koordinativ oder ionisch gebundener Wirkstoff oder ein interkalierter Wirkstoff freigesetzt wird.
Die Patentanmeldung WO2006/108405 wird als nächstliegender Stand der Technik definiert und zeigt Nanopartikel, wobei an die Nanopartikel therapeutisch wirksame Substanzen gebunden sind, und wobei die Ablösung der therapeutisch wirksamen Substanzen von den Nanopartikeln durch ein magnetisches Wechselfeld bewirkt oder initiiert wird. Es hat sich aber gezeigt, dass die direkte thermische Freisetzung des Wirkstoffes von den Nanopartikeln oftmals nicht effektiv genug war, um bei relativ geringen Temperaturerhöhungen eine therapeutisch effektive Konzentration des freigesetzten Wirkstoffs, z.B. in den Tumorzellen, zu erreichen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, ein Verfahren und geeignete Zusammensetzungen mit gekoppelten Wirkstoffen zur Verwendung in diesem Verfahren bereitzustellen, welches bereits bei geringer Temperaturerhöhung eine quantitative Freisetzung des Wirkstoffs ermöglicht und damit gegenüber dem in WO2006/108405 offenbarten Verfahren zu einer weiteren Effektivitätssteigerung führt. Die vorliegende Erfindung löst die Aufgabe durch die Bereitstellung eines Wirkstofffreisetzungssystems enthaltend eine Zusammensetzung 1 und eine Zusammensetzung 2, wobei die Zusammensetzung 1 mittels einer temperaturinduzierten Freisetzung einer katalytisch aktiven Nukleinsäure aktiviert wird, und wobei die katalytisch aktive Nukleinsäure wiederum katalytisch den Wirkstoff aus der zweiten Zusammensetzung freisetzt. Wie in den Beispielen gezeigt, gelingt dies z.B. mittels einer L-RNA als katalytisch aktive Nukleinsäure, wobei die katalytisch aktive Nukleinsäure bei physiologischen Bedingungen mit einer L-DNA in Form eines Inhibitors hybridisiert vorliegt. Dieser Komplex ist in einem Stabilitätstest in humanem Serum lange Zeit stabil. Durch Verwendung von L-Nukleinsäuren können zudem Wechselwirkungen mit nativen (z.B. endogenen) Nukleasen, die im Zielorganismus vorkommen, ausgeschlossen werden. Über die Basensequenz und die Länge des Oligonukleotid-Inhibitorstrangs ist der Schmelzpunkt des an die Partikel gebundenen Konjugats so eingestellt, dass bei physiologischen Bedingungen keine Dehybridisierung erfolgt (im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt für 38 °C, also für eine Temperatur, die geringfügig höher ist als die normale Körpertemperatur). Bei Körpertemperatur sind die Doppelstränge also so stabil, dass die katalytischen Nukleinsäuren vollständig inhibiert werden. Wird das Partikel jedoch erwärmt, z.B. über magnetische Induktion im magnetischen Wechselfeld, dehybridisieren die katalytischen Nukleinsäurenvon der Inhibitor-DNA, was zur Auflösung der Doppelstränge führt, und katalytisch aktive Nukleinsäuren werden freigesetzt. Diese können nun eine zweite Zusammensetzung enthaltend einen Träger, der über ein Molekül, das als Substrat für die katalytische Nukleinsäure fungiert, mit einem therapeutischen Wirkstoff verbunden ist, enzymatisch spalten. Durch die Spaltung wird der Wirkstoff freigesetzt, der somit seine Wirkung entfalten kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem ersten Aspekt ein Wirkstofffreisetzungssystem enthaltend eine Zusammensetzung 1 , enthaltend mindestens ein Nanopartikel verbunden mit einem Oligonukleotid-Inhibitorstrang, wobei der Oligonukleotid-Inhibitorstrang mit einer katalytisch aktiven Nukleinsäure hybridisiert ist, und eine Zusammensetzung 2 enthaltend einen Träger verbunden mit mindestens einem Substratmolekül, wobei das Substratmolekül mit mindestens einem therapeutischen Wirkstoff verbunden ist, wobei der therapeutische Wirkstoff durch Spaltung des Substratmoleküls freisetzbar ist, wobei die Spaltung des Substratmoleküls durch die katalytisch aktive Nukleinsäure erfolgt.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Wirkstofffreisetzungssystem bestehend aus einem Nanopartikel, das mit einem Oligonukleotid-Inhibitorstrang verbunden ist, wobei der Oligonukleotid-Inhibitorstrang mit einer katalytisch aktiven Nukleinsäure hybridisiert ist, und einem weiteren Nanopartikel, das mit einem Substrat-Oligonukleotid verbunden ist, wobei das Substrat-Oligonukleotid mit einem therapeutischen Wirkstoff verbunden ist, welcher durch Spaltung des Substrat-Oligonukleotids durch die katalytisch aktive Nukleinsäure freisetzbar ist. Definitionen:
Unter dem Begriff "spezifisch" ist zu verstehen, dass die katalytisch aktive Nukleinsäure vorzugsweise nur in Bezug auf das Substrat-Oligonukleotid wirkt und dieses spaltet und keine Aktivität gegenüber anderen Oligonukleotiden entfaltet.
Unter dem Begriff „physiologischeBedingungen" sind die pysikalisch chemischen Bedingungen zu verstehen, die im Zielorganismus, vorzugsweise im menschlichen Organismus, im jeweiligen Zielgewebe intra- oder extrazellulär vorliegen. Unter dem Begriff „im Wesentlichen keine Abspaltung des Wirkstoffs" ist zu verstehen, dass der in geringem Maße freigesetzte Wirkstoff keine adversen Reaktionen im Zielgewebe hervorruft. Dies bedeutet insbesondere, dass über einen Zeitraum von 4 Stunden (h) weniger als 10 %, besonderes bevorzugt weniger als 1 %, und insbesondere weniger als 0,5 % des eingesetzten Wirkstoffs in einem Freisetzungsexperiment, wie z.B. Beispiel 3A, freigesetzt wird. Unter den Begriffen „katalytische Nukleinsäuren" oder „katalytisch aktive Nukleinsäuren" sind Nukleinsäure-Moleküle wie beispielsweise „DNAzyme", Ribozyme, modifizierte Nukleinsäuren sowie Nukleinsäure-Analoga zu verstehen, die ohne Beteiligung einer Proteinkomponente spezifisch chemische Reaktionen katalysieren können. Für das Verfahren können nicht nur natürlich vorkommende katalytische Nukleinsäuren Verwendung finden, sondern auch durch evolutive Verfahren (z.B. SELEX) erzeugte Nukleinsäuren eingesetzt werden. Weiterhin können die katalytischen Nukleinsäuren mit Hilfe der automatisierten Festphasen- Synthese hergestellt werden.
Unter dem Begriff "durch ein magnetisches Wechselfeld bewirkt oder initiiert" wird verstanden, dass zum einen das magnetische Wechselfeld bzw. die Impulse direkt die Freisetzung bzw. Ablösung bewirken, oder die Freisetzung bzw. Ablösung indirekt, beispielsweise über die Aktivierung von Enzymen oder die Erzeugung von Wärme, bewirkt wird.
Unter dem Begriff„vollständig hybridisiert" wird verstanden, dass alle Moleküle der eingesetzten katalytisch aktiven Nukleinsäure hybridisiert vorliegen. Da erfindungsgemäß bevorzugt mit einem Überschuss an Inhibitorsträngen gearbeitet wird, können also Oligonukleotid-Inhibitorstränge bei vollständiger Hybridisierung frei vorliegen.
Unter dem Begriff„ca." wird eine Abweichung von ± 5%, insbesondere von ± 1% verstanden.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem der Oligonukleotid-Inhibitorstrang kovalent, insbesondere über einen Crosslinker (Linker 1) an das Nanopartikel gebunden ist. Der Linker 1 , wie auch die später eingeführten Linker 2 und Linker 3, können entweder direkt aus zwei funktionellen Gruppen zwischen Nanopartikel (oder Träger) und Oligonukleotid kovalent gebildet werden. Bevorzugt kann dieser aus einer Peptidbindung, einem Triazolring oder einer Dithiolbrücke bestehen oder durch eine anderen Dimerisierungs-, Kondensations-, Alkylierungs- oder Click- Reaktionen gebildet werden. Ferner können sie aus einem homo- oder hetero- bifunktionalen Crosslinker bestehen, der zwischen einer funktionellen Gruppe des Oligonukleotids und einer funktionellen Gruppe oder der reaktiven Oberfläche des Nanopartikels (oder Trägers) eingefügt werden. Hierzu kann es notwendig sein, die benötigte funktionelle Gruppe, die für die Kopplung des Oligonukleotids verwendet wird, darüber bereitzustellen, indem ein modifiziertes Nukleotid bei der Oligonukleotidsynthese verwendet wird. Dieses modifizierte Nukleotid wird bevorzugt endständig in das Oligonukleotid eingebaut. Der eingesetzte Crosslinker ist unter physiologischen Bedingungen nicht spaltbar.
Es können unterschiedliche Gruppen von Crosslinkern für die erfindungsgemäßen Linker 1 , Linker 2 und Linker 3 unterschieden werden, je nachdem welche reaktiven Gruppen sie tragen. Die heterobifunktionalen Crosslinker haben zwei unterschiedliche reaktive Enden, wodurch es möglich ist, die Konjugation sequentiell durchzuführen und dadurch unerwünschte intramolekulare Nebenreaktionen zu vermeiden. Zu der Gruppe der heterobifunktionalen Crosslinker gehören z.B. Sulfo-SMCC (Succinimidyl-4-(N-maleimido- methyl)cyclohexan-1-carboxylat), Sulfo-NHS (-hydroxysulfosuccinimide), EDC (1- Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidhydrochlorid) oder Sulfo-LC-SPDP (N- Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionate).
Sulfo-SMCC
Figure imgf000006_0001
Sulfo-NHS
Figure imgf000007_0001
EDC
Figure imgf000007_0002
Sulfo-LC-SPDP
Figure imgf000007_0003
Insbesondere werden durch Aminosilanmodifizierung eingebrachte Aminogruppen auf der Nanopartikeloberfläche mit einer SH Gruppe am 5'-Ende des Inhibitor- Oligonukleotids mit dem Crossliker Sulfo-SMCC bzw. Sulfo-GMBS umgesetzt.
In dem erfindungsgemäßen Wirkstofffreisetzungssystem enthält die Zusammensetzung 1 die katalytisch aktive Nukleinsäure und den Oligonukleotid- Inhibitorstrang, der beispielsweise kovalent über einen bifunktionalen Crosslinker, beispielsweise Sulfo-SMCC, an die Partikeloberfläche gebunden ist. Die Basensequenzen von katalytischer Nukleinsäure und Inhibitorstrang liegen unter physiologischen Bedingungen vollständig hybridisiert vor, was durch eine weitgehend bis vollständig komplementäre Basensequenz erreicht wird. Die katalytisch aktive Nukleinsäure und/oder der Oligonukleotid-Inhibitorstrang sind dabei aus der Gruppe der RNA, DNA, L-RNA oder L-DNA oder modifizierte Nukleinsäuren ausgewählt. Modifizierte Nukleinsäuren sind beispielsweise solche, die eine im Vergleich zu der entsprechenden, natürlich vorkommenden Nukleinsäuren geringere Nuklease-Sensitivität haben. Beispiele für modifizierte Nukleinsäuren sind LNA, PNA, morpholino (Karkare und Bhatnagar, 2006) oder GNA (Zhang und Chaput, 2010). L-Ribozyme sind beispielsweise in Seelig et al. (2000), US 2003219422 und DE 10 2009 007929 beschrieben. Ferner können wie oben beschrieben mittels modifizierter Nukleinsäuren funktionelle Gruppen zur Kopplung in das Oligonukleotid eingeführt werden, die bevorzugt endständig eingebaut werden. Insbesondere wird ein SH-modifiziertes Nukleotid eingefügt. Dies wird bevorzugt endständig, insbesondere am 5'-Ende des Oligonukleotids bei der Synthese eingeführt. Dieses kann dann z.B. mit Hilfe eines der Crosslinker Sulfo-SMCC oder Sulfo-GMBS an eine Aminogruppe eines Aminosilan- modifizierten Nanopartikels gekoppelt werden.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem der Linker 1 durch Reaktion einer Aminogruppe mit einem Crosslinker und der SH-Gruppe des SH-modifizierten Nukleotids am 5'-Ende des Oligonukleotids- Inhibitorstrangs gebildet wird, wobei die Aminogruppe durch Aminosilanmodifizierung auf der Nanopartikeloberfläche eingebracht wurde und der Crosslinker bevorzugt Sulfo-SMCC oder Sulfo-GMBS ist.
Die katalytisch aktive Nukleinsäure hat bevorzugt eine Länge von 10 bis 100 Nukleotiden, insbesondere eine Länge von 12 bis 60 Nukleotiden. Geeignete katalytische Nukleinsäuren sind im Stand der Technik bekannt. Diese werden ggf. auf deren 5'- oder 3'-Ende noch verlängert, um eine geeignete Hybridisierungstemperatur einzustellen oder um modifizierte Nukleinsäuren einzubauen. Als katalytisch aktive Nukleinsäure wird bevorzugt eine RNA oder DNA verwendet. In der Natur besitzen katalytisch aktive Nukleinsäure-Moleküle Sequenzspezifität. Diese Sequenzspezifität ist auf spezifische Basenpaarungen zurückzuführen, die in Nähe der Spaltstelle zwischen der katalytischen Nukleinsäure und dem Substrat-Oligonukleotid gebildet werden. Theoretisch können katalytisch aktive Nukleinsäuren dermaßen konstruiert werden, dass jegliche Nukleotidsequenz in einer sequenzspezifischen Art und Weise geschnitten werden kann.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden katalytischen Nukleinsäuren wie Hammerhead, Hairpin, Ribonuklease P und Hepatitis-Delta-Virus Ribozyme wurden eine Reihe von synthetischen RNA-Molekülen entwickelt, deren katalytische Aktivität als Ergebnis der Entwicklung von in vitro Selektions- Techniken in den letzten Jahren dramatisch gestiegen ist (Carmi et al., 1998). „DNAzyme" sind hierbei ein neueres Produkt der biotechnologischen Entwicklung. Solche DNA-Moleküle mit katalytischer Aktivität werden dabei exklusiv durch in vitro Selektionsprozesse gewonnen. Sie können sowohl DNA als auch RNA spalten. Ein solches Molekül mit RNAse-Aktivität ist zum Beispiel das 10-23 DNAzym (Santoro et al., 1997).
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem die katalytisch aktive Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus RNA, DNA, L-RNA, L-DNA und einer modifizierten Nukleinsäure, wobei die katalytisch aktive Nukleinsäure insbesondere ein SH-modifiziertes Nukleotid enthält, wobei die katalytisch aktive Nukleinsäure bevorzugt eine Länge von 10 bis 100 Nukleotiden und insbesondere eine Länge von 12 bis 60 Nukleotiden hat, wobei die katalytisch aktive Nukleinsäure bevorzugt RNA ist, insbesondere ein Ribozym, insbesondere ein Hammerhead-Ribozym, und insbesondere enthaltend die Sequenz 5'-GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3' (SEQ ID NO: 1). Erfindungsgemäße katalytische Nukleinsäuren sind unter anderem Hammerhead, Hairpin, Ribonuklease P und Hepatitis-Delta-Virus Ribozyme sowie von diesen abgeleitete Ribozym-Analoga und weitere synthetische Ribozyme und „DNAzyme". Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind dabei Hammerhead Ribozyme.
Natürlich vorkommende Hammerhead Ribozyme, z.B. aus pflanzlichen Viren, bestehen typischerweise aus einem einzelnen RNA Molekül, welches sich selber spaltet. Die Sequenz besteht dabei minimal aus drei Doppelhelices, die von kurzen Linkern konservierter Sequenzen miteinander verbunden werden. Der konservierte„Uridine turn" verlinkt dabei Helix 1 mit Helix 2. Helix 2 und Helix 3 sind durch die Sequenz GAAA miteinander verbunden. Zusätzlich enthält ein Hammerhead Ribozym zumindest einen Loop.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die katalytisch aktive Nukleinsäure eine L-RNA, L-DNA und/oder eine modifizierte Nukleinsäure. Unter modifizierten Nukleinsäuren werden beispielsweise solche verstanden, die eine geringere Nuklease-Sensitivität haben. Ferner können modifzierte Nukleinsäuren verwendet werden, um geeignete Kopplungsgruppen in das Oligonukleotid einzuführen.
Besonders bevorzugt sind Ribozyme, insbesondere ein Hammerhead Ribozyme. Eine besonders bevorzugte katalytische Nukleinsäure enthält die Sequenz 5'- GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3' (SEQ ID NO: 1).
Der Oligonukleotid-Inhibitorstrang wird passend zur katalytisch aktiven Nukleinsäure gem. allgemeinem fachmännischem Können konstruiert. Entsprechend ist der Oligonukleotid-Inhibitorstrang des
Wirkstofffreisetzungssystems ebenfalls RNA oder, DNA, insbesondere L-RNA, L- DNA und/oder modifizierte Nukleinsäuren, die eine geringere Nuklease-Sensitivität haben.
Passend zur aktiven Nukleinsäure hat der Inhibitorstrang bevorzugt eine Länge von 10 bis 100 Nukleotiden, insbesondere eine Länge von 10 bis 60 Nukleotiden, und insbesondere enthält er die Sequenz 5 - G CCT CAT CAG TCG AGC C-3' (SEQ ID NO: 2).
Als Oligonukleotid-Inhibitorstrang wird bevorzugt eine Nukleinsäure mit einer Länge von 10 bis 100 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von 10 - 60 Nukleotiden verwendet. Die gewählte Länge von >10 Nukleotiden ist in der Hybridisierungsstabilität begründet, die Bevorzugung auf <100 Nukleotiden ist bedingt durch die hohen Kosten bei der synthetischen Herstellung von langen Oligonukleotiden. Grundsätzlich wird diese so ausgewählt, dass sie unter physiologischen Bedingungen aufgrund ihrer Basenpaarung mit der katalytischen Nukleinsäure vollständig hybridisiert vorliegt und somit weitgehend komplementär zur katalytischen Nukleinsäure ist. Eine besonders bevorzugte Nukleinsäure enthält die Sequenz 5'- G CCT CAT CAG TCG AGC C-3' (SEQ ID NO: 2).
