WO2011024550A1 - 口腔粘膜由来細胞を利用した誘導多能性幹細胞の効率的な製造方法 - Google Patents

口腔粘膜由来細胞を利用した誘導多能性幹細胞の効率的な製造方法 Download PDF

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博文 矢谷
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing induced pluripotent stem cells with high establishment efficiency. More specifically, the present invention relates to a method for producing induced pluripotent stem cells with high establishment efficiency by utilizing somatic cells derived from oral mucosa. Furthermore, the present invention relates to induced pluripotent stem cells produced by the production method.
  • IPS cells can be prepared from the somatic cells of the person, do not cause immune rejection, and have few ethical problems.
  • skin fibroblasts are mainly used to produce iPS cells.
  • liver and stomach cells see Non-Patent Document 2
  • peripheral blood see Non-Patent Document 3
  • extracted wisdom teeth It has been reported that iPS cells can also be produced from cells of wisdom wisdom.
  • the somatic cells used for conventional iPS cell production have a problem that the efficiency of iPS cell establishment is low and they cannot be a stable source of iPS cells.
  • the somatic cells used for the production of conventional iPS cells are accompanied by a surgical attack on the living body, it is not desirable from the viewpoint of burden on the patient.
  • An object of the present invention is to provide a technique for producing iPS cells with low burden on a patient and high establishment efficiency.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above-mentioned problems.
  • the oral mucosa-derived cells that can be collected with less burden on the patient are selected from various somatic cells.
  • the establishment efficiency was remarkably increased and iPS cells could be produced efficiently.
  • the present invention has been completed by further studies based on this finding.
  • the present invention provides the following aspects of the invention.
  • Item 1 A method for producing induced pluripotent stem cells, comprising a step of introducing a reprogramming factor capable of inducing somatic cells into pluripotent stem cells to somatic cells derived from oral mucosa.
  • Item 2. The production method according to Item 1, wherein the somatic cells derived from the oral mucosa are fibroblasts derived from the oral mucosa.
  • Item 3. Item 2. The production method according to Item 1, wherein the somatic cells derived from the oral mucosa are fibroblasts derived from gingiva.
  • the production method according to Item 1, wherein the reprogramming factor capable of inducing somatic cells into pluripotent stem cells comprises an Oct family gene, a Sox family gene, and a klf family gene.
  • the production method according to Item 4, wherein the reprogramming factor capable of inducing somatic cells into pluripotent stem cells further comprises a Myc family gene.
  • Item 6. An induced pluripotent stem cell obtained by introducing a reprogramming factor capable of inducing a somatic cell into a pluripotent stem cell to a somatic cell derived from the oral mucosa.
  • Item 7. The induced pluripotent stem cell according to Item 6, wherein the somatic cell derived from the oral mucosa is a gingival-derived fibroblast.
  • Item 9. Item 7.
  • the induced pluripotent stem cell according to Item 6, wherein the reprogramming factor capable of inducing a cell into a pluripotent stem cell comprises an Oct family gene, a Sox family gene, and a klf family gene.
  • Item 10. Item 10.
  • Item 11. Item 11. A cell preparation for regenerative medicine, comprising the induced pluripotent stem cell according to any one of Items 6 to 10.
  • somatic cells derived from the oral mucosa as cells used for iPS cell induction, iPS cell establishment efficiency can be improved, and iPS cells can be established in a shorter time than before. It becomes possible.
  • a gingival tissue For collection of cells from the oral mucosa, it is possible to use a gingival tissue to be discarded generated by gingival resection during general dental treatment such as tooth extraction, periodontal treatment or implant treatment.
  • the technology to establish iPS cells using tissues to be disposed of in the course of treatment is expected not only to contribute to tissue regenerative medicine that is eagerly desired in the medical and dental fields, but also to establish iPS cells that can be established in a minimally invasive manner. It can facilitate banking, easily use its own iPS cells for future diseases, and contribute to the development of multidisciplinary regenerative medicine.
  • fibroblasts derived from the oral mucosa when fibroblasts derived from the oral mucosa (particularly derived from the gingiva of the oral mucosa) are used as somatic cells derived from the oral mucosa, even after the subculture of the fibroblasts is repeated. Since iPS cells can be induced with high establishment efficiency, the use of fibroblasts derived from the oral mucosa as a cell source induced by iPS cells is particularly suitable for clinical application.
  • Example 1 the results of observing the cell morphology (inoculated on feeder cells) 19 to 26 days after introduction of 4 factors (c-Myc, Oct3 / 4, Sox, Klf4) into mouse gingival fibroblasts Indicates.
  • 4 factors c-Myc, Oct3 / 4, Sox, Klf4
  • 3 factors Oct3 / 4, Sox, Klf4 were introduced into mouse gingival fibroblasts and cloned into 11 types of iPS cell lines and mouse ES cells (seeded on feeder cells). The result of observation of (state) is shown.
  • Example 1 the result of observing the cell morphology of the iPS cell clone strain prepared by introducing 3 factors (Oct3 / 4, Sox, Klf4) into mouse gingival fibroblasts in suspension culture in ES medium for 3 days Indicates.
  • cell morphology was changed 4 days after introduction of 4 factors (c-Myc, Oct3 / 4, Sox, Klf4) to mouse gingival fibroblasts and tail-derived fibroblasts subcultured 6 times.
  • the observation results and the results of crystal violet staining of cells 9 days after introduction of 4 factors (c-Myc, Oct3 / 4, Sox, Klf4) are shown.
  • Example 1 the result of having observed the differentiation ability in ivitro of the iPS cell produced by introduce
  • Example 1 the result of having observed the differentiation ability in invitro of the iPS cell produced by introduce
  • Example 1 the result of observing the differentiation of iPS cells prepared by introducing 3 factors (Oct3 / 4, Sox, Klf4) into mouse gingival fibroblasts into pulsatile cells (cardiomyocytes) in vitro. Show. It has been confirmed that the cells shown in this figure are beating.
  • Example 1 iPS cells prepared by introducing 3 factors (Oct3 / 4, Sox, Klf4) or 4 factors (c-Myc, Oct3 / 4, Sox, Klf4) into mouse gingival fibroblasts (6 times) Subcultured gingival fibroblasts) were cultured for 28 days in a bone differentiation-inducing medium supplemented with dexamethasone, ⁇ -glycerophosphate and ascorbic acid-2-phosphate, and converted into osteoblasts in vitro The result of having observed the differentiation of is shown. The results of double staining of alkaline phosphatase and von Kossa on iPS cells prepared by introducing 3 factors in the upper left and 4 factors in the upper right are shown.
  • Example 1 iPS cells (derived using gingival fibroblasts subcultured 6 times) and mouse ES cells into which three factors (Oct3 / 4, Sox, Klf4) were introduced into mouse gingival fibroblasts, The result of having measured the expression of various marker genes is shown.
  • mGF indicates mouse gingival fibroblasts
  • SNL indicates feeder cells used for culture.
  • Example 1 iPS cells in which factor 4 (c-Myc, Oct3 / 4, Sox, Klf4) was introduced into mouse gingival fibroblasts (induced using gingival fibroblasts subcultured 6 times; transduced mGF ) And mouse ES cells, the results of measuring the expression of various marker genes are shown.
  • mGF indicates mouse gingival fibroblasts
  • SNL indicates feeder cells used for culture.
  • iPS cells (6 passages) in which 3 factors (Oct3 / 4, Sox, Klf4) or 4 factors (c-Myc, Oct3 / 4, Sox, Klf4) were introduced into mouse gingival fibroblasts were used.
  • Example 1 (Induction using gingival fibroblasts) shows the results of alkaline phosphatase staining.
  • iPS cells (6 passages) in which 3 factors (Oct3 / 4, Sox, Klf4) or 4 factors (c-Myc, Oct3 / 4, Sox, Klf4) were introduced into mouse gingival fibroblasts were used.
  • Induction using gingival fibroblasts; methylation of cytosine annin dinucleotide (CpG) in promoter region of Nanog and Oct3 / 4 genes of mGF-iPS-3F or 4F), mouse ES cells, and mouse gingival fibroblasts The result of analyzing the state is shown.
  • Example 12 black circles indicate CpG sites that are methylated, and white circles indicate CpG sites that are not methylated.
  • iPS cells induced using gingival fibroblasts subcultured 6 times
  • 3 factors Oct3 / 4, Sox, Klf4
  • 4 factors c-Myc, Oct3 / 4, Sox, Klf4
  • mice iPS cells (induced using gingival fibroblasts subcultured 6 times) in mice.
  • Example 3 shows the result of histological analysis of teratoma formed after injection into the testicular medulla by hematoxin and eosin staining.
  • Example 1 the result of having evaluated the reprogramming efficiency (induction efficiency to an iPS cell) in a mouse gingival fibroblast (mGF) and a mouse tail origin fibroblast (TTF) is shown.
  • A shows four factors (c-Myc, Oct3) on mouse gingival fibroblasts and mouse tail-derived fibroblasts that had been subcultured 4 times (P4), 7 times (P7), and 10 times (P10).
  • P4 shows four factors (c-Myc, Oct3) on mouse gingival fibroblasts and mouse tail-derived fibroblasts that had been subcultured 4 times (P4), 7 times (P7), and 10 times (P10).
  • Sox, Klf4 shows the results of measuring the establishment efficiency of iPS cells.
  • B shows the results of measuring the growth characteristics of mouse gingival fibroblasts and mouse tail-derived fibroblasts that had been subcultured 5 times.
  • C shows maintenance of telomeres that contribute to cell proliferation in mouse gingival fibroblasts and mouse tail-derived fibroblasts that have been subcultured 4 times (P4), 5 times (P5), and 6 times (P6). Shows the results of measuring the endogenous expression of the Tert gene necessary for real-time RT-PCR.
  • Example 2 the result of having observed the test material at the time of inducing
  • A the photograph at the time of extract
  • B shows the results of observing human gingival fibroblasts and human gingival epithelial cells grown from human gingival tissue pieces.
  • C shows the results of observation of human gingival fibroblasts used for induction into iPS cells.
  • D shows the result of observing iPS cells induced by introducing 4 factors (c-Myc, Oct3 / 4, Sox, Klf4) into human gingival fibroblasts.
  • E and F show the results of observation in a cloned state of iPS cells induced by introducing 4 factors (c-Myc, Oct3 / 4, Sox, Klf4) into human gingival fibroblasts.
  • G shows the result of observing human ES cells.
  • H shows the result of observing iPS cells derived from human skin fibroblasts.
  • I shows the results of alkaline phosphatase staining of iPS cells induced by introducing 4 factors (c-Myc, Oct3 / 4, Sox, Klf4) into human gingival fibroblasts.
