CN102711727B - 用于受控的活性物质释放的催化性核酸的依赖于温度的激活 - Google Patents

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Abstract

本发明的目标为包含两种复合物的活性物质释放系统。第一复合物包含与寡核苷酸抑制剂链相连接的纳米颗粒，所述寡核苷酸抑制剂链与具有催化活性的核酸杂交。第二复合物包含与底物分子相连接的载体，所述底物分子与治疗性活性物质相偶联。通过外部刺激，所述第一复合物的该具有催化活性的核酸被释放出来，并与所述第二复合物的该底物分子特异性地结合。这导致所述底物分子的切割，由此释放出与其结合的活性物质。

Description

用于受控的活性物质释放的催化性核酸的依赖于温度的激活
本发明描述了一种活性物质释放系统，其通过具有催化活性的核酸来运作。在第一步中，该具有催化活性的核酸通过外部刺激而从与纳米颗粒相结合的寡核苷酸抑制剂链上释放。在第二步中，释放出的具有活性的核酸与其底物（纳米颗粒-活性物质缀合物）相结合，由此释放出共价地、静电地、配位地或离子地结合的活性物质或者嵌入的活性物质。
专利申请WO2006/108405被确定为最接近的现有技术并且涉及纳米颗粒，其中治疗有效的物质与所述纳米颗粒相结合，并且其中所述治疗有效的物质从所述纳米颗粒上的脱落通过交变磁场引起或起始。但是，已证明，活性物质从纳米颗粒上的直接热释放对于在相对较小的温度升高下达到所释放出的活性物质的治疗有效浓度（例如在肿瘤细胞中）来说经常不是足够有效的。
现在，本发明的任务是提供一种方法和合适的用于该方法的具有偶联的活性物质的复合物，其使得能够在小的温度升高下就使活性物质显量释放，并因此相比于在WO2006/108405中所公开的方法而言导致进一步的效率提高。
本发明通过提供一种活性物质释放系统而解决了该任务，所述活性物质释放系统包含复合物1和复合物2，其中复合物1借助于具有催化活性的核酸的温度诱导的释放而被激活，并且其中所述具有催化活性的核酸反过来从第二复合物中催化释放出所述活性物质。如在实施例中所表明的，这例如借助于作为具有催化活性的核酸的L-RNA来实现，其中所述具有催化活性的核酸在生理条件下以与以抑制剂形式的L-DNA杂交的状态存在。在人血清中的稳定性测试之中，该复合体是长时间稳定的。此外，通过使用L-核酸可以排除与存在于靶生物体中的天然（例如内源性）核酸酶的相互作用。通过寡核苷酸抑制剂链的碱基序列和长度来调整与所述颗粒相结合的缀合物的解链温度，从而使得在生理条件下不发生解杂交（在本发明的范围内是指38℃，也就是比正常体温稍高的温度）。因此，在体温的情况下，所述双链是稳定的，从而完全抑制了所述催化性核酸。然而，如果使所述颗粒升温，例如通过在交变磁场中的磁感应，那么所述催化性核酸就从所述抑制剂DNA上解杂交，这导致所述双链的解开，并且释放出具有催化活性的核酸。现在这些具有催化活性的核酸可以酶促切割第二复合物了，所述第二复合物包含载体，所述载体通过用作所述催化性核酸的底物的分子与治疗性活性物质相连接。通过所述切割，释放出所述活性物质，其因此可以发挥其作用。
因此，在第一个方面，本发明涉及活性物质释放系统，其包含：复合物1，其包含至少一个与寡核苷酸抑制剂链相连接的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸抑制剂链与具有催化活性的核酸杂交；和复合物2，其包含与至少一个底物分子相连接的载体，其中所述底物分子与至少一个治疗性活性物质相连接，其中所述治疗性活性物质可通过所述底物分子的切割而释放，其中所述底物分子的切割通过所述具有催化活性的核酸来实现。
特别地，本发明涉及活性物质释放系统，其由下列构成：与寡核苷酸抑制剂链相连接的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸抑制剂链与具有催化活性的核酸杂交；和与底物寡核苷酸相连接的另外的纳米颗粒，其中所述底物寡核苷酸与治疗性活性物质相连接，所述治疗性活性物质可通过由所述具有催化活性的核酸切割所述底物寡核苷酸而释放。
定义：
术语“特异性地”是指，所述具有催化活性的核酸优选地仅对所述底物寡核苷酸起作用并切割它，而对其他寡核苷酸不显示活性。
术语“生理条件”是指，在靶生物体中，优选地在人生物体中，在各靶组织中于细胞内或细胞外存在的物理化学条件。
术语“基本上没有活性物质的解裂”是指，少量释放的活性物质在靶组织中不引起不利反应。特别地，这意味着，在释放试验（例如实施例3A）中，在4小时（h）的时间段期间，释放出少于10%，特别优选地少于1%，和特别地少于0.5%的所使用的活性物质。
术语“催化性核酸”或“具有催化活性的核酸”是指诸如“DNA核酶（DNAzyme）”、核酶、经修饰的核酸以及核酸类似物的核酸分子，其可以无需蛋白质组分的参与而特异性地催化化学反应。对于该方法，不仅可以使用天然存在的催化性核酸，而且还可以使用通过进化方法（例如SELEX）而产生的核酸。此外，可以借助于自动化固相合成来制备催化性核酸。
术语“通过交变磁场引起或起始”是指，交变磁场或脉冲直接引起释放或脱落，或者释放或脱落间接地（例如通过酶的激活或热的产生）被引起。
术语“完全杂交”是指，所使用的具有催化活性的核酸的所有分子都以杂交状态存在。由于根据本发明优选地用过量的抑制剂链进行运作，因而在完全杂交的情况下，寡核苷酸抑制剂链可以以游离状态存在。
术语“大约”是指，±5%的偏差，特别地±1%的偏差。
特别地，本发明涉及活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链共价地，特别是通过交联剂（连接体1），与所述纳米颗粒相结合。
连接体1，以及后来引入的连接体2和连接体3，可以要么直接地由在纳米颗粒（或载体）和寡核苷酸之间的两个官能团共价地形成。优选地，其可以由肽键、三唑环或二硫桥组成，或者通过其他二聚化反应、缩合反应、烷基化反应或Click反应而形成。此外，它们可以由同双官能交联剂或异双官能交联剂组成，所述交联剂插入在寡核苷酸的官能团和纳米颗粒（或载体）的官能团或反应性表面之间。为此，可能必要的是，通过在寡核苷酸合成中使用经修饰的核苷酸，而为其提供用于寡核苷酸的偶联的所需的官能团。优选地，将该经修饰的核苷酸在末端处掺入到所述寡核苷酸中。
所使用的交联剂在生理条件下是不可切割的。
根据它们携带何种反应基团，对于根据本发明的连接体1、连接体2和连接体3，可以区分出不同的交联剂类群。异双官能交联剂具有两个不同的反应性末端，由此可能的是，顺次进行缀合并因此避免不希望的分子内副反应。例如，磺基-SMCC（4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷-1-羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯）、磺基-NHS（N-羟基磺基琥珀酰亚胺）、EDC（1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐）或磺基-LC-SPDP（3-(2-吡啶基联硫基)-丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯）属于异双官能交联剂类群。
磺基-SMCC
磺基-NHS
EDC
磺基-LC-SPDP
特别地，使用交联剂磺基-SMCC或磺基-GMBS，使在纳米颗粒表面上的通过氨基硅烷修饰而引入的氨基基团与在抑制剂寡核苷酸的5’-末端处的SH基团进行反应。
在根据本发明的活性物质释放系统中，复合物1包含具有催化活性的核酸和寡核苷酸抑制剂链，所述寡核苷酸抑制剂链例如通过双官能交联剂（例如磺基-SMCC）共价结合至颗粒表面。催化性核酸和抑制剂链的碱基序列在生理条件下以完全杂交的状态存在，这通过从很大程度互补至完全互补的碱基序列来达到。
在此，所述具有催化活性的核酸和/或所述寡核苷酸抑制剂链选自RNA、DNA、L-RNA或L-DNA或者经修饰的核酸。经修饰的核酸例如是这样的，其具有相比于相应的天然存在的核酸而言更低的核酸酶敏感性。经修饰的核酸的例子为LNA、PNA、吗啉代（Karkare和Bhatnagar,2006）或GNA（Zhang和Chaput,2010）。L-核酶例如描述在Seelig等人(2000)、US 2003219422和DE 10 2009 007929中。此外，如上面所描述的，可以借助于经修饰的核酸，将用于偶联的官能团引入到寡核苷酸中，其优选地在末端处掺入。特别地，插入SH-修饰的核苷酸。在合成中，这种SH-修饰的核苷酸优选地在末端处，特别地在寡核苷酸的5’-末端处插入。然后，这可以例如借助于交联剂磺基-SMCC或磺基-GMBS而与经氨基硅烷修饰的纳米颗粒的氨基基团相偶联。
特别地，本发明涉及活性物质释放系统，其中所述连接体1通过氨基基团与交联剂和在所述寡核苷酸抑制剂链的5’-末端处的SH-修饰的核苷酸的SH基团的反应而形成，其中所述氨基基团通过在纳米颗粒表面上的氨基硅烷修饰而引入，并且所述交联剂优选地为磺基-SMCC或磺基-GMBS。
所述具有催化活性的核酸优选地具有10至100个核苷酸的长度，特别地12至60个核苷酸的长度。合适的催化性核酸是现有技术中已知的。如果需要，这种催化性核酸在其5’-末端或3’-末端处还要延长，以便调整出合适的杂交温度或者掺入经修饰的核酸。
作为具有催化活性的核酸，优选地使用RNA或DNA。在自然界中，具有催化活性的核酸分子具有序列特异性。这种序列特异性归因于特异的碱基配对，所述特异的碱基配对在该催化性核酸和该底物寡核苷酸之间的切割位点附近形成。理论上，可以如此来构建具有催化活性的核酸，从而使得可以以序列特异性的行为和方式剪切每个核苷酸序列。
除了天然存在的催化性核酸例如锤头状核酶、发夹型核酶、核糖核酸酶P和肝炎δ病毒核酶外，还开发了一系列合成的RNA分子，其催化活性作为近些年体外选择技术的发展结果而显著地增加（Carmi等人,1998）。在这方面，“DNA核酶”是生物技术发展的较新产品。在此，专门地通过体外选择过程来获得这样的具有催化活性的DNA分子。它们不仅可以切割DNA，而且可以切割RNA。这样的具有RNA酶活性的分子为例如10-23DNAzym（Santoro等人,1997）。
在另一个实施方案中，本发明涉及活性物质释放系统，其中所述具有催化活性的核酸选自RNA、DNA、L-RNA、L-DNA和经修饰的核酸，其中该具有催化活性的核酸特别地包含SH-修饰的核苷酸，其中该具有催化活性的核酸优选地具有10至100个核苷酸的长度，和特别地12至60个核苷酸的长度，其中该具有催化活性的核酸优选地为RNA，特别是核酶，特别是锤头状核酶，和其特别地包含序列5’-GGC UCG ACUGAU GAG GCG C-3’（SEQ ID NO:1）。
