WO2011078223A1 - 頸部リンパ節転移分析方法及び頭頸部癌の腫瘍マーカー - Google Patents

頸部リンパ節転移分析方法及び頭頸部癌の腫瘍マーカー Download PDF

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中城公一
浜川裕之
合田啓之
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing cervical lymph node metastasis and a tumor marker for head and neck cancer.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 Sentinel lymph node biopsy has been used clinically for various carcinomas since Morton et al. Reported its usefulness against malignant melanoma in 1992 (Non-patent Document 4). The usefulness has already been reported (Non-patent Documents 2 and 3).
  • lymph node metastasis of squamous cell carcinoma of the head and neck can be determined using QRT-PCR method based on the expression level of PVA (pemphigus vulgaris antigen) gene (Non-patent Document 9).
  • Patent Documents 1 and 2 disclose tumor markers for head and neck cancer.
  • Kazuhiko Sato Hoshio Hirayama et al .: sentinel lymph node biopsy: Ayumi of Acupuncture 192: 147-150,2000.
  • Matsuzuka Takashi Shikano Masato et al .: Prediction of cervical lymph node metastasis by sentinel lymph node biopsy: head and neck tumor 27: 192-197, 2001.
  • Junichi Kihara Naoyuki Kono et al .: Examination of sentinel lymph nodes in cases of oral cancer N0: head and neck tumor 28: 108-113, 2002.
  • the present invention provides a method for analyzing cervical lymph node metastasis of head and neck cancer and a tumor marker for head and neck cancer used therefor.
  • the present invention is a method for analyzing metastasis of head and neck cancer to a cervical lymph node, which is selected from the group consisting of genes represented by SEQ ID NOs: 1 to 36 in the sequence listing in a cervical lymph node sample.
  • the present invention relates to a method for analyzing cervical lymph node metastasis, which comprises measuring the expression level of at least one gene and comparing the expression level with a reference value.
  • the present invention includes, as an aspect thereof, one or a plurality of genes selected from the group consisting of genes represented by SEQ ID NOs: 1 to 36 in the sequence listing, or their expression products and / or expression levels.
  • the present invention also relates to a tumor marker for head and neck cancer used in the method for analyzing cervical lymph node metastasis of the present invention.
  • the present invention has an effect that the possibility of metastasis of head and neck cancer to cervical lymph nodes can be analyzed.
  • FIG. 1 is a graph showing an example in which the expression level of the gene represented by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing (ANXA8L2 mRNA expression level) was measured in head and neck cancer metastatic lymph nodes and normal lymph nodes.
  • FIG. 2 is a graph showing an example in which the expression level of the gene represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing (DSG3 mRNA expression level) was measured in head and neck cancer metastatic lymph nodes and normal lymph nodes.
  • FIG. 3 is a graph showing an example in which the expression level of the gene represented by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing (S100P mRNA expression level) was measured in head and neck cancer metastatic lymph nodes and normal lymph nodes.
  • FIG. 1 is a graph showing an example in which the expression level of the gene represented by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing (ANXA8L2 mRNA expression level) was measured in head and neck cancer metastatic lymph nodes and normal lymph nodes.
  • FIG. 2 is a graph showing
  • FIG. 4 is a graph showing an example in which the expression level (MMP1 mRNA expression level) of the gene represented by SEQ ID NO: 23 in the sequence listing was measured in head and neck cancer metastatic lymph nodes and normal lymph nodes.
  • FIG. 5 is a graph showing an example of the results of detecting ANXA8L and DSG3 gene mRNA by RT-PCR for 8 specimens of CK19 mRNA-negative head and neck cancer metastatic lymph nodes.
  • FIG. 6 is a graph showing an example of the results of detecting ANXA8L and DSG3 gene mRNA by RT-PCR method for 7 metastasis-negative specimens and 12 metastasis-positive specimens.
  • FIG. 7 is a graph showing an example of the results of detection of mRNA for KRT-1, KRT-6A, MMP1, S100P, and ARSI genes by RT-PCR for metastasis-negative 7 specimens and metastasis-positive 12 specimens.
  • the present invention compares the total gene expression levels of head and neck squamous cell carcinoma metastatic cervical lymph nodes and non-cancer-bearing patient-derived cervical lymph nodes (both human cervical lymph nodes). 36 types of genes shown in Table 1 identified as genes whose expression is upregulated and whose expression is not detected in salivary glands can be used as tumor markers indicating the possibility of metastasis of cervical cancer to cervical lymph nodes. Based on this knowledge.
  • cervical lymph node derived from a non-cancer-bearing patient refers to a cervical lymph node provided from a patient with a benign disease (not cancer) that has undergone cervical surgery.
  • a cervical lymph node derived from a non-cancer-bearing patient can show a gene expression state of a cervical lymph node (ie, a normal cervical lymph node) to which cancer has not spread. Therefore, in the cervical lymph nodes where head and neck cancer has metastasized, genes that show higher expression levels than those in non-cancer-bearing patient-derived cervical lymph nodes may cause metastasis of cervical cancer to cervical lymph nodes.