Somit betrifft die Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem der Oligonukleotid-Inhibitorstrang ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus RNA, DNA, L-RNA, L-DNA und einer modifizierten Nukleinsäure, insbesondere enthaltend ein SH-modifiziertes Nukleotid, bevorzugt mit einer Länge von 10 bis 100 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von 10 bis 60 Nukleotiden, insbesondere enthaltend die Sequenz 5 - G CCT CAT CAG TCG AGC C-3' (SEQ ID NO: 2).
Das molare Verhältnis von Oligonukleotid-Inhibitorstrang zu katalytisch aktiver Nukleinsäure ist bevorzugt > 1 , insbesondere 1 bis 2, um eine vollständige Hybridisierung der katalytischen Nukleinsäure zu gewährleisten. Im Ausführungsbeispiel mit dem Oligonukleotid-Inhibitorstrang enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 2 und der katalytisch aktiven Nukleinsäure enthaltend die Sequenz SEQ ID NO: 1 wurde ein optimales Verhältnis und eine hinreichende Stabilität bei T < 43°C von 1 ,0 bis 1 ,3, insbesondere von ca. 1 ,1 , durch in vitro Experimente mittels Gelelektrophorese ermittelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung somit ein Wirkstofffreisetzungssystem, in welchem in der Zusammensetzung 1 das Verhältnis des Oligonukleotid-Inhibitorstrangs zu der katalytisch aktiven Nukleinsäure > 1 und insbesondere 1 bis 2 ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Wirkstofffreisetzungssystem, in welchem in der Zusammensetzung 1 das Verhältnis des Oligonukleotid-Inhibitorstrangs mit der Sequenz 5'- G CCT CAT CAG TCG AGC C-3' (SEQ ID NO: 2) zu der katalytisch aktiven Nukleinsäure mit der Sequenz 5 - GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3' (SEQ ID NO: 1) 1 ,0 bis 1 ,3 und insbesondere ca. 1 ,1 ist.
In dem erfindungsgemäßen Wirkstofffreisetzungssytem ist bevorzugt, dass die katalytisch aktive Nukleinsäure unter physiologischen Bedingungen, insbesondere sogar bis zu einer Körpertemperatur von unter 43°C, mit dem Oligonukleotid- Inhibitorstrang vollständig hybridisiert vorliegt. Bei Temperaturen von 43 °C und mehr liegt dann mindestens eine katalytisch aktive Nukleinsäure, bevorzugt 5 %, mehr bevorzugt 10 %, insbesondere 20 % der katalytische aktiven, insgesamt enthaltenden Nukleinsäuren dehybridisiert vor. Die Freisetzung der mindestens einen katalytischen Nukleinsäure kann über den in einem Freisetzungsassay in Puffer gemäß Beispiel 3 gemessen werden. Die signifikante Freisetzung des Fluorenzfarbstoffes lässt auf die Dehybridisierung mindestens einer katalytischen Nukleinsäure schließen. Damit kann gewährleistet werden, dass die Wirkstofffreisetzung aus der Zusammensetzung 2 nur bei erhöhten Temperaturen, z.B. durch die Erwärmung der Nanopartikel im Magnetfeld, stattfindet. Insbesondere betrifft die Erfindung somit ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem die katalytisch aktive Nukleinsäure unter physiologischen Bedingungen mit dem Oligonukleotid-Inhibitorstrang vollständig hybridisiert vorliegt und bei 43 °C mindestens eine katalytisch aktive Nukleinsäure, bevorzugt 5 %, stärker bevorzugt 10 %, und insbesondere 20 % der gebundenen, katalytisch aktiven Nukleinsäuren dehybridisiert.
Das Nanopartikel der Zusammensetzung 1 enthält bevorzugt einen Kern, der ein para- oder superparamagnetisches Eisenoxid enthält. Geeignete Nanopartikel sind im Stand der Technik beschrieben. Insbesondere eignen sich für das erfindungsgemäße System Nanopartikel aus WO 97/38058, WO 98/58673 und WO 2009/086824 Qeweils durch Bezugnahme inkorporiert).
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem das Nanopartikel einen Kern enthaltend mindestens ein paramagnetisches oder superparamagnetisches Eisenoxid besitzt.
Diese Nanopartikel bestehen bevorzugt aus einem magnetischen Material, vorzugsweise einem ferromag netischen, antiferromagnetischen, ferrimagnetischen, antiferrimagnetischen oder superparamagnetischen Material, weiter bevorzugt aus Eisenoxiden, insbesondere superparamagnetischen Eisenoxiden oder aus reinem Eisen, welches mit einer Oxidschicht versehen ist. Diese eisenbasierten Materialien werden besonders aufgrund ihrer geringen Toxizität gewählt, grundsätzlich sind aber auch andere Metalloxide geeignet. Bevorzugte Eisenoxide sind Magnetit (Fe3O4), Maghemit (y-Fe2O3) oder Mischungen dieser beiden Oxide. Allgemein können die bevorzugten Nanopartikel durch die Formel FeOx wiedergegeben werden, worin X eine Zahl von 1 bis 2 bedeutet. Neben den magnetischen Materialien der Formel FeOx, worin X eine Zahl im Bereich von 1 ,0 bis 2,0 ist, sind auch Materialien der allgemeinen Formel MFe2Ü mit M = Co, Ni, Mn, Zn, Cd, Ba oder andere Ferrite einsetzbar. Ferner eignen sich auch Silica- oder Polymerpartikel, in die magnetische Materialien wie beispielsweise die hierin genannten magnetischen Materialien eingelagert und/oder angebunden sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem sich das paramagnetische oder superparamagnetische Nanopartikel im Wechselmagnetfeld erwärmt.
Generell wird die erforderliche Wärme für die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform durch ein extrakorporal angelegtes magnetisches Wechselfeld erzeugt, welches die vorzugsweise superparamagnetischen Nanopartikel anregt, wodurch vor allem Hysteresewärme freigesetzt wird. Geeignete Geräte sind beispielsweise in WO 2001/10501 , WO 2001/10500 und WO 2009/118091 beschrieben. Ein extrakorporal angelegte Wechselmagnetfeld kann intern verstärkt werden (WO 2009/118091). Alternativ kann das Wechselmagnetfeld auch intern induziert werden (WO 2009/118091). Diese Wärmefreisetzung führt zu der erhöhten Temperatur, welche benötigt wird, um die katalytisch aktive Nukleinsäure freizusetzen.
Zur Erwärmung der paramagnetischen oder superparamagnetischen Nanopartikel im magnetischen Wechselfeld werden insbesondere Frequenzen im Bereich von 10 - 500 kHz und Feldstärken von 0,5 - 50 kA/m, insbesondere 50 - 200 kHz und Feldstärken von 0,5 - 20 kA/m verwendet. Diese Bereiche sind besonders für die Behandlung beim Menschen gut tolerabel und klinisch bereits erprobt. Eine Erwärmung des die Nanopartikel enthaltenden Gewebes auf über 80°C, insbesondere auf Temperaturen zwischen 43°C und 55°C ist möglich und abhängig von der spezifischen Absorptionsrate der Partikel sowie ihrer Konzentration im Zielgewebe. Die Herstellung von Nanopartikeln, jedoch ohne Wirkstoff und auch ohne Beschichtung ist ausführlich in US 6,048,515 beschrieben. Ferner ist die Funktionalisierung der Oberfläche der Nanopartikel bekannt, so dass nach bekannten Verfahren Aminogruppen, Hydroxygruppen, Carboxylgruppen, Thiolgruppen, Epoxidgruppen oder Carbonylgruppen auf der Oberfläche der Nanopartikel erzeugt werden können.
Die Nanopartikel basieren bevorzugt auf magnetischen eisenhaltigen Kernen, die von einer oder mehreren kolloidalen Hüllen oder Beschichtungen umgeben sind. Der Kern besteht dabei vorzugsweise aus Magnetit oder Maghemit. Die primäre Funktion der Hüllen ist es, eine kolloidale Verteilung im wässrigen Medium zu erreichen und die Nanopartikel vor Agglomerationen zu schützen. Mehrschalig umhüllte Partikel, wie sie in WO 98/58673 beschrieben werden, sind prinzipiell als Basis für die Nanopartikel-Konjugate geeignet, da das biologische Verhalten solcher Partikel durch Überbeschichtungen mit Polymeren einstellbar ist.
In dem erfindungsgemäßen Wirkstofffreisetzungssystem der Beispiele wurde ein Eisenoxidkern mit einem Durchmesser von 15 nm (TEM) gewählt, welches mit einer reaktiven Silanhülle, genauer einer Aminosilanhülle versehen war.
Um die Kopplungseffektivität an die Oberfläche zu verbessern und die Aktivität der Eisenoxidoberfläche zu verringern, enthalten die erfindungsgemäßen Nanopartikel der Zusammensetzung 1 bevorzugt mindestens eine Hülle, bevorzugt eine Silanhülle oder eine SiO2-Hülle und eine Silanhülle. Diese Partikel sind superparamagnetisch und haben gegenüber den reinen Eisenpartikeln den Vorteil einer inerten Oberfläche. Damit ist der Eisenoxidkern vor Reaktionen im physiologischen Medium geschützt; zudem bietet die SiO2-Oberfläche den Vorteil, dass die Funktionalitätendichte durch Kondensation des reaktiven Silans an die vorhandenen SiOH Gruppen im Vergleich zu reinem Eisenoxid erhöht ist. Bevorzugt sind Nanopartikel, die vor der Beschichtung mit der funktionellen Silanhülle mit einer Si02-Schicht von 1-20 nm, insbesondere 5 nm beschichtet wurden.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem das Nanopartikel mindestens eine Hülle, bevorzugt eine Silanhülle oder eine S1O2- und eine Silanhülle, enthält.
Es besteht aber auch die Möglichkeit, die Nanopartikel aus einem nicht magnetischen Material wie beispielsweise Siliziumoxid (Si02) (s.u.) oder auch Gold (Au) einzusetzen. Werden Nanopartikel aus nicht magnetischen Materialien verwendet, so erfolgt die Anregung und Wärmeerzeugung im Bereich der Nanopartikel nicht durch ein magnetisches Wechselfeld sondern z.B. durch Infrarotstrahlung.
Die Nanopartikel weisen vorzugsweise einen Durchmesser von weniger als 500 nm auf. Vorzugsweise besitzen die Nanopartikel einen durchschnittlichen Durchmesser von 15 nm oder liegen vorzugsweise in dem Größenbereich von 1 - 100 nm und insbesondere bevorzugt im Bereich von 10 - 20 nm.
Das Substratmolekül muss durch das die katalytisch aktive Nukleinsäure spaltbar sein, so dass durch die Spaltung der Wirkstoff aus dem Träger-Substratmolekül- Wirkstoff-Konjugat freigesetzt wird und seine Wirkung entfalten kann. In der Regel handelt es sich bei dem Substratmolekül um ein Oligonukleotid, es kann aber auch ein spaltbares Peptid oder ein anderes auf die katalytisch aktive Nukleinsäure abgestimmtes Molekül sein.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem das Substratmolekül ein Oligonukleotid ist. Der Träger der Zusammensetzung 2 kann ein Polymer (z.B. ein Polylactidglycolid), insbesondere ein Biopolymer, ein Si02-Partikel, ein metallischer Partikel, z.B. Goldpartikel, oder ein oxidisches Partikel sein. Geeignete Biopolymere sind z.B. Zucker, Dextrane, Chitosane oder Stärke. Bevorzugt ist auch hierfür ein oberflächenmodifiziertes Eisenoxidteilchen. Der Träger kann als Gel, Mikropartikel, Mikrosphäre oder Nanopartikel vorliegen. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegt die Zusammensetzung 2 ebenfalls als oxidisches Nanopartikel wie oben für Zusammensetzung 1 beschrieben vor. Dabei kann es sich sogar um dasselbe Nanopartikel handeln wie das Nanopartikel der Zusammensetzung 1. Bevorzugt sind ferner Nanopartikel-enthaltende Medizinprodukte, wie Sie in WO 2009/100716 beschreiben sind (durch Bezugnahme inkorporiert). In einer Ausführungsform können der Oligonukleotid-Inhibitorstrang, hybridisiert mit der katalytisch aktive Nukleinsäure, und das Substratmolekül-Wirkstoffkonjugat an dasselbe Nanopartikel gekoppelt vorliegen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung somit ein Wirkstofffreisetzungssystem, in welchem der Träger ein Polymer, insbesondere ein Biopolymer, ein SiO2-Partikel, ein metallisches Partikel, insbesondere ein Goldpartikel, oder ein oxidisches Partikel ist, bevorzugt ein oberflächenmodifiziertes Eisenoxidteilchen, welches als Gel, Micropartikel, Microsphäre oder Nanopartikel, insbesondere als oxidisches Nanopartikel, vorliegt.
Das erfindungsgemäße Wirkstofffreisetzungssystem umfasst in einer Ausführungsform zwei Arten von Nanopartikeln. Zum einen die Nanopartikel, welche den Wirkstoff gebunden über das Substrat-Oligonukleotid und optional einen Linker an das magnetische Nanopartikel enthalten und zum anderen die Nanopartikel, welche die katalytisch aktive Nukleinsäure hybridisiert an einen Oligonukleotid-Inhibitorstrang enthalten. Oder ein Einkomponentensystem, bei dem beide Bestandteile (katalytisch aktive Nukleinsäure und Substrat) an einem Partikel gebunden sind. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Nanopartikel, welches mit einem Oligonukleotid-Inhibitorstrang verbunden ist, der mit einer katalytisch aktiven Nukleinsäure hybridisiert ist, welche befähigt ist, ein Substrat-Oligonukleotid zu spalten, welches mit einem weiteren Nanopartikel und einem therapeutischen Wirkstoff verbunden ist.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Nanopartikel, welches mit einem therapeutischen Wirkstoff und mit einem Substrat-Oligonukleotid verbunden ist, wobei das Substrat-Oligonukleotid durch eine katalytisch aktive Nukleinsäure spaltbar ist.
Das Funktionsprinzip des erfindungsgemäßen Wirkstofffreisetzungssystems ist wie folgt. Die katalytisch aktive Nukleinsäure ist an einen Oligonukleotid- Inhibitorstrang hybridisiert und wird erst bei erhöhter Temperatur, d.h. oberhalb von 38 °C, vorzugsweise oberhalb von 40 °C freigesetzt. Dadurch wird sichergestellt, dass unter physiologischen Bedingungen und bei Temperaturen bis 38 °C keine Freisetzung der katalytisch aktiven Nukleinsäure eintritt.
Der Oligonukleotid-Inhibitorstrang an den die katalytisch aktive Nukleinsäure hybridisiert ist, ist wiederum an ein magnetisches Nanopartikel und vorzugsweise an ein superparamagnetisches Nanopartikel gebunden.
Der freizusetzende Wirkstoff, bei dem es sich vorrangig um einen Antikrebswirkstoff handelt, ist über ein Substrat-Oligonukleotid und optional einen Linker an ein weiteres Nanopartikel gebunden, kann aber auch an demselben Nanopartikel gebunden sein, an dem der Oligonukleotid-Inhibitorstrang mit der hybridisierten katalytisch aktiven Nukleinsäure gebunden ist. Die Träger- bzw. Partikel-Wirkstoff-Konjugate bieten zudem den Vorteil, dass sie sich in Tumorzellen oder auch Bakterienzellen anreichern und beispielsweise mittels MRT (Magnet-Resonanz-Tomographie) nicht nur Tumoren geringer Größe sondern sogar einzelne Tumorzellen detektieren lassen. Über diese hochempfindliche Detektionsmethode lässt sich beispielsweise das Auftreten und das Ausmaß von Metastasenbildung nachweisen. Die erfindungsgemäßen Nanopartikel sowie das erfindungsgemäße Wirkstofffreisetzungssystem können bei dieser Detektionsmethode eingesetzt werden.
Der Wirkstoff ist derart fest und vorzugsweise kovalent an das Substrat- Oligonukleotid gebunden, dass unter physiologischen Bedingungen im Wesentlichen keine Abspaltung des Wirkstoffs erfolgt. Bei dem Nanopartikel, woran das Substrat-Oligonukleotid optional über einen Linker gebunden ist, handelt es sich vorzugsweise auch um magnetische und insbesondere bevorzugt superparamagnetische Partikel im Nanometer- bis Mikrometerbereich.
Somit kann durch Anlegen eines insbesondere äußeren magnetischen Wechselfeldes die Temperatur im Bereich der Nanopartikel derart erhöht werden, dass die hybridisierte katalytisch aktive Nukleinsäure freigesetzt wird. Die katalytisch aktive Nukleinsäure bindet dann an das Substrat-Oligonukleotid und spaltet dieses, so dass der Wirkstoff von dem Nanopartikel abgelöst wird und seine Wirksamkeit entfalten kann.
Die Effektivitätssteigerung gegenüber dem in WO2006/108405 beschriebenen Verfahren ergibt sich durch eine weitgehend quantitative Abspaltung und Freisetzung des Wirkstoffs, weil durch die erzeugte Wärme nicht der Wirkstoff an sich freigesetzt werden muss, was in der Regel bei kleinen Termperaturänderungen nicht quantitativ erfolgt, sondern nur katalytische Mengen der katalytisch aktiven Nukleinsäure, welche nicht quantitativ freigesetzt werden muss, weil eben katalytische Mengen ausreichen, um das Substrat-Oligonukleotid zu spalten. Somit wird in nicht quantitativer Weise ein Katalysator freigesetzt, welcher in der Lage ist, den Wirkstoff quantitativ freizusetzen. Dies bewirkt eine fast 100%ige Effektivitätssteigerung gegenüber dem Verfahren gemäß WO2006/108405, bei dem der Wirkstoff durch die Wärmeentwicklung direkt freigesetzt werden soll.
