WO2011054699A1 - Verwendung von biokompatiblen zusammensetzungen und hieraus polymerisierten materialien zur inhibierung der angiogenese - Google Patents

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Juergen Mollenhauer
Burkhard Schlosshauer
Beate Scholz
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Definitions

  • the present invention relates to the use of a biocompatible composition and a material polymerized therefrom, based on crosslinkable hydrophilic polymer, for the inhibition and / or prevention of angiogenesis.
  • Angiogenesis is the formation of new vascular structures that have an endothelial cell lining as well as smooth muscle cells and pericytes. Angiogenesis plays a major role in both physiological processes, for example in embryonic development and wound healing, and in pathological processes, for example in polyarthritis and tumor growth.
  • Angiogenesis is a complex process in which the endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells necessary for the formation of the vessel walls are replaced by various angiogenic growth factors, for example by the fibroblast growth factor "fibroblast growth factor (FGF)” and / or the vascular endothelial growth factor "Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)".
  • FGF fibroblast growth factor
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • Angiogenesis is of considerable biological and medical importance, distinguishing two therapeutic applications of angiogenesis, angiogenic treatment and anti-angiogenic or non-angiogenic treatment.
  • the neovascularization is to be stimulated, in particular by use and administration of growth factors, such as, for example, for the treatment of arteriosclerosis, in particular coronary heart disease and peripheral occlusive disease.
  • growth factors such as, for example, for the treatment of arteriosclerosis, in particular coronary heart disease and peripheral occlusive disease.
  • An anti- or non-angiogenic treatment is used in particular where a neovascularization is necessarily prevented and undesirable, such as in the treatment of tumors, since solid tumors are dependent on a growing capillary network, which supplies the tumor with oxygen and nutrients. Accordingly, anti-angiogenic therapeutic approaches try to reduce / block the vascular supply and thus the blood flow to a tumor.
  • VEGF-neutralizing monoclonal antibodies were used for anti-angiogenic treatment of tumors in the prior art.
  • Unhindered angiogenesis also plays an important role in other diseases, such as Crohn's disease, psoriasis, and rheumatoid arthritis, since the newly formed vessels create a constant influx of inflammatory cell populations into the affected areas of the body.
  • diseases and Diseases directly related to angiogenesis can be found, for example, in Table 1 in the publication by Polverini, "Angiogenesis in Health and Disease: Insights into Basic Mechanisms and Therapeutic Opportunities," Journal of Dental Education, (2002). Vol. 66, 962-975.
  • Implants with which damaged tissue to be replaced, or stent / stent grafts that are introduced into certain organs to support the wall is often a prerequisite for a long-lasting successful use that they are not promote the neovascularization at the site where they were implanted, but to insert as neutral and inert as possible in the surrounding tissue, where they may also be absorbed.
  • endothelial cells attaching to medical implants, thereby triggering the mechanisms of neovascularization. This can cause unwanted side effects, such as swelling and thickening of the tissue into which the device has been implanted, to tumor growth.
  • the devices to be implanted are often coated with anti-angiogenic (and also anti-inflammatory) active substances, such as, for example, antibodies (for example anti-VEGF antibodies), retinoic acid and its derivatives, suramin, metalloproteinases -1- and metalloproteinases-2 inhibitors, epothilone, colchicine, vinblastine, paclitaxel, etc., which are said to inhibit the adhesion of endothelial cells to the devices, and the thereby triggerable neovascularization.
  • anti-angiogenic active substances such as, for example, antibodies (for example anti-VEGF antibodies), retinoic acid and its derivatives, suramin, metalloproteinases -1- and metalloproteinases-2 inhibitors, epothilone, colchicine, vinblastine, paclitaxel, etc.
  • coated devices / implants have the disadvantage that, on the one hand, the production due to the additional coating step is complex, and on the other hand, the anti-or non-angiogenic effect of the coating on the quality / quantity of the application of the coating and the active ingredient and of the durability the coating depends. Furthermore, it has been shown in the past that self-coated implants could not completely prevent the adhesion of endothelial cells. In addition, the coatings cause often side effects in the patient to be treated, which not only affect the success of the respective intervention, but also can be harmful to health as a whole.
  • the object is achieved by the use of a biocompatible composition based on a hydrophilic polymer which is polymerizable to a hydrogel-forming material, and wherein the hydrophilic polymer is crosslinkable serum albumin or crosslinkable serum protein for inhibiting and / or preventing angiogenesis or endothelial cell -Proliferation.
  • the invention also relates to the use of said biocompatible composition for coating and surface modification of implants made of materials other than the material polymerized from said composition.
  • the object is further achieved by the use of a polymerized hydrogel-forming material obtained by polymerizing a serum albumin or serum protein-based composition for the inhibition and / or prevention of angiogenesis or endothelial cell proliferation.
  • a new therapeutic agent or a medical carrier material is provided which makes it possible, for example, to replace tissue by means of an implant and at the same time inhibits the adhesion and proliferation of endothelial cells thereto.
  • this avoids the neovascularization as well as swelling and thickening of the tissue into which the composition is introduced for the replacement of a diseased or deficient tissue, and at the same time replaces the deficient or diseased tissue by resorption of the material.
  • a carrier material for an implant is provided, with which angiogenesis can be selectively inhibited, and, for example, the growth of other cells, which are not involved in angiogenesis, specifically promoted by prior introduction into the composition / material can be.
  • the composition can first be polymerized in situ, ie. the composition may be injected to the site where tissue replacement or tissue support is to take place and then polymerized at that site.
  • the composition can also be polymerized prior to introduction into the body of a patient, and then implanted via a surgical procedure.
  • the inventors have shown in their own experiments that a composition based on serum albumin or serum proteins or the material polymerized therefrom are excellently suitable as carrier material for the inhibition of the adhesion of endothelial cells and thus for the inhibition / prevention of angiogenesis.
  • the serum albumin / protein-based composition / material may be used as a medical implant for inhibiting angiogenesis, especially where neovascularization is disadvantageous and / or necessarily precluded. dert., for example, in a tissue replacement of cartilage, intervertebral discs, cornea.
  • serum albumins may contain a large number of different substances, e.g. Metal ions (metals), fatty acids and amino acids, bind various proteins and drugs, so they are extremely biocompatible and cause virtually no reactions in the body.
  • the use according to the invention can also take place in combination with other biologically and / or therapeutically active substances which are intended to have a biological and / or therapeutic effect via the composition or the gel at the target site of the patient.
  • the use according to the invention can take place in such a way that the material is first polymerized in situ or is already polymerized before implantation, and is implanted in the hydrogel state. It should be understood that when the polymerized hydrogel is implanted, a more firm consistency of the hydrogel is preferred which facilitates or facilitates practicable handling of the hydrogel.
  • the degree of strength, or the fluid property of the hydrogel or the material can be adjusted via the degree of crosslinking, after which the hydrogel or the material is the stronger, the more it is cross-linked. The fluid properties of a gel are thus between that of a liquid and that of a solid body.
  • albumin is known as a biocompatible substance, and is also described as a gel or carrier material as such, for example, in DE 10 2008 008 071.3, its use for inhibiting the adhesion and proliferation of endothelial cells and for inhibiting angiogenesis has not been known ,
  • the composition or the polymerized hydrogel-forming material based thereon can have serum albumin / serum proteins which can be obtained from each mammal or can be used correspondingly for each mammal, with human, bovine, ovine rabbit serum albumin being preferred and wherein the use according to the invention is preferably used in humans with a material based on human serum albumin.
  • the precursor of the hydrogel-forming material can be handled at room temperature. Accordingly, the material can be stored separately from the respective additives or cells to be introduced and brought together shortly before the application according to the invention with the additives, if desired, or, if appropriate, cells which are to support, for example, tissue regeneration.
  • the polymerization time is adjustable, with times between a few seconds and 2 minutes can be provided. Therefore, the additives and / or cells are immediately anchored in the material so as to avoid unwanted diffusion from the material.
  • the application as already mentioned, either with the in situ polymerizable hydrogel-forming material, or be polymerized with a prior to introduction into the body of a patient already to a hydrogel material.
  • composition and “material” are used in the present invention, “composition” being predominantly, but not exclusively, used for the unpolymerized material, and “material” or “gel” for the polymerized Composition.
  • gel is meant the semi-solid state of the composition which is in the form of a three-dimensional, polymerized network.
  • base material for the hydrophilic polymer is variable, so that on the one hand commercially available albumin, for example human albumin, purified or recombinantly produced, can be used, as well as allogeneic or autologous serum.
  • the use of the present invention is such that the serum albumin or serum protein-based composition is injected into the site to be treated where it polymerizes to the hydrogel-forming material, or the polymerized hydrogel-forming material is implanted directly.
  • the crosslinked albumin dissolves within a certain period of time, during which, for example, cells present in the material have developed a pericellular matrix in situ and are thus implanted in the environment.
  • endothelial cells are prevented from adhering and proliferating, triggering neovascularization from the material.
  • the use according to the invention is provided when the albumin concentration in the polymerized hydrogel-forming material is between approximately 5 to approximately 20, in particular approximately 10 mg / ml of material.
