CN116075598A

CN116075598A - 用于鉴定人类受试者的医学病状的方法

Info

Publication number: CN116075598A
Application number: CN202180033608.2A
Authority: CN
Inventors: 阿希什·特里帕西
Original assignee: 23 Jigai Private Ltd
Current assignee: 23 Jigai Private Ltd
Priority date: 2020-05-08
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2023-05-05
Also published as: AU2021267468A1; JP2023529064A; ZA202211940B; KR20230008756A; IL297967A; US20230212688A1; BR112022022585A2; CA3177987A1; EP4146830A1; WO2021225527A1; MX2022013833A

Abstract

本公开公开了一种用于检测受试者的医学病状的体外和非侵入性方法。所述方法涉及从样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；从步骤的所述混合物获得核酸；用所述核酸执行测定以分析来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较。本公开还提供了一种用于预测癌症的发作和用于预测癌症的存在的方法。本文还公开了一种治疗癌症的方法。此外，还公开了一种试剂盒和检测试剂盒。

Description

用于鉴定人类受试者的医学病状的方法

技术领域

本公开广泛涉及医疗保健技术领域，并且具体地提供了用于检测人类受试者的医学病状的存在或不存在的简易方法。如本文所公开的方法还从血液样品中检测人类受试者的炎性病状的存在或不存在。进一步地，如本公开所描述的方法还检测受试者的癌症的存在或不存在或即将发生。如本文所描述的方法是涉及分析从人类受试者获得的样品的体外方法。

背景技术

由于人基因组的完成和下一代测序技术的发展，已经加速了对疾病的遗传病因的研究，这开启了将个体基因组的改变翻译为临床相关信息以协助疾病诊断和治疗、临床决策策略的愿景。这些努力以海量数据的形式产生了大量潜在有用的信息，从而促进了生物医学研究。然而，对于研究者而言，应用和阐述此信息仍然是繁琐且耗时的，因为突变谱的临床相关分子指纹源自通过活检手术提取的组织。

活检是涉及在检查中取出组织用于疾病诊断和进一步治疗方法的公知技术。通常，活检是侵入性的，并且涉及将组织从其自然环境中取出的复杂的外科手术。组织活检是癌症的“黄金标准”，但有趣的是，许多非癌组织(即，病变组织)也被切除以便检测疾病的起源、传播(transmission)、进展等，这稀释了原始疾病数据并且导致包含误诊的假阳性。几乎所有的组织都可以通过活检进行研究，包含肌肉、甲状腺、膀胱、心脏、前列腺、皮肤、肺、淋巴结、肝、肾、神经等。科学文献中包含活检的一些疾病是脑白质病变中的皮质脱髓鞘，用于多发性硬化的早期检测(Lucchinetti等人2011)；用于肾疾病、肝硬化肝病、丙型肝炎相关肾小球肾炎和球蛋白性血管炎、单克隆丙种球蛋白病等的经皮肾活检(Hogan,Mocanu和Berns 2016)；用于检测骨关节炎患者的组织中的单核细胞浸润、纤维化、血管生成、巨噬细胞浸润和衬里层增厚的滑膜活检(Ene等人2015)；用于炎性皮肤病症的剃削、穿刺或切片活检(Harvey,Chan和Wood 2017)；用于评估COPD的计算机断层扫描导向肺活检(Asai等人2013)；心肌活检(Francis和Lewis 2018)；用于肝硬化患者的肝活检(Sherman等人2007)等。然而，大多数组织活检会导致手术并发症、出血和不良副作用等，并且因此与如血液、尿液、唾液等生物流体测试相反，不推荐组织活检。组织活检很难执行，导致疼痛，通常会使手术出现不适感，可能无法鉴定肿瘤的确切解剖学位置，或者可能由于手术切除血管生成富集区而进一步引起促进转移的并发症。由于组织活检手术的复杂性和所获得的混合结果，以及缺乏与关于待研究的组织与受试者的病状的此类研究相关的明确性，在此工作领域存在着知识鸿沟。

干细胞，特别是胚胎源干细胞，具有多能性标志物，即Oct4、Nanog、Sox2和其异构体，这些标志物表明在发育、稳态和老化过程中分化为形成器官的多种组织的潜力不同。由于干细胞促成组织发育，因此其充当表明组织损坏和损伤的分子生物传感器，即医学病状的标志。因此，干细胞标志物是用于确定医学病状的严重程度的重要生物标志物，并且鉴定体液中的胚胎样干细胞标志物可以非侵入性地检测医学病状。

因此，本领域迫切需要部署用于确定医学病状的严重程度以及鉴定体液中的胚胎样干细胞标志物以非侵入性地检测医学病状的方法。

发明内容

在本公开的一方面，提供了一种用于检测受试者的医学病状的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为1.1-3倍检测到所述受试者体内存在医学病状。

在本公开的另一方面，提供了一种用于预测受试者的癌症的发作的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为3-5倍预测了所述受试者的癌症的发作。

在本公开的另一方面，提供了一种用于检测受试者的癌症的存在的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平增加至少5倍检测到所述受试者体内存在癌症。

在本公开的另一方面，提供了一种用于监测对抗癌疗法的应答的体外方法，所述方法包括：(a)在抗癌疗法期间的一个时间点获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与参照物中的非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平进行比较，所述比较监测到所述对抗癌疗法的应答。

在本公开的另一方面，提供了一种用于检测对抗癌疗法的积极应答的体外方法，所述方法包括：(a)在施用抗癌疗法之前获得样品-I；(b)在施用所述抗癌疗法之后获得样品-II；(c)从所述样品-I富集非常小的胚胎样干细胞以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物-I；(d)从所述样品-II富集非常小的胚胎样干细胞以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物-II；(e)从所述混合物-I获得核酸-I；(f)从所述混合物-II获得核酸-II；(g)用所述核酸-I和所述核酸-II独立地执行测定以分析Oct4A的表达水平；以及(h)将来自所述核酸-II的所述Oct4A的表达水平与来自所述核酸-I的所述Oct4A的表达水平进行比较，其中与来自所述核酸-I的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述核酸-II的所述Oct4A的表达水平降低检测到对癌症治疗的积极应答。

在本公开的另一方面，提供了一种用于检测癌症的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；(e)将所述样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平相比，所述样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平增加了>5倍指示癌症的存在；以及(f)对所述核酸执行基于序列的测定并分析至少一种癌症相关标志物中的突变，其中所述至少一种癌症相关标志物中的突变的存在指示了基于所分析的所述癌症相关标志物的特定类型的癌症的存在。

在本公开的另一方面，提供了一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；(e)将所述样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，所述样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平增加了>5倍检测到癌症；以及(f)向所述受试者施用抗癌疗法以治疗癌症。

在本公开的另一方面，提供了一种用于对受试者的癌症进行分级的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为5-10倍指示了所述受试者的I期癌症。

在本公开的另一方面，提供了一种用于对受试者的癌症进行分级的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为10-15倍指示了所述受试者的II期癌症。

在本公开的另一方面，提供了一种用于对受试者的癌症进行分级的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为15-20倍指示了所述受试者的III期癌症。

在本公开的另一方面，提供了一种用于对受试者的癌症进行分级的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为20至更多倍指示了所述受试者的IV期癌症。

在本公开的一方面，提供了一种用于检测受试者的医学病状的体外方法，所述方法包括：(a)获得血液样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析所述细胞中的Oct4A的甲基化水平；以及(e)将来自所述样品的所述细胞中的所述Oct4A的甲基化水平与对照样品中的Oct4A的甲基化水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的甲基化水平相比，来自所述样品的所述细胞中的所述Oct4A的甲基化水平的调节指示了所述受试者的医学病状。

在本公开的另一方面，提供了一种用于检测受试者的癌症的体外方法，所述方法包括：(a)获得血液样品；(b)从所述样品富集细胞，以获得包括所述细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析所述细胞中的Oct4A的甲基化水平；以及(e)将来自所述样品的所述细胞中的所述Oct4A的甲基化水平与对照样品中的Oct4A的甲基化水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的甲基化水平相比，来自所述样品的所述细胞中的所述Oct4A的甲基化水平的调节指示了所述受试者的癌症。

在本公开的另一方面，提供了一种用于检测癌症的体外方法，所述方法包括：(a)获得血液样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述细胞的混合物；(c)从所述细胞分离线粒体；(d)从步骤(c)的所述混合物获得核酸；以及(e)对所述核酸执行基于序列的测定并分析至少一种癌症相关标志物中的突变，其中所述至少一种癌症相关标志物中可能或可能不调节核Oct4A水平的突变的存在指示了基于所分析的所述癌症相关标志物的特定类型的癌症的存在。

在本公开的另一方面，提供了一种用于检测受试者的癌症的存在的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得血液样品；(b)枚举所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(c)将所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量增加检测到所述受试者体内存在癌症。

在本公开的另一方面，提供了一种用于预测受试者的癌症的发作的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得血液样品；(b)枚举所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(c)将所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量增加预测了所述受试者的癌症的发作。

在本公开的另一方面，提供了一种用于检测受试者的医学病状的存在的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得血液样品；(b)枚举所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(c)将所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量增加检测到所述受试者体内存在医学病状。

在本公开的另一方面，提供了一种用于检测受试者的癌症的存在的方法，所述方法包括：(a)在体内枚举受试者的血液中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(b)将所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量与对照中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照中的非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量增加检测到所述受试者体内存在癌症。

在本公开的另一方面，提供了一种用于预测受试者的癌症的发作的方法，所述方法包括：(a)在体内枚举受试者的血液中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(b)将所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量与对照中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照中的非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量增加预测了所述受试者的癌症的发作。

在本公开的另一方面，提供了一种用于检测受试者的医学病状的存在的方法，所述方法包括：(a)在体内枚举受试者的血液中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(b)将所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量与对照中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照中的非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量增加检测到所述受试者体内存在医学病状。

在本公开的另一方面，提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：(a)用于分析选自由包括非常小的胚胎样干细胞的混合物中的Oct4A、星状菌属(Stella)和脆弱拟杆菌(Fragilis)组成的组的至少一种生物标志物的表达水平的引物组；(b)用于执行定量PCR测定的试剂；(c)用于执行全基因组或外显子组或转录组测序的试剂；以及(d)用于分析序列谱的至少一个组织特异性阵列。

参考以下描述和所附权利要求将更好地理解本主题的这些和其它特征、方面和优点。提供本发明内容是为了以简化形式引入一系列概念。本发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分并且被包含在内以进一步展示本公开的各方面。通过参考附图与本文所呈现的具体实施例的详细描述的组合，可以更好地理解本公开。

图1描绘了根据本公开的实施方案的HrC标度(标度将来自VSEL的Oct4A的表达与医学病状相关联)，其示出了被证明与不同癌症期有关的不同范围。

图2描绘了根据本公开的实施方案的参加研究的癌症患者的类型分布。

图3描绘了根据本公开的实施方案的饼状图，其示出了基于受试者的HrC评分被鉴定为非癌症(绿色)、炎症和高危(深黄色)、I期癌症(粉红色)、II期癌症(红色)、III期癌症(红色)和IV期癌症(紫色)的受试者的分布。

图4描绘了根据临床研究参与者的数据对应于1,000个患者样品点的点阵图值。根据本公开的实施方案，所有附图均通过ggplot库使用R包进行绘制，从而示出了基于统计分析的HrC测试的性能评估。

图5描绘了代表性信息图形图像，其概述了临床研究筛选、招募、分布、分析和阐述的过程。通过对研究受试者进行研究并且基于HrC值进行分类，在研究中获得了代表性数据。图形表示基于受试者的HrC值按升序排列的受试者的分布。根据本公开的实施方案，这些受试者被鉴定为非癌症(绿色)、炎症和高危(深黄色)、I期癌症(粉红色)、II期癌症(红色)、III期癌症(褐红色)和IV期癌症(紫色)。