Abbildung 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Wirkstofffreisetzungssystems.
Die Nanopartikel-Wirkstoff-Konjugate bestehen aus Nanopartikeln (z.B. Eisenoxid, Gold, S1O2 oder Core-Shell Partikeln unterschiedlicher vorzugsweise superparamagnetischer Materialen), optional Crosslinker und Substrat- Oligonukleotiden (DNA, RNA, modifizierte Nukleinsäuren sowie Nukleinsäure- Analoga), die einen Wirkstoff tragen und spezifisch von entsprechenden katalytischen Nukleinsäuren gespalten werden können. Die katalytischen Nukleinsäuren aus der ersten Komponente dienen nach der thermischen Freisetzung als Schneide-Werkzeug, um den Substrat-Oligonukleotid-Strang zu spalten. Der Wirkstoff, in Abbildung 2 symbolisiert durch den Stern, wird anschließend freigesetzt.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Wirkstofffreisetzungssystems liegt in der katalytischen Aktivität der Nukleinsäuren und der daraus resultierenden gesteigerten Effizienz bei der enzymatischen Freisetzung des Wirkstoffes aus dem Nanopartikel-Wirkstoff-Konjugat. Aufgrund des enzymatischen Charakters der katalytisch wirksamen Nukleinsäuren sind nur geringe Konzentrationen an katalytischen Nukleinsäuren notwendig, um therapeutisch effektive Konzentration des Wirkstoffes, aus dem Nanopartikel-Wirkstoff-Konjugat freizusetzen.
Das Problem der nicht sonderlich effektiven thermischen Freisetzung des Wirkstoffes wird somit dadurch gelöst, dass der Wirkstoff im Nanopartikel- Wirkstoff-Konjugat nicht thermisch, sondern enzymatisch freigesetzt wird. Dadurch ist auch die thermische Freisetzung von sehr geringen Mengen an katalytischen Nukleinsäuren ausreichend, um eine enzymatische Freisetzung von großen Mengen Wirkstoff in den Tumorzellen zu erreichen.
Weitere Vorteile des Wirkstofffreisetzungssystems liegen in seiner großen Variabilität und Anpassungsmöglichkeit an verschiedene Situationen. Die temperaturabhänge Aktivierung der katalytischen Nukleinsäuren kann z.B. durch die Länge der Inhibitorsequenz oder die Hybridisierungsverhältnisse zwischen Inhibitor und katalytischen Nukleinsäuren beliebig verändert werden. Die Geschwindigkeit der Wirkstofffreisetzung bzw. die Menge der freigesetzten Wirkstoffe sind von der lokalen Temperatur bzw. den Konzentrationen der Komponenten abhängig, so dass mögliche Nebenwirkungen des Wirkstoffes auf normale Zellen gezielt minimiert werden können.
In dem erfindungsgemäßen Wirkstofffreisetzungssystem wird das Substratmolekül kovalent, vorzugsweise über einen Linker 2 an den Träger gebunden. Der Linker 2 wird gemäß allgemeinem Fachwissen je nach vorhandenen reaktiven Gruppen des Trägers bzw. des Substratmoleküls ausgewählt. Ggf. wird eine modifizierte Nukleinsäure, insbesondere endständig modifizierte Nukleinsäure eingesetzt, um beispielsweise auf Substrat-Oligonukleotid-Seite eine Aminogruppe zur Verfügung zu stellen. Grundsätzlich können die gleichen Crosslinker eingesetzt werden, wie diese oben für Linker 1 beschrieben wurden. Bevorzugte Linker sind Sulfo-SMCC und Sulfo-GMBS.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem das Substratmolekül kovalent, insbesondere über einen Linker 2 kovalent mit dem Träger verbunden ist, wobei der Linker bevorzugt Sulfo-SMCC oder Sulfo-GMBS ist.
Das Substrat-Oligonukleotid ist bevorzugt ausgewählt aus DNA, RNA, L-DNA, L- RNA und modifizierten Nukleinsäuren. Unter modifzierten Nukleinsäuren sind solche bevorzugt, die eine geringere Nukleasesensitivität haben, um eine spontane Freisetzung durch Aktivtät der natürlich vorkommenden Nukleasen zu verhindern bzw. zu vermindern. Zudem können modifizierte Nukleotide eingebaut werden, die eine zusätzliche reaktive Gruppe, eine Kopplungsfunktionalisierung enthalten. Diese werden bevorzugt endständig eingebaut. Bevorzugte Funktionen sind insbesondere Amino-, Thiol-, oder Corboxyl-, Alkin- oder Azid-Funktion.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung somit ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem das Substrat-Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, RNA, L-DNA, L-RNA und einer modifizierten Nukleinsäure, wobei die modifizierte Nukleinsäure bevorzugt eine insbesondere endständige Kopplungsfunktionalisierung, insbesondere eine Amino-, Thiol-, oder Corboxyl-, Alkin- oder Azid-Funktion, aufweist.
Als Substratmolekül kann grundsätzlich jedes Molekül verwendet werden, das durch für Zusammensetzung 1 gewählte katalytisch aktive Nukleinsäure gespalten werden kann. Vorzugsweise erfolgt diese Spaltung spezifisch. Entsprechende Paare von katalytischen Nukleinsäuren und ihren Substraten sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Substrat-Oligonukleotide haben bevorzugt eine Länge von 10 bis 100 nt, mehr bevorzugt 15 - 60 nt, insbesondere 20-30 nt. Wiederum sind Oligonukleotide größer als 100 nt in der Regel zu teuer. Erkennungssequenzen von Substraten sind in der Regel mindestens 10 nt lang. Passend zu der in den Beispielen verwendeten katalytisch aktiven Nukleinsäure ist insbesondere ein Substrat-Oligonukleotid enthaltend die Sequenz 5'- GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3' (SEQ ID NO: 3) bevorzugt.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Wirkstofffreisetzungssystem, in der das Substrat- Oligonukleotid eine Länge von 10 bis 100 Nukleotiden aufweist, bevorzugt eine Länge von 15 bis 60 Nukleotiden, stärker bevorzugt eine Länge von 20 bis 30 Nukleotiden, insbesondere enthaltend die Sequenz 5 - GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3' (SEQ ID NO: 3). Das erfindungsgemäße Wirkstofffreisetzungssystem enthält mindestens einen therapeutische Wirkstoff, der ist aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren, siRNAs, antisense RNAs, Aminosäuren, Aptamere, Peptide, Proteine, Glycoproteine, Kohlenhydrate, Glycane, Lipide, Lipoproteine und niedermolekulare Wirkstoffe ausgewählt ist. Besonders bevorzugt sind niedermolekulare Wirkstoffe.
Diese haben bevorzugt eine anti-proliferative, zytostatische, zytotoxische, anti- migrative, anti-angiogene, anti-thrombotische, anti-inflammatorische, anti- phlogistische, anti-koagulative, anti-bakterielle, anti-virale und/oder antimykotische Wirkstoffe, insbesondere zytostatische oder zytotoxische Wirkung, wobei antiproliferative, anti-migrative, anti-angiogene, zytostatische und/oder zytotoxische Wirkstoffe sowie Nukleinsäuren, insbesondere auch inhibitorische Nukleinsäuren (z.B. siRNA), Aminosäuren, Peptide, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Glycoproteine, Glycane oder Lipoproteine mit anti-proliferativen, anti-migrativen, anti-angiogenen, anti-thrombotischen, anti-inflammatorischen, antiphlogistischen, zytostatischen, zytotoxischen, anti-koagulativen, anti-bakteriellen, anti-viralen und/oder anti-mykotischen Eigenschaften bevorzugt sind. Darüber hinaus können diese Substanzen auch Radiosensitizer oder Sensitizer oder Verstärker anderer auch kombinierter konventioneller Krebsbehandlungsmethoden sein, oder solche Sentitizer enthalten.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung somit ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem der therapeutische Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren, siRNAs, antisense RNAs, Aminosäuren, Aptamere, Peptide, Proteine, Glycoproteine, Kohlenhydrate, Glycane, Lipide, Lipoproteine und niedermolekulare Wirkstoffe, wobei der therapeutische Wirkstoff, insbesondere ein niedermolekularer Wirkstoff ist, und bevorzugt eine anti-proliferative, zytostatische, zytotoxische, anti-migrative, anti- angiogene, anti-thrombotische, anti-inflammatorische, anti-phlogistische, anti- koagulative, anti-bakterielle, anti-virale und/oder antimykotische Wirkung, insbesondere eine zytostatische oder zytotoxische Wirkung besitzt, insbesondere wobei der therapeutische Wirkstoff Doxorubicin oder Methotrexat ist.
Als zytotoxische und/oder zytostatische Verbindungen, d.h. chemische Verbindungen mit zytotoxischen und/oder zytostatischen Eigenschaften können unter anderem Alkylierungsmittel, Antibiotika mit zytostatischen Eigenschaften, Antimetabolite, Mikrotubuli-Inhibitoren und Topoisomerase-Inhibitoren, Platinenthaltende Verbindungen und andere Zytostatika wie beispielsweise Asparaginase, Tretinoin, Alkaloide, Podophyllotoxine, Taxane und Miltefosin®, Hormone, Immunmodulatoren, monoklonale Antikörper, Signaltransduktoren (Signaltransduktionsmoleküle) und Zytokine eingesetzt werden.
Als Beispiele für Alkylierungsmittel können unter anderem Chlorethamin, Cyclophosphamid, Trofosfamide, Ifosfamid, Melphalan, Chlorambucil, Busulfan, Thiotepa, Carmustin, Lomustin, Dacarbazin, Procarbazin, Temozolomid, Treosulfan, Estramustin und Nimustin genannt werden.
Beispiele für Antibiotika mit zytostatischen Eigenschaften sind Daunorubicin als auch liposomales Daunorubicin, Doxorubicin (Adriamycin), Dactinomycin, Mitomycin C, Bleomycin, Epirubicin (4-Epi-Adriamycin), Idarubicin, Dactinomycin, Mitoxantron, Amsacrin und Actinomycin D.
Methotrexat, 5-Fluorouracil, 6-Thioguanin, 6-Mercaptopurin, Fludarabin, Cladribin, Pentostatin, Gemcitabin, Cytarabin, Azathioprin, Raltitrexed, Capecitabin, Cytosinarabinosid, Tioguanin und Mercaptopurin können als Beispiele für Antimetabolite (antimetabolische Wirkstoffe) angeführt werden.
Zu der Klasse der Alkaloide und Podophyllotoxine gehören unter anderem Vincristin, Vinblastin, Vindesin, Etoposid als auch Teniposid. Desweiteren können Platin-enthaltende Verbindungen erfindungsgemäß eingesetzt werden. Als Platin- enthaltende Verbindungen seien beispielsweise Cisplatin, Carboplatin und Oxaliplatin genannt. Zu den Mikrotubuli-Inhibitoren zählen beispielsweise Alkaloide wie beispielsweise Vinca-Alkaloide (Vincristin, Vinblastin, Vindesin, Venorelbin) und Paclitaxel (Taxol®) sowie Derivate des Paclitaxel. Als Topoisomerase-Inhibitoren können beispielsweise Etoposid, Teniposid, Camptothecin, Topotecan und Irinotecan genannt werden.
Paclitaxel und Docetaxel sind Beispiele für die Verbindungsklasse der Taxane und zu den anderen zytostatischen Wirkstoffen (anderen Zytostatika) zählen beispielsweise Hydroxycarbamide (Hydroxyurea), Imatinib, Miltefosin®, Amsacrin, Topotecan (Topoisomerase-I-Inhibitor), Pentostatin, Bexaroten, Tretinoin und Asparaginase. Vertreter der Verbindungsklasse der monoklonalen Antikörper sind unter anderem Trastuzumab (Herceptin®), Alemtuzumab (MabCampath®) und Rituximab (MabThera®).
Es können auch Hormone wie beispielsweise Glucocorticoide (Prednison), Oestrogene (Fosfestrol, Estramustin), LHRH (Buserelin, Goserelin, Leuprorelin, Triptorelin), Flutamid, Cyproteronacetat, Tamoxifen, Toremifen, Aminoglutethimid, Formestan, Exemestan, Letrozol und Anastrozol eingesetzt werden. Zu den Klassen der Immunmodulatoren, Zytokine, Antikörper und Signaltransduktoren zählen lnterleukin-2, lnterferon-α, Erythropoietin, G-CSF, Trastuzumab, Rituximab, Efitinib (Iressa®), Ibritumomab (Zevalin®), Levamisol sowie Retinoide.
Bei dem freizusetzenden Wirkstoff kann es sich auch um ein Opioid-Agonisten, ein Nichtopioid-Analgetikum, ein nicht-steroidal-anti-inflammatorischen (NSAID) Wirkstoff, ein Anti-Migräne Wirkstoff, einen Cox-Il Inhibitor, einen ß-adrenergen Blocker, ein Antikonvulsivum, ein Antidepressivum, einen Ca2+-Kanalblocker oder einen Wirkstoff für die Behandlung von neuronalen oder neurodegenerativen Krankheiten wie z.B. der Parkinson-Krankheit, Angstzuständen, Epilepsie, Schlaganfall, Psychosen, kognitiven Störungen oder Depressionen handeln. Das erfindungsgemäße Wirkstofffreisetzungssystem und pharmazeutische Zusammensetzungen werden für die Behandlung als auch zur Prophylaxe von Krankheiten eingesetzt, bei denen die Eigenschaften der gesteuerten Wirkstofffreisetzung ausgenutzt werden können, um den Wirkstoff gesteuert, in therapeutisch relevanten Konzentrationen, nur in den Zellen des Zielgewebes freizusetzen.
Ein weiterer bedeutender Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Möglichkeit der gesteuerten zeitabhängigen Wirkstofffreisetzung eines Wirkstoffes von den Partikeln zum einen durch Anlegen eines äußeren magnetischen Wechselfeldes bei magnetischen Partikeln oder durch Bestrahlung mit Infrarotwellen bei nicht magnetischen Partikeln. Dadurch kann zu einem bestimmten Zeitpunkt, beispielsweise während eines Migräneanfalls oder beim Auftreten starker Schmerzen gezielt und zeitlich kontrolliert Wirkstoff freigesetzt werden, um die Störung, Schmerzen oder andere Krankheiten zu behandeln.
Demzufolge werden das Wirkstofffreisetzungssystem und die enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen auch zur Prophylaxe und Behandlung von Schmerzen, neurodegenerativen Erkrankungen und cardiovaskulären Erkrankungen.
Als Beispiele für nützliche Opioid-Agonisten sind zu nennen: Alfentanil, Allylprodin, Alphaprodin, Anileridin, Benzylmorphin, Bezitramid, Bubrenorphin, Butorphanol, Clonitazen, Codein, Desomorphine, Dextromoramid, Dezocin, Diampromid, Diamorphon, Dihydrocodein, Dihydromorphin, Dimenoxadol, Dimepheptanol, Dimethylthiambuten, Ethylmorphin, Etonitazen Fentanyl, Heroin, Hydrocodon.hydromorphon, Hydroxypethidin, Isomethadon, Ketobemidon, Levorphanol, Levophenacylmorphan, Lofentanil, Meperidin, Meptazinol, Metazocin, Methadon, Metopon, Morphin, Myrophin, Nalbuphin, Narcein, Nicomorphin, Norlevorphanol, Normethadon, Nalorphin, Normorphin, Norpipanon, Opium, Oxycodon, Oxymorphon, Papaveretum, Pentazocin, Phenadoxon, Phenomorphan, Phenazocin, Phenoperidin, Piminodin, Piritramid, Proheptazin, Promedol, Properidin, Propiram, Propoxyphen, Sufentanil, Tilidin, Tramadol und pharmazeutisch verträgliche Salze und Mixturen hiervon.
Als Beispiele für nützliche Nichtopiod-Analgetika einschließlich nicht-steroidal-antiinflammatorischer (NSAID) Wirkstoffe sind zu nennen: Aspirin, Ibuprofen, Diclofenac, Naproxen, Benoxaprofen, Flurbiprofen, Fenoprofen, Flubufen, Ketoprofen, Indoprofen, Piroprofen, Carprofen, Oxaprozin, Pramoprofen, Muroprofen, Trioxaprofen, Suprofen, Aminoprofen, Tiaprofensäure, Fluprofen, Bucloxinsäure, Indomethacin, Sulindac, Tolmetin, Zomepirac, Tiopinac, Zidometacin, Acemetacin, Fentiazac, Clidanac, Oxpinac, Mefenaminsäure, Meclofenaminsäure, Flufenaminsäure, Nifluminsäure, Tolfenaminsäure, Diflurisal, Flufenisal, Piroxicam, Sudoxicam, Isoxicam und pharmazeutisch verträgliche Salze und Mixturen hiervon.
Weitere Nichtopioid-Analgetika umfassen folgende chemische Klassen von analgetischen, antipyretischen, nicht-steroidal-anti-inflammatorischen (NSAID) Wirkstoffen: Salycylsäurederivate, einschließlich Aspirin, Natriumsalicylat, Cholin- Magnesium-Trisalicylat, Salsalat, Diflunisal, Salycylsalicyclicsäure, Sulfasalazin und Olsalazin; para-Aminophenol Derivate, einschließlich Acetaminophen und Phenacetin; Indol- und Indenessigsäure, einschließlich Indomethacin, Sulindac und Etodolac; Heteroarylessigsäuren, einschließlich Tolmetin, Diclofenac und Ketorolac; Anthranilsäure (Fenamate), einschließlich Mefenaminsäure und Meclofenaminsäure; Enolsäuren, einschließlich Oxicamen (Piroxicam, Tenoxicam) und Pyrazolidinedione (Phenylbutazon, Oxyphenthartazon); und Alkanone, einschließlich Nabumeton.
Als Beispiele für nützliche Cox-Il Inhibitoren und 5-Lipoxygenase Inhibitoren sind zu nennen: Celecoxib, Etoricoxib, Rofecoxib, Parecoxib und Valdecoxib. Als Beispiel für nützliche Anti-Migräne Wirkstoffe sind zu nennen: Alpiroprid, Bromocriptin, Dihydroergotamin, Dolasetron, Ergocornin, Ergocorninin, Ergocryptin, Ergonovin, Ergot, Ergotamin, Flumedroxon-Acetat, Fonazin, Ketanserin, Lisurid, Lomerizin, Methylergonovin, Methysergid, Metoprolol, Naratriptan, Oxetoron, Pizotylin, Propranolol, Risperidon, Rizatriptan, Sumatriptan, Timolol, Trazodon, Zolmitriptan und Mixturen hiervon.