  • Table 1 The 36 genes shown in Table 1 below satisfy this condition.
  • salivary gland cells are often cells in the cervical lymph nodes. Therefore, a gene whose expression is detected in the salivary gland may cause false positives of a gene that commonly shows increased expression only in cancer metastatic cervical lymph nodes. Since the 36 genes shown in Table 1 below are not detected in salivary glands, these genes can be used as tumor markers with a reduced risk of false positive. Among these, ANXA8L2, DSG3, KRT1, KRT6A, ARSI, MMP1 and S100P are preferable as a gene used as a tumor marker from the viewpoint of detection sensitivity of metastasis and false positive reduction.
  • ANXA8L2 KRT1, KRT6A, ARSI, MMP1 And S100P are more preferable, and ANXA8L2 is more preferable.
  • the DSG3 gene is also called a PVA gene (the same applies hereinafter).
  • the present invention is a method for analyzing metastasis of head and neck cancer to a cervical lymph node (hereinafter also referred to as “analysis method of the present invention”), which is arranged in a cervical lymph node sample.
  • Cervical lymph node metastasis comprising measuring the expression level of at least one gene selected from the group consisting of the genes represented by SEQ ID NOs: 1-36 in the column table and comparing the expression level with a reference value It relates to the analysis method.
  • the expression level of at least one gene selected from the group consisting of the genes represented by SEQ ID NOs: 1 to 8 and 10 to 36 in the sequence listing in the cervical lymph node sample is used.
  • Examples include a method for analyzing cervical lymph node metastasis, which comprises measuring and comparing the expression level with a reference value.
  • head and neck cancer refers to cancer that can be formed from the neck excluding the brain and eyes.
  • oral cancer nasal sinus cancer, lip cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, head Includes tumors and ear cancer.
  • tumor marker is a generic name for substances that serve as markers (markers) of cancer cells and are useful as criteria for diagnosis and treatment of cancer.
  • “measuring the expression level of a gene” means measuring the amount of a gene expression product.
  • the “expression product” includes an RNA component contained in total RNA extracted from a cell, and may include a transcription product (mRNA) of a gene.
  • the method for measuring the gene expression level is not particularly limited, and can be performed, for example, by a quantitative PCR method or a DNA microarray method.
  • the gene expression level may be relative to the internal standard, or relative to the sample to be compared (for example, a normal cell sample).
  • the gene to be measured refers to the gene shown in Table 1 above (the genes represented by SEQ ID NOs: 1 to 36 in the Sequence Listing) unless otherwise specified.
  • cervical lymph node sample refers to a lymph node to be analyzed for the presence or absence of metastasis of head and neck cancer, for example, sentinel lymph node, and surroundings where head and neck cancer is present or present. Other cervical lymph nodes, and lymph nodes removed by cervical dissection.
  • total RNA is recovered from the entire lymph node recovered from the subject, cDNA or cRNA is prepared, and quantitative PCR method or DNA microarray is used using them. It is preferable to carry out the method.
  • comparing the expression level with a reference value means comparing the expression level in an analysis sample with a preset reference value.
  • the reference value can be the expression level in normal cervical lymph nodes.
  • the reference value is preferably 3 times or more, more preferably 10 times or more, even more preferably 30 times or more, even more preferably 100 times or more higher than the reference value, the neck of the sample It is possible that head and neck cancer has spread to lymph nodes.
  • the reference value is preferably 3 times or more, more preferably 10 times or more, still more preferably 30 times or more, and even more preferably 100 times or more of the expression level in normal cervical lymph nodes. be able to.
  • the expression level of the sample is higher than a reference value, it can be considered that there is a high possibility that head and neck cancer has spread to the cervical lymph node of the sample.
  • normal cervical lymph nodes can include cervical lymph nodes of normal human individuals, but it is ethically difficult to remove the lymph nodes of a completely healthy person. Therefore, in the present specification, the “normal cervical lymph node” is a cervical lymph node provided from a patient with a benign disease (not cancer) that has undergone cervical surgery. Lymph node ".
  • the number of genes whose expression levels are measured / compared may be one, but from the viewpoint of analysis accuracy, two or more are preferable, five or more are more preferable, and ten or more are more preferable. More preferably, 20 or more types are even more preferable.
  • cervical dissection that is, removal of all lymph nodes (about 30) present in the cervix is generally performed.
  • the analysis method of the present invention to these isolated cervical lymph nodes, it is possible to clarify how many lymph node metastases existed in the cervix, and the number of the lymph node metastasis can be determined according to the number of the lymph nodes. Can be considered and determined.
  • the analysis method of the present invention can also be applied to a method of performing dissection (sentinel lymph node biopsy).
  • the determination of head and neck cancer metastasis to a human lymph node for medical purposes, and the presence or absence of head and neck cancer metastasis to a human lymph node for medical purposes. Does not include judging prescriptions and treatment / surgical plans.
