WO2011009731A1 - Verfahren zur aufreinigung oder extraktion - Google Patents

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WO2011009731A1
WO2011009731A1 PCT/EP2010/059778 EP2010059778W WO2011009731A1 WO 2011009731 A1 WO2011009731 A1 WO 2011009731A1 EP 2010059778 W EP2010059778 W EP 2010059778W WO 2011009731 A1 WO2011009731 A1 WO 2011009731A1
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organic solvent
analyte
functionalized
polymer resin
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David Siegel
Matthias Koch
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BAM Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N2030/009—Extraction

Definitions

  • the invention relates to a process for the purification or extraction of carbonyl compounds which are present in complex, in particular non-polar mixtures, wherein the carbonyl group of the carbonyl compound is not conjugated with a heteroatom, and the use of solid phase for the purification or extraction of
  • a liquid extract of the food is generally first prepared.
  • the target analytes are present together with a number of interfering substances such as fats, proteins or sugars.
  • the extract Prior to quantification of the target analytes, the extract must be purified, as the interfering substances may interfere or damage the instruments used for quantification or may overlay the target analyte signal. Difficulties exist in particular in the production of extracts in the analysis of non-polar contaminants in edible oils, fats and high-oil / fatty matrices, which are in themselves non-polar substance mixtures.
  • non-polar pollutants in oils and fats generally can not be selectively extracted with nonpolar organic solvents or non-polar solid phases.
  • Previous purification techniques depend on the chemical and physical properties of both the analyte and the matrix in which the analyte is to be detected (for example, flour, oil, coffee). Of particular interest is the detection of the mycotoxin zearalenone.
  • conventional analytical methods of the prior art are shown:
  • immunoaffinity columns The principle of immunoaffinity columns relies on the use of antibodies that bind rapidly and selectively to the target analyte (antibody - antigen interaction).
  • the antibodies are immobilized (ie, applied to a solid phase) and packed in a mini-column in this form. As a result, an extract or a liquid sample is applied directly to the column.
  • the antibodies bind the analyte, while interfering substances remain in solution and are separated. In a subsequent elution step, the antibodies are denatured and the analyte is released again.
  • Immunoaffinity columns are often used in the field of mycotoxin analysis. Especially in the analysis of the estrogenic mycotoxin zearalenone, commercial immunoaffinity columns are considered "state-of-the-art.” They continue to be relevant to analytical methods for monitoring current EU legislation.
  • Immunoaffinity columns offer the highest possible selectivity in the current state of the art, since in general only the analyte of interest is retained. Significant disadvantages of immunoaffinity columns are enormous development costs, which translate into significant end-user prices. Due to possible cross reactivities of the used antibodies with matrix components, the
  • immunoaffinity columns are still usable only once. Due to the relatively high development effort, immunoaffinity columns are only available for a limited range of analytes. Since only one specific analyte can normally be bound to an antibody, immunoaffinity columns are generally not suitable for multi-analyte methods. In addition, they are not compatible with high levels of organic solvents, as the latter also lead to denaturation. A strong dilution of organic extracts is therefore necessary. Direct analysis of oils and fats with immunoaffinity columns is not possible.
  • SPE materials hold the Analytes do not have an antibody-antigen interaction, but return via physisorption or ionic interactions. Interfering substances with analyte-like physical / chemical properties are also retained. SPE columns are less selective but less expensive than immunoaffinity columns.
  • a classic SPE material is octadecyl-modified silica gel. There are a lot of variations / modifications.
  • SPE cartridges do not suffer from increased batch dependency, in some cases can be reused and are available for a wide range of applications.
  • nonpolar analytes such as the mycotoxin zearelenone, the rodenticides warfarin, coumafuryl and coumachlor, the pesticide mesotrione and the fungicide zoxamide
  • a non-polar SPE phase can be used as the oil or fat itself is a non-polar matrix however, no selectivity is achieved so that the entire matrix is extracted.
  • the products in this category are each optimized for one or a few analytes. Very good results are achieved for these analytes. Disadvantages are the comparatively high prices of the products and the severely limited range of analytes.
  • liquid / liquid extraction is dispensed with a solid phase.
  • the analyte is taken up in solvent mixtures which undergo phase separation.
  • the selectivity is achieved by a different affinity of analyte and interfering substances to the corresponding phases and can be optimized by varying the pH. Frequently several liquid / liquid extraction steps are carried out in succession.
  • the oil or fat can be saponified (i.e., hydrolyzed alkaline). Subsequently, the released fatty acids can be separated by a liquid / liquid extraction. The non-saponifiable ingredients can then be one of
  • Embodiments of the invention are characterized in the subclaims.
  • the process according to the invention is based on the reversible formation of a chemical, covalent bond.
  • This bond is attached between the target analyte to be purified, which is in solution, and a reactive chemical group on a solid phase (e.g., a polymeric resin, preferably polystyrene resin).
  • a solid phase e.g., a polymeric resin, preferably polystyrene resin.
  • the analyte is fixed to the solid phase and the solution containing the non-reactive impurities can be separated.
  • the solid phase is then washed several times with organic solvent to separate impurities adhering via physisorption.
  • the covalent bond that fixes the analyte to the solid phase is cleaved to obtain a purified solution of the chemically unaltered analyte.
  • This solution can be used directly for instrumental detection, e.g. be fed via HPLC-FLD, HPLC-MS or GC-MS.
  • the underlying chemistry is reversible hydrazone formation (a condensation reaction).
  • the solid phase is functionalized with a hydrazine group.
  • the latter reacts with an aldehyde or keto group of the analyte (see Fig. 1).
  • the analytes to be purified must therefore have a carbonyl group.
  • the carbonyl group must not be conjugated with a heteroatom (nitrogen, oxygen, etc.) (in Figure 1 neither R 2 nor R 3 may be heteroatom).
  • the method is therefore only applicable if in
  • Analyte molecule in addition to the carboxylic acid / ester / amide group is a further carbonyl group which is not conjugated with a heteroatom.
  • Inappropriate analytes include the mycotoxins fumonisin FB 1/2 , ochratoxin A or aflatoxin G 2 .
  • the solid phase is functionalized with a sulfonylhydrazine group Figure 2).
  • Figure 2 Special version for the analyte zearalenone and a toluenesulfonyl hydrazine-functionalized polystyrene resin
  • Macroporous resins have a rigid structure compared to swelling resins, so that the pores (and thus the reactive sites) are easily accessible even without swelling of the resin. This is important because aqueous solvent mixtures which have unfavorable swelling properties are used in the process to be reported. Upon release of the analyte, the hydrazone bond is hydrolyzed to recover the chemically unaltered analyte.
  • reaction conditions must be such that the equilibrium is on the respective desired side (analyte bound to solid phase / analyte in solution).
