CN102596182A - 生物相容性组合物及由其聚合的材料用于抑制血管生成的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物相容性组合物的应用，所述组合物能够聚合为水凝胶形成材料并基于亲水性聚合物，用于抑制和/或预防血管生成或内皮细胞增殖，其中所述亲水性聚合物是可交联的血清白蛋白或可交联的血清蛋白。本发明还涉及一种聚合的水凝胶形成材料用于抑制和/或预防血管生成或内皮细胞增殖的用途，所述聚合的水凝胶形成材料通过将基于血清白蛋白或血清蛋白的组合物聚合而得到。

Description

生物相容性组合物及由其聚合的材料用于抑制血管生成的应用
本发明涉及一种基于可交联的亲水性聚合物的生物相容性组合物及由其聚合的材料用于抑制和/或预防血管生成的应用。
血管生成是指新的血管结构的形成，所述结构具有内皮细胞内壁并具有平滑肌细胞和周细胞。血管生成不仅对于生理过程诸如在胚胎发育和伤口愈合中，还对于病理过程诸如在多发性关节炎和肿瘤生长中，起到非常大的作用。
在研究和文献中，曾经且目前仍部分使用三个不同的概念用于血管的新形成——血管发生、血管生成和动脉发生——其中，目前采用血管生成这一概念作为所有形式新血管形成的总概念，因为这三种所述形式的范围难以区分，并且根本原理是一致的。
血管生成是一个复杂的过程，其中构成血管壁所必须的内皮细胞、周细胞和平滑肌细胞通过不同的血管生成生长因子，例如通过成纤维细胞生长因子(FGF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)激活。新的毛细血管通过已存在于相关组织中的内皮细胞的增殖和迁移产生。
血管生成具有重要的生物学和医药学意义，在此，血管生成的两种治疗应用区分为促血管生成的治疗和抗血管生成或非血管生成的治疗。
在前一种治疗中应当刺激形成新血管，特别是通过使用和给药生长因子，像是例如对动脉硬化，特别是冠心病和外周阻塞疾病的治疗。
而抗血管生成或非血管生成的治疗特别在必须阻止或不希望形成新血管的情况下使用，例如在肿瘤治疗中，因为实体瘤依赖于向其提供氧和养分的共生毛细血管网络。相应地，抗血管生成疗法尝试减少/阻隔肿瘤的血管供应，由此减少/阻隔对肿瘤的供血。因此，在现有技术中，为了进行肿瘤的抗血管生成治疗，使用例如中和VEGF的单克隆抗体。
在其他疾病例如克隆氏症、银屑病和类风湿性关节炎中，不受阻的血管生成也有重要作用，因为通过新形成的血管，用于发炎的细胞群的连续流到达身体中的感染部位。与血管生成有直接关系的病症和疾病的概述可以在例如Polverini的著作《Angiogenesis in health and Disease：Insights intoBasic Mechanisms and Therapeutic Opportunities》，Journal of DentalEducation，(2002)Vo1.66，962-975中的表1中找到。
此外，对于可植入的医疗装置/植入物，例如应当用以替代受损组织的植入物，或是安置到特定器官中用以支撑其壁的支架/斯滕特移植物，通常对于持久成功使用的前提条件是，要求它们在其植入位置不促进形成新的血管，而尽可能的被中性和惰性地填入包围它们的组织中，在那里，它们还有可能被再吸收。对于医学植入物来说，在这些情况下会产生巨大的危险，即内皮细胞粘连在植入物上并由此启动新血管形成机制。由此能够产生不希望的副作用，例如植入了所述装置的组织的肿胀和增生，直至导致出现肿瘤生长。
为了防止出现这种情况，在现有技术中，通常对将植入装置用抗血管生成的(并且还消炎的)活性成分涂覆，例如抗体(如抗VEGF抗体)、视黄酸及其衍生物、苏拉明、金属蛋白酶-1-和金属蛋白酶-2-抑制剂、埃坡霉素、秋水仙碱、长春花碱、紫杉醇等等，其应当抑制内皮细胞粘连到所述装置上和可由此引发的新血管形成。
但是这类涂覆的装置/植入物存在缺点，一方面，由于附加涂覆步骤而导致生产成本增高，另一方面，覆层的抗血管生成或无血管生成效果依赖于设置覆层及活性成分的质量/数量，还依赖于覆层的耐久性。此外，过去的事实证明，涂覆植入物本身不能够完全阻止内皮细胞的粘连。此外，覆层经常导致在接受治疗的患者体内产生副作用，这些副作用不仅影响每个手术的成效，还能够造成整体健康受损。