  • the analysis method of the present invention determines the metastasis of head and neck cancer to human lymph nodes for medical purposes, and the method of determining head and neck cancer metastasis to human lymph nodes for medical purposes. It may include determining a prescription and a treatment / surgical plan based on the presence or absence.
  • the present invention provides a head and neck comprising one or a plurality of genes selected from the group consisting of genes represented by SEQ ID NOs: 1-36 in the sequence listing, or their expression products and / or expression levels.
  • the present invention relates to a tumor marker for head cancer (hereinafter also referred to as “tumor marker for head and neck cancer of the present invention”).
  • the expression product may include an RNA strand transcribed using gene DNA as a template, that is, an RNA strand synthesized by RNA polymerase, and an RNA strand modified in a cell after transcription.
  • the RNA strand contained in the expression product is not particularly limited.
  • RNA messenger RNA
  • rRNA ribosomal RNA
  • tRNA transport RNA
  • snRNA nuclear low molecular RNA
  • SnoRNA nucleolar low molecular RNA
  • the tumor marker for head and neck cancer of the present invention can be used as an index of head and neck cancer metastasis in the cervical lymph node. That is, when the expression of the tumor marker for head and neck cancer of the present invention is enhanced in the cervical lymph node, the possibility that metastasis has occurred in the lymph node is increased. Therefore, in one embodiment, the tumor marker for head and neck cancer of the present invention comprises a transcript of a gene selected from the group consisting of genes represented by SEQ ID NOs: 1 to 36 in the sequence list of head and neck cancer, It is a tumor marker of head and neck cancer for use in the analysis method of the invention.
  • the tumor marker for head and neck cancer of the present invention is at least one selected from the group consisting of genes represented by SEQ ID NOs: 1 to 8 and 10 to 36 in the sequence list of head and neck cancer.
  • a tumor marker for head and neck cancer which comprises a gene transcription product and is used in the analysis method of the present invention.
  • the present invention provides, as a further aspect, the use of the tumor marker of the present invention, which comprises analyzing or determining or determining the metastasis of head and neck cancer in a cervical lymph node or a head and neck lymph node sample. Regarding tumors.
  • One embodiment thereof includes the use of the tumor marker of the present invention in the analysis method of the present invention.
  • Example 1 Metastatic lymph nodes (7 cases) derived from patients with head and neck squamous cell carcinoma were used as samples. Moreover, the lymph node (1 example) and salivary gland (5 examples) derived from a non-cancer bearing patient were used as a comparison object sample. Regarding the use of specimens in this study, written consent was obtained after sufficient explanation was given to the patient and family.
  • [Use of tumor marker] The expression level of mRNA of SEQ ID NOs: 6, 9, 13, and 23 (ANXA8L2, DSG3 (PVA), S100P, and MMP1 genes, respectively) in the sequence listing was changed to 9 samples of head and neck squamous cell carcinoma metastatic lymph nodes. The expression level was compared with the expression level in normal lymph nodes (lymph nodes derived from non-cancer-bearing patients). The expression level was measured by the real-time quantification RT-PCR method. That is, 100 ng of TOTAL RNA derived from each lymph node tissue was used as a template, and each mRNA was reverse transcribed and amplified by Light Cycler (Roche Diagnostics) using specific primers.
  • the expression level of each gene was quantified by detecting the amount of amplified product using TaqMan (registered trademark) probe (Applied Biosystems) or SYBR (registered trademark) Green I (Takara, Otsu, Japan).
  • the four genes show expression levels exceeding the expression levels in normal lymph node samples in all head and neck squamous cell carcinoma metastasis lymph node samples, and the four genes represent one sample. All of the head and neck squamous cell carcinoma metastasized lymph node samples except the above showed an expression level exceeding 3 times the expression level in the normal lymph node sample.
  • Example 2 Eight lymph node specimens whose metastasis was determined to be negative in a conventional cancer metastasis gene test for detection of Cytokeratin 19 (CK19) mRNA but whose head and neck cancer had metastasized by microscopic pathological examination Used as a sample. Regarding the use of specimens in this study, written consent was obtained after giving sufficient explanations to the patient and family.
  • CK19 Cytokeratin 19
  • [Use of tumor marker] The expression level of mRNA of the genes of SEQ ID NOs: 6 and 9 in the sequence listing (respectively ANXA8L2 and DSG3 (PVA) genes) was measured for the sample, and the expression level was measured for normal lymph nodes (lymph nodes derived from non-cancer-bearing patients). ) And the expression level in The expression level was measured by the real-time quantification RT-PCR method as in Example 1.
  • Example 3 A new metastatic lymph node (12 cases) derived from a patient with squamous cell carcinoma of the head and neck different from Examples 1 and 2 was used as a sample, and a new lymph node (7 cases) derived from a non-cancer-bearing patient was used as a comparative sample. Using. Regarding the use of specimens in this study, written consent was obtained after sufficient explanation was given to the patient and family.