  • the composition / material for example, living mammalian cells, in particular human living cells, as well as a pharmacological agent, a biologically active agent, or one or more or mixtures thereof are used together with the composition / material.
  • mammalian cells any cell derived or derived from a mammal, including, in particular, human and animal Cells fall.
  • Such cells may, for example, be selected from musculoskeletal cells, in particular chondrocytes, osteocytes, fibrochondrocytes, metabolite-regulating gland cells, islet cells, melatonin-producing cells, progenitor cells and stem cells, in particular mesenchymal stem cells, ie therefore cells which are suitable for the particular use of the composition, or are suitable and desired for the respective injection site.
  • chondrocytes osteocytes
  • fibrochondrocytes metabolite-regulating gland cells
  • islet cells melatonin-producing cells
  • progenitor cells and stem cells in particular mesenchymal stem cells, ie therefore cells which are suitable for the particular use of the composition, or are suitable and desired for the respective injection site.
  • These cells are viable in the composition or polymerized hydrogel-forming material and develop new tissue with
  • the use according to the invention is also suitable for preventing neovascularization in therapies having the goal of producing s / fw hormones, such as insulin, thyroxine or melatonin.
  • s / fw hormones such as insulin, thyroxine or melatonin.
  • Bioly active substance and “pharmaceutically active or active substance” is intended to mean any natural or synthetic substance which may either have a biological or pharmaceutical influence on cells or tissue or which may exert reactions on or in cells , This influence may be limited to certain cells and certain conditions without the substance losing its biological or pharmaceutical active importance.
  • the chemical nature of the presently usable substances is not limited to a particular (compound) class, but rather may include any natural and synthetic substance that exerts by its nature and / or in modified form any effect on biological cells.
  • biologically or pharmaceutically active or active substances for example, antibiotics, antiinflammatory agents, metabolites sel-hormones, chondroprotective agents, gene therapy agents, growth hormones or differentiation and / or modulation factors, immunosuppressants, immunostimulating substances, generally peptides, proteins, nucleic acids, organic agents, hyaluronic acid, apoptosis-inducing agents, receptor agonist and receptor antagonists, or mixtures thereof, be used.
  • extracellular matrix proteins cell surface proteins, and generally polysaccharides, lipids, antibodies, growth factors, sugars, lectins, carbohydrates, cytokines, DNA, RNA, siRNA, aptamers, as well as binding or effect relevant fragments thereof, as well as so-called disease modifiying Osteoarthritis agents, or mixtures thereof, are used. All substances can be synthetically produced or naturally occurring or derived from recombinant sources.
  • DMOAs Disease-modifying osteoarthritis agents
  • the use according to the invention is preferred when the biologically active substance is hyaluronic acid and is present in the material in a final concentration of between about 1 to about 10 mg / ml of material, in particular with a. 4 mg / ml material.
  • growth hormones including human growth hormone and recombinant growth hormone (rhGH), bovine growth hormone, porcine growth hormone; Growth hormone releasing hormones; Interferons, including interferon alpha, beta and gamma; Interleukin-l; Interleukin-2; Insulin; Insulin-like growth factor, including IGF-1; heparin; erythropoietin; somatostatin; Somatotropin; Protease inhibitors; adrenocorticotropin; prostaglandins; as well as analogues, Fragments, mimetics or polyethyleneglycol (PEG) -modified derivatives of these compounds; or a combination of them.
  • growth hormones including human growth hormone and recombinant growth hormone (rhGH), bovine growth hormone, porcine growth hormone
  • Growth hormone releasing hormones Interferons, including interferon alpha, beta and gamma
  • Interleukin-l Interleukin-2
  • Insulin Insulin-like growth factor
  • the serum albumin or serum protein is functionalized by groups selected from maleimide, vinylsulfone, acrylate, alkyl halide, azirine, pyridyl, thionitrobenzenic acid, or arylating groups.
  • the cells or substances to be introduced into the composition are introduced by dispersion into the composition with the functionalized polymer which crosslinks with the cells / substances.
  • the invention also relates to the use of the composition or material for coating and surface modification of implants made of materials other than the material polymerized from said composition.
  • a coating or modification offers the possibility to coat implants, which consist of another, incomparably compatible material, so as to make these implants, which normally promote endothelial cell proliferation and thus also angiogenesis, non-angiogenic.
  • Any implants come into consideration, in particular those which themselves are based on hydrogels, but which are not based on the composition. This is also particularly advantageous in cases where a direct chemical bonding chemistry, as used for the polymerized material, is possible. This allows a covalent attachment of a thin layer of material to the implant material.
  • the invention also relates to the use of the described composition or of the polymerized hydrogel-forming material for the treatment or prevention of angiogenesis-associated diseases.
  • This measure has the advantage that these diseases can be alleviated by the use according to the invention by the inhibition of angiogenesis or even preventively prevented.
  • angiogenesis-associated diseases can be found, for example, in Carmeliet, "Angiogenesis in Health and Disease", Nature Medicine (2003), Vol. 9 No. 6: 653-660, and in particular in Table 1 listed there, in the diseases characterized by excessive angiogenesis are listed.
  • diseases characterized by excessive angiogenesis include cancer, some infectious diseases, autoimmune diseases, DiGeorge's syndrome, arteriosclerosis, obesity, psoriasis, Karposi's sarcoma, diabetic retinopathy, primary pulmonary hypertension, bronchial asthma, peritoneal adhesions, endometriosis, arthristis, synovitis, osteophytes, osteomyelitis.
  • FIG. 1 The results on adhesion tests of endothelial cells on a polymerized, hydrogel-forming, serum albumin-based material (hereinafter also referred to as "albino gel” or “Albugel”): Schematic representation of the culture of endothelial cells on the albugel (A); Diagram for the quantification of the number of endothelial cells on the albugel after 1 day and 5 days (B); Phalloidin-stained endothelial cells under the different culture conditions (C);
  • FIG. 2 shows the detection of the vitality of the endothelial cells on Albugel: diagram for the quantification of endothelial cells on the Albugel (A); Diagram for investigating the cytotoxic effect of Albugel extracts on endothelial cells (B); Calcein and DAPI stained endothelial cells under the different culture conditions (C, E, G, I) and uptake of Dil-Ac-LDL (D, F, H, J);
  • Fig. 3 shows the results of the study on the proliferation of endothelial cells on Albugel: DAPI- and BrdU-stained endothelial cells under the different culture conditions (A-D); Diagram for the quantification of the proliferation of endothelial cells on the albugel (E);
  • FIG. 4 shows the results of the investigations of the invasion of endothelial cells by the Albugel: schematic representation of the structure (A); Diagram for the quantitation of albuminogen-migrated endothelial cells (B); Chart for the analysis of the chemotactic index (C); Diagram for the analysis of the chemo-invasive index (D), Rose- Bengal-stained endothelial cells on the bottom of the Transwell filter (EL); the results of the studies on the ingrowth of blood vessels of the chorioallantoic membrane into the albugel: photos of the implants in ovo (A, B); Photos of the explanted chorioallantoic membrane with the albugel (C, D); HE (hematoxylin-eosin) stained chorioallantoic membrane with albugel (E, F); Sambucus nigra lectin-stained chorioallantoic membrane with albugel (G, H); and phase contrast images to G and H (I, J); the results
  • the thus functionalized serum albumin / protein can be polymerized by addition of SH crosslinkers.
  • the crosslinker bis-thio polyethylene glycol come into consideration, which carries an SH group at both ends.
  • crosslinking agents generally include substances which carry SH groups, in particular polymers, and, for example, dithio-PEG or SH-modified dextran, SH-modified polyvinyl alcohol, SH-modified polyvinylpyrrolidone, etc.
  • Bis-thio-PEG is commercially available, the crosslinker having a molecular weight of 10,000 g / mol was used. If the molecular weight is lower, this reduces the formation of gel, at higher masses the gel gels too quickly, which makes it impossible to sufficiently mix the substances.
  • the best gelation is achieved when SH groups of the crosslinker and maleimide groups of the albumin are present in equimolar concentrations. In each case, a final concentration of 3 mM maleimide and SH groups in the gel was used.
  • sheep -Albugel contained 4 mg / ml of high polymer hyaluronic acid (hereinafter and in the figures also referred to as "HS" / abbreviated), which is mixed before polymerization and therefore physically firmly anchored.
  • HS high polymer hyaluronic acid
  • a wide variety of animal and human serum albumins can be used as sources of albumin.
  • the same number of cells were cultured in a gelatinized (0.5%) 48-well plate and an albugel prepared with an additional 0.5% gelatin (final concentration in the gel).
  • the cells were cultured on 10 mg / ml Matrigel TM, a poorly defined basal membrane extract from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma, which acts as a basement membrane equivalent in basic research.
  • 2% gelatin solution 1: 4 was mixed with PBS (phosphate-buffered saline) and the plates were incubated therewith for 30 min. incubated. Subsequently, the plates were washed once with PBS.