  • expression of various marker genes was performed on iPS cells (transduced hGF) and human ES cells prepared by introducing 4 factors (c-Myc, Oct3 / 4, Sox, Klf4) into human gingival fibroblasts. The measurement results are shown.
  • “hGF” indicates human gingival fibroblasts
  • SNL indicates feeder cells used for culture.
  • the method for producing iPS cells of the present invention comprises a step of introducing a reprogramming factor capable of inducing somatic cells into pluripotent stem cells to somatic cells derived from oral mucosa.
  • a reprogramming factor capable of inducing somatic cells into pluripotent stem cells to somatic cells derived from oral mucosa.
  • iPS cells are induced from somatic cells derived from the oral mucosa.
  • the somatic cells used in the present invention may be derived from the oral mucosa, but preferably gingival cells are used in order to induce iPS cells with high establishment efficiency.
  • the somatic cells derived from the oral mucosa used in the present invention may be any of oral mucosal fibroblasts and oral mucosal epithelial cells, preferably gingival fibroblasts and gingival epithelial cells, more preferably Examples include gingival fibroblasts.
  • Oral mucosal fibroblasts, particularly gingival fibroblasts can be induced into iPS cells with high establishment efficiency, and can maintain iPS cell establishment efficiency even after subculture.
  • somatic cells induced by iPS cells have reduced establishment efficiency after being subcultured, but oral mucosal fibroblasts are cultured, for example, to about 7-10 passages. Even after this, iPS cells can be induced with high establishment efficiency, and it is very convenient to use, and it can be said that its clinical practicality is extremely high.
  • somatic cells derived from the oral mucosa are mammals such as humans, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, cows, goats, monkeys, etc. Although it is appropriately selected from those derived from humans, those derived from humans are preferred when used for the purpose of human therapy, development tools for human therapeutics, and the like. Moreover, when using human-derived oral mucosa-derived somatic cells, they may be derived from any of fetuses, infants, children, and adults. When the induced iPS cells are used for human therapeutic purposes, it is desirable to use somatic cells derived from the oral mucosa collected from the patient.
  • the somatic cells derived from the oral mucosa to be used can use gingival tissue to be discarded, which is generated by gingival resection or the like during extraction, periodontal treatment, or implant treatment.
  • Cell collection from the oral mucosa is, for example, the method reported by Nikawa et al. (Nikawa H, Egusa H, Makihira S, Okamoto T, Kurihara H, Shiba H, Amano H, Murayama T, Yatani H, Hamada T. An in vitro Evaluation of the adhesion of Candidaspecies to oral and lung tissue cells. Mycoses.
  • the collected oral mucosal tissue is placed on a tissue culture plate and allowed to stand, and the cells from the oral mucosa are recovered by culturing at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 to recover the cells grown from the tissue. Can be collected.
  • the reprogramming factor for inducing somatic cells derived from the oral mucosa into iPS cells is not particularly limited as long as it can induce somatic cells into pluripotent stem cells, but in general, (1) Oct family Examples include a combination of three factors including a gene or gene product thereof, (2) a Sox family gene or gene product thereof, and (3) a Klf family gene or gene product thereof. Furthermore, from the viewpoint of further improving iPS cell establishment efficiency, in addition to the above three factors, it is desirable to combine (4) Myc family genes or gene products thereof.
  • DNA methyltransferase inhibitors (5-Azacytidine, 5-Aza-2'-deoxycytidine) and histone deacetylase inhibitors (valproic acid, trichostatin A, suberolanilide / hydrozamic acid, etc.) It is possible to increase the induction efficiency of iPS cells by the above reprogramming factor by using a low molecular compound such as), and it can also be used as a reprogramming factor only by a combination of low molecular weight compounds.
  • a low molecular compound such as
  • Oct family includes Oct3 / 4, Oct1A, Oct-6, etc. These Oct families may be used individually by 1 type, and may be used in combination of 2 or more type. Among these OCT families, Oct3 / 4 is preferably used from the viewpoint of efficient induction into the present iPS cells.
  • the base sequence of Oct3 / 4 is known (NCBI accession Number NM_002701 (human), NM_013633 (Mouse)).
  • the base sequence of the Oct1A gene NCBI accession Number NM_002697 (human), NM_198934 (Mouse)
  • the base sequence of the Oct6 gene NCBI accession Number NM_002699 (human), NM_011141 (Mouse) are also known.
  • the Sox family includes Sox1, Sox2, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17, and Sox18. These Sox families may be used alone or in combination of two or more. Among these Sox families, Sox2 is preferably used from the viewpoint of efficient induction into iPS cells.
  • the base sequence of the Sox2 gene is known (NCBI accession Number NM_003106 (human), NM_011443 (Mouse)).
  • the base sequence of Sox1 gene (NCBI accession Number NM_005986 (human), NM_009233 (Mouse)), the base sequence of Sox3 gene (NCBI accession Number NM_005634 (human), NM_009237 (Mouse)), the base sequence of Sox7 gene (NCBIionaccession Number NM_031439 (human), NM_011446 (Mouse)), Sox15 gene base sequence (NCBI accession Number NM_006942 (human), NM_009235 (Mouse)), Sox17 gene base sequence (NCBI accession Number NM_0022454 (human), NM_011441 (Mouse) ) And the base sequence of the Sox18 gene (NCBI accession Number NM_018419 (human), NM_009236 (Mouse)) are also known.
  • the Klf family includes Klf1, Klf2, Klf4, and Klf5. These Klf families may be used alone or in combination of two or more. Among these Klf families, Klf4 is preferably used from the viewpoint of efficient induction into iPS cells.
  • the base sequence of the Klf-4 gene is known (NCBI accession Number-NM_010637 (human), NM_004235 (Mouse)).
  • nucleotide sequence of the Klf1 gene (NCBI accession Number NM_006563 (human), NM_010635 (Mouse)
  • nucleotide sequence of the Klf2 gene NCBI accession Number NM_016270 (human), NM_008452 (Mouse)
  • nucleotide sequence of the Klf5 gene NCBI accession Number NM_001730 (human), NM_009769 (Mouse)
  • Myc family includes c-Myc, N-Myc, and L-Myc. These Myc families may be used alone or in combination of two or more. Among these Myc families, in the present invention, c-Myc and L-Myc are preferably used, and c-Myc is more preferably used.
  • c-Myc is known as a transcriptional regulator involved in cell differentiation and proliferation (S. Adhikary, M. Elilers, Nat. Rav. Mol. Cell Biol., 6, pp635-645, 2005), The nucleotide sequence is known (NCBINCaccession Number NM_010849 (human), NM_002467 (Mouse)).
  • NCBINCaccession Number NM_005378 human
  • NM_008709 human
  • NM_008506 Mouse
  • the reprogramming factor is commonly present in mammals including humans and can be derived from any mammal, but it is desirable to select it appropriately according to the origin of the somatic cell to be introduced.
  • the reprogramming factor is preferably human-derived.
  • the reprogramming factor may include several (for example, 1 to 10, preferably 1 to 6, more preferably 1 to 4) amino acid sequences of the gene product.
  • 1 to 3, particularly preferably 1 or 2 amino acids are substituted, deleted, and / or inserted, and have a function equivalent to that of a wild-type gene product, or It may be a mutated gene encoding a mutated gene product.
  • the reprogramming factor can be prepared according to a conventional method based on known sequence information.
  • cDNA of a target gene can be prepared by extracting RNA from a mammal-derived cell and cloning according to a conventional method.
  • the reprogramming factor introduced into somatic cells derived from the oral mucosa can be either a gene (nucleic acid molecule) or a gene product (protein) as long as the somatic cells can be induced into pluripotent stem cells. Although it is good, it is preferably a gene (nucleic acid molecule) from the viewpoint of increasing iPS cell establishment efficiency.
  • the introduction of the reprogramming factor into somatic cells derived from the oral mucosa can be carried out according to a known method.
  • the reprogramming factor when the reprogramming factor is a gene, the reprogramming factor can be introduced into a somatic cell derived from the oral mucosa by a method usually used in transfection of animal cells.
  • the method for introducing the reprogramming factor into somatic cells include a method using a vector; a calcium phosphate method; a lipofection method; an electroporation method; a microinjection method and the like.
  • the method using a vector is preferable from the viewpoint of introduction efficiency.
  • a viral vector, a non-viral vector, an artificial virus, or the like can be used as the vector. It is preferably used from the viewpoint of safety.
  • each gene may each be integrated in a different vector, and two or more types of genes may be integrated in one vector.
  • a protein expression vector in which the coding sequence of the reprogramming factor is linked to the coding sequence of 2A peptide can also be used.
  • reprogramming factors used for inducing somatic cells derived from the oral mucosa into iPS cells are not limited to those described above, but are not limited to nucleic acids, but are conventionally known reprogramming factors and newly developed reprogramming factors in the future. Program factors are included.
  • oral mucosa-derived somatic cells into which the above reprogramming factor has been introduced are able to acquire self-proliferation ability and pluripotency, and are undifferentiated, pluripotent and proliferative ability. It is induced by cells having i (iPS cells). Oral mucosa-derived somatic cells into which the reprogramming factor has been introduced are induced into iPS cells by culturing for about 9 to 15 days. According to the present invention, there is an advantage that the period induced by iPS cells after the reprogramming factor introduction treatment is shorter than that of the prior art, and there is also an advantage that iPS cells can be established in a short period of time.
  • iPS cells from somatic cells derived from the oral mucosa that have undergone the reprogramming factor introduction treatment, the presence or absence of cell proliferation ability, iPS cell-specific characteristics, etc. are used as indicators. be able to. Specifically, such iPS cells are selected from cells having proliferative ability, such as cell shape, iPS cell-specific marker genes (eg, Nanog, Eras, Zfp42, endogenous Oct3 / 4, etc.). ) Expression, presence or absence of alkaline phosphatase staining, and presence or absence of teratoma-forming ability in the mouse body.
  • proliferative ability such as cell shape, iPS cell-specific marker genes (eg, Nanog, Eras, Zfp42, endogenous Oct3 / 4, etc.).
  • iPS cell-specific marker genes eg, Nanog, Eras, Zfp42, endogenous Oct3 / 4, etc.
  • the iPS cells thus obtained have the ability to differentiate into various cells such as nerve cells, hepatocytes, smooth muscle cells, osteoblasts, cardiomyocytes as well as self-proliferating ability, epidermal tissue, muscle tissue, Since various tissues such as adipose tissue, nerve tissue, cartilage tissue, bone tissue, intestinal tract-like epithelial tissue can be regenerated, they can be used for various regenerative medical purposes. That is, the iPS cells thus obtained can be used as a cell preparation for regenerative medicine. Furthermore, the iPS cells thus obtained can also be used as a therapeutic drug development tool by evaluating responsiveness to various drugs.