根据本发明的催化性核酸尤其为锤头状核酶、发夹型核酶、核糖核酸酶P和肝炎δ病毒核酶，以及从其衍生的核酶类似物和其他合成的核酶和“DNA核酶”。在此，本发明的一个特别优选的实施方案为锤头状核酶。
天然存在的锤头状核酶，例如来自植物病毒的锤头状核酶，通常由可自我切割的单个RNA分子组成。在此，该序列最小由三个双螺旋组成，所述双螺旋通过具有保守序列的短连接体而相互连接。在此，保守的“尿苷转角”将螺旋1与螺旋2连接在一起。螺旋2和螺旋3通过序列GAAA相互连接。此外，锤头状核酶包含至少一个环。
根据一个特别优选的实施方案，所述具有催化活性的核酸为L-RNA、L-DNA和/或经修饰的核酸。“经修饰的核酸”是指例如这样的，其具有更低的核酸酶敏感性。此外，可以使用经修饰的核酸，以便将合适的偶联基团引入到寡核苷酸中。
特别优选的是核酶，特别是锤头状核酶。特别优选的催化性核酸包含序列5’-GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3’（SEQ ID NO:1）。
根据普通的专业技能，与具有催化活性的核酸相适合地来构建寡核苷酸抑制剂链。相应地，所述活性物质释放系统的所述寡核苷酸抑制剂链同样也为RNA或DNA，特别是L-RNA、L-DNA和/或经修饰的核酸（其具有更低的核酸酶敏感性）。
与具有活性的核酸相适合地，所述抑制剂链优选地具有10至100个核苷酸的长度，特别地10至60个核苷酸的长度，和特别地，它包含序列5’-G CCT CAT CAG TCG AGC C-3’（SEQ ID NO:2）。
作为寡核苷酸抑制剂链，优选地使用具有10至100个核苷酸的长度，特别地具有10至60个核苷酸的长度的核酸。所选择的>10个核苷酸的长度是由于杂交稳定性而造成的，<100个核苷酸的选择受制于在长的寡核苷酸的合成制备中的高成本。原则上，如此地选择抑制剂寡核苷酸，从而它在生理条件下基于其碱基配对而以与催化性核酸完全杂交的状态存在，并因而与催化性核酸在很大程度上互补。特别优选的核酸包含序列5’-G CCT CAT CAG TCG AGC C-3’（SEQ ID NO:2）。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链选自RNA、DNA、L-RNA、L-DNA和经修饰的核酸，其特别地包含SH-修饰的核苷酸，其优选地具有10至100个核苷酸的长度，特别地具有10至60个核苷酸的长度，其特别地包含序列5’-G CCT CAT CAG TCG AGC C-3’（SEQ ID NO:2）。
寡核苷酸抑制剂链与具有催化活性的核酸的摩尔比例优选地≥1，特别地1至2，以便保证催化性核酸的完全杂交。在采用包含序列SEQID NO:2的寡核苷酸抑制剂链和包含序列SEQ ID NO:1的具有催化活性的核酸的实施实例中，通过借助于凝胶电泳的体外实验确定了1.0至1.3，特别地大约1.1的最佳比例和在T<43℃的情况下的足够稳定性。
在一个优选的实施方案中，本发明因而涉及活性物质释放系统，其中在复合物1中，所述寡核苷酸抑制剂链与所述具有催化活性的核酸的比例≥1，特别地1至2。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及活性物质释放系统，其中在复合物1中，具有序列5’-G CCT CAT CAG TCG AGC C-3’（SEQ IDNO:2）的寡核苷酸抑制剂链与具有序列5’-GGC UCG ACU GAU GAG GCGC-3’（SEQ ID NO:1）的具有催化活性的核酸的比例为1.0至1.3，特别地大约1.1。
在根据本发明的活性物质释放系统中优选的是，所述具有催化活性的核酸在生理条件（特别地，甚至直至低于43℃的体温）下以与所述寡核苷酸抑制剂链完全杂交的状态存在。那么，在43℃或更高温度的情况下，至少一个具有催化活性的核酸，优选地5%，更优选地10%，特别地20%的全部所包含的具有催化活性的核酸以解杂交的状态存在。关于此，至少一个催化性核酸的释放可以根据实施例3在释放测定法中在缓存液中进行测量。荧光染料的显著释放使得能够推断出至少一个催化性核酸的解杂交。因此，可以保证，仅在升高的温度的情况下（例如通过在磁场中纳米颗粒的升温）才发生从复合物2上的活性物质释放。
特别地，本发明因此涉及活性物质系统，其中所述具有催化活性的核酸在生理条件下以与所述寡核苷酸抑制剂链完全杂交的状态存在，并且在43℃的情况下，至少一个具有催化活性的核酸，优选地5%，更优选地10%，特别地20%的所结合的、具有催化活性的核酸解杂交。
优选地，复合物1的纳米颗粒包含核心，所述核心包含顺磁性或超顺磁性氧化铁。合适的纳米颗粒在现有技术中作了描述。特别地，来自WO 97/38058、WO 98/58673和WO 2009/086824（各自通过提及而合并入本文）的纳米颗粒适合于根据本发明的系统。
在另一个实施方案中，本发明涉及活性物质系统，其中所述纳米颗粒具有包含至少一种顺磁性或超顺磁性氧化铁的核心。
这些纳米颗粒优选地由磁性材料组成，优选地由铁磁性材料、反铁磁性材料、亚铁磁性材料、反亚铁磁性材料或超顺磁性材料组成，进一步优选地由氧化铁（特别是超顺磁性氧化铁）组成或由配备有氧化层的纯铁组成。这些铁基材料特别地由于其低毒性而被选择，但是原则上，其他金属氧化物也是合适的。优选地，氧化铁为磁铁矿（Fe3O4）、磁赤铁矿（γ-Fe2O3）或者这两种氧化物的混合物。通常，优选的纳米颗粒可以通过式FeOX来描述，其中X表示1至2的数字。
除了式FeOX（其中X为在1.0至2.0范围内的数字）的磁性材料之外，通式MFe2O4（其中M=Co、Ni、Mn、Zn、Cd或Ba）的材料或者其他铁氧体也是可用的。此外，其中贮存有或结合有磁性材料（例如本文中所述及的磁性材料）的二氧化硅颗粒或聚合物颗粒也是合适的。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及活性物质释放系统，其中所述顺磁性或超顺磁性纳米颗粒在交变磁场中升温。
一般地，在一个优选的实施方案中，通过身体外施加的交变磁场来产生对于本发明来说所必需的热，所述交变磁场激发优选地超顺磁性纳米颗粒，由此主要释放磁滞热。合适的仪器例如描述在WO2001/10501、WO 2001/10500和WO 2009/118091中。身体外施加的交变磁场可以在内部被加强（WO 2009/118091）。备选地，也可以在内部诱导所述交变磁场（WO 2009/118091）。该热释放导致升高的温度，其是必需的，以便释放所述具有催化活性的核酸。
为了在交变磁场中顺磁性或超顺磁性纳米颗粒的升温，特别地使用在10-500kHz范围内的频率和0.5-50kA/m的场强，特别是50-200kHz的频率和0.5-20kA/m的场强。这些范围特别对于在人中的治疗来说是可以良好耐受的，并且已经在临床上得到证实。将包含所述纳米颗粒的组织升温至超过80℃，特别是43℃至55℃的温度是可能的，并且依赖于所述颗粒的比吸收速率以及其在靶组织中的浓度。
纳米颗粒（然而没有活性物质，也没有涂层）的制备详细描述于US 6,048,515中。此外，纳米颗粒表面的官能化是已知的，从而可以根据已知的方法在纳米颗粒的表面上产生氨基基团、羟基基团、羧基基团、巯基基团、环氧基团或羰基基团。
所述纳米颗粒优选地基于磁性含铁核心，该核心被一个或多个胶态包壳或涂层所包封。在此，所述核心优选地由磁铁矿或磁赤铁矿组成。所述包壳的首要功能是达到在水性介质中的胶态分散和保护纳米颗粒免于附聚。包裹有多个壳层的颗粒，如在WO 98/58673中所描述的，原则上适合于作为纳米颗粒缀合物的基础，这是因为这样的颗粒的生物学行为是可以通过具有聚合物的涂覆层来调整的。
在实施例的根据本发明的活性物质释放系统中，选择直径为15nm（TEM）的氧化铁核心，其配备有反应性硅烷包壳，更准确而言氨基硅烷包壳。
为了改善在所述表面上的偶联效率和降低氧化铁表面的活性，复合物1的根据本发明的纳米颗粒优选地包含至少一个壳，优选地硅烷包壳或者SiO2包壳和硅烷包壳。这些颗粒是超顺磁性的，并且具有相对于纯铁颗粒而言有着惰性表面这一优点。因此，保护了氧化铁核心免于在生理学介质中的反应；此外，SiO2表面提供了这样的优点，即相比于纯氧化铁而言，通过反应性硅烷缩合至现存的SiOH基团上而提高了官能度密度优选的是这样的纳米颗粒，所述纳米颗粒在用功能性硅烷包壳进行涂覆之前，用1-20nm，特别地5nm的SiO2层进行涂覆。
特别地，本发明涉及活性物质释放系统，其中所述纳米颗粒包含至少一个包壳，优选地硅烷包壳或者SiO2包壳和硅烷包壳。
但也存在这样的可能性，即采用由非磁性材料例如氧化硅（SiO2）（见下面）或者金（Au）制成的纳米颗粒。如果使用由非磁性材料制成的纳米颗粒，那么在纳米颗粒范围内的激发和热产生不通过交变磁场而是例如通过红外线辐射来进行。
所述纳米颗粒优选地具有小于500nm的直径。优选地，所述纳米颗粒具有15nm的平均直径，或者优选地处于在1-100nm的大小范围内，和特别优选地在10-20nm的范围内。
所述底物分子必须是可被所述具有催化活性的核酸切割的，从而通过所述切割而从载体-底物分子-活性物质缀合物中释放出活性物质，并且所述活性物质可以发挥其作用。通常，所述底物分子为寡核苷酸，但它也可以是可切割的肽或者其他经调整而适合于所述具有催化活性的核酸的分子。
特别地，本发明涉及活性物质释放系统，其中所述底物分子为寡核苷酸。
复合物2的载体可以为聚合物（例如，聚丙交酯乙交酯），特别是生物聚合物，SiO2颗粒，金属颗粒例如金颗粒，或者氧化颗粒。合适的生物聚合物例如为糖、右旋糖酐、壳聚糖或淀粉。对此，表面经修饰的氧化铁微粒也是优选的。所述载体可以作为凝胶、微颗粒、微球体或纳米颗粒而存在。根据一个特别优选的实施方案，复合物2也如上面对于复合物1所描述的那样作为氧化纳米颗粒而存在。在此，其甚至可以为与复合物1的纳米颗粒相同的纳米颗粒。此外，包含纳米颗粒的医药产品是优选的，如在WO 2009/100716（通过提及而合并入本文）中所描述的那样。在一个实施方案中，所述寡核苷酸抑制剂链可以以与所述具有催化活性的核酸杂交的状态存在，并且底物分子-活性物质缀合物可以以与同一个纳米颗粒相偶联的状态存在。
在另一个优选的实施方案中，本发明因此涉及活性物质释放系统，其中所述载体为聚合物，特别是生物聚合物，SiO2颗粒，金属颗粒，特别是金颗粒，或者氧化颗粒，优选地为表面经修饰的氧化铁微粒，其作为凝胶、微颗粒、微球体或纳米颗粒，特别地作为氧化纳米颗粒而存在。
在一个实施方案中，根据本发明的活性物质释放系统包含两种类型的纳米颗粒。一方面，这样的纳米颗粒，其包含通过底物寡核苷酸和任选地连接体与磁性纳米颗粒相结合的活性物质；和另一方面，这样的纳米颗粒，其包含与寡核苷酸抑制剂链杂交的具有催化活性的核酸。或者，单组分系统，其中两种组成成分（具有催化活性的核酸和底物）与单个颗粒相结合。