  • Matrigel TM (20 mg / ml; BD Biosciences, San Jose, USA) was used 1: 2 with endothelial cell medium without FCS (fetal calf serum) mixed and polymerized for 20 min at 37 ° C in the plate.
  • the cells were cultured for 1 day or for 5 days at the various cultivation conditions.
  • the endothelial cells were treated as follows:
  • HUVECs were fixed with 2.5% glutaraldehyde / PBS to determine cell adhesion, permeabilized with 0.2% Triton-X 100 / PBS and then with DAPI (4 ', - diamidino-2-phenylindole ) and Phalloidin Oregon Green stained.
  • the cells were treated with Dil-Ac-LDL (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate-acetylated low-density lipoprotein) and then stained with calcein and DAPI for the detection of vital and dead HUVEC.
  • Dil-Ac-LDL 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate-acetylated low-density lipoprotein
  • Albugel extracts were examined for their cytotoxic effect on endothelial cells.
  • FIG. 2A The vitality of the endothelial cells is shown in FIG. 2A and qualitatively in FIGS. 2C, E, G and I.
  • FIG. While hardly any dead cells were detectable on the gelatin coating even after 5 days and less than 40% of the cells on Matrigel TM were dead after 5 days, the number of dead endothelial cells on the albugeles increased to more than 60%.
  • vital cells were able to take up Dil-Ac-LDL under all culture conditions (see FIGS. 2D, F, H, J), the functionality of the endothelial cells thus being retained. Extracts of the albugels additionally had no cytotoxic effect on the endothelial cells (FIG. 2, B).
  • Gelatin coating and Matrigel For the gelatin coating, 2% gelatin solution 1: 4 was mixed with PBS (phosphate buffered saline) and the plates were incubated therewith for 30 min. Subsequently, the plates were washed once with PBS.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Matrigel TM (20 mg / ml) was mixed 1: 2 with endothelial cell medium without FCS (fetal calf serum) and polymerized for 30 min at 37 ° C in the plate. The cells were cultured for 1 day at the various culture conditions.
  • FCS fetal calf serum
  • the endothelial cells were treated as follows:
  • HUVEC HUVEC were fixed to determine cell adhesion with 2.5% glutaraldehyde / PBS, permeabilized with 0.2% Triton-X 100 / PBS and then with DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) and phalloidin Oregon Green colored.
  • FIG. 7G after 1 day of culture on the aliquots and on Matrigel TM, the cell number is significantly below the cell number of the gelatin coating.
  • the morphology of the cells under the different culture conditions can be seen in Figs. 7A-H.
  • the endothelial cells spread to gelatin and form typical "Tubes" on Matrigel TM. Endothelial cells on the albugel form aggregates ( Figures 7C and E) or form a kind of spheroidal structure ( Figures 7D and F).
  • 3 ⁇ 10 5 ⁇ 33258-labeled HUVEC were transferred to the filters in 200 ⁇ M endothelial cell medium per batch. After the cells had settled for 2 hours, 600 ⁇ M endothelial cell medium with and without 40 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) was pipetted into the lower compartment. After 24 hours, the cells on the top of the filter were wiped off and the cells were fixed to the bottom of the filter and counted. Alternatively, the cells were stained with Rose Bengal.
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • the blood vessels of the CAM do not grow on the implanted albugles (Figure 5 A-D). Blood vessels could not be detected either in HE stained sections ( Figures 5 E and F) or in Sambucus nigra lectin stained sections ( Figures 5G and H), with blood vessels detected in the CAM using both staining methods.
  • the results show that the albugel exerted no angiogenic influence on the blood vessels of the CAM.
  • endothelial cells hardly adhere or proliferate on Albugel.
  • endothelial cells die off on the albugel, not because of the toxicity of the albug, but rather because of the lack of vital cell adhesion.
  • addition of the chemotactic attractant VEGF did not induce migration of the endothelial cells into the albugel, and blood vessels of the chicken egg chorioallantoic membrane did not migrate into the albugel.
  • in vivo experiments on the mouse with the albugel showed no migration of blood vessels into the Albugel.
  • non-permissive properties for endothelial cells thus offer the possibility of using the albug as a matrix / implant for the inhibition and prevention of angiogenesis and adhesion of endothelial cells, in particular in the field of implantation of medicine, for example in the treatment of sclerosis, and regenerative medicine, For example, in the treatment of diseased and / or deficient cartilage, intervertebral disc, corneal tissue.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer biokompatiblen Zusammensetzung, die zu einem hydrogelbildenden Material polymerisierbar ist und die auf einem hydrophilen Polymer basiert, zur Inhibierung und/oder Prävention der Angiogenese oder Endothelzell-Proliferation, wobei das hydrophile Polymer vernetzbares Serumalbumin oder vernetzbares Serumprotein ist. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines polymerisierten, hydrogelbildenden Materials, das durch Polymerisierung einer auf Serumalbumin oder Serumproteinen basierenden Zusammensetzung erhalten wurde, zur Inhibierung und/oder Prävention der Angiogenese oder Endothelzell-Proliferation.

Description

Verwendung von biokompatiblen Zusammensetzungen und hieraus polymerisierten
Materialien zur Inhibierung der Angiogenese
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer biokompatiblen Zusammensetzung und eines hieraus polymerisierten Materials, basierend auf vernetzbarem hydrophilen Polymer, zur Inhibierung und/oder Prävention der Angiogenese.
Als Angiogenese bezeichnet man die Ausbildung von neuen Gefäßstrukturen, die eine Endothelzell-Auskleidung sowie auch glatte Muskelzellen und Perizyten aufweisen. Die Angiogenese spielt bei sowohl physiologischen Prozessen, bspw. in der Embryonalentwicklung und der Wundheilung, als auch bei pathologischen Prozessen, bspw. bei Polyarthritis und Tumorwachstum, eine große Rolle.
In der Forschung und Literatur wurden und werden für die Neubildung von Gefäßen zum Teil drei unterschiedliche Begriffe verwendet - Vaskulogenese, Angiogenese Arteriogenese - wobei sich heute der Begriff Angiogenese als Überbegriff für alle Formen der Gefäßneubildung durchgesetzt hat, da eine Abgrenzung der drei genannten Formen teilweise schwierig und das zugrunde liegende Prinzip einheitlich ist. Bei der Angiogenese handelt es sich um einen komplexen Prozess, bei dem die zur Bildung der Gefäßwände notwendigen Endothelzellen, Perizyten, und glatten Muskelzellen durch verschiedene angiogenetische Wachstumsfaktoren, bspw. durch den Fibroblasten-Wachstumsfaktor "Fibroblast Growth Factor (FGF)" und/oder den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor "Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)", aktiviert werden. Neue Kapillaren entstehen durch Proliferation und Migration von im betreffenden Gewebe bereits vorliegenden Endothelzellen.
Die Angiogenese ist von erheblicher biologischer und medizinischer Bedeutung, wobei zwei therapeutische Anwendungen der Angiogenese unterschieden werden, die Pro-angiogenetische Behandlung und die anti-angiogenetische bzw. non- angiogenetische Behandlung.
Bei ersterer soll die Gefäßneubildung stimuliert werden, insbesondere durch Einsatz und Verabreichung von Wachstumsfaktoren, wie bspw. zur Behandlung der Arteriosklerose, insbesondere der koronaren Herzkrankheit und der peripheren Verschlusskrankheit.
Eine anti- bzw. non-angiogene Behandlung wird insbesondere dort eingesetzt, wo eine Gefäßneubildung unbedingt verhindert und unerwünscht ist, wie bspw. bei der Tumorbehandlung, da solide Tumoren abhängig von einem mitwachsenden Kapillarnetz sind, das den Tumor mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt. Entsprechend versuchen anti-angiogenetische Therapieansätze die Gefäßversorgung und damit die Durchblutung eines Tumors zu reduzieren/zu blockieren. So wurden für eine anti- aniogenetische Behandlung von Tumoren im Stand der Technik bspw. VEGF- neutralisierende monoklonale Antikörper eingesetzt.
Auch bei anderen Krankheiten, wie Morbus Crohn, Psoriasis, und rheumatoide Arthritis, spielt eine ungehinderte Angiogenese eine große Rolle, da über die neu gebildeten Gefäße ein ständiger Zufluss für entzündliche Zellpopulationen an die betroffenen Stellen im Körper geschaffen wird. Eine Übersicht über Krankheiten und Erkrankungen, die mit einer Angiogenese in einem unmittelbaren Zusammenhang stehen, findet sich bspw. in der Tabelle 1 in der Veröffentlichung von Polverini, "Angiogenesis in health and Disease: Insights into Basic Mechanisms and Therapeutic Opportunities", Journal of Dental Education, (2002) Vol. 66, 962-975.