  • the expression level was measured for the sample, and the expression level was compared with the expression level in the comparative sample.
  • the expression level was measured by the real-time quantification RT-PCR method as in Example 1.
  • FIGS. 6 and 7 The results are shown in FIGS.
  • the expression of ANXA8L2 and DSG3 (PVA) genes was not observed at all in normal lymph nodes.
  • FIG. 7 the expression of KRT-1, KRT-6A, MMP1, S100P, and ARSI genes was also significantly increased in metastatic lymph nodes compared to normal lymph nodes.
  • the present invention is useful, for example, in the field of head and neck cancer treatment.

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Abstract

頭頸部癌の頸部リンパ節転移の分析方法、及び、それに用いる頭頸部癌の腫瘍マーカーの提供。頸部リンパ節試料における、配列表の配列番号１～３６で表される遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定すること、及び、前記発現量を基準値と比較することを含む頸部リンパ節への頭頸部癌の転移を分析する方法。配列表の配列番号１～３６で表される遺伝子からなる群から選択される１若しくは複数の遺伝子、又は、それ若しくはそれらの発現産物及び又は発現量からなり、前記頸部リンパ節転移分析方法に用いる頭頸部癌の腫瘍マーカー。

Description

頸部リンパ節転移分析方法及び頭頸部癌の腫瘍マーカー
　本発明は、頸部リンパ節転移分析方法及び頭頸部癌の腫瘍マーカーに関する。
　頭頸部癌の治療において大きな問題の一つにリンパ節転移の制御が挙げられる。頸部リンパ節転移の有無、さらに転移リンパ節の個数は患者の予後を大きく左右するため、頸部リンパ節の転移様相の正確な把握は治療上必要不可欠である。しかしながら、触診や画像診断（ＣＴ，ＭＲＩ，Ｅｃｈｏ，ＰＥＴ－ＣＴ）などの方法では潜在的なリンパ節転移（約５ｍｍ未満）の検出には限界がある。そこで、より正確なリンパ節転移診断としてセンチネルリンパ節生検が行われている（非特許文献１～３）。センチネルリンパ節生検は１９９２年にMortonらが悪性黒色腫に対してその有用性を報告して以来（非特許文献４）、種々の癌腫に対しても臨床応用がなされており、頭頸部癌に対してもその有用性が既に報告されている（非特許文献２及び３）。
　また、これまでのリンパ節微小転移診断に関する研究の結果、最大径が２００μｍ以上の転移巣が存在すればＨ＆Ｅ染色で検出可能であること、サイトケラチン免疫染色を併用することによりさらに少数の腫瘍細胞でも確認できること、リアルタイム定量化ＲＴ－ＰＣＲ法による遺伝子診断では１から数個の腫瘍細胞が検出可能で、検出のための標的遺伝子としてはSquamous Cell Carcinoma Antigen（ＳＣＣＡ）遺伝子が有用であることが明らかにされている（非特許文献５～８）。さらに、頭頸部扁平上皮癌のリンパ節転移がＰＶＡ（pemphigus vulgaris antigen）遺伝子の発現量に基づきＱＲＴ－ＰＣＲ法を用いて判断できることが開示されている（非特許文献９）。
　また、頭頸部癌の腫瘍マーカーとしては、これまで幾つかの遺伝子が開示されている（特許文献１及び２）。
特開２００７－５２号公報 特開２００９－３４０７１号公報
佐藤一彦、平山星夫　他: 腋窩郭清指標としての錫コロイドを用いた sentinel lymph node biopsy: 医学のあゆみ 192:147-150,2000. 松塚　崇、鹿野真人　他: センチネルリンパ節生検による頸部リンパ節転移予測 : 頭頸部腫瘍 27:192-197,2001. 木原圭一、甲能直幸　他: 口腔癌 N0 症例におけるセンチネルリンパ節の検討: 頭頸部腫瘍28:108-113,2002. Morton D, Wen DR, et al: Technical details of intraoperative lymphatic mapping for early stage melanoma: Arch Surg 127:392-399,1992. Hamakawa H, Fukuzumi M, et al: Genetic detection of micrometastases based on SCC antigen mRNA in cervical lymph nodes of head and neck cancer: Clin Exp Metastasis 17:593-599,1999. Hamakawa H, Takemura K, et al: Histological study on pN upgrading of oral cancer: Virchows Arch 437:116-121,2000. 大西詔子: リアルタイム定量化 PCR 法を用いた口腔癌頸部リンパ節微小転移の遺伝子診断: 愛媛医学21:183-191,2002. 中城公一、新谷　悟、大西詔子、寺門永顕、浜川裕之: 口腔悪性腫瘍におけるセンチネルリンパ節微小転移の術中迅速診断: 頭頸部腫瘍 29:64-69,2003. Ferris L. Robert et al., Cancer Res., vol.65 (6) 2147-2156, 2005.