因此，对于能够克服现有技术缺陷的、而且——同时具有出色的生物相容性的——使用起来有效的以及制造成本低廉的医学植入物的供应，目前仍存在巨大的需求。
在所述技术背景下，本发明的目的在于，提供一种用于医学植入物的制品，所述制品不激活或不导致新血管形成，并且抑制内皮细胞的粘连。
根据本发明，通过应用一种生物相容性的组合物达到上述目的，所述组合物基于亲水性聚合物并能够聚合为水凝胶形成材料，其中亲水性聚合物为可交联的血清白蛋白或可交联的血清蛋白，用于抑制和/或预防血管生成或内皮细胞增殖。
此外本发明还涉及所述生物相容性组合物的应用，用于对植入物进行涂覆和表面改性，所述植入物由另一种与从上述组合物出发聚合得到的材料不同的材料构成。
上述目的进一步通过应用一种聚合的、水凝胶形成材料解决，所述材料通过聚合基于血清白蛋白或血清蛋白的组合物得到，用于抑制和/或预防血管生成或内皮细胞增殖。
由此，本发明的基本目的完全得到解决。
通过根据本发明组合物的应用以及聚合的、水凝胶形成材料，提供一种新的治疗制品，或药物载体材料，使得例如利用植入物进行组织替代成为可能，并且同时抑制内皮细胞在其上粘连和增殖。有利之处在于，由此避免新血管形成以及在其中引入了用于替代患病或缺损组织的所述组合物的组织的肿胀和增生，且同时通过材料的吸收替代缺损或患病组织。
根据本发明所述的应用，还提供植入物用载体材料，通过所述载体材料能够有针对性地抑制血管生成，并且例如通过预先引入所述组合物/材料中，可以有针对性地促进其它不参与血管生成的细胞的生长。
除此之外，所述新应用的有利之处在于，组合物还是首先可原位聚合的，亦即可以将所述组合物注入到应当进行组织替代或组织支撑的位置，并首先在该位置进行聚合。由此，为所需的治疗处理仅需最少的医学手术。反之，所述组合物也能够在植入患者体内之前进行聚合，随后通过外科手术植入。
发明者已在其试验中证实，基于血清白蛋白或血清蛋白的组合物，或更确切地说，由所述组合物聚合得到的材料，特别适合于作为载体材料，用以抑制内皮细胞的粘连，从而用于抑制/预防血管生成。因此，这种基于血清白蛋白/蛋白的组合物/材料作为医学植入物，特别可以用于在新血管形成是不利的和/或是必须绝对避免的情况下，例如在软骨、椎间盘、角膜进行组织替代时，抑制血管生成。令人惊喜的是，在本发明中的基础实验证实，与其它现有技术中应用的和公知的载体或基体相比，只有基于血清白蛋白/血清蛋白的材料抑制了内皮细胞的粘连。与此同时，在此所述材料本身对内皮细胞是无毒的，并且因此对应接受所述材料作为医疗植入物的患者来说也是无毒的，这再次证明了所述材料对患者特别高的生物兼容性。
除此之外，血清白蛋白能够结合大量不同的物质，像是例如金属离子(金属)、脂肪酸和氨基酸、各种蛋白质和药品，因此其极具生物相容性，而且如此之好而不在体内引起反应。
由此，根据本发明所述的应用也能够与其它生物和/或治疗活性物质组合使用，所述活性物质应在患者的目标位置通过组合物或者更确切地说通过凝胶发挥生物和/或治疗效果。与此同时，本发明所述应用能够以如下方式实施，即所述材料是可首先原位聚合的，或在植入前已聚合并且以水凝胶状态植入。由此理解的是，当植入聚合了的水凝胶时，优选更加坚固的水凝胶稠度，使得对所述水凝胶的实际处理成为可能或变得容易。坚固性的程度，或更确切地说，水凝胶或材料的流体性质能够在此通过其交联度得到调整，交联越强，其后水凝胶或材料就越坚固。因此，凝胶的流体性质处于液体和固体之间。
虽然白蛋白作为生物兼容性物质是公知的，并且还作为凝胶或载体材料，作为这些在例如DE 10 2008 008 071.3中得以叙述，但它在抑制内皮细胞的粘连和增殖及抑制血管生成方面的应用尚属未知。
用于根据本发明所述应用的组合物，或更确切地说基于所述组合物聚合的水凝胶形成材料，可以在其中含有能够从任何哺乳动物获得，或能够相应地应用于任何哺乳动物的血清白蛋白/血清蛋白，在此优选为人类、牛、羊或家兔血清白蛋白，并且根据本发明所述的应用，对人类优先使用基于人类血清白蛋白的材料。