Auch bei implantierbaren medizinischen Vorrichtungen/Implantaten, also bspw. Implantate, mit denen beschädigtes Gewebe ersetzt werden soll, oder Stent/Stentgrafts, die in bestimmte Organe eingebracht werden, um deren Wand abzustützen, ist oftmals Voraussetzung für einen dauerhaft erfolgreichen Einsatz, dass diese nicht die Gefäßneubildung an der Stelle, an der sie implantiert wurden, fördern, sondern sich möglichst neutral und inert in das sie umgebende Gewebe einfügen, wo sie ggf. auch resorbiert werden. In diesen Fällen besteht, bei medizinischen Implantaten die große Gefahr, dass sich Endothelzellen an diese anheften und dadurch die Mechanismen der Gefäßneubildung in Gang setzen. Dadurch können unerwünschte Nebenwirkungen, wie bspw. Schwellungen und Verdickungen des Gewebes, in das die Vorrichtung implantiert wurde, bis hin zum Tumorwachstum, auftreten.
Um dies zu verhindern, werden im Stand der Technik die zu implantierenden Vorrichtungen oftmals mit anti-angiogenen (und auch entzündungshemmenden) Wirkstoffen beschichtet, wie bspw. Antikörper (bspw. anti-VEGF Antikörper), Reti- nonsäure und ihre Derivate, Suramin, Metallproteinasen-1- und Metallproteinasen-2- Inhibitoren, Epothilon, Colchicin, Vinblastin, Paclitaxel, etc., die die Adhäsion von Endothelzellen an die Vorrichtungen, und die dadurch triggerbare Gefäßneubildung, inhibieren sollen.
Derartig beschichtete Vorrichtungen/Implantate haben allerdings den Nachteil, dass einerseits die Herstellung aufgrund des zusätzlichen Beschichtungsschrittes aufwändig ist, und dass andererseits die anti- oder non-angiogene Wirkung der Beschichtung von der Qualität/Quantität der Anbringung der Beschichtung und des Wirkstoffes sowie von der Dauerhaftigkeit der Beschichtung abhängt. Ferner zeigte sich in der Vergangenheit, dass selbst beschichtete Implantate die Adhäsion von Endothelzellen nicht vollständig verhindern konnten. Darüber hinaus verursachen die Beschichtun- gen oftmals Nebenwirkungen im zu behandelnden Patienten, die nicht nur den Erfolg des jeweiligen Eingriffs beeinflussen, solchen auch insgesamt gesundheitsschädlich sein können.
Es besteht daher gegenwärtig nach wie vor ein großer Bedarf an der Bereitstellung von medizinischen Implantaten, mit welchen die Nachteile des Standes der Technik überwunden werden können, und die - bei gleichzeitiger hervorragender Biokompatibilität - effizient im Einsatz und kostengünstig in der Herstellung sind.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Mittel für ein medizinisches Implantat bereitzustellen, die keine Gefäßneubildung auslösen bzw. verursachen, bzw. die die Adhäsion von Endothelzellen inhibieren.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Verwendung einer biokompatiblen Zusammensetzung gelöst, die auf einem hydrophilen Polymer basiert und die zu einem hydrogelbildenden Material polymerisierbar ist, und wobei das hydrophile Polymer vernetzbares Serumalbumin oder vernetzbares Serumprotein ist, zur Inhibierung und/oder Prävention der Angiogenese oder der Endothelzell-Proliferation.
Ferner betrifft die Erfindung auch die Verwendung der genannten biokompatiblen Zusammensetzung zur Beschichtung und Oberflächenmodifikation von Implantaten, die aus anderen Materialien als das Material bestehen, das ausgehend von der genannten Zusammensetzung polymerisiert ist.
Die Aufgabe wird ferner durch die Verwendung eines polymerisierten, hydrogelbildenden Materials gelöst, das durch Polymerisierung einer auf Serumalbumin oder Serumproteinen basierenden Zusammensetzung erhalten wurde, zur Inhibierung und/oder Prävention der Angiogenese oder Endothelzell-Proliferation.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird dadurch vollkommen gelöst. Mit der erfindungsgemäßen Verwendung der Zusammensetzung und dem polymeri- sierten, hydrogelbildenden Material wird ein neues therapeutisches Mittel bzw. ein medizinisches Trägermaterial bereitgestellt, das die Möglichkeit bspw. zum Gewebeersatz mittels eines Implantats ermöglicht und gleichzeitig die Adhäsion und Proliferation von Endothelzellen daran inhibiert. Vorteilhafterweise werden dadurch die Gefäßneubildung sowie eine Schwellung und Verdickung des Gewebes, in das die Zusammensetzung zum Ersatz eines erkrankten oder defizienten Gewebes eingebracht wird, vermieden, und gleichzeitig das defiziente oder erkrankten Gewebe durch Resorption des Materials ersetzt.
Mit der erfindungsgemäßen Verwendung wird also ein Trägermaterial für ein Implantat bereitgestellt, mit dem die Angiogenese gezielt inhibiert werden kann, und bspw. das Wachstum von anderen Zellen, die nicht an der Angiogenese beteiligt sind, durch vorherige Einbringung in die Zusammensetzung/das Material gezielt gefördert werden kann.
Vorteilhaft an der neuen Verwendung ist darüber hinaus, dass die Zusammensetzung auch erst in situ polymerisierbar ist, d.h. die Zusammensetzung kann an die Stelle injiziert werden, wo der Gewebeersatz bzw. die Gewebeunterstützung stattfinden soll, und polymerisiert dann erst an dieser Stelle aus. Dadurch ist für die beanspruchte therapeutische Behandlung lediglich ein minimaler medizinischer Eingriff notwendig. Andererseits kann die Zusammensetzung auch vor Einbringung in den Körper eines Patienten auspolymerisiert werden, und anschließend über einen chirurgischen Eingriff implantiert werden.
Die Erfinder haben in eigenen Versuchen gezeigt, dass eine auf Serumalbumin bzw. Serumproteine basierende Zusammensetzung bzw. das hieraus polymerisierte Material als Trägermaterial für die Inhibierung der Adhäsion von Endothelzellen und damit für die Inhibierung/Prävention der Angiogenese hervorragend geeignet sind. So kann die auf Serumalbumin/-proteinen basierende Zusammensetzung/das Material als zu medizinisches Implantat zur Inhibierung der Angiogenese insbesondere dann eingesetzt werden, wo eine Gefäßneubildung von Nachteil ist und/oder unbedingt verhin- dert werden muss, bspw. bei einem Gewebeersatz von Knorpel, Bandscheiben, Cornea. Überraschenderweise hat sich in den der Erfindung zugrunde liegenden Versuchen gezeigt, dass im Vergleich zu anderen, im Stand der Technik verwendeten und bekannten Trägern oder Matrices, nur das auf Serumalbumin/-proteinen basierende Material eine Adhäsion von Endothelzellen inhibiert. Dabei ist das Material aber für die Endothelzellen selber nicht toxisch - und damit auch nicht für den Patienten, der das Material als medizinisches Implantat erhalten soll-, was wiederum die besonders hohe Bioverträglichkeit des Materials für den Patienten beweist.
Darüber hinaus können Serumalbumine eine große Anzahl unterschiedlicher Substanzen, wie z.B. Metallionen (Metalle), Fettsäuren und Aminosäuren, verschiedene Proteine und Arzneimittel binden, weshalb sie äußerst biokompatibel sind und so gut wie keine Reaktionen im Körper hervorrufen.
Daher kann die erfindungsgemäße Verwendung auch in Kombination mit anderen biologisch und/oder therapeutische aktiven Substanzen erfolgen, die über die Zusammensetzung bzw. das Gel am Zielort des Patienten eine biologische und/oder therapeutische Wirkung entfalten sollen. Dabei kann die erfindungsgemäße Verwendung derart erfolgen, dass das Material erst in situ polymerisiert oder aber vor dem Implantierung bereits polymerisiert ist, und im Hydrogel-Zustand implantiert wird. Dabei versteht es sich, dass bei einer Implantation des auspolymerisierten Hydrogels eine eher festere Konsistenz des Hydrogels bevorzugt ist, die eine praktikable Handhabung des Hydrogels ermöglicht bzw. erleichtert. Der Grad des Festigkeit, bzw. die Fluideigenschaft des Hydrogels bzw. des Material kann dabei über dessen Vernetzungsgrad eingestellt werden, wonach des Hydrogel bzw. das Material um so fester ist, je stärker vernetzt es ist. Die Fluideigenschaften eines Gels liegen somit zwischen der einer Flüssigkeit und der eines Feststoffkörpers.
Obgleich Albumin als bioverträgliche Substanz bekannt ist, und auch als Gel bzw. Trägermaterial als solches bspw. in der DE 10 2008 008 071.3 beschrieben ist, so war dessen Verwendung zur Inihibierung der Adhäsion und Proliferation von Endothelzellen, sowie zur Inhibierung der Angiogenese, nicht bekannt. Die für die erfindungsgemäße Verwendung einzusetzende Zusammensetzung bzw. das hierauf basierende polymerisierte hydrogelbildende Material kann dabei Serumalbumin/Serumproteine aufweisen, die von jedem Säugetier gewonnen werden, bzw. entsprechend für jedes Säugetier eingesetzt werden können, wobei humanes, Rinder-, Schaf- Kaninchenserumalbumin bevorzugt sind, und wobei die erfindungsgemäße Verwendung vorzugsweise beim Menschen mit einem auf humanem Serumalbumin basierenden Material eingesetzt wird.