  • heptane or methanol are used as the solvent.
  • the preferred acetic acid also serves as a catalyst for hydrazone formation.
  • the hydrazine groups of the polymer resin are converted to the hydrazine hydrochlorides prior to use by treatment with a mixture of methanol and aqueous hydrochloric acid.
  • the resin is then dried. In this way, proton catalysis is achieved without having to add aqueous components to the coupling solvent / methanol. If the resin is not conditioned, is the
  • the hydrodynamic volume of the analyte in the solvent used is small enough to permit penetration of the polymer resin pores (the majority of the reactive hydrazine groups are located in the pore interior).
  • the release of the analyte is hydrolytic.
  • Organic solvents or mixtures of organic solvents with water or aqueous acids such as methane conc. HCl 80:20 are suitable, but only release an insufficient portion ( ⁇ 60%) of the bound analyte.
  • a low molecular weight ketone / aldehyde e.g., acetone
  • the organic solvent may advantageously be identical to the ketone or aldehyde. Acetone itself forms hydrazone bonds on the solid phase and thus displaces the analyte.
  • the method achieves an analyte-dependent recovery of> 80%.
  • the o.g. Chemistry runs completely under mild conditions at room temperature.
  • the solid phase can therefore be regenerated after use and reused up to three times
  • the invention is a general method that is applicable to a variety of analytes and matrices.
  • Well-suited analytes include the mycotoxin zearelenone, the rodenticides warfarin, coumafuryl and coumachlor, the pesticide mesotrione and the fungicide zoxamide.
  • Extracts purified by the process of the present invention are free of critical impurities such as fats, sugars, amino acids and proteins. Due to the broad selectivity for aldehydes and ketones, however, the latter are not necessarily separated. Therefore, an additional chromatographic separation is usually provided before detection (eg by HPLC or GC). A particularly preferred embodiment of the method is explained in the following flow chart:
  • Non-lipophilic sample matrix Lipophilic sample matrix
  • the active solid phase is weighed into a laboratory-standard reaction vessel.
  • the task, washing and elution solutions are added directly and removed again via a syringe or pipette.
  • Advantage of this application design is the flexibility in the choice of parameters such as amount of solid phase, amount of solvent mixtures and reaction times, etc. Since the solid phase is not fixed, there are disadvantages in handling, as possibly when adding / removing the solutions solid phase is dragged.
  • the active solid phase is fixed between two frits in a column made of plastic or glass. Discharge, washing and elution solutions are introduced from above and dripped through the column into a collecting vessel.
  • This application design is characterized by its robustness and uncomplicated handling. A marketing of end customer products on the basis of the column design is conceivable.
  • the invention is in addition to the method described above, the use of solid phases which are functionalized with hydrazine groups, for the purification or extraction of carbonyl compounds, in particular nonpolar carbonyl compounds. It is particularly advantageous that the isolation of carbonyl-containing compounds from a complex mixture including a quantitative quantitative release takes place under reproducible conditions quantitatively. Quantitative in this context means that the content of the liberated, purified carbonyl compound is not less than 60% of the original content.
  • the method according to the invention are detected by HPLC-UV at 5 replicates and a sample preparation according to the o.g. Example consistently
  • Food matrices are chemically very complex, i. They contain a large number (in many cases several thousand) chemical compounds.
  • the technical problem with purification is separating the target analytes from the remaining matrix components. This is necessary because the matrix components can interfere with the detection step performed with sensitive instruments such as HPLC-MS / MS coupling.
  • "Technically problematic" is the purification because the substances to be separated are often similar to the target analytes
  • the thousands of chemical compounds that are present in a food matrix, such as coffee, to isolate precisely one compound are not trivial, and in quantitative quantitative analysis (such as those found in eg A multi-day purification is not practical because of the high number of samples to be processed, which requires time-consuming and cost-effective procedures be less susceptible to interference and repeatable. All these claims, the process of the invention is fair.
  • the invention furthermore makes it possible for the first time to selectively isolate nonpolar carbonyl compounds from oils and fats, without relying on gel permeation chromatography or aggressive saponification conditions. Further advantages of the method according to the invention over the described prior art methods are shown below
  • the solid phases used are free of complex biological materials and are therefore characterized by low acquisition costs, low batch variances and high robustness. Highly reproducible results are achieved.
  • Several carbonyl-containing analytes such as the mycotoxin zearelenone, the rodenticides warfarin, coumafuryl and coumachlor, the pesticide mesotrione and the fungicide zoxamide) can be purified with the same solid phase in one go. This is with
  • the advantage here is above all the increased selectivity and thus better cleaning performance of the notified process.
  • the compounds are not bound by polarity but by chemical reactivity under closely defined conditions (time, temperature).
  • Another advantage is the high stability of the covalent chemical bond formed during the extraction with the solid phase.
  • the solid phase can be washed several times without significant analyte losses even with such solvents in which the analyte is actually well soluble. This is generally not possible with SPE techniques.
  • MycoSep / MultiSep columns are expensive compared to the method of the invention.
  • the range of analytes is severely limited because the MycoSep / MultiSep products are optimized for one or a few analytes.
  • the process of the invention is applicable to a wide range of carbonyl compounds. Direct application of dissolved fats or diluted oils to MycoSep / MultiSep products is not possible, while the method according to the invention provides this performance.
  • liquid / liquid extraction is far less selective than the process of the invention. It is also more susceptible to interference due to a multitude of work steps. It is not suitable for multi-analyte methods insofar as the analytes have strongly different polarities / solubilities, whereas in the method according to the invention the polarity is not a criterion.
  • the process according to the invention does not rely on the equipment required for gel permeation chromatography.
  • the solvent consumption is lower.
  • the invention dispenses with aggressive saponification conditions and therefore ensures the stability of the analytes to be extracted.
  • the target analytes are quantified, as already described. This step is conveniently carried out by means of HPLC-UV / FLD / MS or GC-FID / ECD / MS.
  • HPLC-UV / FLD / MS or GC-FID / ECD / MS.
  • other uses of the purified extract are conceivable instead of quantification. Fragrance / aroma chemicals
  • scent extracts can be obtained in stable form and released at a later time. Pre-cleaning in the isolation of substances on a preparative scale
  • the above workflows are based on analytical substance quantities. With appropriate upscaling (increasing the amount of solid phase and thus the reactive sites), the described technique can also be used for pre-purification in the quantitative isolation of substances from complex matrices. Here is the goal to isolate a single substance on a gram scale and in high purity.
  • the necessary Amount of active solid phase can be calculated from the typical loading with reactive sites (normally about 2-3 mmol / g).
  • the prepurified material can be further purified by recrystallization or quantitative HPLC.
  • Coumafuryl (rodenticides), zoxamide (fungicide) and mesotrione (pesticide) are exemplified.