因此，本发明还涉及纳米颗粒，其与寡核苷酸抑制剂链相连接，所述寡核苷酸抑制剂链与能够切割底物寡核苷酸的具有催化活性的核酸杂交，所述底物寡核苷酸与另一纳米颗粒和治疗性活性物质相连接。
此外，本发明涉及纳米颗粒，其与治疗性活性物质和与底物寡核苷酸相连接，其中所述底物寡核苷酸可被具有催化活性的核酸切割。
根据本发明的活性物质释放系统的功能原理如下。所述具有催化活性的核酸与寡核苷酸抑制剂链杂交，并且在升高的温度（即38℃以上，优选地40℃以上）的情况下才释放。由此确保，在生理条件下和在直至38℃的温度的情况下，不出现所述具有催化活性的核酸的释放。
所述寡核苷酸抑制剂链与所述具有催化活性的核酸杂交，而其又与磁性纳米颗粒，优选地超顺磁性纳米颗粒相结合。
待释放的活性物质（特别重要地，其为抗癌活性物质）通过底物寡核苷酸和任选地连接体与另一纳米颗粒相结合，但也可以与同一个纳米颗粒（在其上结合了带有经杂交的具有催化活性的核酸的所述寡核苷酸抑制剂链）相结合。
此外，所述载体-活性物质缀合物或者说颗粒-活性物质缀合物还提供了这样的优点，即它们在肿瘤细胞或者细菌细胞中富集，并且使得能够例如借助于MRT（磁共振体层摄影术）而检测出不仅小尺寸的肿瘤，而且甚至单个肿瘤细胞。通过该高灵敏的检测方法，例如能够确定转移形成的出现和程度。可以在该检测方法中使用根据本发明的纳米颗粒以及根据本发明的活性物质释放系统。
所述活性物质如此牢固地（优选地，共价地）与所述底物寡核苷酸相结合，从而在生理条件下基本上不发生活性物质的解裂。优选地，在其上任选地通过连接体结合了所述底物寡核苷酸的纳米颗粒也为在纳米范围至微米范围内的磁性（特别优选地，超顺磁性）颗粒。
因此，可以通过施加特别是外部的交变磁场，来如此地升高在纳米颗粒范围内的温度，从而释放出经杂交的具有催化活性的核酸。然后，所述具有催化活性的核酸与所述底物寡核苷酸相结合并切割后者，从而所述活性物质从所述纳米颗粒上脱落并且可以发挥其效应。
相比于在WO2006/108405中描述的方法而言的效率提高通过活性物质的很大程度数量的解裂和释放而产生，因为通过所产生的热，并不必须释放活性物质本身（这在小的温度变化下通常不会显量地发生），而只释放出催化量的所述具有催化活性的核酸，其不必须显量地释放，因为仅催化量就足以切割所述底物寡核苷酸。因此，以非显量的方式释放催化剂，其能够显量地释放所述活性物质。这引起相比于根据WO2006/108405的方法而言几乎100%的效率提高，在根据WO2006/108405的方法中，活性物质会通过热产生而直接释放。
图2显示了根据本发明的活性物质释放系统的一个实施实例。
所述纳米颗粒-活性物质缀合物由纳米颗粒（例如，氧化铁、金、SiO2或者各种不同的（优选地超顺磁性）材料的核-壳颗粒），任选地交联剂，和底物寡核苷酸（DNA、RNA、经修饰的核酸以及核酸类似物）组成，所述底物寡核苷酸携带活性物质并且可以被相应的催化性核酸特异性地切割。来自第一组分的催化性核酸在热释放后用作切割工具，以切割所述底物寡核苷酸链。随后释放出活性物质，其在图2中用星状物来表示。
根据本发明的活性物质释放系统的优点在于核酸的催化活性和由此产生的提高的在活性物质从纳米颗粒-活性物质缀合物中酶促释放方面的效率。由于所述具有催化效应的核酸的酶促性质，因而仅需要低浓度的催化性核酸来从纳米颗粒-活性物质缀合物中释放出治疗有效浓度的活性物质。
因此，通过下列方式解决了活性物质的非特别有效的热释放的问题：不是用热的方法，而是酶促地释放在纳米颗粒-活性物质缀合物中的活性物质。由此，非常少量的催化性核酸的热释放也足以实现在肿瘤细胞中大量活性物质的酶促释放。
所述活性物质释放系统的其他优点在于其对于各种不同情形的大的可变性和适应可能性。例如，可以通过抑制剂序列的长度或者抑制剂和催化性核酸之间的杂交比例来任意地改变催化性核酸的依赖于温度的激活。活性物质释放的速度或者说所释放的活性物质的量依赖于局部温度或者所述组分的浓度，从而可以使活性物质对于正常细胞的可能的副作用有针对性地最小化。
在根据本发明的活性物质释放系统中，所述底物分子共价地，优选地通过连接体2，与载体相结合。按照普通的专业知识，根据载体或底物分子的现存的反应性基团来选择连接体2。任选地，使用经修饰的核酸，特别是在末端处经修饰的核酸，以便例如在底物寡核苷酸一侧提供氨基基团。原则上，可以使用同样的交联剂，如在上面对于连接体1所描述的那些。优选地，连接体为磺基-SMCC和磺基-GMBS。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及活性物质释放系统，其中所述底物分子共价地，特别是通过连接体2共价地与所述载体相连接，其中所述连接体优选地为磺基-SMCC或磺基-GMBS。
所述底物寡核苷酸优选地选自DNA、RNA、L-DNA、L-RNA和经修饰的核酸。经修饰的核酸优选地是这样的核酸，其具有较低的核酸酶敏感性，以便防止或减少通过天然存在的核酸酶的活性而引起的自发释放。此外，可以掺入经修饰的核苷酸，其包含额外的反应性基团，即偶联官能化（Kopplungsfunktionalisierung）。这些基团优选地在末端处掺入。优选的官能团特别地为氨基官能团、巯基官能团、或羧基官能团、炔官能团或叠氮化物官能团。
特别地，本发明因此涉及活性物质释放系统，其中所述底物寡核苷酸选自DNA、RNA、L-DNA、L-RNA和经修饰的核酸，其中所述经修饰的核酸优选地具有特别地末端偶联官能化，特别是氨基官能团、巯基官能团、或羧基官能团、炔官能团或叠氮化物官能团。
作为底物分子，原则上可以使用每种这样的分子，其可被对于复合物1而选择的具有催化活性的核酸切割。优选地，该切割特异性地进行。相应的成对的催化性核酸与其底物是现有技术中充分知晓的。底物寡核苷酸优选地具有10至100nt，更优选地15-60nt，特别地20-30nt的长度。再次地，大于100nt的寡核苷酸通常太贵。底物的识别序列通常长至少10nt。特别地，与实施例中所使用的具有催化活性的核酸相称地，包含序列5’-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCGAGC-3’（SEQ ID NO:3）的底物寡核苷酸是优选的。
因此，在另一个优选的实施方案中，本发明涉及活性物质释放系统，其中所述底物寡核苷酸具有10至100个核苷酸的长度，优选地15至60个核苷酸的长度，更优选地20至30个核苷酸的长度，其特别地包含序列5’-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3’（SEQ ID NO:3）。
根据本发明的活性物质释放系统包含至少一个治疗性活性物质，其选自包括核酸、siRNA、反义RNA、氨基酸、适体、肽、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、聚糖、脂质、脂蛋白和低分子量活性物质的组。低分子量活性物质是特别优选的。
这些优选地具有抗增殖、抑制细胞、细胞毒性、抗迁移、抗血管发生、抗血栓形成、抗炎、消炎、抗凝、抗细菌、抗病毒和/或抗真菌的活性物质，特别是抑制细胞或细胞毒性的作用，其中抗增殖、抗迁移、抗血管发生、抑制细胞和/或细胞毒性的活性物质以及核酸，特别地还有具有抗增殖、抗迁移、抗血管发生、抗血栓形成、抗炎、消炎、抑制细胞、细胞毒性、抗凝、抗细菌、抗病毒和/或抗真菌特性的抑制性核酸（例如，siRNA）、氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、糖蛋白、聚糖或脂蛋白，是优选的。此外，这些物质也可以为辐射增敏剂或者其他也是联合的常规癌症治疗方法的增敏剂或增强剂，或者可以包含这样的增敏剂。
特别地，本发明因此涉及活性物质释放系统，其中所述治疗性活性物质选自包括核酸、siRNA、反义RNA、氨基酸、适体、肽、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、聚糖、脂质、脂蛋白和低分子量活性物质的组，其中所述治疗性活性物质特别地为低分子量活性物质，并且优选地具有抗增殖、抑制细胞、细胞毒性、抗迁移、抗血管发生、抗血栓形成、抗炎、消炎、抗凝、抗细菌、抗病毒和/或抗真菌的作用，特别是抑制细胞或细胞毒性的作用，特别地，其中所述治疗性活性物质为多柔比星或甲氨蝶呤。
作为细胞毒性和/或抑制细胞的化合物，即具有细胞毒性和/或抑制细胞的特性的化学化合物，可以尤其使用烷化剂，具有抑制细胞的特性的抗生素，抗代谢药，微管抑制剂和拓扑异构酶抑制剂，含铂的化合物，和其他细胞抑制剂例如天冬酰胺酶、维甲酸、生物碱、鬼臼毒素、紫杉烷和米替福激素，免疫调节剂，单克隆抗体，信号转导物（信号转导分子），和细胞因子。
作为烷化剂的例子，可以尤其提及氯乙胺、环磷酰胺、曲磷胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、塞替派、卡莫司汀、洛莫司汀、达卡巴嗪、丙卡巴肼、替莫唑胺、曲奥舒凡、雌莫司汀和尼莫司汀。
具有抑制细胞的特性的抗生素的例子为柔红霉素以及脂质体柔红霉素、多柔比星（阿霉素）、更生霉素、丝裂霉素C、博来霉素、表柔比星（4-表-阿霉素）、伊达比星、更生霉素、米托蒽醌、安吖啶和放线菌素D。
作为抗代谢药（抗代谢的活性物质）的例子，可以提及甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、氟达拉滨、克拉屈滨、喷司他丁、吉西他滨、阿糖胞苷、硫唑嘌呤、雷替曲塞、卡培他滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鸟嘌呤和巯基嘌呤。
属于生物碱和鬼臼毒素这一类别的物质尤其包括长春新碱、长春碱、长春地辛、依托泊苷以及替尼泊苷。此外，根据本发明，可以使用含铂的化合物。作为含铂的化合物可以提及例如顺铂、卡铂和奥沙利铂。属于微管抑制剂的物质例如包括，生物碱例如长春花生物碱（长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨），和紫杉醇（泰）以及紫杉醇的衍生物。作为拓扑异构酶抑制剂，可以提及例如依托泊苷、替尼泊苷、喜树碱、托泊替康和伊立替康。
紫杉醇和多西他赛为紫杉烷这一化合物类别的例子，并且属于其他抑制细胞的活性物质（其他细胞抑制剂）的物质包括例如羟基脲（羟基脲）、伊马替尼、米替福安吖啶、托泊替康（拓扑异构酶I抑制剂）、喷司他丁、贝沙罗汀、维甲酸和天冬酰胺酶。单克隆抗体这一化合物类别的代表尤其为曲妥珠单抗（赫赛）、阿仑珠单抗和利妥昔单抗（美罗）。