根据本发明所述的应用进一步的优点在于，所述水凝胶形成材料的前体是可在室温操作的。因此，所述材料能够与各种加入的成分或细胞分开存放，并当需要时，在即将进行本发明所述应用前，再使其与成分，或有时与细胞，例如应当支持形成新组织的细胞，汇合到一起。其中，聚合时间是可调节的，可以将时间设计为几秒至2分钟。由此，组分和/或细胞立即固定于材料中，避免不希望的从材料中向外的扩散。在此如上文所述，所述应用要么通过可原位聚合的水凝胶形成材料实现，要么通过在向患者体内引入之前已经聚合的水凝胶材料实现。
在本说明书中，在根据本发明所述的应用中使用术语“组合物”和“材料”，其中，“组合物”偏重于但并不专一地用于尚未聚合的材料，而“材料”或“凝胶”用于已聚合的组合物。不过可以理解，这些术语不能够完全地相互分开，因为组合物和材料实际上指的是同一对象。此处，“凝胶”指的是组合物的半固体状态，它以三维的聚合的网络形式存在。
根据本发明所述的应用进一步的优点在于，亲水性聚合物的原料是可变的，所以一方面可以使用可商购的白蛋白，例如提纯或重组制备的人白蛋白，另一方面也能够使用异源或自体血清。
如上文所述，根据本发明所述的应用以下述方式实现：将基于血清白蛋白或血清蛋白的组合物注入待治疗位置，在该处所述组合物聚合成为水凝胶形成材料，或者将已聚合的水凝胶形成材料直接植入。向患者植入之后，在一段确定的时间内，交联的白蛋白分解，在此过程中，例如存在于材料中的细胞原位发展为细胞周的基质，并且因此构造在所述环境中。同时，抑制了内皮细胞的粘连和增殖及因此触发的基于材料的新血管形成。
在此，根据本发明所述的应用的一个实施方式设计为，聚合的水凝胶形成材料中的白蛋白浓度处于约5至约20特别是约10mg/ml材料。
制造用于根据本发明所述应用的组合物的范例方法，可在上文已述的DE 10 2008 008 071.3中找到，其内容明确通过引用结合在此。
根据本发明所述的一个优选的实施方式设计为，将例如活的哺乳动物细胞，特别是人类的活细胞，以及药理学试剂，生物效应试剂，或者其中的一种或多种或其混合物，与所述组合物/材料共同应用。
此处，哺乳动物细胞指任何从哺乳动物导出或源自哺乳动物的细胞，其中特别要提到人类和动物的细胞。这些细胞能够例如选自无肌肉骨架细胞，特别是软骨细胞、骨细胞、纤维软骨细胞、以及调节新陈代谢的腺细胞、岛细胞(Inselzellen)、生成褪黑素的细胞、前体细胞以及干细胞、特别是间充质干细胞，因此就是那些对组合物的各种使用或各种注入位置来说适合的和所期望的细胞。这些细胞能够在组合物或聚合的水凝胶形成材料中存活，并且在吸收材料的同时发展新的组织。
根据本发明所述的应用还适合用于防止疗法中的新血管形成，所述疗法目的是原位生产激素，如胰岛素、甲状腺素或褪黑素。如果将产生这些或其它激素的细胞通过所述组合物或材料引入患者体内的治疗位置，它们产生各种激素并且将其释放到环境中，而同时抑制新血管形成。
可以理解，根据本发明所述的应用也能够与生物或药物活性物质共同起作用。“生物活性物质或起生物学效果的物质”和“药物活性物质或起药物效果的物质”在此应当表示每一种天然的或合成的物质，该物质要么对细胞或组织能够有生物或药物的影响，要么能够在细胞上或细胞内进行反应。与此同时，这些影响能够限制在特定的细胞和特定的条件下，而所述物质并不失去其生物或药物活性含义。与此同时，已有的可用物质的化学结构并不局限于特定(化合物)类，而能够包含任何天然和合成的物质，所述物质通过其天然性质和/或以其改性形式对生物细胞产生任意影响。
因此特别优选的是，使用例如抗生素、消炎药、新陈代谢激素、软骨保护剂、基因治疗剂、生长激素或分化和/或调节因子、免疫抑制剂、刺激免疫的物质、一般的肽、蛋白质、核酸、有机活性物质、透明质酸、诱导细胞凋亡的活性物质、受体激动剂和受体拮抗剂、或它们的混合物，作为生物或药物活性或效应物质。此外，可以使用胞外基质的蛋白质、细胞表面的蛋白质、以及一般的多糖、脂类、抗体、生长因子、糖、凝集素、碳水组合物、细胞因子、DNA、RNA、siRNA、适配体、以及对结合和性能重要的片段、以及所谓的疾病修饰骨关节炎药剂，或上述物质的混合物。在此，全部物质能够被合成制造或由天然得到，或来自重组的源。“疾病修饰骨关节炎药剂”(DMOA)在此指一系列物质，其目前作为药物使用，特别是用于关节炎——其中也包括其它自身免疫疾病——以缓解疼痛和发炎，而其严格的起效机理至今尚未完全明确。大多数这种物质含有葡糖胺和硫酸软骨素的混合物。