　しかしながら、頸部リンパ節の転移の正確な把握に有用なさらなる分析方法やそれに用いる頭頸部癌の腫瘍マーカーが望まれている。そこで、本発明は、頭頸部癌の頸部リンパ節転移の分析方法、及び、それに用いる頭頸部癌の腫瘍マーカーを提供する。
　本発明は、頸部リンパ節への頭頸部癌の転移を分析する方法であって、頸部リンパ節試料における、配列表の配列番号１～３６で表される遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定すること、及び、前記発現量を基準値と比較することを含む頸部リンパ節転移分析方法に関する。
　また、本発明は、その態様として、配列表の配列番号１～３６で表される遺伝子からなる群から選択される１若しくは複数の遺伝子、又は、それ若しくはそれらの発現産物及び又は発現量からなり、本発明の頸部リンパ節転移分析方法に用いる頭頸部癌の腫瘍マーカーに関する。
　本発明は、頭頸部癌の頸部リンパ節への転移の可能性を分析できるという効果を奏する。
図１は、頭頸部癌転移リンパ節及び正常リンパ節において、配列表の配列番号６で表される遺伝子の発現量（ＡＮＸＡ８Ｌ２ ｍＲＮＡ発現量）を測定した一例を示すグラフである。 図２は、頭頸部癌転移リンパ節及び正常リンパ節において、配列表の配列番号９で表される遺伝子の発現量（ＤＳＧ３ ｍＲＮＡ発現量）を測定した一例を示すグラフである。 図３は、頭頸部癌転移リンパ節及び正常リンパ節において、配列表の配列番号１３で表される遺伝子の発現量（Ｓ１００Ｐ ｍＲＮＡ発現量）を測定した一例を示すグラフである。 図４は、頭頸部癌転移リンパ節及び正常リンパ節において、配列表の配列番号２３で表される遺伝子の発現量（ＭＭＰ１ ｍＲＮＡ発現量）を測定した一例を示すグラフである。 図５は、ＣＫ１９ｍＲＮＡ陰性頭頸部癌転移リンパ節８検体について、ＡＮＸＡ８Ｌ及びＤＳＧ３遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲ法で検出した結果の一例を示すグラフである。 図６は、転移陰性７検体及び転移陽性１２検体について、ＡＮＸＡ８Ｌ、及びＤＳＧ３遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲ法で検出した結果の一例を示すグラフである。 図７は、転移陰性７検体及び転移陽性１２検体について、ＫＲＴ－１、ＫＲＴ－６Ａ、ＭＭＰ１、Ｓ１００Ｐ、ＡＲＳＩ遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲ法で検出した結果の一例を示すグラフである。
　本発明は、頭頸部扁平上皮癌転移頸部リンパ節と非担癌患者由来頸部リンパ節（いずれもヒト頸部リンパ節）の全遺伝子発現量を比較し、転移リンパ節においてのみ共通して発現亢進が認められ、かつ唾液腺において発現が検出されない遺伝子として同定された下記表１に示す３６種類の遺伝子が、頭頸部癌の頸部リンパ節への転移の可能性を示す腫瘍マーカーとして使用できるという知見に基づく。
　本明細書において「非担癌患者由来頸部リンパ節」とは、頸部の手術を受けた良性疾患（癌ではない）の患者から提供を受けた頸部リンパ節をいう。非担癌患者由来頸部リンパ節は、癌が転移してない頸部リンパ節（すなわち、正常頸部リンパ節）の遺伝子発現状態を示すことができる。したがって、頭頸部癌が転移した頸部リンパ節において、非担癌患者由来頸部リンパ節における発現量よりも多い発現量を示す遺伝子は、頭頸部癌の頸部リンパ節への転移の可能性を示す腫瘍マーカーとして使用できる。下記表１に示す３６種類の遺伝子は、この条件を満たす。
　また、「唾液腺」の細胞は、しばしば頸部リンパ節に存在することがある細胞である。よって、唾液腺にて発現が検出される遺伝子は、癌転移頸部リンパ節においてのみ共通して発現亢進を示す遺伝子の偽陽性の原因となるおそれがある。下記表１に示す３６種類の遺伝子は、唾液腺において発現が検出されないため、これらの遺伝子は前述の偽陽性のリスクが低減された腫瘍マーカーとして使用できる。これらの中でも、転移の検出感度及び偽陽性低減の観点から、腫瘍マーカーとして使用する遺伝子としては、ＡＮＸＡ８Ｌ２、ＤＳＧ３、ＫＲＴ１、ＫＲＴ６Ａ、ＡＲＳＩ、ＭＭＰ１及びＳ１００Ｐが好ましく、ＡＮＸＡ８Ｌ２、ＫＲＴ１、ＫＲＴ６Ａ、ＡＲＳＩ、ＭＭＰ１及びＳ１００Ｐがより好ましく、ＡＮＸＡ８Ｌ２がさらに好ましい。なお、前記ＤＳＧ３遺伝子は、ＰＶＡ遺伝子とも呼ばれる（以下同様）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　［頸部リンパ節転移を分析する方法］
　すなわち、本発明は、１つの態様として、頸部リンパ節への頭頸部癌の転移を分析する方法（以下、「本発明の分析方法」ともいう）であって、頸部リンパ節試料における配列表の配列番号１～３６で表される遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定すること、及び、前記発現量を基準値と比較することを含む頸部リンパ節転移分析方法に関する。