  • Flour 10 g of flour are mixed with 40 ml of acetonitrile: water (84:16) and shaken for 30 minutes. The mixture is centrifuged. 10 ml of the supernatant are evaporated and taken up in 1 ml of heptane: acetic acid (85:15 v: v).
  • Oil 0.2 mL of oil is diluted with 0.8 mL of heptane.
  • the supply solution is removed.
  • the resin is washed once with 2 mL heptane and then dried in a gentle stream of nitrogen.
  • Flour 10 g of flour are combined with 40 ml of acetonitrile: water (84:16) and shaken for 30 minutes. The mixture is centrifuged. 10 ml of the supernatant are evaporated and resumed in 1 ml of methanol.
  • Oil 0.2 mL of oil is diluted with 0.8 mL of methanol.
  • the feed solution is added to 100 mg ( ⁇ 2 mg) of a commercially available, macroporous, toluene sulfonyl hydrazine functionalized polystyrene resin having an average hydrazine loading of 1.5 mmol / g.
  • the resin was conditioned with MeOH: 0.4M HCl 90:10 (v / v) before use. It is shaken for 1.5 hours.
  • the supply solution is removed.
  • the resin is washed once with 1.8 mL of methanol and then once with 1 .8 mL of heptane and finally in the gentle

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Abstract

Um ein wirtschaftliches Verfahren zur Aufreinigung oder Extraktion von Analyten, die in komplexen, insbesondere unpolaren Stoffgemischen vorliegen, zu schaffen, wird vorgeschlagen dass das Stoffgemisch in einem wasserfreien Medium auf eine mit Hydrazingruppen funktionalisierte Festphase aufgebracht, das Medium wieder abgetrennt sowie anschließend die Festphase mit organischem Lösungsmittel gewaschen wird und dass nach dem Waschen die Festphase mit einer Mischung aus organischen Lösungsmittel und wässriger Säure zur Freisetzung der Carbonylverbindung eluiert wird, wobei die Carbonyl- Verbindung gelöst in dem organischen Lösungsmittel und der wässrigen Säure erhalten wird.

Description

Verfahren zur Aufreinigung oder Extraktion
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung oder Extraktion von Carbonyl- verbindungen, die in komplexen, insbesondere unpolaren Stoffgemischen vorliegen, wobei die Carbonylgruppe der Carbonylverbindung nicht mit einem Heteroatom konjugiert ist, sowie die Verwendung von Festphase zur Aufreinigung oder Extraktion von
Carbonylverbindungen.
In der routinemäßigen, quantitativen Analytik von Kontaminanten, wie beispielsweise Mykotoxinen, Pestiziden etc., in festen Lebensmitteln wird im Allgemeinen zunächst ein flüssiges Extrakt des Lebensmittels hergestellt. In diesem flüssigen Extrakt liegen die Zielanalyten zusammen mit einer Reihe von Störsubstanzen wie Fetten, Proteinen oder Zuckern vor. Vor der Quantifizierung der Zielanalyten muss das Extrakt aufgereinigt werden, da die Störsubstanzen die zur Quantifizierung verwendeten Instrumente stören oder beschädigen bzw. das Zielanalytsignal überlagern können. Schwierigkeiten sind insbesondere bei der Erzeugung von Extrakten in der Analytik unpolarer Kontaminanten in Speiseölen, -fetten und hochgradig öl-/fetthaltigen Matrices gegeben, die an sich unpolare Substanzgemische sind. Unpolare Schadstoffe in Ölen und Fetten lassen sich daher im Allgemeinen nicht selektiv mit unpolaren, organischen Lösungsmitteln oder unpolaren Festphasen extrahieren. Bisherige Aufreinigungstechniken hängen von den chemischen und physikalischen Eigenschaften sowohl des Analyten als auch der Matrix, in der der Analyt nachgewiesen werden soll (zum Beispiel Mehl, Öl, Kaffee), ab. Von besonderem Interesse ist der Nachweis des Mykotoxins Zearalenon. Nachfolgend werden übliche analytische Verfahren nach dem Stand der Technik dargestellt:
Immunoaffinitätssäulen Das Prinzip der Immunoaffinitätssäulen beruht auf der Verwendung von Antikörpern, die schnell und selektiv den Zielanalyten binden (Antikörper - Antigen Wechselwirkung). Die Antikörper werden immobilisiert (d.h. auf eine Festphase aufgebracht) und in dieser Form in eine Mini-Säule gepackt. In der Folge wird ein Extrakt oder eine flüssige Probe direkt auf die Säule aufgebracht. Die Antikörper binden den Analyten, während Störsubstanzen in Lösung bleiben und abgetrennt werden. In einem anschließenden Elutionsschritt werden die Antikörper denaturiert und der Analyt wieder freigesetzt. Immunoaffinitätssäulen werden häufig im Bereich der Mykotoxinanalytik eingesetzt. Besonders bei der Analytik des östrogenwirksamen Mykotoxins Zearalenon werden kommerzielle Immunoaffinitätssäulen als„state-of-the-art" angesehen. Sie haben weiterhin Relevanz für analytische Methoden zur Überwachung der aktuellen EU-Gesetzgebung.
Immunoaffinitätssäulen bieten nach dem heutigen Stand der Technik eine höchstmögliche Selektivität, da im Allgemeinen ausschließlich der Analyt von Interesse zurückgehalten wird. Bedeutende Nachteile der Immunoaffinitätssäulen sind enorme Entwicklungskosten, die sich in beträchtlichen Endverbraucherpreisen niederschlagen. Auf Grund von möglichen Kreuzreaktivitäten der verwendeten Antikörper mit Matrixbestandteilen, muss die
Verwendbarkeit von Immunoaffinitätssäulen für jede Matrix neu nachgewiesen werden. Weiterhin ist die Leistungsfähigkeit der Immunoaffinitätssäulen chargenabhängig. Da von Hersteller zu Hersteller und Charge zu Charge ggf. unterschiedliche Antikörper verwendet werden, muss eine analytische Methode stets auf die konkret verwendete Charge angepasst werden, was einen beträchtlichen Mehraufwand nach sich zieht. Da die
Antikörper bei der Elution denaturieren, sind Immunoaffinitätssäulen weiterhin nur einmal verwendbar. Auf Grund des vergleichsweise hohen Entwicklungsaufwandes stehen Immunoaffinitätssäulen nur für ein begrenztes Analytenspektrum zur Verfügung. Da mit einem Antikörper im Normalfall nur ein spezifischer Analyt gebunden werden kann, sind Immunoaffinitätssäulen gemeinhin nicht für Multi-Analytmethoden geeignet. Sie sind außerdem nicht mit hohen Anteilen organischer Lösungsmitteln kompatibel, da letztere ebenfalls zu einer Denaturierung führen. Eine starke Verdünnung organischer Extrakte ist daher nötig. Eine direkte Analytik von Ölen und Fetten mit Immunoaffinitätssäulen ist nicht möglich.