图6描绘了根据本公开的实施方案的基于受试者的HrC值排列按升序布置并且被鉴定为非癌症、炎症、高危和I期癌症的受试者的分布。

图7描绘了根据本公开的实施方案的基于受试者的HrC值排列按升序布置并且被鉴定为非癌症和II期癌症的受试者的分布。

图8描绘了根据本公开的实施方案的基于受试者的HrC值排列按升序布置并且被鉴定为非癌症和III期癌症的受试者的分布。

图9描绘了根据本公开的实施方案的基于受试者的HrC值排列按升序布置并且被鉴定为非癌症和IV期癌症的受试者的分布。

图10描绘了根据本公开的实施方案的从健康受试者和癌症患者的血液获得的非常胚胎样干细胞(VSEL)的数量的比较分析。

图11描绘了根据本公开的实施方案的用于定量受试者体内的VSEL以将其与所述受试者的医学病状相关联的方式。

图12描绘了根据本公开的实施方案的使用DriverDBv3数据库基于TCGA数据的33种癌症类型中(根据基于血液的遗传测试获得的)前56种基因的表达谱。

图13描绘了基于3个癌症基因组数据库的33种癌症类型中(根据基于血液的遗传测试获得的)前56种基因的表达谱。根据本公开的实施方案，使用jvenn绘制数据。

图14描绘了根据本公开的实施方案的骨肉瘤患者的活检中(根据基于血液的遗传测试获得的)靠前的粘蛋白基因和突变的表达谱。

具体实施方式

本领域的技术人员将意识到，除了具体描述的那些之外，本公开可以进行变化和修改。应当理解，本公开包含所有此类变化和修改。本公开还包含在本说明书中单独地或共同地参考或指示的所有此类步骤、特征、组合物和化合物，以及此类步骤或特征中的任何或更多个步骤或特征的任何和所有组合。

定义

为了方便起见，在进一步描述本公开之前，此处描述了说明书中采用的某些术语和实例。这些定义应该根据本公开的其余部分来阅读并且如本领域的技术人员那样来理解。本文所使用的术语具有本领域技术人员公认和已知的含义，然而，为了方便和完整起见，特定术语和其含义阐述如下。

使用冠词“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”来指代所述冠词的语法宾语中的一个或多于一个(即，至少一个)。

术语“包括(comprise)”和“包括(comprising)”以包容的、开放的意义使用，意味着可以包含另外的元素。所述术语并不旨在被解释为“仅由…组成”。

贯穿本说明书，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise)”以及如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”等变体应当理解为意指包含所述的要素或步骤、或要素或步骤的组，但不排除任何其它要素或步骤或要素或步骤的组。

术语“包含(including)”用于表示“包含但不限于”。“包含”和“包含但不限于”可互换地使用。

术语“对照样品”是指来自健康受试者的样品。样品应当是血液样品或尿液样品或组织样品或痰样品。

对照样品是指从相应样品获得的VSEL，以便能够将从样品获得的VSEL与从对照样品获得的VSEL的Oct4A表达水平进行比较。可替代地，“对照样品”是指所关注的相关受试者的VSEL中管家基因(例如18S rRNA)的表达。然而，可以设想，本领域的技术人员可以采用选自18S rRNA、ACTB、ATP5B、CyC1、EIF4A2、GAPDH、RPL13A、SDHA、TOP1、UBC、YWHAZ、PGK1、PPIA、RPLPO、ARBP、B2M、TFRC、GUSB、HMBS、HPRT1、TBP的任何管家基因作为对照。

术语“医学病状”包含所有遗传或先天性病症、病变、疾病、损伤或超出正常、适龄人类变异范围的生理或心理病状。

术语“癌症”是指哺乳动物中以不受调节的细胞生长为特征的生理病状。如本公开中所使用的术语“癌症”旨在包含良性、恶性癌症、潜伏肿瘤或微转移瘤。癌症类型包含但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤(包含髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包含脂肪肉瘤和滑液细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包含类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞瘤)、间皮瘤、神经鞘瘤(包含听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤和白血病或淋巴系统恶性肿瘤。癌症的更具体的实例包含乳腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、胰腺癌、宫颈癌、结肠癌、骨肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、膀胱癌、胃肠道间质瘤(GIST)、肾癌(例如肾细胞癌)、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包含小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、包含胃肠癌的胃部癌或胃癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、肝肿瘤、乳腺癌(包含转移性乳腺癌)、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞肿瘤、肛门癌、阴茎癌、默克尔细胞癌(Merkel cell cancer)、真菌病、睾丸癌、食道癌、胆道肿瘤、头颈部癌以及B细胞淋巴瘤(包含低度/滤泡型非霍奇金氏淋巴瘤(nonHodgkin's lymphoma，NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL；中度/滤泡型NHL；中度弥散性NHL；高度成免疫母细胞性NHL；高度成淋巴细胞性NHL；高度小无核裂细胞性NHL；巨大肿块NHL、套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；以及瓦登斯特陆巨球蛋白血症(Waldenstrom'sMacroglobulinemia))；慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；以及移植后淋巴增生异常(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)以及梅格斯综合征(Meigs'syndrome)。

术语“检测(detects或detection)”是指使用来自患者的样品在活体患者外部执行的检测。

术语“预测(predicts或prediction)”是指知道将来或适当时间将要发生的事情的行为。

术语“血液样品”是指从受试者获得的全血样品。如本文所公开的方法的范围从获得血液样品的阶段开始，所述方法不涉及任何侵入性技术，也不涉及对受试者进行手术。术语“血液样品”还涵盖包含任何形式的处理血液样品。通过处理，本公开旨在覆盖用于富集特定细胞群的任何方法或仅仅是进行处理，以便能够通过“体外”方法将血液样品用于测试。

术语“体外”是指在试管、培养皿或活生物体外部的其它地方执行或发生的任务或方法或实验。

术语“非常小的胚胎样干细胞”或“VSEL”是指本领域中公知的多能干细胞类型的细胞。根据本公开，VSEL的尺寸小于7微米。

术语“细胞游离正常或肿瘤DNA”或“cfDNA”是指本领域中公知的从非多能或多能细胞获得的在血液中循环的核酸类型。

术语“循环肿瘤DNA”或“ctDNA”是指本领域中公知的从非多能/多能细胞获得的在血液中循环的肿瘤细胞的核酸类型。

术语“细胞游离正常或肿瘤RNA”或“cfRNA”是指本领域中公知的从非多能/多能细胞获得的在血液中循环的核酸类型。

术语“循环肿瘤细胞”或“CTC”是指本领域中公知的在血液中具有非多能/多能性质的肿瘤细胞类型。

术语“癌症干细胞”或“CSC”是指本领域中公知的血液中的原始非多能/多能癌细胞类型。

术语“生物标志物”是指作为核酸的生物分子，并且用于表征特定细胞群。所述术语旨在覆盖核酸的DNA和RNA形式两者。术语“非常小的胚胎样干细胞的生物标志物”是指可以用于表征VSEL群的任何生物标志物。

术语“受试者”是指使用本公开的体外方法取得其血液或组织样品进行分析的任何哺乳动物。例证基于用作受试者的人。

术语“图像分析”是指用于枚举受试者的血液或组织样品中VSEL群的数量以检测癌症的存在或不存在以及癌症期的任何侵入性和非侵入性成像技术。图像分析还可以帮助鉴定受试者的医学病状的存在或不存在。

术语“侵入性”是指涉及通过切口或插入器械进入活体的任何技术。

术语“体液”是指人体分泌的任何液体。其是指血液或痰或尿液，或来自人体的任何其它类型的液体。

术语“线粒体”是指包含DNA/RNA的细胞器，其用于测序、转录组学分析以确定受试者的医学病状。

根据科学文献，癌症相关标志物包括癌症研究领域中所有公知的癌症相关标志物。本文一并提及了癌症相关标志物的非限制性列表，ABL1、EVI1、MYC、APC、IL2、TNFAIP3、ABL2、EWSR1、MYCL1、ARHGEF12、JAK2、TP53、AKT1、FEV、MYCN、ATM、MAP2K4、TSC1、AKT2、FGFR1、NCOA4、BCE11B、MDM4、TSC2、ATF1、FGFR1OP、NFKB2、BEM、MEN1、VHL、BCL11A、FGFR2、NRAS、BMPR1A、MLH1、WRN、BCL2、FUS、NTRK1、BRCA1、MSH2、WT1、BCL3、GOLGA5、NUP214、BRCA2、NF1、BCL6、GOPC、PAX8、CARS、NF2、BCR、HMGA1、PDGFB、CBFA2T3、NOTCH1、BRAF、HMGA2、PIK3CA、CDH1、NPM1、CARD11、HRAS、PIM1、CDH11、NR4A3、CBEB、IRF4、miR145、PEAG1、CDK6、NUP98、CBEC、JUN、PPARG、CDKN2C、PAEB2、CCND1、KIT、PTPN11、CEBPA、PME、CCND2、KRAS、RAF1、CHEK2、PTEN、CCND3、ECK、REE、CREB1、RB1、CDX2、LM02、RET、CREBBP、RUNX1、CTNNB1、MAF、ROS1、CYLD、SDHB、DDB2、MAFB、SMO、DDX5、SDHD、DDIT3、MAML2、SS18、EXT1、SMARCA4、DDX6、MDM2、TCL1A、EXT2、SMARCB1、DEK、MET、TET2、FBXW7、SOCS1、EGFR、MITF、TFG、FH、STK11、ELK4、MLL、TLX1、FLT3、SUFU、ERBB2、MPL、TPR、FOXP1、SUZ12、ETV4、MYB、USP6、GPC3、SYK、ETV6、IDH1、TCF3和其组合。类似地，根据科学文献，非限制性基因的列表包括疾病研究领域中所有与医学病状相关的标志物。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本公开的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述了优选方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文。

本公开的范围不受本文所述的具体实施方案的限制，所述具体实施方案旨在仅用于例示的目的。如本文所述，功能等效的产物、组合物和方法显然在本公开的范围内。癌症只是根据本公开的医学病状的一个方面，因为其作为实例被广泛研究，但本发明涉及所有医学病状。

癌症与突变的基因有关，并且对肿瘤相关遗传改变的分析越来越多地用于诊断、预后和治疗目的。近十年来，基于患者肿瘤的分子特征的“个性化”或“分层化”管理已进入常规临床实践。实体瘤的遗传谱目前从外科手术或活检样本中获得；然而，由于其侵入性性质，手术不能总是惯常进行。首先，从同一患者获得的多个肿瘤样本的综合表征说明同一肿瘤的不同区域之间存在肿瘤内异质性(空间异质性)以及同一患者中原发性肿瘤与局部或远处复发之间存在肿瘤内异质性(时间异质性)(Gerlinger等人2012)。此外，最近的研究已经表征了随着原发性肿瘤中以较小频率存在的抗治疗性亚克隆的出现肿瘤特征随时间的动态变化(Bedard等人2013)。因此，肿瘤间和肿瘤内异质性为指导肿瘤学临床决策带来了关键挑战，因为活检在捕获患者肿瘤的完整基因组景观时可能不准确(Bedard等人2013)。其次，肿瘤的完整“图片”通常受到肿瘤可及性的限制，因为在初始诊断时以及在整个疾病治疗过程中，与获取组织所需的侵入性手术相关的临床并发症的发生率增加(Mlika等人2016)。许多晚期癌症患者的体力状态不佳也可能限制令人不舒服的介入性活检手术的作用(Mlika等人2016)。此外，由于诊断需求增加和每位患者递送的组织数量减少，生物标志物检测的重要障碍是足够数量的组织的可得性(例如，肿瘤细胞性和样本的大小)。多达80％的患有晚期疾病的癌症患者只有来自小活检或细胞学检查的组织，从而限制了执行另外的测试的能力，并且多达31％的患者没有可用的组织(Wong等人2014)。即使可以收集组织，如福尔马林固定等保存方法也可能在1-25％等位基因频率范围中显示出高水平的C>T/G>A转变，从而可能导致分子测定的假阳性结果(Wong等人2014)。最后，组织活检还增加了患者护理成本，并且获得结果的周转时间有时可能比医生预期的用于患者治疗的时间要长。鉴于组织活检使用的这些局限性，当前需要观察肿瘤遗传学和肿瘤动力学的新方法。

最近，基于DNA甲基化检测循环游离DNA中的CpG残基已被确定为常见癌症以及如神经退行性病变和精神病症等其它疾病的通用生物标志物。然而，基于DNA甲基化的检测技术的一些缺点是(1)耗时且漫长的手术；(2)相对昂贵的技术；(3)检测高度依赖于测定条件和特定DNA限制性位点中CpG残基的存在；(4)需要大量的DNA，这在疾病的早期阶段几乎不存在；以及(5)早期筛查敏感性非常低，尤其是在检测的I期，这是预防癌症进展的关键期。