在根据本发明所述应用的一个实施方式中特别优选生物效应物质是透明质酸，并且其在材料中的最终浓度为约1至约10mg/ml材料，特别是约4mg/ml材料。
其它实例包括但不限于下列合成的或天然的或由其重组的源：生长激素，包括人类生长激素和重组生长激素(rhGH)、牛生长激素、猪生长激素；生长激素释放激素；干扰素，包括干扰素-α、-β和-γ；白介素-1；白介素-2；胰岛素；类胰岛素生长因子，包括IGF-1；肝素；红细胞生成素；促生长素抑制素；促生长素；蛋白酶抑制剂；促皮质素；前列腺素；以及这些化合物的类似物、片段、模拟物或聚乙二醇(PEG)修饰的衍生物；或它们的组合。可以理解，一般说来，所有目前使用原位从载体/基体中释放出(药)物的疾病疗法领域对本发明的应用来讲都是可行的，而使用的(药)物或是使用的细胞依赖于当时的治疗情况，这对于专业技术人员而言每次都需要明确。
在根据本发明所述应用的一个实施方式中优选的是，将血清白蛋白或血清蛋白用选自下列基团中的基团功能化：马来酰亚胺-、乙烯基磺基-、丙烯酸酯-、烷基卤化物-、1-氮杂环丙烯(Azirin)-、吡啶基-、硫代硝基苯甲酸基团或芳基化基团。
“功能化的”或功能化是指现有的每个——完成的——过程，在该过程中向聚合物——例如通过向聚合物添加基团——提供其通常没有的功能。
通过用马来酰亚胺基团对聚合物功能化，可以在将其引入所述组合物/材料中时保证聚合物良好的交联以及同时保证细胞的生存能力或物质的生物功能性。在某些情况下，待引入组合物的细胞或物质通过将与细胞/物质交联的功能化聚合物在组合物中进行分散而引入。
如上文所述，本发明还涉及所述组合物或材料在植入物覆层和表面改性方面的应用，该植入物由与随后由所述组合物聚合而成的材料不同的材料制成。
这种覆层或改性提供了对由其它不具可比的兼容性的材料制成的植入物进行涂覆的可能性，以使这些通常促进内皮细胞增殖且由此促进血管生成的植入物成为非血管生成的。与此同时，对每个植入物加以考虑，特别是那些进而本身基于水凝胶，但不基于所述组合物的植入物。这在下面的情况下更加特别有利，即有可能发生直接的化学成键化学，正如将应用于聚合的材料那些。这允许在植入物材料上有一层薄材料层的共价连接。
如上文所述，本发明还涉及所述组合物或聚合的水凝胶形成材料的应用，用于治疗或预防与血管生成有关的疾病。
这种措施的优点是，所述疾病能够通过根据本发明所述的应用，通过抑制血管生成，得到减轻或甚至预防。
一份与血管生成有关的疾病的列表可在例如Carmeliet，″Angiogenesisin health and disease″，Nature Medicine(2003)，Vol.9Nr.6：653-660中找到，特别是在该文中列出的表1中找到，其中，列出了以过度血管生成为特征的疾病，例如包括：癌症、某些传染病、自身免疫疾病、迪格奥尔格综合征、动脉硬化、肥胖症、银屑病、卡波济肉瘤、糖尿病视网膜病变、原发性肺高血压、支气管哮喘、腹膜粘连、子宫内膜异位症、关节炎、滑膜炎、骨赘形成、骨髓炎。
其它的优点由描述和附图给出。
可以理解，在不脱离本发明的范围的情况下，目前所述及下文即将叙述的特征不仅能够应用于各个给出的组合，也还能应用于其它的组合或单独情况。
本发明的实施例在附图中示出，并在接下来的描述中详细解释。其中：
图1示出了在一种基于血清白蛋白的聚合的水凝胶形成材料(下文中也称之为“白蛋白凝胶”(Albumingel或Albugel))上的内皮细胞粘连试验的结果：在白蛋白凝胶上的内皮细胞培养的示意图(A)；1天和5天之后在白蛋白凝胶上的内皮细胞的数量的定量图(B)；用鬼笔毒环肽染色的不同培养条件下的内皮细胞(C)；