Solid Phase Extraction (SPE)
Zur Probenvorbereitung/-reinigung verwendete Säulen können statt mit immobilisierten Antikörpern ebenfalls mit SPE-Materialien gepackt werden. SPE-Materialien halten den Analyten nicht über eine Antikörper-Antigen Wechselwirkung, sondern über Physisorption oder ionische Wechselwirkungen zurück. Störsubstanzen mit dem Analyten ähnlichen physikalischen/chemischen Eigenschaften werden ebenfalls zurückgehalten. SPE-Säulen sind weniger selektiv, aber preislich günstiger als Immunoaffinitätssäulen. Ein klassisches SPE-Material ist das Octadecyl-modifizierte Silicagel. Es existiert eine Vielzahl an Variationen / Modifikationen.
Im Gegensatz zu Immunoaffinitätssäulen leiden SPE-Kartuschen nicht unter erhöhter Chargenabhängigkeit, können in manchen Fällen wiederverwendet werden und stehen für ein breites Anwendungsspektrum zur Verfügung.
Auf Grund allgemeiner Rückhaltemechanismen (Physisorption bzw. ionische Wechselwirkungen) ist die Selektivität von SPE-Kartuschen im Allgemeinen aber gering. Weiterhin können Waschschritte zum vorzeitigen, teilweisen Verlust des Analyten führen.
Bei der Extraktion unpolarer Analyten (wie etwa dem Mykotoxin Zearelenon, den Rodentizi- den Warfarin, Coumafuryl und Coumachlor, dem Pestizid Mesotrion sowie dem Fungizid Zoxamid) kann eine unpolare SPE-Phase verwendet werden, da das Öl bzw. Fett an sich eine unpolare Matrix darstellt wird jedoch keine Selektivität erreicht, so dass die komplette Matrix extrahiert wird.
Mvcosep / Multisep-Säulen
Während die o.g. Verfahren auf einer Fixierung des Analyten an einer Festphase beruhen, kann auch der umgekehrte Weg beschritten werden, indem nicht der Analyt, sondern die abzutrennenden Verunreinigungen an einer Festphase fixiert werden. Beim Überleiten eines Lebensmittelextrakts über eine entsprechende Säule wird ohne Elutionsschritt direkt eine gereinigte Lösung erhalten. Die Firma Romer Labs Diagnostic GmbH, TuIIn, Österreich vertreibt unter dem Markennamen MycoSep® bzw. MultiSep® exklusiv entsprechende Produkte. Die Säulen sind mit einer Mischung aus Aktivkohle, lonentauscherharzen, Celite® und weiteren, nicht offengelegten Materialien gepackt. Die Adsorbentien sind dabei jeweils für eine Analyten-/Anwendungsgruppe optimiert. Der Rückhalt der Störsubstanzen erfolgt über Physisorption / ionische Wechselwirkungen.
Die Produkte dieser Kategorie sind jeweils für einen oder einige wenige Analyten optimiert. Für diese Analyten werden sehr gute Ergebnisse erzielt. Nachteile sind die vergleichsweise hohen Preise der Produkte sowie das stark eingeschränkte Analytenspektrum. Die
Produkte sind weiterhin nur einmal verwendbar.
Konventionelle Aufreinigung durch Flüssig/Flüssig-Extraktion
Bei der Flüssig/Flüssig Extraktion wird auf eine Festphase verzichtet. Der Analyt wird in Lösungsmittelgemischen aufgenommen, die einer Phasentrennung unterliegen. Die Selektivität wird durch eine unterschiedliche Affinität von Analyt und Störsubstanzen zu den entsprechenden Phasen erzielt und kann durch Variation des pH-Wertes optimiert werden. Häufig werden mehrere Flüssig/Flüssigextraktionsschritte hintereinander ausgeführt.
Diese Methode der Aufreinigung ist im Allgemeinen ineffizient, da eine sehr geringe Selektivität für den Zielanalyten besteht. Eine große Zahl an ähnlich polaren Störsubstanzen wird coextrahiert. Eine Vielzahl an manuellen Arbeitsschritten macht die Methode anfällig für Störungen.
Gelpermeationschromatographie (GPC)
Zur Erzeugung von gereinigten Extrakten unpolarer Analyten aus Ölen und Fetten bzw. stark öl-/fetthaltigen Matrices wird wegen der genannten Nachteile bei vorgenannten Verfahren nach heutigem Stand der Technik die Gelpermeationschromatographie (GPC) (Synonym: Größenausschlußchromatographie) verwendet. Diese apparative Methode trennt Substanzgemische nach dem hydrodynamischen Volumen ihrer Bestandteile auf und ist daher nicht auf die Polarität als Selektivitätskriterium angewiesen.
Zur Durchführung der GPC wird ein entsprechendes Gerät inkl. Säulenmaterial und Eluenten benötigt. Anschaffungs- und Unterhaltskosten sind daher entsprechend hoch. Mitarbeiter müssen in die Bedienung des Geräts eingewiesen werden und der
Probendurchsatz ist auf Grund der Geräteverfügbarkeit begrenzt. Der Verbrauch an organischen Lösungsmitteln ist hoch. Verseifung
Alternativ zur GPC kann das Öl bzw. Fett verseift (d.h. alkalisch hydrolysiert) werden. Im Anschluss lassen sich die freigesetzten Fettsäuren durch eine Flüssig/Flüssigextraktion abtrennen. Die nicht-verseifbaren Bestandteile können anschließend einer der
vorgenannten Aufreinigungsmethoden zugeführt werden.
- A - Hier wird kein separates Gerät benötigt, allerdings sind viele Verbindungen unter den aggressiven Verseifungsbedingungen instabil und werden selbst hydrolysiert. Verseifung ist daher z.B. nicht für die Analytik von Zearalenon geeignet. Weiterhin muss nach der Verseifung im Normalfall ein zweiter Reinigungsschritt, z.B. mit SPE-Kartuschen erfolgen, so dass ein erhöhter Arbeitsaufwand nötig wird.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein wirtschaftliches Verfahren zur Aufreinigung oder Extraktion von Analyten, die in komplexen, insbesondere unpolaren Stoffgemischen vorliegen, zu schaffen.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte
Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der reversiblen Knüpfung einer chemischen, kovalenten Bindung. Diese Bindung wird zwischen dem aufzureinigenden Zielanalyt, der in Lösung vorliegt, und einer reaktiven chemischen Gruppe auf einer Festphase (z.B. einem Polymerharz, vorzugsweise Polystyrenharz) geknüpft. In der Folge ist der Analyt an der Festphase fixiert und die Lösung, welche die nicht-reaktiven Verunreinigungen enthält, kann abgetrennt werden. Die Festphase wird anschließend mehrfach mit organischem Lösungsmittel gewaschen, um über Physisorption anhaftende Verunreinigungen abzutrennen. In einem Elutionsschritt wird schließlich die kovalente Bindung, die den Analyten an der Festphase fixiert, gespalten und so eine gereinigte Lösung des chemisch unveränderten Analyten erhalten. Diese Lösung kann direkt der instrumentellen Detektion, z.B. über HPLC-FLD, HPLC-MS oder GC-MS zugeführt werden.