  • Example 1 Production and Evaluation of Mouse iPS Cells
  • iPS cells were induced from mouse gingival fibroblasts or tail-derived fibroblasts, and the properties of the induced iPS cells were further evaluated. It was.
  • MF-start medium Toyobo, Osaka
  • FP medium 10% fetal bovine serum (Sigma, St. Louis, MO), 50 units / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin-containing DMEM (Dulbecco's The culture was continued after changing to a modified Eagle medium without sodium pyruvate (Nacalai Tesque, Kyoto) medium].
  • ES ⁇ Mouse embryonic stem (ES) cell line and feeder cell>
  • a retroviral vector (pMXs-IRES-puro) incorporating mouse c-Myc gene, Oct3 / 4 gene, Sox2 gene or Klf4 gene (cDNA) was purchased from Addgene (Cambridge, MA).
  • a retroviral vector (pMX-GFP) incorporating a green fluorescent protein (GFP) gene was purchased from Cell Biolabs (San Diego, Calif.) And used.
  • Platinum-E packaging cells used for the production of virus particles were those provided by Professor Toshio Kitamura of the University of Tokyo.
  • Each plasmid vector (9 ⁇ g) was mixed with a mixed solution of OPTI-MEMI medium (Invitrogen) and FuGENE-6 reagent (Roche, Basel, Switzerland), and the gene was introduced into Platinum-E cells by the lipofection method. After 24 hours, the culture supernatant containing each virus particle was collected and used for retroviral infection (iPS cell induction) of gingival fibroblasts or tail-derived fibroblasts.
  • OPTI-MEMI medium Invitrogen
  • FuGENE-6 reagent FuGENE-6 reagent
  • IPS cell induction 24 hours before transduction by retrovirus infection, 5 ⁇ 10 5 gingival fibroblasts subcultured 4 to 10 times were seeded on 10-cm culture plates treated with 0.1% gelatin and bFGF (final concentration) 3 ng / ml: Peprotech, London, UK).
  • IPS cell induction was performed using 4 factors (c-Myc, Oct3 / 4, Sox, Klf4) or 3 factors (Oct3 / 4, Sox, Klf4) excluding c-Myc.
  • the virus-containing supernatants of the above 4 factors or 3 factors were mixed so as to finally have an equal volume.
  • the transduced fibroblasts were seeded on SNLP76.7-4 feeder cells (2.6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 ) that had been inactivated by mitomycin C treatment.
  • the concentration of seeded cells is 0.1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 3 cells / cm 2 for induction using 4 factors, and 0.7 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 for induction using 3 factors. It was.
  • the medium was ES medium (containing 15% fetal bovine serum, 2 mM L-Glutamine, 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M nonessential amino acids, 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M 2-mercaptoethanol, 50 U penicillin, and 50 ⁇ g / ml streptomycin DMEM medium), and thereafter the medium was replaced with a fresh one every day.
  • ES medium containing 15% fetal bovine serum, 2 mM L-Glutamine, 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M nonessential amino acids, 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M 2-mercaptoethanol, 50 U penicillin, and 50 ⁇ g / ml streptomycin DMEM medium
  • FIG. 1 and 2 show the results of cell observation when iPS cells were induced from gingival fibroblasts subcultured 6 times by introducing the above 4 or 3 factors.
  • Fig. 1 shows the results of observing cells seeded on feeder cells (4 factors introduced; 19 to 26 days after transduction);
  • Fig. 2 shows that 3 factors were introduced and induced on feeder cells for 35 to 50 days.
  • 11 shows the results of observing 11 cloned iPS cell lines (derived using gingival fibroblasts subcultured 6 times) and mouse ES cells, respectively. From this result, it was clarified that the cells in which the above 4 factors or 3 factors were introduced into gingival fibroblasts showed ES cell-like cell morphology and were induced by iPS cells.
  • IPS cells derived from gingival fibroblasts were collected by trypsinization and collected in ES medium Transferred to a low attachment culture dish. Three days later, the agglutinated cells were seeded on a 0.1-well gelatin-coated 12-well tissue culture plate or 8-well glass chamber slide (Nalge Nunc International, Naperville, IL), and further cultured in ES medium for 3 days. went.
  • the above cells were fixed with 10% phosphate buffered formalin solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) and phosphorous containing 1% bovine serum albumin and 0.1% toriton-X100. Incubation was carried out in acid buffer solution (PBS) for 20 minutes.
  • PBS acid buffer solution
  • mice anti-human ⁇ -smooth muscle actin monoclonal antibody 0.05 mol / L; / clone 1A4, Dako, Glostrup, Denmark
  • rabbit anti-human ⁇ 1-fetoprotein polyclonal antibody 0.05 mol / L; Dako
  • mouse anti-human ⁇ -III tubulin monoclonal antibody 0.5 ⁇ g / ml; clone TU-20, Millipore, Temecula, CA
  • control IgG 0.5 ⁇ g / ml
  • iPS cells derived from gingival fibroblasts were used for fluorescence under the same conditions as above. Immunostaining was performed. The results are shown in FIG. From this result, even iPS cells obtained by introducing 4 factors into cells expressing ⁇ -III tublin (neuronal cells), ⁇ -fetoprotein (hepatocytes), ⁇ -smooth muscle actin (smooth muscle cells) proteins Of three germ layer cells were confirmed.
  • iPS cells in 12-well tissue culture plates iPS cells obtained by introducing factor 3 or factor 4: derived from gingival fibroblasts that were subcultured 6 times
  • 0.1 ⁇ M dexamethasone 10 mM ⁇ -glycerophosphate and 50 ⁇ M ascorbic acid-2-phosphate (Sigma) were added and cultured in a bone differentiation induction medium.
  • Alkaline phosphatase and von Kossa double staining were performed to detect alkaline phosphatase activity, an osteoblast marker, and calcification of extracellular matrix.
  • the results are shown in FIG. From this result, it was also found that the iPS cells prepared above have an alkaline phosphatase activity and have the ability to differentiate into cells (osteoblasts) exhibiting calcification.
  • RNA obtained from mouse gingival fibroblasts or feeder cells used for culturing iPS cells was used for RT-PCR analysis.
  • Total RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany). After DNase I (Ambion, Austin, TX) treatment, cDNA was synthesized from 1 ⁇ g of total RNA using Super Script III reverse transcriptase (Invitogen, Carlsbad, Calif.).
  • the cDNA target was amplified by PCR using Taq DNA polymerase (Promega, Madison, Wis.) According to the recommended method.
  • the PCR primer pairs used are shown in Table 1 below. PCR products were subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining, and visualized under ultraviolet illumination (Dolphin-View Image System: Wealtec, Sparks, NV).
  • the expression of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA was used as an internal control.
  • the result is shown in FIG.
  • the iPS cells produced above were confirmed to be positive for alkaline phosphatase, which is a marker for ES cells.
  • iPS cells iPS cells obtained by introducing factor 3 or factor 4: induced using gingival fibroblasts subcultured 6 times
  • mouse ES cells were suspended for 3 days and then suspended.
  • Cell bodies embryoid bodies
  • genomic DNA was isolated from these cell masses and mouse gingival fibroblasts.
  • CpG cytosine anine dinucleotide
  • mice were bred under conditions free from specific pathogens and allowed to drink and feed freely. After 7-10 weeks, the mice were perfused with PBS, then perfused with a fixed solution containing 1% paraformaldehyde and 1.25% glutaraldehyde, and the teratomas formed in the mouse testis were removed for histological analysis. went. After embedding the sample in paraffin, sections having a thickness of 3 ⁇ m were prepared and stained with hematoxin and eosin (H & E).
  • gingival tissues and tail tissues were collected from the same 10-week-old male male C57BL / 6J mice, and the above Under the same conditions, gingival fibroblasts and tail-derived fibroblasts were obtained.
  • the resulting gingival fibroblasts and tail-derived fibroblasts were treated with FP medium [DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal calf serum (Sigma, St. Louis, MO), 50 units / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin) without sodium pyruvate (Nacalai Tesque, Kyoto) medium].
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% fetal calf serum (Sigma, St. Louis, MO), 50 units / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin
  • IPS cells were induced. Confirmation of induction in iPS cells was performed by alkaline phosphatase staining along with observation of ES cell-like morphology. The reprogramming efficiency to iPS cells was calculated as the ratio (%) of the number of colonies of iPS cells to the number of cells subjected to transformation.
  • FIG. 15A The obtained results are shown in FIG.
  • the right figure of A of FIG. 15 shows the reprogramming efficiency at the time of being induced
  • FP medium 10% fetal calf serum (Sigma, St. Louis, MO), 50 units / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin Containing DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium without sodium pyruvate: Kyoto) medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium without sodium pyruvate: Kyoto
  • Example 2 Production and Evaluation of Human iPS Cells Using the experimental materials and conditions shown below, iPS cells were induced from human gingival fibroblasts, and the properties of the induced iPS cells were further evaluated.
  • ⁇ IPS cells derived from human embryonic stem (ES) cell lines and human skin fibroblasts > Human skin fibroblasts, human embryonic stem (ES) cell line (KhES-1, passage number 35), and iPS cells established from human skin fibroblasts were provided by the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University. It was. Human ES cells were handled according to the guidelines for the use of human ES cells established by the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan. SNL feeder cells used were provided by Dr. Allan Bradley (Sanger Institute, London, UK).
  • ⁇ Retrovirus particle production In introducing the four factors by retroviral infection, a mouse llc6a1 expression lentiviral vector (pLenti6 / UbC / mSlc7a1 vector) was expressed in human gingival fibroblasts and human skin fibroblasts in advance. In this, first, 4 ⁇ 10 6 293FT cells (Invitrogen) were added to 293FT medium [10% fetal calf serum (Sigma, St.
  • Retroviral vectors incorporating human c-Myc gene, Oct3 / 4 gene, Sox2 gene or Klf4 gene (cDNA) were purchased from Addgene (Cambridge, MA). Platinum-E packaging cells used for the production of virus particles were those provided by Professor Toshio Kitamura of the University of Tokyo.
  • Each plasmid vector (9 ⁇ g) was mixed with a mixed solution of OPTI-MEMI medium (Invitrogen) and FuGENE-6 reagent (Roche, Basel, Switzerland), and the gene was introduced into Platinum-E cells by the lipofection method. After 48 hours, the culture supernatant containing each virus particle was collected and used for retroviral infection (iPS cell induction) of gingival fibroblasts or skin-derived fibroblasts.
  • OPTI-MEMI medium Invitrogen
  • FuGENE-6 reagent FuGENE-6 reagent
  • IPS cell induction 24 hours before transduction by retroviral infection, 8 ⁇ 10 5 gingival fibroblasts or human skin fibroblasts were seeded on 10-mm culture plates treated with 0.1% gelatin, and FP medium [10% fetal bovine Serum (Sigma, St. Louis, MO), 50 units / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin-containing DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium without sodium pyruvate: Nacalai Tesque, Kyoto) medium].