非常小的胚胎样干细胞(VSEL)是在许多组织中发现的原始干细胞并且具有多能性质，即分化成多种细胞类型/组织的能力。VSEL本质上是静止的，但在致癌应激下会被激活并具有分化成癌症干细胞或肿瘤起始细胞的能力。这些细胞随后导致癌症的引发、进展和转移。在指示多能性的胚胎干细胞标志物中，Oct4和其异构体(Oct4A、Oct4b、Oct4bl)(Wang和Dai,2010)与癌症进展、疾病期和疾病生存有关。Oct4A是多能性的主调节器，其在早期胚胎发生中经历甲基化以关闭基因表达。因此，成体体细胞不表达Oct4A，然而，有报道称Oct4A通过脐带血间充质干细胞和骨髓源性基质细胞进行表达。更重要的是，Oct4A在癌细胞系和癌组织中以低水平表达(Li等人,2015)，因此，这意味着一些癌细胞的多能状态可能归因于癌症干细胞起源。事实上，各种癌症干细胞也被证明表达Oct4A，因此，这意味着肿瘤引发细胞表达此基因。在癌症的早期阶段期间，肿瘤引发细胞脱落到血液循环中，并且指示转移和侵袭之前的疾病引发。这些细胞以及在血流中循环的细胞游离DNA可能导致Oct4A多能性标志物表达，所述多能性标志物使得能够以合理的准确性(即高敏感性和特异性)对各种类型的癌症进行早期检测以及对癌症进行分级。而且，各种癌组织和肿瘤细胞(在其循环或脱落到血液循环之前)、驻留癌症干细胞以及一些如来自成人牙齿的牙髓干细胞、良性前列腺等正常组织表达Oct4A。此外，已知成纤维细胞暴露于如缺氧(2％氧和FGF2)等微环境变化会诱导Oct4A。这可能意味着，响应于组织损坏、损伤或患病状况，Oct4A在所关注的组织中高度表达，在血液样品中也有对应的表达。由于癌细胞和VSEL两者都具有Oct4A作为常见标志物，并且此标志物的过表达与转移和侵袭性有关，因此，本公开公开了一种用于检测受试者的医学病状的体外方法。本公开的方法基于对外周循环血液中任何细胞类型的Oct4A生物标志物的检测，包含但不限于非多能起源的正常/肿瘤细胞游离DNA、正常/肿瘤细胞游离RNA、癌症干细胞、循环肿瘤细胞等，具体地非常小的胚胎样干细胞。根据本公开，所述方法不仅检测如癌症等医学病状，还检测癌症期、患者生存状态、肿瘤治疗的效果等，而不涉及任何侵入性技术。

因此，本公开公开了来自VSEL的Oct4A作为标志物，用于早期检测(或不存在癌症)以及根据癌症期(I、II、III、IV)对癌症进行分级。本公开公开了一种数学标度，称为HrC标度，其根据本文指示的值范围与不同癌症期在数字上成比例。

根据本公开的方法包括从血液、组织中分离VSEL，并使用分离的VSEL/富集的VSEL作为检测癌症或检测任何医学病状的诊断工具。基于从血液/组织中分离的VSEL中的Oct4A水平，所述方法能够将Oct4A的表达不仅与癌症的存在或不存在相关联，还与包含实体瘤、血液系统恶性肿瘤和肉瘤的各种癌症的癌症期相关联，这导致了称为HrC的数学标度的发展。HrC标度基于以下评分将VSEL Oct4A表达与癌症联系起来：0-2：指示癌症/炎症不存在；2-6(是指Oct4A表达水平变化1.1-3倍)：指示如糖尿病、结核病、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、痴呆、心血管疾病、关节炎等医学病状的炎性状态；6-10(是指Oct4A表达水平变化3-5倍)：类别包含面临发展成癌症的紧迫威胁的受试者；10-20(是指Oct4A表达水平变化5-10倍)：I期癌症；20-30(是指Oct4A表达水平变化10-15倍)：II期癌症；30-40(是指Oct4A表达水平变化15-20倍)：III期癌症；以及>40(是指Oct4A表达水平变化大于20倍)：IV期癌症。因此，根据本公开的方法包括从血液/组织中分离VSEL并将其Oct4A表达与癌症分期相关联，从而开发出一种强大的诊断和预后工具。而且，VSEL的Oct4A测量已被证明以100％的特异性和敏感性有效地诊断肿瘤治疗的效果、无病生存率和复发率。

本公开提供了优于肿瘤细胞介导的癌症检测系统的明显优点，如下所示：(1)目前的“液体活检”诊断工具受到其敏感性和特异性的限制，可能是因为其源自循环肿瘤细胞、细胞游离DNA、成体干细胞等，并且研究的是一组不同的生物标志物或DNA甲基化谱，而不是多能干细胞和其标志物，(2)不同于已知的VSEL在再生医学中的治疗用途，VSEL的诊断使用可以使用经过验证的HrC标度系统基于血液进行，(3)VSEL可以从1ml血液中分离出来，并且因此其与需要更大检测体积的循环肿瘤细胞、细胞游离DNA等相比具有更大的优势，(4)Oct4A测量仅适用于从1ml血液中富集的VSEL，(5)与循环肿瘤细胞(其可能并不普遍存在于所有肿瘤类型中)和细胞游离DNA(其可能不是肿瘤来源和本质上异质性的)相比，基于VSEL的Oct4A测量来自指示癌症的正常细胞(由于其多能性和致癌性质)，以及(6)VSEL Oct4A测量在临床上不仅可用于检测种类繁多的癌症(实体瘤、血液系统恶性肿瘤和肉瘤)的存在，还可用于检测肿瘤形成前即将发生的癌症、癌症期、良性与恶性表型、炎性状态、肿瘤治疗的效果、复发率等。具体地，特定癌症期(I、II、III或IV)的存在可以帮助医生针对特定期的治疗方式和癌症及其进展的非侵入性检测的做出决策。类似地，即将发生的癌症的检测可以产生预防性策略，而肿瘤治疗后的HrC标度测试可以帮助确定疾病存活率、治疗效果和复发概率。因此，Oct4A致癌基因被描述为第一多能标志物，根据对500名非癌症患者和500名癌症患者的试验，其能够以100％的敏感性和特异性对癌症和癌症期进行检测。在机制上，这主要是由于其在VSEL中的组成性激活，定义了其多能性，并且因此临床表现为：a)VSEL内源性地引发癌症，b)VSEL通过未知的机制转化为癌症干细胞，c)癌症干细胞作为恶性肿瘤以及侵袭性、迁移性和运动性的主要驱动因素，d)检测血液中富集的VSEL以及e)Oct4A过表达作为原始和恶性细胞表型的排他性标志物。

总体而言，为了克服与已知技术相关的问题，本公开公开了一种简单且非侵入性的技术，用于鉴定人类受试者的医学病状和炎性状态，具体地癌症的存在或不存在和癌症期。根据所述方法，血液或尿液样品优选地足以获得与执行侵入性传统活检技术后获得的详细信息等效的详细信息。进一步地，本公开的方法将能够清楚地确定医学病状，所述医学病状甚至没有在人类受试者体内显示出任何症状，从而允许执业医师有足够的时间治疗人类受试者。本公开的方法涉及从样品(血液或尿液)中富集非常小的胚胎样干细胞(VSEL)，并进一步从富集的非常小的胚胎样干细胞中分离出核酸。此类核酸可以表示人类受试者的全基因组和/或转录组和/或外显子。因此获得的核酸通过使用下一代测序或类似技术经受序列分析，以获得序列谱。将谱与参考序列进行比较，以检查至少一种标志物中任何突变的存在，其中突变的存在鉴定了受试者体内存在医学病状。根据本公开的VSEL对于如本文所述的VSEL的某些生物标志物呈阳性。标志物可以是对于要用于鉴定医学病状的任何组织具有特异性的公知的标志物。取决于活检是在组织中哪个点进行的，活检可能得出巨大的表达和突变差异。然而，如本文所公开的方法在突变形成点处应用组织特异性基因表达，并且因此去除了异质性。由于VSEL可能通过在组织中转化为癌症干细胞而引发癌症，因此组织特异性VSEL清楚地指示了表示肿瘤基因型和表型。根据本方法，从包含50,000-100,000个表达谱的人类受试者的样品接收的基因组和转录组数据被馈送到算法中，所述算法进而根据血液或尿液或组织样品给出身体中器官组织水平的RNA信息。突变和表达数据将与科学文献和人类转录组/基因表达数据库交叉引用，以识别与医学病状相关的一组基因。算法可以连接转录组和全基因组数据，以生成组织水平转录组数据的读数。此外，基于数据，还将识别器官参数，如其功能活性、炎症指标、氧化应激、生物途径、分子机制等。基于使用算法对与转录组和突变数据相关的原发和继发器官的识别，描绘对各种人类疾病的易感性也将是可能的。进一步地，本公开中描述的方法还使得能够测试罕见疾病，如但不限于脊髓肌肉萎缩症、埃勒斯-当洛斯综合征(Ehlers-Danlos syndrome)、普罗特斯综合征(Proteussyndrome)、镰状细胞性贫血、哈钦森-吉尔福德早衰症(Hutchinson-Gilford progeria)等，所述疾病是基因突变的最终结果。如本公开所述的方法能够富集外周血/尿液样品中的VSEL，其可以通过Oct4A、脆弱拟杆菌和星状菌属生物标志物的存在来表征。一旦确定了VSEL的身份，就将如Oct4A、脆弱拟杆菌和星状菌属等生物标志物的表达水平与对照样品中的表达进行比较，其中与对照相比VSEL生物标志物的表达水平增加指示了人类受试者的医学病状的存在或不存在以及炎性病状的存在。进一步地，对从VSEL获得的核酸进行测序能够深入了解印证检测的分子机制和生物途径。而且，特定标志物中的突变的存在或不存在鉴定了受试者的潜在医学病状。作为本公开的替代性实施方案，还可以测量富集的VSEL中的蛋白质水平以分析从人类受试者的样品中获得的VSEL中的Oct4A的蛋白质水平。Oct4A蛋白质的成倍增加可能与癌症的存在或不存在相关。蛋白质水平还可能与癌症的分期相关。进一步地，蛋白质水平还可能与受试者的医学病状的存在或不存在相关。根据本公开的实施方案之一，来自受试者的血液将通过针刺(1ml或2ml或5ml或10ml或20ml血液)获得。在血液采集之后，Oct4A的蛋白质水平将通过使用自动ELISA试剂盒、自动免疫荧光测定试剂盒在几分钟到几小时内以高通量的方式进行估计。样品中的Oct4A的水平与对照样品(健康受试者)中的Oct4A的水平相关，其中的Oct4A的蛋白质水平增加指示了医学病状的存在，或预测到即将发生的癌症，或癌症的存在。Oct4A的蛋白质水平的比较可以进一步指示癌症的期/等级。

为了概述，本公开的方法能够通过分析从人类受试者的血液/组织样品中分离的VSEL获得的核酸来提供人类受试者的遗传图谱。与对照样品相比人类受试者的血液/组织样品中的Oct4A或星状菌属或脆弱拟杆菌的表达增加指示了潜在的医学病状，并且还指示了人类受试者的炎性状态。通过分析从VSEL获得的核酸以了解特定标志物中的突变的存在或不存在，准确地确定了潜在的医学病状。因此，仅根据血液/组织样品，有效地提供了与活检的数据等效的数据。

根据本公开，任何已知的标志物都可以由根据本公开的方法获得的序列谱进行分析。本公开仅提供了此类标志物的非限制性列表。类似地，根据本公开所公开的方法，如Oct4A、星状菌属和脆弱拟杆菌等VSEL的生物标志物的表达增加指示了潜在的医学病状或人类受试者的炎症的存在。因此，可以设想，不存在任何此类增加指示健康个体。本公开仅提供可以检测的疾病的非限制性列表，然而，根据所使用的标志物的类型，可以检测到任何疾病。进一步地，可以理解，一旦从简单的血液样品中获得整个序列和转录组学谱，遗传谱的信息就可以用于提供关于人类受试者的遗传或转录组学水平的完整信息。

算法被定义为其中非常小的胚胎样干细胞的突变和表达数据将与科学文献和人类转录组/基因表达数据库交叉引用，以识别与医学病状相关的一组基因。算法可以连接转录组和全基因组数据，以生成组织水平转录组数据的读数。此外，基于数据，还将识别器官参数，如其功能活性、炎症指标、氧化应激、生物途径、分子机制等。基于使用算法对与转录组和突变数据相关的原发和继发器官的识别，描绘对各种医学病状的易感性也将是可能的。进一步地，所描述的发明还将使得能够测试罕见疾病，如但不限于脊髓肌肉萎缩症、埃勒斯-当洛斯综合征、普罗特斯综合征、镰状细胞性贫血、哈钦森-吉尔福德早衰症等，所述疾病是特定基因突变的最终结果。