　本発明の分析方法の一実施形態として、頸部リンパ節試料における、配列表の配列番号１～８及び１０～３６で表される遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定すること、及び、前記発現量を基準値と比較することを含む、頸部リンパ節転移分析方法が挙げられる。
　本明細書において「頭頸部癌」とは、脳と眼を除いた首から上にできる癌をいい、一般的に、口腔癌、鼻副鼻腔癌、口唇癌、咽頭癌、喉頭癌、頭部腫瘍、耳の癌を含む。また、本明細書において「腫瘍マーカー」とは、癌細胞の目印（マーカー）となる物質であって、癌の診断や治療の判断基準として役立つ物質の総称をいう。
　本明細書において「遺伝子の発現量を測定すること」とは、遺伝子の発現産物の量を測定することをいう。本明細書において「発現産物」は、細胞から抽出されるトータルＲＮＡに含まれるＲＮＡ成分を含み、遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）を含みうる。遺伝子の発現量の測定方法は、特に制限されず、例えば、定量ＰＣＲ法やＤＮＡマイクロアレイ法によって行うことができる。遺伝子の発現量は、内部標準に対する相対的なものであってもよく、比較対象試料（例えば、正常細胞試料）に対する相対的なものであってもよい。測定対象の遺伝子は、特に言及が無い場合は、上記表１の遺伝子（配列表の配列番号１～３６で表される遺伝子）をいう。
　本明細書において「頸部リンパ節試料」とは、頭頸部癌の転移の有無を分析する対象となるリンパ節をいい、例えば、センチネルリンパ節、並びに、頭頸部癌が存在する又は存在した周辺のその他の頸部リンパ節、及び、頸部郭清により摘出されるリンパ節を含みうる。遺伝子の発現量を測定する場合には、分析精度向上の点から、対象から回収されたリンパ節全体からトータルＲＮＡを回収してｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを調製し、それらを用いて定量ＰＣＲ法やＤＮＡマイクロアレイ法を行うことが好ましい。
　本明細書において「発現量を基準値と比較すること」とは、分析試料における発現量と予め設定しうる基準値とを比較することをいう。一実施形態において、基準値は、正常頸部リンパ節における発現量とすることができる。この形態において、試料の発現量が該基準値よりも好ましくは３倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは３０倍以上、さらにより好ましくは１００倍以上高い場合に、該試料の頸部リンパ節に頭頸部癌の転移している可能性が高いとすることができる。その他の実施形態において、基準値は、正常頸部リンパ節における発現量の好ましくは３倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは３０倍以上、さらにより好ましくは１００倍以上の量とすることができる。この形態において、前記試料の発現量が基準値よりも高い場合に前記試料の頸部リンパ節に頭頸部癌の転移している可能性が高いとすることができる。
　本明細書において「正常頸部リンパ節」は、ヒト正常個体の頸部リンパ節を含みうるが、完全な健常人のリンパ節の摘出は倫理的に困難である。したがって、本明細書において「正常頸部リンパ節」は、頸部の手術を受けた良性疾患（癌ではない）の患者から提供を受けた頸部リンパ節である「非担癌患者由来頸部リンパ節」を含みうる。
　本発明の分析方法において、発現量を測定・比較する遺伝子の数は、１種類でもよいが、分析の精度の点からは、２種類以上が好ましく、５種類以上がより好ましく、１０種類以上がさらに好ましく、２０種類以上がさらにより好ましい。
　現在、頭頸部癌の治療方法においては、頸部郭清、すなわち、頸部に存在するリンパ節（約３０個）を全て摘出することが一般的に行われる。本発明の分析方法をこれらの摘出された頸部リンパ節に適用することにより、頸部に何個のリンパ節転移が存在したかを明らかにすることができ、その個数によって以後の治療方針を検討・決定することができる。
　また、いきなり頸部郭清を行なうのではなく、センチネルリンパ節（１－２個）を摘出し、転移の有無を確認し、転移がなければ頸部郭清を行わず、転移があれば頸部郭清を行う方法（センチネルリンパ節生検）に対しても、本発明の分析方法を適用できる。なお、本発明の分析方法は、一実施形態において、医療目的でヒトのリンパ節への頭頸部癌の転移を判断すること、並びに、医療目的でヒトのリンパ節への頭頸部癌転移の有無に基づき処方や治療・手術計画について判断することを含まない。また、本発明の分析方法は、その他の実施形態において、医療目的でヒトのリンパ節への頭頸部癌の転移を判断すること、並びに、医療目的でヒトのリンパ節への頭頸部癌転移の有無に基づき処方や治療・手術計画について判断することを含んでもよい。
　［頭頸部癌の腫瘍マーカー］