Bei der zu Grunde liegenden Chemie handelt es sich um reversible Hydrazonbildung (eine Kondensationsreaktion). Die Festphase ist mit einer Hydrazingruppe funktionalisiert.
Letztere reagiert mit einer Aldehyd- oder Ketogruppe des Analyten (siehe Abb. 1). Die aufzureinigenden Analyten müssen daher über eine Carbonylgruppe verfügen. Weiterhin darf die Carbonylgruppe nicht mit einem Heteroatom (Stickstoff, Sauerstoff etc.) konjugiert sein (in Abbildung 1 darf weder R2 noch R3 Heteroatom sein). Auf Carbonsäuren sowie deren Amide und Ester ist das Verfahren daher nur dann anwendbar, wenn im
Analytmolekül neben der Carbonsäure/Ester/Amidgruppe eine weitere Carbonylgruppe vorliegt, die nicht mit einem Heteroatom konjugiert ist. Nicht geeignete Analyten sind etwa die Mykotoxine Fumonisin FB1/2, Ochratoxin A oder Aflatoxin G2. Abbildung 1: Allgemeine chemische Grundlage des Verfahrens, R1 = beliebiges
Spacermolekül, R2 und R3 keine Heteroatome
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Hydrazmfunktionalisierte Analyt Analyt als Hydrazon kovalent an Festphase gebunden
Festphase
Nach einer bevorzugten Ausfύhrungsform des Verfahrens ist die Festphase mit einer Sulfonylhydrazmgruppe funktionalisiert Abbildung 2).
Abbildung 2: Spezielle Ausführung für den Analyten Zearalenon und ein Toluensulfonyl- hydrazinfunktionalisiertes Polystyrenharz
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Sulfonylhydrazinfunktionalisiertes Zearalenon Zearalenon kovalent an Polystyrenharz gebunden
Polystyrenharz Wird als Festphase ein Polymerharz eingesetzt, werden makroporόsen (Porengröße 30-60 Ä) Harze bevorzugt. Makroporόse Harze verfügen im Vergleich zu quellenden Harzen über eine rigide Struktur, so dass die Poren (und damit die reaktiven Stellen) auch ohne ein Quellen des Harzes gut zugänglich sind. Dies ist von Bedeutung, da im Rahmen des anzumeldenden Verfahrens wässπge Lösungsmittelmischungen verwendet werden, welche ungünstige Quelleigenschaften aufweisen. Bei der Freisetzung des Analyten wird die Hydrazonbindung hydrolysiert und so der chemisch unveränderte Analyt zurückgewonnen.
Da es sich bei Bindung sowie Freisetzung des Analyten prinzipiell um dieselbe Gleichgewichtsreaktion handelt, müssen die Reaktionsbedingungen so gewählt werden, dass das Gleichgewicht auf der jeweils gewünschten Seite liegt (Analyt an Festphase gebunden / Analyt in Lösung).
Entscheidend für den Erfolg der Bindung, d.h. die Kopplung des Analyten an die Festphase ist die Abwesenheit von Wasser im Reaktionsgemisch.
Vorzugsweise werden Heptan oder Methanol als Lösungsmittel verwendet.
Um die Kopplungsreaktion zu beschleunigen ist außerdem eine Katalyse durch Protonen von Vorteil. Im Fall des Heptans wird dazu vorzugsweise ein Anteil einer Carbonsäure, bevorzugt
Essigsäure zugesetzt. Die bevorzugte Essigsäure dient zugleich als Katalysator der Hydrazonbildung.
Bei der Ausführungsform mit Methanol werden die Hydrazingruppen des Polymerharzes vor Verwendung durch Behandlung mit einer Mischung aus Methanol und wässriger Salzsäure in die Hydrazin-Hydrochloride überführt. Das Harz wird anschließend getrocknet. Auf diese Weise wird Protonenkatalyse erreicht, ohne dem Kopplungslösungsmittel/Methanol wässrige Anteile zusetzen zu müssen. Wird das Harz nicht konditioniert, ist die
Kopplungsreaktion sechsfach verlangsamt.
Weiterhin wird vorzugsweise sichergestellt, dass das hydrodynamische Volumen des Analyten im verwendeten Lösungsmittel klein genug ist, um eine Durchdringung der Polymerharzporen zu erlauben (die Mehrzahl der reaktiven Hydrazingruppen befindet sich im Poreninneren).
Durch computergestützte Molekularsimulation kann gezeigt werden, dass das hydrodynamische Volumen von Zearalenon in Methanol hinreichend klein ist, um die 30-60 Ä Poren des Polymerharzes zu durchdringen. Andere Lösungsmittel wie etwa Ethylacetat oder Acetonitril sind hingegen nicht geeignet. Das Verfahren der Molekularsimulation wird in Siegel, D., Andrae, K., Proske, M., Kochan, C, Koch, M., Weber, M., & Nehls, I. (2010), Dynamic covalent hydrazine chemistry as a selective extraction and cleanup technique for the quantification of the Fusarium mycotoxin zearalenone in edible oils. Journal of Chromatography A, 1217(15), 2206-2215
beschrieben. Hiermit wird der Inhalt dieser Veröffentlichung in diese Anmeldung aufgenommen.
Die Freisetzung des Analyten erfolgt hydrolytisch. Organische Lösungsmittel oder Mischungen aus organischen Lösungsmitteln mit Wasser oder wässrigen Säuren (etwa Metha- nohkonz. HCl 80:20) sind geeignet, setzen allerdings nur einen ungenügenden Teil (< 60 %) des gebundenen Analyten frei. Zur vollständigen Freisetzung wird dem Elutionsgemisch ein niedermolekulares Keton / Aldehyd (z.B. Aceton) im hohen Überschuss zugesetzt, wobei dann Wasser oder wässrige Säuren nicht anwesend sein müssen. Das organische Lösungsmittel kann vorteilhafterweise identisch mit dem Keton oder Aldehyd sein. Aceton bildet selbst Hydrazonbindungen an der Festphase aus und verdrängt so den Analyten. Das Verfahren erzielt eine analytabhängige Wiederfindung von > 80 %. Für die
Verwendung in analytischen Methoden sind gemäß des Codex Alimentarius der WHO Wiederfindungen von mindestens 60 % unerlässlich. Die Wiederfindung bezeichnet in diesem Zusammenhang den Anteil der anfänglich vorhandenen Stoffmenge in der gereinigten Lösung am Ende des Verfahrens.