根据本公开的方法涉及其中非常小的胚胎样干细胞将经受蛋白质组、代谢组学、甲基化分析的过程，并且所获得的数据将通过使用各种途径数据库的途径分析与基因表达水平相联系。VSEL的遗传分析以及途径分析导致对疾病治疗方式(肿瘤治疗或疾病特异性干预)的识别，以帮助临床医生和医生。进一步地，从VSEL获得的cDNA将用于进一步检测患病状况的存在和/或还提供用于治疗患病状况的治疗方式。此外，VSEL的转录组学分析可以用于检测患病状况并提供治疗方式。作为替代方案，还可以对VSEL执行外显子分析，以检测患病状况并提供用于治疗患病状况的治疗方式。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于检测受试者的医学病状的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为1.1-3倍检测到所述受试者体内存在医学病状。在本公开的另一个实施方案中，与对照样品中的Oct4A的表达水平相比，来自样品的非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平的增加范围为1-2.9或1-2.5或1-2倍检测到受试者体内存在医学病状。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于预测受试者的癌症的发作的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为3-5倍预测了所述受试者的癌症的发作。在本公开的另一个实施方案中，与对照样品中的Oct4a的表达水平相比，来自样品的非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平的增加范围为3.2-4.8或3.5-4.5或3.6-4.2或3.8-4倍预测了受试者的癌症的发作。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于检测受试者的癌症的存在的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平增加至少5倍检测到所述受试者体内存在癌症。在本公开的另一个实施方案中，与对照中的Oct4A的表达水平相比，来自样品的非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平的增加范围为5-10或10-15或15-20或20-25倍。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的体外方法，其中所述方法进一步包括通过执行基于序列的测定对核酸进行分析。在本公开的实例中，通过执行基于序列的测定对核酸进行分析检测到癌症的类型。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于监测对抗癌疗法的应答的体外方法，所述方法包括：(a)在抗癌疗法期间的一个时间点获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与参照物中的非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平进行比较，所述比较监测到所述对抗癌疗法的应答。与参照物中的表达水平相比，样品中的非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平降低指示对抗癌疗法的积极应答，其中所述参照物是选自由以下组成的组的至少一个：(i)在施用抗癌疗法之前获得的样品；(ii)相较于如本文所述的方法的步骤(a)中提及的时间点在稍早的时间点获得的样品；(iii)相较于如本文所述的方法的步骤(a)中提及的时间点在稍后的时间点获得的样品；以及(d)从无癌症受试者获得的样品。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于检测对抗癌疗法的积极应答的体外方法，所述方法包括：(a)在施用抗癌疗法之前获得样品-I；(b)在施用所述抗癌疗法之后获得样品-II；(c)从所述样品-I富集非常小的胚胎样干细胞以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物-I；(d)从所述样品-II富集非常小的胚胎样干细胞以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物-II；(e)从所述混合物-I获得核酸-I；(f)从所述混合物-II获得核酸-II；(g)用所述核酸-I和所述核酸-II独立地执行测定以分析Oct4A的表达水平；以及(h)将来自所述核酸-II的所述Oct4A的表达水平与来自所述核酸-I的所述Oct4A的表达水平进行比较，其中与来自所述核酸-I的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述核酸-II的所述Oct4A的表达水平降低检测到对癌症治疗的积极应答。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于检测癌症的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；(e)将所述样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平相比，所述样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平增加指示癌症的存在；以及(f)对所述核酸执行基于序列的测定并分析至少一种癌症相关标志物中的突变，其中所述至少一种癌症相关标志物中的突变的存在指示了基于所分析的所述癌症相关标志物的特定类型的癌症的存在。在本公开的另一个实施方案中，将样品中的非常小的胚胎样干细胞的生物标志物的表达水平与对照样品中的至少一种生物标志物的表达水平进行比较以及使序列谱与参考序列谱相关以鉴定至少一种标志物中的突变的存在或不存在是通过算法进行的。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的用于检测癌症的体外方法，其中所述方法进一步包括分析在步骤(c)中获得的核酸中的癌症相关标志物的表达水平，并且其中所述标志物的表达水平通过使用定量PCR技术进行分析。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的体外方法，其中核酸通过选自由以下组成的组的任何一种方法从混合物获得：(a)硫氰酸胍-苯酚-氯仿核酸提取；(b)氯化铯梯度离心法；(c)十六烷基三甲基溴化铵核酸提取；(d)碱性提取；(e)基于树脂的提取；以及(f)固相核酸提取。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的体外方法，其中用核酸执行测定以分析非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平是通过选自由定量PCR、流式细胞术和下一代测序(NGS)组成的组的技术进行的。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的体外方法，其中对照是从无癌症受试者获得的非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平。在本公开的另一个实施方案中，对照是管家基因的表达水平，其中所述管家基因包含但不限于18S rRNA、ACTB、ATP5B、CyCl、EIF4A2、GAPDH、RPL13A、SDHA、TOP1、UBC、YWHAZ、PGK1、PPIA、RPLPO、ARBP、B2M、TFRC、GUSB、HMBS、HPRT1、TBP。在本公开的实例中，管家基因是18S rRNA。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的体外方法，其中从血液样品富集非常小的胚胎样干细胞包括：(a)使血液样品与中性缓冲液以1:1至1:20的比率范围接触，以获得第一混合物；(b)使至少一种盐溶液与所述第一混合物以1:2至1:10的比率范围接触，以获得第二混合物；以及(c)处理所述第二混合物，以获得富集的非常小的胚胎样干细胞。所述第二混合物的处理包括选自由以下组成的组的至少一种方法：(a)提取过程；(b)洗涤过程；(c)离心过程和其组合。在本公开的另一个实施方案中，使血液样品与中性缓冲液以1:2至1:18或1:3至1:15或1:5至1:12的比率范围接触，以获得第一混合物，并且其中使至少一种盐溶液与所述第一混合物以1:3至1:9或1:4至1:8或1:4至1:7的比率范围接触，以获得第二混合物。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的体外方法，其中癌症相关标志物选自由确定与癌症相关的已知标志物组成的组。进一步地，本公开的方法并不依赖于侵入性技术。在本公开的另一个实施方案中，癌症相关标志物选自由以下组成的组：mir145、OLR1、CD68、MSR1、CXCL16、NCAN、TKTL1、AN04、CHIT1、GPNMB、CCL18、TGFβl、FSP1、S100A6、SLC13A3、BGN、NCF2、6Ckine、MMP-9、MMP-3、MMP-7、整合素-β4、多效生长因子、尿激酶R、HLA-C、SLC9A3R1、NAT9、RAPTOR和SLC12A8、SPINK5、FcεRI-β、PHF11、IGFBP1、FACL4、IL1R、TGFβ、CHRNA3/5、IREB2、HHIP、FAM13A、AGER、肌钙蛋白T和I、HSP60、BNP、GDF-15、MMP2、MMP3、MMP9、IL6、TNFα、CRP、S0X9、ACAN、COL2A1、DKK1、FRZB、RUNX2、COL10A1、IGH、IGHM、IGHG1、去乙酰化酶、ACE2、IFI27、IFIT1、IFITM1、DPP4、KRAS、BRCA1和2、TP53、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRB1(I型)、PPARG、KCNJ11、CDKAL1、CDKN2A-CDKN2B、IDE-KIF11-HHEX、IGF2BP2和SLC30A8(II型)和其组合。

在本公开的一个实施方案中，提供了用于检测受试者的医学病状的体外方法，其中所鉴定的医学病状选自由以下组成的组：多发性硬化、肾病症、皮肤疾病、肝病、肺病、心血管疾病、骨关节炎、病毒性疾病、癌症和糖尿病。在本公开的实例中，医学病状是癌症。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；(e)将所述样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，所述样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平增加检测到癌症；以及(f)向所述受试者施用抗癌疗法以治疗癌症。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于对受试者的癌症进行分级的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为5-10倍指示了所述受试者的I期癌症。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于对受试者的癌症进行分级的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为10-15倍指示了所述受试者的II期癌症。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于对受试者的癌症进行分级的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为15-20倍指示了所述受试者的III期癌症。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的体外方法，其中核酸是DNA或RNA。在本公开的另一个实施方案中，核酸选自由以下组成的组：来自样品的正常RNA、正常DNA、肿瘤RNA或肿瘤DNA。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的体外方法，其中从样品富集非常小的胚胎样干细胞是通过选自由以下组成的组的任何方法进行的：流式细胞术、基于磁珠的分离、过滤、基于微流体的细胞分选、基于适体的细胞分离和浮力激活细胞分选。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的体外方法，其中核酸表示基因组或转录组或外显子、cDNA。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的体外方法，其中样品选自由以下组成的组：血液、组织、尿液和痰。在本公开的另一个实施方案中，样品是血液中的至少一种细胞类型，并且其中至少一种细胞类型选自由癌症干细胞和循环肿瘤细胞组成的组。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于从血液样品富集非常小的胚胎样干细胞的试剂。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：(a)用于分析选自由包括非常小的胚胎样干细胞的混合物中的Oct4A、星状菌属(Stella)和脆弱拟杆菌(Fragilis)组成的组的至少一种生物标志物的表达水平的引物组；(b)用于执行定量PCR测定的试剂；(c)用于执行全基因组或外显子组或转录组测序的试剂；以及(d)用于分析序列谱的至少一个组织特异性阵列。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于对受试者的癌症进行分级的体外方法，所述方法包括：(a)获得样品；(b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；(c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；(d)用所述核酸执行测定以分析所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及(e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为20至更多倍指示了所述受试者的IV期癌症。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于检测受试者的癌症的存在的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得样品；(b)枚举所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(c)将所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量增加检测到所述受试者体内存在癌症。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于预测受试者的癌症的发作的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得样品；(b)枚举所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(c)将所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量增加预测出了所述受试者的癌症的发作。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于检测受试者的医学病状的存在的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得样品；(b)枚举所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(c)将所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量增加检测到所述受试者体内存在医学病状。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于检测受试者的癌症的存在的方法，所述方法包括：(a)在体内枚举受试者的血液/组织中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(b)将所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量与对照中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量增加检测到所述受试者体内存在癌症。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于预测受试者的癌症的发作的方法，所述方法包括：(a)在体内枚举受试者的血液/组织中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(b)将所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量与对照中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量增加预测了所述受试者的癌症的发作。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种用于检测受试者的医学病状的存在的方法，所述方法包括：(a)在体内枚举受试者的血液/组织中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(b)将所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量与对照中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量增加检测到所述受试者体内存在医学病状。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的用于鉴定人类受试者的医学病状的方法，其中非常小的胚胎样干细胞具有直径小于7微米的尺寸。在本公开的另一个实施方案中，非常小的胚胎样干细胞具有直径范围为1-7微米的尺寸。在本公开的替代性实施方案中，非常小的胚胎样干细胞具有直径范围为2-6微米的尺寸。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的方法，其中对照样品是来自受试者的管家基因的表达水平。在另一个实施方案中，管家基因是18s rRNA。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的用于鉴定人类受试者的医学病状的方法，其中非常小的胚胎样干细胞的生物标志物选自由Oct4的假基因组成的组，并且其中所述Oct4的假基因选自由以下组成的组：Oct4pg1、Oct4pg2、Oct4pg3、Oct4pg4、Oct4pg5、Oct4pg6和Oct4pg7。