　本発明は、その他の態様として、配列表の配列番号１～３６で表される遺伝子からなる群から選択される１若しくは複数の遺伝子、又は、それ若しくはそれらの発現産物及び又は発現量からなる頭頸部癌の腫瘍マーカー（以下、「本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカー」ともいう）に関する。前記発現産物は、遺伝子のＤＮＡを鋳型として転写されるＲＮＡ鎖、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼにより合成されるＲＮＡ鎖、及び、転写後細胞内で修飾されたＲＮＡ鎖を含みうる。前記発現産物に含まれるＲＮＡ鎖は、特に制限されず、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、運搬ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、及びその他のタンパク質を指令しないＲＮＡ等が挙げられる。これらのＲＮＡ鎖は、転写後、細胞内でプロセッシングされたものも含む。また、本明細書において、「遺伝子」とは、生体機能と関連するＤＮＡの任意の断片をいう。なお、配列表のポリヌクレオチドがＲＮＡを表す場合、ｔ（チミン）塩基は、ｕ（ウラシル）塩基に読み替えるものとする。
　本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーは、頸部リンパ節においる頭頸部癌の転移の指標とすることができる。すなわち、本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーが頸部リンパ節において発現亢進している場合には、該リンパ節に転移が起こっている可能性が高くなる。したがって、一実施形態において、本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーは、頭頸部癌の配列表の配列番号１～３６で表される遺伝子からなる群から選択される遺伝子の転写産物からなり、本発明の分析方法に用いるための頭頸部癌の腫瘍マーカーである。また、その他の実施形態において、本発明の頭頸部癌の腫瘍マーカーは、頭頸部癌の配列表の配列番号１～８及び１０～３６で表される遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物からなり、本発明の分析方法に用いるための頭頸部癌の腫瘍マーカーである。
　本発明は、さらなる態様として、本発明の腫瘍マーカーの使用であって、頸部リンパ節又は頭頸部リンパ節試料における頭頸部癌の転移を分析若しくは判定又は判断することにおける本発明の腫瘍マーカーの腫瘍に関する。その一実施形態として、本発明の分析方法における本発明の腫瘍マーカーの使用が挙げられる。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに説明する。
　（実施例１）
　［試料］
　頭頸部扁平上皮癌患者由来の転移リンパ節（７例）を試料とした。また、比較対象試料として非担癌患者由来のリンパ節（１例）及び唾液腺（５例）を用いた。なお、検体の本研究への使用については、患者本人及び家族へ十分な説明を行った上で、文書による同意を得た。
　［解析］
　各試料を機械的にホモジナイズした後、Isogen（Nippon Gene, Toyama, Japan）を用いてトータルＲＮＡを抽出、精製した。トータルＲＮＡ１μｇをケミルミネッセントＲＴ－ＩＶＴラベリングキット（Applied Biosystems, FosterCity, CA）を用いて増幅し、digoxigenin（Roche Diagnostics, Basel, Switzerland）標識ｃＲＮＡを合成した。合成ｃＲＮＡをヒトゲノムサーベイマイクロアレイ（Applied Biosystems）にハイブリダイゼーションさせたのち、ケミルミネッセントディテクションキット（Applied Biosystems）を用いて洗浄、発色後、Applied Biosystems 1700マイクロアレイアナライザー（Applied Biosystems）を用いて２９，０９８遺伝子の発現定量を行った。各症例の遺伝子発現量の比較はGene Spring GX7.3（Agilent Technologies, SantaClara, CA）を用いて解析した。
　［腫瘍マーカーの同定］
　頭頸部扁平上皮癌転移リンパ節７検体と非担癌患者由来リンパ節１検体の全遺伝子発現量を比較した。非転移リンパ節と比較して、転移リンパ節においてのみ共通して３倍以上の発現亢進が認められ、かつ唾液腺において発現が検出されない遺伝子を腫瘍マーカーとして３６種類同定した（上記表１、配列表の配列番号１～３６で表される遺伝子）。各遺伝子における発現亢進の度合いを上記表１において「変化倍率」として示す。同定されたRefSeqあるいはUniGeneに登録されていない新規遺伝子が２種類認められ（配列表の配列番号８及び１２で表される遺伝子）、また癌との関連が報告されている遺伝子が１２種類含まれていた。
　［腫瘍マーカーの使用］