  • IPS cell induction using 4 factors was performed.
  • the virus-containing supernatants of the above four factors were mixed in an equal amount.
  • a solution obtained by adding polybrene (final concentration: 4 ⁇ g / ml) to this mixed solution was replaced with the medium of each fibroblast and cultured overnight at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • the culture supernatant was aspirated and removed every day for 5 days from the next day and replaced with fresh FP medium.
  • 5 ⁇ 10 4 fibroblasts were seeded on SNL feeder cells (1.5 ⁇ 10 6 cells) that had been inactivated by mitomycin C treatment and seeded on 10-cm culture plates. .
  • ES cell line On the next day, the medium was replaced with Prime ES medium (ReproCELL), and the medium was replaced with a fresh one once every two days thereafter. Several ES cell-like colonies that emerged 15 to 26 days after transduction were selected and subcultured, and among the cloned colonies, colony cell lines that showed ES cell-like morphology and proliferative ability were selected. iPS cell line.
  • iPS cell-like colonies were formed in the human gingival fibroblasts into which the four factors were introduced (see D in FIG. 16). On the other hand, under these conditions, iPS cell-like colonies were hardly formed in skin fibroblasts into which the four factors had been introduced.
  • five clonal strains were obtained by mechanically peeling and subculturing iPS cell-like colonies derived from human gingival fibroblasts 26 days after transduction (see E and F in FIG. 16). The colonies proliferated and showed the same morphology and proliferation characteristics as human ES cells (see G in FIG. 16) and iPS cells established from human skin fibroblasts (see H in FIG. 16). It was also confirmed that ES cell-like colonies derived from human gingival fibroblasts have a strong activity of alkaline phosphatase, which is a marker for ES cells (see I in FIG. 16).
  • RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

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Abstract

本発明の主な目的は、患者への負担が少なく、しかも高樹立効率で誘導多能性幹細胞を作製する技術を提供することである。 口腔粘膜由来の細胞を選択し、当該細胞に対して多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入することによって、樹立効率が顕著に上昇し、iPS細胞を効率的に製造できる。

Description

口腔粘膜由来細胞を利用した誘導多能性幹細胞の効率的な製造方法
　本発明は、高い樹立効率で誘導多能性幹細胞を製造する方法に関する。より詳細には、本発明は、口腔粘膜由来の体細胞を利用することによって、誘導多能性幹細胞を高樹立効率で製造する方法に関する。更に、本発明は、当該製造方法によって作製された誘導多能性幹細胞に関する。
　腫瘍摘出などにより失われた生体組織に対し、その形態、機能の回復を図るためには、従来の生体材料を用いた置換手法に加え、細胞の移植を基盤とした新たな治療法の開発が望まれている。近年、骨髄由来間葉系幹細胞等の組織幹細胞を用いた再生療法は，骨組織などでは実現可能な段階を迎えつつある（非特許文献１参照）。但し、骨髄由来間葉系幹細胞を得るためには骨髄穿刺が必要であることや，治療に必要な幹細胞数の確保が困難であることから，より安全かつ容易に採取できる幹細胞源が望まれる。
　一方、近年、OCT3/4、KLF4、c-MYC及びSOX2をコードする各々の遺伝子を体細胞に導入することにより、体細胞を初期化して誘導多能性幹(iPS)細胞に誘導する技術が報告され、再生医薬の分野で革新的な技術が提供されている（特許文献１参照）。このiPS細胞の研究の進展はめざましく、その再生医療での応用は国家プロジェクトとして注目を浴びている。
　iPS細胞は、本人の体細胞から作製可能であり、免疫拒絶反応を起こさず、倫理的な問題も少ないため、臨床上の実用化が期待されている。従来、iPS細胞の作製には、主に皮膚の線維芽細胞が用いられているが、肝臓や胃の細胞（非特許文献２参照）、末梢血（非特許文献３参照）、又は抜去智歯（親知らず）の細胞からもiPS細胞を作り出せることが報告されている。しかしながら、従来のiPS細胞の作製に使用された体細胞では、iPS細胞の樹立効率が低く、安定なiPS細胞の供給源にはならないという課題がある。更に、従来のiPS細胞の作製に使用された体細胞では、その採取に生体への外科的侵撃を伴うため、患者への負担の点からも望ましくない。
　このような従来技術を背景として、患者への負担が少なく、しかも高樹立効率でiPS細胞を作製する技術の開発が切望されている。
国際公開第2007/069666号パンフレット
Yamada Y, et al. Injectable tissue-engineered bone using autogenous bone marrow-derived stromal cells for maxillary sinus augmentation: Clinical application report from a 2-6-year follow-up. Tissue Eng Part A 2008; 14: 1699-707. Aoi T et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science 2008; 321: 699-702. Loh YH et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood 2009; in press.
　本発明は、患者への負担が少なく、しかも高樹立効率でiPS細胞を作製する技術を提供することを目的とする。
　本発明者等は、上記課題を解決すべく、鋭意検討を行ったところ、様々な体細胞の中から、患者への負担が少なく採取可能な口腔粘膜由来の細胞を選択し、当該細胞に対して多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入することによって、樹立効率が顕著に上昇し、iPS細胞を効率的に製造できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
 項１．　口腔粘膜由来の体細胞に対して、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入する工程を含む、誘導多能性幹細胞の製造方法。
項２．　口腔粘膜由来の体細胞が、口腔粘膜由来の線維芽細胞である、項１に記載の製造方法。
項３．　口腔粘膜由来の体細胞が、歯肉由来の線維芽細胞である、項１に記載の製造方法。
項４．　体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子が、Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びklfファミリー遺伝子を含む、項１に記載の製造方法。
項５．　体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子が、更にMycファミリー遺伝子を含む、項４に記載の製造方法。
項６．　口腔粘膜由来の体細胞に対して、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入することにより得られる、誘導多能性幹細胞。
項７．　口腔粘膜由来の体細胞が、口腔粘膜由来の線維芽細胞である、項６に記載誘導多能性幹細胞。
項８．　口腔粘膜由来の体細胞が、歯肉由来の線維芽細胞である、項６に記載誘導多能性幹細胞。
項９．　細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子がOctファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びklfファミリー遺伝子を含む、項６に記載の誘導多能性幹細胞。
項１０．　体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子が、更にMycファミリー遺伝子を含む、項９に記載の誘導多能性幹細胞。
項１１．　項６乃至１０のいずれかに記載の誘導多能性幹細胞を含む、再生医療用の細胞製剤。
　本発明によれば、iPS細胞の誘導に使用する細胞として、口腔粘膜由来の体細胞を使用することによって、iPS細胞の樹立効率を高め、従来に比べて短時間でiPS細胞を樹立することが可能になる。
　口腔粘膜から細胞の採取は、抜歯術、歯周治療又はインプラント治療等の一般的な歯科治療の際に歯肉切除術などによって生じる廃棄予定の歯肉組織を用いることが可能である。治療過程で生じる廃棄予定の組織を用いてiPS細胞を樹立する技術は、医科および歯科領域において切望される組織再生医療への貢献が期待されるのみならず、低侵襲で樹立可能なiPS細胞のバンキングを容易にし、将来の疾病に自身のiPS細胞を容易に利用でき，多分野の再生医療の発展に寄与することができる。
　更に、本発明において、口腔粘膜由来の体細胞として、口腔粘膜由来（特に、口腔粘膜の歯肉由来）の線維芽細胞を使用すると、当該線維芽細胞の継代培養を繰り返した後であっても、高樹立効率でiPS細胞に誘導することができるので、iPS細胞に誘導される細胞源として、口腔粘膜由来の線維芽細胞の使用は、特に臨床上の応用に好適である。