在本公开的一个实施方案中，从健康个体的血液中分离的VSEL将用于治疗应用。VSEL将通过促进细胞扩增在体外富集，并且将使用CRISPR-Cas9技术进行编辑以用于治疗应用。可替代地，VSEL将在合适的条件下分化成组织特异性细胞类型，并用于适当的治疗应用。根据另一个实施方案，VSELS将去分化为诱导多能干细胞(iPSC)。iPSC可以进一步分化成组织特异性细胞，所述组织特异性细胞可以注射到损伤部位以用于治疗应用。在替代性实施方案中，提供了包括用于从血液样品富集VSEL的试剂的试剂盒。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的方法，其中Oct4A表达将与受试者中调节的其它基因一起进行分析。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的方法，其中与对照样品中的Oct4A的表达水平相比，来自样品的非常小的胚胎样干细胞的Oct4A的表达水平增加区分了恶性病状与良性病状。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的方法，其中与对照样品中的Oct4A的表达水平相比，来自样品的非常小的胚胎样干细胞的Oct4A的表达水平增加指示了线粒体改变。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的体外方法，其中所述方法基于HrC标度测试，并且其中，HrC标度是指数字比例因子，其指示为检测癌症的存在、不存在或癌症期而观察到的Oct4A变化倍数两倍的值。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的方法，其中获得了来自受试者的血液样品，并且从所述样品，所关注的细胞使用II级生物安全柜中离心进行自动化分离，进一步自动化分离DNA/RNA，并且因此，Oct4A的基于自动化RT-PCR的基因表达使得能够自动确定HrC得分。

在本公开的一个实施方案中，提供了一种如本文所述的方法，其中所述方法分析了从血液/组织中提取的VSEL中的NCBI基因列表数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gene/)中列出的任何基因，当与对照受试者相比进行调节时，其通过转录组的表达分析和突变分析和/或外显子和基因组的突变分析进行测量，指示了具有组织特异性定位的医学病状。

尽管已经参考具体实施方案描述了本主题，但此描述并不意味着以限制意义来解释。在参考对本主题的描述时，所公开实施方案的各种修改以及本主题的替代性实施方案对于本领域的技术人员而言将变得显而易见。因此可以设想，可以在不背离所定义的本主题的精神或范围的情况下进行此类修改。

实例

现在将利用工作实例来说明本公开，所述工作实例旨在说明本公开的工作并且不旨在限制性地暗示对本公开的范围的任何限制。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料可以用于实践所公开的方法和组合物，但是本文描述了示例性方法、装置和材料。应当理解，本公开不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。

材料与方法

临床研究设计

根据本公开的研究是在获得印度浦那桑吉万医院(Sanjeevan Hospital，Pune，India)的马哈拉施特拉邦技术教育协会伦理委员会(Ethics Committee of MaharashtraTechnical Education Society)的伦理学批准后进行的，并在印度临床试验注册处(Clinical Trial Registry India)进行注册(CTRI/2019/01/017166)。

最初收集了180个样品以及患者病史和所有相关信息。在从外周血富集的VSEL中研究了Oct-4 A mRNA的表达，并帮助达到了标度(HrC标度)，其中癌症期与OCT-4A表达的变化倍数相关联。一旦获得标度，就在共1000名受试者中进行其验证，所述受试者从印度的七个不同地点招募用于研究，其中500名是非癌症患者，并且500名是癌症患者(表1)。这些样品通过国家生物制药设施进行致盲。患有组织学上或细胞学上证明为恶性肿瘤，实体瘤或者血液系统恶性肿瘤的患者，均被包含在癌症组。从每个受试者都获得了知情同意书。在少数情况下关注随机研究循环肿瘤细胞(CTC)。

血液样品处理

从受试者收集血液样品(大约10ml)并进行处理以富集VSEL，如下所述。简而言之，将样品在Ficoll-Hypaque上进行分层，并在1200rpm下经受密度梯度离心15分钟。离心后，使RBC级分中的细胞经受RBC裂解，并且然后以3000rpm(1000g)进行离心以沉淀VSEL。

RNA分离和cDNA合成

根据制造商的说明，使用RNAplus(美国尔湾的安倍医疗公司(MP Biomedicals，Irvine，USA))从VSEL沉淀物中提取总RNA。提取RNA后，根据制造商的说明，使用还原辅助第一链cDNA合成试剂盒(英国的赛默飞世尔科技公司(Thermo scientific，UK))合成第一链cDNA。简而言之，将1μg总RNA与5X反应缓冲液和逆转录酶混合物一起温育。根据制造商的说明，反应在应用生物系统

热循环仪9700(美国的应用生物系统公司(AppliedBiosystems，USA))中进行。

qRT-PCR研究

Oct4A基因转录本的表达水平是通过实时PCR系统-ABI 7500(美国的应用生物系统公司)使用赛默飞世尔科技公司的Maxima SYBR Green/ROX qPCR预混液试剂盒(英国的赛默飞世尔科技公司)和基因特异性引物序列，即Oct4A进行估算：正向AGCCCTCATTTCACCAGGCC(SEQ ID NO:1)和反向TGGGACTCCTCCGGGTTTTG(SEQ ID NO:2)。18srRNA基因用作管家基因。扩增条件为：在94℃下初始变性3分钟，然后进行45次循环，包含在94℃下变性30秒，在62℃下引物退火30秒，并且在72℃下延伸30秒，然后进行从55℃至95℃的熔融曲线分析步骤。在每个循环的扩展步骤中收集发射的荧光。通过研究熔融曲线验证了PCR扩增子的同质性。使用7500管理器软件(英国的应用生物系统公司)在每次实验中产生的C_t值用于计算mRNA表达水平。

循环肿瘤细胞(CTC)

如前所述对CTC进行研究(Diehl等人2018)。CTC存在于患有实体瘤的患者中，并且作为转移的种子起作用(Palmirotta等人2018)。其被认为是临床生物标志物和治疗靶点，并被认为是液体活检的组分。外周血被吸入EDTA试管中。一小时内，使试管以820g经受离心10分钟。将大约1-ml等分试样的血浆转移到1.5-ml试管中，并以16,000g离心10分钟以沉淀任何剩余的细胞碎片。将上清液转移到新试管中并储存在-80℃下。根据制造商的说明，使用QIAamp MinElute试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从2ml血浆等分试样中纯化总基因组DNA。如前所述，用人LINE-1定量实时PCR测定的修饰版本对从血浆分离的总DNA量进行定量(Diehl等人2008)。对从血浆样品分离的总DNA量进行定量。使用三个引物集来扩增人LINE-1家族最丰富的一致性区域内不同大小的区域(79bp用于：5'-agggacatggatgaaattgg-3'(SEQ ID NO:3)。79bp反向：5'-tgagaatatgcggtgtttgg-3'(SEQ ID NO:4)；97bp用于：5'-tggcacatatacaccatggaa-3'(SEQ ID NO:5)；97bp反向：5'-tgagaatgatggtttccaatttc-3'(SEQ ID NO:6)；127bp用于：5'-acttggaaccaacccaaatg-3'(SEQ ID NO:7)，127bp反向：5'-tcatccatgtccctacaaagg-3'(SEQ ID NO:8))。PCR在25μl反应体积中进行，所述反应体积由等于2μl血浆的模板DNA、0.5U的Taq DNA聚合酶、1x PCR缓冲液、6％(v/v)DMSO、每个dNTP的1mM、5μl的SYBR Green和每个引物的0.2μM组成。扩增使用以下循环条件在循环仪中进行：94℃持续1分钟；94℃的2次循环持续10秒；67℃持续15秒；70℃持续15秒；94℃的2次循环持续10秒；64℃持续15秒；70℃持续15秒；94℃的2次循环持续10秒；61℃持续15秒；70℃持续15秒；94℃的35次循环持续10秒；59℃持续15秒；70℃持续15秒。

根据本公开要遵循的程序

对从人类受试者获得的血液样品进行处理以富集非常小的胚胎样干细胞。根据本公开的一个方面，获得血液样品(测试样品)作为研究的一部分。使血液样品与中性缓冲液以1:1(血液样品:中性缓冲液)至1:20的比率范围接触，以获得第一混合物。使至少一种盐溶液与所述第一混合物以1:2(盐溶液:第一混合物)至1:10的比率范围接触，以获得第二混合物。处理第二混合物以获得经处理的包括非常小的胚胎样干细胞的第二混合物。通过本领域公知的方法从非常小的胚胎样干细胞获得核酸。

结果

最初基于120个样品中的Oct-4A表达开发了HrC标度。外周血中的Oct4A表达与病史(PET扫描和活检报告)相关。据观察，与非癌症受试者相比，癌症患者的外周血中的Oct4A呈多方面上调。在癌症患者内，OCT4A的表达在4期癌症中最高并且在1期中最低。在倍数增加的基础上，开发了HrC标度，可以使用所述标度将非癌症和癌症受试者分开。根据本公开的HrC标度/值的设计方式是，与从健康受试者的血液样品分析的管家基因或Oct4A相比，HrC值是从测试受试者的血液样品分析的Oct4A的表达中变化倍数的两倍。为清楚起见，如果Oct4A的表达中的变化倍数为X，则HrC值将是2X。而且，癌症期也被解读。非癌症患者和炎症增加可能导致以后癌症引发(与患者病史相关)的患者也揭示了特定的值范围。受试者基于其HrC评分进行鉴定并且分布为非癌症、炎症、高危、I期癌症、II期癌症、III期癌症和IV期癌症(图1)。

在2019年1月至5月期间，共筛选和招募了1051名患者进行研究。1051名受试者中有51名因筛选失败而被排除在外。有534名男性和466名女性。对于完整数据集，患者平均年龄为63.0岁。平均体重为69.3kg并且平均身高为161.38。表1概述了完整数据集的患者人口统计数据。

表1：研究中包含的所有受试者的人口统计数据

在500名癌症患者中，有431名患者正在接受治疗(R_x)，48名患者在诊断出癌症后没有接受任何治疗(R_x初始)，并且21名患者经历了外科手术干预用于癌症治疗(Ro)。研究包含患有25种不同类型的癌症的患者，如图2所示。

在分析的1000份HrC样品中，498份样品为非癌症，7份被评估为处于高危期，11份处于I期癌症，94份处于II期癌症，133份处于III期癌症，并且257份处于IV期癌症(图3)。

HrC水平能够检测到几种类型的实体瘤和液体癌的存在。图4-8提供了所有1000个研究受试者的结果的详细信息。显然，HrC值没有歧义。表2提供了10个病例的详细信息，其中可以使用HrC作为监测患者癌症状态的工具来获得新的结果。

表2：10个病例的详细信息，其中使用HrC作为监测患者癌症状态的工具来获得结果。

分析受试者的血液中VSEL的数量和其与受试者的医学病状或癌症的相关性

可以测量每单位血液的VSEL计数，不仅用于区分患有癌症、即将发生的癌症和非癌症的患者，还可以区分癌症期。一旦从血液单位中分离出细胞，就通过常规比色染色使用如苏木精、Hoechst 33342染料等核染色方法来完成VSEL的侵入性体外成像。另一方面，非侵入性光学显微镜是最近开发的体内技术，其利用共聚焦显微镜原理以亚微米分辨率对血管的大横截面积进行成像(从而鉴定指示VSEL的2-6μm尺寸范围的所关注的细胞)而不染色。一个此类实例是可以利用通过与电波或超声波有关的方法。技术背后的原理是当入射到在组织表面下方的测量深度处检测到的特定血管上时细胞和亚细胞结构的不同光散射系数。在另一实施方案中，也可以使用基于荧光的技术和血流中染色细胞的图像捕获，尽管此过程可能会改变细胞和/或导致毒性。

图10描绘了癌症患者与健康个体的血液中存在的VSEL的数量的比较。分析是通过从患有慢性骨髓性白血病(血癌)的第四期65岁女性患者的外周血中分离VSEL、制备涂片、固定在4％多聚甲醛中、用苏木精/曙红(Eosin)染色并使用显微镜成像来执行的。参考图9，左小图表示来自健康受试者的血液样品，并且右小图表示来自健康受试者的血液样品。根据图像的分析，左小图的顶部、中间和底部图像中VSEL的大致数量为25、22和22。另一方面，右小图的顶部、中间和底部图像中VSEL的大致数量为53、55和52。因此，图9清楚地展示了VSEL数量的增加可能与癌症的存在相关。

根据本公开的一个实施方案，血液中VSEL的数量也可以在体内进行分析。图11描绘了可以用于通过体内方法分析血液中VSEL数量的众多方式之一。设想开发一种使用荧光量子点纳米颗粒进行癌症检测(步骤1)的生物GPS系统，所述系统当与中间衔接蛋白(步骤2)和VSEL特异性抗体(步骤3)融合时，产生量子点-衔接蛋白-VSEL特异性抗体融合分子(步骤4)。当将此溶液注射到血流中(步骤5)时，导致通过量子点和选择性荧光发射对VSEL进行特异性标记，这可以通过荧光成像计算机断层扫描(步骤6)进行捕获。因此，体内VSEL图像分析可以导致造影剂注射介导的对正常与癌症患者的VSEL计数的识别。