Die o.g. Chemie läuft vollständig unter milden Bedingungen bei Raumtemperatur ab. Die Festphase ist daher nach Verwendung regenerierbar und bis zu dreimal wiederverwendet werden
Bei der Erfindung handelt sich um ein allgemeines Verfahren, das auf eine Vielzahl an Analyten und Matrices anwendbar ist. Gut geeignete Analyten sind etwa das Mykotoxin Zearelenon, die Rodentizide Warfarin, Coumafuryl und Coumachlor, das Pestizid Mesotrion und das Fungizid Zoxamid.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigte Extrakte sind von kritischen Verunreinigungen wie Fetten, Zuckern, Aminosäuren und Proteinen befreit. Auf Grund der breiten Selektivität für Aldehyde und Ketone werden letztere aber nicht zwangsläufig abgetrennt. Daher ist in der Regel eine zusätzliche chromatographische Trennung vor der Detektion (z.B. mittels HPLC oder GC) vorgesehen. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist in nachstehendem Flussdiagramm erläutert:
Flussdiagramm
Nicht lipophile Probenmatπx Lipophile Probenmatrix
(z B Mehl, Kaffee), (z B Butter OD ,
enthalt Analyten X und Y enthalt Analyt X und Y
Extraktion mit
Losungsmitte] mischung A
(z B Acetonitnl Wasser 84 16 W)
VΘrunreimgtθ Losung von X und Y ] Verdünnen mit brw Losen i n in i_oΞungsmιttθlmiΞchung A ϊ Methanol
Eindampfen, Wiederaufnahme das
Rückstands in Methanol
Verunreinigte Losung von X und Y in Methanol
Aufgabe auf aktive Festphase
(vorbehandeltes, sulfonylhydrazinfunktionalisiertes Polystyrenharz)
Abtrennung der flussigen Phase
X und Y an aktive Fettphase gebunden Festphase verunrei nigt
Waschen dei aktiven hestphase mit Methanol und Heptan
Trocknθn der aktiven Festphase im Stickstoff Et rom
Zugabe der Eluüonslosungsmittelmischung B
(Acetor fJ 13 M HCl 70 30 v v),
Abtrennen der festen Phase
Gereinigte Losung von X und Y m uosungsmittelmischung B Gebrauchte , inaktive
Festphase
Überführung m Probengefaß (Vial) Pekonditionierung der Festphase mit Instrumente He Analytik Methanol 0 4 M HCl 90 1O v v
Zweimaliges Waschen mit
Diethylether
Trocknen im Slckstoffstrom
Messergebnis Gehalt von X und Ym der ursprünglichen
Probenmatrix
Regenerierte, aktive
Festphase Es werden für das erfindungsgemäße Verfahren zwei Designs besonders bevorzugt. Diese werden im Folgenden beschrieben. Batch-Design
Die aktive Festphase wird in ein laborübliches Reaktionsgefäß gewogen. Die Aufgabe-, Wasch- und Elutionslösungen werden direkt zugesetzt und über eine Spritze oder Pipette wieder abgenommen. Vorteil dieses Anwendungsdesigns ist die Flexibilität bei der Wahl Parameter wie Menge der Festphase, Menge der Lösungsmittelmischungen und Reaktionszeiten etc. Da die Festphase nicht fixiert ist, ergeben sich Nachteile beim Handling, da ggf. bei der Zugabe / Entnahme der Lösungen Festphase verschleppt wird.
Säulendesign
Die aktive Festphase wird zwischen zwei Fritten in einer Säule aus Plastik oder Glas fixiert. Aufgabe-, Wasch- und Elutionslösungen werden von oben aufgegeben und tropfen durch die Säule in ein Auffanggefäß. Dieses Anwendungsdesign zeichnet sich vor allem durch Robustheit und unkompliziertes Handling aus. Eine Vermarktung von Endkundenprodukten auf Basis des Säulendesigns ist denkbar.
Gegenstand der Erfindung ist neben dem vorbeschriebenen Verfahren auch die Verwendung von Festphasen, die mit Hydrazingruppen funktionalisiert sind, zur Aufreinigung oder Extraktion von Carbonylverbindungen, insbesondere unpolaren Carbonylverbindungen. Besonders vorteilhaft ist dabei, dass die Isolierung von carbonylhaltigen Verbindungen aus einem komplexen Stoffgemisch inkl. einer anschließenden quantitativen Freisetzung unter reproduzierbaren Bedingungen quantitativ erfolgt. Quantitativ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass der Gehalt der freigesetzten, gereinigten Carbonylverbindung nicht weniger als 60 % des ursprünglichen Gehalts beträgt.
Im Rahmen der Probenvorbereitung bzw. -Vorreinigung für analytische Messungen geht üblicherweise ein gewisser Anteil des ursprünglich vorhandenen Analyten verloren. Damit eine analytische Methode verlässliche, robuste Messergebnisse liefern kann, darf dieser Anteil 40 % nicht übersteigen. Anders gesagt muss das Verfahren der Probenvorbereitung zumindest 60 % des ursprünglich vorhandenen Analyten erhalten (d.h. die Wiederfindung muss größer 60 % sein). Diese Schwelle ist im Codex Alimentarius der WHO festgelegt. Ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass je nach Analyt Wiederfindungen > 90 % erzielt werden können. Ein weiteres Kriterium für die Güte eines analytischen Verfahrens ist die Streuung der
Messwerte. Letztere hängt neben der detektorabhängigen Streuung von der Probenvorbereitung ab. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bei Detektion mittels HPLC-UV bei 5 Replikaten und einer Probenvorbereitung gemäß dem o.g. Beispiel durchweg
Streuungen < 5 % erhalten. Diese hohe Reproduzierbarkeit ist ein weiterer entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Möglichkeit gegeben, Lebensmittelextrakte von carbonylhaltigen Analyten mit guter Selektivität und geringem Kostenaufwand zu reinigen, ohne auf Immunoaffinitätstechniken zurückgreifen zu müssen.