実施例１において、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入した19～26日後の細胞形態（フィーダー細胞上に播種された状態）を観察した結果を示す。 実施例１において、3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入し、クローン化した11種類のiPS細胞株およびマウスES細胞の細胞形態（フィーダー細胞上に播種された状態）を観察した結果を示す。 実施例１において、3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入して作製したiPS細胞クローン株を、ES培地で3日間浮遊培養した際の細胞形態を観察した結果を示す。 実施例１において、６回継代培養したマウス歯肉線維芽細胞及び尾部由来線維芽細胞に対して、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）を導入した4日後に細胞形態を観察した結果、及び4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）を導入した9日後の細胞にcrystal violet染色を行った結果を示す。 実施例１において、マウス歯肉線維芽細胞に3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）を導入して作製されたiPS細胞のin vitroにおける分化能を観察した結果を示す。左上にはコントロールIgG（免疫グロブリンG）抗体で免疫染色及びDAPI核染色した結果；左下には抗α1-フェトプロテイン抗体で免疫染色及びDAPI核染色した結果；右上には抗β-IIIチューブリン抗体で免疫染色及びDAPI核染色した結果；右下には抗α-平滑筋アクチン抗体で免疫染色及びDAPI核染色した結果を示す。 実施例１において、マウス歯肉線維芽細胞に4因子（Oct3/4，Sox，Klf4，c-Myc）を導入して作製されたiPS細胞のin vitroにおける分化能を観察した結果を示す。左には抗β-IIIチューブリン抗体で免疫染色及びDAPI核染色した結果；中央には抗α1-フェトプロテイン抗体で免疫染色及びDAPI核染色した結果；右には抗α-平滑筋アクチン抗体で免疫染色及びDAPI核染色した結果を示す。図中、抗α1-フェトプロテイン抗体で免疫染色は緑色を呈し、DAPI核染色は赤色を呈している。 実施例１において、マウス歯肉線維芽細胞に3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）を導入して作製されたiPS細胞のin vitroにおける拍動細胞（心筋細胞）への分化を観察した結果を示す。本図に示す細胞は、拍動していることが確認されている。 実施例１において、マウス歯肉線維芽細胞に3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）又は４因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）を導入して作製されたiPS細胞（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）を、デキサメタゾン、β-グリセロリン酸及びアスコルビン酸-2-リン酸を添加した骨分化誘導培地で28日間培養し、in vitroにおける骨芽細胞への分化を観察した結果を示す。左上には3因子を、右上には4因子を導入して作製されたiPS細胞に対してアルカリフォスファターゼ及びvon Kossa二重染色を行った結果を示す。左下及び右下には、それぞれ右上及び左上に示す染色した細胞の拡大写真像を示す。図中、アルカリフォスファターゼ活性を示す細胞は赤色を呈し、石灰化した細胞外基質は黒色を呈している。 実施例１において、3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入したiPS細胞（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）及びマウスES細胞について、各種マーカー遺伝子の発現を測定した結果を示す。図中、「mGF」はマウス歯肉線維芽細胞を示し、「SNL」は培養に使用したフィーダー細胞を示す。 実施例１において、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入したiPS細胞（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導；transduced mGF）及びマウスES細胞について、各種マーカー遺伝子の発現を測定した結果を示す。図中、「mGF」はマウス歯肉線維芽細胞を示し、「SNL」は培養に使用したフィーダー細胞を示す。 実施例１において、3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）又は4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入したiPS細胞（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）に対して、アルカリフォスファターゼ染色を行った結果を示す。 実施例１において、3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）又は4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入したiPS細胞（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導；mGF-iPS-3F or 4F）、マウスES細胞、及びマウス歯肉線維芽細胞のNanog及びOct3/4遺伝子のプロモータ領域におけるシトシングアニンジヌクレオチド（CpG）のメチル化状態を分析した結果を示す。図１２中、黒丸がメチル化されているCpG部位、白丸がメチル化されていないCpG部位を示す。 実施例１において、3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入したiPS細胞（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）をマウスの精巣髄質に注入した後に、形成されたテラトーマをヘマトキシン及びエオシン染色によって組織学的解析した結果を示す。 実施例１において、４因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をマウス歯肉線維芽細胞に導入したiPS細胞（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）をマウスの精巣髄質に注入した後に、形成されたテラトーマをヘマトキシン及びエオシン染色によって組織学的解析した結果を示す。 実施例１において、マウス歯肉線維芽細胞(mGF)とマウス尾部由来線維芽細胞(TTF)における再プログラミング効率（iPS細胞への誘導効率）を評価した結果を示す。Ａには、４回（Ｐ４）、７回（Ｐ７）及び１０回（Ｐ１０）の継代培養を行ったマウス歯肉線維芽細胞とマウス尾部由来線維芽細胞に、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）を導入した際にiPS細胞の樹立効率を測定した結果を示す。Ｂには、５回の継代培養を行ったマウス歯肉線維芽細胞とマウス尾部由来線維芽細胞の増殖特性を測定した結果を示す。Ｃには、４回（Ｐ４）、５回（Ｐ５）及び６回（Ｐ６）の継代培養を行ったマウス歯肉線維芽細胞とマウス尾部由来線維芽細胞について、細胞増殖に寄与するテロメアの維持に必要なTert遺伝子の内在性発現をReal-time RT-PCRにて測定した結果を示す。 実施例２において、ヒト歯肉線維芽細胞からiPS細胞の誘導を行った際の試験材料及び各段階で得られた細胞を観察した結果を示す。Ａには、試験に供したヒト歯肉組織片を採取した際の写真を示す。Ｂには、ヒト歯肉組織片から増殖させたヒト歯肉線維芽細胞とヒト歯肉上皮細胞を観察した結果を示す。Ｃには、iPS細胞への誘導に使用したヒト歯肉線維芽細胞を観察した結果を示す。Ｄには、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をヒト歯肉線維芽細胞に導入して誘導したiPS細胞を観察した結果を示す。Ｅ及びＦには、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をヒト歯肉線維芽細胞に導入して誘導したiPS細胞をクローン化した状態で観察した結果を示す。Ｇには、ヒトES細胞を観察した結果を示す。Ｈには、ヒト皮膚線維芽細胞から誘導したiPS細胞を観察した結果を示す。Ｉには、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をヒト歯肉線維芽細胞に導入して誘導したiPS細胞に対して、アルカリフォスファターゼ染色を行った結果を示す。 実施例２において、4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）をヒト歯肉線維芽細胞に導入して作成したiPS細胞（transduced hGF）及びヒトES細胞について、各種マーカー遺伝子の発現を測定した結果を示す。図中、「hGF」はヒト歯肉線維芽細胞を示し、「SNL」は培養に使用したフィーダー細胞を示す。
　本発明のiPS細胞の製造方法は、口腔粘膜由来の体細胞に対して、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入する工程を含むことを特徴とする。以下、本発明について、詳述する。
　本発明では、口腔粘膜由来の体細胞から、iPS細胞を誘導する。本発明で使用される体細胞は、口腔粘膜由来であればよいが、高樹立効率でiPS細胞を誘導させるために、好ましくは歯肉細胞が挙げられる。本発明で使用される口腔粘膜由来の体細胞としては、口腔粘膜の線維芽細胞、口腔粘膜の上皮細胞のいずれであってもよいが、好ましくは歯肉線維芽細胞及び歯肉上皮細胞、更に好ましくは歯肉線維芽細胞が挙げられる。口腔粘膜の線維芽細胞、特に歯肉線維芽細胞は、高樹立効率でiPS細胞に誘導可能であると共に、継代培養を行った後でも、iPS細胞の樹立効率を維持させることができる。従来、iPS細胞に誘導する体細胞は、継代培養を行った後には、樹立効率が減少することが知られているが、口腔粘膜の線維芽細胞は、例えば7～10継代程度まで培養した後であっても、高樹立効率でiPS細胞への誘導が可能であり、使用利便性に優れており、臨床上の実用性が極めて高いといえる。
　また、上記口腔粘膜由来の体細胞は、誘導されるiPS細胞の使用目的に応じて、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル等の哺乳動物由来のものから適宜選択されるが、ヒトの治療やヒト治療薬の開発ツール等の目的で使用する場合にはヒト由来のものが好適である。また、ヒト由来の口腔粘膜由来の体細胞を使用する場合、胎児、幼児、小児、及び成人のいずれに由来するものであってもよい。誘導されるiPS細胞をヒトの治療目的で使用する場合には、患者から採取した口腔粘膜由来の体細胞を使用することが望ましい。また、使用する口腔粘膜由来の体細胞は、抜歯術、歯周治療又はインプラント治療等の際に歯肉切除術などによって生じる廃棄予定の歯肉組織を用いることも可能である。口腔粘膜から細胞の採取は、例えば、Nikawaらが報告した方法（Nikawa H, Egusa H, Makihira S, Okamoto T, Kurihara H, Shiba H, Amano H, Murayama T, Yatani H, Hamada T. An in vitro evaluation of the adhesion of Candidaspecies to oral and lung tissue cells. Mycoses. 2006;49(1):14-7.）に従って実施される。即ち、採取した口腔粘膜組織を組織培養プレート上に密着させて静置し、5%CO2存在下、37℃で培養することによって組織から増殖した細胞を回収する方法によって、口腔粘膜から細胞を採取することができる。
　口腔粘膜由来の体細胞をiPS細胞に誘導するための再プログラム因子としては、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能なものである限り特に制限されないが、一般的には、(1)Octファミリー遺伝子又はその遺伝子産物、(2)Soxファミリー遺伝子又はその遺伝子産物、及び(3)Klfファミリー遺伝子又はその遺伝子産物を含む３因子の組合せが例示される。更に、iPS細胞の樹立効率を更に向上させるという観点から、上記３因子に加えて、(4)Mycファミリー遺伝子又はその遺伝子産物を組み合わせることが望ましい。また、細胞の初期化誘導に際して、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（5-Azacytidine、5-Aza-2'-deoxycytidine）やヒストンデアセチラーゼ阻害剤（バルプロ酸、トリコスタチンＡ、スベロイラニリド・ハイドロザミック酸等）等の低分子化合物を用いることで上記再プログラム因子によるiPS細胞への誘導効率を高めることが可能であり、低分子化合物の組み合わせのみで再プログラム因子として使用することもできる。
　Octファミリーとしては、Oct3/4、Oct1A、及びOct 6等が挙げられる。これらのOctファミリーは、1種単独で使用してもよく、また2種以上を組み合わせて使用してもよい。これらのOCTファミリーの中でも、本iPS細胞への効率的な誘導という観点から、Oct3/4が好適に使用される。Oct3/4の塩基配列は、公知（NCBI accession Number NM_002701（human）、NM_013633（Mouse））である。また、Oct1A遺伝子の塩基配列（NCBI accession NumberNM_002697（human）、NM_198934（Mouse））、Oct6遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_002699（human）、NM_011141（Mouse））についても公知である。