研究的结果表明，可以通过血液测试来预测、筛选和诊断癌症。结果证实了HrC测试(根据本公开的方法)对可靠的基于血液的癌症诊断的可能。HrC测试的特异性>99％，无假阳性或假阴性。HrC测试采用基于机器学习的算法进行多分析物数据，以使得癌症能够被特异性鉴定。提供了十个有趣病例的数据，其中HrC分析对临床医生有帮助(表2)。

理想的癌症检测诊断工具的三个标准是：(i)敏感性，准确地正确检测疾病的能力；(ii)特异性，区分健康、非癌个体的能力；以及(iii)定位或分类，确定癌症类型和其起源组织的测试能力。目前，研究最多的用于癌症检测的基于血液的非侵入性测试基于对癌症特异性生物标志物的突变和表达的识别来利用循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和外泌体(Zhou等人,2020)。尽管CTC和ctDNA可以被认为是癌症早期检测和诊断的有吸引力的工具，但一些研究质疑这些测试对癌症预后的敏感性、特异性(Kowalik等人,2017)。

可以检测到从患者垂死的癌细胞(通过坏死)滑入血液循环的循环肿瘤细胞和肿瘤DNA，并且已经开发了先进的技术来识别甚至单个肿瘤DNA分子，包含血流中的基因突变/DNA甲基化模式(Killock 2018)。然而，并非所有早期肿瘤都会脱落DNA和CTC，并且因此除非采用新方法，否则不可能准确描绘癌症的分子特征。此外，共病性炎性疾病可能会脱落DNA(Chaudhary和Mittra,2019)，这将与用于进行准确的疾病诊断的癌症检测相冲突，从而影响敏感性和特异性。另一方面，癌症干细胞(CSC)是罕见的并且难以分离，并且可能无法准确描绘癌症期。总体而言，需要高度准确的、非侵入性的基于血液的监测系统来检测不同期和亚型的癌症。

Oct4、Nanog和Sox2是在血液和癌组织中表达的关键干细胞多能性标志物(Wang和Herlyn,2015；Monferrer等人,2019)，并且描绘了疾病预后、存活率、化疗效果和其它此类疾病相关参数。因此，开发高度特异性和敏感性的预后“液体活检”工具将使得临床医生能够鉴定是否存在癌症、癌症即将发生以及癌症期。然而，尽管有足够的引文，但循环肿瘤细胞和癌症干细胞在血液和组织活检中以罕见的数量存在，并且分离也很繁琐。因此，需要测量如造血干细胞、间充质干细胞等正常血液细胞中的Oct4、Nanog和Sox2水平。事实上，在最近的研究中，这些标志物已经在所有患者的血液样品中进行了测试(Sodja等人2016)，但是，与癌症期的相关性尚未被研究。

本公开公开了一种用于根据受试者的血液评估癌症的分子谱(范围0-60)的简单方法(HrC测试)。使用包括Oct4A、Nanog和Sox2基因表达水平的三阶多项式方程将不同的评分范围与不同癌症期相关联，并提供所有类型癌症的信息，包含是否(i)存在癌症(ii)癌症即将发生(iii)不同癌症期以及(iv)肿瘤治疗的效果。进一步地，本公开所公开的方法还告知了分析的样品(血液)所来自的受试者是否具有除癌症以外的任何其它医学病状。HrC标度基于以下评分将VSEL Oct4A表达与医学病状联系起来：0-2指示癌症/炎症不存在；并且2-6与指示如糖尿病、结核病、阿尔茨海默氏病、痴呆、心血管疾病、关节炎等医学病状的炎性状态的存在相关。非癌症患者和炎症增加可能导致以后癌症引发(与患者病史相关)的患者也可以基于HrC数据进行分类。研究的结果表明，可以根据血液测试来预测、筛选和诊断癌症。HrC测试的特异性>99％，无假阳性或假阴性。HrC采用基于机器学习的算法。癌症是致命的、使人衰弱的疾病，2018年全球有>900万人死于癌症(Bray等人2018)。疾病病因学的特征在于遗传改变(Chakravarthi等人2016)和代谢变化(Hammoudi等人2011)，这些变化发展为无法控制的异常细胞生长、增殖和转移性进展(Riggi等人2018)。晚期癌症通常缺乏有效的治疗选择(Chakraborty和Rahman 2012)。目前，当务之急是尽早检测疾病，因为早期检测可以使得帮助临床医生视情况而定确定合适的干预，以预防疾病的发作或进一步进展，降低治疗成本，改善患者预后(无疾病和无进展生存期、缓解时间、延迟复发)(Schiffman等人2015)。如果在早期阶段检测风险，则所有癌症的近70％是可以预防的，因此，强调需要更好的即时诊断(Gandhi等人2017)。早期阶段的平均五年生存率为75％，而晚期的平均五年生存率仅为16％(Eskiizmir等人2017)。

目前的诊断方法包含PET CT扫描、MRI和所有方法的黄金标准组织活检(Cowling和Loshak 2019)。活检是昂贵的、侵入性的或痛苦的，引起不适，并且外科手术会产生不适当的副作用(Do等人2019)。此外，由于解剖位置不显眼，一些肿瘤样本难以分离，使其无法获得(Do等人2019)。而且，由于肿瘤基因表达和突变的异质性，组织活检可能无法得到准确的信息。组织活检可能会增加转移性病变的风险，并且安全性也令人担心，例如与血管源性肿瘤微环境的采样有关(Do等人2019)。类似地，成像方法有时不能检测到癌症来源，即原发性不明的癌症(CUP)起源(Varadhachary 2007)相对频繁，从而导致影响介入治疗的不准确诊断。结肠镜检查、前列腺特异性抗原、乳房摄影和宫颈细胞学是少数几种癌症类型的有限数量的现有筛选测试(Ilic等人2018)；尽管其功效受到质疑(Ilic等人2018)，并且一些患者没有遵循筛选的医疗指南(Ilic等人2018)。大多数癌症类型缺乏有效的非侵入性早期筛选选择(Curry等人2003)。

HrC标度是基于对登记为CTRI注册编号CTRI/2018/07/015116的受试者进行的试点临床研究针对多种癌症类型开发并进行测试的。执行此临床研究以评估癌症和非癌症受试者的Oct4A变化倍数表达值。受试者的Oct4A表达与其病史(PET扫描和活检报告)相关，并且观察到与非癌症受试者相比，癌血液样品中的Oct4A呈多方面上调。在癌症患者内，Oct4A的表达在4期癌症中最高并且在1期中最低。此外，在癌症受试者中，基于HrC标度准确地识别癌症期。

本公开公开了一种方法(HrC测试)，所述方法涉及从血液中分离VSEL并利用其相关多能性标志物Oct4A作为诊断和预后工具，其具有开创性意义，与肿瘤细胞介导的癌症检测系统相比具有明显优势。

在即将发生的癌症检测的情况下，所述方法可以产生预防性策略，而肿瘤治疗后的HrC标度测试可以帮助确定疾病存活率、治疗效果和复发概率。因此，来自VSEL的Oct4A致癌基因被描述为第一多能标志物，根据对500名非癌症患者和500名癌症患者的试验，其能够以100％的敏感性和特异性对癌症和癌症期进行检测。在机制上，这主要是由于其在VSEL中的组成性激活，定义了其多能性，并且因此临床表现为：a)VSEL内源性地引起癌症，b)VSEL通过未知的机制转化为癌症干细胞，c)癌症干细胞作为恶性肿瘤以及侵袭性、迁移性和运动性的主要驱动因素，d)检测血液中富集的VSEL以及Oct4A过表达作为原始和恶性细胞表型的排他性标志物。

VSEL的CDNA分析实例

在全转录组学分析中，RNA片段被转化为cDNA库，用于基因表达和突变分析。因此，对来自第四期肝癌患者的VSEL进行了转录组学分析，并在对应于癌症的各种器官转移的以下基因中发现了突变(表3)。如随附所示，骨病变获得的基因突变数量最多，尽管其中这些基因中只有2个是非内源性的。另一方面，根据COSMIC、ICGC数据库，肝也显示3个非内源性基因中的2个发生突变，而肺显示一个5UTR基因发生突变。因此，可以设想，从受试者的外周血富集的VSEL的cDNA信息可以提供特异性鉴定医学病状的信息。例如，即使在没有使用常规方法鉴定癌症起源的情况下，从外周血富集的VSEL获得的cDNA也可以提供此效果的信息。

表3：9种基因的突变谱分析(根据本公开，从人类受试者的外周血富集的VSEL获得)。

根据本公开，对来自伴有肺和骨转移的第四期肝癌患者的VSEL进行了转录组学分析，其中对所述患者的血液样品进行测试用于遗传分析，以确定疾病类型、分类和定位。通过在用于诊断癌症和其等级的方法(HrC测试)中利用多能性标志物Oct4A以及遗传和数学技术的组合，获得的HrC评分为40.1。因此，HrC评分为40.1对应于癌症的存在以及第4期分类。

进一步地，对患者的血液样品的转录组学分析揭示了102种明显突变和57,000个独特的mRNA谱。使用COSMIC和ICGC突变数据库，在102种突变中，3种对应于肝特异性病变，即PRICKLE4、GRIN2C和UNC50，而5种突变对应于骨病变(PRKDC、CSMD3、CYFIP2、EIF1B、ZCHHC6)，并且1种突变对应于肺(NR1I2)。将与>100的读取计数相对应的突变的基因表达数据与包含33种癌症类型的TCGA数据集的现有癌症数据库中的所述基因表达数据进行比较。根据科学文献、driverdb-v3和表达图谱数据库，胆管癌展现出最高的表达谱，在前56个表达基因中具有对应于此胆管癌(bile duct cancer)的-68％和-40％的基因，以及与其它癌症亚型相比最高的表达水平。此外，根据1个数据库基因组(基于基因疾病关联www.disgenet.org)，前60种基因中有-30％对应于肺器官作为身体部位，根据肺癌探索者数据库，基于科学文献，前56种基因的32％中有-20％对应于肺癌。此外，根据科学文献，数据集中前56种基因的23％在骨肉瘤患者中发生突变或差异表达。此外，MUC基因家族可能是骨肉瘤的预后标志物。因此，为了克服与文献相关的缺点，本公开公开了一种非侵入性的、基于血液的诊断测试，用于不仅检测癌症的存在，而且还检测癌症期和原发性(肝)以及基于转录组学和突变分析的继发性和三级定位(肺和骨)。

在本公开中，发现粘液基因在转录组中明显上调。而且，根据突变数据分析，发生明显突变的SLC19A1和SLC46A1是叶酸和甲氨蝶呤(骨肉瘤治疗药物)的转运蛋白。类似地，MTR基因发生突变，这属于蛋氨酸代谢和叶酸途径，指示患者叶酸代谢途径缺陷。根据维基路径，与Wnt信号传导途径相关的基因LGR6也发生了突变，并且与成骨细胞周转相关的PRKDC也发生了突变。H00K3发生突变，这与骨细胞相关，而与异种生物代谢相关的肝特异性基因NR1I2也发生突变。使用链接组学，基因与TCGA胆管癌数据集中的突变相关。有趣的是，从本公开进行的研究中发现，在胆管癌患者中，MUC16基因表达与>25％的突变相关，所述突变与p<0.05直接联系。

为了检查根据本公开的数据集中基因的表达是否与肝细胞癌、胆管癌和肺癌相关，将本公开的实验结果与文献进行比较，以基于对患者的转录组学分析来鉴定原发性、继发性和转移性癌症位点。本公开的结果与科学文献的结果交叉引用：

(a)粘蛋白

根据本公开，在测试数据中以高水平表达的粘蛋白是：MUC16、MUC12、MUC4、MUC6、MUC17和MUC19。将本公开的结果与科学文献进行比较，其中在肝内胆管癌肿块形成型受试者中，在30/63样品(48％)中检测到MUC16，而在19/63患者(30％)中检测到MUC4。这两种基因都与高表达患者与低表达患者相比的预后不良有关。而且，在患者的正常组织样品中未检测到MUC4或MUC16。类似地，根据另一项研究，MUC4在正常肝内胆管中染色较弱，但已报道在胆管癌中的表达。而且，已报道了胆管癌中MUC6的局灶性表达。在又另一项研究中，在27例(37％)肝内胆管癌患者中检测到10例的MUC4表达，并被鉴定为预测胆管癌患者结果的有用标志物。在另一项研究中，发现MUC4在69名胆道癌患者中的27％的胆汁中过表达(1.9倍)。在包含249名患者的研究论文中，发现MUC4的高水平或阳性水平与切除胆管癌患者的生存率较低有关。进一步地，在又另一项研究中，高达64％的胆管癌患者经常删除MUC12和MUC17(研究样品中59/92)。胆管癌的淋巴结转移与这些MUC12和MUC17缺失有关。尽管在本公开中没有观察到MUC12和MUC17缺失，然而，观察到MUC12和MUC17的基因表达增强，由此，指示MUC12和MUC17的基因表达增强可能与胆管癌相关。