图2示出了在白蛋白凝胶上的内皮细胞的活力的证据：在白蛋白凝胶上的内皮细胞的定量图(A)；白蛋白凝胶的提取物对内皮细胞的细胞毒害效果的研究图(B)；用钙黄绿素和DAPI染色的不同培养条件下的内皮细胞(C，E，G，I)和使用DiI-Ac-LDL的照片(D，F，H，J)；
图3示出了对在白蛋白凝胶上的内皮细胞增殖的研究结果：用DAPI和BrdU染色的不同培养条件下的内皮细胞(A-D)；在白蛋白凝胶上的内皮细胞增殖的定量图(E)；
图4示出了对穿过白蛋白凝胶的内皮细胞侵入的研究结果：装置示意图(A)；通过白蛋白凝胶移动的内皮细胞的定量图(B)；趋化性指数分析图(C)；化学侵入指数分析图(D)；孟加拉玫瑰红染色的在Transwell过滤器下腔面上的内皮细胞(E-L)；
图5示出了在白蛋白凝胶中的尿囊绒膜血管生长的研究结果：胚胎内(in ovo)植入物的照片(A，B)；带有白蛋白凝胶的外植尿囊绒膜的照片(C，D)；HE(苏木精-曙红)染色的带有白蛋白凝胶的尿囊绒膜(E，F)；接骨木花黑质凝集素染色的带有白蛋白凝胶的尿囊绒膜(G，H)；以及G和H的相差照片(I，J)；
图6示出了Skid/nu小鼠背上皮下白蛋白凝胶的植入试验结果：带有周边小鼠组织的白蛋白凝胶的HE染色(A)；带有周边小鼠组织的白蛋白凝胶的接骨木花黑质凝集素染色和DAPI染色(B)；以及
图7示出了在白蛋白凝胶上的无限增殖化的内皮细胞的粘连试验的结果：用鬼笔毒环肽染色的不同培养条件下的内皮细胞(A-F)；1天之后白蛋白凝胶上的内皮细胞数量的定量图(G)。
实施例：
A)制备由马来酰亚胺修饰的血清白蛋白
将250mg人、家兔或羊的血清白蛋白(Sigma-Aldrich)溶于5ml 1M的硼酸钠(pH 8.2)。向其加入75μl的在PBS/硼酸钠(pH 8.2)(1∶1)中的260mM的N-马来酰基-β-丙氨酸(Sigma-Aldrich Kat.-Nr 63285)溶液，并在室温培养90min。将106mg的3-马来酰亚胺-丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMP，Obiter Research，Urbana，IL，USA)溶于950μl二甲基甲酰胺(DMF)中。将不能溶解的物质通过离心法分离。将500μl上层清液加入白蛋白溶液中，随后将其在室温培养60min。随后向其中加入500μl 3M乙酸钠(pH 4.7)，并且在冰上对1升PBS渗析三次。随后将渗析液通过超滤(YM-3膜，Millipore)浓缩至体积为3.5ml，过滤消毒并且在-80℃存放。
如此功能化后的血清白蛋白/蛋白能够通过加入SH-交联剂进行聚合。在此，特别考虑在两端都带有SH基团的交联剂双硫代聚乙二醇。除了双硫代-PEG，通常考虑作为交联剂的物质为带有SH-基团的物质，特别是聚合物，例如二硫代-PEG或SH修饰的葡聚糖、SH修饰的聚乙烯醇、SH修饰的聚乙烯吡咯烷酮等等。
双硫代-PEG是商业可得的，使用摩尔质量为10000 g/mol的交联剂。如果摩尔质量小于此值，它将减少凝胶形成，在更高的质量时，凝胶过快凝胶化，不能够形成充分的物质混合。当交联剂的SH基团和白蛋白中的马来酰亚胺基团具有相同摩尔浓度时，凝胶形成达到最优。使用在凝胶中最终浓度各自为3mM的马来酰亚胺和SH基团。此外，羊白蛋白凝胶包含4mg/ml在聚合前混合入其中并且因此从物理上讲牢固地固定存在的高分子透明质酸(在下文和附图中也用“HS”表示/缩写)。但是作为白蛋白来源，可使用多种动物和人的血清白蛋白。
B)用于证明白蛋白凝胶的非血管生成性质的试验
1.作为用于人内皮细胞的基材的白蛋白凝胶的测试
