DE3812017C2 - Verfahren zur Derivatisierung von Aminosäuren mit Phenylisothiocyanat für die HPLC und Vorrichtungen hierfür - Google Patents

Verfahren zur Derivatisierung von Aminosäuren mit Phenylisothiocyanat für die HPLC und Vorrichtungen hierfür

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Derivatisierung von Aminosäuren mit Phenylisothiocyanat für eine sich an­ schließende Aminosäurenanalyse durch High Pressure Liquid Chromatography.
Die quantitative Analyse von Aminosäuregemischen durch High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) ist mit ausreichender Genauigkeit und Empfindlichkeit nur nach Derivatisierung der Aminosäuren möglich. Es entstehen Aminosäurederivate, die eine UV-Detektion oder eine Fluoreszenzdetektion mit hoher Empfindlichkeit gestatten. Eine Möglichkeit der Deri­ vatisierung ist die Umsetzung der Aminosäuren mit Phenyl­ senföl.
Es ist bekannt, daß bei der Umsetzung von Aminosäuren mit Phenylisothiocyanat Phenylthioharnstoffderivate entstehen, die durch HPLC mit einer Reverse-Phase-Säule getrennt werden können. Die Detektion erfolgt z.B. bei 254 nm im UV. Vor der HPLC-Analyse muß jedoch überschüssiges Phenylisothiocyanat möglichst vollständig entfernt werden. Das geschah bis jetzt ausschließlich durch Anlegen eines Hochvakuums, beispielsweise durch Vakuumdestillation oder durch spezielle Systeme (Pico-Tagtm System der Fa. Millipore Waters). Dieser Verfahrensschritt ist apparativ und zeitlich sehr aufwendig und schwierig zu standardi­ sieren.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das bestehende Verfahren zu verbessern und zu vereinfachen.
Diese Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des An­ spruchs 1 gelöst.
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß der zeitraubende und schwer standardisierbare Verfahrensschritt der Vakuumtrocknung der Reaktionsprodukte durch eine sehr einfache Möglichkeit der Abtrennung über­ schüssigen Phenylisothiocyanates ersetzt wird. Damit reduzieren sich die Analysenzeiten wesentlich, das Verfahren ist leicht zu standardisieren. Darüber hinaus ist mit Hilfe der Erfindung die Derivatisierung der Aminosäuren mit Phenylisothiocyanat leicht zu automatisieren; die Kopplung einer automatischen Derivatisierungseinheit gemäß Anspruch 3, 4 oder 5 mit einer ebenfalls automatisch arbeitenden HPLC-Anlage zu einem Amino­ säureanalyzer bietet sich an.
Kernstück einer automatischen Vorrichtung zur Derivatisierung von Aminosäuren mit Phenylisothiocyanat ist ein Reaktions­ gefäß, indem zuerst die eigentliche Derivatisierung abläuft. Nach Abschluß der Reaktion (in der Regel 20-30 min.) wird in das gleiche Gefäß durch automatische Dosierungsvorrichtungen eine ausreichende Menge einer wäßrigen 0,1%igen Natrium­ acetatlösung oder einer anderen geeigneten Lösung bzw. Wasser zugegeben, so daß Phasentrennung eintritt und der Überschuß an Phenylisothiocyanat die lipophile Phase bildet. Es erfolgt als nächster Schritt die Phasentrennung; entweder als Filtraton über ein hydrophiles Membranfilter oder durch Passage der Reaktionsmischung über ein lipophiles Adsorptionsmaterial. Dieser Schritt wird durch geeignete Maßnahmen gesteuert. Es kann ein extern erzeugter Überdruck (z.B. Preßluft), ein außerhalb erzeugtes Vakuum (z.B. durch Vakuumpumpe) oder ein direkt auf die Reaktionsmischung wirkender Kolben die Phasentrennung regeln. Nach der Derivatisierung wird das Reaktionsgefäß entweder gespült und wiederverwendet, oder automatisch durch ein neues Gefäß ersetzt. Die abgetrennte Phase kann über einen angeschlossenen Probensammler auto­ matisch an eine HPLC-Anlage zur Analyse weitergereicht werden.

Claims (5)

1. Verfahren zur Derivatisierung von Aminosäuren mit Phenyl­ isothiocyanat für eine sich anschließende Aminosäuren­ analyse durch High Pressure Liquid Chromatography (Vor­ säulenderivatisierung), gekennzeichnet durch
  • a) Durchführung der Derivatisierungsreaktion zwischen Aminosäuren und Phenylisothiocyanat in Ethanol oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel unter Zusatz von Triethylamin oder anderer geeigneter basischer Zusätze.
  • b) Zugabe von Wasser, einer wäßrigen verdünnten Natrium­ acetatlösung oder einer anderen geeigneten wäßrigen Lösung nach Abschluß der Reaktion.
  • c) Abtrennung der wäßrigen Phase mittels Filtration über ein hydrophiles Membranfilter aus Zelluloseacetat mit einer Nennporenweite von 0,2 µm oder ein anderes geeignetes Filter oder mittels eines geeigneten lipo­ philen Adsorptionsmateriales und Analyse des erhaltenen Filtrats bzw. der gereinigten wäßrigen Phase ohne jede weitere Behandlung durch High Pressure Liquid Chromatography.
2. Vorrichtung zur manuellen Durchführung der Derivatisierungs­ methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) ein Reaktionsgefäß durch ein hydrophiles Membranfilter aus Zelluloseacetat und einer Nennporenweite von 0,2 µm oder ein anderes geeignetes Filter bzw. alternativ durch eine mit lipophilem Adsorptionsmaterial gefüllte Kartusche abgeschlossen ist,
  • b) Hähne oder andere geeignete Vorrichtungen es erlauben, Reagentien und Analysenlösung im Reaktionsgefäß zu mischen,
  • c) ein Kolben es gestattet, die Reaktionsmischung zur Abtrennung der lipophilen Phase durch den Filter bzw. die Kartusche zu pressen,
  • d) ein Gefäß die wäßrige Phase nach Abtrennung der lipo­ philen Phase aufnimmt.
3. Vorrichtung zur vollautomatischen Durchführung der Deri­ vatisierungsmethode nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) automatische Dosierungsmöglichkeiten für Reagentien und Analysenlösung durch Kolbenbüretten oder andere geeignete Vorrichtungen bestehen,
  • b) ein motorisch angetriebener Kolben die Reaktionsmischung zur Phasentrennung durch den Filter oder die Kartusche preßt.
4. Vorrichtung zur vollautomatischen Durchführung der Deri­ vatisierungsmethode nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) ein nach dem Filter bzw. der Kartusche angelegter und außerhalb erzeugter Unterdruck die Reaktionsmischung zur Phasentrennung durch das Filter oder die Kartusche zieht.
5. Vorrichtung zur vollautomatischen Durchführung der Deri­ vatisierungsmethode nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) ein außerhalb erzeugter Überdruck die Reaktionsmischung zur Phasentrennung durch den Filter oder die Kartusche presst.
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