此外，在对4126名胆管癌患者进行免疫组化分析的73项研究的纲要中，根据本公开在数据集中高度表达的MUC4被鉴定为与经切除的患者的总生存率相关。MUC4基因扩增可能导致肺癌患者中RNA或蛋白质水平的表达增强。根据研究，TTN和MUC16是人肝细胞系HepG2中含量最大的蛋白质。与生活在更清洁的空气质量中的非癌症受试者相比，MUC16在中国城市中暴露于空气污染的肺癌患者中过度表达。因此，除了卵巢癌外，MUC16可能是肺癌的候选标志物。此外，根据一些研究，粘蛋白的表达可能与肺腺癌的进展有关。在一项研究中，仅在1/26所检查的患者中，免疫组化研究所表达的MUC4和MUC6存在于胆管癌患者中。尽管MUC4在表达的前10种基因中，然而，MUC6在本公开的数据集中表达水平较低。肝内胆管癌的预后不良基于MUC4、MUC12、MUC17的表达，而预后良好基于MUC6。

然而，从上述观察进行总结，可以得出在本公开的数据集中，粘蛋白表达即MUC16、MUC4、MUC12、MUC6、MUC17和MUC19指示胆管癌多于肝细胞癌，因为粘蛋白的存在有利于胆管癌而不是肝细胞癌。

(b)肝胆管癌和肺癌患者的全外显子测序

根据文献中的先前发现，基于肿瘤组织样品的全外显子测序，在肝癌和肝内胆管癌的各种基因中观察到拷贝数变异(CNV)增益。CNV增益已示出与增强的基因表达呈线性相关。根据本公开的数据集，56种基因中有68％显示CNV增益>3，这暗示对应于胆管癌的基因表达增强。此外，数据表示从患者右肝叶的组织切除。相反，根据关于总计高达56种基因的100％肺癌患者的CNV分析的科学论文，前56种基因中有32％在FDR<0.05的情况下通过基因表达中频率百分比增益而明显改变。

(c)在本公开的数据集中表达的其它所关注基因

根据如GSE数据集所证实的研究，KCNQ1OT1基因在肝细胞癌组织中上调，所述基因在本公开中也高度表达。此外，KCNQ1OT1基因在非小细胞肺癌患者中也过表达。

基于3个肺腺癌数据集，另一种基因PDE4DIP与肺癌患者的更高表达的生存率相关。而且，基于突变数据集，在3-4％的胆管癌和肝细胞-胆管癌合并患者中发生突变。

根据本公开，线粒体MT-ND5、MT-ND4和MT-CO1基因均已表达。根据文献研究之一的结果，已经观察到在102名胆管癌患者中有9名观察到上述基因的非同义突变。进一步地，所有三个线粒体基因都与氧化磷酸化有关，其中缺陷导致癌症的致癌激活。

SYNE1是在肝细胞癌组织中过表达的肿瘤抑制基因。在偶发性肺癌患者中，其经常被甲基化导致基因失活，然而，根据本公开，观察到SYNE1基因的表达较高。进一步地，在肺癌和胰腺癌(潜在部位)中，KRAS突变最常与p53、PKHD1和SYNE1基因相关。GRIN2B也是根据本公开中进行的研究被上调的肿瘤抑制基因，然而，其在肺癌患者中沉默。UBR4在小鼠肝肿瘤和小鼠肝癌细胞系(Hepa 1-6)中过表达。根据本公开的数据集，观察到UBR4也过表达。值得注意的是，UBR4基因的下调与癌细胞的存活率降低和迁移有关。进一步地，根据本公开，观察到肝细胞组织和肺癌组织样品中SNHG14增加。

FRAS 1是过表达的肝转移基因，也是胃癌患者的研究中的生物标志物。此外，FRAS1与A549肺癌细胞系中的细胞迁移和侵袭有关。根据本公开，FRAS1也上调。

KSR2基因表达与Ras介导的信号传导，即MEK/ERK和Myc和MAPK相关。KSR2也与AMPK相关。根据在本公开中进行的研究，发现KSR2基因的表达增加。

CACNA1E在肝癌患者中明显上调，并且是肺癌患者的驱动癌症基因。观察到，根据在本公开中进行的实验，CACNA1E基因过表达。

进一步地，观察到在本公开的数据集中表达的NFASC基因已示出与正常组织相比，在肝细胞癌患者组织中上调，并且与胆管癌相关。此外，NFASC基因也与肺癌患者的癌细胞迁移有关。

PEXNA4在肺癌患者组织样品和本公开的数据集中上调。

NF1是在肝细胞癌患者中的关键肿瘤抑制基因。NF1阻断了RAS/RAK/MAPK途径。根据文献，NF1丢失促进KRAS驱动的肺癌进展。在肺癌患者中，NF1丢失导致谷氨酰胺代谢成瘾。COL7A1已示出在胆管癌患者中过表达。SORL1在肝癌患者中上调，并且是肝转移基因，而GPR98是骨、肝、肺转移基因。CSMD2基因在肝内胆管癌中表达增加。与正常组织样品和肺组织样品中相比，ACACA在肝癌中明显更高。BRF1在肝细胞癌患者中增加，并且与较短的生存时间有关。ANK3在小细胞肺癌患者中明显增加，但在非小细胞肺癌患者中降低。

MUC16、MUC6、MUC17、MUC4、MUC12、TTN都与骨肉瘤患者相关。此外，MUC基因家族与骨肉瘤的可能预后标志物相关。总体而言，在本公开的数据集中高度表达的以下基因被发现在>50％的骨肉瘤患者中发生突变：MACF1、OBSCN、NEB、SYNE1、SYNE2、FRAS1、DNAH9。

因此，从上述观察可以推断出，VSEL中的高基因表达与癌症患者组织中的突变谱之间存在关系。还观察到，根据研究纲要，以下基因显示出肿瘤与正常样品的正标准化均数差：对于肺腺癌的MUC16、KCNQ1OT1、MUC4、UBR4、CACNA1E、NF1、COL7A1、SORL1、CSMD2、BRF1、LAMA1、MUC6、MUC17；以及对于使用肺癌探索者数据库的肺鳞状细胞癌的NEB、NF1、COL7A1、SORL1、CSMD2、ACACA、RYR1、UNC80、LAMA1、HIF1AN、MCC。

表4提供了根据各种数据库和科学文献的肝、肺和骨的基因表达谱，与转录组学数据的前56种基因一致。图12-14示出了转录组学数据中前56种基因的表达谱。

表4

序列号	定位	表达百分比
			1	肝	50
2	肺	27
			3	骨	23

图12描绘了基于使用DriverDBv3数据库的TCGA数据的33种癌症类型中(根据基于血液的遗传测试获得的)前56种基因的表达谱。胆管癌获得了表达水平的平方和的最高组合，对应于通过PET-SCAN成像证实的癌症的原发定位。表达谱对应于正常样品中肿瘤组织的中位基因表达与媒介基因表达的比率。将每种表达的基因归一化比率的数据合并为每种癌症类型并以图形方式呈现。

图13描绘了基于3个癌症基因组数据库的33种癌症类型中(根据基于血液的遗传测试获得的)前56种基因的表达谱。数据使用jvenn进行绘制。根据DriverDBv3数据库，前56个遗传数据中有24种基因明显表达，表达图谱数据库有21个，并且表达图谱1患者数据有23个，从而暗示了约41％的对应关系。而且，在所有三个数据库中，有一组9种基因共同地明显表达，即FRAS1、OBSCN、NEB、COL7A1、PHLDB1、HIF1AN、SSPO、NFI和TRAPPC9。有趣的是，根据一项研究，7个胆管癌患者中有7种基因明显突变，即MUC16、MUC12、MUC4、MUC19、RYR3、OBSCN、TTN。

图14示出了骨肉瘤患者的活检中(根据基于血液的遗传测试获得的)靠前的粘蛋白基因和突变的表达谱。

总体而言，根据TCGA胆管癌数据库，前56种基因的42％表达，42％对应于表达图谱，而68％与科学文献中一名患者的CNV增益相关(肝右叶定位(IVa段))，从而导致胆管癌平均50％。类似地，27％对应于肺癌，而23％对应于总计100％的骨肉瘤，也如表4所示。

基于对全外显子、转录组和CNV扩增的科学文献，可以观察到，前56种基因表达对胆管癌的概率为68％，并且对肺癌的概率为32％。

进一步地，在本公开中，基于以下分析确定了骨组织的子位置：

使用基因躁狂软件进行了两种类型的分析。根据DIS GENET和科学文献，将血液遗传测试中表达的前3个或前56种基因映射到骶骨、髋臼、C6椎骨和肩胛骨的各种突变和表达分析。

基于上述分析，发现遗传数据集与骨子位置之间存在良好的遗传相互作用，如表5所示。表5显示了根据各种数据库和科学文献，骨组织的基因的遗传相互作用与转录组学数据的前56种基因一致。

表5

可以设想，基于用于鉴定骨组织位点的类似遗传相互作用，本领域技术人员还可能将癌症的潜在部位鉴定为胰腺和肾脏。

因此，可以得出结论，本公开提供了一种体外和非侵入性方法，以基于患者转录组学分析鉴定原发性、继发性和转移性癌症位点。

本公开的优点

如本公开所公开的方法是一种简单的基于血液或尿液的测试，并且不涉及任何侵入性技术。所述方法提供了与通过传统活检获得的信息等效的数据，但没有侵入性部分。而且，活检只能在组织可能受损或与潜在病状有关的情况下进行。在许多情况下，人体可能不会发出与潜在医学病状有关的早期信号，因为当状况出现时，患者剩余的时间可能非常少。本质上，本文的公开内容能够确定此非侵入性过程的有效诊断范围，不仅比当前已知的技术更早地预后和检测癌症，而且还具有最广泛的范围来检测具有单一标志物的多种癌症(实体瘤、血液系统恶性肿瘤和肉瘤)。还确定了此方法提供突变和表达转录组数据、分析深度和途径信息数据的能力，以达到目前只能通过侵入性活检和多个器官的水平。如果存在炎症或医学病状的早期迹象，则从VSEL获得的转录组、基因组或外显子的测序可以清楚地确定受试者的医学病状。另外，测序数据还可以用于准确地确定受试者体内存在的癌症类型。

进一步地，本公开还包含转录组基因库的范围。转录组基因库是在体外环境中储存生物体外部的遗传物质，用于在稍后阶段进行后续分析以评估健康状况的储存库。因此，储存RNA样品(-80℃或甚至液氮下)，指示健康以及患病个体的突变和表达谱，可以在任何时间点提供对遗传改变的动态分析。因此，个体的RNA储存对于暂时检测患病状况至关重要。VSEL可以很容易地以无痛、快速、低成本且非侵入性的方式从血液样品中获得，并且还指示了指示全器官活检的动态组织特异性基因表达谱。因此，储存来自受试者的血液样品的VSEL遗传物质的RNA库可以潜在地从患者一生中任何阶段的全身/器官角度提供有关个体健康状况的丰富数据。此数据可以与其它市售的病理学测试交叉引用，以帮助临床医生和医生进行疾病诊断，并可能建议治疗方式。

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序列表

<110> 23 IKIGAI私人有限公司（23 IKIGAI PTE LTD.）

<120> 用于鉴定人类受试者的医学病状的方法

<130> PD038036PCT

<140> 202180033608.2

<141> 2022-11-08

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO: 1 depicts the forward primer squence for Oct 4a gene

<400> 1

agccctcatt tcaccaggcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO: 2 depicts the reverse primer sequence for Oct 4a gene

<400> 2

tgggactcct ccgggttttg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO: 3 depicts the forward primer sequence for LINE 1 family(79 bp)

<400> 3

agggacatgg atgaaattgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO: 4 depicts the reverse primer sequence for LINE 1 family(79 bp)