　配列表の配列番号６、９、１３、及び２３の遺伝子（それぞれ、ＡＮＸＡ８Ｌ２、ＤＳＧ３（ＰＶＡ）、Ｓ１００Ｐ、ＭＭＰ１遺伝子）のｍＲＮＡの発現量を、新たな９サンプルの頭頸部扁平上皮癌転移リンパ節について測定し、その発現量を正常リンパ節（非担癌患者由来のリンパ節）における発現量と比較した。発現量の測定は、リアルタイム定量化ＲＴ‐ＰＣＲ法にて行った。すなわち、各リンパ節組織由来ＴＯＴＡＬ ＲＮＡ　１００ ｎｇを鋳型とし、それぞれのｍＲＮＡを特異的なプライマーを用いてLight Cycler（Roche Diagnostics）にて逆転写及び増幅した。同時に、TaqMan（登録商標）プローブ（Applied Biosystems）又はSYBR（登録商標）Green Ｉ（Takara, Otsu, Japan）を用いて増幅産物量を検出することにより各遺伝子の発現量を定量した。
　その結果を図１～４に示す。これらの図に示すとおり、前記４つの遺伝子は、全ての頭頸部扁平上皮癌転移リンパ節サンプルにおいて正常リンパ節サンプルにおける発現量を超える発現量を示し、また、前記４つの遺伝子は、１サンプルを除く全ての頭頸部扁平上皮癌転移リンパ節サンプルにおいて正常リンパ節サンプルにおける発現量の３倍を超える発現量を示した。
　（実施例２）
　［試料］
　Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１９（ＣＫ１９）ｍＲＮＡを検出対象とした従来のがん転移遺伝子検査では転移が陰性と判断されたが、顕微鏡による病理組織検査によって頭頸部癌が転移していたことが判明したリンパ節８検体を試料として用いた。なお、検体の本研究への使用については、患者本人及び家族へ十分な説明を行った上で、文書による同意を得た。
　［腫瘍マーカーの使用］
　配列表の配列番号６及び９の遺伝子（それぞれ、ＡＮＸＡ８Ｌ２及びＤＳＧ３（ＰＶＡ）遺伝子）のｍＲＮＡの発現量を、前記試料ついて測定し、その発現量を正常リンパ節（非担癌患者由来のリンパ節）における発現量と比較した。発現量の測定は、前記実施例１と同様にリアルタイム定量化ＲＴ‐ＰＣＲ法にて行った。
　その結果を図５に示す。図５に示す通り、ＡＮＸＡ８Ｌ２遺伝子については、全ての検体で発現が検出された。また、ＤＳＧ３（ＰＶＡ）遺伝子は、２検体（２５％）を除き、発現が検出された。
　（実施例３）
　［試料］
　実施例１及び２とは異なる新たな頭頸部扁平上皮癌患者由来の転移リンパ節（１２例）を試料とし、また、比較対象試料として新たな非担癌患者由来のリンパ節（７例）を用いた。なお、検体の本研究への使用については、患者本人及び家族へ十分な説明を行った上で、文書による同意を得た。
　［腫瘍マーカーの使用］
　配列表の配列番号６、９、４、２、２３、１３、及び３２の遺伝子（それぞれ、ＡＮＸＡ８Ｌ、ＤＳＧ３（ＰＶＡ）、ＫＲＴ－１、ＫＲＴ－６Ａ、ＭＭＰ１、Ｓ１００Ｐ、及びＡＲＳＩ遺伝子）のｍＲＮＡの発現量を、前記試料ついて測定し、その発現量を比較対象試料における発現量と比較した。発現量の測定は、前記実施例１と同様にリアルタイム定量化ＲＴ‐ＰＣＲ法にて行った。
　その結果を図６及び７に示す。図６に示す通り、ＡＮＸＡ８Ｌ２及びＤＳＧ３（ＰＶＡ）遺伝子については、正常リンパ節で全く発現が認められなかった。また、図７に示すとおり、ＫＲＴ－１、ＫＲＴ－６Ａ、ＭＭＰ１、Ｓ１００Ｐ、及びＡＲＳＩ遺伝子についても、転移リンパ節において、正常リンパ節に比べて有意に発現が上昇していた。
　本発明は、例えば、頭頸部癌の治療の分野で有用である。

Claims (5)

  1. 頸部リンパ節への頭頸部癌の転移を分析する方法であって、
    頸部リンパ節試料における、配列表の配列番号１～８及び１０～３６で表される遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定すること、及び、
    前記発現量を基準値と比較することを含む、頸部リンパ節転移分析方法。
  2. 基準値が正常頸部リンパ節における発現量であって、前記試料の発現量が基準値よりも３倍以上高い場合に前記試料頸部リンパ節に頭頸部癌の転移している可能性が高いとする基準値である、請求項１記載の頸部リンパ節転移分析方法。
  3. 基準値が正常頸部リンパ節における発現量の３倍以上の量であって、前記試料の発現量が基準値よりも高い場合に前記試料頸部リンパ節に頭頸部癌の転移している可能性が高いとする基準値である、請求項１記載の頸部リンパ節転移分析方法。
  4. 前記遺伝子が、配列表の配列番号６で表されるＡＮＸＡ８Ｌ２遺伝子である、請求項１から３のいずれかに記載の頸部リンパ節転移分析方法。
  5. 配列表の配列番号１～８及び１０～３６で表される遺伝子からなる群から選択される１若しくは複数の遺伝子、又は、それ若しくはそれらの発現産物及び又は発現量からなり、請求項１から３のいずれかに記載の頸部リンパ節転移分析方法に用いる、頭頸部癌の腫瘍マーカー。
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