还可以使用激素，例如糖皮质激素（泼尼松）、雌激素（磷雌酚、雌莫司汀）、LHRH（布舍瑞林、戈舍瑞林、亮丙瑞林、曲普瑞林）、氟他胺、醋酸环丙孕酮、他莫昔芬、托瑞米芬、氨鲁米特、福美坦、依西美坦、来曲唑和阿那曲唑。属于免疫调节剂、细胞因子、抗体和信号转导物这些类别的物质包括白介素-2、干扰素-α、促红细胞生成素、G-CSF、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、吉非替尼（易瑞）、替伊莫单抗（泽娃灵）、左旋咪唑以及类视黄醇。
待释放的活性物质也可以为阿片类激动剂、非阿片类镇痛药、非类固醇抗炎（NSAID）活性物质、抗偏头痛活性物质、Cox-II抑制剂、β-肾上腺素能阻断剂、抗惊厥药、抗抑郁药、Ca2+通道阻断剂或者用于治疗神经元疾病或神经变性疾病（例如帕金森病、焦虑状态、癫痫、中风、精神病、认知障碍或抑郁）的活性物质。
根据本发明的活性物质释放系统和药物组合物用于治疗以及预防疾病，其中可以利用受控制的活性物质释放的特性，以便只在靶组织的细胞中以治疗上意义重大的浓度受控制地释放活性物质。
本发明的另一个显著的优点是可能实现活性物质从颗粒上的受控制的依赖于时间的活性物质释放，要么在磁性颗粒的情况下通过施加外部的交变磁场，要么在非磁性颗粒的情况下通过用红外波进行照射。由此可以在确定的时刻，例如在偏头痛发作期间或者在强烈疼痛出现的情况下，有针对性地和在时间上受控地释放活性物质，以便治疗障碍、疼痛或其他疾病。
因此，所述活性物质释放系统和包含其的药物组合物也用于预防和治疗疼痛、神经变性疾病和心血管疾病。
作为有用的阿片类激动剂的例子，将可提及：阿芬太尼、烯丙罗定、阿法罗定、阿尼利定、苄吗啡、贝齐米特、丁丙诺啡、布托啡诺、氯尼他秦、可待因、地索吗啡、右吗拉胺、地佐辛、地恩丙胺、二醋吗啡、双氢可待因、双氢吗啡、地美沙多、地美庚醇、二甲噻丁、乙基吗啡、依托尼秦、芬太尼、海洛因、氢可酮、氢吗啡酮、羟哌替啶、异美沙酮、凯托米酮、左啡诺、左芬啡烷、洛芬太尼、麦啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、美托酮、吗啡、麦罗啡、纳布啡、那碎因、尼可吗啡、去甲左啡诺、去甲美沙酮、烯丙吗啡、去甲吗啡、诺匹哌酮、阿片、羟考酮、羟吗啡酮、阿片全碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、非诺啡烷、非那佐辛、苯哌利定、匹米诺定、哌腈米特、普罗庚嗪、γ-二甲哌替啶、丙哌利定、丙吡兰、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲马多以及其药学上相容的盐和混合物。
作为有用的非阿片类镇痛药（包括非类固醇抗炎（NSAID）活性物质）的例子，将可提及：阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸、萘普生、苯洛芬、氟比洛芬、非诺洛芬、氟布芬、酮洛芬、吲哚洛芬、匹罗洛芬（Piroprofen）、卡洛芬、奥沙普秦、普莫洛芬（Pramoprofen）、莫罗洛芬（Muroprofen）、曲奥洛芬（Trioxaprofen）、舒洛芬、氨洛芬、噻洛芬酸、氟洛芬、布氯酸、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、佐美酸、硫平酸、齐多美辛、阿西美辛、芬替酸、环氯茚酸、Oxpinac、甲芬那酸、甲氧芬那酸、氟芬那酸、尼氟酸、托芬那酸、二氟尼柳、氟苯柳、吡罗昔康、舒多昔康、伊索昔康以及其药学上相容的盐和混合物。
其他的非阿片类镇痛药包括下列化学类别的镇痛的、退热的、非类固醇抗炎的（NSAID）活性物质：水杨酸衍生物，包括阿司匹林、水杨酸钠、三水杨酸胆碱镁、双水杨酯、二氟尼柳、双水杨酸、柳氮磺吡啶和奥沙拉秦；对氨基苯酚衍生物，包括对乙酰氨基酚和非那西丁；吲哚乙酸和茚乙酸，包括吲哚美辛、舒林酸和依托度酸；杂芳基乙酸，包括托美丁、双氯芬酸和酮咯酸；邻氨基苯甲酸（芬那酸类），包括甲芬那酸和甲氧芬那酸；烯醇酸类，包括昔康类（吡罗昔康、替诺昔康）和吡唑烷二酮类（保泰松、Oxyphenthartazon）；和链烷酮类（Alkanone），包括萘丁美酮。
作为有用的Cox-II抑制剂和5-脂加氧酶抑制剂的例子，将可提及：塞来考昔、艾托考昔、罗非考昔、帕瑞考昔和伐地考昔。
作为有用的抗偏头痛活性物质的例子，将可提及：阿吡必利、溴隐亭、双氢麦角胺、多拉司琼、麦角柯宁碱、麦角异柯宁碱、麦角隐亭碱、麦角新碱、麦角、麦角胺、醋酸氟美烯酮、二甲替嗪、酮色林、利舒脲、洛美利嗪、甲麦角新碱、美西麦角、美托洛尔、那拉曲坦、奥昔托隆、苯噻啶、普萘洛尔、利培酮、利扎曲坦、舒马曲坦、噻吗洛尔、曲唑酮、佐米曲坦以及其混合物。
作为有用的β–肾上腺素能阻断剂的例子，将可提及：醋丁洛尔、阿普洛尔、氨磺洛尔、阿罗洛尔、阿替洛尔、苯呋洛尔、倍他洛尔、贝凡洛尔、比索洛尔、波吲洛尔、布库洛尔、布非洛尔、丁呋洛尔、布尼洛尔、布拉洛尔、盐酸布替君、丁非洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、塞利洛尔、塞他洛尔、氯拉洛尔（Chloranolol）、地来洛尔、依泮洛尔、艾司洛尔、茚诺洛尔、拉贝洛尔、左布诺洛尔、甲吲洛尔、美替洛尔、美托洛尔、莫普洛尔、纳多洛尔、萘肟洛尔、奈必洛尔、硝苯洛尔、尼普地洛、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普拉洛尔、丙萘洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、硫氧洛尔、他林洛尔、特他洛尔、替利洛尔、噻吗洛尔、托利洛尔和希苯洛尔。
作为有用的抗惊厥药的例子，将可提及：乙酰苯丁酰脲、阿布妥因、阿洛双酮、氨鲁米特、4-氨基-3-羟基丁酸、苯乳胺、贝克拉胺、布拉氨酯、溴化钙、卡马西平、桂溴胺、氯美噻唑、氯硝西泮、地西酰胺、地沙双酮、二甲双酮、去氧苯妥英、依特比妥、依沙双酮、乙琥胺、乙苯妥英、非尔氨酯、氯苯乙砜、加巴喷丁、5-羟色氨酸、拉莫三嗪、溴化镁、硫酸镁、美芬妥英、甲苯比妥、美沙比妥、美替妥英、甲琥胺、5-甲基-5-(3-菲基)-乙内酰脲、3-甲基-5-苯基乙内酰脲、那可比妥、尼美西泮、硝西泮、奥卡西平、甲乙双酮、苯乙酰脲、非沙比妥、苯丁酰脲、苯巴比妥、苯琥胺、苯基甲基巴比妥酸、苯妥英、苯噻妥英钠、溴化钾、普瑞巴林、扑米酮、普罗加胺、溴化钠、茄（Solanum）、溴化锶、琥氯非尼、舒噻美、替群妥英、噻加宾、托吡酯、三甲双酮、丙戊酸、丙戊酰胺、氨己烯酸和唑尼沙胺。
作为有用的抗抑郁药的例子，将可提及：苯奈达林、卡罗沙酮、西酞普兰、(S)-西酞普兰、二甲沙生、芬咖明、吲达品、盐酸茚洛秦、奈福泮、诺米芬辛、奥西曲坦、奥昔哌汀、帕罗西汀、舍曲林、硫西新、曲唑酮、苯莫辛、异丙氯肼、异丙烟肼、异卡波肼、尼亚拉胺、奥他莫辛、苯乙肼、可替宁、罗利普令、咯利普兰、马普替林、美曲吲哚、米安色林、米氮平、阿地唑仑、阿米替林、氧阿米替林、阿莫沙平、布替林、氯米帕明、地美替林、地昔帕明、二苯西平、二甲他林、度硫平、多塞平、氟西嗪、丙米嗪、丙米嗪N-氧化物、伊普吲哚、洛非帕明、美利曲辛、美他帕明、去甲替林、诺昔昔林、奥匹哌醇、苯噻啶、丙吡西平、普罗替林、奎纽帕明、噻奈普汀、曲米帕明、阿屈非尼、贝那替秦、安非他酮、布他西丁、地奥沙屈、度洛西汀、依托哌酮、非巴氨酯、非莫西汀、芬戊二醇、氟西汀、氟伏沙明、血卟啉、金丝桃素、左法哌酯、美地沙明、米那普仑、米那普令、吗氯贝胺、奈法唑酮、奥沙氟生、吡贝拉林、普罗林坦、吡琥胺酯、利坦色林、罗克吲哚、氯化铷、舒必利、坦度螺酮、托扎啉酮、托芬那辛、托洛沙酮、反苯环丙胺、L-色氨酸、文拉法辛、维洛沙秦和齐美利定。
作为有用的Ca2+通道阻断剂的例子，将可提及：苄普地尔、克仑硫地尔硫芬地林、戈洛帕米、米贝拉地尔、普尼拉明、司莫地尔、特地林（Terdilin）、维拉帕米、氨氯地平、阿雷地平、巴尼地平、贝尼地平、西尼地平、依福地平、依高地平、非洛地平、伊拉地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、桂利嗪、氟桂利嗪、利多氟嗪、洛美利嗪、苄环烷、依他苯酮、泛托法隆和哌克昔林。
作为在治疗神经元疾病或神经变性疾病（例如帕金森病、焦虑状态、癫痫、中风、精神病、认知障碍或抑郁）中有用的活性物质的例子，将可提及：L-多巴、抗胆碱能药、COMT抑制剂、5-羟色胺重摄取抑制剂、丁螺环酮、三环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、丙戊酸、卡马西平、选择性5-羟色胺重摄取抑制剂、5-羟色胺-去甲肾上腺素重摄取抑制剂、去甲肾上腺素-5-羟色胺选择性抗抑郁药和曲米帕明。
用于治疗或预防帕金森病：卡比多巴/左旋多巴、培高利特、溴隐亭、罗匹尼罗、普拉克索、恩他卡朋、托卡朋、司来吉兰、金刚烷胺和盐酸苯海索。
用于治疗或预防焦虑状态：苯二氮杂类，例如阿普唑仑、溴替唑仑、氯氮氯巴占、氯硝西泮、氯拉酸、地莫西泮、地西泮、艾司唑仑、氟马西尼、氟西泮、哈拉西泮、劳拉西泮、咪达唑仑、硝西泮、去甲西泮、奥沙西泮、普拉西泮、夸西泮、替马西泮和三唑仑；非苯二氮杂类活性物质，例如丁螺环酮、吉哌隆、伊沙匹隆、替螺酮、佐匹克隆、唑吡坦和扎来普隆；选自巴比妥酸盐的镇静药，例如异戊巴比妥、阿普比妥、仲丁比妥、布他比妥、甲苯比妥、美索比妥、戊巴比妥、苯巴比妥、司可巴比妥和硫喷妥；和氨基甲酸丙二醇酯，例如甲丙氨酯和泰巴氨酯。
用于治疗或预防癫痫：卡马西平、乙琥胺、加巴喷丁、拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、扑米酮、丙戊酸、三甲双酮、苯二氮杂γ-乙烯基GABA、乙酰唑胺和非尔氨酯。
用于治疗或预防中风：抑制凝血的活性物质，例如肝素，以及可以溶解凝结的小血块的活性物质，例如链激酶或组织特异性纤溶酶原激活物，和减轻肿胀的活性物质，例如甘露醇、皮质类固醇或乙酰水杨酸。
用于治疗或预防精神病：吩噻嗪类，例如盐酸氯丙嗪、苯磺酸美索达嗪和盐酸硫利达嗪，噻吨类，例如氯普噻吨和盐酸替沃噻吨，氯氮平，利培酮，奥氮平，喹硫平，富马酸喹硫平，氟哌啶醇，癸酸氟哌啶醇，琥珀酸洛沙平，盐酸吗茚酮，匹莫齐特和齐拉西酮。
用于治疗或预防认知障碍：用于治疗痴呆的活性物质，例如他克林，多奈哌齐，布洛芬，和抗精神病活性物质例如硫利达嗪和氟哌啶醇。
用于治疗或预防抑郁：阿米替林、阿莫沙平、安非他酮、氯米帕明、地昔帕明、多塞平、丙米嗪、马普替林、奈法唑酮、去甲替林、普罗替林、曲唑酮、曲米帕明、文拉法辛、西酞普兰、(S)-西酞普兰、氟西汀、氟伏沙明、帕罗西汀、舍曲林、异卡波肼、帕吉林、苯乙肼、反苯环丙胺、右苯丙胺和哌甲酯。
优选地，上面所提及的活性物质共价地与所述底物寡核苷酸相结合。活性物质的结合可以例如通过羟基基团、氨基基团、羰基基团、巯基基团或羧基基团来实现，这取决于各活性物质携带何种官能团。