Als Beispiel für nützliche ß-adrenerge Blocker sind zu nennen: Acebutolol, Alprenolol, Amosulabol, Arotinolol, Atenolol, Befunolol, Betaxolol, Bevantolol, Bisoprolol, Bopindolol, Bucumolol, Bufetolol, Bufuralol, Bunitrolol, Bupranolol, Butidrin-Hydrochlorid, Butofilolol, Carazolol, Carteolol, Carvedilol, Celiprolol, Cetamolol, Chloranolol, Dilevalol, Epanolol, Esmolol, Indenolol, Labetalol, Levobunolol, Mepindolol, Metipranolol, Metoprolol, Moprolol, Nadolol, Nadoxolol, Nebivalol, Nifenalol, Nipradilol, Oxprenolol, Penbutolol, Pindolol, Practolol, Pronethanol, Propranolol, Sotalol, Sulfinalol, Talinolol, Tertatolol, Tilisolol, Timolol, Toliprolol und Xibenolol.
Als Beispiel für nützliche Antikonvulsiva sind zu nennen: Acetylpheneturide, Albutoin, Aloxidon, Aminoglutethimide, 4-amino-3-hydroxybuttersäure, Atrolactamid, Beclamid, Buramat, Kalziumbromid, Carbamazepin, Cinromid, Clomethiazol, Clonazepam, Decimemid, Diethadion, Dimethadion, Doxenitroin, Eterobarb, Ethadion, Ethosuximid, Ethotoin, Felbamat, Fluoreson, Gabapentin, 5- hydroxytryptophan, Lamotrigin, Magnesiumbromid, Magnesiumsulfat, Mephenytoin, Mephobarbital, Metharbital, Methetoin, Methsuximid, 5-methyl-5-(3- phenanthryl)-hydantoin, 3-methyl-5-phenylhydantoin, Narcobarbital,
Nimetazepam, Nitrazepam, Oxcarbazepin, Paramethadion, Phenacemid, Phenetharbital, Pheneturid, Phenobarbital, Phensuximid,
Phenylmethylbarbiturinsäure, Phenytoin, Phethenylat-Natrium, Kaliumbromid, Pregabalin, Primidon, Progabid, Natriumbromid, Solanum, Strontiumbromid, Suclofenid, Sulthiam, Tetrantoin, Tiagabin, Topiramat, Trimethadion, Valproinsäure, Valpromid, Vigabatrin und Zonisamid. Als Beispiel für nützliche Antidepressiva sind zu nennen: Binedalin, Caroxazon, Citalopram, (S)-Citalopram, Dimethazan.Fencamin, Indalphin, Indeloxazin- Hydrochlorid, Nefopam, Nomifensin, Oxitriptan, Oxypertin, Paroxetin, Setralin, Thiazesim, Trazodon, Benmoxin, Iprociozid, Iproniazid, Isocarboxazid, Nialamid, Octamoxin, Phenelzin, Cotinin, Rolicyprin, Rolipram, Maprotilin, Metralindol, Mianserin, Mirtazepin, Adinazolam, Amitriptylin, Amitriptylinoxid, Amoxapin, Butriptylin, Clomipramin, Demexiptilin, Desipramin, Dibenzepin, Dimetacrin, Dothiepin, Doxepin, Fluacizin, Imipramin, Imipramin N-oxid, Iprindol, Lofepramin, Melitracen, Metapramin, Nortriptylin, Noxiptilin, Opipramol, Pizotylin, Propizepin, Protriptylin, Quinupramin, Tianeptin, Trimipramin Adrafinil, Benactyzin, Bupropion, Butacetin, Dioxadrol, Duloxetin, Etoperidon, Febarbamat, Femoxetin, Fenpentadiol, Fluoxetin, Fluvoxamin, Hematoporphyrin, hypericin, Levophacetoperan, Medifoxamin, Milnacipran, Minaprin, Moclobemid, Nefazodon, Oxoflozan, Piberalin, Prolintan, Pyrisuccideanol, Ritanserin, Roxindol, Rubidiumchlorid, Sulpirid, Tandospiron, Thozalinon, Tofenacin, Toloxaton, Tranylcypromin, L-Tryptophan, Venlafaxin, Viloxazin und Zimelidin.
Als Beispiel für nützliche Ca2+-Kanalblocker sind zu nennen: Bepridil, Clentiazem, Diltiazem, Fendilin, Gallopamil, Mibefradil, Prenylamin, Semotiadil, Terdilin, Verapamil, Amlodipin, Aranidipin, Barnidipin, Benidipin, Cilnidipin, Efonidipine, Elgodipin, Felodipin, Isradipin, Lacidipin, Lercanidipin, Manidipin, Nicardipin, Nifedipin, Nilvadipin, Nimodipin, Nisoldipin, Nitrendipin, Cinnarizin, Flunarizin, Lidoflazin, Lomerizin, Bencyclan, Etafenon, Fantofaron und Perhexilin.
Als Beispiel für nützliche Wirkstoffe in der Behandlung von neuronalen oder neurodegenerativen Krankheiten wie z.B. der Parkinson-Krankheit, Angstzuständen, Epilepsie, Schlaganfall, Psychosen, kognitiven Störungen oder Depressionen handeln sind zu nennen: L-Dopa, Anticholinergika, COMT-Hemmer, Serotonin-Wiederaufnahmehemmer, Buspiron, trizyklische Antidepressiva, Monoaminooxidase-Hemmer, Valproinsäure, Carbamazepin, Selective Serotonin Reuptake Inhibitoren, Serotonin-Noradrenalin-Reuptake-Inhibitoren, Noradrenalin- Serotonin-selektive Antidepressiva und Trimipramin.
Für die Behandlung oder Prävention von der Parkinson-Krankheit: Carbidopa/Levodopa, Pergolid, Bromocriptin, Ropinirol, Pramipexol, Entacapon, Tolcapon, Selegilin, Amantadin und Trihexyphenidyl-Hydrochloride.
Für die Behandlung oder Prävention von Angstzuständen: Benzodiazepine, wie z.B. Alprazolam, Brotizolam, Chlordiazepoxid, Clobazam, Clonazepam, Clorazepate, Demoxepam, Diazepam, Estazolam, Flumazenil, Flurazepam, Halazepam, Lorazepam, Midazolam, Nitrazepam, Nordazepam, Oxazepam, Prazepam, Quazepam, Temazepam und Triazolam; Nicht-Benzodiazepine Wirkstoffe, wie z.B. Buspiron, Gepiron, Ipsapiron, Tiospiron, Zolpicon, Zolpidem und Zaleplon; Beruhigungsmittel aus der Gruppe der Barbiturate, wie z.B. Amobarbital, Aprobarbital, Butabarbital, Butalbital, Mephobarbital, Methohexital, Pentobarbital, Phenobarbital, Secobarbital und Thiopental; und Propanediol Carbamat, wie z.B Meprobamat und Tybamat.
Für die Behandlung oder Prävention von Epilepsie: Carbamazepin, Ethosuximid, Gabapentin, Lamotrigin, Phenobarbital, Phenytoin, Primidon, Valproinsäure, Trimethadion, Benzodiazepine, γ-vinyl GABA, Acetazolamid und Felbamat.
Für die Behandlung oder Prävention von Schlaganfall: Gerinnungshemmende Wirkstoffe, wie z.B. Heparin sowie Wirkstoffe, die geronnene Blutklümpchen auflösen können, wie Streptokinase oder gewebespezifischer Plasminogenaktivatoren und Wirkstoffe, die Schwellungen reduzieren, wie Mannitol, Corticosteroide oder Acetylsalicylsäure.
Für die Behandlung oder Prävention von Psychosen: Phentothiazine, wie z.B. Chlorpromazin-Hydrochlorid, Mesoridazin-Besilat und Thoridazin-Hydrochlorid; Thioxanthene, wie z.B. Chloroprothixen und Thiothixen-Hydrochlorid, Clozapin, Risperidon, Olanzapin, Quetiapin, Quetiapin Fumarat, Haloperidol, Haloperidol Decanoat, Loxapin Succinat, Molindon-Hydrochlorid, Primozid und Ziprasidon.
Für die Behandlung oder Prävention von kognitiven Störungen: Wirkstoffe zur Behandlung von Demenz, wie z.B. Tacrin; Donepezil, Ibuprofen und antipsychotische Wirkstoffe wie Thioridazin und Haloperidol.
Für die Behandlung oder Prävention von Depression: Amitryptylin, Amoxapin, Bupropion, Clomiopramin, Desipramin, Doxepin, Imipramin, Maprotilin, Nefazadon, Nortriptylin, Protriptylin, Trazodon, Trimipramin, Venlafaxin, Citalopram, (S)-Citalopram, Fluoxetine, Fluvoxamin, Paroxetin, Setralin, Isocarboazid, Pargylin, Phenelzin, Tranylcypromin, Dextroamphetamin und Methylphenidat.
Die vorgenannten Wirkstoffe werden vorzugsweise kovalent an das Substrat- Oligonukleotid gebunden. Die Anbindung der Wirkstoffe kann beispielsweise über Hydroxygruppen, Aminogruppen, Carbonylgruppen, Thiolgruppen oder Carboxylgruppen erfolgen, je nachdem, welche funktionellen Gruppen der jeweilige Wirkstoff trägt.
Hydroxygruppen werden vorzugsweise als Ester, Acetal oder Ketal gebunden, Thiogruppen vorzugsweise als Thioester, Thioacetal oder Thioketal, Aminogruppen vorzugsweise als Amide und teilweise auch als Imine (Schiffsche Basen), Carboxylgruppen vorzugsweise als Ester oder Amide und Carbonylgruppen vorzugsweise als Ketale.
Gemäß einer Ausführungsform sind insbesondere die Wirkstoffe Doxorubicin und Methotrexat bevorzugt. Methotrexat lässt sich kovalent mittels einer Peptidbindung über eine Aminogruppe, die in das Substrat-Oligonukleotid vorzugsweise endständig eingebaut wurde, über eine Carboxy-Gruppe des Methotrexat koppeln. Doxorubicin könnte zum Beispiel als Prodrug über einen Linker and die Aminofunktion gekoppelt werden, wie es für Albumin-Doxorubicin Konjugate im Stand der Technik beschrieben ist (Abu Ajaj et al., 2009, Boga et al., 2009, Calderon et al., 2009, Kratz et al., 2008).
Die Anbindung der mindestens einen therapeutisch wirksamen Substanz an das Substrat-Oligonukleotid, d.h. der Moleküle mindestens einer therapeutisch wirksamen Substanzklasse oder eines bestimmten Wirkstoffes, erfolgt vorzugsweise kovalent oder durch eine überwiegend kovalente Bindung und/oder durch eine ausreichend starke ionische Bindung, Einlagerungsverbindung, Komplexbindung oder durch Interkalierung, so dass eine unkontrollierte Freisetzung von therapeutisch wirksamer Substanz weitgehend unterbleibt. Als unkontrollierte Freisetzung wird die Ablösung von therapeutisch wirksamer Substanz im gesunden Gewebe verstanden, insbesondere die Ablösung ohne eine Spaltung des Substrat-Oligonukleotides durch die katalytische Nukleinsäure der ersten Komponente.
Eine solche unkontrollierte Freisetzung führt dazu, dass therapeutisch wirksame Substanzen dort freigesetzt werden, wo sie eher schädliche Nebenwirkungen als therapeutische Effekte bewirken, nämlich außerhalb des kanzerogenen Gewebes bzw. der Tumorzellen.
Im ersten Schritt wird die katalytische Nukleinsäure z.B. mittels eines magnetischen Wechselfeldes, insbesondere eines äußeren bzw. von außen angelegten magnetischen Wechselfeldes (Impuls) oder auch durch IR-Strahlung für Gold Nanopartikel von seinem Oligonukleotid-Inhibitorstrang getrennt. Die freie katalytische Nukleinsäure bindet daraufhin das Substrat-Oligonukleotid im Nanopartikel-Wirkstoff-Konjugat und setzt durch Spaltung des Substrates den Wirkstoff zusammen mit dem anhängenden Oligonukleotid frei. Das einzelsträngige Oligonukleotid wird im Inneren der Zelle schnell abgebaut, so dass dann der Wirkstoff gänzlich frei ist.
Gemäß einer Ausführungsform des Wirkstofffreisetzungssystems ist der therapeutische Wirkstoff kovalent, insbesondere über einen Linker 3 mit dem Substrat-Oligonukleotid verbunden. Dies kann wie für Linker 1 und 2 durch direkte Anbindung, insbesondere Bildung einer Peptidbindung zwischen Wirkstoff und Substratmolekül, aber auch durch einen homo- oder heterobifunktonellen Crosslinker wie zuvor beschrieben erfolgen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung somit ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem der therapeutische Wirkstoff kovalent, insbesondere über einen Linker 3 kovalent mit dem Substratmolekül verbunden ist.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Wirkstofffreisetzungssystems ist der Linker 3 eine Peptidbindung oder ein Hydrazon, wobei letzteres den Vorteil hat, dass es sich im sauren Milieu des Lysosoms bzw. des Tumor vom Substratrest, d.h. dem Teil, der nach Spaltung noch am Wirkstoff vorhanden ist, abspalten lässt und somit die ursprüngliche Struktur des Wirkstoffs wiederhergestellt wird. Methotrexat lässt sich kovalent mittels einer Peptidbindung über eine Aminogruppe, die in das Substrat-Oligonukleotid vorzugsweise endständig eingebaut wurde, über eine Carboxy-Gruppe des Methotrexat koppeln. Doxorubicin kann als Prodrug über die Aminogruppe gekoppelt werden (Abu Ajaj et al., 2009, Boga et al., 2009, Calderon et al., 2009, Kratz et al., 2008).
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem der Linker 3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Aminogruppe und Hydrazon, insbesondere wobei Methotrexat über eine Peptidbindung zwischen der Aminogruppe mit einer Carboxy-Gruppe des Methotrexat gekoppelt ist. In einer Ausführungsform ist der therapeutische Wirkstoff inaktiv solange er an das Substratmolekül und/oder den Linker 3 gebunden ist. Mit Freisetzung vom Substrat-Oligonukleotid bzw. Linker 3 durch die Spaltung des Substratmoleküls oder nach anschließender Aufnahme durch eine Zelle wird dann der Wirkstoff aktiviert. In einer Ausführungsform kann der abgespaltene Wirkstoff noch einen Teil des nunmehr gespaltenen Substratmoleküls sowie Linker 3 enthalten und somit deaktiviert sein. In diesem Fall können in der Zelle spaltbare, insbesondere enzymatisch spaltbare oder säurelabile Crosslinker eingesetzt werden, insbesondere Hydrazone, die bei Eintritt in das Lysosom gespalten werden und den aktiven Wirkstoff freisetzen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsfrom ein Wirkstofffreisetzungssystem, in dem der therapeutische Wirkstoff inaktiv ist, solange er an das Substratmolekül und/oder den Linker 3 gebunden ist, und in dem der therapeutische Wirkstoff mit Freisetzung vom Substratmolekül bzw. mit Freisetzung vom Linker 3 oder nach anschließender Aufnahme durch eine Zelle aktiviert wird.
Ein kurzer Nukleotidstrang kann bei der Spaltung noch am Wirkstoff verbleiben, welcher jedoch unter physiologischen Bedingungen abgebaut wird und die Wirksamkeit des Wirkstoffs nicht bzw. nicht wesentlich beeinflusst.
Für den Fall einer nur schwachen Bindung des Wirkstoffs an das Substrat- Oligonukleotid, beispielsweise bei einer nicht-kovalenten, ionischen, adsorptiven, lipophilen und/oder Van der Waalschen Bindung und/oder einen Anbindung über Wasserstoffbrücken kann eine Schutzhülle oder Barrierebeschichtung die Freisetzung der therapeutisch aktiven Substanzen unterbinden, bis die Nanopartikel ihren Bestimmungsort erreicht haben. Anstelle dieser Schutzhülle oder Barrierebeschichtung oder als weitere Schicht auf dieser Schutzhülle oder Barrierebeschichtung kann eine äußere Schicht aufgebracht werden, zellspezifische Funktionalitäten trägt.
Diese zellspezifische Beschichtung erhöht die Affinität der Nanopartikel zu bestimmten Zellen, beispielsweise zu bestimmten Bakterienzellen oder zu bestimmten Tumorzellen und dient somit der Zelldiskriminierung. Solche zellspezifischen Nanopartikel reichern sich bevorzugt in solchen Zellen an, zu denen sie aufgrund der Funktionalität auf ihrer Oberfläche eine erhöhte Affinität haben und sind somit tumorspezifisch. Mit dieser Technologie lassen sich beispielsweise tumorspezifische Nanopartikel für bestimmte Krebsarten entwickeln.
Ferner können auch die Nanopartikel durch eine kolloidale Schutzhülle stabilisiert werden, welche die Nanopartikel vor einer Agglomeration schützen. Es ist bevorzugt, wenn derartige Schutzhüllen oder Beschichtungen Aminogruppen oder Carboxygruppen aufweisen. Für die der Schutzhüllen bzw. Beschichtungen können biologische, synthetische oder semisynthetische Polymere eingesetzt werden. Für die Erzeugung einer Barriereschicht werden vorzugsweise biostabile, d.h. gegen biologischen Abbau weitgehend resistente Polymere eingesetzt. Zur Erzeugung von zellspezifischen Hüllen bzw. Beschichtungen werden vorzugsweise biologisch abbaubare Polymere verwendet.
Als biostabile Polymere können eingesetzt werden: Polyacrylsäure und Polyacrylate wie Polymethylmethacrylat, Polybutylmethacrylat, Polyacrylamid, Polyacrylonitrile, Polyamide, Polyetheramide, Polyethylenamin, Polyimide, Polycarbonate, Polycarbourethane, Polyvinylketone, Polyvinylhalogenide, Polyvinylidenhalogenide, Polyvinylether, Polyisobutylene, Polyvinylaromaten, Polyvinylester, Polyvinylpyrollidone, Polyoxymethylene, Polytetramethylenoxid, Polyethylen, Polypropylen, Polytetrafluorethylen, Polyurethane, Polyetherurethane Silicon-Polyetherurethane, Silicon-Polyurethane, Silicon-Polycarbonat-Urethane, Polyolefin-Elastomere, Polyisobutylene, EPDM-Gummis, Fluorosilicone, Carboxy- methylchitosane, Polyaryletheretherketone, Polyetheretherketone, Polyethylen- terephtalat, Polyvalerate, Carboxymethylcellulose, Cellulose, Rayon, Rayontriacetate, Cellulosenitrate, Celluloseacetate, Hydroxyethylcellulose, Cellulosebutyrate, Celluloseacetatbutyrate, Ethylvinylacetat-copolymere, Polysulfone, Epoxyharze, ABS-Harze, EPDM-Gummis, Silicone wie Polysiloxane, Polydimethylsiloxane, Polyvinylhalogene und Copolymere, Celluloseether, Cellulosetriacetate. Chitosane und Copolymere und/oder Mischungen dieser Substanzen.
Als bioabbaubare Polymere können verwendet werden: Polyvalerolactone, Poly- ε-Decalactone, Polylactonsäure, Polyglycolsäure Polylactide, Polyglycolide, Copolymere der Polylactide und Polyglycolide, Poly-s-caprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyhydroxybutyrate, Polyhydroxyvalerate, Polyhydroxy- butyrate-co-valerate, Poly(1 ,4-dioxan-2,3-dione), Poly(1 ,3-dioxan-2-one), Poly- para-dioxanone, Polyanhydride wie Polymaleinsäureanhydride, Polyhydroxymethacrylate, Fibrin, Polycyanoacrylate, Polycaprolacton- dimethylacrylate, Poly-ß-Maleinsäure Polycaprolactonbutylacrylate,