a)为了研究白蛋白凝胶对内皮细胞(“EZ”)的效果，传代3至9的初级人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(PromoCel，Heidelbergl)在凝胶中培养，随后研究细胞的粘连、活力和增殖。为此，在48孔板上每个孔中聚合100μl羊白蛋白凝胶，并将处于300μl内皮细胞培养基中的1.5x104HUVEC在凝胶上培养24小时或5天(试验装置见图1A)。为了对照，在一个明胶化的(0.5％)48孔板上培养相同数量的细胞，并且制备含附加0.5％明胶(凝胶中的最终浓度)的白蛋白凝胶。同时，在10mg/ml的MatrigelTM上培养所述细胞，MatrigelTM是一种几乎尚未定义的来自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤的基底膜提取物，其在基础研究中作为基底膜等价物。
白蛋白凝胶的制备(在下文和附图中缩写/标记为“AG”)：
  含透明质酸的羊血清白蛋白凝胶
  内皮细胞培养基(不含FCS)混合有   Xx53μl
  马来酰亚胺修饰的羊血清白蛋白以及   Xx7μl
  Visiol (20mg/ml)   Xx20μl
  预先存在于板上的双硫代-PEG，且与凝胶材料混合   Xx20μl
  最终体积   Xx100μl
明胶层和MatrigelTM：
为制备明胶层，将2％明胶溶液以1∶4与PBS(磷酸盐缓冲盐水)混合，将装有溶液的板培养30min。随后将板用PBS洗涤一次。MatrigelTM(20mg/ml；BD Biosciences，San Jose，USA)以1∶2与不含FCS(胎牛血清)的内皮细胞培养基混合，在板中在37℃聚合20min。
所述细胞在不同的培养条件下培养1天或5天。对内皮细胞作如下处理以进行评价，：
在1天之后和5天之后，用2.5％的戊二醛/PBS固定HUVEC，渗入0.2％Triton-X100/PBS，随后用DAPI(4′，-二脒基-2-苯基吲哚)和鬼笔毒环肽Oregon Green染色，以确定细胞粘连。
或者：利用“5-溴-2′-脱氧-尿苷细胞标记和检测试剂盒I(5-Bromo-2′-deoxy-Uridin Cell Labeling and Detetion Kit I)”(Roche，Mannheim)使1天后增殖的HUVEC可见。
或者：在1天和5天之后用DiI-Ac-LDL(1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基-靛炭花青苷高氯酸乙酰化的低密度脂蛋白)处理细胞，随后用钙黄绿素和DAPI染色，以探测活的和死的HUVEC。
b)附加研究白蛋白凝胶提取物对于内皮细胞的细胞毒性作用。
制备提取物：
将200μl白蛋白凝胶(含有和不含明胶添加物)在Eppendorf管中聚合，并且在37℃用1ml内皮细胞培养基振动培养24小时。为了对照，相应地制备MatrigelTM的提取物。内皮细胞用不同的提取物并用DMSO(二甲亚砜)作为死亡对照培养24小时。对比于仅用培养基培养的细胞，细胞的活力通过Alamar Blue试验测定。
c)结果：
如图1可看到的，在白蛋白凝胶和MatrigelTM上培养1天后的细胞数明显低于明胶层的细胞数。5天培养之后，凝胶上的细胞数下降，与此相反，在明胶中继续增加。在不同培养条件下细胞的形态可以如图1C-J所示。内皮细胞在白蛋白凝胶上形成聚集体且不能够粘附在凝胶上，而内皮细胞在明胶上蔓延并在MatrigelTM上形成典型的“管”。此结果证明，内皮细胞不能粘附在白蛋白凝胶上，并且例如在更换培养基时从凝胶上脱落。
内皮细胞的活力如图2A所示，且定性地在图2C、E、G和I中示出。在5天之后，在明胶层上也几乎检测不到死亡细胞，并且5天之后在MatrigelTM上也检测到少于40％的死亡细胞，而白蛋白凝胶上的死亡内皮细胞数升高至高于60％。反之，在所有培养条件下在DiI-Ac-LDL情况下均得到活细胞(见图2D、F、H、J)，因而内皮细胞的功能保持不变。白蛋白凝胶的提取物对内皮细胞不显示附加的细胞毒性效果(图2，B)。
如图3中(A-D定性，E定量)显示的，在白蛋白凝胶上增殖的内皮细胞与在明胶层上相比，只有很少的量。
向白蛋白凝胶中加入公知其促血管生成和促粘附性能的明胶，对内皮细胞不显示正面影响。
2.作为人内皮细胞基材的白蛋白凝胶的试验
为了排除观察到的效果是由透明质酸(“HS”)导致的，进一步用不含透明质酸的家兔白蛋白凝胶进行试验。
a)实施：