　Soxファミリーとしては、Sox1、Sox2、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17、及びSox18が挙げられる。これらのSoxファミリーは、1種単独で使用してもよく、また2種以上を組み合わせて使用してもよい。これらのSoxファミリーの中でも、iPS細胞への効率的な誘導という観点から、Sox2が好適に使用される。Sox2遺伝子の塩基配列は、公知（NCBI accession Number NM_003106（human）、NM_011443（Mouse））である。また、Sox1遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_005986（human）、NM_009233（Mouse））、Sox3遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_005634（human）、NM_009237（Mouse））、Sox7遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_031439（human）、NM_011446（Mouse））、Sox15遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_006942（human）、NM_009235（Mouse））、Sox17遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_0022454（human）、NM_011441（Mouse））、Sox18遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_018419（human）、NM_009236（Mouse））についても公知である。
　Klfファミリーとしては、Klf1、Klf2、Klf4、及びKlf5等が挙げられる。これらのKlfファミリーは、1種単独で使用してもよく、また2種以上を組み合わせて使用してもよい。これらのKlfファミリーの中でも、iPS細胞への効率的な誘導という観点から、Klf4が好適に使用される。Klf 4遺伝子の塩基配列は公知（NCBI accession Number NM_010637（human）、NM_004235（Mouse））である。また、Klf1遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_006563（human）、NM_010635（Mouse））、Klf2遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_016270（human）、NM_008452（Mouse））、及びKlf5遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_001730（human）、NM_009769（Mouse））についても公知である。
　Mycファミリーとしては、c-Myc、N-Myc、及びL-Myc等が挙げられる。これらのMycファミリーは、1種単独で使用してもよく、また2種以上を組み合わせて使用してもよい。これらのMycファミリーの中でも、本発明では、好ましくはc-Myc及びL-Myc、更に好ましくはc-Mycが使用される。c-Mycは、細胞の分化及び増殖に関与する転写制御因子として知られており（S. Adhikary, M. Elilers, Nat. Rav. Mol. Cell Biol., 6, pp635-645, 2005）、その塩基配列は公知（NCBI accession Number NM_010849（human）、NM_002467（Mouse））である。また、N-Myc遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_005378（human）、NM_008709（Mouse））及びL-Myc遺伝子の塩基配列（NCBI accession Number NM_005376（human）、NM_008506（Mouse））についても公知である。なお、本明細書において、NCBIとは、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）の略である。
　上記再プログラム因子は、ヒトを含む哺乳動物において共通して存在しており、任意の哺乳動物由来のものを使用できるが、導入する体細胞の由来に応じて適宜選択することが望ましい。例えば、体細胞としてヒト由来のものを使用する場合であれば、上記再プログラム因子はヒト由来であることが望ましい。また、上記再プログラム因子は、野生型遺伝子又はその遺伝子産物以外に、その遺伝子産物のアミノ酸配列における数個（例えば１～１０個、好ましくは１～６個、更に好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、特に好ましくは１又は２個）のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されており、且つ、野生型の遺伝子産物と同等の機能を有する変異遺伝子産物、又は当該変異遺伝子産物をコードしている変異遺伝子であってもよい。
　本発明において、上記再プログラム因子は、公知の配列情報に基づいて、常法に従って調製することができる。例えば、哺乳動物由来の細胞からRNAを抽出し、常法に従ってクローニングすることにより、目的とする遺伝子のcDNAを調製することができる。
　口腔粘膜由来の体細胞に導入される上記再プログラム因子は、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能であることを限度として、遺伝子（核酸分子）又は遺伝子産物（タンパク質）のいずれであってもよいが、iPS細胞の樹立効率を高めるという観点から、遺伝子（核酸分子）であることが好適である。
　口腔粘膜由来の体細胞への上記再プログラム因子の導入は、公知の方法に従って実施することができる。例えば、上記再プログラム因子が遺伝子の場合には、上記再プログラム因子の口腔粘膜由来の体細胞への導入は、動物細胞のトランスフェクションにおいて通常使用される方法で行うことができる。具体的には、上記再プログラム因子を体細胞へ導入する方法として、ベクターを使用する方法；リン酸カルシウム法；リポフェクション法；エレクトロポレーション法；マイクロインジェクション法等が例示される。これらの中でも、導入効率の点から、ベクターを使用する方法が好ましい。ベクターを使用して上記再プログラム因子を体細胞に導入する場合には、ベクターとして、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、人工ウイルス等を用いることができるが、アデノウイルス及びレトロウイルス等のウイルスベクターが、安全性の観点から好適に使用される。なお、ベクターを使用する場合、上記再プログラム因子は、各遺伝子が各々別のベクターに組み込まれていてもよく、１つのベクターに２種以上の遺伝子が組み込まれていてもよい。更に、ベクターを使用して上記再プログラム因子を体細胞に導入する場合には、上記再プログラム因子のコード配列を２Ａペプチドのコード配列につないだタンパク質発現ベクターを使用することもできる。
　本発明において、口腔粘膜由来の体細胞をiPS細胞に誘導するために使用される再プログラム因子は、前述するものの他、核酸に限らず、従来公知の再プログラム因子及び将来新たに開発される再プログラム因子が包含される。
　斯くして上記再プログラム因子が導入された口腔粘膜由来の体細胞は、細胞が初期化され、自己増殖能と多分化能を獲得することができ、未分化であって多能性及び増殖能を有する細胞（iPS細胞）に誘導される。上記再プログラム因子が導入された口腔粘膜由来の体細胞は、約９～１５日間程度、培養することによって、iPS細胞に誘導される。本発明によれば、上記再プログラム因子の導入処理後にiPS細胞に誘導される期間が、従来技術に比して短いという利点もあり、短期間でiPS細胞を樹立できるという利点もある。
　上記再プログラム因子の導入処理を行った口腔粘膜由来の体細胞の中から、iPS細胞を選択するには、細胞の増殖能の有無、iPS細胞特有の特性を有するか否か等を指標として行うことができる。このようなiPS細胞の選択は、具体的には、増殖能を有する細胞の中から、細胞の形状、iPS細胞に特異的なマーカー遺伝子（例えば、Nanog，Eras，Zfp42，内在性Oct3/4等）の発現の有無、アルカリフォスファターゼの染色性の有無、マウス体内におけるテラトーマ形成能の有無を指標として行うことができる。
　斯くして得られたiPS細胞は、自己増殖能と共に、神経細胞、肝細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、心筋細胞等の各種細胞に分化する能力を備えており、表皮組織、筋組織、脂肪組織、神経組織、軟骨組織、骨組織、腸管様上皮組織等の様々な組織の再生が可能であるので、各種の再生医療目的で使用することができる。即ち、斯くして得られたiPS細胞は、再生医療用の細胞製剤として使用することができる。更に、斯くして得られたiPS細胞は、各種薬物に対する応答性を評価することによって、治療薬の開発ツールとしても使用することもできる。
　以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例１　マウスiPS細胞の作製及び評価
　以下に示す実験材料及び条件で、マウス歯肉線維芽細胞又は尾部由来線維芽細胞からiPS細胞の誘導を行い、更に誘導されたiPS細胞の特性の評価を行った。
＜マウス歯肉線維芽細胞及び尾部由来線維芽細胞の分離培養＞
　10週齡雄C57BL/6Jマウスより口腔粘膜歯肉組織及び尾部組織を採取した。これら組織片をそれぞれ0.1%ゼラチンコート処理した組織培養プレート上に密着させて置き、MF-start培地（Toyobo，大阪）を組織片が覆われる程度に加えて5%CO2存在下、37℃で静置した。組織片から線維芽細胞が十分に生育した時点で組織片を取り除くことにより線維芽細胞を得て、２～３日おきに新しい培地に交換した。細胞が70％コンフルエントに達した時点で継代培養し、培地をFP培地〔10%ウシ胎仔血清（Sigma, St. Louis, MO），50 units/ml penicillin，50 μg/ml streptomycin含有DMEM（Dulbecco's modified Eagle medium without sodium pyruvate: ナカライテスク，京都）培地〕に交換して培養を続けた。
＜マウス胚性幹（ES）細胞株およびフィーダー細胞＞
　マウス胚性幹（ES）細胞株（AB2.2）及びSNLP76.7-4フィーダー細胞は、Dr. Allan Bradley（Sanger Institute，London, UK）より供与されたものを用いた。
＜レトロウイルス粒子産生＞
　マウスc-Myc遺伝子、Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子又はKlf4遺伝子（cDNA）を組み込んだレトロウイルスベクター（pMXs-IRES-puro）はAddgene（Cambridge, MA）から購入した。また、レトロウイルスベクターの導入効率を確認するために，緑色蛍光蛋白質（GFP）遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクター（pMX-GFP）をCell Biolabs（San Diego, CA）から購入し、用いた。ウイルス粒子の産生に用いるPlatinum-Eパッケージング細胞は、東京大学の北村俊雄教授より供与されたものを用いた。
　OPTI-MEMI培地（Invitrogen）とFuGENE 6試薬（Roche, Basel, Switzerland）の混合溶液に各プラスミドベクター（9 μg）を混合し、リポフェクション法によりPlatinum-E細胞に遺伝子導入した。24時間後に各ウイルス粒子を含んだ培養上清を回収し、歯肉線維芽細胞又は尾部由来線維芽細胞のレトロウイルス感染（iPS細胞誘導）に用いた。
＜iPS細胞誘導＞
　レトロウイルス感染による形質導入24時間前に、４～10回継代培養した5×105 個の歯肉線維芽細胞を、0.1%ゼラチンコート処理した10-cm培養プレートに播種し、bFGF（最終濃度3 ng/ml：Peprotech, London, UK）含有FP培地で培養した。4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）又はc-Mycを除いた3因子（Oct3/4，Sox，Klf4）を用いたiPS細胞誘導を実施した。iPS細胞誘導には、上記４因子又は３因子の各ウイルス含有上清を最終的に等量になるよう混合した。GFPを用いた場合には、（c-Myc，）Oct3/4，Sox，Klf4，GFPが（1:）1:1:1:3の比率となるように混合した。この混合液にpolybrene（最終濃度4 μg/ml）及びbFGF（最終濃度10 ng/ml）を添加した溶液を各線維芽細胞の培地と置換し、5%CO2存在下，37℃で一晩培養した。翌日及びその2日後に培養上清を吸引除去し、bFGF（最終濃度3 ng/ml）含有FP培地と交換した。形質導入4日後に、mitomycin C処理により増殖を不活性化したSNLP76.7-4フィーダー細胞上（2.6 x 104個/cm2）に、形質導入を行った線維芽細胞を播種した。播種した細胞の濃度は，4因子を用いた誘導では0.1×103～1×103個/cm2，3因子を用いた誘導では0.7×104～1×104個/cm2を用いた。翌日、培地をES培地（15%ウシ胎児血清，2 mM L-Glutamine，1×10-4 M nonessential amino acids，1×10-4M 2-mercaptoethanol, 50 U penicillin, and 50 μg/ml streptomycin含有DMEM培地）に置換し、以後毎日培地を新鮮なものに交換した。形質導入後（4因子を後板誘導の場合；9～21日間、3因子を用いた誘導の場合；35～50日間）に出現したいくつかのES細胞様の形態のコロニーを選択して継代培養し、クローン化したコロニーの中で特にES細胞様の形態および増殖能を示すコロニー細胞株をiPS細胞株とした。