Vorteilhaft bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist ferner, dass die Vorstufe des hydrogelbildenden Materials bei Raumtemperatur gehandhabt werden kann. Das Material kann demnach separat von den jeweils einzubringen Zusätzen oder Zellen gelagert werden und kurz vor der erfindungsgemäßen Anwendung mit den Zusätzen, falls erwünscht, oder ggf. Zellen, die bspw. Gewebeneubildung unterstützen sollen, zusammengeführt werden. Die Polymerisationszeit ist dabei einstellbar, wobei Zeiten zwischen wenigen Sekunden und 2 Minuten vorgesehen sein können. Daher werden die Zusätze und/oder Zellen sofort in dem Material verankert, so dass eine unerwünschte Diffusion aus dem Material vermieden wird. Dabei kann die Anwendung, wie bereits zuvor erwähnt, entweder mit dem in situ polymerisierbaren hydrogelbildenden Material erfolgen, oder aber mit einem vor der Einbringung in den Körper eines Patienten bereits zu einem Hydrogel-Material polymerisiert sein.
In der vorliegenden Anmeldung werden bei der erfindungsgemäßen Verwendung die Begriffe "Zusammensetzung" und "Material" verwendet, wobei "Zusammensetzung" überwiegend, aber nicht ausschließlich, für das noch nicht polymerisierte Material verwendet wird, und "Material" oder "Gel" für die polymerisierte Zusammensetzung. Gleichwohl versteht es sich, dass diese Begriffe nicht vollständig voneinander getrennt werden können, da die Zusammensetzung und das Material faktisch den gleichen Gegenstand meinen. Dabei wird unter "Gel" der halbfeste Zustand der Zusammensetzung verstanden, der in Form eines dreidimensionalen, polymerisierten Netzwerks vorliegt. Vorteilhaft ist bei der erfindungsgemäßen Verwendung ferner, dass der Grundstoff für das hydrophile Polymer variabel ist, so dass einerseits kommerziell verfügbares Albumin, bspw. humanes Albumin, gereinigt oder rekombinant hergestellt, eingesetzt werden kann, sowie auch allogenes oder autologes Serum.
Wie bereits erwähnt, erfolgt die erfindungsgemäße Verwendung derart, dass die auf Serumalbumin bzw. Serumprotein basierende Zusammensetzung in die zu behandelnde Stelle injiziert wird, wo sie zu dem hydrogelbildenden Material polymerisiert, oder das polymerisierte hydrogelbildende Material wird direkt implantiert. Nach der Einbringung in den Patienten löst sich das vernetzte Albumin innerhalb eines bestimmten Zeitraumes auf, währenddessen bspw. in dem Material vorliegende Zellen in situ eine perizelluläre Matrix entwickelt haben, und so in die Umgebung eingenistet werden. Gleichzeitig wird verhindert, dass sich Endothelzellen anheften und proliferieren und so eine Gefäßneubildung ausgehend von dem Material triggern.
Dabei ist in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung vorgesehen, wenn die Albuminkonzentration im polymerisierten hydrogelbildenden Material von zwischen ca. 5 bis ca. 20, insbesondere ca. 10 mg/ml Material beträgt.
Beispielhafte Verfahren zum Herstellen der Zusammensetzung für die erfindungsgemäße Verwendung finden sich in der bereits oben erwähnten DE 10 2008 008 071.3, auf deren Inhalt diesbezüglich hiermit explizit Bezug genommen wird.
Erfindungsgemäß ist in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, dass bspw. lebende Säugetierzellen, insbesondere humane lebende Zellen, sowie ein pharmakologisches Agens, ein biologisch wirksames Agens, oder eins oder mehrere oder Mischungen davon zusammen mit der Zusammensetzung/dem Material verwendet werden.
Unter Säugetierzellen wird dabei jede Zelle verstanden, die von einem Säugetier abgeleitet ist bzw. abstammt, wobei hierunter insbesondere humane und tierische Zellen fallen. Solche Zellen können bspw. ausgewählt sein unter muskuloskelettäre Zellen, insbesondere Chondrocyten, Osteocyten, Fibrochondrocyten, sowie stoffwechselregulierende Drüsenzellen, Inselzellen, Melatonin-produzierende Zellen, Vorläuferzellen und Stammzellen, insbesondere mesenchymalen Stammzellen, mithin also Zellen, die für den jeweiligen Einsatz der Zusammensetzung, bzw. für die jeweilige Injektionsstelle geeignet und gewünscht sind. Diese Zellen sind in der Zusammensetzung bzw. dem polymerisierten hydrogelbildenden Material lebensfähig und entwickeln ein neues Gewebe bei gleichzeitiger Resorption des Materials.
Die erfindungsgemäße Verwendung ist auch geeignet, um eine Gefäßneubildung bei Therapien zu verhindern, die das Ziel der in s/fw-Hormonproduktion haben, wie bspw. Insulin, Thyroxin oder Melatonin. Wenn Zellen, die diese oder andere Hormone produzieren, über die Zusammensetzung oder das Material an die zu behandelnden Stelle im Körper eines Patienten eingebracht werden, produzieren diese die jeweiligen Hormone und setzen diese an die Umgebung frei, wobei gleichzeitig eine Gefäßneubildung verhindert wird.
Es versteht sich, dass die erfindungsgemäße Verwendung auch in Zusammenwirkung mit biologischen oder pharmazeutisch aktiven Substanzen erfolgen kann. "Biologisch aktive bzw. wirksame Substanz" und "pharmazeutisch aktive bzw. wirksame Substanz" soll dabei jede natürliche oder synthetische Substanz bedeuten, die entweder einen biologischen oder pharmazeutischen Einfluss auf Zellen oder Gewebe haben kann, bzw. die Reaktionen auf oder in Zellen ausüben kann. Dieser Einfluss kann dabei auf bestimmte Zellen und bestimmte Bedingungen beschränkt sein, ohne dass die Substanz ihre biologisch oder pharmazeutische aktive Bedeutung verlieren würde. Die chemische Beschaffenheit der vorliegend verwendbaren Substanzen ist dabei nicht auf eine bestimmte (Verbindungs-)Klasse beschränkt, sondern kann vielmehr jede natürliche und synthetische Substanz mit einschließen, die von ihrer Natur aus und/oder in modifizierter Form irgendeine Wirkung auf biologische Zellen ausübt.
So ist insbesondere bevorzugt, wenn als biologisch oder pharmazeutisch aktive bzw. wirksame Substanzen bspw. Antibiotika, entzündungshemmende Mittel, Stoffwech- sel-Hormone, Chondroprotektiva, Agentien zur Gentherapie, Wachstumshormone oder Differenzierungs- und/oder Modulationsfaktoren, Immunsuppresiva, immunstimulierende Substanzen, allgemein Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, organische Wirkstoffe, Hyaluronsäure, Apoptose-induzierende Wirkstoffe, Rezeptoragonisten- und Rezeptorantagonisten, oder Mischungen davon, eingesetzt werden. Ferner können Proteine der extrazellulären Matrix, Proteine der Zelloberfläche, sowie allgemein Polysaccharide, Lipide, Antikörper, Wachstumsfaktoren, Zucker, Lektine, Kohlenhydrate, Zytokine, DNA, RNA, siRNA, Aptamere, sowie bindungs- oder wirkungsrelevante Fragmente davon, sowie sogenannte Disease-modifiying Osteoarthritis Agents, oder Mischungen davon, eingesetzt werden. Dabei können sämtliche Substanzen synthetisch hergestellt oder natürlich vorkommend sein bzw. aus rekom- binanten Quellen stammen. Unter „Disease-modifying Osteoarthritis Agents" (DMOAs) sind dabei eine Reihe von Substanzen zu verstehen, die als Medikament gegenwärtig insbesondere bei Arthrose - inzwischen aber auch bei weiteren Autoimmunkrankheiten - zur Linderung von Schmerzen und Entzündungen eingesetzt werden, und deren exakter Wirkungsmechanismus bisher noch nicht umfassend geklärt ist. Die meisten dieser Substanzen enthalten Mischungen aus Glucosamin und Chondroitin-Sulfat.
Insbesondere ist in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung bevorzugt, wenn die biologisch wirksame Substanz Hyaluronsäure ist und in dem Material in einer Endkonzentration von zwischen ca. 1 bis ca. 10 mg/ml Material vorliegt, insbesondere mit a. 4 mg/ml Material.