将无限增殖化的人脐静脉内皮细胞(HUVEC hTERT)用于培养。
将在300μl内皮细胞培养基中的1.5x104HUVEC，在0.5％明胶层上、100μl MatrigelTM(10mg/ml)上或100μl纯白蛋白凝胶上在48孔板中培养。作为进一步的对照，制备含附加0.5％明胶(最终浓度)的对照试样。
白蛋白凝胶的制备：
  家兔血清白蛋白凝胶
  内皮细胞培养基(不含FCS)混合有   Xx73μl
  马来酰亚胺修饰的羊血清白蛋白以及   Xx7μl
  预先存在于板上的双硫代-PEG，且与凝胶材料混合   Xx20μl
  最终体积   Xx100μl
明胶层和MatrigelTM：
为制备明胶层，将2％明胶溶液以1∶4与PBS(磷酸盐缓冲盐水)混合，并将装有所述混合液的板培养30min。随后将板用PBS洗涤一次。
MatrigelTM(20mg/ml)以1∶2与不含FCS(胎牛血清)的内皮细胞培养基混合，在板中在37℃聚合30min。所述细胞在不同的培养条件下培养1天。
对内皮细胞作如下处理以进行评价，：
在1天之后，用2.5％的戊二醛/PBS固定HUVEC，渗入0.2％Triton-X100/PBS，随后用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)和鬼笔毒环肽OregonGreen染色，以确定细胞粘连。
b)结果：
如图7G可知，在白蛋白凝胶和MatrigelTM上培养1天后的细胞数明显低于明胶层的细胞数。在不同培养条件下细胞的形态可以由图7A-H所示。内皮细胞在明胶上蔓延并在MatrigelTM上形成典型的“管”。在白蛋白凝胶上内皮细胞形成聚集体(图7C和E)，或者形成一种球状结构(图7D和F)。
3.内皮细胞通过白蛋白凝胶的侵入
a)将内皮细胞通过Transwell过滤器上的白蛋白凝胶的侵入与通过MatrigelTM的侵入及通过未涂层的过滤器的迁移进行对比。图4A可以示出所述试验设备的示意图。
孔尺寸为8μm的Transwell过滤器用100μl含有透明质酸的白蛋白凝胶、100μl含有0.5％明胶的白蛋白酸和100μl MatrigelTM(5mg/ml)涂覆。为了确定迁移，使用未涂覆的Transwell过滤器。
每次将在200μl内皮细胞培养基中的3x105Hoechst 33258-标记的HUVEC通过过滤器。细胞沉淀2hr之后，将含有和不含40ng/ml VEGF(血管内皮生长因子)的600μl内皮细胞培养基移液至下方的小室中。24小时后，将过滤器上腔面的细胞洗去，固定和数出过滤器下腔面的细胞。也可选择用孟加拉玫瑰红对细胞染色。
b)结果：
Transwell过滤器下腔面上的内皮细胞的数量在图4B中示出，用孟加拉玫瑰红染色的内皮细胞在图4E-L中示出。从过滤器下腔面上的细胞数的平均值，计算趋化性指数(见图4C)，该指数说明了VEGF诱导的迁移或侵入与无VEGF诱导的迁移或侵入的比率，并计算化学侵入指数(见图4D)，该指数说明了移动通过凝胶的细胞和迁移的细胞的比率。对所有层来说，趋化性指数大致相同，因此VEGF的诱导是可比的。但在两种白蛋白凝胶中化学侵入指数明显低于MatrigelTM的化学侵入指数，这证明，仅有少量内皮细胞能够移动通过白蛋白凝胶。
4.尿囊绒膜的血管在白蛋白凝胶中的生长：
a)实施
在Rasse Hissex Braun的蛋中，在胚胎日龄为3时在蛋壳中嵌入一个窗口。在胚胎日龄为8时将200μl含有透明质酸的白蛋白凝胶以及200μl含有透明质酸和0.5％明胶的白蛋白凝胶转移到显著血管化的尿囊绒膜(CAM)上。将蛋进一步培养至胚胎日龄为13。所述CAM在4％PFA(多聚甲醛)/PBS中在室温在胚胎内固定，随后将其外植并在4℃再固定1天，在30％的蔗糖/蒸馏水中脱水2天，并且在Tissue Tek(O.C.T.Compound，Sakura；Torrance Canada)中冻结。7μm厚的冷冻切片用HE(苏木精-曙红)染色，5μm厚的冷冻切片用接骨木花黑质凝集素染色。
b)结果：