　上記４因子又は3因子を導入して、６回継代培養した歯肉線維芽細胞からiPS細胞を誘導した際に、細胞観察を行った結果を図１及び２に示す。図１には、フィーダー細胞上に播種した細胞（4因子導入；形質導入19～26日後）を観察した結果；図２には、3因子を導入して35～50日間フィーダー細胞上で誘導し、クローン化した11種類のiPS細胞株（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）及びマウスES細胞を観察した結果を、それぞれ示す。この結果から、歯肉線維芽細胞に上記４因子又は3因子を導入した細胞は、ES細胞様の細胞形態を示し、iPS細胞に誘導されていることが明らかとなった。
　また、3因子を導入して６回継代培養した歯肉線維芽細胞から誘導した9種類のiPS細胞株をES培地で3日間浮遊培養して、細胞形態（embryoid body形成）を観察した。その結果を図３に示す。
＜歯肉および尾部由来線維芽細胞におけるiPS細胞樹立効率の比較＞
　同一の10週齡雄マウス固体の歯肉あるいは尾部から同時に分離培養した歯肉線維芽細胞及び尾部由来線維芽細胞を並行して６回継代培養した。これらの細胞を６ウェル培養プレートに1×104～2×104 cells/wellの濃度で播種し、上記の４因子を用いたiPS細胞誘導を上記と同条件で行った。形質導入後に出現した細胞コロニーをcrystal violet染色にて検出し、ES細胞様コロニー数を比較検討した。
　結果を図４に示す。この結果から、歯肉線維芽細胞を使用した場合には、尾部由来線維芽細胞の場合と比較して、著明に多くのES細胞様コロニーが認められた。以上の結果から、口腔粘膜組織はiPS細胞の樹立を迅速かつ効率的に可能にする細胞源であり、歯肉線維芽細胞から樹立したiPS細胞が今後の再生医学研究に応用でき得ることが示された。
＜歯肉線維芽細胞由来iPS細胞のin vitroにおける分化＞
　歯肉線維芽細胞から誘導したiPS細胞（3因子を導入して得られたiPS細胞：６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）を、トリプシン処理を行って採取し、ES培地を含むlow attachment培養ディッシュに移した。3日後、凝集した細胞を0.1%ゼラチンコート処理した12ウェル組織培養プレート、又は8ウェルのガラス製チャンバースライド（Nalge Nunc International, Naperville, IL）に播種し、更に3日間ES培地中にて培養を行った。
　蛍光免疫細胞染色のため、上記の細胞を10%リン酸緩衝ホルマリン溶液（和光純薬工業（株）、大阪、日本）で固定し、1%ウシ血清アルブミン及び0.1%toriton-X100を含有するリン酸緩衝溶液（PBS）中で20分間インキュベーションを行った。2回の洗浄後、細胞をマウス抗ヒトα-平滑筋アクチンモノクローナル抗体（0.05 mol/L; clone 1A4, Dako, Glostrup, Denmark）、ウサギ抗-ヒトα1-フェトプロテインポリクローナル抗体（0.05 mol/L; Dako）を添加して室温にて30分間インキュベーションを行うか、或いはマウス抗ヒトβ-IIIチューブリンモノクローナル抗体（0.5 μg/ml; clone TU-20, Millipore, Temecula, CA）又はコントロールIgG（0.5 μg/ml; mouse IgG whole molecules: Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, CA）を添加して4℃にて一晩インキュベーションを行った。その後、細胞を洗浄し、Alexa568 ヤギ抗マウス又は抗ウサギIgG（1:500; Molecular Probes, Eugene, OR）のいずれかで、37℃にて30分間インキュベーションを行い、更にDAPI（Roche）核染色を行った。結果を図５に示す。この結果から、上記で作製されたiPS細胞をフィーダー細胞非依存的に培養すると、β-III tublin（神経細胞）、α-fetoprotein（肝細胞）、α-smooth muscle actin（平滑筋細胞）蛋白質を発現する細胞への三胚葉系細胞分化が確認された。
　更に、歯肉線維芽細胞から誘導したiPS細胞（4因子を導入して得られたiPS細胞：６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）を用いて、上記と同条件で蛍光免疫染色を行った。結果を図６に示す。この結果から、4因子を導入して得られたiPS細胞でも、β-III tublin（神経細胞）、α-fetoprotein（肝細胞）、α-smooth muscle actin（平滑筋細胞）蛋白質を発現する細胞への三胚葉系細胞分化が確認された。
　また、上記3因子を導入して得られたiPS細胞コロニー（形質導入から50日目）をフィーダー細胞上に播種してES培地中で5～１０日間培養した結果、拍動する細胞（心筋細胞）への分化が確認された。結果を図７に示す。
　また、骨芽細胞分化誘導のため、12ウェル組織培養プレート中のiPS細胞（3因子又は4因子を導入して得られたiPS細胞：共に6回継代培養した歯肉線維芽細胞から誘導）を、0.1μMデキサメタゾン、10ｍM β-グリセロリン酸及び50μMアスコルビン酸-2-リン酸（Sigma）を添加した骨分化誘導培地中で培養した。骨芽細胞マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性及び細胞外基質の石灰化を検出するために、アルカリフォスファターゼ及びvon Kossa二重染色を行った。結果を図８に示す。この結果から、上記で作製されたiPS細胞が、アルカリフォスファターゼ活性を有し、石灰化を呈する細胞（骨芽細胞）への分化能を有していることも判明した。
＜逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）解析＞
　フィーダー細胞上に播種して3日目のiPS細胞（3因子又は4因子を導入して得られたiPS細胞：６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）、マウスES細胞、マウス歯肉線維芽細胞、又はiPS細胞の培養に使用したフィーダー細胞から得られた全RNAをRT-PCR解析に使用した。全RNAをRNeasy Mini Kit（QIAGEN, Hilden, Germany）を用いて抽出した。DNase I（Ambion, Austin, TX）処理の後、Super Script III逆転写酵素（Invitogen, Carlsbad, CA）を用いて、1μgの全RNAからcDNAを合成した。推奨される方法に従い、Taq DNAポリメラーゼ（Promega, Madison, WI）を用いて、このcDNAターゲットをPCRで増幅した。使用したPCRプライマー対を下記表１に示す。PCR産物を、1.5%アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロミド染色処理を行い、紫外線照明のもとで可視化した（Dolphin-View Image System: Wealtec, Sparks, NV）。グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）mRNAの発現を内部コントロールとして用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られた結果を図９及び１０に示す。この結果から、歯肉線維芽細胞から誘導したiPS細胞は、ES細胞に特異的なマーカー遺伝子（Nanog、ERas、zfp42、内在性Oct3/4）を強く発現していることが確認され、自己増殖能と多分化能を獲得していることが確認された。
＜アルカリフォスファターゼによる染色＞
　３因子又は４因子を導入してそれぞれ50日間又は20日間誘導したiPS細胞クローン株（６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）に対して、アルカリフォスファターゼによる染色を行った。
　この結果を図１１に示す。上記で作製されたiPS細胞は、ES細胞のマーカーとされるアルカリフォスファターゼが陽性を示すことが確認された。
＜DNAメチル化解析＞
　iPS細胞（3因子又は4因子を導入して得られたiPS細胞：６回継代培養した歯肉線維芽細胞を使用して誘導）、及びマウスES細胞をそれぞれ３日間浮遊培養した後、浮遊している細胞塊（embryoid body）を回収し、これらの細胞塊、及びマウス歯肉線維芽細胞からゲノムDNAを単離した。これらのゲノムDNAを使用し、Nanog及びOct3/4遺伝子のプロモータ領域におけるシトシングアニンジヌクレオチド（CpG）のメチル化状態をBisulfite sequencing法により分析した。Nanog及びOct3/4遺伝子のプロモータ領域及びCpG lociに関する情報は、Transcriptional Start Site (DBTSS Ver. 7.0: http://dbtss.hgc.jp/)のデータベースから取得した。バイサルファイト処理は、EpiTect Bisulfite kit（Qiagen）を用いて行った。Bisulfite PCRプライマーは、表２のものを使用した。増幅産物を、pGEM-T Easy Vector (Promega)を用いてサブクローニングを行った。５つのクローンをランダムに選択し、各PCR増幅産物についてSP6フォワード及びリバースプライマーでDNA塩基配列の解析を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　得られた結果を図１２に示す。この結果から、マウス歯肉線維芽細胞において、Nanog及びOct3/4遺伝子のプロモータ領域においてメチル化されているCpGの多くは、3因子又は4因子を導入して得られたiPS細胞では脱メチル化されていることが判明した。また、3因子又は4因子を導入して得られたiPS細胞におけるNanog及びOct3/4遺伝子のプロモータ領域のメチル化パターンは、マウスES細胞と近似していることも確認された。なお、図１２中に示す数値は、各遺伝子の転写開始部位から各CpG部位までの塩基数を示し、灰色領域は非翻訳領域、黒色領域は翻訳領域を示す。
　以上の結果から、3因子又は4因子を導入して得られたiPS細胞では、Nanog及びOct3/4遺伝子のプロモータ領域が脱メチル化されており、ES細胞と同様に、これらの遺伝子の発現が促進された状態にあることが明らかとなった。
＜テラトーマ（teratoma）形成及び組織学的解析＞
　8週齢のSCIDマウス（C.B-17; 日本クレア, 東京, 日本）をジエチルエーテル及び10倍希釈したネンブタール（大日本住友製薬, 大阪, 日本）の腹腔内投与（体重100 g につき0.1 ml）により麻酔した。冷却したハンクス平衡塩液（Hank’s balanced salt solution）(Gibco)にiPS細胞（3因子及び4因子を導入して得られたiPS細胞：３回継代培養）を懸濁した、細胞懸濁液（0.2～0.5×106cells/精巣）20μlを、ハミルトンシリンジを用いてマウスの精巣髄質に注射した。その後、マウスを特定病原体未感染の条件のもと、飲水及び摂食が自由な状態で飼育した。7～10週間後、マウスをPBSで灌流した後、1％パラホルムアルデヒド及び1.25%グルタルアルデヒドを含有する固定溶液で灌流を行い、マウス精巣に形成されたテラトーマを摘出して、組織学的解析を行った。試料をパラフィン包埋した後、3 μmの厚さの切片を作製し、ヘマトキシン及びエオシン（H&E）染色を行った。
　H&E染色の結果を図１３及び１４に示す。この結果から、上記で作製されたiPS細胞を注入したSCIDマウスの精巣髄質中で、表皮組織、筋組織、脂肪組織、神経組織、軟骨組織、及び腸管様上皮組織等の組織像が観察され、上記で作製されたiPS細胞の三胚葉に由来する様々な組織への分化能が確認された。
＜再プログラミング効率の分析＞
　歯肉線維芽細胞と尾部由来線維芽細胞における再プログラミング効率（iPS細胞への誘導効率）を比較するために、同一の10週齡雄C57BL/6Jマウスから、歯肉組織及び尾部組織を採取し、上記と同条件で歯肉線維芽細胞及び尾部由来線維芽細胞を得た。得られた歯肉線維芽細胞及び尾部由来線維芽細胞をFP培地〔10%ウシ胎仔血清（Sigma, St. Louis, MO），50 units/ml penicillin，50 μg/ml streptomycin含有DMEM（Dulbecco's modified Eagle medium without sodium pyruvate: ナカライテスク，京都）培地〕にて継代培養を続けた。