Weitere Beispiele schließen, jedoch nicht ausschließlich, die folgenden synthetischen oder natürlichen oder rekombinanten Quellen davon mit ein: Wachstumshormone, einschließlich humanem Wachstumshormon und rekombinatem Wachstumshormon (rhGH), Rinderwachstumshormone, Schweinewachstumshormone; Wachs- tumshormon-freisetzende Hormone; Interferone, einschließlich Interferon-alpha, - beta und -gamma; Interleukin-l; Interleukin-2; Insulin; Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor, einschließlich IGF-l; Heparin; Erythropoietin; Somatostatin; Somatotro- pin; Proteaseinhibitoren; Adrenocorticotropin; Prostaglandine; sowie Analoga, Fragmente, Mimetika oder Polyethyleneglycol(PEG)-modifizierte Derivate dieser Verbindungen; oder eine Kombination davon. Es versteht sich, dass alle gegenwärtig im allgemeinen Gebiet der Therapie von Erkrankungen mit von Trägern/Matrizes in situ freizusetzenden (Wirk-) Stoffen zur Anwendung für die vorliegende Erfindung in Frage kommen, wobei dem Fachmann jeweils klar sein wird, dass der einzusetzende (Wirk-)Stoff bzw. die einzusetzenden Zellen vom jeweiligen zu behandelnden Fall abhängen.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung ist bevorzugt, wenn das Serumalbumin oder das Serumprotein durch Gruppen funktionalisiert ist, die aus Maleimid-, Vinylsulfon-, Acrylat-, Alkylhalogenid-, Azirin-, Pyridyl-, Thionitrobenzol- säuregruppen, oder arylierenden Gruppen ausgewählt sind.
Unter„funktionalisiert" bzw. funktionalisieren ist vorliegend jeder - abgeschlossene - Vorgang zu verstehen, mit dem dem Polymer - bspw. durch Hinzufügen von Gruppen an das Polymer - eine Funktion verliehen wird, die es normalerweise nicht besitzt.
Durch die Funktionalisierung des Polymers mit Maleimidgruppen kann eine gute Vernetzung des Polymers und gleichzeitig die Lebensfähigkeit von Zellen oder Biofunktionalität von Substanzen gewährleistet werden, wenn diese in die Zusammensetzung/das Material eingebracht werden. Die in die Zusammensetzung ggf. einzubringenden Zellen oder Substanzen werden durch Dispergierung in die Zusammensetzung mit dem funktionalisierten Polymer eingebracht, das mit den Zellen/Substanzen vernetzt.
Wie bereits weiter oben erwähnt betrifft die Erfindung auch die Verwendung der Zusammensetzung oder des Materials zur Beschichtung und Oberflächenmodifikation von Implantaten, die aus anderen Materialien als das Material bestehen, das ausgehend von der genannten Zusammensetzung polymerisiert ist. Eine solche Beschichtung bzw. Modifikation bietet die Möglichkeit, Implantate, die aus einem anderen, nicht vergleichbar verträglichem Material bestehen, zu beschichten, um so diese Implantate, die normalerweise die Endothelzell-Proliferation und damit auch eine Angiogenese fördern, non-angiogen zu machen. Dabei kommen jegliche Implantate in Betracht, insbesondere solche, die wiederum selber auf Hydro- gelen basieren, die aber nicht auf der Zusammensetzung basieren. Dies ist ferner insbesondere in den Fällen vorteilhaft, wo eine direkte chemische Anbindungsche- mie, wie sie für das polymerisierte Material eingesetzt wird, möglich ist. Dies erlaubt eine kovalente Anbindung einer dünnen Materialschicht an das Implantatmaterial.
Wie bereits weiter oben erwähnt, betrifft die Erfindung auch die Verwendung der beschriebenen Zusammensetzung oder des polymerisierten hydrogelbildenden Materials zur Behandlung oder Prävention von Angiogenese-assoziierten Krankheiten.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass diese Krankheiten durch die erfindungsgemäße Verwendung durch die Inhibierung der Angiogenese gelindert oder sogar präventiv verhindert werden können.
Eine Auflistung von Angiogenese-assoziierten Krankheiten ist bspw. in Carmeliet, "Angiogenesis in health and disease", Nature Medicine (2003), Vol. 9 Nr. 6: 653-660, zu finden, und insbesondere in der dort aufgeführten Tabelle 1, in der Krankheiten, welche durch übermäßige Angiogenese charakterisiert werden, aufgelistet sind. Bspw. zählen hierzu Krebs, einige Infektionskrankheiten, Autoimmunerkrankungen, DiGe- orge Syndrom, Arteriosklerose, Fettsucht, Psoriasis, Karposi Sarkom, diabetische Retinopathie, primäre pulmonale Hypertension, Asthma bronchiale, peritoneale Adhäsionen, Endometriose, Arthristis, Synovitis, Osteophytenbildung, Osteomyelitis.
Weitere Vorteile ergeben sich aus der Beschreibung und der beigefügten Zeichnung.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 Die Ergebnisse zu Adhäsionsversuchen von Endothelzellen auf einem polymerisierten, hydrogelbildenden, auf Serumalbumin basierenden Material (im Folgenden auch "Albumingel" oder "Albugel"): Schematische Darstellung der Kultur von Endothelzellen auf dem Albugel (A); Diagramm zur Quantifizierung der Anzahl von Endothelzellen auf dem Albugel nach 1 Tag und 5 Tagen (B); Phalloidin-gefärbte Endothelzellen bei den verschiedenen Kulturbedingungen (C);
Fig. 2 den Nachweis der Vitalität der Endothelzellen auf Albugel: Diagramm zur Quantifizierung von Endothelzellen auf dem Albugel (A); Diagramm zur Untersuchung der zytotoxischen Wirkung von Albugel- Extrakten auf Endothelzellen (B); Calcein- und DAPI-gefärbte Endothelzellen bei den verschiedenen Kulturbedingungen (C, E, G, I) und Aufnahme von Dil-Ac-LDL (D, F, H, J);
Fig. 3 die Ergebnisse zur Untersuchung zur Proliferation von Endothelzellen auf Albugel: DAPI- und BrdU-gefärbte Endothelzellen bei den verschiedenen Kulturbedingungen (A-D); Diagramm zur Quantifizierung der Proliferation von Endothelzellen auf dem Albugel (E);
Fig. 4 die Ergebnisse der Untersuchungen der Invasion von Endothelzellen durch das Albugel: schematische Darstellung des Aufbaus (A); Diagramm zur Quantifizierung von durch das Albumingel gewanderten Endothelzellen (B); Diagramm zur Analyse des chemotaktischen Index (C); Diagramm zur Analyse des chemoinvasiven Index (D), Rose- Bengal-gefärbte Endothelzellen auf der Unterseite der Transwell-Filter (E-L); die Ergebnisse der Untersuchungen zum Einwachsen von Blutgefäßen der Chorioallantoismembran in das Albugel: Fotos der Implantate in ovo (A, B); Fotos der explantierten Chorioallantoismembran mit dem Albugel (C, D); HE- (Hämatoxylin-Eosin) gefärbte Chorioallantoismembran mit dem Albugel (E, F); Sambucus nigra Lektin-gefärbte Chorioallantoismembran mit Albugel (G, H); und Phasekontrastaufnahmen zu G und H (I, J); die Ergebnisse zu Implantationsversuchen von Albugel subkutan in den Rücken einer Skid/nu Maus: HE-Färbung des Albugels mit umgebendem Mausgewebe (A), Sambucus nigra Lektin-Färbung und DAPI Färbung des Albugels mit umgebendem Mausgewebe (B); und die Ergebnisse zu Adhäsionsversuchen von immortalisierten Endothelzellen auf dem Albugel: Phalloidin-gefärbte Endothelzellen bei den verschiedenen Kulturbedingungen (A-F); Diagramm zur Quantifizierung der Anzahl von Endothelzellen auf dem Albugel nach 1 Tag (G).
A) Herstellung von maleimidmodifiziertem Serumalbumin
250 mg humanes, Kaninchen- oder Schaf-Serumalbumin (Sigma-Aldrich) wurden in 5 ml IM Na-Borat (pH 8,2) gelöst. Dazu wurden 75 μΐ einer 260 mM N-Maleoyl-ß- Alanin (Sigma-Aldrich Kat.-Nr 63285)-Lösung in PBS/Na-Borat (pH 8,2) (1:1) hinzugefügt, und für 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. 106 mg 3-Maleimido- propionsäure-N-Hydroxysuccinimidester (SMP, Obiter Research, Urbana, IL, USA) in 950 μΐ Dimethylformamid (DMF) gelöst. Unlösliches Material wurde durch Zentrifu- gation abgetrennt. 500 μΐ des Überstandes wurden zu der Albuminlösung gegeben, die danach für 60 min bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Danach wurden 500 μΐ 3M Natriumacetat (pH 4,7) dazu gegeben und dreimal gegen 1 Liter PBS auf Eis dialysiert. Das Dialysat wurde anschließend durch Ultrafiltration (YM-3 Membran, Millipore) auf ein Volumen von 3,5 ml konzentriert, filtersterilisiert und bei -80°C gelagert.
Das so funktionalisierte Serumalbumin/-protein kann durch Zugabe von SH- Vernetzern polymerisiert werden. Dabei kommen insbesondere der Vernetzer Bis- Thio Polyethylenglykol in Betracht, der an beiden Enden eine SH-Gruppe trägt. Neben Bis-Thio-PEG kommen als Vernetzer generell Substanzen in Betracht, die SH- Gruppen tragen, insbesondere Polymere, und bspw. Dithio-PEG oder SH- modifiziertes Dextran, SH-modifiziertes Polyvinylalkohol, SH-modifiziertes Polyvi- nylpyrrolidon, etc.