羟基基团优选地作为酯、缩醛或酮缩醇进行结合，巯基基团优选地作为硫酯、硫缩醛或酮缩硫醇进行结合，氨基基团优选地作为酰胺和部分地也作为亚胺（席夫碱）进行结合，羧基基团优选地作为酯或酰胺进行结合，和羰基基团优选地作为酮缩醇进行结合。
根据一个实施方案，活性物质多柔比星和甲氨蝶呤是特别地优选的。可以通过甲氨蝶呤的羧基基团，通过氨基基团（其优选地在末端处掺入到所述底物寡核苷酸中），借助于肽键来使甲氨蝶呤共价偶联。多柔比星可以例如作为前体药物通过连接体和该氨基官能团进行偶联，如在现有技术中对于白蛋白-多柔比星缀合物所描述的那样（AbuAjaj等人,2009，Boga等人,2009，Calderon等人,2009，Kratz等人,2008）。
所述至少一个治疗有效物质与所述底物寡核苷酸的结合，即至少一种治疗有效物质类别或指定活性物质的分子的结合，优选地共价地或通过占优势地共价的键和/或通过足够强的离子键、内位加成连接（Einlagerungsverbindung）、配位键或通过插层反应（Interkalierung）来实现，从而尽可能不发生治疗有效物质的不受控的释放。不受控的释放是指治疗有效物质在健康组织中脱落，特别是没有通过第一组分的催化性核酸对底物寡核苷酸进行切割而发生的脱落。
这样的不受控的释放导致治疗有效物质在它们引起有害的副作用而不是治疗效果的位点处释放，即在致癌组织或肿瘤细胞之外。
在第一步骤中，所述催化性核酸，例如借助于交变磁场，特别是外部的或者说在外部施加的交变磁场（脉冲），或者对于金纳米颗粒还通过IR辐射，与其寡核苷酸抑制剂链分开。随后，游离的催化性核酸结合在纳米颗粒-活性物质缀合物中的底物寡核苷酸，并通过所述底物的切割而使所述活性物质以及所附的寡核苷酸一起成为游离的。该单链寡核苷酸在细胞内部被迅速降解，从而活性物质然后就完全游离了。
根据活性物质释放系统的一个实施方案，所述治疗性活性物质共价地，特别是通过连接体3与所述底物寡核苷酸相连接。这可以如对于连接体1和2那样通过直接结合，特别是在活性物质和底物分子之间的肽键的形成来实现，但也可以如先前所描述的那样通过同双官能或异双官能交联剂来实现。
根据一个优选的实施方案，本发明因此涉及活性物质释放系统，其中所述治疗性活性物质共价地，特别是通过连接体3共价地与所述底物分子相连接。
依照根据本发明的活性物质释放系统的一个实施方案，所述连接体3为肽键或腙，其中后者具有这样的优点，即它可以在溶酶体或肿瘤的酸性环境中从底物残余部分（即在切割后仍存在于活性物质上的部分）上解裂出来，并因此恢复了活性物质的原始结构。可以通过甲氨蝶呤的羧基基团，通过氨基基团（其优选地在末端处掺入到所述底物寡核苷酸中），借助于肽键来使甲氨蝶呤共价偶联。多柔比星可以作为前体药物通过该氨基基团进行偶联（Abu Ajaj等人,2009，Boga等人,2009，Calderon等人,2009，Kratz等人,2008）。
在另一个实施方案中，本发明涉及活性物质释放系统，其中所述连接体3选自氨基基团和腙，特别地，其中甲氨蝶呤通过该氨基基团与甲氨蝶呤的羧基基团之间的肽键进行偶联。
在一个实施方案中，所述治疗性活性物质在其与所述底物分子和/或所述连接体3相结合期间是无活性的。然后，随着通过所述底物分子的切割而引起的底物寡核苷酸或者说连接体3的释放或者在随后被细胞吸纳后，所述活性物质被激活。在一个实施方案中，解裂下的活性物质可以仍包含现在经切割的底物分子的一部分以及连接体3，并因此而失活。在这种情况下，可以使用在细胞中可切割的（特别是可酶促切割的）或酸不稳定的交联剂，特别是腙，其在进入溶酶体中时裂解并释放出具有活性的活性物质。
因此，在另一个实施方案中，本发明涉及活性物质释放系统，其中所述治疗性活性物质在其与所述底物分子和/或所述连接体3相结合期间是无活性的，并且其中所述治疗性活性物质随着所述底物分子的释放或者说随着所述连接体3的释放或者在随后被细胞吸纳后而被激活。
短的核苷酸链可以在经切割的情况下还留在活性物质上，然而该核苷酸链在生理条件下降解，并且活性物质的效力不受或基本上不受影响。
对于活性物质与底物寡核苷酸只是弱地结合的情况，例如在非共价的、离子的、吸附的、亲脂的和/或范德华的结合和/或通过氢键的结合的情况下，保护壳或屏障层可以阻止具有治疗活性的物质的释放，直至所述纳米颗粒已达到其预定位点。不用这种保护壳或屏障层或者作为在这种保护壳或屏障层上的另一层，可以涂覆携带细胞特异性官能度的外层。
该细胞特异性涂层增加了纳米颗粒对于指定细胞，例如对于指定细菌细胞或对于指定肿瘤细胞的亲和力，并因此用于细胞辨别。这样的细胞特异性纳米颗粒优选地在这样的细胞中富集，对于所述细胞而言，这些细胞特异性纳米颗粒由于在其表面上的官能度而具有增加的亲和力，并因此是肿瘤特异性的。使用该技术能够例如开发出用于指定癌症类型的肿瘤特异性纳米颗粒。
此外，所述纳米颗粒也可以通过胶态保护壳来稳定化，所述胶态保护壳保护所述纳米颗粒免于附聚。如果这样的保护壳或涂层具有氨基基团或羧基基团，则是优选的。对于所述保护壳或涂层，可以使用生物的、合成的或半合成的聚合物。对于屏障层的产生，优选地使用生物稳定的（即在很大程度上抗生物降解的）聚合物。为了产生细胞特异性的包壳或涂层，优选地使用可生物降解的聚合物。
作为生物稳定的聚合物，可以使用：聚丙烯酸和聚丙烯酸酯例如聚甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸丁酯，聚丙烯酰胺，聚丙烯腈，聚酰胺，聚醚酰胺，聚乙烯胺，聚酰亚胺，聚碳酸酯，聚碳氨基甲酸乙酯（Polycarbourethane），聚乙烯酮，聚卤代乙烯，聚偏卤代乙烯，聚乙烯醚，聚异丁烯，聚乙烯基芳香物，聚乙烯酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚甲醛，聚四氢呋喃，聚乙烯，聚丙烯，聚四氟乙烯，聚氨基甲酸乙酯，聚醚氨基甲酸乙酯，硅氧烷-聚醚氨基甲酸乙酯，硅氧烷-聚氨基甲酸乙酯，硅氧烷-聚碳酸酯-氨基甲酸乙酯，聚烯烃弹性体，聚异丁烯，EPDM橡胶，氟硅氧烷，羧甲基壳聚糖，聚芳基醚醚酮，聚醚醚酮，聚对苯二甲酸乙二酯，聚戊酸酯，羧甲基纤维素，纤维素，人造丝，人造丝三乙酸酯，硝酸纤维素，乙酸纤维素，羟乙基纤维素，丁酸纤维素，乙酸丁酸纤维素，乙酸乙基乙烯酯共聚物，聚砜，环氧树脂，ABS树脂，EPDM橡胶，硅氧烷例如聚硅氧烷，聚二甲基硅氧烷，聚卤代乙烯和共聚物，纤维素醚，三乙酸纤维素，壳聚糖，以及这些物质的共聚物和/或混合物。
作为可生物降解的聚合物，可以使用：聚戊内酯，聚ε-癸内酯，聚内酯酸，聚乙醇酸，聚交酯，聚乙醇酸交酯，聚交酯和聚乙醇酸交酯的共聚物，聚ε-己内酯，聚羟基丁酸，聚羟基丁酸酯，聚羟基戊酸酯，聚羟基丁酸酯-共-戊酸酯，聚(1,4-二氧杂环己烷-2,3-二酮)，聚(1,3-二氧杂环己烷-2-酮)，聚对二氧杂环己烷酮，聚酐例如聚马来酸酐，聚羟甲基丙烯酸酯，纤维蛋白，聚氰基丙烯酸酯，聚己内酯-二甲基丙烯酸酯，聚-β-马来酸，聚己内酯-丙烯酸丁酯，多嵌段聚合物例如由低聚己内酯二醇和低聚二氧杂环己烷酮二醇构成的多嵌段聚合物，聚醚酯多嵌段聚合物例如PEG和聚(对苯二甲酸丁二酯)，聚新戊内酯（Polypivotolactone），聚乙醇酸三甲基碳酸酯，聚己内酯-乙醇酸交酯，聚(γ-谷氨酸乙酯)，聚(DTH-亚氨基碳酸酯)，聚(DTE-共-DT-碳酸酯)，聚（双酚A-亚氨基碳酸酯)，聚原酸酯，聚乙醇酸三甲基碳酸酯，聚三甲基碳酸酯，聚亚氨基碳酸酯，聚(N-乙烯基)-吡咯烷酮，聚乙烯醇，聚酯酰胺，甘醇化的聚酯，聚磷酯，聚磷腈，聚[(对羧基苯氧基)丙烷]，聚羟基戊酸，聚酐，聚环氧乙烷环氧丙烷，软质聚氨基甲酸乙酯，在骨架中具有氨基酸残基的聚氨基甲酸乙酯，聚醚酯例如聚环氧乙烷，聚亚烷基草酸酯，聚原酸酯以及其共聚物，脂质，角叉菜聚糖，纤维蛋白原，淀粉，胶原，基于蛋白质的聚合物，聚氨基酸，合成的聚氨基酸，玉米醇溶蛋白，改性的玉米醇溶蛋白，聚羟基烷酸酯，果胶酸，肌动蛋白酸改性和未改性的纤维蛋白和酪蛋白，硫酸羧甲酯，白蛋白，透明质酸，壳聚糖和其衍生物，硫酸乙酰肝素和其衍生物，肝素，硫酸软骨素，右旋糖酐，β-环糊精，藻酸盐，糖胺聚糖，糖类，多糖，蛋白聚糖，糖蛋白，具有PEG和聚丙二醇的共聚物，阿拉伯胶，瓜耳胶，明胶，胶原，胶原-N-羟基琥珀酰亚胺，脂质，磷脂，上面提及的物质的改性物和共聚物和/或混合物。
为了关于指定细胞的进一步的亲和力提高，可以将单克隆抗体和/或适体偶联在所述纳米颗粒的表面上或者在所述纳米颗粒的外层或外壳上。如此地布置所述单克隆抗体和适体，从而使得它们识别指定细胞例如肿瘤细胞，并且进一步提高所述纳米颗粒的细胞辨别。
对于根据本发明的活性物质释放系统来说合适的是，只要所述具有催化活性的核酸以从寡核苷酸抑制剂链上解离的状态存在，其就可以切割所述底物分子。优选地，对于通过所述具有催化活性的核酸来进行的所述底物分子的切割反应来说合适的是，所述底物分子的浓度≥KM，其中kcat优选地≥0.05/分钟，更优选地≥0.5/分钟,特别优选地≥1/分钟，和特别地≥5/分钟。
在此优选地，复合物1与复合物2的比例≤2，特别地≤1。
这是由于抑制和底物切割的竞争反应而引起的。为了治疗目的，希望的是用少量具有催化活性的核酸来获得尽可能高的底物切割速率常数。
在根据本发明的活性物质释放系统的一个具体实施方案中，所述寡核苷酸抑制剂链、所述具有催化活性的核酸和所述底物寡核苷酸各为成镜像的核酸。在此特别优选的是，所述寡核苷酸抑制剂链为L-DNA，其特别地包含序列5’-G CCT CAT CAG TCG AGC C-3’（SEQ ID NO:2），所述具有催化活性的核酸为L-RNA，其特别地包含序列5’-GGC UCGACU GAU GAG GCG C-3’（SEQ ID NO:1），和所述底物寡核苷酸为L-RNA，其特别地包含序列5’-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3’（SEQ IDNO:3）。以这种组成，可以按照实施例来转化出特别合适的活性物质释放系统。
本发明的另一个目标为如在本发明的范围内所定义的复合物1。
当例如患者在先前的时刻（例如在先前的手术期间）已经植入了复合物2时，复合物1可以作为单独的产品进行销售。因此，偶联至这样的植入物的活性物质可以在后来的时刻通过分开地给予复合物1而解裂下来，并因此被激活。在此，可以将该复合物喷洒到该植入物中（例如在海绵状聚合物的情况下）、朝向该植入物施用（在供给（血）管中或在局部附近）或者全身施用（例如静脉内），特别是当复合物1通过靶向机制经历在靶组织中的富集时。
相应地，本发明的另一个目标为如在本发明的范围内所定义的复合物2。
如在上面所描述的，复合物2可以在先前的时刻（例如在手术期间）植入到身体中的指定位置处，以便在后来的时刻就地释放所偶联的活性物质。