Multiblockpolymere wie z.B. aus Oligocaprolactondiole und Oligodioxanondiole, Polyetherestermultiblockpolymere wie z.B. PEG und Poly(butylenterephtalat), Polypivotolactone, Polyglycolsäuretrimethylcarbonate Polycaprolacton-glycolide, Poly(D-ethylglutamat), Poly(DTH-iminocarbonat), Poly(DTE-co-DT-carbonat), Poly(bisphenol A-iminocarbonat), Polyorthoester, Polyglycolsäuretrimethyl- carbonate, Polytrimethylcarbonate Polyiminocarbonate, Poly(N-vinyl)-pyrrolidon, Polyvinylalkohole, Polyesteramide, glycolierte Polyester, Polyphosphoester, Polyphosphazene, Poly[(p-carboxyphenoxy)propan] Polyhydroxypentansäure, Polyanhydride, Polyethylenoxidpropylenoxid, weiche Polyurethane, Polyurethane mit Aminosäurereste im Backbone, Polyetherester wie das Polyethylenoxid, Polyalkenoxalate, Polyorthoester sowie deren Copolymere, Lipide, Carrageenane, Fibrinogen, Stärke, Kollagen, protein-basierende Polymere, Polyaminosäuren, synthetische Polyaminosäuren, Zein, modifiziertes Zein, Polyhydroxyalkanoate, Pectinsäure, Actinsäure, modifiziertes und unmodifiziertes Fibrin und Casein, Carboxymethylsulfat, Albumin, Hyaluronsäure, Chitosan und seine Derivate, Heparansulfate und seine Derivate, Heparine, Chondroitinsulfat, Dextran, ß- Cyclodextrine, Alginate, Glycosaminoglycane, Saccharide, Polysaccharide, Proteoglykane, Glycoproteine, Copolymere mit PEG und Polypropylenglycol, Gummi arabicum, Guar, Gelatine, Collagen Collagen-N-Hydroxysuccinimid, Lipide, Phospholipide, Modifikationen und Copolymere und/oder Mischungen der vorgenannten Substanzen.
Zur weiteren Affinitätssteigerung bezüglich bestimmter Zellen können auf der Oberfläche der Nanopartikel bzw. auf der äußeren Schicht oder Hülle der Nanopartikel monoklonale Antikörper und/oder Aptamere gekoppelt werden. Die monoklonalen Antikörper und Aptamere sind derart ausgestaltet, dass sie bestimmte Zellen beispielsweise Tumorzellen erkennen und die Zelldiskriminierung der Nanopartikel weiter steigern.
Für das erfindungsgemäße Wirkstofffreisetzungssystem gilt, dass die katalytisch aktive Nukleinsäure, sofern sie vom Oligonukleotid-Inhibitorstrang dissoziiert vorliegt, das Substratmolekül spalten kann. Bevorzugt gilt für die Spaltungsreaktion des Substratmoleküls durch die katalytisch aktive Nukleinsäure, dass die Konzentration des Substratmoleküls > KM ist, wobei kcat bevorzugt > 0,05/min, stärker bevorzugt > 0,5/min, besonders bevorzugt 1/min, und insbesondere ^ 5/min ist.
Bevorzugt ist das Verhältnis von Zusammensetzung 1 zu Zusammensetzung 2 dabei < 2, insbesondere 1.
Das ist in der Konkurrenzreaktion von Inhibition und Substratspaltung begründet. Zu therapeutischen Zwecken ist eine möglichst hohe Geschwindigkeitskonstante der Substratspaltung mit einer geringen Menge katalytisch aktiver Nukleinsäure wünschenswert. In einer konkreten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Wirkstofffreisetzungssystems ist der Oligonukleotid-Inhibitorstrang, die katalytisch aktive Nukleinsäure und das Substrat-Oligonukleotid jeweils eine gespiegelte Nukleinsäure. Hierbei ist besonders bevorzugt, dass der Oligonukleotid- Inhibitorstrang eine L-DNA ist, insbesondere enthaltend die Sequenz 5'- G CCT CAT CAG TCG AGC C-3' (SEQ ID NO: 2), dass die katalytisch aktive Nukleinsäure eine L-RNA ist, insbesondere enthaltend die Sequenz 5'- GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3' (SEQ ID NO: 1), und dass das Substrat-Oligonukleotid eine L-RNA, insbesondere enthaltend die Sequenz 5 - GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3' (SEQ ID NO: 3), ist. In dieser Zusammensetzung konnte gemäß den Beispielen ein besonders geeignetes Wirkstofffreisetzungssystem umgesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist eine Zusammensetzung 1 wie sie im Rahmen dieser Erfindung definiert wurde.
Eine Zusammensetzung 1 kann als einzelnes Produkt vertrieben werden, wenn z.B. ein Patient zu einem früheren Zeitpunkt, beispielsweise während einer früheren Operation, eine Zusammensetzung 2 implantiert bekommen hatte. Der an ein derartiges Implantat gekoppelte Wirkstoff könnte somit zu einem späteren Zeitpunkt durch separate Zugabe der Zusammensetzung 1 abgespalten und somit aktiviert werden. Dabei kann die Zusammensetzung in das Implantat gespritzt werden (z.B. bei schwammartigen Polymeren), zum Implantat hin (in zuführende (Blut-)Gefäße oder in örtliche Nähe) oder systemisch verabreicht werden (z.B. i. V. ), insbesondere wenn die Zusammensetzung 1 über einen Targetingmechanismus eine Anreicherung im Zielgewebe erfährt.
Entsprechend ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung eine Zusammensetzung 2 wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung definiert wurde. Diese kann - wie oben beschrieben - zu einem früheren Zeitpunkt beispielsweise während einer Operation an bestimmten Stellen im Körper implantiert werden, um zu einem späteren Zeitpunkt vor Ort den gekoppelten Wirkstoff freizusetzen.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bzw. Medikamente, welche das erfindungsgemäße Wirkstofffreisetzungssystem oder eine der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen 1 oder 2 enthalten, sowie die Verwendung des erfindungsgemäßen Wirkstofffreisetzungssystems zur Herstellung derartiger pharmazeutischer Zusammensetzungen. Bei diesen pharmazeutischen Zusammensetzungen handelt es sich insbesondere um Infusions- oder Injektionslösungen. Derartige Lösungen der Nanopartikel, in beispielsweise physiologischer Kochsalzlösung, sind für die interstitielle bzw. intratumorale Applikation geeignet. Eine intraarterielle oder intravenöse Applikation ermöglicht ferner eine systemische, den ganzen Körper betreffende Therapiemöglichkeit für nicht solide und/oder metastasenbildende Tumorarten. Zur Verabreichung werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen bzw. Medikamente gemäß fachmännischem Können formuliert, d.h. ggf. geeignete Puffer und Hilfsstoffe zugesetzt.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Medikament enthaltend ein Wirkstofffreisetzungssystem wie definiert im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Das erfindungsgemäße Wirkstofffreisetzungssystem und pharmazeutische Zusammensetzungen werden für die Behandlung als auch zur Prophylaxe von Krankheiten eingesetzt, welche sich durch entartete Zellspezies oder körperfremde Zellen auszeichnen und bei denen die Eigenschaften der gesteuerten Wirkstofffreisetzung ausgenutzt werden können, um den Wirkstoff gesteuert, in therapeutisch relevanten Konzentrationen, nur in den entarteten Zellen freizusetzen. Als entartete Zellen gelten insbesondere Krebszellen bzw. in ihrer Proliferation gestörte Zellen als auch stenotisches oder restenotisches Gewebe. Als körperfremde Zellen können insbesondere Bakterien genannt werden.
Demzufolge wird das Wirkstofffreisetzungssystem und die enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Medikament zur Prophylaxe und/oder Behandlung von proliferativen Erkrankungen, Tumoren, Karzinomen, Krebs, Entzündungserkrankungen, insbesondere Autoimmunerkrankungen, und bakteriellen Infektionen eingesetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Medikament enthaltend ein erfindungsgemäßes Wirkstofffreisetzungssystem zur Behandlung und/oder Prophylaxe von proliferativen Erkrankungen, Krebs, Entzündungserkrankungen, insbesondere Autoimmunerkrankungen, und bakteriellen Infektionen.
Als Beispiele für Krebs- und Tumorarten, wo die erfindungsgemäßen Nanopartikel eingesetzt werden können, sind zu nennen: Adenokarzinome, Aderhautmelanom, Akute Leukämie, Akustikusneurinom, Ampullenkarzinom, Analkarzinom, Astro- zytome, Basaliom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Bindegewebstumor, Blasenkrebs, Bronchialkarzinom, Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom, Brustkrebs, Burkitt- Lymphom, Corpuskarzinom, CUP-Syndrom, Dickdarmkrebs, Dünndarmkrebs, Dünndarmtumore, Eierstockkrebs, Endometriumkarzinom, Ependymom, Epithel- Krebsarten, Ewing-Tumoren, Gastrointestinale Tumoren, Gallenblasenkrebs, Gallenkarzinome, Gebärmutterkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Glioblastome, Gynäkologische Tumoren, Hals-, Nasen- und Ohrentumoren, Hämatologische Neoplasien, Haarzell-Leukämie, Harnröhrenkrebs, Hautkrebs, Hirntumoren (Gliome), Hirnmetastasen, Hodenkrebs, Hypophysentumor, Karzinoide, Kaposi- Sarkom, Kehlkopfkrebs, Keimzellentumor, Knochenkrebs, kolorektales Karzinom, Kopf-Hals-Tumore (Tumore des Hals- Nasen- und Ohrenbereichs), Kolonkarzinom, Kraniopharyngeome, Krebs im Mundbereich und auf der Lippe, Leberkrebs, Lebermetastasen, Leukämie, Lidtumor, Lungenkrebs, Lymphdrüsenkrebs (Hodgkin/Non-Hodgkin), Lymphome, Magenkrebs, Malignes Melanom, malignes Neoplasma, Malignome des Magen-Darm-Traktes, Mammakarzinom, Mastdarmkrebs, Medulloblastome, Melanom, Meningeome, Morbus Hodgkin, Mycosis fungoides, Nasenkrebs, Neurinom, Neuroblastom, Nierenkrebs, Nierenzellkarzinome, Non-Hodgkin-Lymphome, Oligodendrogliom, Ösophaguskarzinom, osteolytische Karzinome, u. osteoplastische Karzinome, Osteosarkom, Ovarial-Karzinom, Pankreaskarzinom, Peniskrebs, Plasmozytom, Plattenepithelkarzinome des Kopfes und Halses, Prostatakrebs, Rachenkrebs, Rektumkarzinom, Retinoblastom, Scheidenkrebs, Schilddrüsenkarzinom, Schneeberger Krankheit, Speiseröhrenkrebs, Spinaliom, T-Zell-Lymphom (Mycosis fungoides), Thymom, Tubenkarzinom, Tumoren des Auges, Urethrakrebs, Urologische Tumoren, Urothelkarzinom, Vulvakrebs, Warzenbeteiligung, Weichteiltumoren, Weichteilsarkom, Wilms Tumor, Zervixkarzinom und Zungenkrebs.
Bevorzugt sind insbesondere solide Tumoren. Ferner sind bevorzugt Prostatakarzinome, Gehirntumore, Sarkome, Zervix-Karzinome, Ovarialkarzinome, Mammakarzinome, Bronchialkarzinome, Melanome, Kopf-Hals Tumore, Ösophaguskarzinome, Rektumkarzinome, Pankreas-, Blasen- und Nierenkarzinome, Metastasen der Leber, des Gehirns und in Lymphknoten.
Insbesondere bevorzugt ist ferner die Anwendung und der Einsatz des Wirkstofffreisetzungssystems zusammen mit der konventionellen Hyperthermie, Strahlentherapie und/oder zusammen mit der herkömmlichen Chemotherapie.
Die beiden in einer Ausführung des erfindungsgemäßen Wirkstofffreisetzungssystems verwendeten Komponenten könnten sowohl gleichzeitig als auch nacheinander durch Injektion verabreicht werden. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Medikament, im dem die Zusammensetzungen 1 und 2 gleichzeitig oder nacheinander in den Patienten eingebracht werden.
Das erfindungsgemäße Medikament kann so ausgeführt sein, dass die Zusammensetzungen 1 und 2 gleichzeitig oder nacheinander, also in Form eines Kits als separate Produkte konfektioniert, insbesondere durch intratumorale, interstitielle oder intraperitoneale Injektion in den Patienten eingebracht werden. Dabei sind grundsätzlich beide Reihenfolgen möglich. Entweder kann zu einem früheren Zeitpunkt die Zusammensetzung 2 enthaltend den Wirkstoff eingebracht werden, der durch spätere Injektion der Zusammensetzung 1 und anschließende Erwärmung (wie oben beschrieben) abgespalten und somit aktiviert wird. Andersherum kann aber auch zuerst ein Depot der Zusammensetzung 1 in den Körper eingebracht werden und später, ggf. mehrfach, Zusammensetzung 2 mit dem Wirkstoff eingebracht werden, der durch genannte Erwärmung spezifisch freigesetzt werden kann. Dies ist deshalb möglich, da die Nanopartikel der Zusammensetzung 1 über Jahre an einem Ort im Körper verbleiben können, so dass über lange Zeit durch wiederholte Abspaltung von geringen katalytischen Nukleinsäuren immer wieder Wirkstoff aktiviert werden kann.
Für die Onkologie ist bevorzugt, dass das erfindungsgemäße Medikament enthaltend die Zusammensetzungen 1 und/oder die Zusammensetzung 2 bei Entfernung eines Tumors in das Tumorbett bzw. die Resektionshöhle eingebracht werden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ein Medikament, in dem die Zusammensetzungen 1 und 2 bei Entfernung eines Tumors in das Tumorbett eingebracht werden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Freisetzung eines Wirkstoffes von Zusammensetzung 2 wie zuvor beschrieben enthaltend die Schritte:
(i) Einbringen der Zusammensetzung 1 wie zuvor beschrieben in räumliche Nähe von Zusammensetzung 2 unter Bedingungen, welche die Diffusion der freigesetzten, katalytisch aktiven Nukleinsäure zum Substrat-Oligonukleotid sowie desses Spaltung erlauben, und
(ii) aktives oder passives Erwärmen der Zusammensetzung 1 wie zuvor beschrieben, so dass die katalytisch aktive Nukleinsäure freigesetzt wird.
Abbildungen
Abbildung 1 : zeigt die Abspaltung des Fluoreszenzfarbstoffs Alexa-647, der als Modellsubstanz für einen beliebigen Wirkstoff dient, mittels des erfindungsgemäßen Wirkstofffreisetzungssystem. Die mittlere Kurve (-·-) zeigt den Anstieg der Fluoreszenz im Reaktionsüberstand durch freies Alexa-647, welches aus dem Nanopartikel-Wirkstoff-Konjugat nach Aktivierung der katalytisch aktiven RNA Sequenz durch Dehybridisierung bei 49°C freigesetzt wird. Die zweite Kurve von unten zeigt, dass bei 37°C die Dehybridisierung nicht stattfindet, weil keine Erhöhung der Fluoreszenzintensität im Überstand detektiert werden kann. Die unterste Kurve (-■-) zeigt die Negativkontrolle bei Abwesenheit einer katalytischen Nukleinsäure. Die oberste Kurve (-♦-) zeigt die Positivkontrolle, wo das Nanopartikel-Wirkstoff-Konjugat mit dem nicht-inhibierten katalytisch aktiven RNA-Einzelstrang inkubiert wurde.
Abbildung 2: zeigt eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Wirkstofffreisetzungs-systems, bei dem die katalytisch aktive Nukleinsäure und das zu spaltende Substrat-Oligonukleotid mit dem Wirkstoff an zwei verschiedene Nanopartikel gebunden sind. Das Nanopartikel mit seiner Siliziumoxidbeschichtung ist jeweils links als Kugel dargestellt. Über einen Linken ist der Oligonukleotid-Inhibitorstrang an das Nanopartikel gebunden und an die Oligonukleotid-Inhibitorstrang ist die katalytisch aktive Nukleinsäure hybridisiert. In der Mitte ist das Nanopartikel dargestellt, woran über einen Linker das Substrat- Oligonukleotid gebunden ist, welches an seinem andren Ende mit dem Wirkstoff (dargestellt als Stern) verknüpft ist. Danach wird die Anlagerung der freigesetzten katalytisch aktiven Nukleinsäure an das Substrat-Oligonukleotid gezeigt und zum Schluss wird das gespaltene Substrat-Oligonukleotid dargestellt, welches den Wirkstoff freigesetzt hat.
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Wirkstofffreisetzungssystems. Das System besteht aus den Zusammensetzungen 1 und 2, wobei Erwärmung zur Dehybridisierung von Oligonukleotid-Inhibitorstrand und katalytisch aktiver Nukleinsäure führt, die nun freigesetzt wird und sein Substratmolekül enzymatisch spalten kann. Diese Spaltung wiederum setzt den therapeutischen Wirkstoff aus der Zusammensetzung 2 frei und aktiviert ihn somit.
Abbildung 4: Temperaturabhängige Freisetzung des an das Substrat- Oligonukleotid gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffs Alexa-647 von Nanopartikel/(L)- Substrate-Oligonukleotid Konjugaten in Anwesenheit eines Nanopartikel/(L)- Oligonukleotid-Inhibitorstrang/Ribozym Konjugaten in Puffer. Die RFU im Überstand wurde nach 1 , 2, 3 und 4 h Inkubation bei 37°C bzw. 49°C gemessen. Als Positivkontrolle wurde Nanopartikel/(L)-Substrat-Oligonukleotid Konjugate mit freiem L-Ribozyms, als Negativkontrolle nur Nanopartikel/(L)-Substrat- Oligonukleotid Konjugate mit Reaktionspuffer eingesetzt.
Abbildung 5: Temperaturabhängige Freisetzung des an das Substrat- Oligonukleotid gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffs Alexa-647 von Nanopartikel/(L)- Substrate-Oligonukleotid Konjugaten in Anwesenheit eines Nanopartikel/(L)- Oligonukleotid-Inhibitorstrang/Ribozym Konjugaten in humanem Serum. Die RFU im Überstand wurde nach 1 , 2, 3 und 4 h Inkubation bei 37°C bzw. 49°C gemessen. Als Positivkontrolle wurde Nanopartikel/(L)-Substrat-Oligonukleotid Konjugate mit freiem L-Ribozyms, als Negativkontrolle nur Nanopartikel/(L)- Substrat-Oligonukleotid Konjugate mit Reaktionspuffer eingesetzt.