Bis-Thio-PEG ist kommerziell erhältlich, verwendet wurde der Vernetzer mit einer Molmasse von 10000 g/mol. Liegt die Molmasse darunter, verringert dies die Gelbildung, bei höheren Massen geliert das Gel zu schnell, was eine ausreichende Vermischung der Substanzen unmöglich macht. Die beste Gelbildung wird erreicht, wenn SH-Gruppen des Vernetzers und Maleimidgruppen des Albumins in äquimolaren Konzentrationen vorliegen. Verwendet wurde jeweils eine Endkonzentration von 3 mM Maleimid und SH-Gruppen im Gel. Zusätzlich enthielt das Schaf -Albugel 4 mg/ml hochpolymere Hyaluronsäure (im Folgenden und in den Figuren auch mit "HS" bezeichnet/abgekürzt), die vor Polymerisation zugemischt wird und daher physikalisch fest verankert vorliegt. Als Albuminquelle sind aber die verschiedensten tierischen und menschlichen Serumalbumine verwendbar.
B) Versuche zum Nachweis der non-angiogenen Eigenschaft des Albugels
1. Test des Albugels als Substrat für humane Endothelzellen a) Um die Wirkungen von Albugel auf Endothelzellen ("EZ") zu untersuchen, wurden primäre humane Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC) (PromoCel, Heidelbergl) der Passagen 3 bis 9 auf Gel kultiviert und anschließend die Adhäsion, die Vitalität und die Proliferation der Zellen untersucht. Hierzu wurden je 100 μΐ Schaf-Albugel in einer 48-well Platte auspolymerisiert und je 1,5 x 104 HUVECs in 300 μΐ Endothelzellmedium pro well für 24 Stunden oder für 5 Tage auf dem Gel kultiviert (Versuchsaufbau Siehe Fig. 1A). Zur Kontrolle wurde die gleiche Anzahl Zellen in einer gelatinierten (0,5%) 48-well Platte kultiviert und ein Albugel mit zusätzlich 0,5% Gelatine (Endkonzentration in dem Gel) hergestellt. Gleichzeitig wurden die Zellen auf 10 mg/ml Matrigel™ kultiviert, eines wenig definierten Basalmembranextraktes aus dem Engelbreth-Holm-Swarm Maus-Sarkom, der als Basalmembranäquivalent in der Grundlagenforschung fungiert.
Herstellung der Albugele (im Folgenden und in den Figuren auch mit "AG" abgekürzt/bezeichnet) :
Figure imgf000017_0001
Gelatinebschichtung und Matrigel
Für die Gelatinebeschichtung wurden 2% Gelatinelösung 1:4 mit PBS (Phos- phat-gepufferter Saline) gemischt und die Platten damit für 30 min. inkubiert. Anschließend wurden die Platten einmal mit PBS gewaschen. Matrigel™ (20 mg/ml; BD Biosciences, San Jose, USA) wurde 1:2 mit Endothelzellmedium ohne FCS (fetales Kälberserum) gemischt und für 20 min bei 37°C in der Platte auspolymerisiert.
Die Zellen wurden für 1 Tag oder für 5 Tage bei den verschiedenen Kultivierungsbedingungen kultiviert. Zur Auswertung wurden die Endothelzellen wie folgt behandelt:
Nach 1 Tag und nach 5 Tagen wurden die HUVEC zur Bestimmung der Zelladhäsion mit 2,5% Glutaraldehyd/PBS fixiert, mit 0,2% Triton-X 100/PBS permeabilisiert und anschließend mit DAPI (4',-Diamidino-2-phenylindol) und Phalloidin Oregon Green gefärbt.
Oder: Mithilfe des "5-Bromo-2'-deoxy-Uridin Cell Labeling and Detetion Kit I" (Roche, Mannheim) wurden proliferierende HUVEC nach 1 Tag sichtbar gemacht.
Oder: Nach 1 Tag und 5 Tagen wurden die Zellen mit Dil-Ac-LDL (1,1'- Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbocyanin Perchlorat-acetyliertes Low- Density-Lipoprotein) behandelt und anschließend mit Calcein und DAPI zur Detektion vitaler und toter HUVEC gefärbt. Zusätzlich wurden Albugel-Extrakte hinsichtlich ihrer zytotoxischen Wirkung auf Endothelzellen untersucht.
Herstellung der Extrakte:
200 μΐ Albugel (mit und ohne Gelatinezusatz) wurden in einem Eppendorf- Gefäß auspolymerisiert und für 24 Stunden mit 1 ml Endothelzellmedium bei 37°C schüttelnd kultiviert. Zur Kontrolle wurden Extrakte von Matrigel™ entsprechend hergestellt. Die Endothelzellen wurden für 24 Stunden mit den verschiedenen Extrakten und mit DMSO (Dimethylsulfoxid) als Totkontrolle in- kubiert. Die Vitalität der Zellen, in Bezug gesetzt zu Zellen, welche lediglich mit Medium kultiviert wurden, wurde mittels Alamar Blue Assay ermittelt. Ergebnisse:
Wie Fig. 1 entnommen werden kann, lag nach 1 Tag Kultur auf den Albugelen und auf Matrigel™ die Zellzahl deutlich unter der Zellzahl der Gelatinebe- schichtung. Nach 5-tägiger Kultur sank die Zellzahl auf den Gelen, wohingegen sie auf Gelatine weiter stieg. Die Morphologie der Zellen bei den verschiedenen Kulturbedingungen kann den Fig. 1 C-J entnommen werden. Während die Endothelzellen auf den Albugelen Aggregate bildeten und nicht auf dem Gel adhärieren konnten, breiteten sich die Endothelzellen auf Gelatine aus und bildeten auf Matrigel™ typische "Tubes" aus. Die Ergebnisse zeigen, dass Endothelzellen nicht auf dem Albugel adhärieren können und z.B. bei Mediumwechsel von dem Gel gelöst werden.
Die Vitalität der Endothelzellen ist in der Fig. 2A und qualitativ in der Fig. 2C, E, G und I dargestellt. Während auf der Gelatinebeschichtung auch nach 5 Tagen kaum tote Zellen zu detektieren waren und auch auf Matrigel™ nach 5 Tagen weniger als 40% der Zellen tot waren, stieg die Anzahl toter Endothelzellen auf den Albugelen auf über 60% an. Hingegen waren vitale Zellen bei allen Kulturbedingungen in der Lage Dil-Ac-LDL aufzunehmen (siehe Fig. 2D, F, H, J), die Funktionalität der Endothelzellen bleibt demnach erhalten. Extrakte der Albugele wiesen zusätzlich keine zytotoxische Wirkung auf die Endothelzellen auf (Fig. 2, B).
Wie der Fig. 3 (A-D qualitativ, E quantitativ) entnommen werden kann, proliferierten Endothelzellen auf dem Albugel im Gegensatz zur Gelatinebeschichtung nur in einem geringen Maße. Die Zugabe von Gelatine, die für ihre proangiogenen und proadhäsiven Eigenschaften bekannt ist, in das Albumingel zeigte keinen positiven Effekt auf die Endothelzellen.
2. Test des Albugels als Substrat für humane Endothelzellen
Um auszuschließen, dass Hyaluronsäure ("HS") für die beobachteten Effekte verantwortlich ist, wurden im Weiteren Versuche mit Kaninchen-Albugel ohne Hyaluronsäure durchgeführt. a) Durchführung:
Für die Kultur wurden immortalisierte humane Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC hTERT) verwendet.
I,5xl04 HUVEC wurden in 300 μΐ Endothelzellmedium auf 0,5% Gelatinebe- schichtung, 100 μΐ Matrigel™ (10 mg/ml) oder 100 μΐ Albumingel pur in einer 48-well Platte kultiviert. Als weitere Kontrolle wurde zusätzlich mit 0,5% Gelatine (Endkonzentration) hergestellt.
Herstellung der Albumingele:
Figure imgf000020_0001
Gelatinebeschichtung und Matrigel Für die Gelatinebeschichtung wurden 2% Gelatinelösung 1:4 mit PBS (Phosphate gepufferte Saline) gemischt und die Platten damit für 30 min inkubiert. Anschließend wurden die Platten einmal mit PBS gewaschen.
Matrigel™ (20 mg/ml) wurde 1:2 mit Endothelzellmedium ohne FCS (fetal Kälberserum) gemischt und für 30 min bei 37°C in der Platte auspolymerisiert. Die Zellen wurden für 1 Tag bei den verschiedenen Kulturbedingungen kultiviert.
Zur Auswertung wurden die Endothelzellen wie folgt behandelt:
Nach 1 Tag wurden die HUVEC zur Bestimmung der Zelladhäsion mit 2,5% Glutaraldehyd/PBS fixiert, mit 0,2% Triton-X 100/PBS permeabilisiert und anschließend mit DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) und Phalloidin Oregon Green gefärbt. b) Ergebnisse:
Wie der Fig. 7G entnommen werden kann, liegt nach 1 Tag Kultur auf den Al- bugelen und auf Matrigel™ die Zellzahl deutlich unter der Zellzahl der Gelatinebeschichtung. Die Morphologie der Zellen bei den verschiedenen Kulturbedingungen kann der Fig. 7 A - H entnommen werden. Die Endothelzellen breiten sich auf Gelatine aus und bilden auf Matrigel™ typische "Tubes" aus. Endothelzellen auf dem Albugel bilden Aggregate (Abb. 7C und E) oder sie bilden eine Art Sphäroidstruktur aus (Abb. 7D und F).