此外，本发明涉及药物组合物或者说药物，其包含根据本发明的活性物质释放系统或者根据本发明的复合物1或2之一；以及根据本发明的活性物质释放系统用于制备此类药物组合物的用途。这些药物组合物特别地为输注溶液或注射溶液。纳米颗粒的这样的溶液（在例如生理盐水中）适合于间质或肿瘤内应用。此外，动脉内或静脉内应用进一步使得能够获得用于非实体的和/或形成转移的肿瘤类型的全身性的、涉及整个身体的治疗可能性。为了进行施用，所述药物组合物或者说药物根据专业人员的技能进行配制，即任选地添加合适的缓冲液和助剂。
在另一个方面，本发明涉及包含有在本发明的范围内所定义的活性物质释放系统的药物。
根据本发明的活性物质释放系统和药物组合物用于治疗以及预防疾病，所述疾病以退化的细胞种类或异体的细胞为特征，并且在所述疾病中可以利用受控制的活性物质释放的特性，以便只在退化的细胞中以治疗上意义重大的浓度受控制地释放活性物质。特别地，癌细胞或者说在其增殖方面紊乱的细胞，以及狭窄的或再狭窄的组织，被认为是退化的细胞。作为异体的细胞，特别地可以提及细菌。
因此，使用所述活性物质释放系统和包含其的药物组合物或药物来预防和/或治疗增殖性疾病，肿瘤，癌，癌症，炎性疾病，特别是自身免疫疾病，和细菌感染。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的活性物质释放系统的药物，其用于治疗和/或预防增殖性疾病，癌症，炎性疾病，特别是自身免疫疾病，和细菌感染。
作为其中可以使用根据本发明的纳米颗粒的癌症类型和肿瘤类型的例子，将可提及：腺癌，脉络膜黑素瘤，急性白血病，听神经瘤，壶腹癌，肛门癌，星形细胞瘤，基底细胞瘤，胰腺癌症，结缔组织肿瘤，膀胱癌症，支气管癌，非小细胞支气管癌，乳腺癌症，伯基特淋巴瘤，子宫体癌，CUP综合征，大肠癌症，小肠癌症，小肠肿瘤，卵巢癌症，子宫内膜癌，室管膜瘤，上皮癌症类型，尤因肿瘤，胃肠肿瘤，胆囊癌症，胆管癌，子宫癌症，宫颈癌症，成胶质细胞瘤，妇科肿瘤，颈、鼻和耳肿瘤，血液瘤形成，多毛细胞白血病，尿道癌症，皮肤癌症，脑肿瘤（神经胶质瘤），脑转移，睾丸癌症，垂体肿瘤，类癌，卡波西肉瘤，喉癌症，生殖细胞肿瘤，骨癌症，结肠直肠癌，头-颈肿瘤（颈、鼻和耳区域的肿瘤），结肠癌，颅咽管瘤，在口部区域中和在嘴唇上的癌症，肝癌症，肝转移，白血病，眼睑肿瘤，肺癌症，淋巴结癌症（霍奇金/非霍奇金），淋巴瘤，胃癌症，恶性黑素瘤，恶性瘤，胃肠道的恶性肿瘤，乳腺癌，直肠癌症，成神经管细胞瘤，黑素瘤，脑膜瘤，霍奇金病，蕈样肉芽肿病，鼻癌症，神经鞘瘤，神经母细胞瘤，肾癌症，肾细胞癌，非霍奇金淋巴瘤，少突神经胶质瘤，食管癌，溶骨性和成骨性癌，骨肉瘤，卵巢癌，胰腺癌，阴茎癌症，浆细胞瘤，头和颈的扁平上皮癌，前列腺癌症，咽癌症，直肠癌，视网膜母细胞瘤，阴道癌症，甲状腺癌，Schneeberger病，食道癌症，棘细胞瘤，T-细胞淋巴瘤（蕈样肉芽肿病），胸腺瘤，输卵管癌，眼睛肿瘤，泌尿道癌症，泌尿系统肿瘤，泌尿道上皮癌，外阴癌症，疣牵涉（Warzenbeteiligung），软组织肿瘤，软组织肉瘤，维尔姆斯肿瘤，子宫颈癌和舌癌症。
特别地，实体肿瘤是优选的。此外，优选的是前列腺癌，脑肿瘤，肉瘤，子宫颈癌，卵巢癌，乳腺癌，支气管癌，黑素瘤，头-颈肿瘤，食管癌，直肠癌，胰腺、膀胱和肾癌，肝转移、脑转移和进入淋巴结的转移。
此外，所述活性物质释放系统与常规的高热、放射疗法一起和/或与传统的化学疗法一起的应用和使用是特别优选的。
所述两个在根据本发明的活性物质释放系统的实施中使用的组分既可以同时地也可以相继地通过注射进行施用。
本发明的一个优选的实施方案涉及药物，其中将复合物1和2同时地或相继地引入到患者中。
可以如此来制备根据本发明的药物，从而复合物1和2同时地或相继地（作为分开的产品以试剂盒的形式进行批量生产），特别是通过肿瘤内的、间质的或腹膜内的注射被引入到患者中。在此，原则上这两种顺序都是可能的。要么可以在先前的时刻引入包含活性物质的复合物2，所述活性物质通过后来注射复合物1和随后的升温（如上面所描述的）而解裂下来并因此被激活。但是，反过来，也可以首先将复合物1的贮库引入到身体中，并且在后来，任选地多次地，引入具有活性物质的复合物2，所述活性物质可以通过所提及的升温而特异性地被释放。这之所以是可能的是因为复合物1的纳米颗粒可以在数年内停留在身体内的某一位置，从而可以在长时间内通过少量催化性核酸的反复解裂而一再地激活活性物质。
对于肿瘤学来说优选的是，在去除肿瘤时将根据本发明的包含复合物1和/或复合物2的药物引入到瘤床或者说切除空腔中。
因此，在另一个优选的实施方案中，本发明涉及药物，其中在去除肿瘤时将复合物1和2引入到瘤床中。
此外，本发明的另一个目标是用于从如前面所描述的复合物2上释放活性物质的方法，其包括下列步骤：
i)将如前面所描述的复合物1引入至复合物2的空间邻近处，在允许释放出的具有催化活性的核酸扩散至所述底物寡核苷酸以及对其进行切割的条件下，和
ii)如前面所描述的复合物1主动或被动升温，从而释放出所述具有催化活性的核酸。
附图
图1：显示了借助于根据本发明的活性物质释放系统来进行的荧光染料Alexa-647的解裂，所述荧光染料Alexa-647充当关于任意活性物质的模式物质。中间的曲线（-●-）显示了由于游离的Alexa-647而引起的在反应上清液中荧光的增加，所述Alexa-64在通过在49℃下解杂交而激活具有催化活性的RNA序列后从纳米颗粒-活性物质缀合物中释放出来。从下面起第二条曲线（-▲-）显示，在37℃下不发生解杂交，因为未能检测到上清液中荧光强度的升高。最下面的曲线（-■-）显示了在不存在催化性核酸的情况下的阴性对照。最上面的曲线（-◆-）显示了阳性对照，其中将纳米颗粒-活性物质缀合物与未抑制的具有催化活性的RNA单链一起进行温育。
图2：显示了根据本发明的活性物质释放系统的实施方案，其中将具有催化活性的核酸和具有活性物质的待切割的底物寡核苷酸与两个不同的纳米颗粒相结合。将具有其二氧化硅涂层的纳米颗粒各自在左边描绘成球状物。寡核苷酸抑制剂链通过连接体与纳米颗粒相结合，并且在所述寡核苷酸抑制剂链上杂交有具有催化活性的核酸。在中间描绘了在其上通过连接体而结合了底物寡核苷酸的纳米颗粒，所述底物寡核苷酸在其另一端与活性物质（描绘为星状物）相连接。在这之后显示了释放出的具有催化活性的核酸积聚在底物寡核苷酸上，和最后描绘了经切割的底物寡核苷酸，其释放了活性物质。
图3：活性物质释放系统的示意性描绘。该系统由复合物1和2组成，其中升温导致寡核苷酸抑制剂链与具有催化活性的核酸的解杂交，所述具有催化活性的核酸现在被释放出来并且可以酶促切割其底物分子。而该切割又使治疗性活性物质从复合物2中游离出来，并因此使它激活。
图4：在缓冲液中，在存在纳米颗粒/(L)-寡核苷酸抑制剂链/核酶缀合物的情况下，与底物寡核苷酸相偶联的荧光染料Alexa-647从纳米颗粒/(L)-底物寡核苷酸缀合物上的依赖于温度的释放。在37℃或者49℃下温育1、2、3和4小时后测量上清液中的RFU。作为阳性对照，使用纳米颗粒/(L)-底物寡核苷酸缀合物与游离的L-核酶；作为阴性对照，只使用纳米颗粒/(L)-底物寡核苷酸缀合物与反应缓冲液。
图5：在人血清中，在存在纳米颗粒/(L)-寡核苷酸抑制剂链/核酶缀合物的情况下，与底物寡核苷酸相偶联的荧光染料Alexa-647从纳米颗粒/(L)-底物寡核苷酸缀合物上的依赖于温度的释放。在37℃或者49℃下温育1、2、3和4小时后测量上清液中的RFU。作为阳性对照，使用纳米颗粒/(L)-底物寡核苷酸缀合物与游离的L-核酶；作为阴性对照，只使用纳米颗粒/(L)-底物寡核苷酸缀合物与反应缓冲液。
图6：在血清中L-核酶和R-核酶的稳定性。在人血清中在37℃和给定时间下进行温育后，就其降解来对于各核酶（具有19bp）的30pmol等分试样进行分析。在15%的变性聚丙烯酰胺凝胶中在EtBr染色后在UV-光下显现19bp RNA的降解。A部分显示了在0-48小时内L-核酶的降解，B部分显示了在0–180秒内R-核酶的降解。
实施例
实施例1：通过催化性核酸来进行的荧光染料Alexa-647的依赖于温度的解裂
该实施例1显示了借助于所描述的系统来进行的荧光染料Alexa-647（其充当关于任意活性物质的模式物质）的依赖于温度的解裂。所述催化性核酸为具有序列5’-GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3’（SEQ ID NO:1）的核酶，其与具有序列5’-G CCT CAT CAG TCG AGCC-3’（SEQ ID NO:2）的抑制剂杂交，其中5’-末端的核苷酸携带SH基团。所述双链RNA通过该SH基团和磺基-SMCC交联剂与氧化铁纳米颗粒的氨基基团相连接，所述氧化铁纳米颗粒具有氧化铁核心、SiO2包壳和DIAMO表面官能化。
纳米颗粒-活性物质缀合物由底物寡核苷酸和共价结合的Alexa-647（作为模式物质，以已经偶联的形式获自IBA公司，）组成，具有序列5’-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3’（SEQ ID NO:3），其中5’-末端的核苷酸携带SH基团，所述底物寡核苷酸通过该SH基团和磺基-SMCC交联剂与氧化铁纳米颗粒的氨基基团相连接，所述氧化铁纳米颗粒具有氧化铁核心、SiO2包壳和DIAMO表面官能化。
在图1中，在实验期间的加热期被描绘为中心带。中间的曲线（-●-）显示了由于游离的Alexa-647而引起的在反应上清液中荧光的增加，所述Alexa-64在通过在49℃下解杂交而激活具有催化活性的RNA序列后从纳米颗粒-活性物质缀合物中释放出来。在37℃下（从下面起第二条曲线：-▲-），未发生解杂交并且核酶保持受抑制状态，因此也没有检测到上清液中荧光强度的升高。作为阴性对照（最下面的曲线：-■-），使用在不存在催化性核酸的情况下的纳米颗粒-活性物质缀合物（NP-交联剂-底物链（具有Alexa-647））。作为阳性对照（最上面的曲线：-◆-），将纳米颗粒-活性物质缀合物与未抑制的具有催化活性的RNA单链一起进行温育。
实施例2：用磺基-SMCC来进行的纳米颗粒-核酸偶联
与实施例1类似地，使用磺基-SMCC作为连接体以用于在5’-末端经巯基基团修饰的L-型寡核苷酸和氧化铁纳米颗粒之间的偶联。这对于底物寡核苷酸和寡核苷酸抑制剂链/核酶双链（它们在偶联之前以摩尔比1.1:1在PBS（pH 6.7）中进行杂交）来施行。
表1：所使用的L-型核苷酸
↓为底物寡核苷酸中的切割位点（Ruffner和Uhlenbeck,1990）。
15nm的氧化铁纳米颗粒包含大约550个胺基团/颗粒。首先用1mMTCEP（Sigma）使寡核苷酸还原。为了借助于磺基-SMCC（Sigma）进行偶联，首先于室温在1000rpm（转/分钟）下使氧化铁纳米颗粒与磺基-SMCC以在PBS（pH 7.4）中2.2mM的浓度在用于反应的Thermomixer中温育1小时。通过离心来分离出过量的连接体。随后，用蒸馏水洗涤所述纳米颗粒两次。现在，以65:1的寡核苷酸与纳米颗粒的摩尔比添加经还原的寡核苷酸，并且在4℃下在PBS（pH 6.7）中旋转温育过夜。通过离心来分离出未缀合的寡核苷酸。