　歯肉線維芽細胞及び尾部由来線維芽細胞について、４、７及び１０回の継代培養を行った後に、上記と同条件で４因子（Oct3/4，Sox，Klf4，c-Myc）を導入してiPS細胞への誘導を行った。iPS細胞に誘導されていることの確認は、ES細胞様形態の観察と共に、アルカリフォスファターゼ染色によって行った。iPS細胞への再プログラミング効率は、形質転換に供した細胞数に対するiPS細胞のコロニー数の割合（％）として算出した。
　得られた結果を図１５のＡに示す。図１５のＡの左の写真は、各細胞に対して４因子を導入してiPS細胞に誘導した後に、アルカリフォスファターゼ染色を行った結果を示す。また、図１５のＡの右の図は、４、７及び１０回の継代培養後の各細胞を用いてiPS細胞に誘導した場合の再プログラミング効率を示す。この結果から、尾部由来線維芽細胞では、７及び１０回の継代培養を行った後には、４因子を導入しても、殆どiPS細胞に誘導できなかったのに対して、歯肉線維芽細胞では、１０回の継代培養を行った後でも、４因子を導入すると、効率的にiPS細胞に誘導できることが確認された。
　また、歯肉線維芽細胞及び尾部由来線維芽細胞の増殖特性を比較するために、FP培地〔10%ウシ胎仔血清（Sigma, St. Louis, MO），50 units/ml penicillin，50 μg/ml streptomycin含有DMEM（Dulbecco's modified Eagle medium without sodium pyruvate: ナカライテスク，京都）培地〕100 μl/wellを添加した96wellプレートの各ウェルに、これらの細胞を2×103 個/wellとなるように添加し、37℃、5％CO2雰囲気で８日間培養を行い、2、6、8日目にWST-1細胞増殖測定用試薬（同仁化学研究所、熊本）により細胞数を計測した。この結果を図１５のＢに示す。この結果から、歯肉線維芽細胞は、尾部由来線維芽細胞に比して、有意に高い増殖能を示すことが判明した。
　更に、４、５、及び６回の継代培養を行った後の各細胞について、細胞増殖に寄与するテロメアの維持に必要なTert遺伝子の内在的発現をReal-time RT-PCRにて分析を行った。分析にはTaqMan プローブ及びプライマーを用いた（Mm00436931_m1：Applied Biosystems）。なお、内部コントロールとして、GAPDHを使用し（4352339E：Applied Biosystems）、４回の継代培養を行った尾部由来線維芽細胞における各遺伝子のmRNA発現量に対して、対応するTert遺伝子のmRNA発現量の相対値を求めた。結果を図１５のＣに示す。図１５のＣから明らかなように、歯肉線維芽細胞では６回の継代培養後でも、Tert mRNAの発現量が維持されていたが、尾部由来線維芽細胞では継代回数の増加と共に、Tert mRNAの発現量が低下していた。以上の遺伝子発現量の分析結果からも、歯肉線維芽細胞では、尾部由来線維芽細胞に比して、増殖能が優れていることが支持された。
実施例２　ヒトiPS細胞の作製及び評価
　以下に示す実験材料及び条件で、ヒト歯肉線維芽細胞からiPS細胞の誘導を行い、更に誘導されたiPS細胞の特性の評価を行った。
＜ヒト歯肉線維芽細胞の分離培養＞
　大阪大学歯学部の施設内倫理委員会によって承認されたプロトコールに従って、２４歳男性の歯科インプラント外科手術の際に摘出された健常なヒト歯肉組織片を得た（図１６のＡ参照）。このヒト歯肉組織片を細切した後、0.1%ゼラチンコート処理した組織培養プレート上に密着させて置き、FP培地〔10%ウシ胎仔血清（Sigma, St. Louis, MO），50 units/ml penicillin，50 μg/ml streptomycin含有DMEM（Dulbecco's modified Eagle medium without sodium pyruvate: ナカライテスク，京都）培地〕を組織片が覆われる程度に加えて5%CO2存在下、37℃で静置し、線維芽細胞と上皮細胞を増殖させた（図１６のＢ参照）。FP培地中では上皮細胞は分化して増殖が停止し剥離除去されるため、この培地を用いて継代培養を行うことにより、均質なヒト歯肉線維芽細胞を得た（図１６のＣ参照）。
 ＜ヒト胚性幹（ES）細胞株、及びヒト皮膚線維芽細胞から誘導したiPS細胞＞
　ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト胚性幹（ES）細胞株（KhES-1、継代回数３５）、及びヒト皮膚線維芽細胞から樹立されたiPS細胞は、京都大学再生医科学研究所から供与された。ヒトES細胞は、日本国文部科学省が定めたヒトES細胞の利用に関するガイドラインに従って取り扱った。SNLフィーダー細胞は、Dr. Allan Bradley（Sanger Institute，London, UK）より供与されたものを用いた。
 ＜レトロウイルス粒子製造＞
　レトロウイルス感染による4因子導入を行うにあたり、予めヒト歯肉線維芽細胞及びヒト皮膚線維芽細胞にマウスSlc7a1発現用レンチウイルスベクター（pLenti6/UbC/mSlc7a1ベクター）を発現させた。これにあたり、先ず、4 x 106個の293FT細胞（Invitrogen社）を293FT培地〔10%ウシ胎仔血清（Sigma, St. Louis, MO），2mM L-glutamine（Invitrogen社），1x10-4 M non essential amino acids（Invitrogen社），1 mM sodium pyruvate（Sigma社），50 units/ml penicillin，50 μg/ml streptomycin（Invitrogen社）含有DMEM培地（Nacalai tesque社）〕にて10-cm培養プレートに播種した。翌日に3 μgのpLenti6/UbC/mSlc7a1ベクター（Addgeneより購入）を、Virapower Lentiviral expression system（Invitrogen社）あるいはLipofectamine2000（Invitrogen社）とOPTI-MEMI培地（Invitrogen）の混合溶液を用いて293FT細胞に導入した。遺伝子導入の24時間後に新しい293FT培地に交換し、さらに24時間後に培養上清を回収した。
　一方で、レンチウイルスの感染前日に8 x 105個のヒト歯肉線維芽細胞及びヒト皮膚線維芽細胞をFP培地にて10-cm培養プレートに播種した。回収したレンチウイルス粒子を含んだ培養上清にpolybrene（最終濃度4 μg/ml）を加えたものを、ヒト歯肉線維芽細胞及びヒト皮膚線維芽細胞の培地と交換して細胞をレンチウイルスに感染させ、37℃、5% CO2で一晩培養した。感染24時間後にFP培地に交換した後の各細胞を、次のレトロウイルスの感染に用いた。
　ヒトc-Myc遺伝子、Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子又はKlf4遺伝子（cDNA）を組み込んだレトロウイルスベクター（pMXs）はAddgene（Cambridge, MA）から購入した。ウイルス粒子の産生に用いるPlatinum-Eパッケージング細胞は、東京大学の北村俊雄教授より供与されたものを用いた。
　OPTI-MEMI培地（Invitrogen）とFuGENE 6試薬（Roche, Basel, Switzerland）の混合溶液に各プラスミドベクター（9 μg）を混合し、リポフェクション法によりPlatinum-E細胞に遺伝子導入した。48時間後に各ウイルス粒子を含んだ培養上清を回収し、歯肉線維芽細胞又は皮膚由来線維芽細胞のレトロウイルス感染（iPS細胞誘導）に用いた。
 ＜iPS細胞誘導＞
　レトロウイルス感染による形質導入24時間前に、歯肉線維芽細胞又はヒト皮膚線維芽細胞を、0.1%ゼラチンコート処理した10-mm培養プレートに8×105個播種し、FP培地〔10%ウシ胎仔血清（Sigma, St. Louis, MO），50 units/ml penicillin，50 μg/ml streptomycin含有DMEM（Dulbecco's modified Eagle medium without sodium pyruvate: ナカライテスク，京都）培地〕で培養した。4因子（c-Myc，Oct3/4，Sox，Klf4）を用いたiPS細胞誘導を実施した。iPS細胞誘導には、上記４因子の各ウイルス含有上清を最終的に等量になるよう混合した。この混合液にpolybrene（最終濃度4 μg/ml）を添加した溶液を各線維芽細胞の培地と置換し、5%CO2存在下，37℃で一晩培養した。翌日から5日間、毎日培養上清を吸引除去し、新しいFP培地と交換した。レトロウイルス感染６日後に、mitomycin C処理により増殖を不活性化して10-cm培養プレートに播種したSNLフィーダー細胞（1.5 x 106個）上に、各線維芽細胞を5×104個播種した。翌日、培地をPrimate ES培地（ReproCELL社）に置換し、以後二日に1回培地を新鮮なものに交換した。形質導入15～26日後に出現したいくつかのES細胞様の形態のコロニーを選択して継代培養し、クローン化したコロニーの中で特にES細胞様の形態および増殖能を示すコロニー細胞株をiPS細胞株とした。
 　斯くして４因子を導入したヒト歯肉線維芽細胞では、iPS細胞様のコロニーを形成した（図１６のＤ参照）。一方、この条件では、４因子を導入した皮膚線維芽細胞では、iPS細胞様のコロニーの形成を殆ど認めなかった。また、形質導入26日後にヒト歯肉線維芽細胞由来のiPS細胞様コロニーを機械的に剥がして継代培養することによって、５つのクローン株を得た（図１６のＥ及びＦ参照）。当該コロニーは増殖し、ヒトES細胞（図１６のＧ参照）及びヒト皮膚線維芽細胞から樹立されたiPS細胞（図１６のＨ参照）と同じ形態及び増殖特性を示した。また、ヒト歯肉線維芽細胞から誘導されたES細胞様コロニーは、ES細胞のマーカーとされるアルカリフォスファターゼの強い活性を有することも確認された（図１６のＩ参照）。
　以上の結果から、ヒト歯肉線維芽細胞はヒト皮膚線維芽細胞よりも、効率的にヒトiPS細胞を樹立できることが確認された。
＜逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）解析＞
　上記により得られた５つのiPS細胞クローン株（４因子をヒト歯肉線維芽細胞に導入して得られたiPS細胞）、ヒトES細胞、ヒト歯肉線維芽細胞又はiPS細胞の培養に使用したフィーダー細胞から得られた全RNAをRT-PCR解析に使用した。RT-PCR解析には、表３に示すプライマーを使用して、上記実施例１と同様の手法で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　得られた結果を図１７に示す。この結果から、ヒト歯肉線維芽細胞から誘導したiPS細胞は、ES細胞に特異的なマーカー遺伝子（NANOG、内在性OCT3/4、内在性SOX2、REX1）を強く発現していることが確認され、自己増殖能と多分化能を獲得していることが確認された。

Claims (11)

  1. 　口腔粘膜由来の体細胞に対して、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入する工程を含む、誘導多能性幹細胞の製造方法。
  2. 　口腔粘膜由来の体細胞が、口腔粘膜由来の線維芽細胞である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　口腔粘膜由来の体細胞が、歯肉由来の線維芽細胞である、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子が、Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びklfファミリー遺伝子を含む、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子が、更にMycファミリー遺伝子を含む、請求項４に記載の製造方法。
  6. 　口腔粘膜由来の体細胞に対して、体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子を導入することにより得られる、誘導多能性幹細胞。
  7. 　口腔粘膜由来の体細胞が、口腔粘膜由来の線維芽細胞である、請求項６に記載誘導多能性幹細胞。
  8. 　口腔粘膜由来の体細胞が、歯肉由来の線維芽細胞である、請求項６に記載誘導多能性幹細胞。
  9. 　細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子がOctファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びklfファミリー遺伝子を含む、請求項６に記載の誘導多能性幹細胞。
  10. 　体細胞を多能性幹細胞に誘導可能な再プログラム因子が、更にMycファミリー遺伝子を含む、請求項９に記載の誘導多能性幹細胞。
  11. 　請求項６乃至１０のいずれかに記載の誘導多能性幹細胞を含む、再生医療用の細胞製剤。
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