CAM的血管不在植入的白蛋白凝胶上生长(图5A-D)。用HE染色(图5E和F)的切片和用接骨木花黑质凝集素(图5G和H)染色的切片均未能发现血管的生长，因为CAM中的血管应该能借助这两种染色方法被观测到。这个结果证明，白蛋白凝胶对CAM的血管没有任何血管生成方面的影响。
5.Scid/nu小鼠背上白蛋白凝胶的植入
a)基于人血清白蛋白的白蛋白凝胶用人椎间盘细胞接种(besiedelt)并且注射入Scid/nu小鼠的背部。植入两周之后，将白蛋白凝胶重新外植，并对经HE染色后外植白蛋白凝胶切片进行研究。此外，利用免疫组织化学染色对血管探测人von Willebrand因子。
b)结果
通过HE染色，既未在小鼠组织周围也未在植入物中发现血管(图6A)，植入物中的人椎间盘细胞的细胞核用苏木精染色。含有抗人von Willebrand因子的抗体的血管的特殊染色证明，在周围的组织中存在血管，不过并不生长入白蛋白凝胶中(图6B)。在植入物中，仅有用DAPI染色的人椎间盘细胞是可分辨的。
总结上述试验能够证明，在白蛋白凝胶上的内皮细胞几乎不粘连或增殖。除此之外还证明，在白蛋白凝胶上的内皮细胞产生凋亡，但并不是因为白蛋白凝胶的毒性，而更多是因为缺少对存活很重要的细胞粘连。通过加入趋化性的引诱剂VEGF，内皮细胞在白蛋白凝胶中的移动将不发生，而且鸡蛋-尿囊绒膜的血管也不移动到白蛋白凝胶中。用白蛋白凝胶对小鼠进行的体内试验证明，血管没有移入白蛋白凝胶。
因此这些非限制的性质为内皮细胞提供了如下可能，即将白蛋白凝胶作为基体/植入物用于抑制和预防血管生成和内皮细胞的粘连，特别是在医学的植入领域，例如对硬化症的治疗，以及再生医疗，例如对患病和/或缺损的软骨组织、椎间盘组织和角膜组织进行治疗。

Claims (10)

1.一种生物相容性组合物用于抑制和/或预防血管生成或内皮细胞增殖的应用，所述组合物可聚合为水凝胶形成材料并且所述组合物基于亲水性聚合物，其特征在于：所述亲水性聚合物是可交联的血清白蛋白或可交联的血清蛋白。
2.根据权利要求所述的应用，其特征在于：所述组合物具有下述中的至少一种：哺乳动物细胞、药理学试剂、生物效应试剂，或其中的一项或多项或混合物。
3.根据前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于：所述血清白蛋白或血清蛋白通过选自马来酰亚胺-、乙烯基磺基-、丙烯酸酯-、烷基卤化物-、1-氮杂环丙烯-、吡啶基-、硫代硝基苯甲酸基团、或芳基化基团的基团官能化。
4.根据前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于：所述血清白蛋白和血清蛋白是人血清白蛋白和人血清蛋白。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的应用，其特征在于，所述起药理学作用的试剂选自下述中的至少一种：抗生素、消炎药、新陈代谢激素、软骨保护剂、基因治疗剂、生长激素、分化或调节因子、免疫抑制剂、刺激免疫的物质、DMOA、核酸、诱导细胞凋亡的活性物质、粘连调节活性物质、受体激动剂和受体拮抗剂、或它们的混合物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于：所述材料中的白蛋白浓度为约5至约15mg/ml材料，特别为约10mg/ml材料。
7.根据前述权利要求中任一项所述的应用，其特征在于：所述组合物以可注入的形式使用。
8.一种聚合的水凝胶形成材料用于抑制和/或预防血管生成或内皮细胞增殖的应用，所述材料通过对基于血清白蛋白或血清蛋白的组合物的聚合获得。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将所述材料作为植入物安置。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物或根据权利要求8所述的材料的应用，其特征在于，所述应用用作植入物的表面层。
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