实施例3：核酶-纳米颗粒-活性物质释放系统的释放实验
如在实施例2中所描述的那样来制备纳米颗粒/(L)-底物寡核苷酸*缀合物和纳米颗粒/(L)-寡核苷酸抑制剂链/核酶缀合物。所述释放实验在反应缓冲液和人血清中进行。
A.在反应缓冲液中：
将在实施例2中制备的缀合物重悬浮在反应缓冲液（Tris-HCl 50mM,pH 7.5，具有10mM MgCl2）中并以1:1的比例在1.5ml反应容器中混合（两个批料，对于37℃和49℃）。作为阳性对照，将纳米颗粒/(L)-底物寡核苷酸缀合物与0.625μM游离的L-核酶（其具有相同的来自表1的序列）在反应缓冲液中进行调制。相应地，作为阴性对照，将纳米颗粒/(L)-底物寡核苷酸缀合物与反应缓冲液相混合。所有四个反应批料都具有相同的纳米颗粒/(L)-底物寡核苷酸缀合物终浓度。
将一个缀合物批料在37℃下，另一个在49℃下，在Thermomixer中温育1-4小时。将所述两个对照不仅在37℃下而且也在49℃下进行温育，其中未观察到显著的不同。在1、2、3和4小时后取每个批料的等分试样，并立即进行离心。将上清液小心地转移到新的反应容器中。在NanoDrop 3300荧光分光计（Thermo Scientific）中测量上清液的RFU（相对荧光单位）强度。
49℃下的荧光信号显示出荧光染料的明显的、依赖于时间的释放，其在温育增加的情况下几乎达到阳性对照的水平。与此相反，在阴性对照的情况下，与在37℃下一样，即使在4小时后也几乎不发生释放（参见图4）。
B.在人血清中：
不用反应缓冲液而是在人血清中，在37℃或49℃、94.5%空气湿度和5% CO2下，在培养箱中重复在A中所描述的实验。
在人血清中，在49℃下也可以观察到荧光染料的明显的、依赖于时间的释放，其中在此，在存在有经缀合的抑制剂链的情况下通过核酶而引起的释放的强度仅为在阳性对照情况下（在不存在抑制剂链的情况下）的大约一半（参见图5）。此外，在阴性对照中，与在37℃批料的情况下一样，染料的释放相对于在缓冲液中的相应批料而言增加了（比较图5与图4）。
实施例4：R-核酶或L-核酶的血清稳定性测定法
所述稳定性测定法基本上如Klussmann(1996)所描述的那样来进行。人血清S7023获自Sigma（USA）。在37℃、94.5%空气湿度和5%CO2下，在培养箱中将L-核酶（参见表1）和其相应的R-型（各自19bp）以10μM的浓度在90%的人血清中进行温育（对于L-核酶，0-6小时；对于R-核酶，0-180秒）。以1:1的比例将等分试样与终止溶液（8M尿素，50mM EDTA，2%SDS）相混合，并立即在液氮中冷冻。将样品通过Microcon YM-30（Millipore）滤器进行过滤，并各将30pmol RNA在15%的变性聚丙烯酰胺凝胶（7M尿素）中按照大小进行分离。所述凝胶在EtBr溶液（1μg/ml）中染色15分钟，并在UV-光（302nm）下拍照。
即使经过48小时温育，L-核酶也没有显示出降解（图6的A部分），而对于R-核酶，在120秒后，在经E tBr染色的凝胶中就已经不再能够检测到R-核酶了（图6的B部分）。
参考文献
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优选的实施方案为：
1.活性物质释放系统，其由下列构成：与寡核苷酸抑制剂链相连接的纳米颗粒，所述寡核苷酸抑制剂链与具有催化活性的核酸杂交；和与底物寡核苷酸相连接的另一纳米颗粒，所述底物寡核苷酸与治疗性活性物质相连接，所述治疗性活性物质可通过由该具有催化活性的核酸对该底物寡核苷酸进行切割而释放。
2.根据1的活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链通过交联剂与所述纳米颗粒相结合。
3.根据1或2的活性物质释放系统，其中所述底物寡核苷酸通过交联剂与所述纳米颗粒相结合。
4.根据1至3的活性物质释放系统，其中所述至少一个治疗有效的物质选自包括下列物质的组：抗增殖、抗迁移、抗血管发生、抗血栓形成、抗炎、消炎、抑制细胞、细胞毒性、抗凝、抗细菌、抗病毒和/或抗真菌的活性物质，阿片类激动剂，非阿片类镇痛药，非类固醇抗炎药（NSAID），抗偏头痛药，Cox-II抑制剂，β-肾上腺能阻断剂，抗惊厥药，抗抑郁药，Ca2+通道阻断剂，或者用于治疗神经元疾病或神经变性疾病的活性物质。
5.根据4的活性物质释放系统，其中所述至少一个治疗有效的物质选自包括下列物质的组：放线菌素D、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、嘌呤碱和嘧啶碱的拮抗剂、蒽环类、芳化酶抑制剂、天冬酰胺酶、抗雌激素类、贝沙罗汀、博来霉素、布舍瑞林、白消安、喜树碱衍生物、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、烷基化细胞抑制剂、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多西他赛、多柔比星（阿霉素）、脂质体多柔比星、表柔比星、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、氟达拉滨、氟尿嘧啶、叶酸拮抗剂、福美坦、吉西他滨、糖皮质激素、戈舍瑞林、激素和激素拮抗剂、和美新、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、伊立替康、来曲唑、亮丙瑞林、洛莫司汀、美法仑、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米替福新、丝裂霉素、有丝分裂抑制剂、米托蒽醌、尼莫司汀、奥沙利铂、紫杉醇、喷司他丁、丙卡巴肼、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾内酯、塞替派、硫鸟嘌呤、拓扑异构酶抑制剂、托泊替康、曲奥舒凡、维甲酸、曲普瑞林、曲磷胺、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、抑制细胞有效的抗生素。
6.根据4的活性物质释放系统，其中所述至少一个治疗有效的物质选自包括核酸、siRNA、氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、糖蛋白、聚糖或脂蛋白的组，其中前述物质具有抗增殖、抗迁移、抗血管发生、抗血栓形成、抗炎、消炎、抑制细胞、细胞毒性、抗凝、抗细菌、抗病毒和/或抗真菌的特性。
7.根据1至6的活性物质释放系统在制备用于治疗和/或预防增殖性疾病、癌症和细菌感染的药物组合物中的用途。
8.纳米颗粒，其与寡核苷酸抑制剂链相连接，所述寡核苷酸抑制剂链与具有催化活性的核酸杂交，所述具有催化活性的核酸能够切割底物寡核苷酸，所述底物寡核苷酸与另一纳米颗粒和治疗性活性物质相连接。
9.纳米颗粒，其与治疗性活性物质和与底物寡核苷酸相连接，其中所述底物寡核苷酸可被具有催化活性的核酸切割。

Claims (80)

1.活性物质释放系统，其包含：
i)复合物1，其包含至少一个与寡核苷酸抑制剂链相连接的纳米颗粒，其中所述寡核苷酸抑制剂链在生理条件下与具有催化活性的核酸杂交，所述具有催化活性的核酸具有10至100个核苷酸的长度，所述寡核苷酸抑制剂链具有10至100个核苷酸的长度，并且所使用的具有催化活性的核酸的所有分子在生理条件都以杂交状态存在，而在43℃和更高温度的情况下，至少5％的全部所包含的具有催化活性的核酸将解杂交，和
ii)复合物2，其包含与至少一个底物分子相连接的载体，其中所述底物分子与至少一个治疗性活性物质相连接，
其中所述治疗性活性物质可通过所述底物分子的切割而释放，其中所述底物分子在43℃和更高温度下被所述具有催化活性的核酸切割。
2.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链共价地与所述纳米颗粒相结合。
3.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链通过连接体1共价地与所述纳米颗粒相结合。
4.根据权利要求1至2之一的活性物质释放系统，其中所述具有催化活性的核酸选自RNA、DNA、L-RNA、L-DNA和经修饰的核酸。
5.根据权利要求4的活性物质释放系统，其中所述具有催化活性的核酸包含SH-修饰的核苷酸。
6.根据权利要求4的活性物质释放系统，其中所述具有催化活性的核酸具有12至60个核苷酸的长度。
7.根据权利要求4的活性物质释放系统，其中所述具有催化活性的核酸为RNA。
8.根据权利要求4的活性物质释放系统，其中所述具有催化活性的核酸是核酶。
9.根据权利要求8的活性物质释放系统，其中所述核酶是锤头状核酶。
10.根据权利要求4的活性物质释放系统，其中所述具有催化活性的核酸包含序列5’-GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3’(SEQ IDNO:1)。
11.根据权利要求10的活性物质释放系统，其中所述具有催化活性的核酸由序列5’-GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3’(SEQ IDNO:1)组成。
12.根据权利要求3的活性物质释放系统，其中所述连接体1通过氨基基团与交联剂和在所述寡核苷酸抑制剂链的5’-末端处的SH-修饰的核苷酸的SH基团的反应而形成，其中所述氨基基团通过在纳米颗粒表面上的氨基硅烷修饰而引入。
13.根据权利要求12的活性物质释放系统，其中所述交联剂为磺基-SMCC或磺基-GMBS。
14.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链选自RNA、DNA、L-RNA、L-DNA和经修饰的核酸。
15.根据权利要求14的活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链包含SH-修饰的核苷酸。
16.根据权利要求14的活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链具有10至60个核苷酸的长度。
17.根据权利要求14的活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链包含序列5’-G CCT CAT CAG TCG AGC C-3’(SEQ ID NO:2)。