<400> 4

tgagaatatg cggtgtttgg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO: 5 depicts the forward primer sequence for LINE 1 family(97 bp)

<400> 5

tggcacatat acaccatgga a 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO: 6 depicts the reverse primer sequence for LINE1 family(97 bp)

<400> 6

tgagaatgat ggtttccaat ttc 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO: 7 depicts the forward primer sequence for LINE1 family(127 bp)

<400> 7

acttggaacc aacccaaatg 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO: 8 depicts the reverse primer sequence for LINE1 family(127 bp)

<400> 8

tcatccatgt ccctacaaag g 21

Claims

1.一种用于检测受试者的医学病状的体外方法，所述方法包括：

a)获得样品；

b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；

c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；

d)用所述核酸执行测定以分析来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及

e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，

其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为1.1-3倍检测到所述受试者体内存在医学病状。

2.一种用于预测受试者的癌症的发作的体外方法，所述方法包括：

a)获得样品；

c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；

d)用所述核酸执行测定以分析所述非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；以及

其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为3-5倍预测了所述受试者的癌症的发作。

3.一种用于检测受试者的癌症的存在的体外方法，所述方法包括：

a)获得样品；

c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；

其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平增加至少5倍检测到所述受试者体内存在癌症。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过执行基于序列的测定对所述核酸进行分析。

5.根据权利要求2至3中任一项所述的方法，其中通过基于序列的测定对所述核酸进行分析检测到癌症的类型。

6.根据权利要求3所述的方法，其中与对照中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为5-10倍。

7.根据权利要求3所述的方法，其中与所述对照中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为10-15倍。

8.根据权利要求3所述的方法，其中与所述对照中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为15-20倍。

9.根据权利要求3所述的方法，其中与所述对照中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为20-25倍。

10.一种用于监测对抗癌疗法的应答的体外方法，所述方法包括：

a)在抗癌疗法期间的一个时间点获得样品；

b)从所述样品富集非常小的胚胎样干细胞以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物；

c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；

e)将来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与参照物中的非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平进行比较，所述比较监测到所述对抗癌疗法的应答。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述参照物是选自由以下组成的组的至少一个：(a)在施用抗癌疗法之前获得的样品；(b)相较于权利要求10的步骤(a)中所提及的时间点在稍早的时间点获得的样品；(c)相较于权利要求10的步骤(a)中所提及的时间点在稍后的时间点获得的样品；以及(d)从无癌症受试者获得的样品。

12.根据权利要求10所述的方法，其中与所述参照物中的所述表达水平相比，所述样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平降低指示对所述抗癌疗法的积极应答，并且其中所述参照物是选自由以下组成的组的至少一个：(a)在施用抗癌疗法之前获得的样品；(b)相较于权利要求10的步骤(a)中所提及的时间点在稍早的时间点获得的样品；以及(c)从无癌症受试者获得的样品。

13.一种用于检测对抗癌疗法的积极应答的体外方法，所述方法包括：

a)在施用抗癌疗法之前获得样品-I；

b)在施用所述抗癌疗法之后获得样品-II；

c)从所述样品-I富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物-I；

d)从所述样品-II富集非常小的胚胎样干细胞，以获得包括所述非常小的胚胎样干细胞的混合物-II；

e)从所述混合物-I获得核酸-I；

f)从所述混合物-II获得核酸-II；

g)用所述核酸-I和所述核酸-II独立地执行测定以分析Oct4A的表达水平；以及

h)将来自所述核酸-II的所述Oct4A的表达水平与来自所述核酸-I的所述Oct4A的表达水平进行比较，

其中与来自所述核酸-I的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述核酸-II的所述Oct4A的表达水平降低检测到对癌症治疗的积极应答。

14.一种用于检测癌症的体外方法，所述方法包括：

a)获得样品；

c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；

d)用所述核酸执行测定以分析非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平；

(e)将所述样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的非常小的胚胎样干细胞中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平相比，所述样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平增加指示癌症的存在；以及

(f)对所述核酸执行基于序列的测定并分析至少一种癌症相关标志物中的突变，

其中所述至少一种癌症相关标志物中的突变的存在指示基于所分析的癌症相关标志物的特定类型的癌症的存在。

15.根据权利要求1至3、10、13或14中任一项所述的方法，其中从所述混合物获得所述核酸通过选自由以下组成的组的任何一种方法进行：(a)硫氰酸胍-苯酚-氯仿核酸提取；(b)氯化铯梯度离心法；(c)十六烷基三甲基溴化铵核酸提取；(d)碱性提取；(e)基于树脂的提取；以及(f)固相核酸提取。

16.根据权利要求1至3、10、13或14中任一项所述的方法，其中用所述核酸执行测定以分析Oct4A的表达是通过选自由定量PCR、流式细胞术和下一代测序(NGS)组成的组的技术进行的。

17.根据权利要求1至3或14中任一项所述的方法，其中所述对照是从无癌症受试者获得的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平。

18.根据权利要求1至3、10、13或14中任一项所述的方法，其中所述从血液样品富集所述非常小的胚胎样干细胞包括：

a)使所述血液样品与中性缓冲液以1:1至1:20的比率范围接触，以获得第一混合物；

b)使至少一种盐溶液与所述第一混合物以1:2至1:10的比率范围接触，以获得第二混合物；以及

c)处理所述第二混合物以获得富集的非常小的胚胎样干细胞。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述处理所述第二混合物包括选自由以下组成的组的至少一种方法：(a)提取过程；(b)洗涤过程；(c)离心过程和其组合。

20.根据权利要求14所述的方法，其中所述癌症相关标志物选自由确定与癌症相关的已知标志物组成的组。

21.根据权利要求1至3、10、13或14中任一项所述的方法，其中所述方法并不依赖于侵入性技术。

22.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括：

a)从受试者获得样品；

c)从步骤(b)的所述混合物获得核酸；

(e)将所述样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平与对照样品中的Oct4A的表达水平进行比较，其中与所述对照样品中的所述Oct4A的表达水平相比，所述样品中的非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平增加检测到癌症；以及

(f)向所述受试者施用抗癌疗法以治疗癌症。

23.根据权利要求3所述的方法，其中与所述对照中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为5-10倍指示了I期癌症。

24.根据权利要求3所述的方法，其中与所述对照中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为10-15倍指示了II期癌症。

25.根据权利要求3所述的方法，其中与所述对照中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为15-20倍指示了III期癌症。

26.根据权利要求3所述的方法，其中与所述对照中的所述Oct4A的表达水平相比，来自所述样品的所述非常小的胚胎样干细胞中的所述Oct4A的表达水平的增加范围为20和更多倍指示了IV期癌症。

27.根据权利要求14所述的方法，其中所述癌症相关标志物选自由以下组成的组：mir145、OLR1、CD68、MSR1、CXCL16、NCAN、TKTL1、AN04、CHIT1、GPNMB、CCL18、TGFβl、FSP1、S100A6、SLC13A3、BGN、NCF2、6Ckine、MMP-9、MMP-3、MMP-7、整合素-P4、多效生长因子、尿激酶R、HLA-C、SLC9A3R1、NAT9、RAPTOR和SLC12A8、SPINK5、FcεRI-β、PHF11、IGFBP1、FACL4、IL1R、TGFβ、CHRNA3/5、IREB2、HHIP、FAM13A、AGER、肌钙蛋白T和I、HSP60、BNP、GDF-15、MMP2、MMP3、MMP9、IL6、TNFα、CRP、SOX9、ACAN、COL2A1、DKK1、FRZB、RUNX2、COL10A1、IGH、IGHM、IGHG1、去乙酰化酶、ACE2、IFI27、IFIT1、IFITM1、DPP4、KRAS、BRCA1和2、TP53、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRB1(I型)、PPARG、KCNJ11、CDKAL1、CDKN2A-CDKN2B、IDE-KIF11-HHEX、IGF2BP2和SLC30A8(II型)和其组合。

28.根据权利要求1所述的方法，其中所鉴定的医学病状选自由以下组成的组：多发性硬化、肾病症、皮肤疾病、肝病、肺病、心血管疾病、骨关节炎、病毒性疾病、癌症和糖尿病。

29.根据权利要求1至3或10或13或14中任一项所述的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述核酸选自由以下组成的组：来自所述样品的正常RNA、正常DNA、肿瘤RNA或肿瘤DNA。

31.根据权利要求1至3或10或13或14中任一项所述的方法，其中所述从所述样品富集所述非常小的胚胎样干细胞是通过选自由以下组成的组的任何方法进行的：流式细胞术、基于磁珠的分离、过滤、基于微流体的细胞分选、基于适体的细胞分离和浮力激活细胞分选。

32.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法进一步包括分析在步骤(c)中获得的所述核酸中的所述癌症相关标志物的所述表达水平。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述标志物的所述表达水平通过使用定量PCR技术进行分析。

34.根据权利要求1至3、10、13或14中任一项所述的方法，其中所述方法能够检测癌症而不需要肿瘤内异质性。

35.根据权利要求14所述的方法，其中使序列谱与参考序列谱相关以鉴定所述标志物中的突变的存在或不存在是通过算法进行的。

36.根据权利要求14所述的方法，其中将所述样品中的非常小的胚胎样干细胞的所述生物标志物的所述表达水平与对照样品中的至少一种生物标志物的表达水平进行比较以及使所述序列谱与参考序列谱相关以鉴定至少一种标志物中的突变的存在或不存在是通过算法进行的。

37.根据权利要求1至3、10、13或14中任一项所述的方法，其中所述核酸表示基因组。

38.根据权利要求1至3、10、13或14中任一项所述的方法，其中所述核酸表示转录组。

39.根据权利要求1至3、10、13或14中任一项所述的方法，其中所述核酸表示外显子。

40.根据权利要求1至3、10、13或14中任一项所述的方法，其中所述核酸表示cDNA。

41.根据权利要求1至3、10、13或14中任一项所述的方法，其中所述方法涵盖在鉴定医学病状时人类受试者的所有器官。

42.根据权利要求1至3、10、13或14中任一项所述的方法，其中所述方法提供了与所有器官活检等效的信息。

43.根据权利要求1至3、10、13或14中任一项所述的方法，其中所述方法是体外方法。

44.根据权利要求1至3、10、13或14中任一项所述的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：血液、组织、尿液和痰。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述样品是血液，并且其中所述样品是所述血液中的至少一种细胞类型，并且其中所述至少一种细胞类型选自由癌症干细胞和循环肿瘤细胞组成的组。

46.一种试剂盒，其包括用于从血液样品富集非常小的胚胎样干细胞的试剂。

47.一种检测试剂盒，其包括：(a)用于分析选自由包括非常小的胚胎样干细胞的混合物中的Oct4A、星状菌属(Stella)和脆弱拟杆菌(Fragilis)组成的组的至少一种生物标志物的表达水平的引物组；(b)用于执行定量PCR测定的试剂；(c)用于执行全基因组或外显子组或转录组测序的试剂；以及(d)用于分析序列谱的至少一个组织特异性阵列。

48.一种用于检测受试者的癌症的存在的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得血液/组织样品；(b)枚举所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(c)将所述血液样品中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照血液样品中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述血液样品中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量增加检测到所述受试者体内存在癌症。

49.一种用于预测受试者的癌症的发作的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得血液/组织样品；(b)枚举所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(c)将所述血液样品中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照血液样品中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述血液样品中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量增加预测了所述受试者的癌症的发作。

50.一种用于检测受试者的医学病状的存在的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得血液/组织样品；(b)枚举所述血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(c)将所述血液样品中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量与对照血液样品中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照血液样品中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述血液样品中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量增加检测到所述受试者体内存在医学病状。

51.一种用于检测受试者的癌症的存在的方法，所述方法包括：(a)在体内枚举受试者的血液/组织中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(b)将所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量与对照中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量增加检测到所述受试者体内存在癌症。

52.一种用于预测受试者的癌症的发作的方法，所述方法包括：(a)在体内枚举受试者的血液/组织中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(b)将所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量与对照中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量增加预测了所述受试者的癌症的发作。

53.一种用于检测受试者的医学病状的存在的方法，所述方法包括：(a)在体内枚举受试者的血液/组织中的非常小的胚胎样干细胞的数量；以及(b)将所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量与对照中的非常小的胚胎样干细胞的数量进行比较，其中与对照中的所述非常小的胚胎样干细胞的数量相比，所述受试者体内所述非常小的胚胎样干细胞的数量增加检测到所述受试者体内存在医学病状。