Abbildung 6: Stabilität des L- und R-Ribozyms in Serum. 30 pmol Aliquots des jeweiligen Ribozyms mit 19 bp wurden nach Inkubation in humanem Serum bei 37°C und angegebener Zeit hinsichtlich ihres Abbaus analysiert. Der Abbau der 19 bp RNA wurde in einem 15%igen denaturierenden Polyacrylamidgel nach EtBr- Färbung im UV-Licht dargestellt. Part A zeigt den Abbau innerhalb von 0 - 48 h für das L-Ribozym, Teil B innerhalb von 0 - 180 sec für das R-Ribozym.
Beispiele
Beispiel 1 : Temperaturabhängige Abspaltung des Fluoreszenzfarbstoffs Alexa-647 durch katalytische Nukleinsäuren
Das Beispiel 1 zeigt die temperaturabhängige Abspaltung des Fluoreszenzfarbstoffs Alexa-647 (dient als Modellsubstanz für einen beliebigen Wirkstoff) mittels des beschriebenen Systems. Bei der katalytischen Nukleinsäure handelt es sich um ein Ribozym mit der Sequenz: 5'- GGC UCG ACU GAU GAG GCG C -3' (SEQ ID NO: 1), das mit einem Inhibitor mit der Sequenz: 5'- G CCT CAT CAG TCG AGC C -3' (SEQ ID NO: 2) hybridisiert ist, wobei das 5'- endständige Nukleotid eine SH-Gruppe trägt. Die doppelsträngige RNA ist über die SH-Gruppe und einen Sulfo-SMCC Crosslinker mit einer Aminogruppe des Eisenoxid-Nanopartikels mit Eisenoxidkern, SiO2-Hülle und DIAMO- Oberflächenfunktionalisierung verbunden.
Das Nanopartikel-Wirkstoff-Konjugat besteht aus dem Substrat-Oligonukleotid und kovalent gebundenem Alexa-647 als (Modellsubstanz, bereits gekoppelt bezogen von der Firma IBA, Göttingen) mit der Sequenz: 5'- GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3' (SEQ ID NO: 3), wobei das 5 '-endständige Nukleotid eine SH- Gruppe trägt, das über die SH-Gruppe und einen Sulfo-SMCC-Crosslinker mit einer Aminogruppe des Eisenoxid-Nanopartikels mit Eisenoxidkern, Si02 Hülle und DIAMO-Oberflächenfunktionalisierung verbunden ist.
Die Heizperioden während des Experiments sind in Figur 1 als Balken dargestellt. Die mittlere Kurve (-·-) zeigt den Anstieg der Fluoreszenz im Reaktionsüberstand durch freies Alexa-647, welches aus dem Nanopartikel-Wirkstoff-Konjugat nach Aktivierung der katalytisch aktiven RNA Sequenz durch Dehybridisierung bei 49°C freigesetzt wird. Bei 37°C (zweite Kurve von unten: -A-) findet die Dehybridisierung nicht statt und das Ribozym bleibt inhibiert, daher wird auch keine Erhöhung der Fluoreszenzintensität im Überstand detektiert. Als Negativkontrolle (unterste Kurve: -■-) wurde das Nanopartikel-Wirkstoff-Konjugat (NP-Crosslinker-Substratstrang mit Alexa-647) in Abwesenheit einer katalytischen Nukleinsäure eingesetzt. Als Positivkontrolle (oberste Kurve: -♦-) wurde das Nanopartikel-Wirkstoff-Konjugat mit dem nicht-inhibierten katalytisch aktiven RNA- Einzelstrang inkubiert.
Beispiel 2: Nanopartikel-Nukleinsäure-Kopplung mit Sulfo-SMCC
Analog zu Beispiel 1 wurde Sulfo-SMCC als Linker zur Kopplung zwischen 5 - endständig-Thiol-Gruppen-modifizierten Oligonukleotiden in L-Form und Eisenoxid Nanopartikeln verwendet. Dies wurde für die Substrat-Oligonukleotide und die Oligonukleotid-Inhibitorstrang/Ribozym-Doppelstränge durchgeführt, die vor Kopplung in dem molaren Verhältnis 1 ,1 :1 in PBS (pH 6,7) hybridisiert wurden.
Tabelle 1: Verwendete Nukleotide in L-Form
Ribozym L-RNA 5 -GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3'
SEQ ID NO:1
Oligo-Inhibitor L-DNA 5 -G CCT CAT CAG TCG AGC C-3'
SEQ ID NO:2 Substrat-Oligo L-RNA 5 -GCG CCG AAA CAC CGU GUC j UCG AGC-3'
SEQ ID NO:3 i ist die Schnittstelle im Substrat-Oligonukleotid (Ruffner und Uhlenbeck, 1990).
Die 15 nm Eisenoxid-Nanopartikel enthalten ca. 550 Amin-Gruppen pro Partikel. Die Oligonukleotide wurden zunächst mit 1 mM TCEP (Sigma) reduziert. Zur Kopplung mittels Sulfo-SMCC (Sigma) wurden zunächst die Eisenoxid Nanopartikel mit Sulfo-SMCC mit einer Konzentration von 2,2 mM in PBS (pH 7.4) für 1 h bei Raumtemperatur bei 1.000 rpm (Umdrehungen pro Minute) Inkubation in einem Thermomixer zur Reaktion gebracht. Der Überschuss an Linker wurde per Zentrifuation abgetrennt. Anschließend wurden die Nanopartikel zweimal mit aqua dest. gewaschen. Die reduzierten Oligonukleotide wurden nun in einem molaren Verhältnis von Oligonukleotide zu Nanopartikel von 65:1 hinzugegeben und in PBS (pH 6,7) bei 4°C über Nacht rotierend inkubiert. Nicht-konjugierte Oligonukleotide wurden per Zentrifugation abgetrennt.
Beispiel 3: Freisetzungsexperimente des Ribozym-Nanopartikel- Wirkstofffreisetzungssystems
Nanopartikel/(L)-Substrate-Oligonukleotid* Konjugate und Nanopartikel/(L)- Oligonukleotid-Inhibitorstrang/Ribozym Konjugate wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Die Freisetzungsexperimente wurden in Reaktionspuffer und humanem Serum durchgeführt.
A. In Reaktionspuffer:
Die in Beispiel 2 hergestellten Konjugate wurden in Reaktionspuffer (Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, with 10 mM MgC ) resuspendiert und im Verhältnis 1 :1 in 1 ,5 ml Reaktionsgefäßen gemischt (zwei Ansätze, für 37 °C und 49 °C). Als Positivkontrolle wurde Nanopartikel/(L)-Substrat-Oligonukleotid Konjugate mit 0.625 μΜ des freien L-Ribozyms mit identischer Sequenz aus Tabelle 1 in Reaktionspuffer angesetzt. Entsprechend wurde als Negativkontrolle Nanopartikel/(L)-Substrat-Oligonukleotid Konjugate mit Reaktionspuffer gemischt. Alle vier Reaktionsansätze hatten die gleiche Endkonzentration des Nanopartikel/(L)-Substrat-Oligonukleotid-Konjugats.
Ein Ansatz der Konjugate wurde bei 37°C, der andere bei 49°C im Thermomixer für 1 - 4 h inkubiert. Beide Kontrollen wurden sowohl bei 37°C als auch bei 49°C inkubiert, wobei keine signifikanten Unterschiede beobachtet wurden. Aliquots eines jeden Ansatzes wurden nach 1 , 2, 3 und 4 h genommen und sofort zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die RFU (relative fluorescence unit)-Stärke des Überstands wurde im NanoDrop 3300 Fluorospektrometer (Thermo Scientific) gemessen.
Das Fluoreszenzsignal bei 49 °C zeigte eine deutliche, zeitabhängige Freisetzung des Fluoreszenzfarbstoffes, die bei zunehmender Inkubation fast das Niveau der Positivkontrolle erreichte. Hingegen erfolgte bei der Negativkontrolle wie bei der bei 37°C selbst nach 4 h kaum eine Freisetzung (siehe Abbildung 4).
B. In humanem Serum:
Die in A beschriebenen Experimente wurden anstelle von Reaktionspuffer in humanem Serum in einem Inkubator bei 37 °C bzw. 49°C, 94.5% Luftfeuchtigkeit und 5% C02 wiederholt.
Auch in humanem Serum konnte eine deutliche, zeitabhängige Freisetzung des Fluoreszenzfarbstoffes bei 49 °C beobachtet werden, wobei hier die Freisetzung durch das Ribozym in Anwesenheit des konjugierten Inhibitorstrangs nur etwa halb so stark war wie bei der Positivkontrolle (in Abwesenheit eines Inhibitorstrangs) (siehe Abbildung 5). Ferner war die Freisetzung des Farbstoffes in der Negativkontrolle wie bei dem 37 °C Ansatz gegenüber den entsprechenden Ansätzen in Puffer erhöht (vgl. Abbildung 5 mit Abbildung 4). Beispiel 4: Serum Stabilitätsassay des R- bzw. L-Ribozyms
Die Stabilitätsassays wurden im Wesentlichen wie von Klussmann (1996) beschrieben durchgeführt. Humanes Serum S7023 wurde von Sigma (USA) bezogen. Das L-Ribozym (siehe Tabelle 1) und dessen entsprechende R-Form (jeweils 19 bp) wurden in einer Konzentration von 10 μΜ in 90%igem humanem Serum in einem Inkubator bei 37°C, 94,5% Luftfeuchtigkeit und 5% C02 inkubiert (0 bis 6 h für das L-Ribozym, 0 bis 180 sec für das R-Ribozym). Aliquots wurden im Verhältnis 1 :1 mit Stopplösung (8 M Urea, 50 mM EDTA, 2% SDS) gemischt und sofort in Flüssigstickstoff eingefroren. Die Proben wurden über Microcon YM- 30 (Millipore) Filter gefiltert und jeweils 30 pmol RNA in einem 15%igen denaturierenden Polyacrylamidgel (7M Harnstoff) der Größe nach aufgetrennt. Das Gel wurde in EtBr-Lösung (1 pg/ml) für 15 min gefärbt und unter UV-Licht (302 nm) fotographiert.
Während das L-Ribozym selbst über 48 h Inkubation keine Abbau zeigt (Teil A der Abbildung 6), kann man für das R-Ribozym bereits nach 120 sec im EtBr- gefärbten Gel kein R-Ribozym mehr nachweisen (Teil B der Abbildung 6).
Referenzen
ABU AJAJ, K., GRAESER, R., FICHTNER, I. & KRATZ, F. 2009. In vitro and in vivo study of an albumin-binding prodrug of doxorubicin that is cleaved by cathepsin B. Cancer Chemother Pharmacol., 64, 413-8. Epub 2009 Feb 20.
BOGA, C, FIUME, L, BAGLIONI, M., BERTUCCI, C, FARINA, C, KRATZ, F., MANERBA, M., NALDI, M., DI STEFANO, G., CALDERON, M., GRAESER, R., HAAG, R., ABU AJAJ, K. & FICHTNER, I. 2009. Characterisation of the conjugate of the (6-maleimidocaproyl)hydrazone derivative of doxorubicin with
lactosaminated human albumin by 13C NMR spectroscopy; Development of enzymatically cleavable prodrugs derived from dendritic polyglycerol; In vitro and in vivo study of an albumin-binding prodrug of doxorubicin that is cleaved by cathepsin B. Eur J Pharm Sei., 38, 262-9. Epub 2009 Aug 18.
CALDERON, M., GRAESER, R., KRATZ, F., HAAG, R., ABU AJAJ, K. &
FICHTNER, I. 2009. Development of enzymatically cleavable prodrugs derived from dendritic polyglycerol; In vitro and in vivo study of an albumin-binding prodrug of doxorubicin that is cleaved by cathepsin B. Bioorg Med Chem Lett., 19, 3725-8. Epub 2009 May 18.
CARMI, N., BALKHI, S. R., BREAKER, R. R., SUN, L. Q., CAIRNS, M. J.,
SARAVOLAC, E. G., BAKER, A. & GERLACH, W. L. 1998. Cleaving DNA with DNA; Catalytic nucleic acids: from lab to applications. Proc Natl Acad Sei U S A., 95, 2233-7.
KARKARE, S. & BHATNAGAR, D. 2006. Promising nucleic acid analogs and mimics: characteristic features and applications of PNA, LNA, and morpholino. Appl Microbiol Biotechnol., 71 , 575-86. Epub 2006 May 9.
KLUSSMANN, S., NOLTE, A., BALD, R., ERDMANN, V. A., FURSTE, J. P., RUFFNER, D. E. & UHLENBECK, O. C. 1996. Mirror-image RNA that binds D- adenosine; Thiophosphate interference experiments locate phosphates important for the hammerhead RNA self-cleavage reaction. Nat Biotechnol., 14, 11 12-5.
KRATZ, F., BOGA, C, FIUME, L, BAGLIONI, M., BERTUCCI, C, FARINA, C, MANERBA, M., NALDI, M., DI STEFANO, G., CALDERON, M., GRAESER, R., HAAG, R., ABU AJAJ, K. & FICHTNER, I. 2008. Albumin as a drug carrier: design of prodrugs, drug conjugates and nanoparticles; Characterisation of the conjugate of the (6-maleimidocaproyl)hydrazone derivative of doxorubicin with
lactosaminated human albumin by 13C NMR spectroscopy; Development of enzymatically cleavable prodrugs derived from dendritic polyglycerol; In vitro and in vivo study of an albumin-binding prodrug of doxorubicin that is cleaved by cathepsin B. J Control Release., 132, 171-83. Epub 2008 May 17.
RUFFNER, D. E. & UHLENBECK, O. C. 1990. Thiophosphate interference experiments locate phosphates important for the hammerhead RNA self-cleavage reaction. Nucleic Acids Res., 18, 6025-9.
SANTORO, S. W., JOYCE, G. F., CARMI, N., BALKHI, S. R., BREAKER, R. R., SUN, L Q., CAIRNS, M. J., SARAVOLAC, E. G., BAKER, A. & GERLACH, W. L. 1997. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme; Cleaving DNA with DNA; Catalytic nucleic acids: from lab to applications. Proc Natl Acad Sei U S A., 94, 4262-6.
SEELIG, B., KEIPER, S., STUHLMANN, F. & JASCHKE, A. 2000.
Enantioselective Ribozyme Catalysis of a Bimolecular Cycloaddition Reaction This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant no.: Ja 794/3-1 ) and the Bundesministerium für Bildung und Forschung (Grant no.: BEO 0311861 ). We thank Dr. S. Klussmann and Dr. S. Vonhoff (Noxxon Pharma AG, Berlin) for the synthesis of the L-ribozyme. Angew Chem Int Ed Engl., 39, 4576- 4579.
ZHANG, S. & CHAPUT, J. C. 2010. Synthesis of glycerol nucleic acid (GNA) phosphoramidite monomers and oligonucleotide polymers. Curr Protoc Nucleic Acid Cftem.Chapter, Unit 4.40. Bevorzugte Ausführungsformen sind
1. Ein Wirkstofffreisetzungssystem, bestehend aus einem Nanopartikel,
verbunden mit einem Oligonukleotid-Inhibitorstrang, der mit einer
katalytisch aktiven Nukleinsäure hybridisiert ist, und einem weiteren
Nanopartikel, verbunden mit einem Substrat-Oligonukleotid, das mit einem therapeutischen Wirkstoff verbunden ist, welcher durch Spaltung des Substrat-Oligonukleotids durch die katalytisch aktive Nukleinsäure freisetzbar ist.
2. Ein Wirkstofffreisetzungssystem nach 1 , wobei der Oligonukleotid- Inhibitorstrang über einen Crosslinker an das Nanopartikel gebunden ist.
3. Ein Wirkstofffreisetzungssystem nach 1 oder 2, wobei das Substrat- Oligonukleotid über einen Crosslinker an das Nanopartikel gebunden ist.
4. Ein Wirkstofffreisetzungssystem nach 1 bis 3, wobei die mindestens eine therapeutisch wirksame Substanz ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend anti-proliferative, anti-migrative, anti-angiogene, antithrombotische, antiinflammatorische, antiphlogistische, zytostatische, zytotoxische, anti-koagulative, anti-bakterielle, anti-virale und/oder antimykotische Wirkstoffe, Opioid-Agonisten, Nichtopioid-Analgetika, nichtsteroidal-anti-inflammatorischen (NSAID), Anti-Migräne Mittel, Cox-Il Inhibitoren, ß-adrenergen Blocker, Antikonvulsiva, Antidepressiva, Ca2+- Kanalblocker oder Wirkstoffe für die Behandlung von neuronalen oder neurodegenerativen Krankheiten.
5. Ein Wirkstofffreisetzungssystem nach 4, wobei die mindestens eine
therapeutisch wirksame Substanz ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend Actinomycin D, Aminoglutethimid, Amsacrin, Anastrozol, Antagonisten von Purin- und Pyrimidin-Basen, Anthracycline,
Aromatasehemmer, Asparaginase, Antiöströgene, Bexaroten, Bleomycin, Buselerin, Busulfan, Camptothecin-Derivate, Capecitabin, Carboplatin, Carmustin, Chlorambucil, Cisplatin, Cladribin, Cyclophosphamid, Cytarabin, Cytosinarabinosid, alkylierende Cytostatika, Dacarbazin, Dactinomycin, Daunorubicin, Docetaxel, Doxorubicin (Adriamycin), Doxorubicin lipo, Epirubicin, Estramustin, Etoposid, Exemestan, Fludarabin, Fluorouracil, Folsäureantagonisten, Formestan, Gemcitabin, Glucocorticoide, Goselerin, Hormone und Hormonantagonisten, Hycamtin, Hydroxyharnstoff, Idarubicin, Ifosfamid, Imatinib, Irinotecan, Letrozol, Leuprorelin, Lomustin, Melphalan, Mercaptopurin, Methotrexat, Miltefosin, Mitomycine, Mitosehemmstoffe, Mitoxantron, Nimustine, Oxaliplatin, Paclitaxel, Pentostatin, Procarbazin, Tamoxifen, Temozolomid, Teniposid, Testolacton, Thiotepa, Tioguanin, Topoisomerase-Inhibitoren, Topotecan, Treosulfan, Tretinoin, Triptorelin, Trofosfamide, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinorelbin, zytostatisch wirksame Antibiotika.
Ein Wirkstofffreisetzungssystem nach 4, wobei die mindestens eine therapeutisch wirksame Substanz ausgewählt wird aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren, siRNA, Aminosäuren, Peptide, Proteine,
Kohlenhydrate, Lipide, Glycoproteine, Glycane oder Lipoproteine, wobei die vorgenannten Stoffe anti-proliferative, anti-migrative, anti-angiogene, antithrombotische, antiinflammatorische, antiphlogistische, zytostatische, zytotoxische, anti-koagulative, anti-bakterielle, anti-virale und/oder antimykotische Eigenschaften besitzen.
Verwendung des Wirkstofffreisetzungssystems nach 1 bis 6 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von proliferativen Erkrankungen, Krebs und bakteriellen
Infektionen.
Nanopartikel, welches mit einem Oligonukleotid-Inhibitorstrang verbunden ist, der mit einer katalytisch aktiven Nukleinsäure hybridisiert ist, welche befähigt ist, ein Substrat-Oligonukleotid zu spalten, welches mit einem weiteren Nanopartikel und einem therapeutischen Wirkstoff verbunden ist. Nanopartikel, welches mit einem therapeutischen Wirkstoff und mit einem Substrat-Oligonukleotid verbunden ist, wobei das Substrat-Oligonukleotid durch eine katalytisch aktive Nukleinsäure spaltbar ist.