18.根据权利要求14的活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链由序列5’-G CCT CAT CAG TCG AGC C-3’(SEQ ID NO:2)组成。
19.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中在复合物1中，所述寡核苷酸抑制剂链与所述具有催化活性的核酸的比例≥1。
20.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中在复合物1中，所述寡核苷酸抑制剂链与所述具有催化活性的核酸的比例是1至2。
21.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中在复合物1中，具有序列5’-G CCT CAT CAG TCG AGC C-3’(SEQ ID NO:2)的寡核苷酸抑制剂链与具有序列5’-GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3’(SEQ ID NO:1)的具有催化活性的核酸的比例为1.0至1.3。
22.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中在复合物1中，具有序列5’-G CCT CAT CAG TCG AGC C-3’(SEQ ID NO:2)的寡核苷酸抑制剂链与具有序列5’-GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3’(SEQ ID NO:1)的具有催化活性的核酸的比例为1.1。
23.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中所述具有催化活性的核酸在生理条件下与所述寡核苷酸抑制剂链完全杂交，并且在43℃的情况下，至少一个具有催化活性的核酸解杂交。
24.根据权利要求23的活性物质释放系统，其中5％的所结合的、具有催化活性的核酸解杂交。
25.根据权利要求23的活性物质释放系统，其中10％的所结合的、具有催化活性的核酸解杂交。
26.根据权利要求23的活性物质释放系统，其中20％的所结合的、具有催化活性的核酸解杂交。
27.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中所述纳米颗粒具有包含至少一种顺磁性或超顺磁性氧化铁的核心。
28.根据权利要求27的活性物质释放系统，其中所述顺磁性或超顺磁性纳米颗粒在交变磁场中升温。
29.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中所述纳米颗粒具有至少一个包壳。
30.根据权利要求29的活性物质释放系统，其中所述纳米颗粒具有硅烷包壳或者SiO2包壳和硅烷包壳。
31.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中所述底物分子为寡核苷酸。
32.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中所述载体为聚合物，金属颗粒，或者氧化物颗粒，其作为凝胶、微颗粒、微球体或纳米颗粒而存在。
33.根据权利要求32的活性物质释放系统，其中所述纳米颗粒为氧化纳米颗粒。
34.根据权利要求32的活性物质释放系统，其中所述聚合物为生物聚合物。
35.根据权利要求32的活性物质释放系统，其中所述金属颗粒是金颗粒。
36.根据权利要求32的活性物质释放系统，其中所述氧化物颗粒为为表面经修饰的氧化铁微粒。
37.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中所述底物分子共价地与所述载体相连接。
38.根据权利要求37的活性物质释放系统，其中所述底物分子通过连接体2共价地与所述载体相连接。
39.根据权利要求38的活性物质释放系统，其中所述连接体为磺基-SMCC或磺基-GMBS。
40.根据权利要求31的活性物质释放系统，其中所述底物寡核苷酸选自DNA、RNA、L-DNA、L-RNA和经修饰的核酸。
41.根据权利要求40的活性物质释放系统，其中所述经修饰的核酸具有特异性用于末端偶联的官能团。
42.根据权利要求41的活性物质释放系统，其中所述官能团是氨基官能团、巯基官能团、羧基官能团、炔官能团或叠氮化物官能团。
43.根据权利要求40的活性物质释放系统，其中所述底物寡核苷酸具有10至100个核苷酸的长度。
44.根据权利要求40的活性物质释放系统，其中所述底物寡核苷酸具有15至60个核苷酸的长度。
45.根据权利要求40的活性物质释放系统，其中所述底物寡核苷酸具有20至30个核苷酸的长度。
46.根据权利要求40的活性物质释放系统，其中所述底物寡核苷酸包含序列5’-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3’(SEQID NO:3)。
47.根据权利要求40的活性物质释放系统，其中所述底物寡核苷酸由序列5’-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3’(SEQ IDNO:3)组成。
48.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中所述治疗性活性物质选自包括核酸、siRNA、反义RNA、氨基酸、适体、肽、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、脂质、脂蛋白和低分子量活性物质的组。
49.根据权利要求48的活性物质释放系统，其中所述治疗性活性物质为低分子量活性物质。
50.根据权利要求48的活性物质释放系统，其中所述治疗性活性物质具有抗增殖、抑制细胞、细胞毒性、抗迁移、抗血管发生、抗血栓形成、抗炎、抗凝、抗细菌、抗病毒和/或抗真菌的作用。
51.根据权利要求48的活性物质释放系统，其中所述治疗性活性物质具有抑制细胞或细胞毒性的作用。
52.根据权利要求48的活性物质释放系统，其中所述治疗性活性物质为多柔比星或甲氨蝶呤。
53.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中所述治疗性活性物质共价地与所述底物分子相连接。
54.根据权利要求53的活性物质释放系统，其中所述治疗性活性物质通过连接体3共价地与所述底物分子相连接。
55.根据权利要求54的活性物质释放系统，其中所述连接体3选自氨基基团和腙。
56.根据权利要求55的活性物质释放系统，其中甲氨蝶呤通过该氨基基团与甲氨蝶呤的羧基基团之间的肽键进行偶联。
57.根据权利要求54的活性物质释放系统，其中所述治疗性活性物质在其与所述底物分子和/或所述连接体3相结合期间是无活性的，并且随着所述底物分子或者说所述连接体3的释放和/或在随后被细胞吸纳后而被激活。
58.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中只要所述具有催化活性的核酸以从所述寡核苷酸抑制剂链上解离的状态存在，其就可以切割所述底物分子，
下列适用于通过所述具有催化活性的核酸来进行的所述底物分子的切割反应：所述底物分子的浓度≥KM，
其中kcat≥0.05/分钟。
59.根据权利要求58的活性物质释放系统，其中kcat≥0.5/分钟。
60.根据权利要求58的活性物质释放系统，其中kcat≥1/分钟。
61.根据权利要求58的活性物质释放系统，其中kcat≥5/分钟。
62.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中复合物1与复合物2的比例≤2。
63.根据权利要求1的活性物质释放系统，其中复合物1与复合物2的比例≤1。
64.根据权利要求31的活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链、所述具有催化活性的核酸和所述底物寡核苷酸为镜像核酸。
65.根据权利要求64的活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链为L-DNA。
66.根据权利要求64的活性物质释放系统，其中所述寡核苷酸抑制剂链为包含序列5’-G CCT CAT CAG TCG AGC C-3’(SEQ ID NO:2)的L-DNA。
67.根据权利要求63的活性物质释放系统，其中所述具有催化活性的核酸为L-RNA。
68.根据权利要求63的活性物质释放系统，其中所述具有催化活性的核酸为包含序列5’-GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3’(SEQID NO:1)的L-RNA。
69.根据权利要求64的活性物质释放系统，其中所述具有催化活性的核酸为由序列5’-GGC UCG ACU GAU GAG GCG C-3’(SEQ IDNO:1)组成的L-RNA。
70.根据权利要求64的活性物质释放系统，其中所述底物寡核苷酸为L-RNA。
71.根据权利要求64的活性物质释放系统，其中所述底物寡核苷酸为包含序列5’-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3’(SEQ ID NO:3)的L-RNA。
72.根据权利要求64的活性物质释放系统，其中所述底物寡核苷酸为由序列5’-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC-3’(SEQID NO:3)组成的L-RNA。
73.在权利要求1至30之一中定义的复合物1。
74.在权利要求1或者31至56之一中定义的复合物2。
75.包含根据权利要求1至72之一的活性物质释放系统的药物。
76.包含根据权利要求1至72之一的活性物质释放系统的药物，其用于治疗和/或预防增殖性疾病，癌症，炎性疾病，和细菌感染。
77.包含根据权利要求1至72之一的活性物质释放系统的药物，其用于治疗和/或预防自身免疫疾病。
78.根据权利要求76的药物，其中将复合物1和复合物2同时或顺次引入到患者中。
79.根据权利要求76的药物，其中在去除肿瘤时将复合物1和复合物2引入到瘤床中。
80.用于从根据权利要求1或者31至57之一的复合物2上释放活性物质的体外方法，其包括下列步骤：
i)将根据权利要求1至30之一的复合物1引入至复合物2的空间邻近处，在允许释放出的具有催化活性的核酸扩散至所述底物分子以及对其进行切割的条件下，和
ii)复合物1主动或被动升温，从而释放出所述具有催化活性的核酸。
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