Nahrungsmittelmatrices sind chemisch sehr komplex, d.h. Sie enthalten eine Vielzahl (in vielen Fällen mehrere tausend) chemische Verbindungen. Das technische Problem bei der Aufreinigung besteht darin, die Zielanalyten von den übrigen Matrixbestandteilen zu trennen. Dies ist erforderlich, da die Matrixbestandteile den Detektionsschritt, der mit empfindlichen Instrumenten wie etwa der HPLC-MS/MS Kopplung ausgeführt wird, stören bzw. die Instrumente beschädigen können.„Technisch problematisch" ist die Aufreinigung, weil die abzutrennenden Substanzen häufig den Zielanalyten ähnliche chemische und physikalische Eigenschaften aufweisen. Anders gesagt: aus den tausenden chemischen Verbindungen, die in einer Lebensmittelmatrix wie etwa Kaffee, vorliegen, genau eine Verbindung zu isolieren, ist nicht trivial. Hinzu kommt, dass im Rahmen der quantitativen Routineanalytik (wie sie zum Beispiel in Lebensmitteluntersuchungsämtern durchgeführt wird), eine mehrere Tage dauernde Aufreinigung auf Grund der hohen zu bearbeitenden Probenzahl nicht praktikabel ist. Man ist hier auf zeit- und kosteneffektive Verfahren angewiesen. Die Verfahren müssen weiterhin„robust", d.h. wenig störanfällig und wiederholbar sein. All diesen Ansprüchen wird das erfindungsgemäße Verfahren gerecht.
Die Erfindung ermöglicht es weiterhin erstmals, unpolare Carbonylverbindungen selektiv aus Ölen und Fetten zu isolieren, ohne auf Gelpermeationschromatographie oder aggressive Verseifungsbedinungen angewiesen zu sein. Weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den beschriebenen Verfahren nach dem Stand der Technik werden nachstehend dargestellt
Vorteile gegenüber Immunoaffinitätssäulen
Die verwendeten Festphasen sind frei von komplexen biologischen Materialien und zeichnen sich daher durch günstige Anschaffungskosten, geringe Chargenvarianzen und hohe Robustheit aus. Es werden hochgradig reproduzierbare Ergebnisse erzielt. Mehrere carbonylhaltige Analyten (wie etwa das Mykotoxin Zearelenon, die Rodentizide Warfarin, Coumafuryl und Coumachlor, das Pestizid Mesotrion und das Fungizid Zoxamid) lassen sich mit derselben Festphase in einem Arbeitsgang aufreinigen. Dies ist mit
Immunoaffinitätssäulen nicht möglich.
Die Regenerierbarkeit der Festphase senkt die Materialkosten noch weiter. Während die Preise für eine einmal verwendbare Immunoaffinitätssäule derzeit bei 10 bis 20 Euro liegen, kosten für das anzumeldende Verfahren verwendbare Festphasen weniger als 50 Cent je Verwendung.
Vorteile gegenüber SPE-Techniken
Vorteil ist hier vor allem die erhöhte Selektivität und damit bessere Reinigungsleistung des anzumeldenden Verfahrens. Die Verbindungen werden nicht nach Polarität, sondern nach chemischer Reaktivität unter eng definierten Bedingungen (Zeit, Temperatur) gebunden. Ein weiterer Vorteil ist die hohe Stabilität der bei der Extraktion mit der Festphase geknüpften kovalenten chemischen Bindung. Die Festphase kann ohne signifikante Analyt-Verluste mehrfach selbst mit solchen Lösungsmitteln gewaschen werden, in denen der Analyt eigentlich gut löslich ist. Dies ist bei SPE-Techniken im Allgemeinen nicht möglich.
Vorteile gegenüber MycoSep/MultiSep
MycoSep/MultiSep-Säulen sind im Vergleich zu dem erfindungsgemäßen Verfahren teuer. Das Analytenspektrum ist stark eingeschränkt, da die MycoSep/MultiSep Produkte auf einen bzw. einige wenige Analyten optimiert sind. Das erfindungsgemäße Verfahren ist hingegen auf ein breites Spektrum an Carbonylverbindungen anwendbar. Eine direkte Aufgabe von gelösten Fetten bzw. verdünnten Ölen auf MycoSep/MultiSep-Produkte ist nicht möglich, während das erfindungsgemäße Verfahren diese Leistung erbringt.
Vorteile gegenüber Flüssig/Flüssig-Extraktion Die Flüssig/Flüssigextraktion ist weit weniger selektiv als das erfindungsgemäße Verfahren. Durch eine Vielzahl an Arbeitsschritten ist sie außerdem anfälliger für Störungen. Sie ist nicht für Multi-Analyt Methoden geeignet, insofern die Analyten stark unterschiedliche Polaritäten/Löslichkeiten aufweisen, während beim erfindungsgemäßen Verfahren die Polarität kein Kriterium darstellt.
Vorteile gegenüber Gelpermeationschromatoqraphie
Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht auf die für die Gelpermeationschromatographie nötige apparative Ausrüstung angewiesen. Der Lösungsmittelverbrauch ist geringer.
Vorteile gegenüber Verseifung
Das erfindungsgemäße verzichtet auf aggressive Verseifungsbedingungen und gewährleistet daher die Stabilität der zu extrahierenden Analyten. Am Ende des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zielanalyten, wie bereits beschrieben, quantifiziert. Dieser Schritt erfolgt günstigerweise mittels HPLC-UV/FLD/MS oder GC-FID/ECD/MS. An Stelle der Quantifizierung sind jedoch auch andere Verwendungen des gereinigten Extraktes denkbar. Duft-/Aromachemie
Viele natürlich vorkommende Carbonylverbindungen sind D uft-/Aroma Stoffe (etwa Citronel- IaI, Benzaldehyd). Da das erfindungsgemäße Verfahren praktisch einen Auszug aller reaktiven Carbonylverbindungen einer Matrix enthält, kann es statt der quantitativen Analyse auch einer olfaktorischen Evaluation zugeführt werden.
Wird die Festphase vor der Freisetzung der an sie gebundenen Carbonylverbindungen getrocknet und gelagert, lassen sich so Duftauszüge in stabiler Form erhalten und zu späterem Zeitpunkt freisetzen. Vorreinigung bei der Isolierung von Substanzen im präparativen Maßstab
Die oben genannten Arbeitsabläufe gehen von analytischen Substanzmengen aus. Bei entsprechendem Upscaling (Erhöhung der Menge der Festphase und somit der reaktiven Stellen) lässt sich die beschriebene Technik auch zur Vorreinigung im Rahmen der quantitativen Isolierung von Stoffen aus komplexen Matrices einsetzen. Hier ist das Ziel, eine einzelne Substanz im Gramm-Maßstab und in hoher Reinheit zu isolieren. Die nötige Menge an aktiver Festphase kann aus der typischen Beladung mit reaktiven Stellen (im Normalfall etwa 2-3 mmol/g) berechnet werden. Nach der Anwendung des
erfindungsgemäßen Verfahrens kann der vorgereinigte Stoff durch Umkristallisation oder quantitative HPLC weiter aufgereinigt werden.
Im Folgenden ist die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Rahmen der Quantifizierung der Analyten Zearalenon (Mykotoxin), Warfarin, Coumachlor und
Coumafuryl (Rodentizide), Zoxamide (Fungizid) und Mesotrion (Pestizid) beispielhaft beschrieben.