Claims

Patentansprüche
Wirkstofffreisetzungssystem, enthaltend
i) eine Zusammensetzung 1 , enthaltend mindestens ein Nanopartikel verbunden mit einem Oligonukleotid-Inhibitorstrang, wobei der
Oligonukleotid-Inhibitorstrang mit einer katalytisch aktiven Nukleinsäure hybridisiert ist, und
ii) eine Zusammensetzung 2, enthaltend einen Träger verbunden mit mindestens einem Substratmolekül, wobei das Substratmolekül mit mindestens einem therapeutischen Wirkstoff verbunden ist,
wobei der therapeutische Wirkstoff durch Spaltung des Substratmoleküls freisetzbar ist, wobei die Spaltung des Substratmoleküls durch die katalytisch aktive Nukleinsäure erfolgt.
Wirkstofffreisetzungssystem nach Anspruch 1 , wobei der Oligonukleotid- Inhibitorstrang kovalent, insbesondere über einen Linker 1 , an das
Nanopartikel gebunden ist.
Wirkstofffreisetzungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die katalytisch aktive Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus RNA, DNA, L-RNA, L-DNA und einer modifizierten Nukleinsäure, insbesondere enthaltend ein SH-modifiziertes Nukleotid,
bevorzugt mit einer Länge von 10 bis 100 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von 12 bis 60 Nukleotiden, wobei die katalytisch aktive
Nukleinsäure bevorzugt RNA ist, insbesondere ein Ribozym, insbesondere ein Hammerhead-Ribozym, insbesondere enthaltend die Sequenz 5'-GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3' (SEQ ID NO: 1).
4. Wirkstofffreisetzungssystem nach Anspruch 3, wobei der Linker 1 durch
Reaktion einer Aminogruppe mit einem Crosslinker und der SH-Gruppe des SH-modifizierten Nukleotids am 5'-Ende des Oligonukleotids- Inhibitorstrangs gebildet wird, wobei die Aminogruppe durch
Aminosilanmodifizierung auf der Nanopartikeloberfläche eingebracht wurde und der Crosslinker bevorzugt Sulfo-SMCC oder Sulfo-GMBS ist.
Wirkstofffreisetzungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Oligonukleotid-Inhibitorstrang ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus RNA, DNA, L-RNA, L-DNA und einer modifizierten Nukleinsäure, insbesondere enthaltend ein SH-modifiziertes Nukleotid, bevorzugt mit einer Länge von 10 bis 100 Nukleotiden, insbesondere mit einer Länge von 10 - 60 Nukleotiden, insbesondere enthaltend die Sequenz 5'-G CCT CAT CAG TCG AGC C-3' (SEQ ID NO: 2).
Wirkstofffreisetzungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei in der Zusammensetzung 1 das Verhältnis des Oligonukleotid-Inhibitorstrangs zu der katalytisch aktiven Nukleinsäure 1 , insbesondere 1 bis 2, ist.
Wirkstofffreisetzungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei in der Zusammensetzung 1 das Verhältnis des Oligonukleotid-Inhibitorstrangs mit der Sequenz 5'-G CCT CAT CAG TCG AGC C-3' (SEQ ID NO: 2) zu der katalytisch aktiven Nukleinsäure mit der Sequenz 5'-GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3* (SEQ ID NO: 1 ) 1 ,0 bis 1 ,3, insbesondere ca. 1 ,1 , ist.
Wirkstofffreisetzungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die katalytisch aktive Nukleinsäure unter physiologischen Bedingungen mit dem Oligonukleotid-Inhibitorstrang vollständig hybridisiert vorliegt und bei 43 °C mindestens eine katalytisch aktive Nukleinsäure, bevorzugt 5 %, stärker bevorzugt 10 %, insbesondere 20 % der gebundenen, katalytisch aktiven Nukleinsäuren dehybridisiert.
9. Wirkstofffreisetzungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Nanopartikel einen Kern enthaltend mindestens ein paramagnetisches oder superparamagnetisches Eisenoxid besitzt.
10. Wirkstofffreisetzungssystem nach Anspruch 9, wobei sich das
paramagnetische oder superparamagnetische Nanopartikel im
Wechselmagnetfeld erwärmt.
11. Wirkstofffreisetzungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Nanopartikel mindestens eine Hülle, bevorzugt eine Silanhülle oder eine S1O2- und eine Silanhülle, enthält.
12. Wirkstofffreisetzungssystem nach Anspruch 1 bis 11 , wobei das
Substratmolekül ein Oligonukleotid ist.
13. Wirkstofffreisetzungssystem nach Anspruch 1 bis 12, wobei der Träger ein Polymer, insbesondere ein Biopolymer, ein Si02-Partikel, ein metallisches Partikel, insbesondere ein Goldpartikel, oder ein oxidisches Partikel ist, bevorzugt ein oberflächenmodifiziertes Eisenoxidteilchen,
das als Gel, Micropartikel, Microsphäre oder Nanopartikel, insbesondere als oxidisches Nanopartikel, vorliegt.
14. Wirkstofffreisetzungssystem nach Anspruch 1 bis 13, wobei das
Substratmolekül kovalent, insbesondere über einen Linker 2 kovalent mit dem Träger verbunden ist, wobei der Linker bevorzugt Sulfo-SMCC oder Sulfo-GMBS ist.
15. Wirkstofffreisetzungssystem nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei das Substrat-Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, RNA, L-DNA, L-RNA und einer modifizierten Nukleinsäure, wobei die modifizierte Nukleinsäure bevorzugt eine insbesondere endständige
Kopplungsfunktionalisierung, insbesondere eine Amino-, Thiol-, oder Corboxyl-, Alkin- oder Azid-Funktion, aufweist.
16. Wirkstofffreisetzungssystem nach Anspruch 15, wobei das Substrat- Oligonukleotid eine Länge von 10 bis 00 Nukleotiden aufweist, bevorzugt eine Länge von 15 bis 60 Nukleotiden, stärker bevorzugt eine Länge von 20 bis 30 Nukleotiden, insbesondere enthaltend die Sequenz 5'-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3' (SEQ ID NO: 3).
17. Wirkstofffreisetzungssystem nach Anspruch 1 bis 16, wobei der
therapeutische Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend
Nukleinsäuren, siRNAs, antisense RNAs, Aminosäuren, Aptamere, Peptide, Proteine, Glycoproteine, Kohlenhydrate, Glycane, Lipide, Lipoproteine und niedermolekulare Wirkstoffe, wobei der therapeutische Wirkstoff
insbesondere ein niedermolekularer Wirkstoff ist, und bevorzugt eine antiproliferative, zytostatische, zytotoxische, anti-migrative, anti-angiogene, anti-thrombotische, anti-inflammatorische, anti-phlogistische, anti- koagulative, anti-bakterielle, anti-virale und/oder antimykotische Wirkung, insbesondere eine zytostatische oder zytotoxische Wirkung besitzt, insbesondere wobei der therapeutische Wirkstoff Doxorubicin oder
Methotrexat ist.
18. Wirkstofffreisetzungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei der therapeutische Wirkstoff kovalent, insbesondere über einen Linker 3 kovalent mit dem Substratmolekül verbunden ist.
19. Wirkstofffreisetzungssystem nach Anspruch 18, wobei der Linker 3
ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Aminogruppe und Hydrazon, insbesondere wobei Methotrexat über eine Peptidbindung zwischen der Aminogruppe mit einer Carboxy-Gruppe des Methotrexat gekoppelt ist.
20. Wirkstofffreisetzungssystem nach Anspruch 1 bis 19, wobei der
therapeutische Wirkstoff inaktiv ist, solange er an das Substratmolekül und/oder den Linker 3 gebunden ist, und mit Freisetzung vom Substratmolekül bzw. vom Linker 3 oder nach anschließender Aufnahme durch eine Zelle aktiviert wird.
21. Wirkstofffreisetzungssystem nach Anspruch 1 bis 20, wobei die katalytisch aktive Nukleinsäure, sofern sie vom Oligonukleotid-Inhibitorstrang dissoziiert vorliegt, das Substratmolekül spalten kann,
wobei bevorzugt für die Spaltungsreaktion des Substratmolekül durch die katalytisch aktive Nukleinsäure gilt: die Konzentration des Substratmoleküls ist > KM,
wobei kcat bevorzugt > 0,05/min, stärker bevorzugt >. 0,5/min, besonders bevorzugt > 1/min, insbesondere > 5/min, ist.
22. Wirkstofffreisetzungssystem nach Anspruch 1 bis 21 , wobei das Verhältnis von Zusammensetzung 1 zu Zusammensetzung 2 < 2, bevorzugt < 1 , ist.
23. Wirkstofffreisetzungssystem nach Anspruch 12 bis 21 , wobei der
Oligonukleotid-Inhibitorstrang, die katalytisch aktive Nukleinsäure und das
Substrat-Oligonukleotid gespiegelte Nukleinsäuren sind,
wobei der Oligonukleotid-Inhibitorstrang bevorzugt eine L-DNA ist, insbesondere enthaltend die Sequenz 5'-G CCT CAT CAG TCG AGC C-3'
(SEQ ID NO: 2), die katalytisch aktive Nukleinsäure bevorzugt eine L-RNA ist, insbesondere enthaltend die Sequenz 5'-GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3' (SEQ ID NO: 1), und das Substrat-Oligonukleotid bevorzugt eine L-RNA ist, insbesondere enthaltend die Sequenz 5'-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3' (SEQ ID NO: 3).
24. Zusammensetzung 1 wie näher definiert in einem der Ansprüche 1 bis 11.
25. Zusammensetzung 2 wie näher definiert in einem der Ansprüche 1 oder 12 bis 20.
26. Medikament enthaltend ein Wirkstofffreisetzungssystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26. Medikament enthaltend ein Wirkstofffreisetzungssystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26 zur Behandlung und/oder Prophylaxe von proliferativen Erkrankungen, Krebs, Entzündungserkrankungen, insbesondere
Autoimmunerkrankungen, und bakteriellen Infektionen.
28. Medikament nach Anspruch 27, wobei die Zusammensetzungen 1 und 2 gleichzeitig oder nacheinander in den Patienten eingebracht werden. 29. Medikament nach Anspruch 27, wobei die Zusammensetzungen 1 und 2 bei Entfernung eines Tumors in das Tumorbett eingebracht werden.
Verfahren zur Freisetzung eines Wirkstoffs von Zusammensetzung 2 gemäß einem der Ansprüche 1 oder 12 bis 20, enthaltend die Schritte: i) Einbringen der Zusammensetzung 1 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 in räumliche Nähe von Zusammensetzung 2 unter Bedingungen, die die Diffusion der freigesetzten, katalytisch aktiven Nukleinsäure zum Substrat-Oligonukleotid sowie dessen Spaltung erlauben, und ii) aktives oder passives Erwärmen der Zusammensetzung 1 , so dass die katalytisch aktive Nukleinsäure freigesetzt wird.
PCT/EP2010/007702 2009-12-16 2010-12-16 Temperaturabhängige aktivierung von katalytischen nukleinsäuren zur kontrollierten wirkstofffreisetzung WO2011082796A2 (de)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012129977/10A RU2012129977A (ru) 2009-12-16 2010-12-16 Зависимое от температуры активирование каталитических нуклеиновых кислот для контролируемого высвобождения действующего вещества
CA2784704A CA2784704A1 (en) 2009-12-16 2010-12-16 Temperature-dependent activation of catalytic nucleic acids for controlled active substance release
CN201080056951.0A CN102711727B (zh) 2009-12-16 2010-12-16 用于受控的活性物质释放的催化性核酸的依赖于温度的激活
JP2012543525A JP2013514289A (ja) 2009-12-16 2010-12-16 制御された活性物質放出のための触媒核酸の温度依存的活性化の方法
US13/515,173 US9517272B2 (en) 2009-12-16 2010-12-16 Temperature dependent activation of catalytic nucleic acids for controlled active substance release
EP10796285A EP2512441A2 (de) 2009-12-16 2010-12-16 Temperaturabhängige aktivierung von katalytischen nukleinsäuren zur kontrollierten wirkstofffreisetzung
AU2010341118A AU2010341118A1 (en) 2009-12-16 2010-12-16 Temperature-dependent activation of catalytic nucleic acids for controlled active substance release

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102009058769.1 2009-12-16
DE102009058769A DE102009058769A1 (de) 2009-12-16 2009-12-16 Temperaturabhängige Aktivierung von katalytischen Nukleinsäuren zur kontrollierten Wirkstofffreisetzung
US28247110P 2010-02-16 2010-02-16
US61/282,471 2010-02-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2011082796A2 true WO2011082796A2 (de) 2011-07-14
WO2011082796A3 WO2011082796A3 (de) 2012-05-03

Family

ID=44305853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2010/007702 WO2011082796A2 (de) 2009-12-16 2010-12-16 Temperaturabhängige aktivierung von katalytischen nukleinsäuren zur kontrollierten wirkstofffreisetzung

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9517272B2 (de)
EP (1) EP2512441A2 (de)
JP (1) JP2013514289A (de)
CN (1) CN102711727B (de)
AU (1) AU2010341118A1 (de)
CA (1) CA2784704A1 (de)
DE (1) DE102009058769A1 (de)
RU (1) RU2012129977A (de)
WO (1) WO2011082796A2 (de)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012119775A1 (de) 2011-03-10 2012-09-13 Magforce Ag Computergestütztes simulationswerkzeug zur unterstützung bei der planung einer thermotherapie
WO2013020701A2 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Magforce Ag Agglomerating magnetic alkoxysilane-coated nanoparticles
EP2560687B1 (de) * 2010-04-19 2017-05-24 Nlife Therapeutics S.L. Zusammensetzungen und verfahren zur selektiven abgabe von oligonukleotidmolekülen an spezifische neuronentypen
JP2018138590A (ja) * 2011-09-07 2018-09-06 エックス−ケム インコーポレイテッド Ｄｎａコードライブラリーをタグ付けするための方法
WO2021152136A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Magforce Ag Paste comprising magnetic alkoxysilane-coated metal containing nanoparticles
US11674135B2 (en) 2012-07-13 2023-06-13 X-Chem, Inc. DNA-encoded libraries having encoding oligonucleotide linkages not readable by polymerases