3. Invasion von Endothelzellen durch das Albugel a) Die Invasion von Endothelzellen durch das Albugel auf einem Transwell-Filter wurde verglichen zur Invasion durch Matrigel™ und der Migration durch einen unbeschichteten Filter. Eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus kann der Fig. 4A entnommen werden. Transwell-Filter mit einer Porengröße von 8 pm wurden mit 100 μΐ Albugel mit Hyaluronsäure, 100 μΐ Albuminsäure mit 0,5% Gelatine und 100 μΐ Matrigel™ (5 mg/ml) beschichtet. Zur Bestimmung der Migration wurden unbeschichtete Transwell-Filter verwendet.
Pro Ansatz wurden 3xl05 Hoechst 33258-markierte HUVEC in 200 μΐ Endo- thelzellmedium auf die Filter überführt. Nachdem sich die Zellen für 2 Stunden abgesetzt hatten, wurden 600 μΐ Endothelzellmedium mit und ohne 40 ng/ml VEGF (Vascular endothelial growth factor) in das untere Kompartiment pipettiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen auf der Oberseite des Filters abgewischt und die Zellen auf de Unterseite des Filters fixiert und ausgezählt. Alternativ wurden die Zellen mit Rose Bengal gefärbt.
Ergebnisse:
Die Anzahl der Endothelzellen auf der Unterseite der Transwell-Filter ist in Fig. 4B gezeigt, Rose Bengal gefärbte Endothelzellen in Fig. 4E-L. Aus den Mittelwerten der Anzahl der Zellen auf der Unterseite der Filter wurde der chemotaktische Index (siehe Fig. 4C), der den Quotienten aus Migration oder Invasion mit VEGF Induktion zu ohne VEGF Induktion angibt und der chemoinvasive Index (siehe Fig. 4D), der den Quotienten aus durch ein Gel gewanderten und migrierten Zellen angibt, berechnet. Die chemotaktischen Indizes bei allen Be- schichtungen lagen etwa gleich hoch, die Induktion durch VEGF ist demnach vergleichbar. Die chemoinvasiven Indizes der beiden Albugele lagen allerdings deutlich unter dem chemoinvasiven Index von Matrigel™, was zeigt, dass Endothelzellen nur in geringem Maße durch das Albugel wandern können. 4. Einwachsen von Blutgefäßen der Chorioallantoismembran in das Albugel a) Durchführung
In Eier der Rasse Hissex Braun wurde an Embryonaltag 3 ein Fenster in die Eischale eingefügt. Am Embryonaltag 8 wurden 200 μΐ Albugel mit Hyaluron- säure und 200 μΐ Albugel mit Hyaluronsäure und 0,5% Gelatine auf die stark vaskularisierte Chorioallantoismembran (CAM) überführt. Die Eier wurden bis Embryonaltag 13 weiter inkubiert. Die CAM wurde in 4% PFA (Paraformalde- hyd)/PBS bei Raumtemperatur in ovo fixiert, anschließend explantiert und für einen weiteren Tag bei 4°C fixiert, für 2 Tage in 30% Saccharose/destilliertem Wasser entwässert und in Tissue Tek (O.C.T. Compound, Sakura; Torrance Kanada) eingefroren. 7 pm dicke Gefrierschnitte wurden HE- (Hämatoxylin- Eosin) und 5 pm dicke Gefrierschnitte mit dem Sambucus nigra Lektin gefärbt. b) Ergebnisse:
Die Blutgefäße der CAM wachsen nicht auf die implantierten Albugele zu (Fig. 5 A-D). Weder in HE gefärbten (Fig. 5 E und F) noch in Sambucus nigra Lektin gefärbten Schnitten (Fig. 5 G und H) konnten Blutgefäße nachgewiesen werden, wobei Blutgefäße in der CAM mithilfe beider Färbemethoden detektiert werden konnten. Die Ergebnisse zeigen, dass das Albugel keinen angiogenen Einfluss auf die Blutgefäße der CAM ausübte.
5. Implantation des Albugels in den Rücken einer Scid/nu Maus a) Albumingele, basierend auf humanem Serumalbumin wurden mit humanen Bandscheibenzellen besiedelt und in den Rücken von Scid/nu Mäusen injiziert. Zwei Wochen nach dem Implantation wurden die Albumingele wieder explantiert und Schnitte dieser explantierten Albumingele nach HE-Färbung untersucht. Zusätzlich wurden Blutgefäße mittels einer immunhistochemi- schen Färbung gegen den humanen von Willebrand Faktor detektiert. b) Ergebnisse
Mittels HE-Färbung konnten weder im umgebenden Mausgewebe noch in den Implantaten Blutgefäße nachgewiesen werden (Fig. 6A), die Zellkerne humaner Bandscheibenzellen in dem Implantat wurden durch das Hämatoxylin gefärbt. Die spezifische Färbung von Blutgefäßen mit einem Antikörper gegen den humanen von Willebrand Faktor zeigte, dass sich in dem umgebenden Gewebe Blutgefäße befanden, nicht jedoch in das Albugel einwuchsen (Fig. 6B). In dem Implantat sind lediglich die D API-gefärbten humanen Bandscheibenzellen erkennbar.
Zusammenfassend konnte mit den oben beschriebenen Versuchen gezeigt werden, dass Endothelzellen auf Albugel kaum adhärieren oder proliferieren. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Endothelzellen auf dem Albugel absterben, und zwar nicht etwa aufgrund einer Toxizität des Albugels, sondern vielmehr aufgrund der fehlenden überlebenswichtigen Zelladhäsion. Auch konnte durch Zugabe des chemotaktischen Lockstoffs VEGF nicht eine Wanderung der Endothelzellen in das Albugel erreicht werden, und auch Blutgefäße der Hühnerei-Chorioalllantoismembran wandern nicht in das Albugel ein. Auch in vivo Versuche an der Maus mit dem Albugel zeigten kein Einwandern von Blutgefäßen in das Albugel.
Diese non-permissiven Eigenschaften für Endothelzellen bieten somit die Möglichkeit der Verwendung des Albugels als Matrix/Implantat zur Inhibierung und Prävention der Angiogenese und der Adhäsion von Endothelzellen, insbesondere im Implantationsbereich der Medizin, bspw. bei der Behandlung von Sklerosen, und der regenerativen Medizin, bspw. bei der Behandlung von erkranktem und/oder defizien- tem Knorpel-, Bandscheiben-, Corneagewebe.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer biokompatiblen Zusammensetzung, die zu einem hydro- gelbildenden Material polymerisierbar ist und die auf einem hydrophilen Polymer basiert, zur Inhibierung und/oder Prävention der Angiogenese oder En- dothelzell-Proliferation, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile Polymer vernetzbares Serumalbumin oder vernetzbares Serumprotein ist.
2. Verwendung nach Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung zumindest eines der Folgenden aufweist, Säugerzellen, ein pharmakologisches Agens, ein biologisch wirksames Agens, oder eins oder mehrere oder Mischungen davon.
3. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Serumalbumin oder das Serumprotein durch Gruppen funktiona- lisiert ist, die aus Maleimid-, Vinylsulfon-, Acrylat-, Alkylhalogenid-, Azirin-, Pyridyl-, Thionitrobenzolsäuregruppen, oder arylierenden Gruppen ausgewählt sind.
4. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Serumalbumin und das Serumprotein humanes Serumalbumin und humanes Serumprotein ist.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das pharmakologisch wirksame Agens ausgewählt ist aus zumindest einem der Folgenden: einem Antibiotikum, einem entzündungshemmendem Mittel, einem Stoffwechsel-Hormon, Chondroprotektiva, Agentien zur Gentherapie, Wachstumshormone, Differenzierungs- oder Modulationsfaktoren, Immun- suppresiva, immun-stimulierende Substanzen, DMOAs, Nucleinsäuren, Apop- tose-induzierende Wirkstoffe, adhäsionsvermittelnde Wirkstoffe, Rezeptora- gonisten- und Rezeptorantagonisten, oder Mischungen davon.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Albuminkonzentration in dem Material von ca. 5 bis ca. 15 mg/ml Material, insbesondere von ca. 10 mg/ml Material beträgt.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung in injizierbarer Form eingesetzt wird.
Verwendung eines polymerisierten, hydrogelbildenden Materials, das durch Polymerisierung einer auf Serumalbumin oder Serumproteinen basierenden Zusammensetzung erhalten wurde, zur Inhibierung und/oder Prävention der Angiogenese oder Endothelzell-Proliferation.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Material als Implantat eingesetzt wird.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Materials nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verwendung als Oberflächenbeschichtung eines Implantates eingesetzt wird.
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