Dabei wird von zwei unterschiedlichen Matrices (Mehl / Öl) ausgegangen. Die Detektion erfolgt mittels HPLC-DAD/FLD.
Variante mit Heptan/Essigsäure
1 ) Herstellung der Aufgabelösung
Mehl: 10g Mehl werden mit 40 ml_ Acetonitril:Wasser (84:16) versetzt und 30 Minuten geschüttelt. Das Gemisch wird zentrifugiert. 1O mL des Überstandes werden eingedampft und in 1 mL Heptan:Essigsäure (85:15 v:v) wiederaufgenommen.
Öl: 0.2 mL Öl werden mit 0.8 mL Heptan verdünnt.
2) Extraktion der Analyten gemäß Abbildung 3 Die Aufgabelösung wird auf 100 mg (± 1 mg) eines kommerziell erhältlichen, makroporösen, toluenesulfonylhydrazinfunktionalisierten Polystyrenharzes mit einer mittleren
Hydrazinbeladung von 1.5 mmol/g gegeben. Es wird 1.5 Stunden geschüttelt.
3) Waschen
Die Aufgabelösung wird abgenommen. Das Harz wird einmal mit 2 mL Heptan gewaschen und anschließend im sanften Stickstoffstrom getrocknet.
4) Elution und Analyse Das getrocknete Harz wird mit 0.4 ml_ Aceton:0.4 M HCl (90:10 v:v) für 2 Stunden geschüttelt. Der Überstand wird durch einen 0.2μm Spritzenfilter (Filtermaterial: regenerierte Cellulose) in ein Vial überführt und mittels HPLC-FLD analysiert. Die Wiederfindung der Zielanalyten ist > 90 %.
5) Regeneration des Harzes
Die Festphase wird 2x mit 2.5 mL MeOH:konz. HcI (80:20 v:v), "Ix mit 2.5 mL MeOH und 1x mit 2.5 mL Heptan für jeweils 30 Minuten geschüttelt und anschließend getrocknet. Die Wiederverwendbarkeit ist für 3 Recyclingzyklen gewährleistet.
Variante mit Methanol 1. Herstellung der Aufgabelösung
Mehl: 10g Mehl werden mit 40 mL Acetonitril:Wasser (84:16) versetzt und 30 Minuten geschüttelt. Das Gemisch wird zentrifugiert. 1O mL des Überstandes werden eingedampft und in 1 mL Methanol wiederaufgenommen.
Öl: 0.2 mL Öl werden mit 0.8 mL Methanol verdünnt.
2. Extraktion der Analyten gemäß Abbildung 3
Die Aufgabelösung wird auf 100 mg (± 2 mg) eines kommerziell erhätlichen, makroporösen, toluenesulfonylhydrazinfunktionalisierten Polystyrenharzes mit einer mittleren Hydrazinbela- dung von 1.5 mmol/g gegeben. Das Harz wurde vor Verwendung mit MeOH:0.4M HCl 90:10 (v/v) konditioniert. Es wird 1.5 Stunden geschüttelt.
3. Waschen
Die Aufgabelösung wird abgenommen. Das Harz wird einmal mit 1.8 mL Methanol und anschließend einmal mit 1 .8 mL Heptan gewaschen und schließlich im sanften
Stickstoffstrom getrocknet. 4. Elution und Analyse Das getrocknete Harz wird mit 0.4 ml_ Aceton:0.13M HCl 70:30 (v/v) für 2 Stunden geschüttelt. Der Überstand wird durch einen 0.2μm Spritzenfilter (Filtermaterial: regenerierte Cellulose) in ein Vial überführt und mittels HPLC-FLD analysiert. Die Wiederfindung der Zielanalyten ist > 90 %.
5. Regeneration und Vorkonditionierung des Harzes
5 g neues oder bereits gebrauchtes Polymerharz werden in einer Glassäule mit 50 mL Heptan gewaschen. Zur Regeneration werden 500 mL MeOH:0.4M HCl 90:10 (v/v) über Nacht durch die Säule getropft. Es wird zweimal mit 50ml Diethylether gewaschen und im Stickstoffstrom getrocknet. Die Lagerung erfolgt bei 4 °C. Die Wiederverwendbarkeit ist für 3 Recyclingzyklen gewährleistet.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Aufreinigung oder Extraktion von Carbonylverbindungen, die in komplexen, insbesondere unpolaren Stoffgemischen vorliegen, wobei die Carbonylgruppe der Carbonylverbindung nicht mit einem Heteroatom konjugiert ist, dadurch
gekennzeichnet, dass das Stoffgemisch in einem wasserfreien Medium auf eine mit Hydrazingruppen funktionalisierte Festphase aufgebracht, das Medium wieder abgetrennt sowie anschließend die Festphase mit organischem Lösungsmittel gewaschen wird und dass nach dem Waschen die Festphase mit einer Mischung aus organischen Lösungsmittel und einem niedermolekularen Keton oder Aldehyd zur Freisetzung der Carbonylverbindung eluiert wird, wobei die Carbonylverbindung gelöst in dem organischen Lösungsmittel erhalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung aus organischem Lösungsmittel und einem niedermolekularen Keton oder Aldehyd zur
Freisetzung der Carbonylverbindung Wasser oder eine wässrige Säure enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Mischung aus organischem Lösungsmittel und einem niedermolekularen Keton oder Aldehyd das organische Lösungsmittel mit dem niedermolekularen Keton oder Aldehyd identisch ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Festphase ein Polymerharz verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Polymerharz
Polystyrenharz verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein makroporöses Polymerharz verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase mit Toluensulfonylhydrazingruppen funktionalisiert ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserfreie Medium ein unpolares Lösungsmittel ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserfreie Medium mit einer Carbonsäure, vorzugsweise Essigsäure versetzt ist.
10. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserfreie Medium Heptan ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserfreie Medium Methanol ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel zum Elution Aceton, Methanol und/oder Heptan ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die mit Hydrazingruppen funktionalisierte Festphase vor Verwendung in eine Festphase mit Hydrazin-Hydrochloriden überführt wird.
14. Verwendung von mit Hydrazingruppen funktionalisierter Festphase zur Aufreinigung oder Extraktion von Carbonylverbindungen, wobei die Carbonylgruppe der
Carbonylverbindung nicht mit einem Heteroatom konjugiert ist, gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase ein Polymerharz ist .
16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymerharz ein Polystyrenharz ist.
17. Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass das
Polymerharz makroporös ist.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphase mit Toluensulfonylhydrazingruppen funktionalisiert ist.
19. Verwendung nach 18, dadurch gekennzeichnet, dass die
Toluensulfonylhydrazingruppen als Toluensulfonylhydrazin-Hydrochlorid-Gruppen vorliegen.
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