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010026638A1 (ja) * 2008-09-04 2010-03-11 株式会社ナノセラピー研究所 抗制御性ｔ細胞抗体と磁性微粒子を含む悪性腫瘍の温熱治療用キット、及びその温熱治療法
EP2396459B1 (de) 2009-02-13 2017-05-03 X-Chem, Inc. Verfahren zur erstellung und durchsuche von dna-kodierten bibliotheken
DE102009058769A1 (de) * 2009-12-16 2011-06-22 MagForce Nanotechnologies AG, 10589 Temperaturabhängige Aktivierung von katalytischen Nukleinsäuren zur kontrollierten Wirkstofffreisetzung
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
DE19177059T1 (de) 2010-10-01 2021-10-07 Modernatx, Inc. N1-methyl-pseudouracile enthältendes ribonucleinsäuren sowie ihre verwendungen
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
EP3929965A1 (de) * 2011-06-20 2021-12-29 Crystalplex Corporation Stabilisierte nanokristalle
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
JP6113737B2 (ja) 2011-10-03 2017-04-12 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 修飾型のヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸、ならびにそれらの使用方法
MX2014007233A (es) 2011-12-16 2015-02-04 Moderna Therapeutics Inc Composiciones de nucleosidos, nucleotidos y acidos nucleicos modificados.
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
EP2834259A4 (de) 2012-04-02 2016-08-24 Moderna Therapeutics Inc Modifizierte polynukleotide
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
CA2892529C (en) 2012-11-26 2023-04-25 Moderna Therapeutics, Inc. Terminally modified rna
DK2928453T3 (da) * 2012-12-05 2017-11-20 Yissum Res Dev Co Of Hebrew Univ Jerusalem Ltd Nanoporøst substrat med genkendelsesfrigivelse og indeholdende aktive midler samt fremgangsmåder til fremstilling og anvendelser deraf
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
EP3041934A1 (de) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Chimäre polynukleotide
EP3041938A1 (de) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Kreisförmige polynukleotide
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
TW201525088A (zh) * 2013-12-20 2015-07-01 Sicpa Holding Sa 熱發光複合顆粒及包含其之標記
US20170204152A1 (en) 2014-07-16 2017-07-20 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2016014846A1 (en) 2014-07-23 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
HRP20220872T1 (hr) 2015-10-22 2022-12-23 Modernatx, Inc. Cjepiva protiv respiratornih virusa
EP3394093B1 (de) 2015-12-23 2022-01-26 Modernatx, Inc. Verfahren zur verwendung von ox40-ligand-codierenden polynukleotiden
MA43587A (fr) 2016-01-10 2018-11-14 Modernatx Inc Arnm thérapeutiques codant pour des anticorps anti-ctla-4
CA3147643A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating hepatocyte nuclear factor 4-alpha (hnf4.alpha.) gene expression
EP4048807A1 (de) 2019-09-23 2022-08-31 Omega Therapeutics, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur modulation von apolipoprotein-b(apob)-genexpression
EP3805242A1 (de) * 2019-10-07 2021-04-14 Sterna Biologicals GmbH & Co. KG Verfahren zur herstellung eines katalytisch aktiven dna-moleküls mit verbesserter aktivität und dessen verwendung in einem verfahren zur behandlung von asthma
US20230134868A1 (en) * 2019-11-30 2023-05-04 Kangma-Healthcode (Shanghai) Biotech Co., Ltd Biomagnetic microsphere and preparation method therefor and use thereof
CA3173528A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
EP4367242A2 (de) 2021-07-07 2024-05-15 Omega Therapeutics, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur modulation der genexpression des sekretierten frizzled-rezeptorproteins 1 (sfrp1)
WO2023161350A1 (en) 2022-02-24 2023-08-31 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
CN116854875B (zh) * 2023-07-07 2024-01-23 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种核酸响应型COFs纳米晶体材料及其制备方法和应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997038058A1 (de) 1996-04-10 1997-10-16 Institut Für Neue Materialien Gem. Gmbh Verfahren zur herstellung agglomeratfreier nanoskaliger eisenoxidteilchen mit hydrolysebeständigem überzug
WO1998058673A1 (de) 1997-06-20 1998-12-30 Institut Für Neue Materialien Gem. Gmbh Nanoskalige teilchen mit einem von mindestens zwei schalen umgebenen eisenoxid-haltigen kern
US6048515A (en) 1994-08-04 2000-04-11 Institut Fur Diagnostikforschung Gmbh Iron-containing nanoparticles with double coating and their use in diagnosis and therapy
WO2001010501A1 (de) 1999-08-07 2001-02-15 Mfh Hyperthermiesysteme Gmbh Magnetfeldapplikator zur aufheizung von magnetischen oder magnetisierbaren substanzen oder festkörpern in biologischem gewebe
WO2001010500A1 (de) 1999-08-07 2001-02-15 Mfh Hyperthermiesysteme Gmbh Magnetfeldapplikator zur aufheizung von magnetischen oder magnetisierbaren substanzen oder festkörpern in biologischem gewebe
US20030219422A1 (en) 2001-11-15 2003-11-27 Noxxon Pharma Ag Allosteric ribozymes and uses thereof
WO2006108405A2 (de) 2005-04-12 2006-10-19 Magforce Nanotechnologies Ag Nanopartikel-wirkstoff-konjugate
WO2009086824A2 (de) 2008-01-09 2009-07-16 Magforce Nanotechnologies Ag Magnetische transducer
WO2009100716A2 (de) 2008-02-11 2009-08-20 Magforce Nanotechnologies Ag Implantierbare nanopartikel-enthaltende produkte
WO2009118091A1 (de) 2008-03-28 2009-10-01 Magforce Nanotechnologies Ag Magnetwechselfeld-applikationsvorrichtung zur aufheizung von magnetischen oder magnetisierbaren substanzen in biologischem gewebe
DE102009007929A1 (de) 2009-02-06 2010-08-12 Freie Universität Berlin Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Nebenwirkungen durch Gabe von Spiegelmeren

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998008856A2 (de) 1996-08-30 1998-03-05 Fuerste Jens Peter Spiegelselektion und spiegelevolution von nucleinsäuren
JP2002518521A (ja) * 1998-06-20 2002-06-25 ワシントン・ユニバーシティ 医用画像解析、診断および治療のための膜透過性ペプチド錯体
JP2005523890A (ja) * 2001-10-18 2005-08-11 エッセンシア・バイオシステムズ・インコーポレイテッド 制御放出のための組成物および方法
AU2003245455A1 (en) 2002-06-13 2003-12-31 Amgen Inc. Hammerhead ribozymes
DE10350248A1 (de) 2003-10-28 2005-06-16 Magnamedics Gmbh Thermosensitive, biokompatible Polymerträger mit veränderbarer physikalischer Struktur für die Therapie, Diagnostik und Analytik
CA2553647A1 (en) 2004-01-20 2005-08-04 Alnis Biosciences, Inc. Articles comprising magnetic material and bioactive agents
EP1737879B1 (de) * 2004-04-19 2012-10-10 Archemix LLC Aptamer-vermittelte intrazelluläre verabreichung von therapeutischen oligonukleotiden
EP2117595A2 (de) * 2006-12-08 2009-11-18 Massachusetts Institute of Technology Fernausgelöste freisetzung von erwärmbaren oberflächen
AU2010211370A1 (en) 2009-02-06 2011-09-29 Freie Universitat Berlin Pharmaceutical composition containing L-ribozyme for treating adverse reactions by administering Spiegelmers
DE102009058769A1 (de) * 2009-12-16 2011-06-22 MagForce Nanotechnologies AG, 10589 Temperaturabhängige Aktivierung von katalytischen Nukleinsäuren zur kontrollierten Wirkstofffreisetzung
DE102010056610A1 (de) 2010-12-31 2012-07-05 Volker A. Erdmann Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend L-DNA

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6048515A (en) 1994-08-04 2000-04-11 Institut Fur Diagnostikforschung Gmbh Iron-containing nanoparticles with double coating and their use in diagnosis and therapy
WO1997038058A1 (de) 1996-04-10 1997-10-16 Institut Für Neue Materialien Gem. Gmbh Verfahren zur herstellung agglomeratfreier nanoskaliger eisenoxidteilchen mit hydrolysebeständigem überzug
WO1998058673A1 (de) 1997-06-20 1998-12-30 Institut Für Neue Materialien Gem. Gmbh Nanoskalige teilchen mit einem von mindestens zwei schalen umgebenen eisenoxid-haltigen kern
WO2001010501A1 (de) 1999-08-07 2001-02-15 Mfh Hyperthermiesysteme Gmbh Magnetfeldapplikator zur aufheizung von magnetischen oder magnetisierbaren substanzen oder festkörpern in biologischem gewebe
WO2001010500A1 (de) 1999-08-07 2001-02-15 Mfh Hyperthermiesysteme Gmbh Magnetfeldapplikator zur aufheizung von magnetischen oder magnetisierbaren substanzen oder festkörpern in biologischem gewebe
US20030219422A1 (en) 2001-11-15 2003-11-27 Noxxon Pharma Ag Allosteric ribozymes and uses thereof
WO2006108405A2 (de) 2005-04-12 2006-10-19 Magforce Nanotechnologies Ag Nanopartikel-wirkstoff-konjugate
WO2009086824A2 (de) 2008-01-09 2009-07-16 Magforce Nanotechnologies Ag Magnetische transducer
WO2009100716A2 (de) 2008-02-11 2009-08-20 Magforce Nanotechnologies Ag Implantierbare nanopartikel-enthaltende produkte
WO2009118091A1 (de) 2008-03-28 2009-10-01 Magforce Nanotechnologies Ag Magnetwechselfeld-applikationsvorrichtung zur aufheizung von magnetischen oder magnetisierbaren substanzen in biologischem gewebe
DE102009007929A1 (de) 2009-02-06 2010-08-12 Freie Universität Berlin Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Nebenwirkungen durch Gabe von Spiegelmeren

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABU AJAJ, K.; GRAESER, R.; FICHTNER; KRATZ, F: "In vitro and in vivo study of an albumin-binding prodrug of doxorubicin that is cleaved by cathepsin B", CANCER CHEMOTHER PHARMACOL., vol. 64, 20 February 2009 (2009-02-20), pages 413 - 8
BOGA, C.; FIUME, L.; BAGLIONI, M.; BERTUCCI, C.; FARINA, C.; KRATZ, F.; MANERBA, M.; NALDI, M.; DI STEFANO, G.; CALDERON, M., EUR J PHARM SCI., vol. 38, 2009, pages 262 - 9
CALDERON, M.; GRAESER, R.; KRATZ, F.; HAAG, R.; ABU AJAJ, K.; FICHTNER: "Development of enzymatically cleavable prodrugs derived from dendritic polyglycerol; In vitro and in vivo study of an albumin-binding prodrug of doxorubicin that is cleaved by cathepsin B", BIOORG MED CHEM LETT., vol. 19, 18 May 2009 (2009-05-18), pages 3725 - 8
CARMI, N.; BALKHI, S. R.; BREAKER, R. R.; SUN, L. Q.; CAIRNS, M. J.; SARAVOLAC, E. G.; BAKER, A.; GERLACH, W. L.: "Cleaving DNA with DNA; Catalytic nucleic acids: from lab to applications", PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 95, 1998, pages 2233 - 7
KARKARE, S.; BHATNAGAR, D.: "Promising nucleic acid analogs and mimics: characteristic features and applications of PNA, LNA, and morpholino", APPL MICROBIO BIOTECHNOL., vol. 71, 9 May 2006 (2006-05-09), pages 575 - 86
KLUSSMANN, S.; NOLTE, A.; BALD, R.; ERDMANN, V. A.; FURSTE, J. P.; RUFFNER, D. E.; UHLENBECK, O. C.: "Mirror-image RNA that binds D-adenosine; Thiophosphate interference experiments locate phosphates important for the hammerhead RNA self-cleavage reaction", NAT BIOTEEHNOL., vol. 14, 1996, pages 1112 - 5
KRATZ, F.; BOGA, C.; FIUME, L.; BAGLIONI, M.; BERTUCCI, C.; FARINA, C.; MANERBA, M.; NALDI, M.; DI STEFANO, G.; CALDERON, M., J CONTROL RELEASE., vol. 132, 2008, pages 171 - 83
RUFFNER, D. E.; UHLENBECK, O. C.: "Thiophosphate interference experiments locate phosphates important for the hammerhead RNA self-cleavage reaction", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 18, 1990, pages 6025 - 9
SANTORO, S. W.; JOYCE, G. F.; CARMI, N.; BALKHI, S. R.; BREAKER, R. R.; SUN, L. Q.; CAIRNS, M. J.; SARAVOLAC, E. G.; BAKER, A.; GE: "A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme; Cleaving DNA with DNA; Catalytic nucleic acids: from lab to applications", PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 94, 1997, pages 4262 - 6
SEELIG, B.; KEIPER, S.; STUHLMANN, F.; JASCHKE, A., ANGEW CHEM INT ED ENGL., vol. 39, 2000, pages 4576 - 4579
ZHANG, S.; CHAPUT, J. C.: "Curr Protoc Nucleic Acid Chem.", 2010, article "Synthesis of glycerol nucleic acid (GNA) phosphoramidite monomers and oligonucleotide polymers"

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2560687B1 (de) * 2010-04-19 2017-05-24 Nlife Therapeutics S.L. Zusammensetzungen und verfahren zur selektiven abgabe von oligonukleotidmolekülen an spezifische neuronentypen
EP3231446A1 (de) * 2010-04-19 2017-10-18 Nlife Therapeutics S.L. Zusammensetzungen und verfahren zur selektiven abgabe von oligonukleotidmolekülen an spezifische neuronentypen
US8949088B2 (en) 2011-03-10 2015-02-03 Magforce Ag Computer-aided simulation tool for providing assistance in the planning of thermotherapy
WO2012119775A1 (de) 2011-03-10 2012-09-13 Magforce Ag Computergestütztes simulationswerkzeug zur unterstützung bei der planung einer thermotherapie
US9844680B2 (en) 2011-03-10 2017-12-19 Magforce Ag Computer-aided simulation tool for providing assistance in the planning of thermotherapy
EP3038115A1 (de) 2011-08-10 2016-06-29 MagForce AG Agglomeration magnetischer alkoxysilanbeschichteter nanopartikel
US9408912B2 (en) 2011-08-10 2016-08-09 Magforce Ag Agglomerating magnetic alkoxysilane-coated nanoparticles
DE202012012795U1 (de) 2011-08-10 2013-11-21 Magforce Ag Agglomerierende Magnetische alkoxysilan-beschichtete Nanopartikel
WO2013020701A2 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Magforce Ag Agglomerating magnetic alkoxysilane-coated nanoparticles
US9962442B2 (en) 2011-08-10 2018-05-08 Magforce Ag Agglomerating magnetic alkoxysilane-coated nanoparticles
JP2018138590A (ja) * 2011-09-07 2018-09-06 エックス−ケム インコーポレイテッド Ｄｎａコードライブラリーをタグ付けするための方法
US11674135B2 (en) 2012-07-13 2023-06-13 X-Chem, Inc. DNA-encoded libraries having encoding oligonucleotide linkages not readable by polymerases
WO2021152136A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Magforce Ag Paste comprising magnetic alkoxysilane-coated metal containing nanoparticles

Also Published As

Publication number Publication date
AU2010341118A1 (en) 2012-07-19
CN102711727B (zh) 2015-03-18
CN102711727A (zh) 2012-10-03
US20130102545A1 (en) 2013-04-25
DE102009058769A1 (de) 2011-06-22
EP2512441A2 (de) 2012-10-24
RU2012129977A (ru) 2014-01-27
JP2013514289A (ja) 2013-04-25
DE102009058769A8 (de) 2012-04-05
US9517272B2 (en) 2016-12-13
CA2784704A1 (en) 2011-07-14
WO2011082796A3 (de) 2012-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2512441A2 (de) Temperaturabhängige aktivierung von katalytischen nukleinsäuren zur kontrollierten wirkstofffreisetzung
EP1871423B1 (de) Nanopartikel-wirkstoff-konjugate
CN102666879B (zh) 模板化的纳米缀合物
JP6983150B2 (ja) 治療剤を含む治療用ナノ粒子ならびにそれを作製および使用する方法
JP5887648B2 (ja) Ｒｎａ干渉効果が高い脂質修飾２本鎖ｒｎａ
Modi et al. Advances in the treatment of neurodegenerative disorders employing nanotechnology
CN109477109A (zh) 靶向人lmna的寡核苷酸类似物
JP5969164B2 (ja) 電荷結合と生分解性共有結合により同時に連結された高分子−ｓｉＲＮＡナノ粒子担体及びその製造方法
KR20180116479A (ko) 올리고뉴클레오티드 관능화된 나노입자의 전달
JPH08511418A (ja) 生分解性極微粒子からのアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドの徐放運搬による長期作用のある処置
WO2009123185A1 (ja) Rna干渉効果が高い2本鎖脂質修飾rna
EP2986556A1 (de) Nicht-immunogene und nukleaseresistente nukleinsäure-origami-elementen und zusammensetzungen daraus
WO2019070890A1 (en) SPHERICAL NUCLEIC ACIDS (SNAs) WITH PEG LAYERS THAT CAN BE REMOVED
DE60208400T2 (de) Therapeutisch verwendbare triethylenglykol-cholesteryl-oligonukleotide
Maslov et al. Synthesis and transfection activity of novel galactosylated polycationic lipid

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201080056951.0

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 5243/DELNP/2012

Country of ref document: IN

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2784704

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012543525

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010341118

Country of ref document: AU

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2010796285

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010796285

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012129977

Country of ref document: RU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2010341118

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20101216

Kind code of ref document: A

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10796285

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13515173

Country of ref document: US